KR20120022453A - 신규한 ｍｄ-2 결합 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질과 특이적으로 결합하는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, MD-2 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 숙주세포 내에서 벡터를 발현시켜서 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 ＭＤ-2 결합 폴리펩타이드 및 이의 용도{Novel MD-2 binding polypeptide and the use thereof}

본 발명은 MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질과 특이적으로 결합하는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 구체적으로 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, MD-2 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 숙주세포 내에서 벡터를 발현시켜서 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

단백질은 생물의 생체 내 조절의 대부분을 맡고 있는 물질로서, 단백질 자체의 성질을 파악하거나 단백질과 다른 물질과의 상호작용을 연구하고 조절하는 기술은 각종 질병의 치료 등을 위해 최근 더욱 중요시되고 있다. 특히 세포 표면에서 발현되는 수용체 단백질을 타겟으로 이와 관련된 단백질 상호작용을 증진 또는 저해하여 세포 내로 전달되는 신호를 조절하려는 연구 및 이를 통한 치료제 개발에 많은 노력이 경주되고 있다. 세포 표면 수용체를 통한 대표적인 기작은 호르몬이나 면역 물질의 작용이 관여하는 기작이 대부분이므로, 이를 이용하여 면역관련 단백질 치료제가 활발히 개발되고 있다.

패혈증은 혈액 중에 다양한 세균이 침범하여 번식하면서 생산된 독성물질에 의해 중독증세를 나타내거나 전신에 감염증을 일으키는 질병을 말한다. 인체가 그람음성균에 감염되었을 때, 세균은 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)를 만들어내며, 이는 인체의 MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질과 결합한다. 상기 결합체는 다시 면역세포의 표면에 있는 TLR-4 (Toll-like receptor-4)와 결합하여 세포 내로 신호를 전달하게 된다. 상기 기작을 통해 세포 내로 전달된 신호는 세포 내에서 다양한 신호전달 경로를 거쳐 NK-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 등의 전사인자를 통해 다양한 면역 반응을 일으킨다. 이는 정상적인 면역 작용이지만, 순간적으로 그 정도가 과하게 될 때 전신적인 고열과 인체 내의 장기 손상을 통해 사망에 이를 수 있다. 패혈증은 전 세계적으로 중환자실 이환율 및 사망률의 주요한 원인으로 알려져 있고 미국의 경우 해마다 750,000명의 패혈증 환자가 발생하며 국내에서도 정확한 통계는 없지만 매우 높은 발병률을 나타내고 있다. 치사율 또한 40% 정도로 매우 높은 편이나, FDA 승인을 받은 치료제는 한가지뿐이며 세균을 제거하는 항생제 외에는 효과적인 치료제가 없는 상태로 아직까지 효과적인 치료법이나 치료 물질은 매우 부족한 실정이다. 세균의 LPS가 전달되는 다양한 신호전달 체계 중의 한 곳을 저해하는 치료제를 개발하기 위한 노력은 여러 가지로 진행되고 있으며 대표적으로 LPS와 유사한 구조로 MD-2에 결합하지만, 이후의 신호전달은 하지 못하게 하는 일본의 제약회사 에자이 (Eisai)가 개발 중인 패혈증 치료제 에리토란 (Eritoran)이 있다.

단백질의 상호작용을 조절하기 위해서는 기존의 단백질-단백질 결합을 모사하여 경쟁적으로 저해하는 방법과 타겟 단백질에 결합하여 성질을 바꿈으로써 조절하는 두 가지 방법이 있다. 상기 방법에 사용되는 물질로 부작용이 적고 해당 단백질에 특이적으로 작용하기 위해서는 저분자 화합물보다는 단백질 치료제가 더욱 적합하다. 이에 현재까지의 단백질 의약품은 대부분 특정 단백질에 결합하여 그 작용을 억제하거나 증진시키는 항체를 생산하는 데 집중되어 단백질 의약품의 50% 정도를 차지하고 있으나, 항체 생산 공정의 복잡함, 결합부위의 한계, 특허 진입장벽 등의 문제로 항체를 대체할 새로운 단백질 골격에 대한 연구가 확산되고 있는 실정이다.

LRR (Leucine Rich Repeat) 패밀리 단백질은 루이신이 일정한 위치에서 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 통틀어 이르는 용어로, 이러한 LRR 패밀리 단백질은 N-말단, 다양한 개수의 반복모듈 및 C-말단으로 구분된 조합이 안정적인 구조를 이루고 있다. LRR 패밀리 단백질은 이 중 반복모듈의 개수를 조절하고 C-말단의 모양을 바꾸며 다른 단백질과의 결합면적을 넓히고, 새로운 결합부위를 만들어낼 수 있는 특징을 가지고 있어 다양한 단백질 타겟에 대한 결합 단백질로 설계하기에 적합한 특성을 갖고 있다. 가변 림프구 수용체 단백질 (Variable Lymphocyte Receptor, VLR)은 LRR 패밀리 단백질의 일종으로 먹장어의 면역작용에 이용되어 다양한 단백질과 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다. 그러나, 상기 VLR의 생산 방법은 항원 물질을 주입한 후 장어에서 VLR을 추출하거나, 대장균에서 불용성 형태 (inclusion body)로 발현시켜 재접힘 (refolding) 후 사용하는 등 단백질 확보에 어려움이 있었다.

이러한 배경하에서 본 발명자들은 패혈증 치료 용도로 사용할 수 있는 대량 생산이 가능한 단백질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 인터날린이 결합된 VLR 골격 단백질을 이용하여, MD-2 단백질과 결합하는 신규한 단백질을 제조하고, 패혈증을 완화할 수 있는 용도를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 패혈증의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "인터날린 B 단백질"이란 리스테리아 (Listeria) 균주에서 발현되는 LRR (Leucin-rich repeat) 패밀리 단백질의 일종으로 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 B 단백질의 N-말단은 반복모듈의 접힘 (folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 모양을 가졌기 때문에 미생물에서 안정적으로 발현되는 것으로 생각되고 있다.

본 발명에서 용어, "인터날린 B 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 B 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프 (capping motif) 및 인터날린 B 단백질의 반복모듈을 의미한다. 인터날린 B 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 B 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 " ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" 및 반복모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN"을 포함할 수 있다. 상기 반복모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 친수성 아미노산을 의미한다. 인터날린 B 단백질의 N-말단은 융합하는 VLR (Variable Lymphocyte Receptor)의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.

본 발명에서 용어 "VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질"이란 먹장어와 칠성 장어에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종으로, 먹장어와 칠성 장어에서 면역 기능을 수행하는 단백질로서 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 주목받고 있다. 상기 인터날린 B 단백질의 N-말단 및 VLR 단백질이 융합된 폴리펩타이드는 인터날린 B 단백질이 융합되지 않은 VLR 단백질보다 수용성 및 발현양이 증가하여 이를 기반으로 한 신규한 단백질 치료제의 제조에 유용하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 단백질의 발현량이 인터날린 B 단백질의 N-말단과 융합하지 않은 경우 (3 mg/L)보다 20 배 이상인 60 mg/L로 발현양이 크게 증가하는 것을 확인하였다 (실시예 2-2 참조). 이와 같은 발현양의 향상은 본 발명의 폴리펩타이드를 이용할 경우 경제성이 크게 향상될 수 있음을 시사하는 것이며, 이와 같이 인터날린 B 단백질과 VLR 단백질이 융합된 융합 폴리펩타이드가 발현양이 증가하는 것은 본 발명자에 의해 최초로 개발된 것이다.

본 발명에서 용어 "VLR 단백질의 변형된 반복모듈"이란 VLR 단백질의 24개 아미노산으로 이루어진 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈에 있어서, MD-2와 원래 상호작용하는 것으로 알려진 TV3 단백질 중 MD-2와 결합하는 것으로 알려진 중요한 TV3 아미노산을 해당하는 VLR 단백질의 반복모듈에 이식한 것을 의미한다. 상기 반복모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 쓰레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것 뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 본 발명의 폴리펩타이드는 반복모듈의 아미노산 서열이 LRR 패밀리의 정의를 따르나, VLR 단백질의 변형된 반복모듈은 자연계에 존재하는 서열의 반복모듈을 조합한 것 또는 컨센서스 디자인을 통해 안정성을 높인 서열의 반복모듈을 조합한 것이다. 바람직하게는 컨센서스 디자인을 통해 구조적으로 중요한 아미노산들을 대부분 유지하고 변이 영역의 아미노산을 다양하게 설계한 것을 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 폴리펩타이드는 MD-2 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4 또는 5인 폴리펩타이드이다 (도 7 내지 10). 본 발명의 목적상 MD-2 단백질에 특이적으로 결합하는 활성을 유지하는 폴리펩타이드는 상기 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나의 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 폴리펩타이드도 본 발명의 범위에 들어가는 것은 자명하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 서열번호 2인 폴리펩타이드는 MD-2와 결합력(K_D)이 4.15 x 10^-8 M (도 4), 서열번호 3인 폴리펩타이드는 6.21 x 10^-8 M (도 3)로서, 기존의 MD-2와 결합하는 것으로 알려진 TV3의 결합력인 7.6 x 10^-8 M과 비교하여 별 차이가 없었으며, 반복모듈을 하나 더 추가한 서열번호 4 및 5도 MD-2와의 결합력이 유지되는 결과를 확인하였다 (도 5). 이와 같은 결과는 본 발명에서 새롭게 제조한 신규한 폴리펩타이드가 MD-2와 특이적으로 결합하는 특징이 있음을 입증하는 것이다.

본 발명에서 용어, "MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질"이란 LPS (Lipopolysaccharide)에 결합할 수 있는 수용체를 가진 당단백질로서, 결합한 LPS를 면역세포의 표면에 있는 TLR-4 (Toll-like receptor-4)에 전달시켜, 세포 내로 신호를 전달하게 하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 똑같이 MD-2에 결합하도록 아미노산을 설계한 단백질이라도 컨센서스 디자인이 포함된 반복모듈을 이용했을 때 수용성으로 많이 발현되는 결과를 확인하였다 (도 1).

바람직하게는 컨센서스 디자인을 통해 안정성을 높인 서열의 반복모듈은 하기 서열식 1의 반복모듈이다.

[서열식 1]

[LTNLxxLxLxxNQLQSLPxGVFDK]

상기 식에서, x는 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 VLR 반복모듈의 경우에는 컨센서스 부분을 고정하고 다양한 아미노산이 들어갈 수 있는 부분을 x라고 표시하였으며, 바람직하게는 MD-2 단백질과의 결합에 중요한 아미노산이다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 폴리펩타이드의 반복모듈의 개수는 다양하게 조절하여 이용할 수 있으며, 자연적으로 2 내지 9개의 모듈을 가지지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 반복모듈을 증가시켰을 경우에도, MD-2와의 결합력을 유지하면서, 자체의 안전성이 증가되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 5).

바람직하게는 상기 폴리펩타이드의 C-말단 부위는 다양하게 치환될 수 있으며, 특히 타겟 물질과 결합에 빈번하게 이용되는 루프 구조는 그 길이에 따라 다양하게 조절될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 목적상 상기 핵산은 서열번호 2, 3, 4 또는 5를 코딩하는 핵산 과 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖고 MD-2에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산 분자일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

바람직하게는 상기 벡터는 단백질 정제용 태그서열을 추가로 포함할 수 있으며, 단백질 정제용 태그서열은 이에 한정되는 것은 아니나, 그 예로 히스티딘-태그 서열 (His-tag), 인플루엔자 헤마글루티딘 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 HA-태그 및 FLAG-태그일 수 있으며, 바람직하게는 히스티딘-태그 서열이다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로 상기 핵산 서열은 도입되는 숙주세포에서 잘 발현되도록 숙주 세포에 맞추어 코돈 최적화된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "코돈 최적화"는 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 변화시키지 않고서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 활용을 반영하도록 상기 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변화시키는 것을 지칭한다. 코돈 최적화는 공지의 기술로 수행될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "형질전환" 또는 "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 숙주세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물을 사용 가능하며, 바람직하게는 대장균이나 이에 제한되는 것은 아니다. 선택되는 대장균은 융합되는 LRR 단백질의 종류에 따라 선택가능한데, 예를 들어 LRR 단백질의 C-말단이 이황화결합을 가지고 있는 종류일 경우에 이의 발현을 도와주기 위해 대장균 유전체의 관련 효소에 변형이 가해진 균주를 선정하는 것이 효율적이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 벡터를 제조하는 단계; (b) 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, MD-2에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 일 실시태양으로 (d) 컬럼을 이용하여 융합 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "패혈증"이란 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 상태를 말한다. 체온이 38도 이상으로 올라가는 발열 증상 혹은 36도 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당 90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 중 두 가지 이상의 증상을 보이는 경우, 이를 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)이라고 부른다. 이러한 전신성 염증 반응 증후군이 미생물의 감염에 의한 것일 때 패혈증이라고 한다. 패혈증은 보통 인체가 그람 음성균에 감염되었을 때, 세균이 분비한 LPS와 인체의 MD-2 단백질과 결합한 결합체가 면역세포 표면에 있는 TLR-4와 결합한 후 세포 내 신호 전달 체계를 통해 다양한 면역 반응이 순간적으로 과도하게 될 때 일어나는 질병이다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여로 패혈증이나 그로부터 야기된 하나 또는 그 이상의 증상을 억제하거나 완화하는 것 뿐만 아니라 질환의 증상을 반전시키는 패혈증의 치료 또는 패혈증의 진행을 방지하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 패혈증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

바람직하게 상기 패혈증의 예방 또는 치료는 상기 폴리펩타이드가 MD-2와 결합하여 이루어지는 것으로, LPS가 인체 내의 MD-2와 결합하지 못하도록 하여 LPS의 신호전달을 저해하여 패혈증을 치료하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 3의 IVLRc-MD2가 LPS 신호 저해에 의한 TNF-α의 분비량을 50% 수준으로 크게 감소시키는 것을 확인하였으며 (도 2), 이와 같은 결과는 본 발명의 폴리펩타이드가 효과적으로 MD-2와 결합하여 LPS의 신호 전달을 저해함으로 인하여, 패혈증을 치료할 수 있음을 입증하는 것이다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 패혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 패혈증 예방 또는 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 패혈증 예방 또는 치료용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 패혈증 치료 방법은 MD-2와 세균의 LPS가 결합하여 면역반응이 과도하게 일어나 전신적인 고열과 인체 내의 장기손상으로 인한 패혈증이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명의 MD-2에 결합하는 신규한 폴리펩타이드는 인터날린이 융합된 VLR 골격 단백질을 이용하여 MD-2와 결합하는 패혈증 치료제 단백질의 설계 및 제조 방법에 의해서 제조된 것으로, 상기 골격 단백질이 MD-2와 결합하여 패혈증을 치료할 수 있는 가능성을 보여줌으로써 패혈증 치료용 단백질을 확보하는 한편, 또한 다양한 결합 단백질로 설계하는 데 적합한 골격임을 증명하여 앞으로 더욱 많은 응용 연구에 기여를 할 수 있을 것이다.

도 1은 자연계에 있는 VLR 반복모듈을 포함하는 폴리펩타이드 및 컨센서스 서열이 포함된 VLR 반복모듈을 포함하는 폴리펩타이드의 단백질 발현양을 나타낸 것이다. 자연계에 있는 반복모듈을 4개 포함한 경우와 컨센서스 서열이 포함된 반복모듈 4개로 구성되어 있는 경우, 컨센서스 기반인 것이 더 많은 양의 단백질이 발현되는 결과를 나타낸다. 1 레인은 표준 마커 (standard marker), 2 레인은 자연계 서열을 기반으로 한 반복모듈을 포함한 것(IVLRn-MD2, 서열번호 2), 3 레인은 컨센서스 서열 기만의 반복모듈을 포함하고 있는 것(IVLRc-MD2, 서열번호 3)을 나타낸다.
도 2는 IVLRc를 이용해 MD-2에 결합하도록 만든 단백질이 LPS와 MD-2로부터 야기되는 패혈증 관련 신호전달을 막는 효과가 있음을 나타낸 것이다. 기존에 완화 효과가 있다고 알려진 TV3와 비슷한 효과를 보이는 것을 입증한 것이다 (이 때 단백질을 MD-2와 섞어서 반응시켜야 효과가 나타남).
도 3은 컨센서스 기반 서열을 이용한 반복모듈로 MD-2에 반응하도록 만든 IVLRc-MD2 (서열번호 3)가 MD-2에 대해 결합력이 있음을 SPR 방법을 통해 확인한 것을 나타낸다.
도 4는 자연계에 존재하는 서열을 이용한 반복모듈로 MD-2에 반응하도록 만든 IVLRn-MD2 (서열번호 2)가 MD2에 대해 결합력이 있음을 SPR 방법을 통해 확인한 것을 나타낸다.
도 5는 반복모듈이 4개인 것(IVLRn-MD2 및 IVLRc-MD2, 서열번호 2 및 서열번호 3), 5개인 것(IVLRn5-MD2 및 IVLRc5-MD2, 서열번호 4 및 서열번호 5) 모두 MD-2와 결합력이 있다는 것을 나타낸다. 자연에 존재하는 서열과 컨센서스 서열에서 디자인된 것 모두 결합력이 있음을 나타낸다. 각각을 MD-2와 섞어 주었을 때 1 레인: IVLRn-MD2, 2 레인:IVLRc-MD2, 3 레인:IVLRn5-MD2, 4 레인:IVLRc5-MD2 모두 각 단백질이 MD-2와 결합한 형태로 분리됨을 확인하였다 (밴드 두 개). 5 레인: 표준 마커.
도 6은 인터날린 B 단백질의 N-말단과 VLR에서 유래한 반복모듈이 융합된 서열번호 1의 IVLRn을 나타낸 것이다. 빨간색은 인터날린 부분을 검정색은 VLR의 반복모듈을 나타낸다. 파란색은 C-말단을 나타낸다.
도 7은 IVLRn을 기반으로 MD-2와 결합할 수 있도록 반복모듈의 아미노산을 치환시킨 서열번호 2의 IVLRn-MD2를 나타낸 것이다. 빨간색은 인터날린 부분을 검정색은 VLR의 반복모듈을 나타낸다. 파란색은 C-말단을 나타내며, 밑줄 친 12개의 아미노산은 MD-2와 결합하도록 아미노산 서열이 치환된 것을 나타낸다.
도 8은 IVLRc를 기반으로 MD-2와 결합할 수 있도록 반복모듈의 아미노산을 치환시킨 서열번호 3의 IVLRc-MD2를 나타낸 것이다. 빨간색은 인터날린 부분을 검정색은 컨센서스 디자인된 VLR의 반복모듈을 나타낸다. 파란색은 C-말단을 나타내며, 밑줄 친 12개의 아미노산은 MD-2와 결합하도록 아미노산 서열이 치환된 것을 나타낸다.
도 9는 IVLRn-MD2를 기반으로 반복모듈의 수를 하나 추가한 서열번호 4의 IVLRn5-MD2를 나타낸 것이다. 빨간색은 인터날린 부분을, 보라색은 추가된 VLR의 반복모듈을 검정색은 자연계 유래의 VLR의 반복모듈을 나타낸다. 파란색은 C-말단을 나타내며, 밑줄 친 24개의 아미노산은 MD-2와 결합하도록 아미노산 서열이 치환된 것을 나타낸다.
도 10은 IVLRc-MD2를 기반으로 반복모듈의 수를 하나 추가한 서열번호 5의 IVLRc5-MD2를 나타낸 것이다. 빨간색은 인터날린 부분을, 보라색은 추가된 VLR의 반복모듈을 검정색은 자연계 유래의 VLR의 반복모듈을 나타낸다. 파란색은 C-말단을 나타내며, 밑줄 친 24개의 아미노산은 MD-2와 결합하도록 아미노산 서열이 치환된 것을 나타낸다.
도 11은 컨센서스 서열 기반으로 반복모듈 4개를 첨가했을 때 만들어질 수 있는 서열이며, 빨간색은 인터날린 부분을 검은색은 반복모듈, 파란색은 C-말단 부분을 나타낸다. 반복 모듈의 x 부분은 임의의 아미노산 서열을 넣을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며 다양한 응용 및 수정이 가능하다.

실시예 1: 인터날린이 융합된 VLR 골격 단백질을 사용하여 MD -2 단백질과 결합하는 아미노산의 설계 및 결합력 측정

<1-1> 인터날린이 융합된 VLR 골격 단백질(IVLR)의 선정 및 TV3-MD2 상호작용을 모사하기 위한 아미노산 설계

구성요소로서 IVLRn으로 이름 붙인 골격을 이용하였다. 상기 골격은 리스테리아 (Listeria monocytogenes) 유래의 인터날린 B 단백질의 N-말단 구조와 첫 번째 반복모듈과 자연계에 있는 VLR 단백질의 반복모듈 네 개 및 이어지는 C-말단 구조를 융합한 것으로 서열번호 1과 같은 구성을 가진다 (도 6).

TV3 단백질은 MD-2와 원래 상호작용을 하는 인간 TLR-4 수용체의 일부분과 안정성을 높이기 위해 도입된 VLR 단백질의 일부가 융합된 것으로 (Cell, 2007, 130, 906-917), 이 자체로 TV3와 7.6 x 10^-8 M 정도의 결합력을 갖고 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 x-ray crystallography를 통해 그 3차원 구조가 밝혀져 있다. 상호작용에 중요하게 작용하는 아미노산을 두 단백질 사이의 거리가 4.5Å 이내인 것으로 결정하였으며, 해당하는 TV3의 아미노산은 Q39, M41, E42, D60, S62, F63, D84, S86, R87, T110, V132, V134, E135, N156, H159, S183, D209, S211, L212, W256, Q284 등이 있다.

본 발명자들은 앞에서 결정한 상호작용에 중요한 TV3의 아미노산 종류들을 해당하는 IVLRn의 아미노산 위치에 변이시켜 MD-2와 결합할 수 있는 IVLRn-MD2를 제작하였다 (서열번호 2 및 도 7).

<1-2> 대장균에서 설계 단백질의 발현 및 MD-2와의 결합력 측정 분석

상기 실시예 <1-1>에서 최종 설계한 아미노산 서열 (서열번호 2)을 바탕으로 DNA를 합성하였다. DNA 서열은 기존의 리스테리아나 장어의 DNA 서열을 따르지 않고, 대장균의 코돈 선호도에 따라 새롭게 DNA 서열을 설계하여 합성하였다. 합성된 DNA는 발현과 정제를 쉽게 하기 위해 단백질의 C-말단 부위에 6개의 히스티딘을 붙이는 pET21a 벡터 (Qiagen)로 옮겨서 클로닝 하였다. 클로닝된 벡터는 VLR의 C-말단에 포함된 이황 결합의 형성을 돕기 위해 Origami B (Novagen)대장균에 형질전환하였다. 상기 벡터가 형질전환된 대장균을 흡광도 (OD₆₀₀) 0.5가 될 때까지 키운 후, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 최종 0.5mM 농도가 되도록 넣고, 18℃에서 20시간 동안 배양하여 인터날린-VLR 융합 단백질을 생산하도록 하였다. 20시간 후에 세포를 깨고 세포 안에서 생산된 인터날린-VLR 융합 단백질의 양을 비교 확인하였다. 생산량이 적은 원래의 단백질은 단백질 끝에 붙은 His-tag를 이용하여 Ni-NTA 레진을 통해 정제하여 농축 후 생산량을 분석하였다.

MD-2 단백질은 곤충세포를 이용한 단백질 발현시스템을 이용하여 생산 및 정제하였다. pAcGp67 벡터에 MD-2와 단백질 정제를 위한 단백질 A (Protein A) 유전자를 함께 클로닝한 후 baculovirus를 이용한 곤충세포 시스템 (insect cell sytem)을 통해 발현시켰다. Hi5 곤충 세포주 밖으로 발현되어 나온 단백질을 lgG 세파로즈 친화도 레진(Sepharose affinity resin)을 이용해 분리 정제한 후, 트롬빈 (thrombin) 분해 과정을 통해 단백질 A 단백질을 잘라낸 MD-2를 얻고, 이를 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피를 통해 추가 정제하였다.

두 단백질 사이의 결합력은 Biacore 3000 system을 이용한 SPR (surface plasmon resonance)을 통하여 측정하였다. 생산된 IVLRn-MD2를 pH4의 아세트산 나트륨 완충용액 (sodium acetate buffer)을 이용한 EDC/NHS 반응을 통해 Biacore CM5 chip 위에 고정화시켰다. 고정화시킨 단백질을 500에서 800사이의 RU (resonance units) 값을 가질 정도의 양을 이용하였다. HBS-EP 완충용액을 흘려주면서 다양한 농도의 MD-2를 주입하여 센서그람 데이터(sensorgram data)를 획득하였다 (도 4). 센서그람 데이터는 비특이적 결합을 나타내는 reference cell의 값을 빼준 후에, Biacore Evaluation 소프트웨어를 이용하여 결합력인 K_D 값을 측정하였다.

그 결과, IVLRn-MD2와 MD-2 사이의 결합력은 4.15 x 10^-8 M 정도로 TV3와 MD-2 사이의 결합력과 비교해서 비슷한 정도인 것을 확인하였다 (도 4).

실시예2 : 컨센서스 디자인이 추가된 인터날린 - VLR 융합 단백질을 골격으로 MD-2와 결합하는 아미노산 설계 및 결합력 분석

<2-1> 컨센서스 디자인이 추가된 인터날린-VRL 융합 단백질 및 이를 MD-2와 결합하도록 설계

컨센서스 정보는 진화적으로 근접한 연관 관계를 가지는 서열들로부터 각 서열 위치의 아미노산 빈도수와 치환 정보 등을 통해 얻을 수 있다. 진화적으로 구조 형성에 중요하여 전체적인 안정성에 기여하고 있는 아미노산 또는 상호작용에 중요한 역할을 하는 서열 위치는 높은 보존률을 보이는 반면 구조 안정성에 영향을 끼치지 않는 부분은 상대적으로 치환이 잘 되는 것으로 알려져 있다. 또한 컨센서스 정보는 각 위치에 나타나는 아미노산의 종류와 빈도수 등을 기반으로 해당 위치에 치환이 가능한 아미노산을 한정할 수 있도록 도와줄 수 있다. 따라서 이 같은 진화적인 위치별 서열 정보를 통해 구조 안정성은 유지하는 동시에 다양한 서열을 설계할 수 있는 가능성을 높였다.

이 같은 컨센서스 서열 분석에 있어서 VLR이 가지는 장점은 우선 항체와 비슷하게 재조합을 통해서 다양성을 획득하기 때문에 반복모듈의 모듈성이 높다는 점이다. 그리고 VLR의 페닐알라닌 뼈대 (phenylalanine spine)부분은 주위의 4개의 루이신 (leucine)과 함께 소수성 코어 (hydrophobic core)를 형성하고 있는데, 이러한 구조는 안정성을 높일 것으로 예상하였다.

컨센서스 디자인을 위한 서열의 선정은 Uniprot DB와 NCBI, nr에 대한 BLAST를 통해서 수행하였다. Uniprot DB에서는 VLR과 루이신이란 검색어를 이용하여 서열을 선택하였고, NCBI 및 nr에 대해서는 하나의 단백질 서열 (PDB ID: 2O6Q)을 이용하여 BLAST하여 나온 상위 100개의 결과를 이용하였다. 반복모듈 선택을 위해서, 전형적인 LRR 모티프를 이용하여 24개의 아미노산으로 이루어져 있는 모티프를 찾았다 (Typical LRR motif: LxxLxxLxLxxNxLxxLxxxxFxx).

전형적인 LRR 모티프를 이용하여 정렬 점수 (alignment score)를 구하고, 정렬 점수가 39.0 이상인 서열을 선택하였다. 그 결과 얻어진 서열 중 765개(Uniprot) 와 500개(NCBI nr)를 이용하였다. 컨센서스를 정의하기 위해 Logo plot을 이용하였는데 Logo plot에서 명확한 보존성 (conservation)을 보이는 부분의 서열은 그대로 이용하고, 약간의 변이를 보이는 부분은 구조 안정성에 도움을 줄 것이라고 생각하는 아미노산을 선택하였다.

이와 같은 결과는 하기에 나타냈다.

컨센서스 서열

1) Uniprot DB

L TN L TxLxLxxNQL KSL PxG V FD N

2) NCBI nr

L TK L TxLxLxxNQL QS LPxG V FD K

밑줄: 높은 보존성 영역

볼드체: 중간 정도의 보존성 영역

x: 변이 영역

중간 정도의 보존성 영역 (볼드체)에 대해서는 다음의 두 가지 선정 기준을 적용하여 적합한 서열을 선정하였다; 1) 아미노산이 나타나는 빈도순, 2) 전하 (charge)가 없는 아미노산.

전하가 없는 아미노산을 선정한 이유는 반복모듈이기 때문에 전하를 띈 아미노산을 사용할 경우 같은 전하가 비슷한 위치에 몰리게 되니까 이를 방지하기 위함이다. 이 같은 과정을 통해서 서열 “LTNLxxLxLxxNQLQSLPxGVFDK”를 컨센서스 모듈의 서열로 확정하였다. 이 중 x의 위치는 진화적으로 다양한 서열을 갖고 있는 위치이며 이 위치의 아미노산의 종류에 따라 타겟 단백질과의 결합력 및 특이성이 조절되는 것으로 생각되었다. 상기 24개의 아미노산으로 이루어진 컨센서스 모듈에서, x는 임의의 아미노산이다. 상기 실시예 1과 마찬가지로 IVLRn과 같이 4개의 VLR 반복모듈을 갖도록 설계하여 IVLRc로 이름을 붙였다 (서열번호 6 및 도 11).

MD-2와 결합하도록 하기 위해서 상기 실시예 1의 경우와 마찬가지로 결합에 중요한 아미노산을 해당위치에 치환하여 설계하였다. 결합에 관여하지 않은 x로 표현되는 변이 영역의 아미노산은 해당 위치에 존재하는 자연계 상의 VLR 아미노산으로 선정을 하였고 이를 IVLRc-MD2라 이름 붙였다 (서열번호 3 및 도 8).

<2-2> 설계된 단백질의 발현 및 결합력 분석

상기 실시예 <2-1>에서 제조한 서열번호 3을 바탕으로 DNA를 합성하여 실시예 <1-2>과 동일한 방법으로 대장균에서 발현시켜 MD-2 단백질과의 결합력을 측정하였다.

그 결과, 결합력인 K_D 값은 6.21 x 10^-8 M 수준으로 TV3-MD2 결합 및 IVLRn-MD2의 경우와 비교해서 비슷한 정도의 결합력을 보였다. 또한 단백질의 발현량이 60 mg/L 정도로 인터날린과 융합하지 않은 경우 (3 mg/L)에 비해 크게 증가하였고, 안정성 (circular dichroism을 통해 측정한 melting temperature, Tm)이 IVLRn-MD2의 70℃에서 IVLRc-MD2는 83℃로 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 신규한 단백질의 경우 기존의 단백질에 비해 발현양이 획기적으로 증가함과 동시에 향후 치료제로 사용 시에도 단백질의 성질이 향상되도록 컨센서스 설계를 적용할 수 있음을 시사하는 결과이다.

실시예3 : IVLRc - MD2 단백질에 세포내 LPS 신호전달 저해 효과 확인 및 패혈증 치료 효과 확인

<3-1> IVLRc-MD2 단백질의 생산 및 내독소 (endotoxin) 제거

IVLRc-MD2 단백질은 기본적으로 실시예 <1-2>에서와 마찬가지의 방법으로 생산 및 정제하였다. 이를 세포 수준 혹은 동물 수준에서 실험하기 위해서는 순수하게 정제된 단백질이 필요하다. 하지만 물리화학적 특성에 관한 실험과 달리 생물학적인 경우에는 대장균을 통한 단백질 정제 시에 함께 얻어지는 많은 양의 내독소가 문제를 야기할 수 있다. 그람음성 박테리아의 세포표면에서 발현되는 다당류의 일종인 LPS는 매우 적은 양으로도 염증반응과 같은 생물학적 효과를 일으키는 물질로서, 실제 실험 시에 대장균이 가지고 있는 내독소를 제거하여 독성을 일으키지 않도록 하는 것이 필요하다. 그러나 불가피하게도 단백질 정제 시에 많은 양의 LPS가 단백질과 함께 정제되어 얻어지게 된다. 이렇게 같이 얻어진 LPS는 유도하지 않은 생물학적 반응을 야기시켜 의미있는 실험결과의 해석을 어렵게 만든다. 이점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 LPS를 효과적으로 제거하기 위하여 LPS와 특이적 결합을 통하여 효과적인 제거가 가능하다고 알려진 polymyxin-B가 결합되어 있는 아가로즈레진(Sigma, Cat# p1441-10ML)을 컬럼에 충전시킨 후, LPS와 단백질이 함께 존재하는 용액을 컬럼에 흘려준 뒤에 최종적으로 PBS 완충용액을 통해 본 발명자들이 원하는 단백질만 용리시켜 정제하였다. 최초 단백질 정제 시 LPS 함유량인 >30,000 EU/㎖에서 최종 12.8 EU/㎖ (3.2 EU/mg 단백질)가 되도록 정제하여 이후의 실험에 이용하였다.

<3-2> 세포 수준에서의 MD-2 저해 작용 분석 시스템 개발 및 이를 이용한 IVLRc-MD2의 작용 확인

본 발명의 InlB-VLR 융합단백질이 MD-2와 결합하여 InlB-VLR/MD-2 복합체 형태로 LPS 신호를 저해하는 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 세포막 수용체인 TLR4의 가용성 세포외 도메인 (extracellular domain)으로 구성된 sTLR4와 MD-2 복합체는 LPS를 트랩하는 능력이 있으며, 결과적으로 세포막의 TLR4 수용체를 매개로 하는 LPS 신호전달이 저해되는 효과를 나타낸다. 이는 LPS와 결합 가능한 sTLR4/MD-2 복합체가 세포막 존재하는 wtTLR4/MD-2 복합체와 경쟁하는 경쟁적 저해효과로 알려져 있다 (Mitsuzawa et al., J. Immunolo., 177:8133-8139, 2006; Brandl et al., J. Endotoxin Res., 11:197-206, 2005). 이에 본 발명자들은 sTLR4/MD-2 복합체가 LPS와 결합하여 신호전달을 저해하는 것과 동일한 매커니즘으로, InlB-VLR/MD-2 복합체가 LPS 신호를 경쟁적으로 저해하는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저 단핵세포인 THP-1 (TIB-202TM, ATCC)세포주를 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 50 μM 2-mercaptoethanol이 첨가된 RPMI 배지로, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포의 밀도가 90%에 도달하면 DPBS 완충용액(pH 7.4)으로 세척한 후, LPS에 대한 감도를 높이기 위해 PMA(phorbol 12-myristate-13-acetate)가 200 nM이 첨가된 배지에 부유시켜 96-웰 플레이트에 2.5×10⁴/웰로 분주하고, 72 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 충분히 분화시켰다.

실험에 앞서 각각 10 ㎍/㎖의 InlB-VLR과 MD-2를 동시에 첨가한 RPMI 배양액과, 대조군으로 10 ㎍/㎖의 MD-2와 10 ㎍/㎖의 IVLR, 10 ㎍/㎖의 TV3, 그리고 10 ㎍/㎖의 TV-3와 MD-2를 동시에 첨가한 배양액들을 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이후 PMA에 의해 대식세포로 분화된 THP-1을 DPBS 완충용액 (pH 7.4)으로 3회 세척하고, 샘플이 포함된 RPMI 배양액들을 20 ng/㎖의 LPS와 함께 THP-1에 처리하여 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간이 경과한 후 각 웰에서 일정량의 배양액을 취하여 DPBS 완충용액 (pH 7.4)으로 4-8배 희석하고, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays)로 분비된 TNF-α를 분석하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 InlB-VLR/MD-2 복합체와 TV3/MD-2 복합체는 LPS 신호저해에 의한 TNF-α의 분비량을 50% 수준으로 크게 감소시켰다. 반면에 InlB-VLR과 TV3를 단독으로 사용한 경우에는 LPS 신호저해 효과가 없었으며, MD-2를 단독으로 사용한 경우에는 알려진 바와 같이 약한 저해 효과를 보였다(Mitsuzawa et al., J. Immunolo., 177:8133-8139, 2006). 한편 InlB-VLR/MD-2 복합체와 TV3/MD-2 복합체에 의한 LPS 신호 저해효과는 거의 유사한 수준으로 확인되었는바, 이는 sTLR4, 또는 TV3가 MD-2와 결합하여 LPS신호를 저해하는 것과 동일한 효과인 것으로 판단되었다 (Mitsuzawa et al., J. Immunolo., 177:8133-8139, 2006; Jung et al., PLoS ONE, 4:e7403, 2009). 이와 같은 결과는 본 발명의 InlB-VLR 융합단백질이 MD-2와 결합하여 InlB-VLR/MD-2 복합체 형태로 LPS 신호를 저해하는 효과를 나타낸다는 것을 입증하는 것이며, 또한 이는 본 발명의 신규한 MD-2 결합 폴리펩타이드가 패혈증을 치료할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예4 : IVLRc - MD2 단백질의 모듈 추가 및 결합 효과 확인

상기 실시예 <1-2>와 <2-2>에서 제조한 단백질이 MD-2에 결합력이 있음을 확인하였으나, 본 발명자들은 IVLR 골격의 특징을 살려 결합력이나 단백질의 성질을 향상시킬 수 있는 새로운 단백질을 설계하였다. 첫 째로 반복모듈의 수를 하나 늘리고, 추가된 모듈에 결합할 수 있는 아미노산을 넣고, 융합된 인터날린의 모듈에도 결합에 영향을 끼칠 수 있는 부분의 아미노산을 치환하여 새로운 단백질인 IVLRn5-MD2와 IVLRc5-MD2를 설계하였다 (서열번호 4 및 5, 도 9 및 10). 설계된 단백질은 실시예 <1-2>에서와 같은 방법으로 발현 및 정제하여 결합력 및 안정성을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 것과 같이 GPC (gel permeation chromatography)를 이용한 pull-down 실험결과 새로운 IVLR 단백질들과 MD-2 단백질이 각각 한꺼번에 결합된 상태로 나오는 것을 확인하였다. 이는 IVLR 단백질의 모듈의 개수를 조절하면서도 타겟 단백질인 MD-2와의 결합력이 유지되는 것을 보여주는 것으로 골격 단백질의 다양한 응용 가능성을 알 수 있다.

CD (Circular dichroism)를 통해 측정한 IVLRc5-MD2의 녹는 점 (melting temperature)은 84℃로 IVLRc-MD2의 83℃와 큰 차이가 없었으나, IVLRn5-MD2의 경우는 IVLRn-MD2보다 5℃ 증가한 77℃로 나타났다. 이는 결합력에 나쁜 영향을 주지 않으면서 단백질 자체의 성질을 향상시킨 것으로 IVLR 골격단백질을 이용할 경우 실용적으로나 산업적으로 더 뛰어난 단백질의 설계 및 제조가 가능함을 시사하는 결과이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel MD-2 binding polypeptide and the use thereof <130> PA100500/KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRn <400> 1 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Lys Tyr Leu Arg Leu Gly Gly Asn Asn Leu Arg Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Glu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ser Thr Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Ala Leu Asn Thr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Lys Leu Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Tyr Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Ser Leu Lys 145 150 155 160 Glu Leu Arg Leu Tyr Asn Asn Gln Leu Lys Arg Val Pro Glu Gly Ala 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 2 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRn-MD2 <400> 2 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Lys Tyr Leu Arg Leu Gly Gly Asn Asn Leu Arg Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Glu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Leu Ile Leu Thr Gly Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Val Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Lys Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Ser Leu Lys 145 150 155 160 Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Lys Arg Val Pro Glu Gly Ala 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 3 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRc-MD2 <400> 3 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Ile Leu Thr Gly Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Val Leu Val Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265 <210> 4 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRn5-MD2 <400> 4 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Thr Ile Gln Ala 35 40 45 Met Glu Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Lys Asn Leu Asp Leu Ser Phe Asn Asn Leu Arg Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Glu Lys Leu Thr Asn Leu Thr Val Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Ser Leu Thr 100 105 110 Tyr Leu Ile Leu Thr Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Glu Leu Val Leu Val Glu Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Lys Leu Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Glu Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Ser Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Arg Val Pro Glu Gly Ala Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 195 200 205 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 210 215 220 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 225 230 235 240 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 245 250 255 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 260 265 270 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 275 280 285 Pro Thr 290 <210> 5 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRc5-MD2 <400> 5 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Thr Ile Gln Ala 35 40 45 Met Glu Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Asn Leu Asp Leu Ser Phe Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Val Leu Asp Leu Ser Arg Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 100 105 110 Tyr Leu Ile Leu Thr Gly Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asn Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys Glu Leu Val Leu Val Glu Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Asn Leu Ala His Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Gln 180 185 190 Leu Gln Ser Leu Pro Glu Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 195 200 205 Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 210 215 220 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 225 230 235 240 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 245 250 255 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 260 265 270 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 275 280 285 Pro Thr 290 <210> 6 <211> 266 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IVLRc <220> <221> VARIANT <222> (88)..(166) <223> Xaa is any amino acid <400> 6 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ser Leu Pro Xaa Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Xaa 100 105 110 Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Xaa Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Xaa Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Xaa 145 150 155 160 Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Xaa Gly Val 165 170 175 Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Leu Tyr Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln 195 200 205 Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile 210 215 220 Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn 225 230 235 240 Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys Pro Thr 260 265

Claims (12)

1. 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR (Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, MD-2 (Myeloid differentiation protein-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2, 3, 4 또는 5인 폴리펩타이드.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 VLR 단백질의 변형된 반복모듈은 자연계에 존재하는 서열의 반복모듈을 조합한 것 또는 컨센서스 디자인을 통해 안정성을 높인 서열의 반복모듈을 조합한 것인 폴리펩타이드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 컨센서스 디자인을 통해 안정성을 높인 서열의 반복모듈은 하기 서열식 1의 반복모듈인 것인 폴리펩타이드.
   [서열식 1]
   [LTNLxxLxLxxNQLQSLPxGVFDK]
   상기 식에서, x는 임의의 아미노산임.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 폴리펩타이드로서 MD-2 단백질에 결합하는 활성을 유지하는 것인 폴리펩타이드.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
   
7. 제6항의 핵산을 포함하는 벡터.
   
8. 제7항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
   
9. (a) 제7항의 벡터를 제조하는 단계;
   (b) 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및
   (c) 상기 숙주세포로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, MD-2에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
   
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 패혈증 예방 또는 치료용 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 패혈증 예방 또는 치료는 상기 폴리펩타이드가 MD-2와 결합하여 이루어지는 것인 조성물.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
    

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