CN111876436B - 一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用 - Google Patents
一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用，属于甲硫氨酸裂解酶技术领域。所述甲硫氨酸裂解酶的编码基因的cDNA序列如SEQ ID No.7所示。本发明还公开了一种甲硫氨酸裂解酶及其生物合成方法和应用，还公开了一种重组表达载体和一种重组宿主细胞。本发明的甲硫氨酸裂解酶的编码基因，能够在宿主细胞中高效表达来源于解脂耶氏酵母的甲硫氨酸降解酶，且其酶活高于其它真核来源的甲硫氨酸降解酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用，属于甲硫氨酸裂 解酶技术领域。
背景技术
临床上多种恶性肿瘤均具有甲硫氨酸依赖特性。甲硫氨酸的化学结构式 如下：
基于这种特性，消耗肿瘤细胞胞依赖的甲硫氨酸成为治疗恶性肿瘤的一 种重要方法。甲硫氨酸裂解酶能将甲硫氨酸降解为α-酮丁酸、甲基硫醇和 氨，主要通过食物添加、化学载体介导或者基因疗法降低体内的甲硫氨酸浓 度，发挥治疗或者辅助治疗的作用。
目前，原核来源的甲硫氨酸降解酶由于引起哺乳动物细胞强烈的免疫反 应和不稳定性，限制了其在临床上的应用。真核来源的甲硫氨酸降解酶由于 具有低免疫性等特点而成为开发的重点，但是，目前报道的真核来源的甲硫 氨酸降解酶的活性普遍较低。
另外，甲硫氨酸降解产物——甲基硫醇及其衍生物二甲基硫、二甲基二 硫和二甲基三硫是重要的食品香料添加剂，主要用于配制玉米、番茄、土豆、 奶制品、菠萝和橘子类果香及青香型香精。因此，在食品中添加甲硫氨酸降 解酶可以改善发酵食品的香味。
鉴于此，有必要研发一种真核来源的、高效的甲硫氨酸裂解酶，以解决 现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种甲硫氨酸裂解酶的编码基因。本发明的 甲硫氨酸裂解酶的编码基因，能够在宿主细胞中高效表达来源于解脂耶氏酵 母(Yarrowialipolytica)的甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A，且其酶 活高于目前已报道的其它真核来源的甲硫氨酸降解酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种甲硫氨酸裂解酶的编码 基因，其cDNA序列为(a)、(b)和(c)中的任一种所示:
(a)SEQ ID No.7所示的核苷酸；
(b)与SEQ ID NO.7的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸；
(c)与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列至少有80％以上同源性的核苷酸序 列。
上述“严谨杂交条件”，意指在所属领域中已知的低离子强度和高温 的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它 序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序 列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异 性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序 列。对于核酸杂交的详尽指导，可参考文献[1]。更具体的，所述严谨条件通 常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)5-10℃。Tm为 在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定 离子强度、pH和核酸浓度下)。因为目标序列过量存在，在Tm下在平衡状态 下50％的探针被占据。严谨条件可为以下条件：其中在pH值7.0-8.3下，盐浓 度低于约1.0M钠离子浓度，通常为0.01M-1.0M钠离子浓度(或其它盐)， 并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃， 而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严 谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂 交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性 严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5× SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中 洗涤。所述洗涤可进行5min、15min、30min、60min、120min或更长时间。
本发明的甲硫氨酸裂解酶的编码基因的有益效果是：
本发明的甲硫氨酸裂解酶的编码基因，能够在宿主细胞中高效表达来源 于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的甲硫氨酸降解酶 YALI0C22088g-Y59A，且其酶活高于目前已报道的其它真核来源的甲硫氨酸 降解酶。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，与所述SEQ ID No.7所示的核苷酸序列至少有90％以上同源性 的核苷酸序列。
进一步，与所述SEQ ID No.7所示的核苷酸序列至少有95％以上同源性 的核苷酸序列。
进一步，与所述SEQ ID No.7所示的核苷酸序列至少有97％以上同源性 的核苷酸序列。
本发明的目的之二，是提供一种甲硫氨酸降解酶。本发明的甲硫氨酸降 解酶由上述甲硫氨酸降解酶的编码基因所编码，其降解甲硫氨酸的效率是 39.64±0.12nM甲硫氨酸·min-1·mg蛋白质-1，是目前目前已报道的真核生物 中催化甲硫氨酸降解效率最高的酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸降解酶的编码 基因编码的甲硫氨酸降解酶。
本发明的甲硫氨酸降解酶的有益效果是：
本发明甲硫氨酸降解酶由上述甲硫氨酸降解酶的编码基因所编码，其降 解甲硫氨酸的效率是39.64±0.12nM甲硫氨酸·min-1·mg蛋白质-1，是目前真 核生物中催化甲硫氨酸降解效率最高的酶。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述甲硫氨酸裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的目的之三，是提供上述甲硫氨酸降解酶的生物合成方法。本 发明通过优化基因序列、表达载体和表达条件，获得的甲硫氨酸裂解酶的纯 度达到90％以上，降解甲硫氨酸的效率是39.64±0.12nM甲硫氨酸·min-1·mg蛋 白质-1，是目前真核生物中催化甲硫氨酸降解效率最高的酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸降解酶的生 物合成方法，包括如下步骤：
步骤1：构建重组酵母表达载体
根据解脂耶氏酵母的YALI0C22088g核苷酸和氨基酸序列,对其密码子 进行优化，人工合成如SEQ ID No.1所示的YALI0C22088g基因，并以SEQ ID No.3所示的上游引物和SEQ ID No.4所示的下游引物进行扩增，通过KpnI 和XhoI双酶切，定向克隆至酵母表达载体pYES2上；
以SEQ ID No.5所示的上游引物和SEQ ID No.6所示的下游引物将编 码Tyr59的核苷酸突变为编码Ala的核苷酸，即得到重组酵母表达载体 pYES2-YALI-88g-Y59A；
步骤2：将步骤1构建得到的表达甲硫氨酸降解酶的重组酵母表达载体 转化到酿酒酵母中，得到甲硫氨酸裂解酶的表达菌；
步骤3：诱导步骤2得到的甲硫氨酸裂解酶的表达菌用于表达甲硫氨酸 裂解酶，收集诱导表达后的菌体，破碎菌体，纯化，即得到甲硫氨酸降解酶。
本发明的甲硫氨酸降解酶的生物合成方法的有益效果是：
1、本发明通过优化基因序列、表达载体和表达条件，获得的甲硫氨酸 裂解酶的纯度达到90％以上，其降解甲硫氨酸的效率是39.64±0.12nM甲硫 氨酸·min-1·mg蛋白质-1，是目前真核生物中催化甲硫氨酸降解效率最高的酶。
2、本发明的甲硫氨酸降解酶的生物合成方法简单，操作容易，市场前 景广阔，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤2中，所述酿酒酵母为酿酒酵母INVSc1。
进一步，步骤3中，所述诱导的方式为半乳糖诱导，具体参数为：诱导 前菌液OD600为0.4，按w/v计，半乳糖的浓度为2％，诱导表达温度为30℃， 诱导时间为16h。
进一步，步骤3中，所述纯化的方法为：清洗并再生的His-标记蛋白纯 化柱，用裂解缓冲液进行柱平衡；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体 用裂解缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清以进行上样结合；上样完毕后， 用裂解缓冲液将柱上的非特异性杂质洗去；用洗脱缓冲液收集目的蛋白；将 收集的目的蛋白过脱盐柱进行纯化并收集，得到纯化的甲硫氨酸降解酶。
更进一步，所述裂解缓冲液由如下组分组成：pH值为8.5的10mM Tris-HCl，300mMKCl，10mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。
更进一步，所述洗脱缓冲液由如下组分组成：pH值为8.5的20mM Tris-HCl，300mMKCl，200mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。
本发明的目的之四，是提供上述甲硫氨酸降解酶的应用。上述甲硫氨酸 降解酶可以用于降解甲硫氨酸，降解效率最高，具有广泛的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：上述甲硫氨酸降解酶在降解 甲硫氨酸中的应用。
上述甲硫氨酸降解酶在降解甲硫氨酸中的应用的有益效果是：
上述甲硫氨酸降解酶可以用于降解甲硫氨酸，降解效率最高，具有广泛 的应用前景。
本发明的目的之五，是提供一种重组表达载体。本发明的重组表达载 体，含有上述甲硫氨酸降解酶的编码基因,能够在宿主E.coli BL21中高效 表达编码基因。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种重组表达载体，含有 上述甲硫氨酸降解酶的编码基因。
本发明的重组表达载体的有益效果是：
本发明的重组表达载体，含有上述甲硫氨酸降解酶的编码基因,能够在 宿主E.coli BL21中高效表达编码基因。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述重组表达载体为重组表达载体pYES2-YALI-88g-Y59A。
本发明的目的之六，是提供一种重组宿主细胞。本发明的重组宿主细胞， 含有上述甲硫氨酸降解酶的编码基因，该基因基于宿主细胞密码子偏好性进 行密码子优化，能够在宿主细胞中被T7启动子高效启动表达。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种重组宿主细胞，含有上 述甲硫氨酸降解酶的编码基因。
本发明的重组宿主细胞的有益效果是：
本发明的重组宿主细胞，含有上述甲硫氨酸降解酶的编码基因，该基因 基于宿主细胞密码子偏好性进行密码子优化，能够在宿主细胞中被T7启动 子高效启动表达。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述重组宿主细胞为酿酒酵母。
进一步，所述重组宿主细胞为酿酒酵母INVSc1。
术语解释：
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所 属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试 中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优 选方法、装置和材料。
术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方 法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域 中已知的其它方法。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单 子叶或双子叶植物细胞。
术语“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、 核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有 天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特 性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则 所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所 用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特 定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码 子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个 或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基 取代的序列来实现简并密码子取代。
术语“多肽”、“酶”和“蛋白质”在本文中互换使用以意指氨基酸残 基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦 然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸 残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本发明中所使用，所述术语涵 盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由 共价肽键连接。
本发明中所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多 个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺 少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改 变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。
附图说明
图1为本发明的实施例2中，优化条件下表达并纯化的甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A的SDS-PAGE图，图中，100、200和500分别表示竞争 洗脱甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A的咪唑浓度(mM)。
图2为本发明的实施例2中，甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A蛋白 的质谱鉴定结果。
图3为本发明的实施例2中，甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A降解 甲硫氨酸活性检测。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
实验材料
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB122，购自武汉淼灵生物科 技有限公司。
酿酒酵母INVSc1和表达质粒pYES2，均购自Invitrogen公司。
实施例1：甲硫氨酸裂解酶基因YALI0C22088g的克隆和突变
(1)根据解脂耶氏酵母的YALI0C22088g核苷酸和氨基酸序列,对其密 码子进行优化，人工合成如SEQ ID No.1所示的YALI0C22088g基因，并设 计扩增YALI0C22088g基因的引物，通过引物扩增和定向克隆，将甲硫氨酸 降解酶基因定向克隆至表达载体pYES2；利用定点突变技术将编码Tyr59的 核苷酸TAC突变为编码Ala的核苷酸GCG，获得重组酵母表达载体 pYES2-YALI-88g。YALI0C22088g基因推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
(2)表达质粒pYES2的提取
LB培养基配方：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L和氨 苄青霉素100mg/L。
取1个装有10mL上述LB培养基的试管，将含有pYES2质粒的E.coli Top10接种于试管中，在37℃、180rpm下过夜培养，按照质粒试剂中的方 法提取质粒。质粒试剂盒购自盒OMEGA bio-tek公司,Plasmid Mini Kit I(200)。质粒提取完成后将其做好标记置于4℃冰箱等待下一步使用。
(3)PCR扩增带有编码His标签的YALI0C22088g
PCR扩增反应体系：SEQ ID No.1所示的YALI0C22088g基因 0.5 μL、10×buffer 5μL、dNTPs 4 μL、SEQ ID No.3所示的上游引物1μL、SEQ ID No.4所示的下游引物1 μL、pfu聚合酶0.4 μL、加ddH2O至50 μL。
88g上游引物：
5'-cggggtaccaacacaatgtctcaccaccaccaccaccacaccagcccggacctgagca c-3'(SEQ ID NO.3)；
88g下游引物：5'-ccgctcgagttatttgctcgcctccagcgc-3'(SEQ ID NO.4)。
斜体部分为编码His标签序列，下划线斜体为酶切位点KpnI和XhoI。
PCR扩增条件：94℃预变性10min；94℃，30s，55℃，30s，72℃， 2min，30个循环；最后延伸72℃，5min。
(4)表达载体构建及转化
采用KpnI和XhoI双酶切表达质粒和PCR产物后，利用PCR产物回收试 剂盒回收酶切产物，建立酶连体系：pYES2和YALI0C22088g混合酶切产物 8μL、10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL、T4 DNA连接酶1μL。将酶连体系 放入16℃的恒温干浴锅中，处理8h后，酶连产物加入E.coli Top 10感 受态细胞。将EP管重置于冰中30min，然后放入42℃水浴热激30s，再 放入冰中静置2min。每管加入500μL LB培养基，在37℃、180rpm摇 床培养60min；然后4000rpm离心4min，取400μL上清，将沉淀轻轻 混匀，涂在含氨苄青霉素100mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中培养10-12 h。将平板上长出的单菌落接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h，挑取菌落进行PCR检测。以ddH2O作为阴性对照，将PCR产 物用琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增出目的条带分子量大约在1.1kb，则初步 证明载体构建成功。
(5)突变体Y59A的构建
利用突变试剂盒(Mut
II Fast Mutagenesis Kit V2，南京诺 唯赞生物科技股份有限公司)将编码Tyr59的核苷酸TAC突变为编码Ala的 核苷酸GCG。首先，利用PCR扩增目标质粒，扩增产物经DpnI消化后，通过 
重组环化，最后按照步骤(4)转化E.coli Top 10感受态细 胞。
MY59-88g上游引物：5'-caacgaggcggtctactcgcggatcgcccacc-3' (SEQ IDNO.5)；
MY59-88g下游引物：5'-agtagaccgcctcgttggttccgtaggccgct-3'(SEQ ID NO.6)。
突变碱基及其互补碱基以斜体展示。
(6)阳性克隆的筛选
将平板上长出的单菌落接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上， 37℃培养12h，挑取单菌落测序，测序序列结果显示载入的88g-His片段 长度为1164bp，且Y59位编码核苷酸替换为GCG(编码A)，表明表达载体 pYES2-YALI-88g构建成功。
实施例2：甲硫氨酸降解酶的表达纯化
(1)酵母感受态细胞的制备
将酿酒酵母INVSc1在YPD固体培养基上活化，转接三次后，接种到YPD液 体培养基中，30℃，200rpm，摇床振荡培养至OD600＝1.0，收集细胞，利用 预冷的超纯水洗涤细胞，并将其重悬在200μL 1M山梨醇溶液中，制备酿酒 酵母感受态细胞。
YPD培养基配方：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，121℃高压灭菌20min， 加入2％(w/v)葡萄糖。
(2)酿酒酵母过表达YALI0C22088g质粒的转化
提取E.coli Top10中的pYES2-YALI-88g-Y59A质粒，将提取的质粒转 入酿酒酵母感受态中，轻轻混匀，加入预冷的0.2cm电极杯中，在超净台 上轻轻敲击使混合物流到电极杯底部，冰浴5min。将电击杯置于电转化仪 中，1.5kV，5mS，作指数衰减脉冲转化。迅速加入1mL预冷的1M山梨 醇至电极杯中，分别将内容物转移至灭菌的1.5mL EP管中。取300μL涂于缺少尿嘧啶的SC液体培养基上，30℃倒置培养2-3d，挑选平板上长出的 转化子进行扩大培养。
SC培养基成份：0.67％(w/v)酵母氮源基础培养基(无氨基酸)，以及 2％(w/v)葡萄糖或棉籽糖,用纯水定容至100mL。
(3)甲硫氨酸降解酶的诱导
将活化后的全部菌液接种于50mL缺少尿嘧啶的SC液体培养基中继续 活化24h，取全部菌液接种于200mL缺少尿嘧啶的SC液体培养基中继续 活化24h。4000rpm离心5min收集菌体接种于1L缺少尿嘧啶的SC液体 培养基中，并加入2％半乳糖进行诱导培养，30℃、200rpm诱导16h。用 高速冷冻离心机(J-26XP，Beckman)，4000rpm、4℃离心15min，收集 诱导后的菌体。
(4)甲硫氨酸降解酶的纯化
将收集的菌体在液氮中速冻并充分研磨，研磨后加入25mL的Lysis buffer重悬；进行超声破壁(运行3s，停3s，99个循环)至溶液变为半 透明状态为止；超声结束后，4℃，12000rpm离心1h，收集破碎细胞后 离心得到的上清。
准备His-标记蛋白纯化柱，超纯水洗3遍，裂解缓冲液洗3次，将上清 过His-标记蛋白纯化柱，流穿两次；用裂解缓冲液冲洗His-标记蛋白纯化 柱，除去His-标记蛋白纯化柱上的杂蛋白，每次3mL，洗3次；用洗脱缓 冲液洗脱目标条带，获得纯化的YALI0C22088g-Y59A(如图1所示)，继而 通过脱盐柱去除洗脱缓冲液中的咪唑。
纯化蛋白所用缓冲液：
所述裂解缓冲液由如下组分组成：pH值为8.5的10mM Tris-HCl，300 mM KCl，10mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟；
所述洗脱缓冲液由如下组分组成：pH值为8.5的20mM Tris-HCl，300 mM KCl，200mM咪唑，10％体积甘油和1mM苯甲基磺酰氟。
(5)甲硫氨酸降解酶的得率
采用BCA(Bicinchoninic Acid)法对通过镍柱纯化的 YALI0C22088g-Y59A洗脱液浓度进行测定，浓度为1.2mg/mL，共收集了50mL 蛋白洗脱液，蛋白最终质量为60mg。出发菌液体积为1L，计算得到甲硫 氨酸降解酶的得率为60mg/L。纯化后的蛋白经质谱分析，蛋白质评分为490， 与YALI0C22088g匹配程度最高，鉴定为YALI0C22088g-Y59A(如图2所示)。
质谱仪规格：4700Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF，厂家为美国 AppliedBiosystems,Framingham,MA。
(6)甲硫氨酸降解酶的酶学特性分析
以甲硫氨酸作为底物，检测甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A降解甲 硫氨酸的效果，5mL酶促反应体系包括：3mg甲硫氨酸降解酶 YALI0C22088g-Y59A，pH值为8.0的50mMTris-HCl,5μM PLP和20mM 甲硫氨酸。酶促反应体系置于温度为30℃条件下反应6h，利用液相检测甲 硫氨酸浓度的降低，检测方法为：取出200μL酶促反应液，加入1μL 10mol/LH3PO4，调节pH值至3.0；利用Reprosil-Pur Basic C18 column(4.6 mm×250mm×5μm)(Dr.Maisch GmbH，Germany)对甲硫氨酸浓度进行检 测，流动相为体积比13：87的乙腈和水，利用50mmol/L KH2PO4和10mol/L H3PO4维持流动相的pH值至3.0,检测波长为230nm。柱温和流动速度分别为 40℃和0.5mL/min(如图3所示)。计算结果本发明制备的甲硫氨酸的降解 效率为39.64±0.12nM甲硫氨酸·min-1·mg蛋白质-1。
对比试验
现有技术已报道的真核来源甲硫氨酸裂解酶有STR3[2]、 HCGL(E59N,R119L,E339V)[3]和hMGL4.0[4]。将本发明得到的甲硫氨酸降解酶 YALI0C22088g-Y59A与上述三种甲硫氨酸裂解酶进行降解效率、Km、kcat以及 kcat/Km的比较。具体如表1所示。
表1
由此可见，本发明的甲硫氨酸降解酶YALI0C22088g-Y59A催化甲硫氨 酸降解效率是STR3的4.49倍，结合底物的能力提高了1032.53倍。相比于 来源于人类的甲硫氨酸降解酶HCGL(E59N,R119L,E339V)和hMGL4.0，催化效 率提高了49.64倍和4.35倍。因此，本发明得到的甲硫氨酸降解酶是目前 已报道的真核生物中催化甲硫氨酸降解效率最高的酶。
参考文献：
1.Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays.1993
2.汤亚杰，贾开志，徐阳华，等.甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物 合成方法[P].中国专利：CN 104928310A.2015-09-23.
3.Everett Stone，Olga Paley，Jian Hu，et al.De Novo Engineering of aHuman Cystathionine-γ-Lyase for Systemic l-Methionine Depletion CancerTherapy[J].ACS Chemical Biology,2012,7:1822-1829.
4.Wei-Cheng Lu,Achinto Saha,Wupeng Yan,et al.Enzyme-mediateddepletion of serum L-Met abrogates prostate cancer growth via multiplemechanisms without evidence of systemic toxicity.PNAS，2020， 117:13000-13011.
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 一种甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccagcc cggacctgag caccctggcg atccacgcgg acgatgaact ggcgcgtacc 60
aacgatgttg cgccgagcat tgctgtgagc accaccttcc gttacagcag caacccggag 120
gacctggtgc cgctggcgga gaacgaagat gaggcggcgt atggcaccaa cgaatacgtt 180
tatagccgta ttgcgcaccc gaccaccagc cgtgttgaga aggtgctgag caccattttc 240
aacaacaaat ttccggtggt ttacaacaac ggtctggcgg cgttcaccgc gctgatcgtg 300
cacgttaacc cgaagcgtct gtttattggc gaagcgtacc acggttgcca cgctgtgagc 360
gacatcttta aacgtattcg ttataacctg gaaatcctga gcctggacga actggataag 420
gttgagaaag gcgatctggt gcacctggag accccggtta acccgaccgg ttacagccgt 480
gacctgagct actatgcgga tgcggcgcac aagaaaggtg gcattctgag cgtggatgcg 540
acctttgcgc cgccgccgct gcaggacccg ttcgattttg gcgcggacat cgttatgcac 600
agcgcgacca agtattttgg tggccacagc gatctgctgg cgggcattct ggtggttaaa 660
acccacgagg aagcggacca actggttggt gatcgtagct tcctgggtag cggcccgggt 720
aacctggaaa gctggctgct gctgcgtagc ctgcgtacct accgtctgcg tatcaagcag 780
caaagcgaca acgcgaccgc gattaccaaa tatttcagcg accacctgag cgattttccg 840
gcgctgaagt gcgtgcacca cagcagcttc cagaccgagg attttgttaa gaaacaactg 900
gtgggtggct acggtccggt gtttgttctg gaaatgcaaa gccgtgaggc ggcgcgtgcg 960
ctgccgagca agctgaaatt ctttaaccac gcgaccagcc tgggtggcgt tgaaagcctg 1020
atcgagtggc gtctgatgag cgacgcgacc accaacccgg cgtatctgcg tgtgagcgtt 1080
ggcgtggaag acgcgaacga tctgattggt gatctgaagc aagcgctgga ggcgagcaaa 1140
taa 1143
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Ser Pro Asp Leu Ser Thr Leu Ala Ile His Ala Asp Asp Glu
1 5 10 15
Leu Ala Arg Thr Asn Asp Val Ala Pro Ser Ile Ala Val Ser Thr Thr
20 25 30
Phe Arg Tyr Ser Ser Asn Pro Glu Asp Leu Val Pro Leu Ala Glu Asn
35 40 45
Glu Asp Glu Ala Ala Tyr Gly Thr Asn Glu Ala Val Tyr Ser Arg Ile
50 55 60
Ala His Pro Thr Thr Ser Arg Val Glu Lys Val Leu Ser Thr Ile Phe
65 70 75 80
Asn Asn Lys Phe Pro Val Val Tyr Asn Asn Gly Leu Ala Ala Phe Thr
85 90 95
Ala Leu Ile Val His Val Asn Pro Lys Arg Leu Phe Ile Gly Glu Ala
100 105 110
Tyr His Gly Cys His Ala Val Ser Asp Ile Phe Lys Arg Ile Arg Tyr
115 120 125
Asn Leu Glu Ile Leu Ser Leu Asp Glu Leu Asp Lys Val Glu Lys Gly
130 135 140
Asp Leu Val His Leu Glu Thr Pro Val Asn Pro Thr Gly Tyr Ser Arg
145 150 155 160
Asp Leu Ser Tyr Tyr Ala Asp Ala Ala His Lys Lys Gly Gly Ile Leu
165 170 175
Ser Val Asp Ala Thr Phe Ala Pro Pro Pro Leu Gln Asp Pro Phe Asp
180 185 190
Phe Gly Ala Asp Ile Val Met His Ser Ala Thr Lys Tyr Phe Gly Gly
195 200 205
His Ser Asp Leu Leu Ala Gly Ile Leu Val Val Lys Thr His Glu Glu
210 215 220
Ala Asp Gln Leu Val Gly Asp Arg Ser Phe Leu Gly Ser Gly Pro Gly
225 230 235 240
Asn Leu Glu Ser Trp Leu Leu Leu Arg Ser Leu Arg Thr Tyr Arg Leu
245 250 255
Arg Ile Lys Gln Gln Ser Asp Asn Ala Thr Ala Ile Thr Lys Tyr Phe
260 265 270
Ser Asp His Leu Ser Asp Phe Pro Ala Leu Lys Cys Val His His Ser
275 280 285
Ser Phe Gln Thr Glu Asp Phe Val Lys Lys Gln Leu Val Gly Gly Tyr
290 295 300
Gly Pro Val Phe Val Leu Glu Met Gln Ser Arg Glu Ala Ala Arg Ala
305 310 315 320
Leu Pro Ser Lys Leu Lys Phe Phe Asn His Ala Thr Ser Leu Gly Gly
325 330 335
Val Glu Ser Leu Ile Glu Trp Arg Leu Met Ser Asp Ala Thr Thr Asn
340 345 350
Pro Ala Tyr Leu Arg Val Ser Val Gly Val Glu Asp Ala Asn Asp Leu
355 360 365
Ile Gly Asp Leu Lys Gln Ala Leu Glu Ala Ser Lys
370 375 380
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggggtacca acacaatgtc tcaccaccac caccaccaca ccagcccgga cctgagcac 59
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt tatttgctcg cctccagcgc 30
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caacgaggcg gtctactcgc ggatcgccca cc 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtagaccgc ctcgttggtt ccgtaggccg ct 32
<210> 7
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaccagcc cggacctgag caccctggcg atccacgcgg acgatgaact ggcgcgtacc 60
aacgatgttg cgccgagcat tgctgtgagc accaccttcc gttacagcag caacccggag 120
gacctggtgc cgctggcgga gaacgaagat gaggcggcgt atggcaccaa cgaagcggtt 180
tatagccgta ttgcgcaccc gaccaccagc cgtgttgaga aggtgctgag caccattttc 240
aacaacaaat ttccggtggt ttacaacaac ggtctggcgg cgttcaccgc gctgatcgtg 300
cacgttaacc cgaagcgtct gtttattggc gaagcgtacc acggttgcca cgctgtgagc 360
gacatcttta aacgtattcg ttataacctg gaaatcctga gcctggacga actggataag 420
gttgagaaag gcgatctggt gcacctggag accccggtta acccgaccgg ttacagccgt 480
gacctgagct actatgcgga tgcggcgcac aagaaaggtg gcattctgag cgtggatgcg 540
acctttgcgc cgccgccgct gcaggacccg ttcgattttg gcgcggacat cgttatgcac 600
agcgcgacca agtattttgg tggccacagc gatctgctgg cgggcattct ggtggttaaa 660
acccacgagg aagcggacca actggttggt gatcgtagct tcctgggtag cggcccgggt 720
aacctggaaa gctggctgct gctgcgtagc ctgcgtacct accgtctgcg tatcaagcag 780
caaagcgaca acgcgaccgc gattaccaaa tatttcagcg accacctgag cgattttccg 840
gcgctgaagt gcgtgcacca cagcagcttc cagaccgagg attttgttaa gaaacaactg 900
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ctgccgagca agctgaaatt ctttaaccac gcgaccagcc tgggtggcgt tgaaagcctg 1020
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ggcgtggaag acgcgaacga tctgattggt gatctgaagc aagcgctgga ggcgagcaaa 1140
taa 1143
Claims (7)
1.一种甲硫氨酸裂解酶的编码基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID No.7所示。
2.权利要求1所述的甲硫氨酸降解酶的编码基因编码的甲硫氨酸降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求2所述的甲硫氨酸降解酶在降解甲硫氨酸中的应用。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的甲硫氨酸降解酶的编码基因。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有权利要求1所述的甲硫氨酸降解酶的编码基因。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为酿酒酵母。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为酿酒酵母INVSc1。
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