CN107354137A - 一种高活性的硒代蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高活性的硒代蛋白及其制备方法，所述高活性硒代蛋白分子中含有硒(Se)，并且每克所述高活性硒代蛋白分子中含有硒50～5000μg。本发明提供的高活性硒代蛋白的生物活性显著高于普通的蛋白。本发明还提供了一种简单、稳定的制备高活性硒蛋白的方法。

Description

一种高活性的硒代蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种高活性的硒代蛋白及其制备方法。

背景技术

硒(Selenium,Se)是哺乳动物必需的微量元素之一，现代医学研究证明，硒对癌症、心脑血管疾病、克山病、大骨节病等疾病均有防治作用。现有的研究发现，直接利用无机硒盐补硒具有一定的毒性，通过食物链补硒是解决缺硒问题的重要途径，但天然食物中的硒含量普遍较低，因此本领域技术人员大多致力于开发富硒功能产品，以满足人体对硒的需要。

在天然状态下，硒是通过硒蛋白(Selenoprotein)来发挥其生理功能的。天然存在的硒蛋白是一类特殊的蛋白质，蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine,SeCys)的形式存在。SeCys大多位于蛋白的活性中心，对蛋白的结构和功能起重要的作用。天然存在的硒蛋白中，SeCys由一个特殊的密码子--位于开放读码框(ORF)内的UGA密码子来编码(在一般蛋白质中UGA作为终止密码子起作用)，在翻译的同时掺入到正在合成的多肽链中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性的硒代蛋白、其制备方法及其应用。根据本发明的硒代蛋白优选为非天然存在的硒代蛋白，即在天然状态下此类蛋白中一般不含有硒或硒代的氨基酸。

在本发明的第一方面，提供了一种高活性硒代蛋白，所述高活性硒代蛋白中含有硒(Se)，所述硒代蛋白中的硒含量为5～5000μg/g。

在另一优选例中，与所述高活性硒代蛋白对应的野生型(天然)蛋白中不含硒。

在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白的生物活性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，优选地提高了30％以上，更优选地提高了50％。

在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白的稳定性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，优选地提高了30％以上，更优选地提高了50％。

在另一优选例中，所述硒代蛋白选自下组：硒代酶(如，SOD、重组天门冬酰胺酶)、硒代抗体或其活性片段(免疫球蛋白，如曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、尼妥株单抗)、硒代多肽抗原、硒代多肽类受体、硒代多肽类配体、多肽类药物(如重组人粒细胞刺激因子、重组干扰素)。

在另一优选例中，所述硒代的酶包括：硒代超氧化物歧化酶、重组天门冬酰胺酶。

在另一优选例中，所述硒代蛋白中的硒共价结合于所述硒代蛋白的氨基酸残基上。

在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白中的一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基、和/或一个或多个半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代，从而形成所述高活性硒代蛋白。

在另一优选例中，每克所述高活性硒代蛋白中含有硒10～3000μg；优选地含有20～1000μg；更优选地含有100～800μg；最优选地含有300～600μg。

在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为硒代超氧化物歧化酶，所述硒代超氧化物歧化酶中包含硒代的氨基酸残基，所述硒代氨基酸残基中的硫(S)被硒取代，所述硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.2。

在另一优选例中，所述超氧化物歧化酶中，还包括选自下组的一个或多个硒代的氨基酸残基：第1位的甲硫氨酸氨基酸残基、第195位的甲硫氨酸氨基酸残基和第197的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.2。

本发明的第二方面，提供了一种制备高活性硒代蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供一表达所述蛋白的细胞；

(ii)在含硒培养液中培养所述细胞，从而使所述细胞表达高活性硒代蛋白；和

(iii)分离并纯化所述高活性硒代蛋白。

在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为本发明第一方面所述的高活性硒代蛋白。

在另一优选例中，所述步骤(ii)的含硒培养液中的硒为无机硒，优选为亚硒酸和/或亚硒酸盐(如，亚硒酸钠)。

在另一优选例中，所述细胞为原核细胞、或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞包括：大肠杆菌、放线菌等。

在另一优选例中，所述真核细胞包括：酵母细胞、动物细胞(如，CHO细胞)，植物细胞等。

在另一优选例中，所述细胞为具有外源的所述蛋白的编码基因的基因工程细胞。

在另一优选例中，所述方法的步骤(ii)中，含硒培养液中硒含量为约10μg/ml～500μg/ml；优选地为约20μg/ml～200μg/ml；更优选地为约50μg/ml～150μg/ml；最优选地为约80μg/ml～140μg/ml。

在另一优选例中，所述步骤(1)包括步骤：

(a)将外源的所述蛋白的编码基因导入宿主细胞中，从而获得表达所述蛋白的基因工程细胞；和

(b)对步骤(a)获得的基因工程细胞进行耐硒的筛选和/或驯化。

在另一优选例中，所述步骤(b)中，总计进行n轮(1≤n≤20)的筛选和驯化：

其中，第1轮筛选和驯化：将表达所述蛋白的基因工程细胞在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为C1，C1为约5μg/ml～20μg/ml；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为C1'；C1'＝C1+X1，X1为约5μg/ml～20μg/ml；

第2轮筛选和驯化：将第一轮筛选出的表达所述蛋白的基因工程细胞的单一菌落在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为C2，C2＝C1'；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为C2'；C2'＝C2+X2，X2为约5μg/ml～20μg/ml；

……；

第n轮筛选和驯化：将第n-1轮筛选出的表达SOD的基因工程细胞的单一菌落在液体培养基中进行培养，所述液体培养基中硒浓度为Cn，Cn＝C(n-1)'；然后将菌液涂布于固体培养基上，培养获得单一菌落，所述固体培养基中硒浓度为Cn'；Cn'＝Cn+Xn，Xn为约5μg/ml～20μg/ml；第n轮筛选和驯化培养出的单一菌落用作步骤(ii)的种子。

在另一优选例中，所述方法的步骤(ii)中，含硒培养液中硒含量为Cn'。

本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物中含有本发明第一方面所述的高活性硒代蛋白。

在另一优选例中，所述组合物中还包括保护剂，优选地所述保护剂包括选自下组的一种或多种：脱脂奶粉、海藻糖、和L-半胱氨酸(或其盐)。

在另一优选例中，所述组合物为试剂组合物、药物组合物、保健品组合物、食品组合物、饲料组合物或化妆品组合物。

在另一优选例中，所述组合物为液体制剂、粉剂或片剂。

本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的高活性硒代蛋白、本发明第三方面所述的组合物的用途，用于制备试剂、食品、药物、或保健品。

本发明的第五方面，提供了一种高活性超氧化物歧化酶(SOD)，所述高活性超氧化物歧化酶中包含一个或多个硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或一个或多个硒代的半胱氨酸氨基酸残基，硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或硒代的半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代。

在另一优选例中，硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQ IDNO.2。

在另一优选例中，所述超氧化物歧化酶中，还包括选自下组的一个或多个硒代的氨基酸残基：第1位的甲硫氨酸氨基酸残基、第195位的甲硫氨酸氨基酸残基和第197的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.2。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了质粒构建的电泳图谱；泳道1为分子量标记，泳道2为目标核酸序列。

图2显示了SOD的SDS-PAGE图谱。

图3显示了高活性的硒代SOD纯化的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现将表达正常蛋白的细胞在含硒的培养基中进行培养，能够获得硒代的蛋白，而且所获得的硒代的蛋白具有显著提高的生物活性。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

硒代蛋白

天然存在的硒蛋白(Selenoprotein)是一类特殊的蛋白质，蛋白中的硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine,SeCys)的形式存在。天然状态下，由一个特殊的密码子编码硒代半胱氨酸，在蛋白翻译的同时掺入到正在合成的多肽链中形成硒蛋白。

本文中“硒代蛋白”优选地不包括天然存在的硒蛋白，指通过人工的方法基于不含硒的野生型蛋白制备的含有硒元素的蛋白。在本发明的一个优选地实施方式中，野生型蛋白中的一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基、和/或一个或多个半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代，从而形成所述硒代蛋白。与本发明中硒代蛋白对应的野生型蛋白可以是酶、抗体或其活性片段、多肽抗原或其活性片段、多肽类受体或配体、多肽类药物等。

具体的根据本发明的硒代蛋白的例子如：超氧化物歧化酶、重组天门冬酰胺酶、重组人粒细胞刺激因子、重组干扰素、单克隆抗体(免疫球蛋白，如曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、尼妥株单抗)等。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)

一个硒代蛋白的具体例子是超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)，SOD是一种含有金属催化活性中心的蛋白酶，广泛存在于生物体内，可以催化发生岐化作用形成H₂O₂和O₂它是一种清除体内过量的自由基的过程，具有防止氧损伤毒害作用。SOD广泛运用于化妆品、食品保健品及药品。

SOD具有抗氧化、防衰老、抗炎、抗肿瘤等作用，hMn-SOD位于细胞线粒体基质，可以清除来至线粒体呼吸链产生的自由基。Mn-SOD对于维持线粒体的自由基平衡，保护线粒体的DNA及蛋白质免受氧损伤毒性具有重要意义。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述SOD具有以下氨基酸序列：

MKHSLPDLPYDYGALEPHINAQIMQLHHSKHHAAYVNNLNVTEEKYQEALAKGDVTAQIALQPALKFNGGGHINHSIFWTNLSPNGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDKFKEKLTAASVGVQGSGWGWLGFNKERGHLQIAACPNQDPLQGTTGLIPLLGIDVWEHAYYLQYKNVRPDYLKAIWNVINWENVTERYMACKK(SEQ ID NO.:2)，优选地，其编码核苷酸序列如下：

AAACATAGCCTGCCGGATCTGCCGTATGATTATGGTGCACTGGAACCGCATATTAATGCACAGATTATGCAACTGCATCATTCCAAACATCATGCAGCCTATGTGAATAATCTGAACGTGACCGAAGAGAAATATCAAGAGGCACTGGCAAAAGGTGATGTTACCGCACAGATTGCACTGCAGCCTGCACTGAAATTTAACGGTGGTGGTCATATTAACCACAGCATTTTTTGGACCAATCTGAGCCCGAATGGTGGTGGTGAACCGAAAGGTGAACTGCTGGAAGCAATTAAACGTGATTTTGGCAGCTTTGATAAATTCAAAGAGAAACTGACCGCAGCAAGCGTTGGTGTTCAGGGTAGCGGTTGGGGTTGGCTGGGTTTTAACAAAGAACGTGGTCATCTGCAAATTGCAGCATGTCCGAATCAGGACCCGCTGCAGGGCACCACCGGTCTGATTCCGCTGCTGGGTATTGATGTGTGGGAACATGCATATTATCTGCAGTATAAAAACGTGCGTCCGGATTATCTGAAAGCCATTTGGAATGTGATTAACTGGGAAAATGTGACCGAACGTTATATGGCCTGCAAAAAA(SEQ ID NO.:1).

本发明中的SOD不仅限于具有上述SEQ ID NO.:2所示序列的多肽，还包括含有该序列的融合蛋白、其活性片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持野生型SOD(序列如SEQ ID NO.:2所示)的生物学功能或活性的多肽(如保守性变异体)。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

在本发明中，“保守性变异体”指与本发明中的SOD氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码上述SOD的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的SOD成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的SOD的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

高活性超氧化物歧化酶(SOD)的制备

将表达上述SOD的宿主细胞，在含硒的环境下进行培养，即可获得本发明的高活性超氧化物歧化酶(SOD)。

在一个优选的实施方式中，培养方法包括步骤：在将SOD宿主菌接种到含有终浓度为2～10mM(优选为7.5mM)的Mn²⁺的培养基中培养至OD_600nm到0.4-0.6，加入亚硒酸钠(如，终浓度为30μg/ml)及IPTG(如0.01mM)在28℃条件下诱导硒代SOD的表达(约12h)，可获得硒代的高活性的SOD蛋白。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物、保健品组合物、食品组合物或化妆品组合物。它含有上述的硒代蛋白，以及载体或赋形剂。这些载体应当是药学上、食品学上或化妆品上可接受的。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和人体可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的硒代蛋白以及人体可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效的剂量量施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

食品组合物或化妆品组合物也可根据本领域中的常规方法进行配制。

本发明的主要优点在于：

(1)提供了一类硒代蛋白，该硒蛋白表现出了显著优于天然蛋白的活性。

(2)提供了一种简单、稳定的制备高活性硒代蛋白的方法。

(3)首次披露了一种高活性超氧化物歧化酶(SOD)，其活性比普通的SOD高出了50％以上；

(4)硒元素具有多种生理活性，硒代氨基酸在SOD序列中的取代，使得SOD可能兼具有机硒元素所特有的活性。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1hMn-SOD基因的获得和质粒构建

hMn-SOD基因的获得：通过NCBI查阅SOD基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示)其中在SOD基因中含有3个甲硫氨酸和2个半胱氨酸可以用于硒代并且在基因的两侧设计了限制性酶切位点。利用化学法合成基因序列,名为为T-SOD。将T-SOD转化到DH5α菌株(购自天根生化科技有限公司)中克隆基因片段。

高表达质粒pET28a-h Mn-SOD构建：

本实施例中采用的是pET28a质粒(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)是一种重组蛋白表达量比较高的表达质粒，表达载体具有卡那霉素(Kan)抗性的标签通过限制性内切酶Xhol Ⅰ-NdeⅠ双切pET28a和SOD基因，利用T4连接酶将SOD片段连接到载体上，构建含有his-tag的表达载体，通过PCR及酶切验证表达质粒构建成功电泳图如图1。

实施例2表达宿主菌

本实施例中使用的是BL21(DE3)的基因工程菌(购自CICC23796)，诱导剂是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)通过控制T7RNA聚合酶控制含T7启动子的pET系列质粒的重组蛋白的表达情况。

通过热击转化法将实施例1中获得的表达质粒转化到CaCl₂制备的BL21感受态中，涂布于卡纳霉素抗性的LB(蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂条2％)平板上，抗性筛选出含有质粒的BL21菌株。通过37℃预表达表达出(经酶活测定)含有活性的SOD的蛋白。SOD的SDS-PAGE图谱如图2所示；对照组是37℃下非诱导的破壁上清液和沉淀物中的hMn-SOD；实验组是37℃下诱导的上清液和沉淀物hMn-SOD。对照组和实验组比较发现对照组中hMn-SOD本底表达及可溶性表达都是比较低，实验组hMn-SOD蛋白总体表达量很高。实验组中上清表示：hMn-SOD可溶性表达蛋白条带；实验组中沉淀表示：hMn-SOD高温条件以包涵体的形式的蛋白表达情况，主要因为表达温度较高，蛋白以包涵体的形式表达。

实施例3耐硒表达菌种的筛选和驯化

表达菌种在硒压力下筛选,在10μg/ml亚硒酸钠的液体LB培养基下培养，取少量的菌液稀释涂布于含有20μg/ml亚硒酸钠的固体LB培养基(含Kan100ug/ml)在37℃的培养箱中过夜培养，第二天挑取长得比较大的且相对较白的菌落到96深孔板内(亚硒酸钠含量20μg/ml)LB培养基37℃240r/min震荡培养12h。用排枪取200μl的培养液于酶标仪下测定生长OD值，OD相对高的菌种用于涂平板(平板亚硒酸钠的含量提高10μg/ml)，依次不断经过多轮的筛选驯化，获得了在140μg/ml的亚硒酸钠(约为63.1μg/ml的硒)的条件下生长的菌株，甘油管保存菌种。

实施例4硒代蛋白的表达和纯化

挑取筛选耐硒表达宿主菌菌落在含有5ml的(含Kan100ug/ml)中在LB液体培养基37℃220r/min过夜培养作为表达培养种子。按5‰的接种量接种于含有200ml的LB液体培养基750ml摇瓶中(含Kan100ug/ml，亚硒酸钠30μg/ml)37℃220r/min到OD＝0.2-0.8值时大约时间为2.5h左右。加入终浓度为IPTG 0.01mM、Mn²⁺2mM在最适温度28℃条件下诱导14-16h表达积累SOD蛋白。

离心收集菌体按1/10的比例加入磷酸盐缓冲溶液(50mM KH₂PO₄,K₂HPO₄)超声破碎65％功率超声3s停5s超声15min。在4℃条件下10000r/min离心15min，取上清溶液即为含SOD的可溶性蛋白粗酶液。纯化蛋白用Ni-NTA柱纯化SOD蛋白，用10mM的咪唑盐平衡柱子，将离心好的蛋白上清上样，最后先用(10mM、20mM、50mM、100mM、150mM)低浓度的咪唑盐清洗杂蛋白，每一个柱体积收集一管SDS-PAGE及280nm处测定蛋白的吸收值，最后测定在200mM、250mM的咪唑盐浓度下洗脱SOD蛋白且杂蛋白含量比较少。收集洗脱液，于10K的超滤管4℃4000r/min浓缩除咪唑盐。纯化SDS-PAGE图谱如图3所示：a为指示蛋白条带大小的Marker，b为上样蛋白，c-i为洗脱纯化的SOD蛋白液。由图可知在蛋白比较纯，基本没有杂蛋白存在，通过Ni-NTA柱纯化可以达到一定的纯度要求的SOD的目的蛋白。最终，本实施例中制备了纯度超过98％的高活性的硒代SOD。

实施例5硒代蛋白的比活测定

对hMn-SOD的酶活测定通过T-SOD试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号A0001-1)及Bradford测定蛋白浓度试剂盒(购自上海生工公司，货号C100530-0100)测定和邻苯三酚自氧化法测定SOD两种方法测定纯化后正常的SOD及硒代SOD的比活，测定结果为：正常的SOD比活为2521.5U/mg、硒代的SOD比活为3844U/mg，硒代的SOD比活要提高50％以上。

为排除无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒代甲硫氨酸)对SOD酶活力影响。在测定正常SOD蛋白样品中酶活时，分别加入不同浓度的(0、10、30、50μg/ml)亚硒酸钠测定酶活力差异。

另外向蛋白破碎样品中分别加入不同浓度的硒代甲硫氨酸及甲硫氨酸(20、2、0.2、0.02、0mg/ml)检测其对SOD酶活影响。

测定结果表明：无机硒亚硒酸钠及硒代甲硫氨酸对SOD酶活均没有影响。

实施例6硒代蛋白的硒测定

利用国标法即荧光分光光度法测定纯化后蛋白的含硒量，测定硒之前是先测定SOD的蛋白含量，通过试剂盒法测定蛋白浓度后，根据浓度取相关的蛋白体积量用于测定硒含量。利用亚硒酸钠0-1ug测定在520nm的吸收值的标准曲线。测定样品用硝酸在200℃条件下消解完全大概需要3h左右的时间，加入一定的浓盐酸还原过氧化的硒。加入EDTA液调节pH到1.5-2.0之间，加入DAN在沸水的条件下与硒反应10min形成荧光物质，环己烷萃取荧光物质在520nm下测定荧光吸收值，测到蛋白的硒含量。

亚硒酸钠0-1.0μg通过国标法测定荧光吸光度的标准曲线。公式y＝61.2X²+1.9 R2＝0.9995

测得硒代SOD硒含量可以达到0.4627μg/mg。

实施例7硒代蛋白的高密度发酵

高密度发酵培养基配方：Na₂HPO₄·12H₂O g/L 12.9g/L,，KH₂PO₄ 5.8g/L，(NH₄)₂SO₄ 3.0g/L，CaCl₂ 0.01g/L，MgSO₄ 0.24g/L，甘油2g/L，黄豆粉4g/L，玉米浆6g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L。补料培养基：MgSO₄ 2.6g/L，甘油700g/L，黄豆粉25g/L，玉米浆25g/L

一级种子：挑取筛选的耐硒表达宿主菌菌落在含有5ml的(含Kan 100μg/ml亚硒酸钠30μg/ml)LB液体培养基中37℃220r/min过夜培养作为表达培养种子。

二级种子：按5％的接种量接种于含有150ml的LB液体培养基750ml摇瓶中(含Kan 100μg/ml亚硒酸钠30μg/ml)37℃220r/min到OD＝3-5值时大约时间为3h左右。

罐高密度发酵：在7L的罐中加入了3L的培养基，121℃灭菌30min，按5％的接种量。调节溶氧并保持在30％-40％，罐压0.03Pa，最后随着菌体的生长，转速可达到800r/min，当菌体生长到OD＝50时加入终浓度IPTG 0.01mM、Mn²⁺2mM，28℃下诱导12h，最后监测OD＝118左右，收菌。

按照实施例4中的方法进行硒代SOD蛋白的纯化，经计算，每升发酵液可获得20000mg硒代SOD。检测表明，获得的硒代SOD的硒含量约为0.45μg/mg。

实施例8硒代位点的鉴定

对实施例4中得到的纯化的硒代SOD进行胰蛋白酶水解，并进行甲基化修饰和二硫键的还原，将SOD蛋白水解成若干肽段，随后进行质谱分析，将所得的信号响应与数据库进行搜索比对，从中筛选出相似度好，覆盖率广，可信度高的肽段。进一步搜索、分析得到上述肽段中的的硒代位点。

结果显示本发明的高活性SOD氨基酸序列中有两个氨基酸残基被硒代，硒代氨基酸残基中的硫被替换为了硒，即：第24位的Met硒代为硒代甲硫氨酸，第141位的Cys硒代为硒代半胱氨酸，其中氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.2。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种高活性硒代蛋白，其特征在于，所述高活性硒代蛋白中含有硒(Se)，所述硒代蛋白中的硒含量为5～5000μg/g；

优选地，所述高活性硒代蛋白的生物活性与不含硒的野生型对应蛋白相比提高了20％以上，更优选地提高了30％以上，最优选地提高了50％。

2.如权利要求1所述的高活性硒代蛋白，其特征在于，所述硒代蛋白选自下组：硒代酶(如，SOD)、硒代抗体或其活性片段、硒代多肽抗原、硒代多肽类受体、硒代多肽类配体、多肽类药物。

3.如权利要求1所述的高活性硒代蛋白，其特征在于，所述硒代蛋白中的硒共价结合于所述硒代蛋白的氨基酸残基上；

优选地，所述高活性硒代蛋白中的一个或多个甲硫氨酸氨基酸残基、和/或一个或多个半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代，从而形成所述高活性硒代蛋白。

4.在另一优选例中，所述高活性硒代蛋白为硒代超氧化物歧化酶，所述硒代超氧化物歧化酶中包含硒代的氨基酸残基，所述硒代氨基酸残基中的硫(S)被硒取代，所述硒代的氨基酸残基选自下组的一个或两个：第24位的甲硫氨酸氨基酸残基和第141的半胱氨酸氨基酸残基，其中氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.2。

5.一种制备高活性硒代蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供一表达所述蛋白的细胞；

(ii)在含硒培养液中培养所述细胞，从而使所述细胞表达高活性硒代蛋白；和

(iii)分离并纯化所述高活性硒代蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)的含硒培养液中的硒为无机硒，优选为亚硒酸和/或亚硒酸盐(如，亚硒酸钠)。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(ii)中，含硒培养液中硒含量为约10μg/ml～500μg/ml；优选地为约20μg/ml～200μg/ml；更优选地为约50μg/ml～150μg/ml；最优选地为约80μg/ml～140μg/ml。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的高活性硒代蛋白。

9.本如权利要求1所述的高活性硒代蛋白、权利要求3所述的的组合物的用途，其特征在于，用于制备试剂、食品、药物、或保健品。

10.一种高活性超氧化物歧化酶(SOD)，其特征在于，所述高活性超氧化物歧化酶中包含一个或多个硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或一个或多个硒代的半胱氨酸氨基酸残基，硒代的甲硫氨酸氨基酸残基和/或硒代的半胱氨酸氨基酸残基中的硫(S)被硒(Se)取代。