CN103476933A - 白介素1受体的拮抗剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了源自于IL-1受体拮抗蛋白(IL1RA)的新型肽，其能够结合至细胞表面IL1受体-1(IL1R1)并干扰IL-1与IL1R1的结合。因此，该结合有效拮抗IL-1的炎性作用，例如通过减少来自巨噬细胞的TNFα分泌。这有望用作整个人体，包括中枢神经系统的抗炎因子。因此，本发明的一个方面在于所述肽作为抗炎剂用于治疗其中IL-1发挥显著作用的病理状态(例如身体和中枢神经系统的炎性病症)的用途。

Description

白介素1受体的拮抗剂

技术领域

本发明涉及包含源自于IL-1受体拮抗蛋白(IL1RA)的短肽的新型化合物，其能够结合至细胞表面IL-1受体1，以在整个人体中拮抗IL-1的炎性作用。还公开了所述肽作为抗炎剂用于治疗其中IL-1发挥显著作用的病理状态(例如身体和中枢神经系统的炎性病症)的应用。

背景技术

白介素1(IL-1)是两种不同的蛋白质(IL-1α和IL-1β)的通称，它们是主要的促炎性细胞因子。IL-1通过结合多种类型细胞上的特异跨膜受体(IL-1RI)发挥其作用。IL-1的作用受到天然抑制剂的抵抗，例如可溶性IL-1受体和IL-1R拮抗蛋白(IL1RA或IL1Ra)。IL1RA通过阻断其与细胞表面受体的相互作用抑制IL-1的作用。

本领域中已经提出了出于抗炎目的而靶向IL-1的治疗途径。这些包括在关节炎实验模型中施用重组IL-1R拮抗蛋白、IL-1捕获融合蛋白、抗IL-1抗体、抗IL-1RI抗体和可溶的IL-1RI和II(Gabay C.等在2010年的综述)。

具有IL-1R拮抗活性的肽公开在例如US20060094663A1中。这些序列衍生自IL-1RAcP(IL-1RI辅助蛋白)。

用作抗炎药物的重组IL-1R拮抗蛋白已经商业化为：阿那白滞素(Anakinra)，以‘Kineret’的商品名销售(参见US5075222)。其已经得到批准用于类风湿性关节炎的治疗。阿那白滞素的缺点在于：(1)其以每剂量为100mg的注射浓缩物递送；(2)其使用重组DNA技术由遗传修饰的大肠杆菌(E.coli)制备；和(3)其具有高分子量(对应于全长IL-1RA)。

因此，鉴定衍生自IL1RA的较短且强效的肽可解决这些缺点，因为(1)可使用较低浓度的该肽；(2)较小的肽在溶液中是稳定的并且能够更容易地以较低的相关成本而进行化学合成；和(3)小模拟肽的较低分子量使其能够更容易地通过血脑屏障，这意味着在脑中达到工作浓度所需的肽量较少，这使其对于神经炎性疾病的治疗也特别有用。特异性靶向还具有副作用较少且功效改进的潜力。

WO05086695A2专利家族公开了IL-1R拮抗蛋白的特异性肽片段。这些片段能够抑制炎性病症中的组织破坏，并且可用于治疗慢性炎性病症和类风湿性关节炎(US2007027082；公开号为US7674464的专利申请)。没有提出对神经退行性病症的作用。

根据US2007027082，其公开的肽片段优选包含子序列LVAGY(“SEQ ID NO:42”)；存在于US2007027082的“SEQ ID NO:13、18、21、23、24和43”中。在体外观察到“SEQ ID NO:13、15、23和24”(实施例3)，且在体内观察到“SEQ ID NO:18和43”(实施例10)逆转了IL-1诱导的作用。

US2007027082的“SEQ ID NO:13、18和19”进一步包含ILR1A的子序列SGRKSSKMQA(本SEQ ID NO:1)。包含ILR1A的子序列SGRKSSKMQA的、具有根据US2007027082的作用的最短肽长35个氨基酸(“SEQ ID NO:13”)，在添加用于优化的核定位信号时，长42个氨基酸（“SEQ ID NO:18”）。在检测短至15个氨基酸，即排除LVAGY子序列(“SEQ ID NO:19”)时，没有在体外观察到对IL-1刺激的胶原酶生产的抑制作用(实施例3)。因此，US2007027082总结到，具有通过IL-1β抑制MMP-1(一种胶原酶)的活性的所有肽都包含IL1RA的LVAGY残基；为IL1RA的所有4种亚型共有(US2007027082[0115])。

本发明公开了IL-1RA的进一步肽片段；在一个实施方式中，所述肽片段短至10个氨基酸，且在一个实施方式中，包含SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或由SGRKSSKMQA(SEQ IDNO:1)组成。本文显示这些片段与IL-1RI直接结合并干扰IL-1R与IL-1β的结合；这与US2007027082的不结合IL1R1的长度为35个氨基酸的肽片段(“SEQ ID NO:13”)相反。

本发明的短肽可包含SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其变体、片段或片段的变体，或由SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其变体、片段或片段的变体组成。其相对于全长IL1RA(阿那白滞素)和US2007027082的长度为35个和42个氨基酸的肽(均包含子序列SGRKSSKMQA)的优点在于，其非常稳定，具有高溶解度，并且还具有低合成成本。这些效果在所述肽维持结合IL1R1并拮抗IL-1作用的能力的情况下发生。

衍生自IL1RA发明的本发明的进一步的短肽包含RIWDVNQKT(SEQ ID NO:29)、TAMEADQPVS(SEQ ID NO:35)或GPNAKLEEKA(SEQ ID NO:36)或其变体、片段或片段的变体，或由RIWDVNQKT(SEQ ID NO:29)、TAMEADQPVS(SEQ ID NO:35)或GPNAKLEEKA(SEQ ID NO:36)或其变体、片段或片段的变体组成；具有与本文列出的SEQ ID NO:1相同的优点。

此外，某些长度短的肽，例如SEQ ID NO:1的10个氨基酸的肽，具有通过血脑屏障(BBB)以对中枢神经系统(CNS)的细胞发挥作用的提高的能力；因此，能够将所述短肽用于与IL-1相关的神经炎性病变。本领域此前尚未提出IL1RA或其肽片段对神经元的作用，也未提出其能通过BBB。本文显示了对轴突生长和神经元细胞存活的积极作用。

发明内容

本发明涉及具有高于全长IL1RA蛋白和阿那白滞素的性质的截短形式的IL1RA。

本发明人在本文中显示了所述多肽结合IL-1R1，并且干扰IL-1R1与细胞因子IL-1β的结合，因此具有对IL-1下游信号转导（signalling）的抑制作用，包括抑制NF-κB活化和减少TNF-α的增加。此外，还在神经元中观察到对轴突生长和细胞存活的积极作用；并且在体内改进类风湿性关节炎的症状。

本发明的一个方面提供了由衍生自IL-1受体拮抗蛋白(IL1RA)的5-20个连续氨基酸残基的肽序列组成的分离肽，所述肽由以下组成：

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的氨基酸序列；或

由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的5个或更多的连续氨基酸组成的片段序列；或

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的变体，所述变体由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中的任一个具有至少50%同一性的5-20个氨基酸的氨基酸序列组成，

其中，所述肽能够结合1型IL-1受体(IL1RI)，并且能够干扰IL-1与IL1RI的结合。

本发明的另一方面提供了包含至少一个本发明的肽的化合物。所述化合物可配制成由单拷贝的所述肽组成的单体，或者可配制成包含2个或更多的本发明肽的多聚化合物。所述两个或更多的肽可以彼此相同或不相同。在具体实施方式中，所述多聚体可以是二聚体或四聚树形化合物。

本文还提供了组合物，例如药物组合物或药物制剂，其包含本发明的肽或化合物。

在令人感兴趣的方面，提供本发明的肽、化合物或组合物，其用作药物。

所述应用包含治疗炎性病变的亚类，特别是IL-1在其中发挥显著作用的那些。这些包括类风湿性关节炎、糖尿病(例如I型糖尿病)、神经退行性疾病，其中所述神经退行性疾病具有神经炎性组分，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症。

附图说明

图1显示了L1Ra(实心显示)和IL1RI(骨架二级结构)之间复合体的三维结构模型。Ilantafin(aka.Ilantide)肽序列(SEQ ID NO:1)的位置以黑色显示。

图2显示了采用表面等离子体共振(SPR)分析，IL1β(A)、IL1Ra(B)和Ilantafin肽(SEQ IDNO:1)与固定在传感芯片上的IL1RI的结合。RU：共振单位。

图3显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)、IL1β和IL1Ra与IL1RI之间相互作用的亲和性和速率常数。

图4显示了可溶性IL1RI(SILR1)与Ilantafin肽(SEQ ID NO:1)之间在结合固定化IL1β中的竞争。与单独的SILR1结合相比时，^*p<0.05。

图5显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)对IL1β活化的NF-KB的抑制作用。Ilantafin肽合成为与赖氨酸骨架相连的四聚树形化合物(Ilantafin-d)。与黑条相比时，^*p<0.05，^**p<0.01。

图6显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)对IL1β活化的NF-KB的抑制作用。Ilantafin肽合成为单体(Ilantafin-m)。与黑条相比时，^*p<0.05，^**p<0.01。

图7显示了ILRa(A)和SILR1(B)蛋白对IL1β活化的NF-KB的抑制作用。与黑条相比时，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001。

图8显示了Ilantafin-d肽(SEQ ID NO:1的四聚树形化合物)的作用是序列特异性的，这是因为具有混杂序列的两个肽(Ilantafin scr-d1(KQSAGKRSMS)、Ilantafin scr-d2(KASQKGMSRS))，和具有反向序列的肽(Ilantafin rev-d(AQMKSSKRGS))都没有抑制IL1β诱导的NF-KB活化。

图9显示了Ilantafin-d肽(SEQ ID NO:1的四聚树形化合物)的作用是靶(IL1RI)-特异性的，这是因为所述肽没有影响IL6诱导的STAT信号的活化。

图10显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)对IL1β-活化的AMJ2-C8巨噬细胞的TNFα分泌的抑制作用。Ilantafin肽合成为与赖氨酸骨架相连的四聚树形化合物(Ilantafin-d)。与黑条相比时，^*p<0.05。

图11显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)对IL1β-活化的AMJ2-C8巨噬细胞的TNFα分泌的抑制作用。Ilantafin肽合成为单体(Ilantafin-m)。与黑条相比时，^*p<0.05。

图12显示了ILRa(A)和SIL1R1对IL1β-活化的AMJ2-C8巨噬细胞的TNFα分泌的抑制作用。与黑条相比时，^*p<0.05，^**p<0.01。

图13显示了Ilantafin(SEQ ID NO:1)、IL1Ra(B)、SIL-1R1(C)和IL1β(D)在小脑颗粒神经元的原代培养物中对轴突生长的作用。与未处理的细胞相比时，^*p<0.05，^**p<0.01。

图14显示了IL1β与Ilantafin(SEQ ID NO:1)和IL1Ra竞争，从而抑制Ilantafin(A)和IL1Ra(B)诱导的轴突生长。与黑条相比时，^*p<0.05。

图15显示了作为树形化合物(Ilantafin-d，A)和单体(Ilantafin-m，B)的Ilantafin(SEQ IDNO:1)均促进了通过降低钾浓度而诱导发生凋亡的小脑颗粒神经元的存活。IGF：胰岛素样生长因子1。显示了来自两个独立试验的结果。

图16显示了采用胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎模型的体内研究的结果。与未处理的对照组相比，使用Ilantafin-d(SEQ ID NO:1的四聚树形化合物)的处理中止了此疾病的临床表现的增加。

图17显示了Ilantafin如何降低具有CIA的动物的发病率。发病率表示为在测试日达到临床指标7并且因此被处死的动物的百分比。至dpi12，Ilantafin显著降低了发病率。*-P<0.05(带有Welch校正的未配对的t-检验)。

图18显示了Ilantafin如何降低CIA的严重性(临床评估)。双向ANOVA揭示了处理对患有CIA的动物的临床评分的显著作用[F(1,238)=18.05,P<0.0001]。至dpi13-15，Ilantafin降低了CIA的严重性。*-P<0.05(带有Welch校正的未配对的t-检验)。

关于附图的更多细节可见于下文的实施例。

具体实施方式

定义和缩写

IL1RA或IL1Ra：IL-1受体拮抗蛋白，在本文中也可命名为IL-1受体拮抗剂。

IL1R1或IL1RI：1型IL1受体。

亲和度：受体与其配体之间的结合强度。

Ilantafin/Ilantide：在本文中可互换地使用，表示IL1RA的片段；Ilantafin-8已得到最多的检测并给予序列标识符SEQ ID NO:1。在本文中，SEQ ID NO:1还可简单地表示为‘Ilantafin’或‘Ilantide’。

术语“个体”指脊椎动物，尤其是哺乳动物的成员，优选包括人在内的灵长类。本文使用的“受试者”和“个体”可互换地使用。

“多肽”或“蛋白”是天然产生的或合成的氨基酸残基聚合物，优选其仅通过肽键相连。本文使用的术语“多肽”涵盖了蛋白、肽和多肽，其中所述蛋白、肽或多肽可以经过或没有经过翻译后修饰。肽的长度通常比蛋白短。

“分离的多肽”是基本不包含污染性细胞成分(例如碳水化合物、脂质或在自然中与该多肽结合的其他似蛋白的杂质)的多肽。通常，分离的多肽制品包含高纯度形式的所述多肽，即，至少约80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、大于95%纯，或大于99%纯。显示具体的蛋白制品包含分离的多肽的一种方式是通过在所述蛋白制品的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后出现的单个条带。然而，术语“分离的”不排除以另外可选的物理形式存在的相同多肽的存在，例如二聚体或可选地糖基化或衍生化的形式。

“氨基酸残基”可以为肽键或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨基酸残基可以为D-构型或L-构型。氨基酸残基包括被包含碳原子或碳原子链的中心部分分开的氨基末端部分(NH₂)和羧基末端部分(COOH)，它们的至少之一包括至少一个侧链或官能团。NH₂是指存在于氨基酸或肽的氨基末端的氨基基团，COOH是指存在于氨基酸或肽的羧基末端的羧基基团。通用术语氨基酸包括天然的或非天然的氨基酸。如在J.Biol.Chem.，243:3552-59(1969)中列出且符合37C.F.R.，1.822(b)(2)部分的标准命名法的天然氨基酸属于下表1中列出的氨基酸组。非天然氨基酸是未列在表1中的氨基酸。此外，非天然氨基酸残基包括但不限于经修饰的氨基酸残基、L-氨基酸残基和D-氨基酸残基的立体异构体。

表1：天然氨基酸及其各自的代码

“等价氨基酸残基”是指能够取代多肽中的另一个氨基酸残基而基本不改变该多肽的结构和/或功能的氨基酸残基。因此，等价氨基酸具有类似的性质，例如侧链的体积(bulkiness)、侧链极性(极性或非极性)、疏水性(疏水或亲水)、pH(酸性、中性或碱性)和碳分子的侧链组织(芳族/脂肪族)。因此，可以将“等价氨基酸残基”认为是“保守氨基酸取代”。

在一个实施方式中，等价氨基酸的分类是指以下类：1)HRK，2)DENQ，3)C，4)STPAG，5)MILV和6)FYW。

在一个实施方式中，在本文使用的术语“等价氨基酸取代”的含义内，以下所述的氨基酸组中的一个氨基酸可以被另一个氨基酸取代：

i)具有极性侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)

ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)

iii)具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly、Ala Val、Leu、Ile)

iv)具有环形侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)

v)具有芳族侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)

vi)具有酸性侧链的氨基酸(Asp、Glu)

vii)具有碱性侧链的氨基酸(Lys、Arg、His)

viii)具有酰胺侧链的氨基酸(Asn、Gln)

ix)具有羟基侧链的氨基酸(Ser、Thr)

x)具有含硫侧链的氨基酸(Cys、Met)，

xi)中性、弱疏水性氨基酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)

xii)亲水性、酸性氨基酸(Gln、Asn、Glu、Asp)，和

xiii)疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)。

“生物活性剂”(即在生物学上具有活性的物质/试剂)是提供可以通过体内或体外证明的某些药理学作用(通常为有益作用)的任何试剂、药物、化合物、物质组合物或混合物。其可以指Ilantafin/Ilantide肽序列，或包含这些序列的化合物。在本文中使用的该术语进一步包括在个体中产生局部或全身作用的任何生理学或药理学活性物质。生物活性剂的另外实例包括但不限于包含寡糖或由寡糖组成的试剂，包含多糖或由多糖组成的试剂，包含任选糖基化的肽或由任选糖基化的肽组成的试剂，包含任选糖基化的多肽或由任选糖基化的多肽组成的试剂，包含核酸或由核酸组成的试剂，包含寡核苷酸或由寡核苷酸组成的试剂，包含多核苷酸或由多核苷酸组成的试剂，包含脂质或由脂质组成的试剂，包含脂肪酸或由脂肪酸组成的试剂，包含脂肪酸酯或由脂肪酸酯组成的试剂，以及包含次级代谢物或由次级代谢物组成的试剂。生物活性剂可以预防性或治疗性治疗个体(例如人或其它任何动物)。

本文使用的术语“药”、“药物”包括局部或全身性作用于人或动物体的在生物学上、生理学上或药学上具有活性的物质。

本文使用的术语“治疗”和“疗法”等同地指治愈性治疗、预防性治疗和改善性治疗或减轻性治疗。该术语包括用于获得可以在临床上建立的有益的或期望的生理学结果的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床效果包括但不限于缓解症状，减小疾病的程度，稳定(即不恶化)病况，延迟或减慢病况/症状的发展或恶化，改善或减轻病况或症状，以及不论可测与否的缓和(不管部分还是完全)。本文使用的术语“减轻”及其变式表示，与不施用本发明组合物相比，生理病况或症状的程度和/或有害表现减少和/或发展时间过程减慢或延长。

如果如根据构成术语“治疗”和“疗法”的定义的标准所测定的，所治疗的病况有变化，则“治疗效果”或“疗效”是明显的。如果有至少5%的改善，优选10%的改善，更优选至少25%，甚至更优选至少50%，如至少75%，最优选至少100%的改善，则所治疗的病况有“变化”。所述变化可基于所治疗个体病况的严重程度的改善，或者基于利用或不利用生物活性剂治疗或用生物活性剂和本发明的药物组合物治疗的个体群病况改善频率的差异。

本发明的治疗可以是预防性、改善性或治愈性的。

“生物活性剂”的“药理学上的有效量”、“药学上的有效量”或“生理学上的有效量”是在施用本发明所述药物组合物时，为在所治疗的个体血流中或作用部位(例如肺、胃系统、结直肠系统、前列腺等)提供期望水平的活性剂以产生预期的生理反应所需要的存在于本文所述药物组合物中的活性剂的量。准确的量将取决于多种因素，例如活性剂、组合物的活性、所采用的递送装置、组合物的物理特征、计划的患者用法(即每天施用的剂量数)和患者因素等，并且可以由本领域技术人员根据本文提供的信息而容易地确定。可以在一次给药中，或者通过多次给药总和为有效量的量(优选在24小时的时间内)而施用“有效量”的生物活性剂。可以通过使用用于测定合适给药量和给药时间的标准临床方法确定有效量。应该理解，“有效量”可以是由医疗专家和/或个人确定的经验性和/或个性化的(个例化)结果。

本文使用的术语“增强”和“提高”有益效果及其变式是指与安慰剂相比的生物活性剂的治疗效果，或者相对于使用不含本发明生物活性剂的药物组合物时通常所获得的上述现有医学治疗效果的提高。作为施用生物活性剂的结果，当获得的治疗效果的强度和/或程度得到促进和/或提高时，“治疗效果的提高”是明显的。“治疗效果的提高”还包括治疗益处的时长得到延长。它还可以表现为，与施用不含生物活性剂的较高量的药物组合物相比，当共同施用所述药物组合物和本发明提供的生物活性剂时获得相同益处和/或效果所需要的所述药物组合物的量较低。优选但不必需地，所述效果的增强引起对所述药物组合物单独不能有效治疗或者治疗效果较小的急性症状的治疗。与单独施用药物组合物相比，当本发明的生物活性剂与药物组合物共同施用时治疗效果具有至少5%的提高，例如治疗效果具有至少10%的提高，则实现了增强。优选地，所述提高为至少25%，更优选至少50%，甚至更优选至少75%，最优选至少100%。

本文使用的生物活性剂和现有药物的“共同施用”或“一起施用”是指，在一定时间段内施用本发明的一种或多种生物活性剂，或者施用本发明的一种或多种生物活性剂和现有药物组合物。所述时间段优选小于72小时，例如48小时，例如小于24小时，例如小于12小时，例如小于6小时，如小于3小时。然而，这些术语还表示可以一起施用所述生物活性剂和治疗性组合物。

“有此需要的个体”是指可以从本发明受益的个体。在一个实施方式中，所述有此需要的个体为患病个体，其中所述疾病为其中IL-1发挥显著作用的免疫疾病。

本发明使用的术语“试剂盒”提供了本发明的一种或多种肽、化合物或组合物，和用于组合施用的第二生物活性剂。试剂盒是指用于同时、分离或顺次应用。所述应用可以是治疗性应用，例如治疗IL-1在其中发挥显著作用的炎症。

由于标准分析方法的不精确性，聚合物的分子量和长度被理解为近似的数值。应当理解，当此数值被表示为“约”X或“近似于”X时，所指的数值X精确至+/-20%，例如+/-10%，如+/-5%。

发明详述

炎症

炎症(拉丁文为inflammare，焚烧)是血管组织对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应的一部分。炎症是生物体除去有害的刺激并启动康复进程的保护性尝试。炎症不是感染的同义词，即便在炎症由感染导致的情况下也是如此。尽管感染由微生物导致，但炎症是生物体对病原体的反应之一。

炎症可被分类为急性或慢性。急性炎症是机体对有害刺激的初步反应，并且通过血浆和白细胞(特别是粒细胞)从血液至受伤组织的移动增加而实现。生化事件的级联使炎性反应传播并成熟，涉及受伤组织内的局部血管系统、免疫系统和各种细胞。长期的炎症，称作慢性炎症，导致存在于炎症位点的细胞类型的进行性改变，并且表征为来自炎性过程的组织的同时的破坏和康复。

白介素

白介素是首先见于由白血血球(白细胞，leukocyte)表达的一类细胞因子(分泌的蛋白/信号转导分子)。术语白介素（interleukin）源自于(中介的-（inter-)）、“作为通讯方式”和(-白细胞的因素（-leukin)）“来自很多这样的蛋白由白细胞产生并作用于白细胞的事实”。然而，这个名称是纪念性的，现已发现白介素由多种细胞产生。

免疫系统的功能在很大程度上依赖于白介素，并且已经描述了大量白介素的罕见缺陷，所有的均显示自身免疫性疾病或免疫缺陷的特征。大多数白介素由辅助CD4+T淋巴细胞合成，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。其促进T细胞、B细胞和造血干细胞的发育和分化。

白介素-1(IL-1)

白介素1(IL-1)是两种不同的蛋白质(IL-1α（IL1A）和IL-1β（IL1B）)的通称，它们是主要的促炎性细胞因子。它们参与免疫反应、炎性反应、组织损伤和造血作用的调控。

IL1基因家族由IL1α、IL1β和IL1RA(IL-1受体拮抗蛋白，也称作IL1Ra)三个成员组成。IL1RA由在一侧靠近3个β-发卡环的6链β-桶组成。尽管IL1α和IL1β是IL1受体的激动剂，天然发生的IL1RA发挥此受体的特异性拮抗剂的功能(Hallegua和Weisman，2002)。

IL-1α

白介素1α(IL-1α)是在人体中由IL1A基因编码的蛋白。

由该基因编码的蛋白是白介素1家族的细胞因子。白介素1α具有广谱的代谢、生理学、造血活性，并且在免疫反应的调控中发挥核心作用之一。其结合白介素-1受体。由其初始合成的前体不包含信号肽片段的结构方面而言，IL-1α是该细胞因子家族中的独特成员(已知IL-1β和IL-18也是如此)。在通过特异的蛋白酶除去N-末端氨基酸的加工后，所得的肽称作“成熟”形式。与质膜结合的钙激活蛋白酶，即钙激活的半胱氨酸蛋白酶，主要负责将IL-1α前体切割成成熟的分子。IL-1α的31kDa前体形式及其18kDa的成熟形式都具有生物活性。

与在内质网中翻译的大多数蛋白质不同，31kDa IL-1α前体的合成与细胞骨架结构(微管)相关。

IL-1α的三维结构包含完全由β-折叠链构成的开放式桶。成熟形式的IL-1α的晶体结构分析显示其具有结合IL-1受体的两个位点。主要的结合位点位于其桶的开放顶端，这与IL-1β的相似但不相同。

IL-1α由上皮细胞组成型地产生，并且大量地见于正常人上皮中，在那里它们发挥维持皮肤屏障功能的重要作用。除皮肤角质细胞、一些上皮细胞以及中枢神经系统中的某些细胞之外，在健康人的大多数细胞类型、组织和血液中没有观察到IL-1α。很多种类的其他细胞只有在刺激后才可被诱导转录IL-1α基因并产生前体形式的IL-1α。它们包括成纤维细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞和嗜碱细胞、内皮细胞、血小板、单核细胞和骨髓细胞系、血液T-淋巴细胞和B-淋巴细胞、星形胶质细胞、肾系膜细胞、朗格汉斯细胞、皮肤树突细胞、自然杀伤细胞、大颗粒淋巴细胞、小胶质细胞、血液中性粒细胞、淋巴结细胞、母体胎盘细胞和多种其他细胞类型。

IL-1α活性的最重要调控分子是IL-1RA，其通常以10-100倍摩尔过量地产生。此外，可溶形式的I型IL-1R具有对IL-1α的高亲和性，并且以5-10摩尔过量地产生。IL-10也抑制IL-1α合成。

IL-1β

白介素1β(IL-1β)也称作catabolin，是在人体中由IL1B基因编码的细胞因子蛋白。IL-1β前体被胱天冬氨酸酶1(caspase1；白介素1β转化酶)切割。胞浆巯基蛋白酶切割所述产物，形成成熟的IL-1β。

IL-1β是白介素1细胞因子家族的成员。这种细胞因子由活化的巨噬细胞作为前蛋白产生，所述前蛋白经过胱天冬氨酸酶1的蛋白水解加工成为其活性形式。这种细胞因子是炎性反应的重要介体，并且参与多种细胞活性，包括细胞增殖、分化和凋亡。已发现，这种细胞因子在中枢神经系统(CNS)环氧化酶-2(PTGS2/COX2)的诱导促成炎性疼痛超敏性。此基因和8个其他白介素1家族基因在2号染色体上形成细胞因子基因簇。

IL-1受体拮抗蛋白(IL1RA)

白介素1受体拮抗蛋白(IL1RA)是在人体中由IL1RN基因编码的蛋白。它是抑制IL1A和IL1B活性的IL-1细胞因子家族的成员，并且调控多种与IL-1相关的免疫和炎性反应。此基因和5个其他密切相关的细胞因子基因在2号染色体上形成跨越大约400kb的基因簇。现已报道了编码不同亚型的4种选择性剪接转录变体。IL1RN基因中的突变导致所谓白介素-1受体拮抗剂缺陷(DIRA)的罕见疾病。IL1RN基因的变体还与精神分裂症的风险相关。

在蛋白相似性方面，IL-1β与IL-1RA的相关性比其与IL-1α更紧密。人成熟IL-1α与成熟IL-1β之间相同的氨基酸为22%，而将IL-1β与IL-1RA比较时，相同的氨基酸为26%，并且在将IL-1α与IL-1RA比较时，相同的氨基酸仅为18%。

下文中公开了IL1RA的所有4种亚型的IL1RA序列(“序列”)。

IL-1受体

IL1具有两个不同的受体：IL1RI和IL1RII(分别为I型和II型IL-1受体，或1型和2型IL-1受体)。IL1RI包含具有用于IL1结合的3个免疫球蛋白样模块的细胞外部分和长的胞质域，而IL1RII包含相同的胞外域，但更短的胞质域。

这两个受体均跨膜（TM）且以可溶形式存在：认为可溶性IL-1受体通过在翻译后切割膜受体的胞外部分衍生而来。这两种IL-1受体(CD121a/IL1R1，CD121b/IL1R2)似乎在进化中十分保守，并且位于相同的染色体定位。这两个受体均可结合所有3种形式的IL-1(IL-1α、IL-1β和IL-1RA)。

IL1以低亲和性与IL1RI结合，并且，IL1R辅助蛋白(IL1R-AcP)与此复合物的结合导致形成由IL1、IL1RI和IL1R-AcP构成的不对称三元复合物的高亲和性结合，引起受体活化和随后的细胞内信号转导和细胞反应。IL1RA主要与IL1RI结合，但由于缺少第二结合位点而不会诱导信号转导。因为IL1与IL1RII的结合不能激发细胞内信号，所以IL1RII是诱饵受体。天然发生的IL1RA和诱饵受体降低了IL1的作用，并且因此似乎是细胞因子生物学中的独特现象(Dinarello,1996)。

本发明的肽片段

本发明公开了具有高于全长IL1RA蛋白和阿那白滞素的改进性质的截短形式的IL1RA。本发明的短肽的改进性质涉及提高的溶解性、提高的稳定性和较低的合成成本。此外，本发明的肽保留了其与IL-1R1结合的能力，并且干扰IL-1β与此受体结合；还有本文他处提及的多种期望的下游作用。

本发明提供的短肽还可使所述短肽更好地跨越穿过血脑屏障。特别令人感兴趣的是，本发明人显示，本发明的10个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO:1)对轴突生长和神经元细胞存活具有积极作用。

血脑屏障(BBB)是循环血液与中枢神经系统（CNS）中的脑脊液（CSF）的分离，用以保持动态平衡。其沿着所有脑毛细管发生，并且由不存在于正常循环中的、毛细管周围的紧密连接组成。内皮细胞限制微观对象(例如，细菌)和大或亲水分子向脑脊液中的扩散，同时允许小的疏水分子(O₂、激素、CO₂)的扩散。屏障的细胞利用特异性蛋白主动运输代谢产物(例如葡萄糖)跨越此屏障。此屏障还包括厚基底膜和星形胶质细胞终足(endfeet)。因此，BBB有效阻止大多数分子进入脑。这意味着，或许可治疗CNS病变的很多药物不能进入将发挥作用的特殊区域。

尽管大多数肽可能能够在一定程度上透过BBB，但在蛋白的分子量(MW)与渗透程度之间存在明显的关联，因此，较短、没有分支的低分子量肽具有较好的渗透程度，这意味着小分子量肽在脑中达到工作浓度所需的肽量较低。

本发明的肽包含IL1RA蛋白的小片段。在一个实施方式中，所述肽包含SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其功能性片段或变体，或由SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其功能性片段或变体组成。

本文使用的“其片段或变体”是指SEQ ID NO:1的片段(长度)、SEQ ID NO:1的变体(同一性)，和SEQ ID NO:1的片段的变体(同一性和长度)。后者可称作“变体片段”。

本发明氨基酸序列的片段和变体都是指所述序列的功能等效物，即保持其结合IL1R1的能力。

衍生自IL1RA发明的本发明的进一步的短肽包含RIWDVNQKT(SEQ ID NO:29)、TAMEADQPVS(SEQ ID NO:35)或GPNAKLEEKA(SEQ ID NO:36)或其变体、片段或片段的变体，或由RIWDVNQKT(SEQ ID NO:29)、TAMEADQPVS(SEQ ID NO:35)或GPNAKLEEKA(SEQ ID NO:36)或其变体、片段或片段的变体组成；如本文SEQ ID NO:1所示。

在优选的实施方式中，本发明肽的特异性在于，所述肽序列在氨基酸序列被混杂或反转时没有作用或作用显著降低。此外，优选所述肽特异性拮抗IL-1的作用，且不拮抗其他蛋白和白介素。

例如SEQ ID NO:1的功能性片段或变体是保留了其结合IL-1R1的能力并且干扰IL-1β与所述受体的结合，和/或以与SEQ ID NO:1相当的水平保留影响关于抑制IL-1诱导的NF-kB活化、降低IL-1诱导的巨噬细胞的TNF-α释放、诱导轴突生长和/或促进神经元细胞存活方面的下游作用的能力的片段或变体(或片段的变体)。这同样适用于SEQ ID NO:29、35和36。

在本文中，采用的是氨基酸残基的标准一字母代码以及标准三字母代码。氨基酸的简写根据IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature Eur.J.Biochem,1984,vol.184,pp9-37中的推荐。在本申请中，针对天然氨基酸使用的是三字母代码或一字母代码。当没有特别说明是L或D型(光学异构体)时，应该理解为所关注的氨基酸具有天然的L型(参见Pure&Appl.Chem.Vol.(56(5)pp595-624(1984))或者D型，从而使所形成的肽可以由L型氨基酸、D型氨基酸或者混合的L型和D型的序列组成。

当没有特别说明时，应该理解本发明使用的肽的C-末端氨基酸以游离的羧酸形式存在，其还可以表示为“-OH”。然而，在另一个实施方式中，本发明使用的肽的C-末端氨基酸可以是酰胺化的衍生物，表示为“-NH₂”。当没有其它说明时，肽的N-末端氨基酸包含游离的氨基基团，其也可以表示为“H-”。然而，在另一个实施方式中，本发明的肽的N-末端氨基酸可以是乙酰化的衍生物，表示为“-乙酰基”或“COCH₃”。

在一个实施方式中，本发明的肽包含天然引入到多肽中的22种氨基酸(即所谓成蛋白氨基酸或天然氨基酸)中的至少5种。其中，20种由通用遗传密码编码。剩余的2种：硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸，通过独特的合成机制引入到蛋白中。本发明的肽还可包含一种或多种非天然、非成蛋白或非标准氨基酸。

在优选的实施方式中，本发明的肽可包含SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其变体、片段或片段的变体，或由SGRKSSKMQA(SEQ ID NO:1)或其变体、片段或片段的变体组成。

在另一个实施方式中，本发明的肽可包含SEQ ID NO:29、35或36，或其片段、变体或变体片段，或由SEQ ID NOs:29、35或36，或其片段、变体或变体片段组成。

在一个实施方式中，所述肽包含衍生自包含SEQ ID NO:1或其片段或变体或其变体片段的IL1RA的至多14个氨基酸的连续氨基酸序列，例如至多13个氨基酸，例如至多12个氨基酸，例如至多11个氨基酸，例如至多10个氨基酸。

在一个实施方式中，本发明的肽由组成IL1RA的SEQ ID NO:1的10个连续氨基酸残基组成。在另一个实施方式中，本发明的肽具有小于或等于5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个衍生自IL1RA的连续氨基酸残基的总长度，并且包含SEQ ID NO:1，或其变体或片段，或变体片段。

本发明的肽可由5-10个连续氨基酸组成，例如6-10个连续氨基酸，例如8-10个连续氨基酸。在一个实施方式中，本发明的肽由包含SEQ ID NO:1、29、35或36中任一个，或其变体、片段或变体片段的5-6个连续氨基酸组成，例如6-7个，例如7-8个，例如8-9个，例如9-10个，例如10-11个，例如11-12个，例如12-13个，例如13-14个连续氨基酸。

在一个实施方式中，本发明的肽由包含SEQ ID NO:29、35或36中任一个，或其变体、片段或变体片段的5-6个连续氨基酸组成，例如6-7个，例如7-8个，例如8-9个，例如9-10个，例如10-11个，例如11-12个，例如12-13个，例如13-14个，例如14-15个，例如15-16个，例如16-17个，例如17-18个，例如18-19个，例如19-20个连续氨基酸。

在另一个实施方式中，本发明的肽包含连续的氨基酸序列，其具有衍生自包含SEQ IDNOs:29、35或36，或其片段、变体或变体片段的IL1RA的具有小于或等于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸残基的总长度。

在另一个实施方式中，本发明肽包含SEQ ID NO:1、29、35或36的片段，或由SEQ IDNOs:1、29、35或36的片段组成，所述片段包含所述肽序列的至少5个连续氨基酸，例如所述肽序列的5个连续氨基酸，例如6个连续氨基酸，例如7个连续氨基酸，例如8个连续氨基酸，例如9个连续氨基酸。

因此，本文将肽的片段定义为包含SEQ ID NO:1、29、35或36的至少5个连续氨基酸的肽，例如SEQ ID NO:1、29、35或36的5个连续氨基酸，例如6个连续氨基酸，例如7个连续氨基酸，例如8个连续氨基酸，例如9个连续氨基酸。因此，SEQ ID NO:1、35或36的片段可包含所述序列的5和9个之间的氨基酸，并且，因此，SEQ ID NO:29的片段可包含所述序列的5和8个之间的氨基酸。

本发明肽的变体，或所述肽的片段的变体可以是与SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段具有至少40%序列同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的同一性，或者与SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段具有40-50%同一性，例如50-60%同一性，例如60-70%同一性，例如70-80%同一性，例如80-90%同一性，例如95-99%序列同一性的氨基酸，其中所述同一性定义为在将其与SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段比较时，所述变体序列中相同氨基酸的百分比。

可使用公知的算法，例如BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85或BLOSUM90，或通过存在于待比较的两条肽序列中的相应位置的具体氨基酸的简单比较，来计算氨基酸序列之间的同一性。

同源性可作为同一性/序列同一性的同义词使用。

本发明肽的变体还可以是与SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段具有约10%的阳性氨基酸匹配的氨基酸序列，例如约20%的阳性氨基酸匹配，例如约30%的阳性氨基酸匹配，例如约40%的阳性氨基酸匹配，例如约50%的阳性氨基酸匹配，例如约60%的阳性氨基酸匹配，例如约70%的阳性氨基酸匹配，例如约80%的阳性氨基酸匹配，例如约90%的阳性氨基酸匹配，其中阳性氨基酸匹配定义为在所比较的两条序列中的相同位置存在具有相似物理和/或化学性质的氨基酸残基。本发明的具体阳性氨基酸匹配是：K对R、E对D、L对M、Q对E、I对V、I对L、A对S、Y对W、K对Q、S对T、N对S和Q对R。

变体包括其中的烷基氨基酸被烷基氨基酸取代，其中的芳族氨基酸被芳族氨基酸取代，其中的含硫氨基酸被含硫氨基酸取代，其中的含羟基氨基酸被含羟基氨基酸取代，其中的酸性氨基酸被酸性氨基酸取代，其中的碱性氨基酸被碱性氨基酸取代，或其中的二元单羧酸氨基酸被二元单羧酸氨基酸取代的序列。

在另一个实施方式中，本发明的肽序列变体，或肽序列的片段的变体可包含至少一个取代，例如彼此独立引入的多个取代。在一个实施方式中，肽变体包含对SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段的氨基酸序列的1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

SEQ ID NO:1、29、35或36或其片段的变体可包含彼此独立的一个或多个保守取代，即，侧链具有相似生化性质并因此不影响肽的功能的氨基酸取代。

在常见的氨基酸中，例如，“保守性氨基酸取代”还可以通过在以下各组中的氨基酸之间的取代而阐明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天门冬氨酸和谷氨酸、(5)谷氨酰胺和天门冬酰胺；和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

本发明的多肽还可包含非天然发生的氨基酸残基。非天然发生的氨基酸包括例如但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酸、同型谷氨酸、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3,3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯基丙氨酸、4-氮杂苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。

保守性取代(或同义取代)可以在本发明的肽或其片段的任何一个或多个位置引入，只要所述变体或片段的变体保留功能性。然而，也可能需要引入在一个或多个位点的非保守性取代(非同义取代)。

导致形成本发明肽的变体的非保守取代可例如极性明显不同，例如用带有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe或Met)取代带有极性侧链的残基(例如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn或Gln)，或带电荷的氨基酸(例如Asp、Glu、Arg或Lys)，或用带电荷或极性的残基取代非极性的残基；和/或ii)其对肽骨架朝向的作用明显不同，例如由另一种残基取代Pro或Gly或将另一种残基取代为Pro或Gly；和/或iii)电荷明显不同，例如用带负电荷的残基(例如Glu或Asp)取代带正电荷的残基(例如Lys、His或Arg)（且反之亦然）；和/或iv)空间位阻明显不同，例如用大体积残基(例如His、Trp、Phe或Tyr)取代具有小侧链的残基(例如Ala、Gly或Ser)（且反之亦然）。

在一个实施方式中，氨基酸的取代可基于其疏水性和亲水性值，以及氨基酸侧链取代基的相关类似性，包括电荷、大小等。

在一个实施方式中，将SEQ ID NO:1或其片段的1、2或3个丝氨酸残基(Ser)取代为选自Gln、Asn和Thr(带有极性无电荷侧链的所有氨基酸)的氨基酸；并且与之独立地，将甘氨酸(Gly)取代为选自Ala、Val、Leu和Ile的氨基酸；并且与之独立地，将至少一个精氨酸(Arg)取代为选自Lys和His(均具有正电荷侧链)的氨基酸；并且与之独立地，将1或2个赖氨酸残基(Lys)取代为选自Arg和His的氨基酸；并且与之独立地，将蛋氨酸(Met)取代为选自Leu、Pro、Ile、Val、Phe、Tyr和Trp(均具有疏水侧链)的氨基酸；并且与之独立地，将至少一个谷氨酰胺(Gln)取代为选自Asp、Glu和Asn的氨基酸；并且与之独立地，将至少一个丙氨酸(Ala)取代为选自Gly、Val、Leu和Ile的氨基酸。

SEQ ID NO:1由10个氨基酸组成，称作1至10位。在一个实施方式中，在SEQ ID NO:1的1位的Ser不变、删除或由Gly取代；2位的Gly不变、删除或由Ala、Ser或Arg取代；3位的Arg不变、删除或由Lys取代；4位的Lys不变，或由Arg、Thr、Gln、Met、Gly或Ser取代；5位的Ser不变，或由Pro、AlaArg、Leu、Gln、Asn、Gly或Lys取代；6位的Ser不变，或由His、Gln、Trp、Asn、Glu、Pro、Ala、Thr、Cys、Gly或Arg取代；7位的Lys不变，或由Arg、His、Glu或Ser取代；8位的Met不变，或由Leu、Thr或Ser取代；9位的Gln不变、删除或由Glu、His或Lys取代；和/或10位的Ala不变、删除或由Leu或Met取代。

此外，SEQ ID NO:1、29、35或36的功能性变体可包含在所述序列任一末端中或末端上的一个或多个氨基酸添加，例如，添加到SEQ ID NO:1、29、35或36，或其变体、片段或变体片段的任一末端中或末端上的1、2、3、4或5个氨基酸。

本发明SEQ ID NO:1的变体、片段或片段的变体的例子包括(与SEQ ID NO:1相比，相同的氨基酸标有下划线；且与SEQ ID NO:1相比，“缺少”或省略的氨基酸表示为“-“；标出了与SEQ ID NO:1相比的整体同一性得分)：

SEQ ID NO:1SGRKSSKMQA(‘Ilantafin’/’Ilantide’)

SEQ ID NO:2SGRKPSKMQA同一性：9/10(90%)

SEQ ID NO:3SGRKSQKM--同一性：7/8(87.5%)

SEQ ID NO:4--RKASKLQA同一性：6/8(75%)

SEQ ID NO:5SARKSEKM--同一性：6/8(75%)

SEQ ID NO:6SGRQSPKM--同一性：6/8(75%)

SEQ ID NO:7SGRKSPHSKLPA同一性：5/10(50%)

SEQ ID NO:8SSRQSSKM--同一性：6/8(75%)

SEQ ID NO:9SGKRPCKMQA同一性：6/10(60%)

SEQ ID NO:10--RMNSKMQ-同一性：5/7(71.4%)

SEQ ID NO:11---KSPKMQ-同一性：5/6(83.3%)

SEQ ID NO:12--RKGGKMQ-同一性：5/7(71.4%)

SEQ ID NO:13SGRGKSSSKM同一性：4/10(40%)

SEQ ID NO:14GRRSSRKMPA同一性：5/10(50%)

SEQ ID NO:15--RKANKLQA同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:16SGRKSHRLQ-同一性：6/9(66.6%)

SEQ ID NO:17--RKAWKMQ-同一性：5/7(71.4%)

SEQ ID NO:18--RKANKLQA同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:19-GRRSSKTEA同一性：6/9(66.6%)

SEQ ID NO:20--RTSSRMQ-同一性：5/7(71.4%)

SEQ ID NO:21-GRKRSRMH-同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:22-GRKRSKTQ-同一性：6/8(75%)

SEQ ID NO:23SGRKLAKLQ-同一性：6/9(66.6%)

SEQ ID NO:24--RKSTEMEA同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:25--RKQNKMEA同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:26--RRSSRLQA同一性：5/8(62.5%)

SEQ ID NO:27--RTSSRMQ-同一性：5/7(71.4%)

本发明肽的变体还可意味着可对肽序列进行修饰。修饰可以是技术人员已知的任何修饰，例如称作翻译后修饰的那些。这些包括一个或多个氨基酸残基的乙酰化、磷酸化、甲基化、糖基化、糖化、酰胺化、羟基化、脱亚胺基化、脱酰胺化，氨甲酰化和硫酸化。

在一个实施方式中，本发明的肽不包含氨基酸序列RPSGRKSSKMQAFRI(SEQ ID NO:37)或由RPSGRKSSKMQAFRI(SEQ ID NO:37)组成，和/或不包含氨基酸序列LVAGY(SEQ IDNO:38)或由LVAGY(SEQ ID NO:38)组成。

在一个实施方式中，本发明的肽是分离的肽。

在一个实施方式中，本发明的肽是非天然发生的肽；衍生自天然发生的肽(IL1RA)。在一个实施方式中，其为合成制备的。

在具体的实施方式中，本发明的肽具有在100Da至5000Da范围的分子量，例如100Da至250Da，例如250Da至500Da，例如500Da至750Da，例如750Da至1000Da，例如1000Da至1500Da，例如1500Da至2000Da，例如2000Da至3000Da，例如3000Da至4000Da，例如4000Da至5000Da。

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其作为药物使用。

合成制备

肽的合成生产方法是本领域熟知的。用于生产合成肽的详细描述以及实践建议可见于Synthetic Peptides:A User's Guide(Advances in Molecular Biology),Grant G.A.ed.,OxfordUniversity Press,2002；或可见于Pharmaceutical Formulation:Development of Peptides andProteins,Frokjaer and Hovgaard eds.,Taylor and Francis,1999。

本发明的肽可作为单体、二聚体或四聚体合成(纯度>80%，Schafer-N，丹麦哥本哈根)。在一个实施方式中，二聚体和四聚体分别由与赖氨酸骨架连接的2和4条链组成。

在一个实施方式中，本发明的肽序列可以通过合成产生，尤其通过序列辅助性肽合成(SAPS)方法或固相肽合成(SPPS)产生。这是技术人员熟知的。

也可以使用9-芴甲氧基羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)作为N-a-氨基保护基团和侧链官能团的适合的共同保护基团，在全自动肽合成仪上分批地合成肽。

在通过反相HPLC纯化后，可以对肽进行进一步加工从而获得例如环状的或C-或N-末端经过修饰的异构体。用于环化和末端修饰的方法是本领域熟知的。

本发明的化合物

本发明的一个方面提供了包含至少一个本发明的肽，或由本发明的肽组成的化合物。在一个实施方式中，所述肽作为单体配制(即，包含1拷贝的肽)，而在另一个实施方式中，所述肽作为多聚体配制。

在本发明的一个方面，提供本发明的化合物，其作为药物使用。

多聚化合物

本发明的肽序列可以通过化学键或通过连接基团与本发明的另一个(相同或不相同)肽序列连接。在一些实施方式中，本发明的肽可以作为单体的寡聚物或多聚物配制，其中每个单体是如上文所述的肽序列。

因此，根据本发明，多聚化合物可以是包含2个或更多的本发明的肽序列的聚合物，所述肽序列是相同的或不相同的，其中，所述2个或更多的肽序列中的至少一个是本发明的肽。优选的，2个肽序列都是本发明的肽。

在一个实施方式中，所述多聚化合物是二聚体，包含本发明的2个肽，所述2个肽彼此相同或不相同。

在另一个实施方式中，所述多聚化合物是三聚体或四聚体，分别包含本发明的3或4个肽，所述肽彼此相同或不相同。

在一个实施方式中，所述多聚化合物是树形化合物，例如四聚树形化合物。树形化合物是重复分支、大致球形的大分子，通常相对于核心是对称的，并且常采用球形的三维形态。本发明的树形化合物可包含4个肽、8个肽、16个肽或32个肽；优选4个肽(即，四聚树形化合物)。

在一些具体实施方式中，所述多聚化合物可包含本发明的2个相同氨基酸序列(二聚体)，或者所述化合物可包含本发明的4个相同拷贝的氨基酸序列(四聚树形化合物)。

本发明的多聚体可通过由肽键或连接基团连接2个或更多的肽单体而制备。它们可以连接到赖氨酸骨架，例如赖氨酸残基(单个赖氨酸残基)，或连接到聚合物载体，例如蛋白载体。在一个实施方式中，此连接基团包含多个赖氨酸残基，例如具有多个赖氨酸残基的核部分。然而，也可以考虑技术人员已知的任何其他肽单体连接。

在一个实施方式中，所述连接可出现在肽单体的N-末端或C-末端。

方法

本发明的另一方面提供了用于刺激轴突生长和/或促进神经元存活的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的本发明的肽、化合物或组合物。

本发明还公开了用于干扰IL1RI与IL-1结合的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的本发明的肽、化合物或组合物。

在优选的实施方式中，所述个体是人，例如患有神经退行性病症的人。

本发明还涉及用于鉴定本文所述肽的结合伴侣的方法，所述方法包括提取所述多肽和分离所述结合伴侣的步骤。

药物制剂

尽管本发明的肽或化合物可作为化学原料(或肽)施用，但有时优选本发明的肽或化合物以药物制剂的形式存在。此药物制剂可以是指药物组合物或药学可接受或安全的组合物。

因此，本发明进一步提供了药物制剂，其包含本发明的肽或化合物，或其药学可接受的盐或酯，和药学可接受的载体和/或稀释剂。所述药物制剂可通过常规技术制备，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy2005,Lippincott,Williams&Wilkins中所述的。

所述药学可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制品包括粉末、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂(cachets)、栓剂和分散性粒剂。固体载体可以是一种或多种赋形剂，其还可充当稀释剂、矫味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、润湿剂、片剂崩解剂或包封材料。

固体载体的实例包括乳糖、白陶土(terra alba)、蔗糖、环糊精、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚。液体载体的实例为糖浆、花生油、橄榄油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯、水、盐水或葡萄糖溶液。类似地，所述载体或稀释剂可包括本领域已知的任何缓释材料，例如单独的或与蜡混合的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。

还包括固体形式的制品，其用于在使用前不久转化成液体形式的制品。这样的液体形式包括溶液、悬浮剂和乳剂。这些制品除活性成分之外，还可包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂和增溶剂等。

本发明的化合物可经配制用于肠胃外施用，并且可以以任选地添加了防腐剂的安瓿、预填充针剂、小体积输注的单位剂量形式或多剂量容器的形式呈现。所述组合物可以采取在油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液的形式，例如在含水聚乙醇中的溶液。

油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄榄油)、可注射有机酯(例如，油酸乙酯)，并且可以包含诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂或助悬剂、稳定剂和/或分散剂的试剂。或者，所述活性成分可以为通过无菌固体的无菌分离或通过溶液冻干获得的粉末形式，以在使用前利用合适的介质(例如无菌且无热原质的水)进行构造。

本发明的化合物也可配制用于局部递送。局部给药的区域包括皮肤表面，并且还包括阴道、直肠、鼻、口和咽喉的粘膜组织。局部制剂可包括用于局部给药的药学可接受的载体。因此，所述组合物可采用例如悬浮剂、溶液、软膏、洗剂、性润滑剂、乳霜、泡沫、气雾剂、喷剂、栓剂、植入物、吸入剂、片剂、胶囊、干粉、糖浆、唇膏或锭剂的形式。

本文所述的药物制剂可透皮给药。透皮给药通常包括用于使药物经由皮肤进入患者的系统循环的化合物的递送。皮肤位点包括用于透皮施用所述药物的解剖学区域，并且包括前臂、腹部、胸部、背部、臀部和乳突区等。

透皮递送通过使患者的皮肤在长时间段中暴露于化合物源而完成。透皮贴剂具有向体内提供药剂-化学修饰剂复合物的受控递送的额外优点。此类剂型可通过将药剂-化学修饰剂复合物溶解、分散或引入适合的媒介(例如弹性体基质材料)而制备。还可使用吸收增强剂以提高所述化合物的跨皮肤流动。可通过提供控速膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中控制此流动的速率。例如，可以由背衬材料和丙烯酸酯粘合剂制备简单的粘性贴剂。

本发明的洗剂还包括适合应用于眼部的那些。洗眼剂可包含任选地包含杀菌剂的无菌含水溶液。

用于鼻、肺和/或支气管给药的制剂通常作为气溶胶给药，以确保雾化的剂量真实地到达鼻腔、支气管道或肺的粘膜。术语“气溶胶颗粒”在本文用于描述适合鼻、支气管或肺给药的(即将到达粘膜的)液体或固体颗粒。

气溶胶通常通过使用设计用于肺和/或支气管递送的机械设备给药，包括但不限于雾化器、定量吸入器和粉末吸入器。关于递送设备的构建，可使用本领域已知的任何雾化形式，包括但不限于液体制剂的喷瓶、喷雾、雾化或泵雾化和干粉制剂的雾化。

液体气溶胶制剂通常包含在药学可接受稀释剂中的本发明的化合物。药学可接受的稀释剂包括但不限于无菌水、盐水、缓冲盐水和葡萄糖溶液等。

用于从粉末吸入设备分散的制剂通常包含细分的干粉，其包含本发明的药物组合物(或衍生物)，并且还可包含有利于所述粉末从所述设备分散的量的填充剂，例如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露糖醇。用于吸入的干粉制剂还可使用填充粉末的胶囊配制，特别是选自合成塑料的材料的胶囊。

所述制剂根据所采用设备的类型配制，并可包括使用适合的推进材料，以及可用于治疗的且本领域技术人员已知的常见稀释剂、助剂和/或载体。所述推进剂可以是本领域中常用的任何推进剂。此类有用推进剂的具体非限定性实例为含氯氟烃、氢氟烃、氢氯氟烃或烃类。

此实施方式的制剂还可包括可用于维持pH、溶液稳定或用于调节渗透压的其他试剂。

本发明还包括本发明化合物的药学可接受的盐(在其能够制备的情况下)。这些盐可以是将其用于制药应用时可接受的那些。也就是说，所述盐可保持母体化合物的生物活性，且所述盐在其应用中及在用于治疗疾病时没有不良或有害作用。

药学可接受的盐以标准方式制备。如果母体化合物是碱，则在适合的溶剂中使用过量的有机或无机酸进行处理。如果母体化合物是酸，则在适合的溶剂中使用过量的无机或有机碱进行处理。

本发明的化合物可以以其碱金属或碱土金属盐的形式，与药学可接受的载体或稀释剂，并发地(concurrently)、同时（simultaneously)或一起给药，特别且优选以其药物组合物的形式，通过口服、直肠或胃肠外(包括皮下)途径以有效量给药。

用于本发明药物组合物的药学可接受的酸加成盐的实例包括，例如，衍生自无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸(例如，酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、对甲苯磺酸酸和芳基磺酸)的那些。

剂量

剂量需求可以随所采用的具体药物组合物、给药途径和所治疗的具体受试者而不同。本领域技术人员也认识到，化合物个体剂量的最佳量和间隔由所治疗的病症的性质和程度、给药的形式、途径和位点，以及所治疗的具体患者决定，且可由常规技术确定这样的最佳条件。本领域技术人员还可理解，可使用治疗测定试验的常规过程确定最佳疗程，即在限定天数中每天给予化合物的剂量数。

每日肠胃外剂量方案可在约0.1至约100mg/kg总体重的范围，例如0.1至1mg/kg、1至5mg/kg、5至10mg/kg、10至15mg/kg、15至20mg/kg、20至30mg/kg、30至40mg/kg、40至50mg/kg、50至60mg/kg、60至70mg/kg、70至80mg/kg、80至90mg/kg和90至100mg/kg总体重。可使用本文实施例7中所述的模型评估所述剂量，其中，在小鼠中使用3.3或10mg/kg的每日剂量。

剂量可每天给药一次，或以高于或低于每天一次的频率给药。例如，剂量可每天给药1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。或者，剂量可以按1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的间隔给药。

本文使用的术语“单位剂量形式”是指适合作为用于人和动物受试者的单一剂量的物理离散单位，每个单位包含单独或与其他试剂组合的预定量化合物，经计算的量足以与药学可接受的稀释剂、载体或介质结合，提供期望的效果。本发明的单位剂量形式的规格依赖于所采用的具体的一种或多种化合物和待实现的作用，以及与宿主内的各化合物相关的药效学。施用的剂量应当是“有效量”或在患者个体中达到“有效水平”所需的量。

在将“有效水平”用作剂量的优选终点时，实际剂量和方案可根据药物代谢动力学、药物分布和代谢的个体间差异而改变。例如，可将“有效水平”定义为对应于本发明化合物浓度的患者中期望的血液或组织水平。

给药

主要的给药途径是口服和胃肠外给药，以将化合物引入血流，以最终靶向期望作用位点。由于在胃肠道中的降解，口服给药较少优选用于本发明的蛋白化合物。胃肠外给药是非口服/肠途径的任何给药途径，借此使化合物避免在肝脏中的首过降解(first-pass degradation)。因此，胃肠外给药包括任何注射和输注，例如推注或连续输注，例如静脉内给药、肌肉内给药和皮下给药。此外，胃肠外给药包括吸入和局部给药。

由于肽在被吞咽的情况下易于降解，因此，优选胃肠外给药。本发明的肽具有显示没有聚集潜力的高溶解度，使其可以配制并通过例如鼻内和皮下给药。

共给药

在一个实施方式中，本发明涉及本发明肽、化合物或组合物与一种或多种其他生物活性剂一起共给药。

在一个实施方式中，本发明涉及本发明肽、化合物或组合物与一种或多种抗炎药一起共给药。

在一个实施方式中，本发明涉及本发明肽、化合物或组合物与一种或多种抗风湿药一起共给药。

在一个实施方式中，本发明涉及本发明肽、化合物或组合物与一种或多种抗神经退行药一起共给药。

其遵循，共给药应是靶向的，以优化患者的治疗，即，在患有类风湿性关节炎的患者中，批准用于此具体目的的药物可补充本发明的肽、化合物或组合物，以优化并改进对该患者的治疗结果。这与批准用于所述具体目的药物是预防性、改进性还是治愈性无关。

试剂盒

本发明还涉及试剂盒，其包含一种或多种上述肽、化合物或组合物和至少一种其他组分。所述其他组分可以是用于治疗炎性病症、糖尿病、神经退行性疾病等的药物。

炎症病症

与炎症相关的异常包括成为多种人疾病基础的大量且无关的疾病的组。免疫系统常参与炎性病症，显示过敏性反应和一些肌病，并且很多免疫系统病症导致异常的炎症。认为在炎症过程中具有病因起源的非免疫疾病包括癌症、动脉硬化症和缺血性心脏疾病。很多种蛋白参与炎症，并且其中任一种均暴露于损害或下调该蛋白的正常功能和表达的遗传突变。

在生物体内发生感染后很短的时间，IL-1激活一系列的免疫系统反应进程。具体而言，IL-1刺激成纤维细胞增殖；诱导蛋白酶的合成、后续的肌肉蛋白质水解，在血液中释放所有类型的氨基酸，并刺激急性期蛋白合成；通过提高血液中铜的浓度并降低锌和铁的浓度，改变血浆的金属离子含量；增加血液嗜中性白细胞并激活淋巴细胞增殖并诱导发烧。

在本发明的一个方面提供本发明的肽用于治疗炎性病症，特别是IL-1在其中发挥显著作用的炎性病症。

在本发明的一个方面也提供本发明的肽，其用于制造治疗炎性病症的药物，特别是IL-1在其中发挥显著作用的炎性病症。

本发明的另一方面提供了用于治疗炎性病症，特别是IL-1在其中发挥显著作用的炎性病症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

在本发明的一个实施方式中，本发明的应用或治疗可用于选自以下的炎性疾病：寻常痤疮、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、白塞氏病

慢性炎症、慢性前列腺炎、皮炎、痛风、肾小球肾炎、超敏反应(包括1型(速发型或异位性或过敏性)，包括变应性哮喘、变应性结膜炎、变应性鼻炎(花粉热)、过敏反应、血管性水肿、风疹(荨麻疹)、嗜酸粒细胞增多和对青霉素和头孢菌素的反应；2型(抗体依赖型)，包括自身免疫性溶血性贫血、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、肝炎、IBS(肠易激综合症)、幼年特发性关节炎(JIA)、天疱疮、恶性贫血(如果是自身免疫性)、银屑病、银屑病关节炎、免疫性血小板减少症、输血反应、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、间质性膀胱炎、格雷夫斯病(Gravesdisease)、重症肌无力(Myastenia gravis)、风湿热、新生儿溶血病和急性移植排斥反应；3型(免疫复合型)，包括类风湿关节炎、免疫复合型肾小球肾炎、血清病、亚急性细菌性心内膜炎、疟疾的症状、系统性红斑狼疮(SLE)、阿瑟斯反应(Arthus reaction)、农民肺(Farmer’s lung)和结节性多动脉炎；4型(细胞介导的或迟发型超敏感性DTH)，包括接触性皮炎、异位性皮炎(湿疹)、颞动脉炎、结节病、麻风病的症状、肺结核的症状、系统性硬化症、曼托试验(Mantouxtest)、腹部疾病和慢性移植排斥)、炎性肠病(包括克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征(Behcet’ssyndrome)、感染性结肠炎和未确定型结肠炎)、肌病(包括皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎)、盆腔炎疾病、足痛风、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥和血管炎。

在本发明的一个实施方式中，本发明的应用或治疗可用于选自以下的免疫疾病：胃酸缺乏自身免疫性慢性活动性肝炎(Achlorhydra Autoimmune Active Chronic Hepatitis)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性出血性脑白质炎、阿狄森氏病(Addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、变态反应、全身毛发脱失、肌萎缩侧索硬化、过敏症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、哮喘、共济失调-毛细血管扩张症、自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎、白塞氏病、乳糜性腹腔性疾病、查加斯病(Chagas’disease)、克罗恩病、慢性疲劳综合征、慢性肉芽肿病、常见变异型免疫缺陷病、1型糖尿病、迪格奥尔格综合征(DiGeorge Syndrome)、自主神经失调、电敏性(Electrosensitivity)、子宫内膜异位症、家族性地中海热、妊娠性类天疱疮(Gestational pemphigoid)、古德帕斯丘综合征、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(GBS)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、HIV感染、高IgM综合征、超敏感性、IgA缺乏症、特发性血小板减少性紫癜、IgG亚类缺乏症、免疫复合物病、免疫系统疾病、免疫缺陷综合征、间质性膀胱炎、川崎病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、莱姆病、淋巴组织增生性疾病、混合性结缔组织病、硬斑病、多化学品过敏症、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、发作性睡病、神经性肌强直、视性眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、萎缩性甲状腺炎症（Ord's thyroiditis）、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、多关节型关节炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、紫癜、类风湿关节炎(RA)、赖特综合征(Reiter’s syndrome)、阿司匹林哮喘三联症(Samter's Syndrome)、结节病、精神分裂症、舍亨二氏过敏症(Schoenlein-Henoch)、硬皮病、选择性型IgA缺乏症、严重联合免疫缺陷(SCID)、不良建筑综合症(Sick Building Syndrome)、干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、高安氏症(Takayasu’s arteritis)（多发性大动脉炎)、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风、外阴阴道炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和Wiskott-Aldrich综合征。

类风湿性关节炎

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗类风湿性关节炎。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗类风湿性关节炎的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

类风湿性关节炎(RA)是影响很多组织和器官但主要发作于滑膜关节的慢性、系统性炎性疾病。病理过程产生继发于滑膜细胞增生的滑膜炎性反应(滑膜炎)、过量的滑液和滑膜中血管翳(异常的纤维血管组织层或肉芽组织)的发生。疾病进程的病理学常导致关节软骨的破坏和关节强直(僵硬)。类风湿性关节炎还可产生在肺、心包膜、胸膜和巩膜中的弥漫性炎症和结节性病变，最常见于皮下组织中。尽管类风湿性关节炎的病因是未知的，但自身免疫在其长期性和进展中都发挥关键的作用，并且认为RA是系统性自身免疫疾病。

大约1%的世界人口受到类风湿性关节炎的影响，女性的发生频率比男性高3倍。在40至50岁之间的发生频率最高，但任何年纪的人都会受到影响。类风湿性关节炎是致残和痛苦的病症，如果没有得到充分的治疗，其可导致机能和行动力的大幅损失。临床诊断在症状、体检、射线照相(X-射线)和实验室化验（labs）的基础上进行。

目前可有多种治疗。非药物治疗包括物理疗法、矫形器、职业治疗和营养治疗，但不阻止关节破坏的进程。使用包括类固醇在内的镇痛和消炎药物缓解症状，并且需要缓解病情的抗风湿药物(DMARDs)以抑制或中断潜在的免疫过程并阻止长期破坏。最近，更新的生物类药物增加了治疗的选择。

痛风/足痛风

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗痛风和/或足痛风。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗痛风和/或足痛风的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗痛风和/或足痛风的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

痛风(在涉及大脚趾时也称作足痛风)是医学病症，通常表征为反复发作的急性炎性关节炎-发红、触痛、发热、肿胀的关节。在大脚趾底部的跖趾关节最常受到影响(～50%的病例)。然而，其还作为痛风石(单钠尿酸盐晶体的沉积)、肾结石或尿酸肾病存在。其由结晶并沉积在关节、肌腱和周边组织中的血液中升高水平的尿酸导致。在临床上，通过观测关节液中的特征性结晶确诊。

痛风在近几十年中的发生频率提高，在其生命中某些点影响约1–2%的西方人口。认为这种提高是由于人口中风险因子提高造成的，例如糖尿病综合征、更长的预期寿命和饮食变化。

目前的治疗形式包括非甾体抗炎药物(NSAID)、类固醇或秋水仙素，以改善症状。一旦急性发作消退，通常通过生活方式的改变降低尿酸水平，在频繁发作的那些患者中，由别嘌呤醇或丙磺舒(probenicid)提供长期的保护。

JIA(幼年特发性关节炎)

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗JIA。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗JIA的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗JIA的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

幼年特发性关节炎(JIA)是儿童中的持久性关节炎的最常见形式。本文中的幼年是指在16岁之前发病，特发性是指没有限定病因的病症，且关节炎是指关节滑膜的炎症。JIA是见于幼年的关节炎亚类，其可以是短暂的、自限的或慢性的。其显著区别于常见于成年的关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎)，以及属于慢性病症的存在于幼年的其他类型的关节炎(例如，银屑病关节炎和强直性脊柱炎)。JIA是自身免疫性疾病。

糖尿病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗糖尿病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗糖尿病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

在一个实施方式中，所述糖尿病是I型糖尿病。在另一个实施方式中，所述糖尿病是II型糖尿病。

糖尿病是一组代谢疾病，其中，或者由于身体不产生足够的胰岛素，或者由于细胞不响应产生的胰岛素，而使患者具有高血糖。该高血糖产生多尿(频繁排尿)、多饮(多口渴)和多食(多饥饿)的典型症状。

·1型糖尿病：由机体不能产生胰岛素导致，并且，目前需要患者注射胰岛素。(也称作胰岛素依赖性糖尿病，简称为IDDM，和青少年糖尿病)。

1型糖尿病表征为胰脏中产生胰岛素的胰岛β细胞的损失，导致胰岛素不足。这种类型的糖尿病还进一步分类为免疫介导或先天的。大部分的1型糖尿病是免疫介导性的，其中β细胞损失是T-细胞介导的免疫攻击。

·2型糖尿病：由胰岛素抵抗导致，其是细胞不能正确地使用胰岛素，有时与完全的胰岛素缺陷组合的病症。(此前称作非胰岛素依赖性糖尿病，简称为NIDDM，和成年发病的糖尿病)。

2型糖尿病的特征在于胰岛素抵抗，其可以与胰岛素分泌的相对降低组合。认为机体组织对胰岛素的缺陷性反应与胰岛素受体有关。2型糖尿病主要由于生活方式因素和遗传导致。

·妊娠糖尿病：是此前从未发生糖尿病的孕期妇女在怀孕期间具有高血糖水平的情况。其可先于2型DM的发生。

其他形式的糖尿病包括由胰岛素分泌的遗传缺陷导致的先天性糖尿病、囊性纤维化相关的糖尿病、高剂量的糖皮质激素诱导的类固醇性糖尿病和几种形式的单基因糖尿病。

没有得到正确治疗的糖尿病可导致很多并发症。急性并发症包括低血糖、糖尿病酮症酸中毒或非酮症高渗性昏迷。严重的长期并发症包括心血管病、慢性肾衰竭和视网膜损伤。因此，重要的是对糖尿病的充分治疗，以及血压控制和生活方式因素，例如戒烟和保持健康的体重。

在2000年，全世界至少1.71人口患有糖尿病，占世界人口的2.8%。2型糖尿病在目前最为常见，影响90-95%的美国糖尿病人口。

白塞氏病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗白塞氏病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗白塞氏病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗白塞氏病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

白塞氏病是罕见的、系统性形式的血管炎(或血管炎症)，其经常表现为粘膜溃疡和眼部受累(涉及眼睛)。眼部受累可以是后葡萄膜炎、前葡萄膜炎或视网膜血管炎的形式。作为系统性疾病，其还累及内脏器官，例如胃肠道、肺、肌肉骨骼和神经系统。此综合征可以是致命的；通过并发血管瘤破裂或严重的神经系统并发症导致死亡，因此，必需立即就医。

神经退行性疾病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗神经退行性疾病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗神经退行性疾病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

具体地，所述神经退行性疾病具有神经炎性成分，并且选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症。特别地，所述神经退行性疾病可以是IL-1在其中发挥重要作用的那些。

在正常情况下，大脑是在免疫方面具有特权的位点。免疫反应的抑制因素包括神经递质、神经激素、神经营养因子、抗炎因子和通过粘附分子或CD200的细胞间接触。然而，单个因素都不能完全解释免疫控制。在神经退行性疾病中观察到的增强的脑免疫反应可能反应了压倒抑制信号的刺激信号。然而，免疫反应的抑制对退行性病症中的神经元不总是有益的(Chang等人，2009)。因此，神经退行性疾病中的治疗性干涉应有助于重建CNS中免疫细胞/小胶质细胞的适当控制。

神经退行性疾病是老龄化社会中致残的不断增长的原因。阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病。估计全世界AD的年发生率为460万例，每7秒出现一个新病例。预期至2040年，全世界将有8千万病例(Massoud和Gauthier,2010)。神经退行；缓慢进展的功能障碍和中枢神经系统(CNS)中的神经元和轴突连接的损失，是此类神经障碍(例如AD、帕金森病(PD)和亨廷顿病(HD))的主要病理特征(Heneka等人，2010)。在AD中，神经炎症的主要特征包括与Aβ(β淀粉状蛋白)沉积相关的区域中的小胶质细胞活化，和多种促炎性细胞因子的表达，例如IL1β和肿瘤坏死因子α(TNFα)。促炎性IL1β与抗炎性IL10的比例在AD患者的血清中显著提高。AD中的局部炎性反应通过活化的小胶质细胞和反应性星形胶质细胞而得以维持。小胶质细胞活化可以是神经保护性或破坏性的。急性神经炎性反应通常对CNS有益，使进一步的损伤最小化，并且有助于受损组织的修复，而慢性炎症则对神经系统有害并造成神经系统损伤。已知AD中Aβ的进行性沉积对小胶质细胞具有化学吸引性，并且因此提供了对小胶质细胞的慢性刺激。现已显示，非甾体类抗炎药物布洛芬在AD中的保护作用(Heneka等人，2010;Krause和Müller,2010)。

IL1系统在神经退行中的作用得到了以下证据链的支持。其表达在任何类型的脑损伤后剧烈且快速地增强。所有的慢性神经退行性疾病都伴随IL1表达的增加。此外，IL1β介导的神经炎症提高了神经元对退化的易感性。小胶质细胞是神经炎症中IL1β的主要来源，尽管也在星形胶质细胞中诱导了IL1β的产生。已发现AD患者中的IL1Ra水平降低。在很多神经退行的试验模型中，通过在脑损伤后提高IL1Ra的量阻断了IL1信号转导而改进了结果。IL1Ra一贯提供神经保护作用。已显示IL1Ra以实验上的治疗性浓度渗透到人脑中，并且已设计了引入IL1Ra作为中风后治疗的临床试验(Cawthorne等人，2011；Clark等人，2008；Koprich等人，2008；Spulber等人，2009；Tarkowski等人，2001)。

阿尔茨海默病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗阿尔茨海默病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗阿尔茨海默病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

阿尔茨海默病(AD)是痴呆的最常见形式。其最常在年龄超过65岁的患者中诊断出，尽管较少流行的早发性阿尔茨海默病的发病早得多。在2006年，全世界有2660万患者。预期到2050年，每85人中就有1人受到阿尔茨海默病影响。

尽管阿尔茨海默病的病程对每个个体都是独特的，但仍有很多共同的症状。最早的可见症状常被误认为是“年龄-相关”的问题或压力的表现。在早期阶段，最常见的识别症状是不能获得新的记忆，例如难以回想起最近观察到的行为。随着疾病进展，症状包括混淆、易怒和侵略性、情绪不稳、语言故障、长期记忆力减退以及随其感官减退而导致患者的普遍性冷淡(general withdrawal)。身体功能逐渐丧失，最终导致死亡。诊断后的平均预期寿命是大约7年。

阿尔茨海默病表征为大脑皮层和某些皮层下区域中神经元和突触的损失。这种损失导致受影响区域的总体萎缩，包括在颞叶和顶叶、额叶和扣带回的部分中的退化。在受AD影响的那些人的大脑中，通过显微镜清楚可见淀粉样蛋白斑块和神经原纤维缠结。斑块是β淀粉样肽和在神经元外侧和周围细胞材料的致密、大多数为不可溶的沉积物。缠结(神经原纤维缠结)是微管相关蛋白τ的凝集物，其可变得过度磷酸化，且在细胞本身内积累。

帕金森病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗帕金森病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗帕金森病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗帕金森病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

帕金森病(PD)是中枢神经系统的退行性疾病。其由黑质(中脑的一个区域)的含多巴胺细胞的未知原因的死亡而导致。在疾病进程的早期，大多数可见症状与运动性相关，包括晃动、僵化、运动缓慢以及走路和步态困难。随后，可出现认识和行为问题，并且在疾病的后期常出现痴呆。其他症状包括感知、睡眠和情感问题。PD更常见于老年人，大多数病例在50岁之后发生。

此疾病的病理表征为称作α突触核蛋白的蛋白质在神经元中称作路易体的包涵体中的累积，以及在中脑部分的某些神经元中多巴胺的形成和活性不足。

现代治疗主要通过左旋多巴和多巴胺激动剂的使用，在管理疾病的早期运动性症状方面有效。随着疾病进展和多巴胺神经元的持续损失，最终达到这些药物对治疗这些症状无效的程度，同时产生以运动扭曲作为特征的称为运动障碍的并发症。存在治疗PD其他症状的药物治疗。饮食和某些形式的复原在缓解症状方面显示了一些功效。现已使用手术和脑深部刺激降低运动性症状，作为在药物无效的严重病例中的最后方案。

亨廷顿病

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗亨廷顿病。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗亨廷顿病的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗亨廷顿病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

亨廷顿病、亨廷顿舞蹈病或亨廷顿症(HD)是神经退行性遗传疾病，其影响肌肉协调并导致认知减退和痴呆症。其通常在中年变得显著可见。HD是称为舞蹈症的异常无意性扭曲运动的最常见的遗传病因，并且与亚洲或非洲人相比，更常见于来自西欧人的后裔。此疾病由个体的所谓亨廷顿基因的2个拷贝中任一个的常染色体显性遗传突变导致。亨廷顿病的身体症状可在从婴儿期至老年的任何年纪开始，但常在35至44岁之间的年纪开始。大约6%的病例在21岁之前发病，具有不能运动-僵化综合征；其进展更快且稍有不同。此变体分类为青少年的、不能运动-僵化或Westphal变式HD。

亨廷顿基因(HTT)编码亨廷顿蛋白(Htt)。此基因的一部分是称为三核苷酸重复的重复片段，其长度在个体之间不同，并且可以在世代之间改变长度。当此重复片段的长度达到特定的阈值时，其产生改变的蛋白形式，即所谓突变体亨廷顿蛋白(mHtt)。这些蛋白的功能改变是病理改变的原因，进而，随着突变蛋白导致大脑特异区域的逐步损伤而导致疾病症状。

此疾病的症状可在个体之间不同，即便相同家族的成员也是如此，但症状进展对于大多数个体是可预测的。最早的症状是协调性的普遍丧失和步态不稳。随着疾病进展，不协调、不平衡的身体运动变得更加显著，并伴随有智力能力下降以及行为和精神病问题。身体能力逐渐受阻，直到协调运动变得非常困难，并且智力能力逐渐下降成痴呆。例如肺炎、心脏病和因跌落导致的物理性损伤的并发症导致在出现症状后的预期寿命降低至大约20年。

没有HD的治愈案例，在疾病后期需要全职护理，但出现了缓解其某些症状的治疗。

多发性硬化症

在本发明的一个方面，提供本发明的肽，其用于治疗多发性硬化症。

在本发明的另一个方面，提供本发明的肽，其用于制备治疗多发性硬化症的药物。

本发明的另一方面提供了用于治疗多发性硬化症的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用本发明的肽。

多发性硬化症(MS，也称作弥漫性硬化或播散性脑脊髓炎)是炎性疾病，其中围绕脑和脊髓的轴突的脂肪性髓鞘受到破坏，导致脱髓鞘和疤痕和宽泛的症状和体征。疾病通常发生在年轻的成年人中，且在女性中更为常见。其具有每10万人2至150人之间的流行率。

MS影响脑和脊髓中神经元细胞彼此沟通的能力。神经元细胞通过发送称为动作电位的电信号通过称为轴突的长纤维而进行沟通，轴突包裹在称为髓磷脂的隔离物质中。在MS中，机体本身的免疫系统攻击并破坏髓磷脂。当髓磷脂损失时，轴突不再能有效地传导信号。多发性硬化症的名称是指疤痕(硬化，更好地称作斑块或伤痕)，特别是在主要由髓磷脂构成的脑白质和脊髓中的。

几乎所有的神经学症状均表现为疾病，且经常发展成身体和认知障碍。MS有多种形式，新症状以发生不连续的发作出现(复发型)，或随时间缓慢积累(渐进型)。在发作之间，症状可完全消失，但是常发生持续的神经问题，特别是随着疾病的进展。

没有多发性硬化症的治愈案例。治疗尝试在发作后逆转功能，防止新的发作，和防止伤残。MS药物治疗会具有不良作用，或耐受差，并且很多患者追求其他的治疗方法，尽管缺乏支持性的科学研究。患者的预期寿命比未受影响的人口短5至10年。

序列

白介素-1受体拮抗蛋白的氨基酸序列(全长；SEQ ID NO:28)

UniProt登录号No.:P18510(IL1RA_HUMAN)

简称：IL-1RN、IL1RN、L-1ra、IRAP、L1F3、IL1RA。

替代名称：ICIL-1RA、IL1抑制剂、INN=阿那白滞素

4个亚型(1个分泌型；3个细胞质型)。

亚型1(标识符：P18510-1)，长177个氨基酸，已选作‘规范’序列：

MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE(SEQID NO:28)

下划线标注了Ilantafin-8/Ilantafin(SEQ ID NO:1)的序列。

亚型2(标识符：P18510-2)，长159个氨基酸(也称作icIL-1ra)。

此亚型的序列与规范序列的差异如下：

aa1-21:MEICRGLRSHLITLLLFLFHS→MAL

亚型3(标识符：P18510-3)，长180个氨基酸(也称作II型icIL-1ra)。

此亚型的序列与规范序列的差异如下：aa1-21：

MEICRGLRSHLITLLLFLFHS→MALADLYEEGGGGGGEGEDNADSK

亚型4(标识符：P18510-4)，长143个氨基酸。

此亚型的序列与规范序列的差异如下：aa1-34：缺失(删除)。

其他Ilantafin的序列(IL1RA的片段)

Ilantafin-1：RIWDVNQKT(SEQ ID NO:29)

Ilantafin-2：AGYLQGPNVN(SEQ ID NO:30)-可溶于水，不溶于PBS或培养基

Ilantafin-3：NQLVAGYLQGPNVN(SEQ ID NO:31)-不可溶于水

Ilantafin-4：VTKFYFQED(SEQ ID NO:32)-不可溶于水

Ilantafin-5：EGVMVTKFYFQED(SEQ ID NO:33)-在产生时完全不溶

Ilantafin-6：NQKTFYLRNNQL(SEQ ID NO:34)-可溶于水，不溶于PBS或培养基

Ilantafin-7：TAMEADQPVS(SEQ ID NO:35)

Ilantafin-8：是Ilantafin，SEQ ID NO:1

Ilantafin-9：GPNAKLEEKA(SEQ ID NO:36)

实施例

实施例1

Ilantafin(Ilantide)序列基序(SEQ ID NO:1)在人IL1Ra和人IL1RI复合体的晶体结构中的定位(图1)。

方法：采用基于PyMOL v0.99的PyMOL^TM软件(DeLano Scientific LLC,South SanFrancisco,California，美国)进行肽定位的做图。这在人IL1Ra和人IL1RI复合体的晶体结构，PDB ID:1IRA(Schreuder等人，1997)的基础上完成。

实施例2

Ilantafin肽(SEQ ID NO:1)与固定化的IL1RI胞外区相互作用，其亲和力在IL1β和IL1Ra与IL1RI的结合亲和力相同的量级之内(图2和3)。此外，所述肽与受体竞争结合IL1β(图3)。

方法：使用BiaCore2000仪器(BiaCore AB,Uppsala，瑞典)，在25℃，使用10mM磷酸钠(pH7.4)，150mM NaCl作为运行缓冲剂进行结合分析。流速为5μl/min。使用制造商的软件，通过非线性曲线拟合分析数据。通过静电相互作用，将包含IL1RI的完整胞外部分的重组蛋白固定在CM5传感器芯片的表面，并注射不同浓度的所述肽和IL1β和IL1Ra蛋白。使用对应于与肽和空白芯片结合之间的差异的曲线进行分析。在图4中，将IL1β蛋白固定在传感器芯片上，并注射不同浓度的Ilantafin肽和0.12μM浓度的可溶受体(SIL1RI)。

实施例3

Ilantafin肽SEQ ID NO:1(制成树形化合物/四聚体和单体形式)抑制由IL1β处理诱导的巨噬细胞活化(图5、图6和图7)。由于各种序列混杂形式的Ilantafin以及具有反向序列的Ilantafin不抑制IL1β的NF-κB活化，因此，Ilantafin的作用是序列特异性的(图8)。由于肽不抑制IL6诱导的信号转导，因此Ilantafin的作用是序列特异性的(图9)。

方法：IL1RI信号转导测试：使用可购自InvivoGen的Blue^TM细胞因子受体细胞技术（丹麦分销商：Sigma-Aldrich丹麦）。其以工程化细胞系的扩增家族呈现，其经设计以提供用于检测由关键细胞因子诱导的信号转导途径的活化的简单、快速且可靠的方法。将HEK-Blue^TMIL1β细胞特异性地工程化，以选择性地对IL1β反应，其特征在于在NF-κB-诱导型启动子控制下的分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。测定各种浓度的Ilantafin肽对IL1β-诱导的(1.2pM)NF-κB活化的抑制作用，并与使用商业IL1Ra和IL1RI获得的数据进行比较。采用HEK-Blue^TMIL6细胞确认Ilantafin作用的靶/受体特异性。

实施例4

如TNF-α分泌所反映的，Ilantafin肽（SEQ ID NO:1）(树形化合物/四聚体或单体形式)都以剂量依赖的方式抑制由IL1β诱导的巨噬细胞活化(图10，图11)。IL1Ra和SIL1RI蛋白也抑制巨噬细胞活化(阳性对照，图12)。

方法：向接种在6孔多培养皿(Nunc)的巨噬细胞培养物(2.5×10⁵细胞/孔)添加Ilantafin肽或IL1Ra或IL1RI。在37℃培养24小时后，向培养物添加IL1β(1.2pM)以活化巨噬细胞。将L929细胞以2×10⁵细胞/mL的密度接种到96孔板上。将两份细胞培养物在37℃培养24小时。收集来自巨噬细胞培养物的条件培养基，并与0.6μg/孔的放射菌素D(Sigma-Aldrich)一起添加到成纤维细胞培养物中。最后，在37℃培养24小时后，向每个孔添加20μl3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基)-2H-四唑(MTS)(Promega,Madison,WI，美国)，并将平板在37℃避光培养～45分钟，并在Sunrise吸光度读数计(Tecan,

瑞士)中测量490nm的光密度。为了计算条件培养基中TNF-α的量，通过使用不同浓度的TNF-α(R&D systems,Minneapolis,MN，美国)处理成纤维细胞获得标准曲线。

实施例5

Ilantafin肽(SEQ ID NO:1)、IL1Ra和SIL1RI蛋白以剂量依赖的方式诱导原代小脑神经元中的轴突生长，而IL1β本身不影响轴突形成。此外，IL1β抑制Ilantafin和IL1Ra诱导的轴突生长。其表明，IL1RI活化的抑制促进神经元分化(图13和图19(重新计算的相同数据)，图14)。

方法：从出生后(P)3或7天的Wistar大鼠(Charles River,Sulzfeld，德国或Taconic,Ejby，丹麦)制备小脑颗粒神经元(CGN)。小脑除去脑膜和血管，通过剁成碎片粗均质化，并使用胰蛋白酶(Sigma-Aldrich,

丹麦)进行胰蛋白酶化。在DNAse1和大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的存在下清洗神经元，并通过铺板前的离心沉淀细胞碎片。以10,000个细胞/孔的密度将CGN平铺到未包被的8孔Lab-Tek腔室载玻片(NUNC,Slangerup，丹麦)上的补充了0.4%(w/v)BSA的Neurobasal-A培养基中。在铺板后立即向培养基中添加不同浓度的肽或蛋白，并将细胞在37℃和5%CO₂下保持24小时。然后，将培养物固定、封闭并用抗大鼠多克隆兔抗体GAP-43（Chemicon,Temecula,CA，美国）孵育，然后用二抗Alexa Fluor488山羊抗兔抗体（Molecular Probes,Eugene,OR，美国）进行孵育，如先前所描述的（Neiiendam等人，2004）。通过计算机辅助的荧光显微镜，使用装配了Nikon Plane20×物镜的Nikon Diaphot倒置显微镜(Nikon，日本)记录所有的免疫染色的培养物。使用电荷耦合器件摄像机(GrundigElectronics,Nurnberg，德国)，使用在Protein Laboratory(University of Copenhagen,Copenhagen，丹麦)开发的软件包Prima捕获图像。使用在Protein Laboratory开发的软件包Process Length评估每个细胞的神经元突起的长度(Ronn等人，2000)。为了评估轴突生长，在每个单独试验中，对每个组处理至少200±20个细胞。

实施例6

Ilantafin肽(SEQ ID NO:1)减少了由降低氯化钾浓度诱导的神经元细胞死亡(凋亡)。此肽的作用与神经元存活因子IGF-1的作用相当(图15和图20)。

方法：存活测试：将CGN的原代培养物以100,000个细胞/cm²的密度平铺到补充了2%(v/v)B27、0.5%(v/v)glutamax（无对应中译文）、100单位/mL青霉素、100lg/mL链霉素和KCl(使得KCl在培养基中的终浓度为40mM)的Neurobasal-A培养基(Gibco BRL)中的多聚L-赖氨酸包被的8孔permanox（无对应中译文）载玻片上。在铺板后24小时，添加胞嘧啶-b-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ara-C；Sigma-Aldrich)至10μM的终浓度以避免胶质细胞的增殖，此后，进一步使神经元在37℃分化6天。通过清洗两次并将培养基替换成补充了1%(v/v)谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100lg/mL链霉素、3.5g D-葡萄糖/L和1%(v/v)丙酮酸钠(Gibco BRL)以及不同浓度肽的培养基Eagle基础培养基（BME；Gibco BRL），来诱导凋亡性细胞死亡。这样，培养基中的钾浓度降低至5mM KCl(Ditlevsen等人，2003)。凋亡诱导后2天，使用4%(v/v)甲醛固定细胞，并如采用海马神经元的存活测试中所述的使用Hoechst33258染色。

实施例7

Ilantafin肽(SEQ ID NO:1)抑制了大鼠中CIA的临床表现增加。

方法：类风湿性关节炎是影响西方国家中大约1%的总人口的慢性、炎性、系统性自身免疫疾病。大鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)是用于筛选抗炎化合物的广泛使用的动物模型。II型牛胶原(CII,Cat.no.20021,Lot090209,Chondrex，美国)、包含0.1%的结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂(CFA,Cat.no.F5581,Lot049K8700,Sigma-Aldrich)、不完全弗氏佐剂(IFA,Cat.no.F5506,Lot058K8702,Sigma)。PBS(Panum Institute,Copenhagen University)。异氟醚(Baxter)。在第0天(CII+CFA)和第10天(CII+IFA，加强免疫)免疫动物。在第15天，平均临床得分达到5.0的数值，并且，将所有动物分成3组，从而使所有组中的疾病严重度(平均临床得分)几乎相等。从第15天开始，每天皮下施用所述肽(两个剂量，3.3和10mg/kg)。使用以下分级系统评估关节炎严重度的临床评估：0-足和手掌无发红或肿胀；1–在足或手掌的跖趾关节和踝关节中轻微肿胀或发红；2-从踝至足弓或整个手掌中进展的肿胀/炎症和发红；3-除脚趾外整个足的肿胀/炎症；4–包括脚趾在内的整个足的肿胀和炎症。

实施例8

血浆和脑脊液中Ilantafin肽(例如，SEQ ID NO:1)的检测。

如Secher等人所述(Secher等人，(2006))，在单次皮下Ilantafin(SEQ ID NO:1)给药(10mg/kg)后15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和24小时，从麻醉的200g Wistar大鼠的眼窝从收集血液样品。如此前所述(Secher等人，2006)，在第2小时，从枕大池收集脑脊液样品。使用竞争性酶联免疫吸附试验测量血浆样品中的Ilantafin浓度。使用稀释在100mM碳酸盐缓冲剂(pH9.6)中的30mg/ml生物素化白蛋白(Sigma-Aldrich)包被96孔AminoTM平板(Nunc)。将平板孵育2小时，并使用磷酸缓冲盐水中的0.05%v/v Tween20(PBST)清洗3次。将1体积样品与3体积的以1:5000稀释在PBST中的过氧化物酶标记的链霉抗生物素混合，并孵育30分钟。随后，向生物素化白蛋白包被的平板添加100ml/孔量的混合物。将平板孵育1小时，并使用PBST清洗3次，并使用TMB plus(Kem-En-Tec,Taastrup，丹麦)显色。使用0.2M硫酸停止酶促反应。使用Sunrise吸光度读数计(Tecan,

瑞士)记录450nm的光密度。优选全部样品一式两份进行测试。

为了研究SEQ ID NO:1是否渗透通过大鼠中的血脑屏障，在皮下给药后，检测血浆和CSF中的生物素-Ilantafin。如果血浆和CSF中都存在所述肽，表明系统给药的Ilantafin穿过了血脑屏障。

实施例9

可通过以下方法：“红藻氨酸诱导的细胞毒性”（“Kainic acid-induced cytotoxicity”）评估例如SEQ ID NO:1的Ilantafins在逆转神经元细胞毒性中的作用。

如此前所述(Soroka等人，2002)，将海马神经元以5x10⁴个细胞/孔的密度平铺在多聚-L赖氨酸包被的8孔LabTek Permanox载玻片(Nunc)上。在培养7天后，使用Ilantafin(0.001–3mM)或全长IL1RA处理神经元1小时，随后，添加300mM新鲜复原的红藻氨酸(Sigma,丹麦)。细胞进一步培养24小时。将细胞以4%v/v甲醛固定，并使用5mg/ml Hoechst33258(Invitrogen,Copenhagen，丹麦)或5mg/ml碘化丙啶(Sigma)染色。如Ronn等人(Ronn等人，(2000))所述，在随机选择的第一视野的位置中，在系统的系列视野中记录至少1000个细胞/条件。在半自动化模式下，使用实验室开发的使偏差最小化的软件，基于核形态(死亡细胞显示致密的染色质或片段化的核)，评估细胞存活。结果显示为活细胞比例的平均值[n活细胞/(n活细胞+n死细胞)+/-SEM]。

实施例10

可通过以下方法：“红藻氨酸诱导的癫痫发作”（“Kainic acid-induced seizures”）评估例如SEQ ID NO:1的Ilantafins在减弱颠痫发作，降低死亡率和减少神经退化中的作用。

在红藻氨酸处理前48、24和2小时，对28-32g的雄性C57BL/6J小鼠皮下注射Ilantafin(10mg/kg)、全长IL1RA或介质。基于初步的剂量调整试验，选择2剂量的红藻氨酸(腹膜内)进行两组试验，以诱导低级颠痫发作(20mg/kg红藻氨酸)或高级颠痫发作和死亡(30mg/kg红藻氨酸)。测量的参数包括癫痫发作的潜伏期、癫痫发作的严重性和死亡率。由不了解处理的观察者记录在红藻氨酸给药后2小时的癫痫发作活性，并根据改良的Racine得分(0=静止；1=面部自动反应；2=点头；3=前肢阵挛；4=直立；5=全身性抽搐；6=死亡；Racine,1972)分级。癫痫发作等级1-3视为低级癫痫发作，且癫痫发作等级4-5视为高级癫痫发作。静止的潜伏期测量为红藻氨酸注射和出现静止之间的时间。对照组的动物接受介质注射。

实施例11

使用Fmoc保护策略、使用Fmoc-(Calbiochem-Novabiochem)保护的氨基酸在TentaGel树脂(Rapp Polymere,Tübingen，德国)上合成肽。树形化合物由与赖氨酸骨架连接的4个单体组成。二聚体由与赖氨酸残基连接的2个单体组成。通过高效液相色谱法和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(VG TOF Spec E,Fisons Instruments,Beverly,MA)的评估，肽的纯度为至少95%。

实施例12

肽溶解性。

在接受来自合成公司的肽(粉末形式)后，将其在水、PBS或培养基中复溶。这样能立即显示所述肽是否可溶。

实施例13

肽稳定性。

用于评估肽稳定性的方法是在将肽保持在4℃和室温的溶液中时，通过分光光度法或MS(质谱；测量带电颗粒的荷质比)测量作为时间的函数(1、2、3天等)的溶液中的肽量。

实施例14

Ilantafin SEQ ID NO:1(SGRKSSKMQA)在胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型中的作用。

方法：

大鼠中胶原诱导的关节炎(CIA)。

CIA的诱导。CIA研究在总计40只雄性Wistar大鼠中进行，试验开始时的平均体重为150g。通过皮下(s.c.)注射溶解于0.05M乙酸(2mg/ml)且随后以1：1乳化在包含1.0mg/ml热失活的结核分枝杆菌（M.tuberculosis）的CFA(Sigma-Aldrich)中的II型牛胶原(CII,Sigma-Aldrich)诱导CIA。在吸入麻醉(异氟醚，3%)下，在尾根注射(s.c.)包含250μg CII和125μg结核分枝杆菌的250μl乳液(免疫后的天数，dpi0)。

治疗设计。在dpi8，在临床症状出现之前，将所有动物随机分成2组，每组20只大鼠，并在8天期间(dpi8-15)，每天进行Ilantafin(10.0mg/kg,s.c.)或介质(PBS,1.0ml/kg,s.c.)给药。在dpi7-16进行临床评估，并在dpi29-33继续进行临床评估而不进行治疗。

临床得分。由不了解治疗分组的观察者评估关节炎的严重性，采用以下分级系统：0–足中无发红或肿胀；1-足中的轻微发红，或单个指间关节中的发红和肿胀；2–足的踝和跖部分中中度肿胀和发红；3-整个足的显著肿胀和发红，足在运动中的使用受限；4-整个足的显著肿胀和发红，在运动和直立中不能使用足。由于CIA通常仅涉及后肢，将大鼠的关节炎指数定义为2肢得分的总和。当关节炎严重性达到7分时，处死动物。

采用双向ANOVA和t-检验进行统计分析。

结果：

Ilantafin降低了CIA动物的发病率，参见图17。发病率表示为在测试日达到临床指数7并因此被处死的动物的百分比。至dpi12，Ilantafin显著降低了发病率。*-P<0.05(带有Welch校正的未配对的t-检验)。

此外，Ilantafin降低了CIA的严重性(临床评估)，参见图18。双向ANOVA显示了处理对具有CIA的动物的临床得分的显著作用[F(1,238)=18.05,P<0.0001]。至dpi13-15，Ilantafin显著降低了CIA的严重性。*-P<0.05(带有Welch校正的未配对的t-检验)。

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Claims (68)

1.一种由衍生自IL-1受体拮抗蛋白(IL1RA)的5-20个连续氨基酸残基的肽序列组成的分离肽，所述肽由以下组成：

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的氨基酸序列；或

由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的5个或更多的连续氨基酸组成的片段；或

SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的变体，所述变体由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中的任一个具有至少50%同一性的5-20个氨基酸的氨基酸序列组成，

其中，所述肽能够结合1型IL-1受体(IL1RI)，并且能够干扰IL-1与IL1RI的结合。

2.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽由以下组成：5-14个连续氨基酸残基的肽序列，所述肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列；由SEQ ID NO:1的5个或更多的连续氨基酸组成的片段；或由与SEQ ID NO:1具有至少50%同源性的5-14个氨基酸组成的氨基酸序列组成。

3.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；由SEQ ID NO:29的5个或更多的连续氨基酸组成的片段；或由与SEQ ID NO:29具有至少50%同源性的5-20个氨基酸组成的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽由以下组成：SEQ ID NO:35的氨基酸序列；由SEQ ID NO:35的5个或更多的连续氨基酸组成的片段；或由与SEQ ID NO:35具有至少50%同源性的5-20个氨基酸组成的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的肽，其中，所述肽由以下组成：SEQ ID NO:36的氨基酸序列；由SEQ ID NO:36的5个或更多的连续氨基酸组成的片段；或由与SEQ ID NO:36具有至少50%同源性的5-20个氨基酸组成的氨基酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽能够刺激轴突生长和/或促进神经元的存活。

7.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽能够抑制IL-1诱导的生物作用；例如NF-kB活化和TNFα增加。

8.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述片段由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的6个或更多的连续氨基酸组成。

9.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述片段由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的5-9个连续氨基酸组成。

10.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述片段由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的6-9个连续氨基酸组成。

11.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述片段由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的6-8个连续氨基酸组成。

12.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的5-15个连续氨基酸残基的肽序列组成。

13.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个的至多14个连续氨基酸残基的肽序列组成。

14.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个具有至少60%的同一性。

15.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个具有至少70%的同一性。

16.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述肽与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQID NO:35或SEQ ID NO:36中任一个具有至少80%的同一性。

17.如权利要求2所述的肽，其中所述氨基酸序列由SEQ ID NO:1组成。

18.如权利要求2所述的肽，其中所述氨基酸序列由选自以下组的氨基酸序列组成：SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。

19.如权利要求1所述的肽，其由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35或SEQID NO:36中任一个具有至少50%同一性的5-20个氨基酸的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包括至少一个氨基酸取代。

20.如权利要求19所述的肽，其中所述氨基酸序列包括2个氨基酸取代，例如3个氨基酸取代，例如4个氨基酸取代，例如5个氨基酸取代。

21.如权利要求19-20中任一项所述的肽，其中所述氨基酸取代是保守性氨基酸取代。

22.如权利要求1-21中任一项所述的肽，其中C-末端氨基酸作为游离羧酸(“-OH”)存在。

23.如权利要求1-21中任一项所述的肽，其中C-末端氨基酸作为酰胺化衍生物(“-NH₂”)存在。

24.如权利要求1-21中任一项所述的肽，其中N-末端氨基酸包括游离氨基基团(“H-“)。

25.如权利要求1-21中任一项所述的肽，其中N-末端氨基酸是乙酰化衍生物(“-乙酰基”或“COCH₃”)。

26.如权利要求1或2中任一项所述的肽，其中所述肽不包含氨基酸序列RPSGRKSSKMQAFRI(SEQ ID NO:37)，也不由氨基酸序列RPSGRKSSKMQAFRI(SEQ IDNO:37)组成。

27.如权利要求1或2中任一项所述的肽，其中所述肽不包含氨基酸序列LVAGY(SEQ IDNO:38)，也不由氨基酸序列LVAGY(SEQ ID NO:38)组成。

28.一种化合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的至少一个肽。

29.如权利要求28所述的化合物，其中，所述肽配制成由单拷贝的肽组成的单体。

30.一种多聚化合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的两个或更多个肽。

31.如权利要求30所述的化合物，其中，通过肽键或连接基团连接所述2个或更多的肽。

32.如权利要求31所述的化合物，其中，所述连接基团包含一个或多个赖氨酸残基。

33.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物是二聚体(即，包含2个肽)。

34.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物是三聚体(即，包含3个肽)。

35.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物是四聚体(即，包含4个肽)。

36.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物是树形化合物且包含4、8、16或32个肽。

37.如权利要求30所述的化合物，其中，所述化合物是四聚树形化合物。

38.如权利要求30-37中任一项所述的化合物，其中，所述2个或更多的肽彼此相同。

39.如权利要求30-37中任一项所述的化合物，其中，所述2个或更多的肽彼此不相同。

40.如权利要求33所述的化合物，其中所述2个肽彼此相同且各由SEQ ID NO:1组成。

41.如权利要求37所述的化合物，其中所述4个肽彼此相同且各由SEQ ID NO:1组成。

42.如权利要求41所述的化合物，其中所述4拷贝的SEQ ID NO:1通过具有多个赖氨酸残基的核心部分连接在一起。

43.一种组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的肽，或权利要求28-42中任一项所述的化合物。

44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述组合物是药学可接受和/或药学上安全的。

45.一种试剂盒，其包含权利要求1-21中任一项所述的肽，权利要求28-42中任一项所述的化合物，或权利要求43和44任一项所述的组合物，和至少一种其他成分。

46.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用作药物。

47.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用于治疗炎性疾病，例如IL-1在其中发挥重要作用的炎性疾病。

48.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途，所述炎性疾病例如IL-1在其中发挥重要作用的炎性疾病。

49.一种用于治疗炎性疾病，例如IL-1在其中发挥重要作用的炎性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

50.如权利要求47和48任一项所述的用途，或权利要求49所述的方法，其中所述炎性疾病选自以下组成的组：寻常痤疮、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、白塞氏病、慢性炎症、慢性前列腺炎、皮炎、痛风、肾小球肾炎、超敏反应(包括1型(速发型或异位性或过敏性)，包括变应性哮喘、变应性结膜炎、变应性鼻炎(花粉热)、过敏反应、血管性水肿、风疹(荨麻疹)、嗜酸粒细胞增多和对青霉素和头孢菌素的反应；2型(抗体依赖型)，包括自身免疫性溶血性贫血、肺出血-肾炎综合征、肝炎、IBS(肠易激综合症)、幼年特发性关节炎(JIA)、天疱疮、恶性贫血(如果是自身免疫性)、银屑病、银屑病关节炎、免疫性血小板减少症、输血反应、桥本氏甲状腺炎、间质性膀胱炎、格雷夫斯病、重症肌无力、风湿热、新生儿溶血病和急性移植排斥反应；3型(免疫复合型)，包括类风湿关节炎、免疫复合型肾小球肾炎、血清病、亚急性细菌性心内膜炎、疟疾的症状、系统性红斑狼疮(SLE)、阿瑟斯反应、农民肺和结节性多动脉炎；4型(细胞介导的或迟发型超敏感性DTH)，包括接触性皮炎、异位性皮炎(湿疹)、颞动脉炎、结节病、麻风病的症状、肺结核的症状、系统性硬化症、曼托试验、腹部疾病和慢性移植排斥)、炎性肠病(包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征、感染性结肠炎和未确定型结肠炎)、肌病(包括皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎)、盆腔炎疾病、足痛风、再灌注损伤、类风湿性关节炎、移植排斥和血管炎。

51.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用于治疗类风湿性关节炎。

52.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用于制备治疗类风湿性关节炎的药物。

53.一种用于治疗类风湿性关节炎的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

54.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用于治疗糖尿病，例如I型糖尿病。

55.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物在制备用于治疗糖尿病，例如I型糖尿病的药物中的用途。

56.一种用于治疗糖尿病，例如I型糖尿病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

57.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物，其用于治疗神经退行性疾病。

58.如权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

59.一种用于治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

60.如权利要求57至58中任一项所述的用途，或权利要求59所述的方法，其中所述神经退行性疾病具有神经炎症组分。

61.如权利要求57至58中任一项所述的用途，或权利要求59所述的方法，其中所述神经退行性疾病与IL-1信号转导相关。

62.如权利要求57至58中任一项所述的用途，或权利要求59所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和多发性硬化症。

63.如权利要求57至58中任一项所述的用途，或权利要求59所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。

64.一种用于刺激轴突生长和/或促进神经元存活的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

65.一种用于干扰IL1RI与IL-1结合的方法，所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的权利要求1-21中任一项所述的肽、权利要求28-42中任一项所述的化合物或权利要求43和44任一项所述的组合物。

66.如权利要求49、53、56、59、64和65中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

67.如权利要求64和65中任一项所述的方法，其中所述个体患有神经退行性疾病。

68.如前述任一权利要求所述的治疗，其中所述治疗是预防性、改善性或治愈性的。

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