CN104928310B

CN104928310B - 甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法

Info

Publication number: CN104928310B
Application number: CN201510311606.1A
Authority: CN
Inventors: 汤亚杰; 贾开志; 徐阳华; 张权; 李红梅
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2015-06-09
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2035-06-09
Also published as: US20170260518A1; US10308925B2; CN104928310A; WO2016197561A1

Abstract

本发明公开了甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法。本发明从黑孢块菌中分离获得SEQ ID No.1所示的编码甲硫氨酸裂解酶的基因。本发明进一步提供了一种高效生物合成甲硫氨酸裂解酶的方法，包括：(1)将SEQ ID No.1所示甲硫氨酸降解酶的编码基因克隆至酵母表达载体中，构建得到重组酵母表达载体；(2)将重组酵母表达载体转化到酿酒酵母中得到表达菌；(3)诱导表达菌表达甲硫氨酸裂解酶，收集诱导表达后的菌体，纯化所表达的重组甲硫氨酸裂解酶。本发明制备的重组甲硫氨酸裂解酶纯度达到90％以上，其降解甲硫氨酸的效率可达0.53±0.0030μM MTL·h^‑1·mg protein^‑1。

Description

甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法

技术领域

本发明涉及甲硫氨酸裂解酶，尤其涉及源于真菌的甲硫氨酸裂解酶及其编码基因，本发明进一步涉及一种获得甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法，属于甲硫氨酸裂解酶及其生物合成领域。

背景技术

甲硫氨酸裂解酶具有广泛的工业和医药用途。在工业领域，甲硫氨酸裂解酶以甲硫氨酸为底物，直接催化合成甲基硫醇及其衍生物二甲基硫、二甲基二硫和二甲基三硫，这些含硫化合物是重要的食品香料添加剂，主要用于配制玉米、番茄、土豆、奶制品、菠萝和橘子类果香及青香型香精(Martinez-Cuesta Mdel,C.,Pelaez,C.,Requena,T.,2013.Methionine metabolism:major pathways and enzymes involved and strategiesfor control and diversification of volatile sulfur compounds in cheese.CritRev Food Sci Nutr.53,366-385.)；另外，主产物甲基硫醇也是一种重要的燃料添加剂，同时可以作为生产甲硫氨酸和杀虫剂的前体化合物(Gutierrez,O.Y.,Zhong,L.S.,Zhu,Y.Z.,Lercher,J.A.,2013.Synthesis of methanethiol from CS₂on Ni-,Co-,and K-Doped MoS₂/SiO₂catalysts.Chemcatchem.5,3249-3259；Zhang,Y.H.,Chen,S.P.,Wu,M.,Fang,W.P.,Yang,Y.Q.,2012.Promoting effect of SiO₂ on the K₂WO₄/Al₂O₃catalystsfor methanethiol synthesis from methanol and H₂S.Catal Commun.22,48-51.)。甲硫氨酸裂解酶在医药领域也有广泛的应用范围，甲硫氨酸裂解酶可以作为癌症辅助治疗的酶制剂，通过将其添加到癌症病人的食物中，可以将食物中的甲硫氨酸降解，减少癌细胞对外源甲硫氨酸的依赖，从而达到辅助治疗的目的(Sun,X.,Yang,Z.,Li,S.,Tan,Y.,Zhang,N.,Wang,X.,Yagi,S.,Yoshioka,T.,Takimoto,A.,Mitsushima,K.,Suginaka,A.,Frenkel,E.P.,Hoffman,R.M.,2003.In vivo efficacy of recombinant methioninase isenhanced by the combination of polyethylene glycol conjugation and pyridoxal5'-phosphate supplementation.Cancer Res.63,8377-8383.)；同时，甲硫氨酸裂解酶亦可通过感染的方式进入癌症细胞，引发癌症细胞的死亡和严重聚集，是基因治疗癌症的一种前沿技术(Venkatachalam,KV,2015.Novel cancer therapy:Targeting methioninemetabolism.29(1):897)。

甲硫氨酸裂解酶广泛存在于原核中，真菌中目前尚未有甲硫氨酸裂解酶的发现。由于密码子偏好性的问题，原核基因在真核发酵微生物中难以高效表达，制约了真核微生物尤其是一些与食品相关的发酵微生物功能的提升。另外，原核的甲硫氨酸裂解酶用于癌症治疗中易引发免疫反应(El-Sayed,A.S.,2010.Microbial L-methioninase:production,molecular characterization,and therapeutic applications.ApplMicrobiol Biotechnol.86,445-467.)。因此，提供一种真核来源的甲硫氨酸裂解酶成为克服上述问题的主要途径。

发明内容

本发明目的之一是提供一种源于真菌的甲硫氨酸裂解酶；

本发明的目的之二是提供所述源于真菌的甲硫氨酸裂解酶的编码基因；

本发明的另一目的是提供一种甲硫氨酸裂解酶的生物合成方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种甲硫氨酸裂解酶的编码基因，其cDNA序列为(a)、(b)或(c)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸；

(b)、与SEQ ID NO:1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的核苷酸；

(c)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有80％以上同源性的核苷酸序列；优选的，与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有90％以上同源性的核苷酸序列；更优选的，与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少有95％以上同源性的核苷酸序列；最优选的，与SEQID No.1所示的核苷酸序列至少有97％以上同源性的核苷酸序列。

优选的，本发明所述的从真菌黑孢块菌中所分离的甲硫氨酸裂解酶的编码基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。该基因序列是基于氨基酸序列的保守性和密码子简并性以黑孢块菌基因组为模板克隆得到的，通过NCBI Blast，其氨基酸序列与同源基因的一致性达到78％。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导，可参考有关文献(Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicProbes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

本发明进一步提供了甲硫氨酸裂解酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

含有所述甲硫氨酸裂解酶的编码基因的重组表达载体也当然包括在本发明保护范畴之中；优选的，所述的重组表达载体是重组酵母表达载体。

进一步，含有所述重组表达载体的重组宿主细胞也属于本发明的保护技术方案；优选的，所述的重组宿主细胞是重组酿酒酵母细胞。

本发明的另外一个目的是提供一种甲硫氨酸降解酶的生物合成方法，该方法包括以下步骤：

(1)将甲硫氨酸降解酶的编码基因克隆至酵母表达载体中，构建得到表达甲硫氨酸降解酶的重组酵母表达载体；

(2)将所构建的表达甲硫氨酸降解酶的重组酵母表达载体转化到酿酒酵母中，得到甲硫氨酸裂解酶的表达菌；

(3)诱导甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶，收集诱导表达后的菌体，破碎菌体，纯化所表达的重组甲硫氨酸裂解酶。

为了达到更好的表达效果，优选的，步骤(1)中将SEQ ID No.1所示的核苷酸通过HindIII和BamHI双酶切定向克隆至酵母表达载体pYES2，得到过表达甲硫氨酸降解酶的重组酵母表达载体pYES2-STR3；

其中，所述的重组酵母表达载体pYES2通过以下方法构建得到：

以黑孢块菌的基因组为模板，用SEQ ID No.3为上游引物和SEQ ID No.4为下游引物扩增编码甲硫氨酸降解酶的基因，将其克隆至pYES2表达载体上，获得重组酵母表达载体pYES2-STR3。

步骤(2)中所述的酿酒酵母优选为酿酒酵母INVSc1；

步骤(3)中所述的诱导甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶的方式优选为用半乳糖诱导表达甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶；

所述的诱导的条件优选为：诱导前菌液OD600为0.4，半乳糖的浓度2％(w/v)，诱导表达温度为30℃，诱导时间为16小时。

步骤(3)中所述的纯化的方法包括如下步骤：清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱，用柱平衡缓冲液Lysis Buffer进行柱平衡；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液Lysis Buffer重悬，超声破碎，离心取上清以进行上样结合；上样完毕后，用含20mM咪唑的洗脱缓冲液将柱上的非特异性杂质洗去；用含200mM咪唑的洗脱缓冲液收集目的蛋白；将收集的目的蛋白过脱盐柱进行纯化并收集，得到纯化的甲硫氨酸降解酶；

其中，柱平衡缓冲液组分为：20mM Tris-HCl pH＝8.5，300mM KCl，10mMimidazole，10％glycerol，1mM PMSF；洗脱缓冲液组分为：20mMTris-HCl pH＝8.5，300mMKCl，20mM imidazole，10％glycerol，1mM PMSF。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：通过优化基因序列、表达载体和表达条件，获得的甲硫氨酸裂解酶STR3纯度达到90％以上，降解甲硫氨酸的效率是0.53±0.0030μM MTL·h^-1·mg protein^-1。目前真核生物中尚未有直接降解甲硫氨酸及其转氨产物KMBA合成甲基硫醇的报道。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“酶”和“蛋白质”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

附图说明

图1是甲硫氨酸的化学结构图。

图2是PCR扩增编码甲硫氨酸裂解酶基因的琼脂糖凝胶电泳图；M为DL5000。

图3是PCR筛选pYES2-STR3阳性单克隆琼脂糖凝胶电泳图；M为DL2000，N为水样阴性对照，其它为阳性克隆筛选结果。

图4是对甲硫氨酸裂解酶的质谱鉴定结果。

图5是优化条件下表达并纯化甲硫氨酸降解酶STR3的SDS-PAGE图；1：Marker，2：破碎细胞后离心得到的上清，3：流穿液(蛋白混合液经过结合柱没有结合部分)，4：镍柱纯化后的STR3。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1、实验材料

Clonostachys rosea(本发明人实验室分离、保存，GeneBank accession numberKT007105)；

酿酒酵母INVSc1和表达质粒pYES2购自Invitrogen公司(Improved method forhigh efficiency transformation of intact yeast cells.Nucleic Acids Res.1992,20:1425)。

实施例1甲硫氨酸裂解酶基因STR3的克隆及表达载体构建

(1)基于甲硫氨酸裂解酶氨基酸序列的保守性和密码子简并性，同源克隆黑孢块菌中甲硫氨酸裂解酶基因的保守序列，利用RACE技术扩增保守序列的5’和3’端，序列拼接后进行NCBI Blast，发现其与模式菌株中同源蛋白在氨基酸水平的一致性为78％。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

(2)表达质粒pYES2的提取

取1个装有10mL LB(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素100mg/L)培养基的试管，将含有pYES2质粒的E.coli Top10接种于试管中，在37℃、180rpm下过夜培养，按照质粒试剂盒中的方法提取质粒。质粒提取完成后将其做好标记放入4℃冰箱等待下一步使用。

(3)PCR扩增带有编码His标签的STR3。

PCR扩增反应体系：黑孢块菌基因组0.5μL、10×buffer 5μL、dNTPs 4μL、STR3-5’上游引物1μL、STR3-3’下游引物1μL、pfu聚合酶0.4μL、加ddH2O至50μL。

STR3-5’上游引物为

5’-CCCAACACAATGTCTGCCCCGCCTCCGCCAAATG-3’，

STR3-3’下游引物为

5’-CGCTTATTTGGCTGTGCGTGGAGTTCGTC-3’

下划线斜体为酶切位点HindIII和BamHI，加粗部分为编码His标签序列。

PCR扩增条件：94℃预变性10min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；最后延伸72℃5min。

将PCR产物STR3-His通过琼脂糖凝胶电泳检测正确后(图2)利用试剂盒回收PCR产物。

(4)表达载体构建及转化

采用BamHI和HindIII双酶切表达质粒和PCR产物后，利用PCR产物回收试剂盒回收酶切产物，建立酶连体系：pYES2和STR3混合酶切产物8μL、10×T₄DNA连接酶缓冲液1μL、T₄DNA连接酶1μL。将酶连体系放入16℃的恒温干浴锅中，处理8h后，酶连产物加入E.coliTop 10感受态细胞。将EP管重置于冰中30min，然后放入42℃水浴热激30s，再放入冰中静置2min。每管加入500μL LB培养基，在37℃、180rpm摇床培养60min；然后4000rpm离心4min，取400μL上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素100mg/L的LB平板上，在37℃恒温箱中培养10-12h。

(5)阳性克隆的筛选

将平板上长出的单菌落接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养6h，挑取菌落进行PCR检测(图3)。以ddH₂O作为阴性对照，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增出目的条带分子量大约在1.4kb，则初步证明载体构建成功。

将正确条带所对应的菌落活化，保菌送去测序，测序序列结果显示载入的STR3-His片段长度为1386bp，表明表达载体pYES2-STR3构建成功。

实施例2甲硫氨酸降解酶的表达纯化

(1)酵母感受态细胞的制备

将保存的酿酒酵母INVSc1在YPD固体培养基上活化，转接三次后，接种到YPD液体培养基中，30℃，200rpm，摇床振荡培养至OD₆₀₀＝1.0，收集细胞，利用预冷的超纯水洗涤细胞，并将其重悬在200μL 1M山梨醇溶液中，制备酿酒酵母感受态细胞。

YPD培养基配方：Yeast Extract10g，Trypton 20g，121℃高压灭菌20min，加入2％(w/v)葡萄糖。

(2)酿酒酵母过表达STR3质粒的转化

提取E.Coli Top10中的pYES2-STR3质粒，将提取的质粒转入酿酒酵母感受态中，轻轻混匀，加入预冷的0.2cm电极杯中，在超净台上轻轻敲击使混合物流到电极杯底部，冰浴5min。将电击杯置于电转化仪中，1.5kV，5mS，作指数衰减脉冲转化。迅速加入1mL预冷的1M山梨醇至电极杯中，分别将内容物转移至灭菌的1.5mL EP管中。取300uL涂于缺少尿嘧啶的SC培养基上，30℃倒置培养2-3d，挑选平板上长出的转化子进行扩大培养。

SC培养基成份：0.67％yeast nitrogen base(without amino acid),2％(葡萄糖或棉籽糖)。

(3)甲硫氨酸降解酶的诱导

将活化后的全部菌液接种于50mL缺少尿嘧啶的SC液体培养基中继续活化24h，取全部菌液接种于200mL Sc-U中继续活化24h。4000rpm离心5min收集菌体接种于1L SC诱导培养基中，并加入2％半乳糖进行诱导培养，30℃、200rpm诱导16h。用高速冷冻离心机(J-26XP，Beckman)400rpm、4℃离心15min收集诱导后的菌体。

(4)甲硫氨酸降解酶的纯化

将收集的菌体在液氮中速冻并充分研磨，研磨后加入25mL的Lysis buffer重悬；进行超声破壁(运行3秒，停3秒，99个循环)至溶液变为半透明状态为止；超声结束后在4℃，12000rpm离心1h，收集破碎细胞后离心得到的上清。

准备Ni-NTE柱，超纯水洗3遍，Lysisi buffer洗3次。将上清过Ni-NTE柱，流穿两次，，收集蛋白混合液经过结合柱没有结合部分；用Wash buffer冲洗镍柱，除去镍柱上的杂蛋白，每次3mL，洗3次；用Eluntion buffer洗脱目标条带，获得纯化的STR3，继而通过脱盐柱去除Elution buffer中的咪唑。

纯化蛋白所用缓冲液：

Lysisi buffer组分为：20mM Tris-HCl(pH＝8.5)，300mM KCl，10mM咪唑，10％甘油，1mM PMSF；Wash Buffer组分为：20mM Tris-HCl(pH＝8.5)，300mM KCl，20mM咪唑，10％甘油，1mM PMSF；

Elution Buffer组分为：20mM Tris-HCl(pH＝8.5)，300mM KCl，200mM咪唑，10％甘油，1mM PMSF；

(5)甲硫氨酸降解酶的得率

采用BCA法对通过镍柱纯化的STR3洗脱液浓度进行测定，浓度为0.67mg/L，共收集了9mL蛋白洗脱液，蛋白最终质量为6.03g；因为出发菌液体积为1L，所以计算得到甲硫氨酸降解酶的得率为6.03g/L。

(6)甲硫氨酸降解酶的酶学特性分析

以甲硫氨酸作为底物，检测STR3的脱巯基效果，5mL酶促反应体系包括：1μg/mLSTR3,50mM Tris-HCl(pH8.0),5μM PLP和20mM甲硫氨酸。酶促反应体系置于温度为25℃条件下反应1h，利用气相色谱检测产物甲基硫醇，检测方法参考(Liu RS,et al.Metabolismof L-methionine linked to the biosynthesis of volatile organic sulfur-containing compounds during the submerged fermentation of Tubermelanosporum.Appl Microbiol Biotechnol 2013,97:9981-9992.)。计算结果本发明制备的甲硫氨酸的降解效率为0.53±0.0030μM MTL·h^-1·mg protein^-1。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工业大学

<120> 甲硫氨酸裂解酶及其编码基因和生物合成方法

<130> tqzx--0026

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

atgtctgccc cgcctccgcc aaatggcgac gccaattcat cctccgcaga cgacaagaag 60

tcaaacccat tgctgaagcg agtcgacctc gatggacacg accttcctcc ctcaccagcc 120

ccgtctagtc cccgaaacgg acgtcgcaga tatgccctgg ccactgagct agtatacact 180

gacagcaaag atcaatatgg tgcttcgagc atccctattt accagtcagc caccttcaaa 240

cagaccagcg caagcggcgg acaggctgag tatgattaca ctcggtctgg aaatcctacc 300

cgaacccatc tagaacgcca tcttgccaag attatgaatg ccaatcgtgc cctagccatc 360

agctcgggca tgggtgcact cgacgtgatc acccgtctgc tacgaccagg tgacgaggtc 420

atcaccggcg atgatcttta cggtggtact cacagactct tgacgtatct ggcaagtaac 480

cagggaatca ttgtccatca tgtcgacacg accgacgccg agacggtcaa ggcacgcatt 540

tcggacaaga ctgctatggt cctcctcgaa acacctacaa accctcttat caagatcgtt 600

gatatcccaa caatcgcccg gaatgcccac gaagcaaatg agaaggctct tgttgttgtt 660

gataacacaa tgctctcccc aatgctgtta aaccccctcg acctcggtgc tgacatcgtt 720

tacgagtcgg gtaccaagta cctctcgggt catcacgaca tcatggctgg tgtgattgca 780

gtaaatgatg ttgagattgg taacaaacta ttcttcacta tcaattcaac tggctgcggt 840

ctgtcaccca atgactcatt ccttctcatg agaggagtca agactcttgc cattcgtatg 900

gagaagcaac agaccaatgc ccaggctatt gccgaatttc tcgagtcgca cggattccga 960

gttcgatatc ccggacttaa aagccatcct caatatgacc tacactggtc aatggcccgt 1020

ggcgctggag ctgtcctgtc cttcgaaacc ggtgacccaa cagtatccca acgaatcgtt 1080

gaggcggcaa gactgtgggc catcagcgtc agttttggat gtgtcaacag tctcattagc 1140

atgccttgcc agatgagcca tgcgagtatt gatgccaaga caagaagaga aagacagatg 1200

ccggaagata tcattcgtct atgcgttggt atcgaagatc ctgctgactt gattgacgat 1260

ctgtcccgcg ctctggttca agctggtgcc gtaaaagtga ctttggacgg ttttcatgcg 1320

acaggtgctg ctgaagagct tggacgaact ccacgcacag ccaaacacca ccaccaccac 1380

cactaa 1386

<210> 2

<211> 461

<212> PRT

<213> Clonostachys rosea

<400> 1

Met Ser Ala Pro Pro Pro Pro Asn Gly Asp Ala Asn Ser Ser Ser Ala

1 5 10 15

Asp Asp Lys Lys Ser Asn Pro Leu Leu Lys Arg Val Asp Leu Asp Gly

20 25 30

His Asp Leu Pro Pro Ser Pro Ala Pro Ser Ser Pro Arg Asn Gly Arg

35 40 45

Arg Arg Tyr Ala Leu Ala Thr Glu Leu Val Tyr Thr Asp Ser Lys Asp

50 55 60

Gln Tyr Gly Ala Ser Ser Ile Pro Ile Tyr Gln Ser Ala Thr Phe Lys

65 70 75 80

Gln Thr Ser Ala Ser Gly Gly Gln Ala Glu Tyr Asp Tyr Thr Arg Ser

85 90 95

Gly Asn Pro Thr Arg Thr His Leu Glu Arg His Leu Ala Lys Ile Met

100 105 110

Asn Ala Asn Arg Ala Leu Ala Ile Ser Ser Gly Met Gly Ala Leu Asp

115 120 125

Val Ile Thr Arg Leu Leu Arg Pro Gly Asp Glu Val Ile Thr Gly Asp

130 135 140

Asp Leu Tyr Gly Gly Thr His Arg Leu Leu Thr Tyr Leu Ala Ser Asn

145 150 155 160

Gln Gly Ile Ile Val His His Val Asp Thr Thr Asp Ala Glu Thr Val

165 170 175

Lys Ala Arg Ile Ser Asp Lys Thr Ala Met Val Leu Leu Glu Thr Pro

180 185 190

Thr Asn Pro Leu Ile Lys Ile Val Asp Ile Pro Thr Ile Ala Arg Asn

195 200 205

Ala His Glu Ala Asn Glu Lys Ala Leu Val Val Val Asp Asn Thr Met

210 215 220

Leu Ser Pro Met Leu Leu Asn Pro Leu Asp Leu Gly Ala Asp Ile Val

225 230 235 240

Tyr Glu Ser Gly Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His His Asp Ile Met Ala

245 250 255

Gly Val Ile Ala Val Asn Asp Val Glu Ile Gly Asn Lys Leu Phe Phe

260 265 270

Thr Ile Asn Ser Thr Gly Cys Gly Leu Ser Pro Asn Asp Ser Phe Leu

275 280 285

Leu Met Arg Gly Val Lys Thr Leu Ala Ile Arg Met Glu Lys Gln Gln

290 295 300

Thr Asn Ala Gln Ala Ile Ala Glu Phe Leu Glu Ser His Gly Phe Arg

305 310 315 320

Val Arg Tyr Pro Gly Leu Lys Ser His Pro Gln Tyr Asp Leu His Trp

325 330 335

Ser Met Ala Arg Gly Ala Gly Ala Val Leu Ser Phe Glu Thr Gly Asp

340 345 350

Pro Thr Val Ser Gln Arg Ile Val Glu Ala Ala Arg Leu Trp Ala Ile

355 360 365

Ser Val Ser Phe Gly Cys Val Asn Ser Leu Ile Ser Met Pro Cys Gln

370 375 380

Met Ser His Ala Ser Ile Asp Ala Lys Thr Arg Arg Glu Arg Gln Met

385 390 395 400

Pro Glu Asp Ile Ile Arg Leu Cys Val Gly Ile Glu Asp Pro Ala Asp

405 410 415

Leu Ile Asp Asp Leu Ser Arg Ala Leu Val Gln Ala Gly Ala Val Lys

420 425 430

Val Thr Leu Asp Gly Phe His Ala Thr Gly Ala Ala Glu Glu Leu Gly

435 440 445

Arg Thr Pro Arg Thr Ala Lys His His His His His His

450 455 460

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

cccaagctta acacaatgtc tgccccgcct ccgccaaatg 40

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

cgcggatcct tagtggtggt ggtggtggtg tttggctgtg cgtggagttc gtc 53

Claims

1.一种源于真菌的甲硫氨酸裂解酶的编码基因，其特征在于：其cDNA序列为SEQ IDNo.1所示的核苷酸。

2.含有权利要求1所述编码基因的重组表达载体。

3.按照权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述的重组表达载体是重组酵母表达载体。

4.含有权利要求2所述重组表达载体的重组宿主细胞。

5.按照权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述的重组宿主细胞是重组酿酒酵母细胞。

6.由权利要求1所述编码基因编码的甲硫氨酸裂解酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

7.一种生物合成权利要求6所述甲硫氨酸裂解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将甲硫氨酸裂解酶的编码基因克隆至酵母表达载体中，构建得到表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体；

(2)将所构建的表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体转化到酿酒酵母中，得到甲硫氨酸裂解酶的表达菌；

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将SEQ ID No.1所示的核苷酸通过HindIII和BamHI双酶切定向克隆至酵母表达载体pYES2，得到过表达甲硫氨酸裂解酶的重组酵母表达载体pYES2-STR3；

步骤(2)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母INVSc1；

步骤(3)中所述的诱导甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶的方式为用半乳糖诱导表达甲硫氨酸裂解酶的表达菌表达甲硫氨酸裂解酶。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的重组酵母表达载体pYES2通过以下方法构建得到：

以黑孢块菌的基因组为模板，用SEQ ID No.3为上游引物和SEQ ID No.4为下游引物扩增编码甲硫氨酸降解酶的基因，将其克隆至pYES2表达载体上，获得重组酵母表达载体pYES2-STR3；

步骤(3)中所述的诱导的条件为：诱导前菌液OD600为0.4，按w/v计，半乳糖的浓度2％，诱导表达温度为30℃，诱导时间为16小时。

10.按照按照权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的纯化的方法包括如下步骤：清洗并再生的HisTrap FF Ni-柱，用柱平衡缓冲液Lysis Buffer进行柱平衡；平衡完毕后，将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液Lysis Buffer重悬，超声破碎，离心取上清以进行上样结合；上样完毕后，用含20mM咪唑的洗脱缓冲液将柱上的非特异性杂质洗去；用含200mM咪唑的洗脱缓冲液收集目的蛋白；将收集的目的蛋白过脱盐柱进行纯化并收集，得到纯化的甲硫氨酸裂解酶。

11.按照权利要求10所述的方法，其特征在于：柱平衡缓冲液组分为：20mM Tris-HClpH＝8.5，300mM KCl，10mM imidazole，10％glycerol，1mM PMSF；洗脱缓冲液组分为：20mMTris-HCl pH＝8.5，300mM KCl，20mM imidazole，10％glycerol，1mM PMSF。

12.权利要求6所述的甲硫氨酸裂解酶在降解甲硫氨酸中的应用。