CN106581643A

CN106581643A - 白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用

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Publication number: CN106581643A
Application number: CN201611115429.0A
Authority: CN
Inventors: 黄钟; 丁丽萍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: CN106581643B

Abstract

本发明公开了白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用，本发明所述药物为以IL‑37蛋白作为活性成分，同时本发明公开了IL‑37、其衍生物、变异体和/或截短多肽为活性成分，或者上述物质的编码核苷酸序列为活性成分，并公开了原核、真核、哺乳类细胞表达及纯化IL‑37及其活性成分，对骨关节炎和痛风及一些自身免疫疾病的治疗作用。本发明也公开了IL‑37及其活性成分编码核苷酸序列克隆至各种表达载体，对骨关节炎和痛风进行基因治疗。该发明也包括含IL‑37的片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等对骨关节炎、痛风和一些自身免疫疾病的治疗作用。

Description

白介素37作为药物在治疗骨关节炎和痛风中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是白介素37在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用。

背景技术

骨关节炎是一种常见于中老年人导致关节疼痛和功能失常的慢性炎症性关节疾病，主要由受累关节处的宿主炎症介质驱动的关节组织异常重塑的退行性疾病，以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征。该病好发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节以及手部指间关节等部位。从病理改变的角度来看，骨关节炎的发病涉及整个关节（关节软骨，软骨下骨，滑膜，半月板和韧带，肌肉和神经），造成关节软骨的破坏，软骨下骨的硬化，骨刺增生，韧带和半月板损伤，是一种退行性的骨性关节疾病。骨关节炎是慢性致残的主要原因，其病因尚未完全明了，对骨关节炎的治疗目前主要以消炎止痛为主，近年来作为发病特征之一的滑膜炎症成为新治疗药物的主要靶标，如抗TNF制剂，抗蛋白酶（anti-MMPs）及缓激肽BK阻断剂，抗IL-6制剂等，至今骨关节炎尚无特效疗法，仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。

痛风是一种因嘌呤代谢障碍，使尿酸累积在关节处而引发红、肿、热和剧烈疼痛的疾病，其发作多见于下肢关节和大拇趾关节，踝关节，膝关节等部位属于关节炎的一种。临床上认为痛风的发病是由于人体血液中高浓度的尿酸形成尿酸盐沉积在关节囊、滑囊、软骨、骨质和其他软组织中形成针状结晶，结晶体沉积在局部关节造成炎症体的过度激活，从而导致免疫系统过度敏感而造成痛风的炎症反应，故痛风亦属于炎症体疾病。炎症体疾病以没有高滴度的自身抗体和抗原特异T细胞的自发炎症为特征。痛风在临床上主要分为三个阶段即高尿酸血症期，痛风反复发作期和慢性痛风石性关节炎期。目前痛风的治疗以别嘌呤醇为主，别嘌醇通过抑制黄嘌呤氧化酶进而减少尿酸的合成，该药对于痛风的高尿酸血症和慢性痛风石治疗比较有效，对急性发作期痛风无效，因该品无消炎作用。对急性期病人目前主要以控制炎症为主尚无特效疗法。

骨关节炎（OA）滑液中的炎症介质主要来源于软骨，软骨下骨及滑膜，其中TNFα和IL-1β作为骨关节炎发病中两个主要的细胞因子主要产生于激活的滑膜细胞，单核细胞和关节软骨中，IL-1β和TNFα通过滑膜成纤维细胞表面高滴度的IL-1β受体和TNFα受体以自分泌的方式大量产生，促炎细胞因子IL-6，IL-8 在滑膜中产生也异常增多，这些促炎细胞因子也可以通过远端扩散的方式进入滑膜液进而作用于软骨基质和软骨细胞造成关节损伤。

促炎细胞因子IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8也是炎症体疾病的主要介导者，在痛风关节炎的发病中，通过过量的尿酸结晶激活炎症体进而募集和激活caspase-1, 激活的Caspase-1将IL-1β前体切割加工成为功能成熟的IL-1β，成熟的IL-1β与细胞膜上的受体结合后或通过NF-kb途径进而启动促炎基因IL-1β, TNFα，IL-6, IL-8的转录和大量合成。促炎细胞因子IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8也是炎症体疾病的主要介导者，在骨关节炎及痛风患者的关节及滑膜中促炎细胞因子IL-1β和TNFα大量存在，其产生一方面可以通过滑膜成纤维细胞表面的IL-1β受体和TNFα受体以自分泌的方式大量生成，另一方面IL-1β与细胞膜上的受体结合后可以启动促炎基因IL-1β, TNFα,IL-6, IL-8的转录和大量合成，在痛风患者中，过量的尿酸结晶也导致IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8的大量生成，这些促炎细胞因子也可以通过远端扩散的方式进入滑膜液进而作用于软骨基质和软骨细胞造成关节损伤。IL-37重组蛋白对外周血和滑膜中IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8等炎性因子mRNA的表达有显著的抑制作用，并降低上述炎性因子在骨关节炎和痛风患者的外周血单核细胞和滑膜细胞中的表达量，从而对炎症发作引起的关节损伤起到保护作用。

IL-37 是IL-1家族中新发现的免疫抑制因子，IL-37基因在胸腺，睾丸及子宫中表达，在单核细胞及树突细胞中IL-37亦可通过ToIL样受体家族的配体，及炎性因子IL-1β,TNF诱导而产生。IL-37 前体蛋白合成后存在于细胞胞浆内，在炎症的刺激下，其前体通过caspase-1切除N端前肽而成为成熟的IL-37蛋白，成熟的IL-37蛋白易位进入细胞核作为转录因子抑制炎性细胞因子的产生，或者直接释放至胞外作为配体发挥抑炎作用。IL-37也可作为转录子调控基因的表达。 IL-37具有五种剪接变体，其中最长的IL-37b含有6个外显子中的5个。目前，针对IL-37b的抗炎作用已有一些研究， IL-37b在体外可以抑制系统红斑狼疮，银屑病，甲亢，视神经脊椎炎及系统性硬化，强直性脊柱炎中炎性细胞因子IL-1β, TNFα, IL-6, IL-17等的产生，在动物模型的实验中也进一步证明IL-37在皮炎，DSS-肠炎，肥胖诱导的炎症中起到治疗作用。这说明IL-37在炎症性疾病中具有抑炎作用。但作为抑炎因子的IL-37在骨关节炎和痛风的功能和作用至今仍无报道，骨关节炎和痛风属于顽固的炎症性疾病，目前尚无特效疗法治疗其炎症，为进一步研究开发治疗骨关节炎和痛风炎症的新药。为此我们对IL-37在骨关节炎和痛风中的作用和功能进行了研究。

但到目前为止，利用IL-37基因进行优化改造及截肽片段构建具有IL-37活性的重组蛋白；够将具有穿模结构构建能进入细胞内及细胞核并具IL-37生物活性的重组蛋白；构建能在体内具有长半衰期并具IL-37生物活性的重组蛋白；及上述重组具IL-37活性重组蛋白对骨关节炎和痛风炎症及一些自身免疫性疾病如：类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑炎作用仍未见报道。

发明内容

本发明解决的问题是通过对IL-37基因进行优化改造，利用IL-37活性成分及其与它有效成分构建具有IL-37活性重组蛋白的制备方法如:利用优化改造后IL-37基因基因片段构建具IL-37生物活性的重组蛋白且极大的增强了蛋白的表达量；研究已表明IL-37不但可作为配体也可作为转录子发挥抑炎作用，为了解决重组的IL-37能穿透细胞膜及核膜进入胞内及细胞核作为转录子发挥其抗炎作用，该课题利用HIV-1 Tat穿模结构与优化改造后IL-37活性基因片段构建IL-37-HIV Tat 融合蛋白，其不但能进入细胞浆及细胞核，且具IL-37生物活性；我们的研究显示，IL-37活性基因片段的重组蛋白在体内半衰期在半小时以内，为了增加重组IL-37蛋白在体内的半衰期时间，我们利用人IgG1 Fc 与改造后IL-37基因基因片段构建融合重组蛋白，其不但能在体内具有较长半衰期并具IL-37生物活性。

本发明的另一个目的是提供上述具有IL-37活性的重组蛋白为药物在骨关节炎、痛风性关节炎及自身免疫疾病的应用。我们的实验结果显示，上述重组蛋白能有效的抑制骨关节炎、痛风性关节炎的炎症反应，提示其能对一些自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑炎有治疗作用。

本发明的另一个目的是，本课题所发明的IL-37重组蛋白可用于制备口服或者注射等相关剂型药物。

本发明具体技术方案如下：

白介素37在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用。

所述药物中的白介素37为重组蛋白,所述的重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ IDNO：1所示：MSFVGENSGVKMGSEDWEKDEPQCCLEDPAGSPLEPGPSLPTMNF/VHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD；

本发明提供的所述的重组的人IL-37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

MVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD；该重组蛋白可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达。

本发明提供的具IL-37活性的重组的人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白的氨末端为HIV-1 Tat穿模结构，羧末端为人IL-37活性部分，两者之间有一中间肽连接，氨基酸序列如SEQID NO：3所示：

MYVRKKRRQRRRAPSGGSGSGGGGEFVRVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD

该重组蛋白穿过细胞膜进入巨噬细胞浆并进入细胞核。可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达。

本发明提供的重组的人IL-37-Fc融合蛋白是重组蛋白的氨末端为IL-37活性部分，羧末端为人IgG1 Fc 包括铰链CH2和CH3部分，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示：

MYVRKKRRQRRSGGSGSGGGGEFVRSRVHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENYKTTPPVLDSDGSFFLYSKTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

该重组蛋白能可明显抑制骨关节炎及痛风性关节滑膜细胞炎性因子的表达，与2相比在动物体内具有较长的半衰期。

作为本发明的进一步改进：

具有IL-37活性的重组蛋白的制备方法，其特征是：包括如如下步骤：

（1）设计得到SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5任一项所述的核苷酸序列；

（2）构建SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5 任一项所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转入宿主细胞，形成可表达如权利4-6任一项所述的具有IL-37 活性的重组蛋白；

（3）培养SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5任一项所述的核苷酸序列表达系统的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（4）分离纯化SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5任一项所述的具有IL-37活性的重组蛋白。

第一步：所述的IL-37重组蛋白是通过下列方法制备得到的：将编码白介素37(IL-37)具有活性成分的基因片段或IL-37-HIV1 Tat融合蛋白连入原核表达载体pET28a得到重组表达载体，将所述重组表达载体转染大肠杆菌，所使用菌株为E.coli Transetta DE3，筛选得到阳性克隆菌；大量培养所述阳性克隆菌，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导IL-37蛋白的表达；超声破碎，凝胶过滤和亲分离纯化得95%纯度的IL-37重组蛋白。本发明运用原核细胞表达了权利要求2的IL-37重组蛋白，并具有较强的生物学活性，后续可以使用该方法大量表达IL-37用于制备药物。

第二步：所述的人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白是通过下列方法制备得到的：首先将将IL-37具有活性成分的编码基因片段与HIV-1 Tat穿模结构域基因片段（49-59 Tat 的氨基酸序列）相连接，该融合蛋白的氨末端为HIV-1 Tat穿模结构，羧末端为人IL-37活性部分，两者之间有一中间肽连接，然后将IL-37-HIV1 Tat融合基因片段连入原核表达载体pET28a得到重组表达载体；将所述重组表达载体转染大肠杆菌，所使用菌株为E.coli Transetta DE3，筛选得到阳性克隆菌；大量培养所述阳性克隆菌，诱导物异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导IL-37的表达；超声破碎，凝胶过滤和亲和层析分离纯化得95%纯度的白细胞介素37重组融合蛋白。本发明运用原核细胞表达了权利要求3 的IL-37-HIV1 Tat融合蛋白，并具生物学活性，后续可以使用该方法大量表达IL-37-HIV1 Tat融合蛋白以用于药物制备。

第三步：所述的人IL-37-Fc融合蛋白是通过下列方法制备得到的：首先将将IL-37具有活性成分的基因片段与IgG1 Fc （铰链区、CH2和CH3）的基因片段相连接，该融合蛋白的氨末端为IL-37活性编码基因部分，羧末端为人IgG1 Fc 铰链区、CH2和CH3部分，然后将IL-37-Fc融合基因片段连入真核核表达载体pPIC9K得到重组表达载体；将AatII将其线性化，然后通过电穿孔导入毕赤酵母菌株GS115，通过免疫印迹检测FC的表达来筛选阳性克隆；大量培养所述阳性克隆酵母，并用甲醇诱导IL-37-Fc的表达；超声破碎，亲和层析分离纯化和S200凝胶过滤纯化去除降解的融合重组IL-37-Fc蛋白。本发明运用真核细胞表达了权利要求4 的IL-37-Fc融合重组蛋白，具有很强的生物学活性。

作为本发明的进一步改进：所述表达的系统为原核表达系统为真核表达系统，所述原核表达系统选自大肠杆菌表达系统；所述真核表达系统为酵母表达系统。

具有IL-37活性的重组蛋白制备药物，应用于骨关节炎、痛风及自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。

具有IL-37活性的基因制备药物，应用于骨关节炎、痛风及某些自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。

作为本发明的进一步改进：所述药物服用方法是口服或非经肠胃形式服用。

作为本发明的进一步改进：所述非经肠胃形式服用方法包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射。

作为本发明的进一步改进：所述药物的制药方式为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸，注射剂，粉针剂或喷雾剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对IL-37基因进行改造，成功地运用原核和真核细胞表达了具IL-37生物活性的基因片段：与HIV1 Tat构建成融合蛋白使其能穿模进入细胞浆和细胞核，与IgG1 Fc构建成融合蛋白使其能具有较长的半衰期，且具有很强的生物学活性，后续可以使用该方法大量表达具IL-37生物活性的重组蛋白用于药物制备。

本发明将成功表达的具IL-37生物活性的重组蛋白对骨关节炎和痛风的炎症细胞进行体外试验，结果显示具IL-37生物活性的重组蛋白对外周血PBMC和滑膜成纤维细胞中IL-1β, TNFα, IL-6,IL-8，CXCL8等炎性因子表达有显著的抑制作用。

本发明对IL-37进行临床体外实验，结果显示具IL-37生物活性的重组蛋白不仅在骨关节炎及痛风关节炎中的外周血及滑膜中呈现高表达，而且具IL-37生物活性的重组蛋白可以明显抑制骨关节炎及痛风患者中的外周血单核细胞中炎性细胞因子IL-1β, TNFα,IL-6,IL-8，CXCL8的转录和表达水平，并能降低骨关节炎及痛风患者滑膜细胞及滑膜液中上述炎性因子mRNA和蛋白的表达量。因此，具IL-37生物活性的重组蛋白对骨关节炎及痛风的炎症有显著抑炎作用，进而减轻炎性因子对患者滑膜和软骨的破坏，特别是对关节损伤具有很好的保护作用，可作为治疗骨关节炎和痛风炎症的药物。

尽管IL-37在骨关节炎和痛风及自身免疫疾病的研究已有报道，但利用改造后IL-37活性基因片段表达具IL-37生物活性的重组蛋白，及其与HIV1 Tat构建成融合蛋白使其能穿模进入细胞，与与IgG1 Fc构建成融合蛋白使其在体内能具有较长的半衰期等重组蛋白，对骨关节炎和痛风及自身免疫疾病炎症的治疗作用到目前为止尚未见报道。

尽管已有IL-37对类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的抑制已有报道，但利用IL-37活性片段及其与HIV1 Tat或IgG1 Fc构建的具IL-37生物活性的重组蛋白对上述自身免疫疾病炎症的抑制作用也尚未见报道。

本专利与目前IL-37在骨关节炎及痛风研究的明显和实质上的进步在于：

本发明成功的利用IL-37活性成分，及其与它有效成分构建具有IL-37活性的重组蛋白如: 将改造后的IL-37基因基因片段构建具IL-37生物活性的重组蛋白，并能大量在原核细胞表达；利用HIV-1 Tat穿模结构与IL-37基因基因片段构建能进入细胞并具IL-37生物活性的重组蛋白；利用人IgG1 Fc 与IL-37基因基因片段构建能在体内具有长半衰期并具IL-37生物活性的重组蛋白。

利用上述具有IL-37生物活性的重组蛋白对IL-37在骨关节炎炎症中的调节进行了研究；结果显示，具IL-37生物活性的重组蛋白能显著抑制骨关节炎的炎症反应，指出了IL-37对骨关节炎具有治疗作用。

利用了本实验室制备的具有IL-37生物活性的重组蛋白研究IL-37对痛风炎症的作用；结果显示该重组蛋白能显著抑制痛风的炎症反应，指出了IL-37重组蛋白能作为药物对痛风的炎症进行治疗。

我们的研究结果提示，我们所构建的上述3种含IL-37活性基因片段的重组蛋白对自身免疫疾病疾病如：类风湿性关节炎、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症具有治疗的作用。

附图说明：

图1. IL-37的PCR产物电泳检测结果图： A图. 纵坐标：标准分子量的DNA Marker：100-5000；横坐标：1-2泳道为从cDNA中克隆的IL-37-HIV1 Tat阳性产物，3-4泳道为从cDNA中克隆的IL-37基因活性片段阳性产物，B图. 纵坐标:标准分子量的DNA Marker：100-5000；横坐标：1-2 泳道为IL-37-Fc阳性产物。

图2. 重组IL-37蛋白纯化结果图：纵坐标：标准分子量蛋白Marker；A图：横坐标：1，2分别为上样纯化后的IL-37基因片段表达的活性蛋白产物，3 为阴性对比； B图1，5分别为上样纯化后的IL-37-HIV1 Tat融合阳性基因活性片段表达的蛋白产物，6 为未纯化表达的菌液；C图4分为上样纯化后的IL-37-IgG1 FC融合阳性基因片段表达的蛋白产物，6为未纯化表达的菌液；结果显示纯化效果良好。

图3. IL-37-IgG1 FC融合重组蛋白的药代动力学研究结果：用纯化IL-37-FC融合重组蛋白在SD大鼠中做单个剂量（10ug/kg）尾静脉注射。血液样本被收集在0，0.5,1,2,6,24,48,72,96小时；血清IL-37的水平由IL-37 ELISA 试剂盒所测量。纵坐标：IL-37-FC小鼠血清的含量（ng/ml）, 横坐标：检测血清中IL-37-FC重组蛋白的时间，结果显示与IL-37重组蛋白相比，IL-37-FC在血清中具有较长的半衰期（IL-37：IL-37-FC 为0.5小时:48小时）。

图4. IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白穿模效果的测试：在培养的巨噬细胞加入IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白，FITC（绿）为F4/80，PE（红）为IL-37，结果显示IL-37-HIV1Tat 融合重组蛋白能穿膜进入细胞内并大部聚集在细胞核内。

图5. IL-37基因和蛋白的表达水平增加在骨关节炎患者，特别是在疾病活跃的骨关节炎患者：骨关节炎患者和健康对照组静脉血液样本（6毫升）收集在深圳市人民医院，并在三小时内处理。离心分离血清，外周血单个核细胞由FicoIL-Paque密度梯度离心进行分离，从活跃的骨关节炎患者分离滑膜细胞和和滑膜液；分别在PBMC和滑膜细胞中提取总RNA，进行cDNA合成，半定量实时PCR和ELISA 分别检测PBMC和滑膜细胞 IL-37 mRNA及血清和滑膜液IL-37蛋白含量，用看家基因GAPDH标准化；。纵坐标：A图为外周血PBMC IL-37mRNA的相对表达量， B图为外周血清 IL-37 蛋白的表达量，C图分别为滑膜细胞IL-37mRNA及滑膜液IL-37蛋白的相对表达量；横坐标：A和B图依次表示骨关节炎患者组，健康对照组，静止期骨关节炎患者组，活动期骨关节炎患者组，C图依次为膜细胞和和滑膜液。

图6.IL-37的表达量与骨关节炎WOMAC评分和临床参数之间的关联性：将参加本实验骨关节炎患者的WOMAC评分和BMI，身体质量指数，CRP, C-反应蛋白与IL-37在患者的表达水平进行相关性比较。纵坐标：A图WOMAC，B图BMI；C图为 CRP；横坐标：均为IL-37 蛋白的水平。

图7. 炎性细胞因子和基质金属蛋白酶3在骨关节炎患者的表达水平：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者和健康对照组静脉血液样本，分离血清及外周血单个核细胞，提取总RNA，进行cDNA合成，半定量实时PCR和ELISA 分别检测PBMC和血清IL-37 mRNA和蛋白含量，GAPDH作为内参。

纵坐标：A和E图为 TNFα，B和F图为IL-1β，C和G图为CXCL8， D和H图为MMP3， A、B、C和D图均为所标mRNA 相对表达量，E、F、G和H为所标血清蛋白相对表达量；横坐标： A、B、C、D、 E、F、G和H均依次为骨关节炎患者和健康对照组。

图8. IL-37水平与骨关节炎性因子表达的相关性：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者静脉血液样本，分离血清， ELISA 分别检测血清IL-37、TNFα、IL-1β、CXCL8和蛋白含量，GAPDH作为内参。纵坐标：A图为 TNFα，B图为IL-1β，C图为CXCL8， D图为MMP3，横坐标：A、B、C、和D均为 IL-37蛋白表达量。

图9.体外IL-37重组蛋白抑制骨关节炎患者外周血单核细胞炎性因子的表达：IL-37 重组蛋白是我们实验室所制备[见图１和２]。从骨关节炎患者和健康对照者分离PBMCs，培养并用加入重组的IL-37然后用LPS刺激，收集细胞和培养上清，分别用RT-PCR和ELISA分析IL-37对炎性介质表达的影响。

纵坐标：A和E图为 TNFα，B和F图为IL-1β，C和G图为CXCL8， D和H图为MMP3， A、B、C和D图均为所标mRNA 相对表达量，E、F、G和H图均为所标血清蛋白相对表达量；横坐标： A、B、C、D、 E、F、G和H均依次为未用IL-37刺激的骨关节炎患者、用IL-37刺激的骨关节炎患者、未用IL-37刺激的健康对照者、用IL-37刺激的健康对照者的PBMCs。

图10.体外IL-37重组蛋白抑制骨关节炎患者滑膜细胞炎性因子的表达： IL-37重组蛋白由我们实验室所制备[见图１和２]。从骨关节炎患者分离滑膜细胞，培养并用重组的IL-37然后用LPS进行刺激，收集细胞和培养上清，分别用RT-PCR和ELISA分析IL-37对炎性介质表达的影响，*P<0.05表示显著差异。

纵坐标：A图为 mRNA 相对表达量，B图为蛋白相对表达量；横坐标：A和B图依次均为TNFα、IL-1β、CXCL8和MMP3。

图11.IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子TNFα表达的作用：从骨关节炎患者分离PBMCs，培养并分别加入5 nmol重组的IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白刺激12 小时,然后用1ug/ml 的LPS刺激5小时刺激，收集细胞和培养上清，用RT-PCR分析IL-37对炎性介质TNFα表达的影响。

纵坐标：为相对TNFαmRNA 的表达量，横坐标：分别为IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞处理组。

图12. IL-37基因和蛋白在痛风患者和健康对照者的表达水平：从深圳市人民医院收集痛风患者和健康对照组静脉血液样本，并在三小时内处理。离心分离血清，外周血单个核细胞由FicoIL-Paque密度梯度离心进行分离；在PBMC提取总RNA，进行cDNA合成，半定量实时PCR和ELISA 分别检测PBMC IL -37 mRNA 和血清IL-37蛋白含量，GAPDH作为内参。纵坐标：A图为外周血PBMC IL-37 mRNA的相对表达量，B图为外周血清 IL-37 蛋白的相对表达量；横坐标：A和B图依次表示痛风患者组，健康对照组。

图13. 检查IL-37 mRNA和蛋白在活动性、静止性痛风患者和健康对照者及痛风患者伴随有和没有伴随痛风石的表达水平：样本收集与图5一样。纵坐标：A和C图为外周血清IL-37 蛋白的表达量，B图为外周血PBMC IL-37 mRNA的相对表达量；横坐标：A和B图依次表示活动期痛风关节炎患者，静止期痛风关节炎患者组，健康对照组；Ｃ图依次表示痛风关节患者炎伴有痛风石和没有伴有痛风石。

图14. IL-37的水平与痛风临床表现的关联性：收集参加本实验痛风患者的临床参数：BMI、UA和CRP 并与IL-37在患者的表达水平进行相关性比较。纵坐标：A图BMI，B图UA；C图为 CRP；横坐标：均为IL-37 蛋白的水平。

图15. 检测炎性细胞因子在痛风患者和健康对照组的表达水平：从深圳市人民医院收集痛风患者和健康对照组静脉血液样本，分离血清及外周血单个核细胞，提取总RNA，进行cDNA合成，半定量实时PCR和ELISA 分别检测PBMC和血清mRNA 和蛋白含量，GAPDH作为内参。纵坐标：A和D图为 IL-1β，B和E图为IL-6，C和F图为TNFα； A、B和C图均为所标mRNA 相对表达量，D、E和F为所标血清蛋白表达量；横坐标： A、B、C、D、 E和F均依次为痛风患者和健康对照组。

图16. IL-37与痛风性性关节炎性因子的相关性：在深圳市人民医院收集骨关节炎患者静脉血液样本，分离血清， ELISA 分别检测血清IL-37与骨关节炎性因子IL-1β、IL-6 TNFα的相关性，GAPDH作为内参。纵坐标：A图为 TNFα，B图为IL-1β，C图为CXCL8， D图为MMP3，横坐标： A、B、C、和D均为 IL-37蛋白表达量。

图17.IL-37重组蛋白对痛风患者炎性因子表达的作用： IL-37 重组蛋白由我们实验室所制备[见图１和２]。从痛风患者和健康对照者分离PBMCs，培养并用加入重组的IL-37然后用LPS刺激，收集细胞和培养上清，提取总RNA，进行cDNA合成，分别用RT-PCR和ELISA分析IL-37对痛风炎性介质表达的影响。

纵坐标：A和D图为 IL-1β，B和E图为 IL-6，C和F图为TNFα， A、B和C 图均为所标mRNA 相对表达量，D、E和F图均为所标血清蛋白表达量；横坐标： A、B、C、D、 E和F均依次为未用IL-37刺激的骨关节炎患者、用IL-37刺激的骨关节炎患者、未用IL-37刺激的健康对照者、用IL-37刺激的健康对照者组。

图18.IL-37重组蛋白对痛风患者滑膜细胞炎性因子水平的调节：IL-37 重组蛋白为我们实验室所制备[见图１和２]。从骨关节炎患者分离滑膜细胞，培养并用重组的IL-37然后用LPS刺激，收集细胞和培养上清，提取总RNA，进行cDNA合成，分别用RT-PCR和ELISA分析IL-37对炎性介质表达的影响。

纵坐标：A图为 mRNA 相对表达量，B图为蛋白表达量；横坐标：A和B图依次均为、IL-1β、IL-6、TNFα。

图19.IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对痛风关节炎患者外周血白细胞炎性因子IL-1表达的作用：从骨关节炎患者分离PBMCs，培养并分别加入5 nmol重组的IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白刺激12小时,然后用1ug/ml 的LPS刺激5小时，收集细胞和培养上清，用RT-PCR分析IL-37对炎性介质TNFα表达的影响。

纵坐标：为相对IL-1 mRNA 的表达量，横坐标：分别为IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对痛风关节炎患者外周血白细胞处理组。

具体实施方式

现结合附图1至17说明与实施例对本发明进一步说明，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

本发明实施方案所用到的主要仪器有：超纯水系统（Classic DI，ELGA，英国），超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司，中国），二氧化碳培养箱（Thermo Froma，美国），电泳仪（BIO-RAD，美国），荧光定量PCR仪（7500fast，Applied Biosystem，美国），荧光显微镜（Olympus，日本），离心机（Thermo Scientific，德国），PCR扩增仪（BIO-RAD，美国），转膜仪（BIO-RAD，美国），凝胶成像系统（Carestream，美国），加样器（Eppendorf，德国），水平电泳槽（BIO-RAD，美国），Westen blot垂直电泳槽（BIO-RAD，美国），-80℃冰箱（SANYO，日本），4-20℃冰箱（海尔，中国），电子分析天平（ALC-210.3，赛多利斯，中国），酶标仪（Epoch，BIOTEK，美国）。

实施例一、IL-37编码基因的克隆及重组质粒pET28a-IL-37、 pET28a-IL-37 HIV1Tat和pPIC9K-IL-37-FC的构建

实验材料来源

质粒和菌种：原核表达载体为质粒pET-28a、pPIC9K购于Invitrogen公司；所使用菌种大肠杆菌E.coli Trans T1克隆菌、E.coli Transetta (DE3)均购于北京全式金生物技术有限公司，毕赤酵母GS115购于Invitrogen公司。

主要试剂和工具酶：质粒DNA小量提取试剂盒和DNA胶纯化试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq酶、DNA marker购于北京全式金生物技术有限公司；蛋白Marker购于Fermentas公司；限制性内切酶和T4连接酶均购于Takara公司。

实验过程及结果：

IL-37基因的改造及融合基因的构建：

根据生物遗传信息学对IL-37编码基因进行优化改造，详见实验结果图1A（比较的基因序列中，上为原始的IL-37序列，下为优化改造后的IL-37序列）将建改造后的IL-37活性基因片段的核苷酸序列进行合成，在5’端加限制性内切酶BamH1 位点，图1B。

将HIV1 Tat含穿膜结构域氨基酸49-59的核苷酸及连接肽的序列（见图2A）在氨端和IL-37活性基因片段的核苷酸序列（图1 B）在羧端的核苷酸序列合成得IL-37-HIV1Tat，在5’端加限制性内切酶BamH1 位点，详见见图2 B；

将IL-37活性基因片段（见图1B）在氨端和IgG1FC段的核苷酸序列在羧端，的核苷酸序列合成得IL-37-FC，在5’端加限制性内切酶SnaB1 位点；

IL-37基因表达载体的构建和扩增：将合成IL-37，IL-37-HIV1Tat和IL-37-FC的基因用DNA 连接酶在16℃进行连接反应，连接到T载体，用氯化钙法将所要克隆的基因产物转化E.coli Trans T1 克隆菌，在含氨苄青霉素的LB平板进行筛选，挑取阳性菌落(含重组质粒载体，进行扩增，提取质粒，IL-37 和IL-37-HIV1 Tat 用限制性内切酶BamH1和Sal1，而IL-37-FC用限制性内切酶SnaB 1和Not1进行酶切。所得产物琼脂糖凝胶电泳鉴定并分离纯化，（详见图1）并测序验证核苷酸序列。

实施例二、IL-37重组蛋白的制备:

重组质粒pET28a-IL-37，重组质粒pET28a-IL-37-HIV1 Tat，重组质粒pPIC9K-IL-37-FC 的构建：限制性内切酶从IL-37，IL-37-HIV1Tat和IL-37-FC 的T载体分别进行双酶切反应（IL-37和IL-37-HIV1Tat T载体用内切酶BamH1和Sal1；IL-37-FC T载体用内切酶SnaB 1和Not1），分别回收酶切产物IL-37，IL-37-HIV1Tat和IL-37-FC 基因片段；质粒pET28a用内切酶BamH1和Sal1而 pPIC9K质粒用内切酶SnaB 1和Not1 进行酶切；琼脂糖凝胶电泳分离,DNA分离柱进行纯化。将纯化的IL-37和IL-37-HIV1Tat产物，和酶切后pET28a，及 IL-37-FC基因片段与酶切后pPIC9K用DNA 连接酶在16℃进行连接反应。

重组蛋白IL-37的表达： pET28a-IL-37 pET28a-IL-37-HIVTat重组蛋白的表达：将连接后的pET28a-IL-37 pET28a-IL-37-HIVTat的重组质粒分别转化E.coli Transetta (DE3)，挑取单菌落培养过夜，按1%比例接种于LB培养基，加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导IL-37的表达， pPIC9K-IL37-FC的重组蛋白的表达：SacⅠ限制性内切酶将pPIC9K-IL37-FC重组质粒线性化，将其电转化到毕赤酵母GS115感受态细胞，将已被转染的毕赤酵母GS115感受态细胞涂布在MD培养基平板，除了组氨酸营养筛选外，还用不同浓度G418进行筛选，挑选在G418高浓度的单克隆菌落，进行PCR鉴定，获得多拷贝重组菌。重组GS115-pPIC9K-IL37-FC用甲醇诱导IL-37-FC表达。

IL-37蛋白的表达验证和纯化：诱导表达后收集菌体，离心破碎，盐析、透析、分子筛、离子交换层析等多个步骤。将纯化的蛋白上样电泳，电泳结束后，凝胶经染色、脱色后采用凝胶成像系统拍照并进行图像分析，若电泳能检测到特异性的与目的蛋白大小相符的蛋白条带出现，且对照没有该条带，则说明菌体表达了目的重组蛋。SDS-SDS-PAGE胶电泳显示得纯化的IL-37蛋白（图2 A、B和C），图2 A为IL-37 活性片段重组蛋白，图2 B为IL-37-HIV1Tat重组蛋白，图2 C为IL-37-FC重组蛋白，结果显示，我们不但成功的表达了IL-37，IL-37-HIV1Tat和IL-37-FC重组蛋白，其纯化的纯度在95% 左右。Brandford法测定蛋白浓度，将纯度达到95%以上的管合并，并进行真空冷冻干燥，得到IL-37蛋白冻干粉末。保存于-20℃备用。

重组IL-37活性基因片段重组蛋白与IL-37-IL-37-Fc在体内血循环半衰期的比较：用纯化IL-37和IL-37-FC融合重组蛋白在SD大鼠中做单个剂量（IL-37 10ug/kg；IL-37-FC 24.810ug/kg）尾静脉注射。血液样本被收集在0，0.5,1,2,6,24,48,72,96小时；IL-37ELISA 试剂盒测量血清IL-37的水平。IL-37和 IL-37-IgG1 FC融合重组蛋白的体内药代动力学研究结果如图3显示，与IL-37重组蛋白相比，IL-37-FC在血清中具有较长的半衰期（IL-37：IL-37-FC 为0.5小时:48小时）.

IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白穿模效果测试：培养THP1巨噬细胞，加入IL-37-HIV1Tat 融合重组蛋白，用抗F4/80-FITC（绿），抗IL-37-PE（红）进行组化免疫荧光检测，结果如图4显示IL-37-HIV1 Tat 融合重组蛋白能穿膜进入细胞内并聚集在细胞核内。

实施例三、患者外周血单核细胞和滑膜细胞的分离，并对IL-37及相关炎性细胞因子蛋白的检测及IL-37与临床表现和炎性因子相关性的分析。

实验材料来源：本研究所用骨关节炎和痛风患者全血及滑膜样本均来自深圳市人民医院。

实验过程：

全血的采集和外周血单核细胞的分离：骨关节炎和痛风患者全血使用肝素抗凝管采集后用于检测临床指标，经患者同意在检测后3小时送至实验室分离外周血单核细胞，用Ficoll-Paque浓度梯队离心法对外周血单核细胞进行分离。

滑膜组织的取用及滑膜细胞的分离：深圳市人民医院在骨关节炎及痛风患者手术时获取滑膜组织，于病理检测使用后经病人同意用于科研。通过洗涤、剪切、胶原酶消化然后再用胰蛋白酶消化、尼龙网过滤，离心后收集细胞，在37℃培养箱中培养24h，弃去未粘附细胞，得贴壁细胞为原代滑膜细胞。

细胞总RNA的提取：收集患者PBMC细胞或滑膜细胞利用Trizol法对mRNA进行提取。

RNA反转录为cDNA：检测RNA的纯度和浓度，将不同管的RNA浓度调为一致，按照ScriptTM cDNA Synthesis kit操作说明书加入反转录酶及通用引物，将RNA逆转录成cDNA。

RT-PCR引物的设计：从Genbank里查找骨关节炎人相关的炎性细胞因子的基因及内参基因的mRNA序列，引物列表如下：

表 5 骨关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表

从Genbank里查找痛风人相关的炎性细胞因子的基因及内参基因的mRNA序列，利用软件Primer 5.0设计相关引物，引物列表如下：

表 6 痛风患者和健康对照检测的基因引物序列列表

Gene name	Forward (5′to 3′)	Reverse (5′to 3′)
			IL-37	AGTGCTGCTTAGAAGACCCGG	AGAGTCCAGGACCAGTACTTTGTGA
IL-1β	GCGGCCAGGATATAACTGACTTC	TCCACATTCAGCACAGGACTCTC
			IL-6	GGTACATCCTCGACGGCATCT	GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC
TNFα	CTTCTCGAACCCCGAGTGAC	TGAGGTACAGGCCCTCTGATG
			GAPDH	TGCACCACCAACTGCTTAGC	GGCATGGACTGTGGTCATGAG

上述引物由上海生物工程有限公司合成。

IL-37 和炎性因子mRNA 定量检测：qPCR检测骨关节炎、痛风患者和健康照者PBMC IL-37和相关炎性因子 mRNA 的表达：采用qPCR试剂盒进行检测,以GAPDH为内参基因，对目的基因的表达进行分析。

IL-37 对炎性因子蛋白定量检测： ELISA 检测骨关节炎、痛风患者和健康对照者血清IL-37和相关炎性因子的蛋白水平。血清和细胞培养上清的细胞因子IL-37，TNFα，IL-1β，CXCL8和MMP3的ELISA试剂盒检测从BD bioscience 购买，检测细胞因子IL-6水平从eBioscience购买。检测方法根据制造商的说明进行。

IL-37与临床指标及炎性细胞因子相关性的分析：采用Spearman相关分析评估血清IL-37水平与骨关节炎和痛风的临床和实验室检查指标及炎性细胞因子的相关性。P值小于0.05被认为具统计学上的显着性。

3．实验结果：

骨关节炎

图5. IL-37 mRNA和蛋白水平在骨关节炎患者比健康对照组显著增高：相比之下，骨关节炎比健康对照者IL-37 mRNA的表达升高2.3-3.5倍之间，尤其是在疾病活动期患者，而在疾病在静止期则增高不显著（图5A）。IL-37血清蛋白水平在骨关节炎患者也显著高于健康对照组，与IL-37 mRNA 水平相似，IL-37血清蛋白水平在疾病活动期显著增高，而在疾病在静止期不显著（图5B）。更为重要的是，与静止骨关节炎患者相比，活动期骨关节炎患者的滑膜细胞和滑膜液中分别显示增高的IL-37 mRNA和血清蛋白水平（图5C）。实验结果指出IL-37在骨关节炎的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图6.血清IL-37的水平与骨关节炎临床表现呈正相关：我们将IL-37在骨关节炎的水平与WOMAC评分及临床指标，如抗SP100，ssa60，CenpB抗体、阿尔布河、Cr、BUN、IgG、ESR和CRP，BMI的相关性进行了比较。如图1所示，血清IL-37水平与WOMAC、BMI和CRP呈正相关。（图6 A、B、C 和表2）。结果进一步确证IL-37在骨关节炎的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图7.炎性细胞因子和基质金属蛋白酶3在骨关节炎患者的表达水平增高: 与正常对照组相比，骨关节炎TNFα，IL-1β，CXCL8和MMP3 在PBMC的 mRNA和血清的蛋白水平表达上调（图7 A、B、C、D、E、F、G和H）。结果与已出版的研究一致，骨关节炎具高表达的炎性细胞因子，进一步证实TNFα，IL-1β，CXCL8和MMP3与骨关节炎疾病密切相关。

图8.骨关节炎患者血清IL-37的水平与骨关节炎促炎因子的水平呈正相关：图8和表2的结果显示，IL-37的蛋白水平与炎性细胞因子TNFα、IL-1β、CXCL8及MMP3呈正相关（图8 A、B、C、D 和表2），这些数据表明IL-37 与骨关节炎的活动度呈正相关。

痛风

图12.IL-37 mRNA和蛋白水平在痛风患者和健康对照组之间的比较：图12 结果显示，痛风IL-37 mRNA的表达比健康对照者显著增高，（图12 A）。IL-37血清蛋白水平在痛风患者也显著高于健康对照组（图12 B）。

图13.比较IL-37 mRNA和蛋白在活动性、静止性痛风患者和健康对照者及痛风患者伴和没有伴有痛风石患者的表达水平：与健康对照者相比，活动性痛风患者IL-37 mRNA和蛋白的水平明显升高，而在疾病缓解期IL-37 mRNA和蛋白的水平则没有显著增高（图13A和B）。有趣的是IL-37 蛋白水平在痛风患者伴有痛风石比痛风患者没有伴有痛风石明显升高（图13 C）。实验结果指出IL-37的 mRNA 和蛋白水平与痛风的活动度呈正相关，尤其是痛风伴有痛风石的患者更为显著。

图14.血清IL-37的水平与痛风临床表现呈正相关：我们将IL-37在痛风的水平与BMI、UA 和CRP等痛风的临床指标的相关性进行分析。如图14所示，血清IL-37水平与BMI、UA和CRP呈正相关，尤其是CRP，图14 A、B、C结果进一步确证IL-37水平在痛风的表达水平与疾病的活动度呈正相关。

图15.炎性细胞因子在痛风患者的表达增高：实验结果显示，痛风IL-1β、 IL-6、TNFα在PBMC的 mRNA和血清的蛋白水平比正常对照组明显增高（图15 A、B、C、D、E和F）。该结果进一步指出炎性细胞因子介导了痛风的炎症反应

图16.痛风患者血清炎促炎因子的水平与IL-37的表达呈正相关：图16 A、B、C 和表5显示痛风患者血清IL-37的蛋白水平与炎性细胞因子IL-1β、 IL-6、TNFα呈正相关，这些数据表明IL-37 与骨关节炎的免疫炎性反应密切相关。

实施例四： IL-37重组蛋白对骨关节炎和痛风患者炎性细胞因子转录的调节

实验材料来源：深圳市人民医院采集自骨关节炎和痛风患者的外周血及滑膜组织及健康对照组的外周血。

实验过程：

经实施例3所述方法分出外周血单核细胞和滑膜细胞：

外周血单核细胞及滑膜细胞的培养：培养上述分离得到的外周血单核细胞和滑膜细胞的培养基为RPMI 1640 (Hyclone,Thermo,美国)全培养基，加10%胎牛血清(Hyclone,美国)及100 IU/ml 青霉素100 μg/ml 链霉素, 将上述细胞在培养基中轻轻混匀后以1×10⁶cells/ml的浓度接种于12孔板内。

重组IL-37蛋白的刺激：细胞培养的第二天，IL-37炎性因子mRNA 定量检测和IL-37 炎性因子蛋白定量检测。加入IL-37、IL-37-HIV1 Tat或IL-37-FC重组蛋白 5 nmol/ml进行刺激或不刺激12小时, 然后LPS1μg/ml刺激4小时后离心收集细胞用于总RNA提取以检测目的基因转录水平。检测细胞培养液上清细胞因子则加入IL-37、IL-37-HIV1 Tat或IL-37-FC 重组蛋白 5 nmol/ml进行刺激或不刺激24小时, 1μg/ml LPS刺激4小时后离心收集细胞上清用于检测上清液中分泌的目的蛋白。

细胞总RNA的提取，RNA反转录为cDNA，RT-PCR引物的设计，qPCR对炎性因子的检测和ELISA 对IL-37 炎性因子蛋白定量检测的实验过程请看实验实例3。

3.实验结果：

骨关节炎：

图9. IL-37重组蛋白在体外抑制骨关节炎患者外周血单核细胞炎性因子的表达: 与对照组比较，IL-37重组蛋白处理组TNFα、IL-1β、 CXCL8和 MMP3 的mRNA和蛋白表达水平在骨关节炎患者明显降低（图9 A、B、C、D、E、F和H）。实验结果显示IL-37能显著抑制骨关节炎相关炎性因子在骨关节炎患者PBMC 的表达，然后有趣的是IL-37并未能抑制健康组PBMC炎性因子的表达。该结果指出IL-37能抑制骨关节炎的炎性反应。

图10. 体外IL-37重组蛋白抑制骨关节炎患者滑膜细胞炎性因子的表达: 更为有重要的是，IL-37重组蛋白处理组与对照组相比，处理组显著抑制了TNFα、IL-1β、 CXCL8和MMP3 的mRNA和蛋白在骨关节炎患者关节滑膜的表达水平（图10 A和B）。实验显示IL-37能显著抑制骨关节炎相关炎性因子在关节滑膜的表达，结果进一步指出IL-37不但能抑制骨关节炎全身的炎性反应且能下调关节局部的炎症。

图11. IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子TNFα表达抑制效果的比较：图11 显示重组的IL-37、IL-37HIV1 Tat和IL-37FC重组蛋白具对骨关节炎患者分离外周血单核细胞炎性因子TNFα的表达均有抑制作用，相比较IL-37 和 IL-37-FC对TNFα的抑制效果强于IL-37HIV1 Tat，提示 IL-37 作为配体的抑炎作用比其作为转录子的作用要强。

痛风：

图17. IL-37重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血单核细胞炎性因子表达的作用：与对照组比较，IL-37重组蛋白处理组的IL-1β、 IL-6和TNFα的mRNA和蛋白表达水平在痛风患者显著下调（图17 A、B、C、D、E和F）。实验显示IL-37能显著抑制痛风相关炎性因子在PBMC的表达，然后IL-37并未能抑制健康组外周血单核细胞炎性因子mRNA和蛋白的表达（图17A、B、C、D、E和F）。该结果指出IL-37能抑制痛风的全身炎性反应。

图18.IL-37重组蛋白显著抑制痛风性关节炎患者滑膜细胞炎性细胞因子的表达：IL-37重组蛋白刺激组与IL-37重组蛋白未刺激组相比，刺激组显著抑制了IL-1β、IL-6和TNFα mRNA和蛋白在痛风患者滑膜细胞的表达（图18 A和B）。实验显示IL-37重组蛋白能显著下调痛风相关炎性因子在关节滑膜的水平，结果进一步指出IL-37重组蛋白不但能抑制痛风全身的炎性反应且能下调痛风性关节炎关节局部的炎症

图18. IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子IL-1表达抑制效果的比较：实验显示重组的IL-37、IL-37HIV1 Tat和IL-37FC重组蛋白具对骨关节炎患者分离外周血单核细胞炎性因子TNFα的表达均有抑制作用，相比较 IL-37 和 IL-37-FC对TNFα的抑制效果强于IL-37HIV1 Tat，提示 IL-37 作为配体的抑炎作用比其作为转录子对痛风性关节炎的抑癌hi的作用要强。

实施例五、IL-37重组蛋白治疗骨关节炎及痛风炎症的服用方法

本发明提供IL-37或其变异体和衍生物及相应核苷酸作为活性成分制备药物的方法，药物服用形式不限制，根据不同服用方法选择合适的形式服用及剂量。

口服形式如药片、胶囊、小颗粒、微小颗粒、粉末可用普通方法生产，如淀粉、乳糖、海藻糖、甘露醇、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉和无机盐，也可包括适当的添加剂，IL-37在制备剂中分量不一，根据合适的背景应用。

非经肠胃形式如注射剂栓剂、擦剂，注射剂制备方法为：将IL-37融合蛋白和甘露醇溶解于适量的注射用水中，在无菌条件下过滤并分装入西林瓶中，冻干。注射方法：包括局部、关节腔、动脉、肌肉内、皮下、骨髓内、囊内、心室内、静脉、腹膜内、粘膜或鼻腔注射等，剂量根据以下因素调整，如年龄，体重，疾病程度。非经肠胃形式可用普通方法生产， IL-37的分量在制备剂中不特别限制，根据背景调整。

IL-37也可用已知的药物运载系统将药物送入体内，如：将IL-37包裹在胶囊或脂质体内, 或使用靶向纳米颗粒服用方法。IL-37或被用于食物组成物的粗原料，如功能性食物和补充剂用来生产具有防止炎症疾病的食物。

本发明不但提供了利用IL-37重组蛋白制备对骨关节炎和痛风治疗性药物的方法，而且体外证明IL-37对骨关节炎及痛风及一些自身免疫疾病的炎性细胞因子有显著抑制作用，

综上所述，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。本领域的普通技术人员阅读本发明文件后，根据本发明的技术方案和技术构思无需创造性脑力劳动而作出其他各种相应的变换方案，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

实验结果

IL-37重组蛋白药物的制备

列表 1. IL-37基因的改造：

列表1 A：原始的IL-37基因核苷酸的序列与改造后的含IL-37基因活性片段序列的比较；上列核苷酸序列为原始的IL-37基因核苷酸的序列，优化改造后的含IL-37基因活性片段在比较的下列核苷酸序列。

ATGTCCTTTGTGGGGGAGAACTCAGGAGTGAAAATGGGCTCTGAGGACTGGGAAAAAGATGAACCCCAGTGCTGCTTAGAAGACCCGGCTGGAAGCCCCC 100

---------------------------------------------------------------------------------------------------- 100

TGGAACCAGGCCCAAGCCTCCCCACCATGAATTTTGTTCACACAAGTCCAA-AGGTGAAGAACTTAAACCCGAAGAAATTCAGCATTCATGACCAGGATC 200

|||||||| ||| | | || || ||| | |||||||||||||| || || |||||||| |

-----------------------------------GTTCACACCTCTCCGAAA-GTTAAAAACCTGAACCCGAAAAAATTCTCTATCCACGACCAGGACC 200

ACAAAGTACTGGTCCTGGACTCTGGGAATCTCATAGCAGTTCCAGATAAAAACTACATACGCCCAGAGATCTTCTTTGCATTAGCCTCATC-CTTGAGC- 300

||||||| ||||| ||||||||||| || || || || ||||| || ||||||||||| || || || |||||||| || | || || || | || |

ACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGTAACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTTCGCTCTGGCTTCTTCTC-TGT-CT 300

TCAGCCTCTGCGGAGAAAGGAAGTCCGATTCTCCTGGGGGTCTCTAAAGGGGAGTTTTGTCTCTACTGTGACAAGGATAAAGGACAAAGTCATCCATCCC 400

|| || ||||| || ||||| |||||| || ||||| || |||||||| || || || || ||||| ||||||| ||||| || ||| || || |

TCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGATCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGACAAAGGTCAGTCTCACCCGTCTC 400

TTCAGCTGAAGAAGGAGAAACTGATGAAGCTGGCTGCCCAAA-AGGAATCAGCACGCCGGCCCTTCATCTTTTATAGGGCTCAGGTGGGCTCCTGGAACA 500

| |||||||| || || ||||||||||| |||||||| || | | ||||| || || || || |||||||| || | |||||||| || || |||||||

TGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAAACTGGCTGCTCAGAAA-GAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTGCTCAGGTTGGTTCTTGGAACA 500

TGCTGGAGTCGGCGGCTCACCCCGGATGGTTCATCTGCACCTCCTGCAATTGTAATGAGCCTGTTGGGGTGACAGATAAATTTGAGAACAGGAAACACAT 600

||||||| || || |||||||| || ||||||||||||||||| ||||| || || || || ||||| || |||| ||||| || ||| | ||||||||

TGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGGTTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAAATTCGAAAACCGTAAACACAT 600

TGAATTTTCATTT-CAACCAGTTTGCAAAGCTGAAATGAGCCCCAGTGAGGTCAGCGATTAGG 663

||||| || | | || || |||||||||||||||||| || ||| || || ||

CGAATTCTCTT-TCCAGCCGGTTTGCAAAGCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAAA 663

列表1 B：优化的IL-37基因片段序列：

TGGATCCATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGA

列表2. IL-37-HIV1 Tat 融合基因：A列表含HIV1 Tat含穿膜结构域氨基酸49-59的核苷酸序列及连接肽的核苷酸序列；B列表含IL-37基因活性片段的核苷酸序列；C列表含IL-37-HIV1 Tat的核苷酸序列；

列表2 A HIV1 Tat含穿膜结构域氨基酸49-59的核苷酸序列及连接肽的核苷酸序列

TACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGATCGGGTAGCGG 50

AGGAGGAGGAGAATTCGTCCG

列表2 B含IL-37-HIV1 Tat的核苷酸序列：

TGGATCCTATGTACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGA 50

TCGGGTAGCGGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAA 100

AAATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGG 150

TAACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCT 200

TCGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCG 250

ATCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGA 300

CAAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGA 350

AACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGT 400

GCTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTG 450

GTTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACA 500

AATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAA 550

GCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATTAATGA

列表3. IL-37-FC 融合基因： A列表含IgG1 FC 核苷酸序列；B含IL-37-FC核苷酸序列，列表2 B中的IL-37基因活性片段的核苷酸序列与本列表A含IgG1 FC 核苷酸序列连接，IL-37基因活性片段在氨端，IgG1 FC 核苷酸序列在羧端；

列表3.A： IgG1 FC 核苷酸序列

GAACCGAAATCTTGCGACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCC 50

GGAACTGCTGGGTGGTCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAG 100

ACACCCTGATGATCTCTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGAC 150

GTTTCTCACGAAGACCCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGT 200

TGAAGTTCACAACGCTAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTA 250

CCTACCGTGTTGTTTCTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAAC 300

GGTAAAGAATACAAATGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGAT 350

CGAAAAAACCATCTCTAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTT 400

ACACCCTGCCGCCGTCTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTG 450

ACCTGCCTGGTTAAAGGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGA 500

ATCTAACGGTCAGCCGGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGG 550

ACTCTGACGGTTCTTTCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCT 600

CGTTGGCAGCAGGGTAACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCT 650

GCACAACCACTACACCCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAA

列表3.B：IL-37-FC核苷酸序列

TTACGTAATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGAGAACCGAAATCTTGC 550

GACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCCGGAACTGCTGGGTGG 600

TCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGACACCCTGATGATCT 650

CTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGACGTTTCTCACGAAGAC 700

CCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGTTGAAGTTCACAACGC 750

TAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGTGTTGTTT 800

CTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAAGAATACAAA 850

TGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGATCGAAAAAACCATCTC 900

TAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTTACACCCTGCCGCCGT 950

CTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTGACCTGCCTGGTTAAA 1000

GGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGAATCTAACGGTCAGCC 1050

GGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGGACTCTGACGGTTCTT 1100

TCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCTCGTTGGCAGCAGGGT 1150

AACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCTGCACAACCACTACAC 1200

CCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAATGA

图1. IL-37的PCR产物电泳检测结果图

A图：泳道1-2是IL-37-HIV1-Tat,3-4shi IL-37；B图：泳道1-2是IL-37-FC克隆的基因片段。

图2. 重组IL-37蛋白的纯化和免疫印迹鉴定结果

1，2泳道分别为上样纯化后的IL-37基因片段表达的活性蛋白产物，泳道3 为阴性对比； B图泳道4，5分别为上样纯化后的IL-37-HIV1 Tat融合阳性基因活性片段表达的蛋白产物，泳道6 为未纯化表达的菌液；C图泳道7分为上样纯化后的IL-37-IgG1 FC融合阳性基因片段表达的蛋白产物，6为未纯化表达的酵母菌液。

图3. 重组IL-37活性基因片段重组蛋白与IL-37-IL-37-Fc在体内血循环半衰期的比较。

图4. 重组IL-3-HIV1tat蛋白可进入细胞。

骨关节炎实验结果

表1.参与实验的骨关节炎患者和健康对照组的人口学和临床特征

表 2. LL-37水平与骨关节炎的临床和实验室检查具相关性

Parameter	Correlation coefficient(r)	P-value
			WOMAC	0.6112	P<0.0001
CRP	0.4603	P<0.0001
			BUN	0.2010	P=0.0009
TNFα	0.3761	P<0.0001
			IL-1β	0.5590	P<0.0001
CXCL8	0.5312	P<0.0001
			MMP3	0.2183	P=0.0005

表 3. 骨关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表

Gene name	Forward (5′to 3′)	Reverse (5′to 3′)
			IL-37	AGTGCTGCTTAGAAGACCCGG	AGAGTCCAGGACCAGTACTTTGTGA
TNFα	CTTCTCGAACCCCGAGTGAC	TGAGGTACAGGCCCTCTGATG
			IL-1β	GCGGCCAGGATATAACTGACTTC	TCCACATTCAGCACAGGACTCTC
CXCL8	GAGTGATTGAGAGTGGACCACACT	GCTCTCTTCCATCAGAAAGCTTTAC
			MMP3	ATGGACAAAGGATACAACAGGGA	TGTGAGTGAGTGATAGAGTGGG
GAPDH	TGCACCACCAACTGCTTAGC	GGCATGGACTGTGGTCATGAG

图5. IL-37 mRNA和蛋白水平在骨关节炎患者比健康对照组显著增高。

图6. 血清IL-37的水平与骨关节炎临床表现密切相关。

图7. 骨关节炎患者的炎性细胞因子在PBMC 和血清的水平增加。

图8. 骨关节炎患者血清IL-37与骨关节炎促炎因子呈正相关。

图9. IL-37抑制骨关节炎患者炎性介质在PBMC中的表达。

图10．IL-37活性基因片段重组蛋白抑制骨关节炎患者炎性介质在滑膜细胞中中的表达。

图11. IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对骨关节炎患者外周血白细胞炎性因子TNFα表达抑制的比较。

痛风实验结果

表 4 参与实验的痛风性关节炎患者和健康对照组的人口学和临床特征

表 5 IL-37水平与痛风性关节炎患者的临床和实验室检查具相关性

Parameter	Correlation coefficient(r)	P-value
			CRP	0.3480	P=0.0020
UA	0.3920	P=0.0006
			BMI	0.1758	P=0.0330
IL-1β	0.6203	P<0.0001
			IL-6	0.4183	P=0.0004
TNFα	0.3651	P=0.0011

表6 痛风性关节炎患者和健康对照检测的基因引物序列列表

图12. 比较骨关节炎患者和健康对照组之间IL-37 mRNA和蛋白的水平。

图13. 比较IL-37 mRNA和蛋白在活动性、静止性痛风性关节炎患者和健康对照者及痛风性关节炎患者伴和没有伴有痛风石患者的表达水平。

图14. IL-37的水平与痛风性关节炎临床参数之间的相关性。

图15. 炎性细胞因子在痛风性关节炎患者的表达水平。

图16. IL-37与骨关节炎性因子的相关性。

图17. IL-37重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子表达的作用，Gout （痛风）， HC （健康对照）。

图18. IL-37(IL-37/IL-HIV1-Tat/IL-37-FC)重组蛋白对痛风性关节炎患者滑膜细胞炎性因子水平的调节。

图19. IL-37，IL-37HIV Tat和IL-37FC重组蛋白对痛风性关节炎患者外周血白细胞炎性因子IL-1表达的作用。

列表1. IL-37基因的改造：

|||||||| ||| | | || || ||| | |||||||| |||||| || || |||||||| |

TGAATTTTCATTT-CAACCAGTTTGCAAAGCTGAAATGAGCCCCAGTGAGGTCAGCGATTAGG 663

||||| || | | || || |||||||||||||||||| || ||| || || ||

CGAATTCTCTT-TCCAGCCGGTTTGCAAAGCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAAA 663

列表1 B：优化的IL-37基因片段序列：

TGGATCCATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGA

TACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGATCGGGTAGCGG 50

AGGAGGAGGAGAATTCGTCCG

列表2 B含IL-37-HIV1 Tat的核苷酸序列：

TGGATCCTATGTACGTAAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAAGAAGCGGAGGA 50

TCGGGTAGCGGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAA 100

AAATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGG 150

TAACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCT 200

TCGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCG 250

ATCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGA 300

CAAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGA 350

AACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGT 400

GCTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTG 450

GTTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACA 500

AATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAA 550

GCTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATTAATGA

列表3. IL-37-FC 融合基因： A列表含IgG1 FC 核苷酸序列；B含IL-37-FC核苷酸序列，列表 2 B中的IL-37基因活性片段的核苷酸序列与本列表A含IgG1 FC 核苷酸序列连接，IL-37基因活性片段在氨端，IgG1 FC 核苷酸序列在羧端；

列表3.A： IgG1 FC 核苷酸序列

GAACCGAAATCTTGCGACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCC 50

GGAACTGCTGGGTGGTCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAG 100

ACACCCTGATGATCTCTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGAC 150

GTTTCTCACGAAGACCCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGT 200

TGAAGTTCACAACGCTAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTA 250

CCTACCGTGTTGTTTCTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAAC 300

GGTAAAGAATACAAATGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGAT 350

CGAAAAAACCATCTCTAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTT 400

ACACCCTGCCGCCGTCTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTG 450

ACCTGCCTGGTTAAAGGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGA 500

ATCTAACGGTCAGCCGGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGG 550

ACTCTGACGGTTCTTTCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCT 600

CGTTGGCAGCAGGGTAACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCT 650

GCACAACCACTACACCCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAA

列表3.B：IL-37-FC核苷酸序列

TTACGTAATGGTTCACACCTCTCCGAAAGTTAAAAACCTGAACCCGAAAA 50

AATTCTCTATCCACGACCAGGACCACAAAGTTCTGGTTCTGGACTCTGGT 100

AACCTGATCGCTGTTCCGGACAAAAACTACATCCGTCCGGAAATCTTCTT 150

CGCTCTGGCTTCTTCTCTGTCTTCTGCTTCTGCTGAAAAAGGTTCTCCGA 200

TCCTGCTGGGTGTTTCTAAAGGTGAATTCTGCCTGTACTGCGACAAAGAC 250

AAAGGTCAGTCTCACCCGTCTCTGCAGCTGAAAAAAGAAAAACTGATGAA 300

ACTGGCTGCTCAGAAAGAATCTGCTCGTCGTCCGTTCATCTTCTACCGTG 350

CTCAGGTTGGTTCTTGGAACATGCTGGAATCTGCTGCTCACCCGGGTTGG 400

TTCATCTGCACCTCTTGCAACTGCAACGAACCGGTTGGTGTTACCGACAA 450

ATTCGAAAACCGTAAACACATCGAATTCTCTTTCCAGCCGGTTTGCAAAG 500

CTGAAATGTCTCCGTCTGAAGTTTCTGACTAATGAGAACCGAAATCTTGC 550

GACAAAACCCACACCTGCCCGCCGTGCCCGGCTCCGGAACTGCTGGGTGG 600

TCCGTCTGTTTTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGACACCCTGATGATCT 650

CTCGTACCCCGGAAGTTACCTGCGTTGTTGTTGACGTTTCTCACGAAGAC 700

CCGGAAGTTAAATTCAACTGGTACGTTGACGGTGTTGAAGTTCACAACGC 750

TAAAACCAAACCGCGTGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGTGTTGTTT 800

CTGTTCTGACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAAGAATACAAA 850

TGCAAAGTTTCTAACAAAGCTCTGCCGGCTCCGATCGAAAAAACCATCTC 900

TAAAGCTAAAGGTCAGCCGCGTGAACCGCAGGTTTACACCCTGCCGCCGT 950

CTCGTGAAGAAATGACCAAAAACCAGGTTTCTCTGACCTGCCTGGTTAAA 1000

GGTTTCTACCCGTCTGACATCGCTGTTGAATGGGAATCTAACGGTCAGCC 1050

GGAAAACAACTACAAAACCACCCCGCCGGTTCTGGACTCTGACGGTTCTT 1100

TCTTCCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAATCTCGTTGGCAGCAGGGT 1150

AACGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCTCTGCACAACCACTACAC 1200

CCAGAAATCTCTGTCTCTGTCTCCGGGTAAATAATGA

Claims

1.白介素37在制备防治骨关节炎和痛风的药物中的应用。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述药物中的白介素37为重组蛋白,所述的重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO：1所示。

3. 根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述药物以人IL-37蛋白或其衍生物人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白、人IL-37-Fc融合蛋白为活性成分。

4. 根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述的重组的人IL-37蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5. 根据权利要求3所述的应用，其特征是：重组的人IL-37-HIV1 Tat融合蛋白的氨末端为HIV-1 Tat穿模结构，羧末端为人IL-37活性部分，两者之间有一中间肽连接，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6. 根据权利要求3所述的应用，其特征是：重组的人IL-37-Fc融合蛋白是重组蛋白的氨末端为IL-37活性部分，羧末端为人IgG1 Fc 包括铰链CH2和CH3部分，氨基酸序列如SEQID NO：4所示。

7.根据权利要求1-6的任意一项所述的应用的具有IL-37活性的重组蛋白的制备方法，其特征是：包括如如下步骤：

（1）设计得到如权利要求5-6任一项所述的核苷酸序列；

（2）构建如权利要求4-6 任一项所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转入宿主细胞，形成可表达如权利4-6任一项所述的具有IL-37 活性的重组蛋白；

（3）培养权利要求4-6任一项所述的核苷酸序列表达系统的重组细胞，使其表达目的蛋白；

（4）分离纯化权利要求4-6任一项所述的具有IL-37活性的重组蛋白。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：所述表达的系统为原核表达系统为真核表达系统，所述原核表达系统选自大肠杆菌表达系统；所述真核表达系统为酵母表达系统。

9.如权利要求4-6任一项所述的具有IL-37活性的重组蛋白制备药物，应用于骨关节炎、痛风及自身免疫疾病如类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。

10.如权利要求4-6任一项所述的具有IL-37活性的基因制备药物，应用于骨关节炎、痛风及某些自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠性肠炎、动脉粥样硬化、银屑病、支气管哮喘、强直性脊柱炎和病态肥胖炎症的治疗。