KR102127218B1 - 뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도 - Google Patents

뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌 신경 교종 및 특히 교모세포종을 치료하기위한 약물의 제조에서 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다. 특정 융합 단백질의 발현을 치료하기위한 약물의 제조에서 식 A로 표시되는 화합물의 용도가 특히 제공된다. 본 발명의 기술적 해결 방법을 통해 뇌 교모세포종의 타이핑을 수행하고, 특정 환자군에 대한 약물 투여가 가능하며, 정확한 치료가 가능하다.
Figure 112018075793206-pct00011

식 A

Description

뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도
본 발명은 생물학적 의약품의 기술 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도에 관한 것이다.
교모세포종은 뇌 신경 교종 중에서 가장 악성인 신경 교종이다. 교모세포종 (Glioblastomas)은 대뇌 피질 아래에서 자라며 거의 대뇌 피질 대뇌 반구 전역에서 발견된다. 침윤성 성장을 통해 교모세포종은 대개 수개의 엽(또는 로브(lobe))을 침범하고 깊은 구조를 침범하고, 뇌들보(또는 뇌량, corpus callosum)를 통해 반대편 대뇌 반구에 퍼진다. 교모세포종은 주로 전두엽에서 발견되며, 다음으로 측두엽과 두정엽, 및 드물게 후두엽 / 시상, 기저핵 등에 발견된다.
교모세포종은 빨리 자라며, 경과가 짧다. 환자의 70-80 %는 3-6 개월의 질병 경과를 경험하고, 단 10 %만이 1 년 이상의 질병 경과를 경험한다. 드문 경우에 교모세포종 출혈은 뇌졸중 유사 발작(stroke-like episode)을 일으킨다. 신경 교모세포종(Glioblastomas)은 급속히 성장하여, 광범위한 뇌부종 및 명백한 두개 내 고혈압의 증상이 나타난다. 거의 모든 환자는 두통, 구토, 두통이 동반된 유두부종, 정신 상태의 변화, 사지의 약화, 의식 장애 및 언어 장애로 고통받는다. 교모세포종은 뇌 조직에 침윤성 손상을 일으켜, 일련의 병소 증상을 일으키며, 교모세포종 환자는 편측 마비, 편측이상감각, 실어증, 반맹증 등 다른 정도의 고통을 겪는다. 편측마비, 뇌 신경 병변, 편측이상감각, 및 반맹증은 신경학적 검사를 통하여 확인할 수 있다. 환자의 약 33 %가 간질 발작을 앓고 있으며, 약 20 %는 아파씨증, 치매 및 정신박약 등과 같은 정신과적 증상이 나타난다.
교모세포종은 두 종류로 분류할 수 있는데, 즉 보다 저등급 신경 교종에서 진행된 2차성 교모세포종과 저등급 전암성 병변을 나타내지 않는 1차성 교모세포종으로 분류할 수 있다.
1차성 교모세포종은 처음 진단될 때 IV-급 교모세포종이며, 가장 분명한 분자적 특징은 EGFR 증폭, 돌연변이 또는 과발현 (40 %), P53 돌연변이 (30 %), CDKN2A/B 결실 (30-40 %), RB1 돌연변이 또는 결실, 염색체 10의 상실 (70 %), PTEN 돌연변이 (30 %) 등을 포함한다.
대조적으로, 2차성 교모세포종은 보다 저-등급 뇌 신경 교종 (II 등급 또는 III 등급)부터 진행되는 IV-등급 신경 교종이다. 첫번째 임상 진단에서 저등급으로 발견된, 신경 교종은 수술이나 화학방사선요법 후에 다시 성장하여 IV-급 신경 교종으로 발전한다. 연구에 따르면 2차성 교모세포종의 분자 마커와 유전자 세포 경로가 1차성 교모세포종과는 다르다는 사실을 규명하였다. 이소구연산염 탈수소효소 (IDH)의 돌연변이는 2차성 교모세포종에서만 발견되었지만, 모든 2차성 교모세포종이 IDH 돌연변이를 갖는 것은 아니다. 현재 2차성 교모세포종의 분자 마커에 대한 연구는 IDH 1 돌연변이 (70 %), P53 돌연변이 (65 %), PDGFA와 PDGFRA 의 과발현 (60 %), 염색체 19의 긴 사슬의 결실 (50 %), RB1의 돌연변이 또는 결실 (25 %)에 초점을 두고 있다. 이러한 분자 마커의 발견은 교모세포종의 표적 치료를 위한 중요한 목표를 제공한다. 이러한 분자 마커를 표적하는 많은 표적 의약품이 있으나, 이 표적 의약품은 다양한 원인으로 임상 적용을 통과하지 못한다. 근본적인 원인은 일반적으로 표적 연계의 특이성이 낮아 치료 효과가 낮고 약의 부작용이 크다는 것이다. 이에, 이러한 표적 의약품은 임상 적용에 적합하지 않다.
따라서, 현재 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종에 대한, 보다 높은 표적 특이성을 가지고 정확한 치료를 할 수 있는 의약품이 요구된다.
간세포 성장 인자 수용체 (HGFR, c-Met라고도 함)는 met 유전자에 의해 코딩되고 수용체 티로신 키나아제 패밀리에 속한다. HGFR이 이의 리간드 간세포 성장 인자와 결합하면, HGFR의 세포내 도메인이 자동적으로 인산화되어 하류 신호 전달 경로를 활성화시켜, 세포 증식, 형태발생 및 운동성을 조절한다. 각각의 다른 종양에서 많은 c-Met 이상이 대부분 나타나는 것으로, 규명되었다. 또한, PTPRZ1 유전자 (수용체 단백질 티로신 키나아제 패밀리에 속함, RPRPB라고도 불림)에 의해 코딩된 포스파타제(인산가수분해효소)가 met 신호 전달 경로를 비활성화시키기 위해 c-Met으로부터 특정 인산화 부위를 제거할 수 있는 것으로 연구 결과 규명되었다. 따라서 이 단백질이 c-Met와 특정한 결합 관계를 가지고 있으며, 질병 발생 및 발달에 있어서 c-Met의 역할에 영향을 줄 수 있다고 결론지을 수 있다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 높은 표적 특이성을 가지며 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종의 개인에 맞추어지고 정확한 치료를 달성할 수 있는 약물을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 많은 양의 연구를 통하여, 여타 c-Met 저해제와 비교하여, c-Met 저해제로서, 식 A로 표시되는 화합물은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종을 저해하는 것에 보다 현저한 효과를 갖는다는 것을 규명하였다. 특히, 상기 화합물은 특이적 융합 단백질을 발현시키고 이에 보다 예후가 좋지 않은, 교모세포종의 아형을 저해하는 것에 보다 현저한 효과를 가진다.
따라서, 본 발명은 다음의 기술적 해결책을 제공한다:
본 발명은 뇌 신경 교종 치료용 약물의 제조에서 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다.
Figure 112018075793206-pct00001
식 A
식 A로 표시되는 화합물은 중국 특허 출원 공보 CN103122000A의 실시예 44에 개시된 바와 같은 단계 및 반응식에 의해 합성될 수 있다.
바람직하게는, 상기 뇌 신경 교종은 교모세포종(glioblastoma)이다.
보다 바람직하게, 뇌 신경 교종은 2차성 교모세포종이다.
연구에 따르면, 한편으로는, 특정 융합 단백질이 이차 교모세포종에서 발현될 수 있음이 밝혀졌다. 융합 단백질은 c-Met의 아미노산 서열의 대부분을 포함하고, c-Met의 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 PTPRZ1의 아미노산 서열의 일부를 포함한다. 식 A로 표시되는 화합물은 융합 단백질을 발현하는 아교형 교모세포종의 증식 및 종양 형성을 억제하는 효과가 보다 우수하다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명은 2차성 교모세포종의 치료용 약물의 제조에 있어서 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공하고, 여기서 상기 2차성 교모세포종은 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이고, 상기 융합 단백질(또한 본원에서 "ZM"이라 불림)은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 번역된 단백질 부분을, c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 번역된 단백질 부분에 융합하는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 단백질 부분은 c-Met의 단백질 부분의 N-말단에 위치한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 N-말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같다. 본원에서 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 융합 단백질을 "ZM1-2"라 명명하고; 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM2-2"로 명명되고; 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM3-2"로 명명되고; 및 서열 번호 6로 표시되는 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM8-2"로 명명된다.
상기 과제의 해결 수단에 기초하여, 교모세포종 세포에서 본 발명의 상술된 융합 단백질의 발현은 면역블로팅을 통해 항체와 검출될 수 있다. 검출하고자 하는 단백질의 아미노산 서열이 알려져있는 경우, 단백질에 대한 항체 (예를 들면, 모노클로날 항체 또는 멀티 클로날 항체)를 사용하여 면역블로팅에 의해 특정 조직 또는 세포에서 단백질의 발현을 검출한다 이는 당 업계의 통상적인 기술이다. 검출은 융합 단백질의 단편 또는 전체 융합 단백질에 대해 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 실시 양태에 따라, 인간 c-Met 단백질에 대한 항체를 사용하여 상기 언급된 융합 단백질의 발현을 검출할 수 있다. 실제로, 임의의 상기 융합 단백질이 교모세포종 세포에서 발현되는지의 여부에 기초하여, 교모세포종은 아형화될 수 있고, 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물로 치료될 수 있다.
한편, 2차성 교모세포종은 특정 융합 전사물(체)을 포함할 수 있으며, 이 융합 전사물은 c-Met-코딩하는 RNA의 대부분과 이 c-Met-코딩 RNA 부분의 5'말단에 융합된 PTPRZ1-코딩 RNA의 일부를 포함한다. 식 A로 표시되는 화합물은 상기 융합 전사물(체)을 함유하는 교모세포종 아종의 증식 및 종양 형성을 억제하는데 있어서, 보다 우수한 효과를 갖는다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명은 2차성 교모세포종의 치료용 약물의 제조에서의 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공하고, 여기서, 상기 2차성 교모세포종은 융합 전사물을 포함하는 2차성 교모세포종의 아종이고, 상기 융합 전사물은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3, 또는 엑손 1 내지 8로부터 전사된 RNA 부분과 c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 전사된 RNA 부분을 연결시키는 것으로부터 형성되고, 여기서 상기 PTPRZ1의 RNA 부분은 상기 c-Met의 RNA 부분의 5'말단에 위치된다.
바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 추가로 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열 및 그 5 '말단에 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에 따르면, 융합 전사물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열로 구성된다.
이와 유사하게, 상기 과제의 해결 수단에 기초하여, 교모세포종 세포에서 본 발명의 상술된 융합 단백질의 발현은 또한 상기 서술된 융합 전사물, 즉 이의 RNA 코딩 서열에서 검출될 수 있다. 검출될 단백질의 아미노산 서열이 알려져 있을 때, RNA 코딩 서열을 검출하는 것은 또한 당 업계의 통상적인 기술에 속하며, 융합 단백질 단편 또는 전체 융합 단백질에 대해 검출이 수행될 수 있다. 예를 들어, 총 RNA를 추출하여 주형으로 사용할 수 있고, 또는 총 RNA를 주형으로 사용되는 cDNA로 역전사시킬 수 있다. 특정 프라이머가 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다. 실제로 융합 전사물이 교모세포종 세포에 존재하는지 여부에 기초하여, 교모세포종을 아형화할 수 있고, 이에 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물로 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10으로 나타낸 융합 단백질 ZM1-2, ZM2-2, ZM3-2 또는 ZM8-2의 cDNA 서열을 제공한다.
본 발명에 의해 제공된 과제의 해결 수단에 기초하여, 식 A로 표시되는 화합물은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종을 치료하기 위해 임상적으로 사용될 수 있으며, 이를 필요로하는 대상에 식 A로 표시되는 화합물 또는 식 A로 표시되는 화합물을 함유하는 임의의 약학적 조성물의 유효량으로 투여될 수 있는 것을 포함하고, 복용량 및 투여 경로는 개인 건강 상태, 질환의 증상 및 중증도 등에 따라 다르며, 특정 상황에서 의사에 의해 판단될 필요가 있다.
구체적으로는, 정밀한 치료 계획이 필요한 경우에는, 치료된 대상의 교모세포종 샘플과 같은, 종양 샘플을 임상적으로 먼저 검출할 수 있고, 예를 들어, 상술된 융합 단백질이 발현되는지 여부 또는 상술된 융합 전사물이 상기 교모세포종 샘플에 함유되어 있는지 여부를 검출, 및/또는 상기 샘플에 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 전사물의 함량을 검출할 수 있다. 치료될 대상의 샘플이 상기 언급된 융합 단백질 또는 융합 전사물을 함유하는 경우, 또는 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 전사물의 함량이 정상의 대상의 것 또는 임의의 여타 관련 샘플 보다 높은 경우, 식 A로 표시되는 화합물 또는 이 화합물을 함유하는 약학적 조성물이 투여될 수 있다. 이러한 상황에서, 샘플에 융합 단백질 또는 융합 전사물의 존재 또는 함량은 통상적인 기술, 예를 들어, 상기 언급된 면역블로팅 및 PCR을 사용하여 검출될 수 있다.
임상 연구에 의하면, 본 발명에서 언급한 융합 단백질을 발현하거나, 또는 본 발명에서 언급한 융합 전사물을 함유하는 교모세포종은 예후가 좋지 않고, 이러한 환자의 생존 시간은 상기 융합 단백질 또는 융합 전사물을 갖지 않는 환자의 생존 시간에 비하여 명백히 짧다 (127일 VS 248일). 이러한 교모세포종을 가진 환자의 경우, 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물은 다른 유사한 약물과 비교하여 특별한 치료 이점을 갖는다.
또한, 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종에 대한 치료 동안, 식 A로 표시되는 화합물은 다른 치료 또는 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 특정 시간 간격으로 사용될 수 있다. 복용량 및 투여 경로는 개개인의 건강 상태, 질환의 증상 및 중증도에 따라 다르며, 특정 상황에 따라 의사가 판단할 필요가 있다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
교모세포종 세포주의 인비보 종양형성 및 인비트로 증식에 대한 식 A로 표시되는 화합물의 실험을 통하여, 본 발명은 처음으로 상기 식 A로 표시되는 화합물이, 여타 c-Met와 비교하여, 보다 현저하게 교모세포종의 발달을 억제하는 것을 입증하였다. 구체적으로 말하자면, 실험은, 유사 구조의 c-Met 억제제와 비교하여, 식 A로 표시되는 화합물은 동물에서 종양 형성과 세포 생존률에 대한 보다 강력한 억제 효과를 가진다는 것을 입증한다. 세포 질험 및 인비보 실험 둘 모두의 결과는 식 A로 표시되는 화합물의 교모세포종에 대한 억제 효과가 크리조티닙과 가깝거나, 또는 보다 높다는 것을 입증한다. 특히, 크리조티닙의 분자량은 식 A로 표시되는 화합물의 분자량 보다 크므로, 크리조티닙이 혈액 뇌 장벽을 통과하는 것이 보다 어렵고, 크리조티닙은 교모세포종에 거의 도달할 수 없고, 역할 수행이 제한적이다. 게다가, 크리조티닙은 이중 표적(타깃) 약물이다. 연구에 따르면, 크리조티닙은 ALK를 억제함과 동시에 c-Met를 억제하고, 이에 상대적으로 큰 부작용을 가지는 것으로 확인된다. 비교하자면, 식 A로 표시되는 화합물은 오직 c-Met만을 표적하고, 이에 부작용은 보다 적다.
특히, 실험은, 식 A로 표시되는 화합물이 특정 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종을 억제하는 효과가 보다 현저하다는 것을 입증하고, 그 효과는 유사 화합물 또는 공지된 치료 약의 효과를 훨씬 상회하는 것임을 입증한다. 융합 단백질이 발현되는지 여부 또는 언급된 융합 전사물이 교모세포종에 존재하는지 여부를 검출함으로써, 상기 융합 단백질을 발현하거나, 또는 상기 융합 전사물을 함유하는 교모세포종의 아형을 다른 교모세포종과 구별할 수 있고, 식 A로 표시되는 화합물을 사용하여 효과적인 치료를 할 수 있고, 이로부터 교모세포종 환자에 대한 개인적이고 정밀한 치료를 구현하고, 이러한 특정 유형의 교모세포종에 의해 야기되는 예후가 좋지 않은 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 동싱에, 식 A로 표시되는 화합물의 작용 메카니즘에 기초하여, 부작용을 피할 수 있고, 환자의 고통을 경감시킬 수 있으며, 이 약물로의 치료를 보다 안전하고 보다 효과적으로 만들 수 있다. 마지막으로, 질환 치료 및 예후의 비용 이점이 향상된다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 의해 제공되는 서열 번호 3으로 표시되는 융합 단백질 (ZM1-2) 및 서열 번호 4로 표시되는 융합 단백질 (ZM2-2)의 cDNA 서열 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 구조를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에서 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 면역블로팅 결과를 나타내고, 여기서 레인 1은 융합 단백질 ZM8-2이고, 레인 2는 융합 단백질 ZM2-2이고, 레인 3 및 4는 각각 레퍼런스이다.
도 4는 렌트 바이러스 벡터 PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro의 구조적 표현이며, 여기서 융합 단백질을 코딩하는 서열에 대한 삽입 위치가 도시된다.
도 5는 실시예 5에서의 인비보 종양 성장 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 5에서 마우스 생존 실험의 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 5의 교모세포종의 인비보 종양 형성 실험의 뇌 자기 공명 영상 결과로서, 여기서 패널 7A는 모델링에 의해 얻어진 벡터 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7B는 모델링에 의해 얻어진 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7C는 식 A로 표시되는 화합물을 처음 투여한 후, 16 일째의 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7D는 식 A로 표시되는 화합물이 처음 투여된 후, 16 일째에 화합물 투여를 중지한 이래로 10일경 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌이미지를 나타낸다.
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명한다. 당업자는 이들 실시예가 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하는 것은 아니고, 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것임을 이해할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 다음 실시예의 방법은 일반적인 방법이다. 하기 실시예에서 사용된 원료 약물 재료 및 시약 재료 등 모두는 달리 명시하지 않는 한 시판되는 제품이다.
실시예 1 : 교모세포종의 RNA 및 cDNA 획득.
80 개의 교모세포종 샘플은 의료 윤리위원회(Medical Ethics Committee)의 기준에 부합하는 수술을 통해 수집되었다. 각 샘플은 샘플을 기증한 환자와 이 환자의 의사로부터 서면 동의를 얻어 수집하였다. 샘플의 성별, 나이 및 질병 유형을 표 1에 나타내었다.
Case No. 성별 나이 교모세포종
유형
Case No. 성별 나이 교모세포종
유형
1 M 44 Primary 41 F 55 Primary
2 F 59 Primary 42 M 38 Primary
3 F 56 Primary 43 M 54 Primary
4 F 48 Primary 44 F 60 Primary
5 M 64 Primary 45 F 37 Primary
6 M 66 Primary 46 F 59 Primary
7 M 59 Primary 47 M 54 Primary
8 F 62 Primary 48 M 52 Primary
9 M 42 Primary 49 M 46 Primary
10 M 81 Primary 50 M 56 Primary
11 M 60 Primary 51 M 60 Primary
12 M 29 Primary 52 F 63 Primary
13 M 26 Primary 53 M 44 Primary
14 M 47 Primary 54 F 25 Primary
15 M 42 Primary 55 M 42 Primary
16 F 43 Primary 56 M 51 Primary
17 F 40 Primary 57 M 45 Primary
18 M 27 Primary 58 F 50 Primary
19 M 42 Primary 59 M 61 Primary
20 F 37 Primary 60 M 33 Secondary
21 M 45 Primary 61 M 8 Secondary
22 M 54 Primary 62 M 42 Secondary
23 F 47 Primary 63 M 29 Secondary
24 M 33 Primary 64 M 29 Secondary
25 M 63 Primary 65 F 40 Secondary
26 M 34 Primary 66 M 44 Secondary
27 M 18 Primary 67 M 33 Secondary
28 M 33 Primary 68 M 27 Secondary
29 M 30 Primary 69 F 37 Secondary
30 M 49 Primary 70 F 56 Secondary
31 M 43 Primary 71 F 31 Secondary
32 F 28 Primary 72 M 45 Secondary
33 M 42 Primary 73 F 34 Secondary
34 F 62 Primary 74 M 54 Secondary
35 M 48 Primary 75 M 46 Secondary
36 F 51 Primary 76 M 18 Secondary
37 F 40 Primary 77 M 38 Secondary
38 F 24 Primary 78 M 48 Secondary
39 F 49 Primary 79 M 53 Secondary
40 M 51 Primary 80 M 51 Secondary
RNA 추출 키트 (Qiagen으로부터 구입)를 사용하여 이의 지침에 따라 각 교모세포종 샘플의 총 mRNA를 추출하였다. 분석기를 이용하여 총 mRNA의 무결성을 확인하였고, 각 샘플의 총 mRNA의 RIN (RNA Integrity Number)이 7.0 보다 큰 것을 확인하였다.
역전사 키트 (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, K1622, 인비트로겐에서 구입)를 사용하여 이의 지시에 따라 주형인 각 샘플로부터의 총 mRNA를 취하는 것으로부터 20㎕ 반응계에서 역전사를 수행하여, 각 샘플에 대한 이중-가닥 cDNA를 합성하였다.
실시예 2 : 교모세포종에서의 본 발명에 따른 융합 단백질의 검출
실시예 1에서 제조된 각 샘플의 이중-가닥 cDNA를 주형으로 취하여 하기 프라이머 서열을 사용하여 증폭시켰다 :
정방향 프라이머 :
서열 번호 11 ATGCGAATCCTAAAGCGTTTCCTCG
역방향 프라이머 :
서열 번호 12 CTATGATGTCTCCCAGAAGGAGGCT
20 μl 증폭 시스템은 다음을 포함한다 : 10 μM 정방향 프라이머, 1 μl; 10 μM 역방향 프라이머, 1 μl; 100 ng 주형; 2X Phusion Master Mix (NEB, 제품 번호 M0531), 10 μl; 및 핵산 분해 효소가 없는(nuclease-free) 물, 최대 20 μl.
PCR 프로그램 설정은 다음을 포함한다 : 98 ℃ 30 초; 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1.5 분, 총 30 사이클; 72 ℃ 5 분; 12 ℃에서 유지.
PCR 생성물을 1 % 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석하고, 생성된 밴드를 DNA 겔 회수 키트 (QIAquick PCR 정제 키트, Qiagen으로부터 구입)로 회수 한 후, T 벡터 (pGEM-T 이지 벡터, Promega로부터 구입)에 클로닝하고, DNA sequencer (ABI Prism 3730×l DNA sequencer, Applied Biosystems에서 구입)로 서열을 결정하였다.
시퀀싱 결과는 증폭을 통해 두 개의 상이한 뉴클레오티드 서열이 얻어짐을 보였다. 그들은 66 개의 상이한 뉴클레오티드를 가지며, 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 의해 나타난 바와 같다. 뉴클레오티드 서열의 시퀀싱 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 융합 단백질 ZM3-2 및 융합 단백질 ZM8-2의 게놈 DNA 서열은 특정 샘플의 전체 게놈 DNA를 시퀀싱함으로써 발견되었다.
샘플 출처에 기초하여, 표 1에 열거된 60번 샘플, 64번 샘플, 77번 샘플, 78번 샘플 및 80번 샘플은 상응하는 융합 단백질의 cDNA 또는 게놈 DNA를 갖는 것으로 규명되었다: 융합 단백질 ZM1-2가 60번 샘플에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM2-2가 64번 샘플과 78번 샘플 모두에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM3-2가 77번 단백질에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM8-2가 80번 샘플에서 발견되었다. 결과에 따르면 본 발명에 따른 융합 단백질 및 이의 코딩 RNA 또는 게놈 DNA가 일부 교모세포종에 특이적으로 존재하고, 다른 부분의 교모세포종에는 존재하지 않고, 거의 모든 것은 2차성 교모세포종에서 발견된다는 것을 보여준다.
따라서, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3 (융합 단백질 ZM1-2), 서열 번호 4 (융합 단백질 ZM2-2), 서열 번호 5 (융합 단백질 ZM3- 2) 및 서열 번호 6 (융합 단백질 ZM8-2)로 표시되는 바와 같이 얻어진다. 서열 정렬을 통해, 이들 4 가지 융합 단백질은 모두 PTPRZ1 단백질의 일부를 N-말단에서 C-말단까지 거의 모든 c-Met 단백질에 융합시킴으로써 형성된다는 것을 발견하였다. 특히, 융합 단백질 ZM1-2는 PTPRZ1의 엑손 1을 c-Met의 엑손 2 내지 24 에 융합시켜 얻었으며, 융합 단백질 ZM2-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 2를 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 수득하였으며, 융합 단백질 ZM3-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 3을 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 수득하였고, 융합 단백질 ZM8-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 8을 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 얻어졌고; 및, 상기 4 개의 융합 단백질은 모두 c-Met의 프로모터 및 엑손 1(비-기능성 요소)에 상응하는 부분을 포함하지 않았다. 따라서, 융합 유전자는 PTPRZ1의 프로모터로 전사되는 것으로 추측된다. 이 4 개의 융합 유전자의 구조적 표현을 도 2에 나타내었다.
게다가, 임상 연구에 따르면, 본 발명에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 가지는 교모세포종의 경우의 중앙값 생존은 127 일이었고, 보고된 교모세포종 경우 (248 일)의 중앙값 생존 보다 짧다. 따라서, 2차성 교모세포종 중에서, 본 발명에서 기술된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 아종은 보다 좋지 않은 예후를 가지는 것으로 판명되었다.
실시예 3 : 교모세포종에서의 융합 단백질의 면역블로팅 검증
실시예 1에서 수집 된 80 개의 교모세포종 샘플의 총 단백질을 융합 단백질의 면역블로팅 검증에 적용하였다.
면역블로팅 검증에 사용된 항체는 인간 c-Met 단백질에 대한 항체였다 (래빗 항체, Abcam으로부터 구입, 제품 번호 : ab51067). 비-융합 인간 c-Met 단백질의 분자량은 145 kDa 인 반면, 융합 단백질의 분자량은 더 크다. 면역블로팅 조작은 항체의 지시 및 면역블로팅 키트의 지시에 따라 수행하였다.
면역블로팅 결과는 얻어진 면역블로팅 밴드가 실시예 2의 결과와 일치한다는 것을 보여주었다 : 표 1에 열거된 샘플 중 60번, 64번, 77번, 78번 및 80번 샘플에서 면역블로팅 밴드가 발견되었다 (모두 2차성 교모세포종 샘플이었다). 도 3은 ZM8-2 및 ZM2-2의 면역블로팅 결과로서, 대략적으로 오버랩된 면역블로팅 밴드에 의하여 나타난 바와 같이, ZM8-2의 분자량은 약 190 kDa이고, ZM2-2의 분자량은 비-융합 인간 c-Met 단백질의 분자량에 가깝다는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명에서 기술된 바와 같은 융합 단백질은 교모세포종의 일부에서 특이적으로 발현되고, 교모세포종의 다른 부분에서는 특이적으로 발현되지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 교모세포종은 상기 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 하위 유형(아종)과 융합 단백질을 발현하지 않는 교모세포종의 하위 유형으로 분류될 수 있다.
실시예 4 : 교모세포종 세포 증식에 대한 식 A로 표시되는 화합물의 억제 활성 측정
교모세포종 세포 증식 억제 활성 시험의 실험은, 식 A로 표시되는 화합물과 크리조티닙뿐만 아니라, 각각 식 A의 구조와 유사한 구조를 갖는 식 B 내지 H로 표시되는 화합물을 사용하여 수행하였다.
식 A-H로 표시되는 화합물은 중국 특허 공개 CN103122000A에 개시된 단계 및 반응식에 따라 합성되었다.
Figure 112018075793206-pct00002
식 A (CN103122000A 실시예 44)
Figure 112018075793206-pct00003
식 B (CN103122000A 실시예 28)
Figure 112018075793206-pct00004
식 C (CN103122000A 실시예 29)
Figure 112018075793206-pct00005
식 D (CN103122000A 실시예 37)
Figure 112018075793206-pct00006
식 E (CN103122000A 실시예 38)
Figure 112018075793206-pct00007
식 F (CN103122000A 실시예 46)
Figure 112018075793206-pct00008
식 G (CN103122000A 실시예 47)
Figure 112018075793206-pct00009
식 H (CN103122000A 실시예 49)
크리조티닙 (CRIZOTINIB; PF-02341066) : 제품 번호 S1068, Selleck, USA로부터 구입함.
우선, 렌티 바이러스 벡터 PCDH (PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, SBI, 제품 번호 : CD510B-1,도 4에 나타낸 구조)를 사용하였고, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8로 표시되는 뉴클리오티드 서열을 이의 지시에 따라 상기 벡터에 클로닝하였고, 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제조하였다. 상기 발현 벡터는 각각 "PCDH-ZM1-2" 및 "PCDH-ZM2-2"로 명명되고 표시되었다. 그 다음, 바이러스 패키징 플라스미드 (SBI, 제품 번호 LV500A-1)를 사용하여 293T 세포를 상기 벡터 중 하나와 공동 감염시켜 렌티 바이러스를 제조하였다. 동일한 방법으로 렌티 바이러스 벡터 PCDH를 패키징하고 293T 세포를 공동 감염시켜 블랭크 벡터를 갖는 렌티 바이러스를 제조하였고, 이 벡터는 "PCDH-blank"로 명명되었다.
본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질 중 어느 하나도 발현하지 않는, 인간 신경 교종 세포주 U87은 중국 과학원 세포 은행 (China Bank of Medical Sciences)에서 구입하였다. U87 세포를 상기 제조된 임의의 렌티 바이러스에 감염시키고, 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포 모델을 확립하기 위해 퓨로마이신 (스크리닝을 위해 0.5 ㎍/mL 및 유지를 위해 0.2 ㎍/mL)을 적용하여 스크리닝 하였다. 세포 모델은 면역블로팅 및 역전사 PCR에 의해 융합 유전자의 전사와 융합 단백질의 발현에 대하여 검증되었고, 각각 융합 단백질 ZM1-2 및 ZM2-2를 안정적으로 발현하는 세포주를 최종적으로 수득하고 "PCDH-ZM1-2 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"로 명명하였다. 유사하게, U87 세포를 블랭크 레퍼런스로서 블랭크 벡터를 갖는 렌티바이러스 PCDH-블랭크로 감염시켜 "PCDH-블랭크 발현 세포"를 수득하였다.
대형 접시에서 배양되고 대수 단계의 이 U87 세포를 멸균 PBS로 1회 세척한 다음, 0.25 % 트립신으로 2분 동안 분해시켰다. 모든 세포를 분리하기 위해 소화시킨 후, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 완전한 DMEM 배지를 사용하여 소화를 중단하였다. 세포를 계수하고, 세포 농도를 20,000 세포/ml로 맞추어 주었다. 이어서, 다중-채널 피펫을 사용하여 코닝 (Corning) 96-웰 플레이트 (2,000 세포/웰)에 세포를 접종하고, 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 시험될 화합물 (크리조티닙 및 식 A 내지 H로 표시되는 화합물)을 각각 DMSO에 용해시켜 스톡 용액을 제조한 후, 스톡 용액 및 완전한 배지를 사용하여 상이한 농도의 약물 (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM)을 갖는 용액을 제조하였다. 이 세포를 배양기(인큐베이터)에서 추가로 72 시간 동안 배양한 다음, 20 ㎕의 3-(4,5-디메틸티아졸-2)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT)를 각 웰에 첨가하였다. 인큐베이터에서 1 내지 3 시간 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 농도에 해당하는 억제율을 계산하고, GraphPad 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
세포 모델 U87
초기 세포
블랭크
레퍼런스
PCDH-ZMI-2
발현 세포
PCDH-ZM2-2
발현 세포


세포에 시험된 화합물의
저해 활성
(IC50, μM)
크리조티닙 2.99 3.27 8.26 9.76
식 A 3.51 2.85 1.34 1.83
식 B 8.15 6.02 7.63 5.59
식 C 4.78 5.79 9.45 12.76
식 D 5.56 4.93 5.22 7.21
식 E 17.25 21.64 32.64 21.88
식 F 64.37 58.82 90.33 125.29
식 G 9.07 9.25 6.75 15.25
식 H 25.38 19.35 23.31 45.12
표 2로부터, 인간 신경 교종 세포주 U87 그 자체 및 블랭크 레퍼런스 세포주 U87에서, 유사한 구조를 갖는 식 F 내지 G로 표시되는 화합물과 비교하여, 식 A로 표시되는 화합물이 더욱 현저하게 세포 생존력을 억제하는 강력한 효과를 나타내며, 크리조티닙과 유사하거나, 훨씬 높은 증식 억제 효과를 달성하는 것을 알 수 있다.
또한, 실험 동안, 융합 단백질 ZM1-2 및 ZM2-2의 발현을 갖는 교모세포종이 명백히 빠르게 증식 함이 밝혀졌다. 세포 중, 식 A로 표시되는 화합물에 의해서만 세포 생존이 억제 되었고, 식 B 내지 H로 표시되는 화합물 및 크리조티닙의 세포 생존에 대한 억제 효과는 식 Afh 표시되는 화합물의 효과 대비 명백히 열등하였다.
실시예 5 : 식 A로 표시되는 화합물의 교모세포종의 인비보 종양 형성의 억제 활성의 측정
교모세포종의 인비보 종양 형성을 억제하는 실험을 식 A로 나타낸 화합물 및 크리조티닙으로 수행하였다.
(1) 종양 성장 억제 실험
먼저, 종양-보유 마우스 모델이 확립되었다. 6 - 8 주령의 체중이 약 16 - 18 g인 BALB/c (nu/nu) 모계 누드 마우스를 Vital River에서 구입했다. 실시예 4에서 제조된 "PCDH-블랭크 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 각각 PBS로 107 세포/ml의 현탁액으로 제조하였다. 75% 에탄올로 멸균된 누드 마우스 우측 견갑골 부위에 상기 세포 현탁액 100 ㎕를 피하 주사하였고, 여기서 PCDH-블랭크 발현 세포는 7 마리의 누드 마우스에 주사되었고, PCDH-ZM2-2 발현 세포는 21 마리의 누드 마우스에 주사되었다. 피하 접종 후 약 2-3 일째, 고형 종양의 형성을 관찰하기 시작하여 약 15 일 후에 종양이 형성되는 것으로 밝혀졌다. 종양 크기와 마우스 체중의 변화를 일주일에 두번 측정했다. "PCDH-블랭크 발현 세포"를 주사하여 얻어진 종양-보유 마우스는 "벡터 마우스 (1)"로 명명되었고, "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 주사하여 얻어진 종양 보유 마우스를 "ZM2-2 마우스 (1)"로 명명하였다.
종양이 약 100 mm3로 부피로 자랄 때, ZM2-2 마우스 (1)는 평균 종양 크기에 따라 3 그룹으로 나누었고, 각 식 A로 표시되는 화합물이 투여된 7마리의 마우스의 그룹, 크리조티닙이 투여된 7마리의 마우스의 그룹, 및 7마리 마우스의 대조군 그룹이었다. 앞의 두 그룹은 식 A로 표시되는 화합물 10 mg/KG/일의 양으로 주어지거나 또는 50 mg/KG/일의 양으로 크리조티닙이 위관 영양법으로 주어졌다. 이 두가지 약물은 각각 정상 식염수로 현택액으로 제조되고, 연속 투여를 위해 연속적으로 교반하면서 1일 1회 투여되었다. 대조군은 정상 식염수로 위관 투여되었다. 종양 크기 및 마우스 체중의 변화는 일주일에 두번 측정되었다. 종양 직경은 버니어 캘리퍼스로 측정되었고, 종양 부피를 계산하기 위한 식은: 종양 부피 = 0.5*길이*너비2 이었다. 종양 크기의 변화를 도 5에 나타내엇다. 결과로부터, 식 A로 표시되는 화합물은 ZM2-2 마우스 (1)에서 종양의 성장을 현저히 억제하고, 이 억제 효과는 크리조티닙의 효과 보다 강력하였다.
(2) 마우스의 생존 실험
먼저, 종양-보유 마우스 모델이 확립되었다. 실시예 4에서 제조된 "PCDH-블랭크 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 각각 PBS로 105 세포/5㎕의 현탁액으로 제조하였다. 75 % 에탄올로 멸균된 누드 마우스에 100㎕의 세포 현탁액을 접종하였다. 세포 접종 위치 (전방 십자 인대의 우측에서 2mm, 후방으로 2mm)는 마우스용 뇌 고정기구를 사용하여 측정되었다; 주입 깊이는 3.5mm이었고 0.6mm 상승했다; 각 5㎕의 세포 용액을 각각의 마우스에 주사 하였다. 주사 후, 마우스를 1 분 동안 유지시킨 후, 일반적인 피부 봉입을 실시하였다. 두개 내 종양이 관찰된 후, "PCDH-블랭크 발현 세포"로 수득된 종양 보유 마우스를 "벡터 마우스 (2)"로 명명하고, "PCDH-ZM2-2 발현 세포"로 수득된 종양 보유 마우스를 "ZM2-2 마우스 (2)"로 명명했다.
마우스의 두뇌는 핵 자기 공명 영상을 통해 탐지되었다. 벡터 마우스 (2)의 두개 내 종양은 분명히 ZM2-2 마우스 (2)의 두개 내 종양보다 작다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이는 본 발명에 의해 제공된 융합 단백질의 발현은 마우스에서 교모세포종의 종양 형성을 명백하게 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 결과는 패널 7A 및 패널 7B에 각각 도시되어 있다.
8 마리의 벡터 마우스 (2) 및 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에 각각 식 A로 표시되는 화합물을 50 mg/KG 중량/일의 양으로 투여하였다. 화합물을 위관 영양법으로 하루 1 회 투여하였다. 동시에, 다른 그룹의 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에게 대조군으로서 생리 식염수를 투여했다. 실험은 6 주 이상 지속되었다. 결과는 정상 식염수만을 투여한 ZM2-2 마우스 (2)는 20 일 이후 점진적으로 사망하는 반면, 식 A로 표시되는 화합물을 투여한 벡터 마우스 (2)는 모두 살아남았고, 식 A는 로 표시되는 화합물의 투여가 명백하게 도 6에 도시된 바와 같이 ZM2-2 마우스 (2)의 생존 시간을 연장시켰다.
식 A로 표시되는 화합물을 투여 한 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌를, 식 A로 표시되는 화합물을 처음 투여한 후 16 일째에 핵 자기 공명 영상으로 검출하였다. 두개 내 종양이 분명히 작아지는 것을 확인하였다. 패널 7C의 결과를 참조한다. 유사하게, 식 A로 표시되는 화합물은 ZM2-2 마우스에서 종양의 성장을 명백하게 억제할 수 있음이 증명된다.
또 다른 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에게 식 A로 표시되는 화합물을 50mg/KG 중량/일의 양으로 투여하였다. 화합물을 위관 영양법으로 하루 1 회 투여하였다. 이어서, 화합물 투여를 1 차 투여 후 16 일째에 중지하고, 화합물 중단 후 10 일째에 핵 자기 공명 영상을 통해 뇌를 검출하였다. 종양이 빠른 성장을 재개했다는 것이 발견되었다. 결과는 패널 7D에 나타냈다.
상기 실험 결과에 따르면, 식 A로 표시되는 화합물은 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 성장을 현저하게 억제할 수 있고, 환자의 생존 기간을 연장시킨다는 것을 알 수 있고, 교모세포종은 상기 화합물의 중단 후 재발하기 쉽다는 것을 알 수 있다. 식 A로 표시되는 화합물의 종양 억제 효과는 크리조티닙의 종양 억제 효과보다 더 강하므로, 상기 화합물은 크리조티닙의 대안으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 경우의 생존 기간의 중앙값은 다른 보고된 교모세포종의 경우보다 짧아서, 교모세포종 중에서 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 경우는 예후가 좋지 않다. 예후가 좋지 않은 이러한 교모세포종 아종의 경우, 식 A로 표시되는 화합물은 c-Met 억제제로 사용 가능한 여타 화합물 및 크리조티닙과 비교하여 보다 우수한 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 실시예에 대한 상기 설명은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 당업자는 본 발명에 따른 다양한 변경 및 변형을 할 수 있고, 이는 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고, 본 발명의 보호 범위에 있다.
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tcccggatat cagcgatctt ctctactttc attggggagc actatgtcca tgtgaacgct 4200 acttatgtga acgtaaaatg tgtcgctccg tatccttctc tgttgtcatc agaagataac 4260 gctgatgatg aggtggacac acgaccagcc tccttctggg agacatcata g 4311 <210> 9 <211> 4491 <212> DNA <213> Fusion protein ZM3-2 cDNA <400> 9 atgcgaatcc taaagcgttt cctcgcttgc attcagctcc tctgtgtttg ccgcctggat 60 tgggctaatg gatactacag acaacagaga aaacttgttg aagagattgg ctggtcctat 120 acaggagcac tgaatcaaaa aaattgggga aagaaatatc caacatgtaa tagcccaaaa 180 caatctccta tcaatattga tgaagatctt acacaagtaa atgtgaatct taagaaactt 240 aaatttcagg gttgggataa aacatcattg gaaaacacat tcattcataa cactgggaaa 300 acagataaac ctctcataat gaaggccccc gctgtgcttg cacctggcat cctcgtgctc 360 ctgtttacct tggtgcagag gagcaatggg gagtgtaaag aggcactagc aaagtccgag 420 atgaatgtga atatgaagta tcagcttccc aacttcaccg cggaaacacc catccagaat 480 gtcattctac atgagcatca cattttcctt ggtgccacta actacattta tgttttaaat 540 gaggaagacc ttcagaaggt tgctgagtac aagactgggc ctgtgctgga acacccagat 600 tgtttcccat gtcaggactg cagcagcaaa gccaatttat caggaggtgt ttggaaagat 660 aacatcaaca tggctctagt tgtcgacacc tactatgatg atcaactcat tagctgtggc 720 agcgtcaaca gagggacctg ccagcgacat gtctttcccc acaatcatac tgctgacata 780 cagtcggagg ttcactgcat attctcccca cagatagaag agcccagcca gtgtcctgac 840 tgtgtggtga gcgccctggg agccaaagtc ctttcatctg taaaggaccg gttcatcaac 900 ttctttgtag gcaataccat aaattcttct tatttcccag atcatccatt gcattcgata 960 tcagtgagaa ggctaaagga aacgaaagat ggttttatgt ttttgacgga ccagtcctac 1020 attgatgttt tacctgagtt cagagattct taccccatta agtatgtcca tgcctttgaa 1080 agcaacaatt ttatttactt cttgacggtc caaagggaaa ctctagatgc tcagactttt 1140 cacacaagaa taatcaggtt ctgttccata aactctggat tgcattccta catggaaatg 1200 cctctggagt gtattctcac agaaaagaga aaaaagagat ccacaaagaa ggaagtgttt 1260 aatatacttc aggctgcgta tgtcagcaag cctggggccc agcttgctag acaaatagga 1320 gccagcctga atgatgacat tcttttcggg gtgttcgcac aaagcaagcc agattctgcc 1380 gaaccaatgg atcgatctgc catgtgtgca ttccctatca aatatgtcaa cgacttcttc 1440 aacaagatcg tcaacaaaaa caatgtgaga tgtctccagc atttttacgg acccaatcat 1500 gagcactgct ttaataggac acttctgaga aattcatcag gctgtgaagc gcgccgtgat 1560 gaatatcgaa cagagtttac cacagctttg cagcgcgttg acttattcat gggtcaattc 1620 agcgaagtcc tcttaacatc tatatccacc ttcattaaag gagacctcac catagctaat 1680 cttgggacat cagagggtcg cttcatgcag gttgtggttt ctcgatcagg accatcaacc 1740 cctcatgtga attttctcct ggactcccat ccagtgtctc cagaagtgat tgtggagcat 1800 acattaaacc aaaatggcta cacactggtt atcactggga agaagatcac gaagatccca 1860 ttgaatggct tgggctgcag acatttccag tcctgcagtc aatgcctctc tgccccaccc 1920 tttgttcagt gtggctggtg ccacgacaaa tgtgtgcgat cggaggaatg cctgagcggg 1980 acatggactc aacagatctg tctgcctgca atctacaagg ttttcccaaa tagtgcaccc 2040 cttgaaggag ggacaaggct gaccatatgt ggctgggact ttggatttcg gaggaataat 2100 aaatttgatt taaagaaaac tagagttctc cttggaaatg agagctgcac cttgacttta 2160 agtgagagca cgatgaatac attgaaatgc acagttggtc ctgccatgaa taagcatttc 2220 aatatgtcca taattatttc aaatggccac gggacaacac aatacagtac attctcctat 2280 gtggatcctg taataacaag tatttcgccg aaatacggtc ctatggctgg tggcacttta 2340 cttactttaa ctggaaatta cctaaacagt gggaattcta gacacatttc aattggtgga 2400 aaaacatgta ctttaaaaag tgtgtcaaac agtattcttg aatgttatac cccagcccaa 2460 accatttcaa ctgagtttgc tgttaaattg aaaattgact tagccaaccg agagacaagc 2520 atcttcagtt accgtgaaga tcccattgtc tatgaaattc atccaaccaa atcttttatt 2580 agtggtggga gcacaataac aggtgttggg aaaaacctga attcagttag tgtcccgaga 2640 atggtcataa atgtgcatga agcaggaagg aactttacag tggcatgtca acatcgctct 2700 aattcagaga taatctgttg taccactcct tccctgcaac agctgaatct gcaactcccc 2760 ctgaaaacca aagccttttt catgttagat gggatccttt ccaaatactt tgatctcatt 2820 tatgtacata atcctgtgtt taagcctttt gaaaagccag tgatgatctc aatgggcaat 2880 gaaaatgtac tggaaattaa gggaaatgat attgaccctg aagcagttaa aggtgaagtg 2940 ttaaaagttg gaaataagag ctgtgagaat atacacttac attctgaagc cgttttatgc 3000 acggtcccca atgacctgct gaaattgaac agcgagctaa atatagagtg gaagcaagca 3060 atttcttcaa ccgtccttgg aaaagtaata gttcaaccag atcagaattt cacaggattg 3120 attgctggtg ttgtctcaat atcaacagca ctgttattac tacttgggtt tttcctgtgg 3180 ctgaaaaaga gaaagcaaat taaagatctg ggcagtgaat tagttcgcta cgatgcaaga 3240 gtacacactc ctcatttgga taggcttgta agtgcccgaa gtgtaagccc aactacagaa 3300 atggtttcaa atgaatctgt agactaccga gctacttttc cagaagatca gtttcctaat 3360 tcatctcaga acggttcatg ccgacaagtg cagtatcctc tgacagacat gtcccccatc 3420 ctaactagtg gggactctga tatatccagt ccattactgc aaaatactgt ccacattgac 3480 ctcagtgctc taaatccaga gctggtccag gcagtgcagc atgtagtgat tgggcccagt 3540 agcctgattg tgcatttcaa tgaagtcata ggaagagggc attttggttg tgtatatcat 3600 gggactttgt tggacaatga tggcaagaaa attcactgtg ctgtgaaatc cttgaacaga 3660 atcactgaca taggagaagt ttcccaattt ctgaccgagg gaatcatcat gaaagatttt 3720 agtcatccca atgtcctctc gctcctggga atctgcctgc gaagtgaagg gtctccgctg 3780 gtggtcctac catacatgaa acatggagat cttcgaaatt tcattcgaaa tgagactcat 3840 aatccaactg taaaagatct tattggcttt ggtcttcaag tagccaaagg catgaaatat 3900 cttgcaagca aaaagtttgt ccacagagac ttggctgcaa gaaactgtat gctggatgaa 3960 aaattcacag tcaaggttgc tgattttggt cttgccagag acatgtatga taaagaatac 4020 tatagtgtac acaacaaaac aggtgcaaag ctgccagtga agtggatggc tttggaaagt 4080 ctgcaaactc aaaagtttac caccaagtca gatgtgtggt cctttggcgt gctcctctgg 4140 gagctgatga caagaggagc cccaccttat cctgacgtaa acacctttga tataactgtt 4200 tacttgttgc aagggagaag actcctacaa cccgaatact gcccagaccc cttatatgaa 4260 gtaatgctaa aatgctggca ccctaaagcc gaaatgcgcc catccttttc tgaactggtg 4320 tcccggatat cagcgatctt ctctactttc attggggagc actatgtcca tgtgaacgct 4380 acttatgtga acgtaaaatg tgtcgctccg tatccttctc tgttgtcatc agaagataac 4440 gctgatgatg aggtggacac acgaccagcc tccttctggg agacatcata g 4491 <210> 10 <211> 5115 <212> DNA <213> Fusion protein ZM8-2 cDNA <400> 10 atgcgaatcc taaagcgttt cctcgcttgc attcagctcc tctgtgtttg ccgcctggat 60 tgggctaatg gatactacag acaacagaga aaacttgttg aagagattgg ctggtcctat 120 acaggagcac tgaatcaaaa aaattgggga aagaaatatc caacatgtaa tagcccaaaa 180 caatctccta tcaatattga tgaagatctt acacaagtaa atgtgaatct taagaaactt 240 aaatttcagg gttgggataa aacatcattg gaaaacacat tcattcataa cactgggaaa 300 acagtggaaa ttaatctcac taatgactac cgtgtcagcg gaggagtttc agaaatggtg 360 tttaaagcaa gcaagataac ttttcactgg ggaaaatgca atatgtcatc tgatggatca 420 gagcatagtt tagaaggaca aaaatttcca cttgagatgc aaatctactg ctttgatgcg 480 gaccgatttt caagttttga ggaagcagtc aaaggaaaag ggaagttaag agctttatcc 540 attttgtttg aggttgggac agaagaaaat ttggatttca aagcgattat tgatggagtc 600 gaaagtgtta gtcgttttgg gaagcaggct gctttagatc cattcatact gttgaacctt 660 ctgccaaact caactgacaa gtattacatt tacaatggct cattgacatc tcctccctgc 720 acagacacag ttgactggat tgtttttaaa gatacagtta gcatctctga aagccagttg 780 gctgtttttt gtgaagttct tacaatgcaa caatctggtt atgtcatgct gatggactac 840 ttacaaaaca attttcgaga gcaacagtac aagttctcta gacaggtgtt ttcctcatac 900 actggaaagg aagagattca tgaagcagat aaacctctca taatgaaggc ccccgctgtg 960 cttgcacctg gcatcctcgt gctcctgttt accttggtgc agaggagcaa tggggagtgt 1020 aaagaggcac tagcaaagtc cgagatgaat gtgaatatga agtatcagct tcccaacttc 1080 accgcggaaa cacccatcca gaatgtcatt ctacatgagc atcacatttt ccttggtgcc 1140 actaactaca tttatgtttt aaatgaggaa gaccttcaga aggttgctga gtacaagact 1200 gggcctgtgc tggaacaccc agattgtttc ccatgtcagg actgcagcag caaagccaat 1260 ttatcaggag gtgtttggaa agataacatc aacatggctc tagttgtcga cacctactat 1320 gatgatcaac tcattagctg tggcagcgtc aacagaggga cctgccagcg acatgtcttt 1380 ccccacaatc atactgctga catacagtcg gaggttcact gcatattctc cccacagata 1440 gaagagccca gccagtgtcc tgactgtgtg gtgagcgccc tgggagccaa agtcctttca 1500 tctgtaaagg accggttcat caacttcttt gtaggcaata ccataaattc ttcttatttc 1560 ccagatcatc cattgcattc gatatcagtg agaaggctaa aggaaacgaa agatggtttt 1620 atgtttttga cggaccagtc ctacattgat gttttacctg agttcagaga ttcttacccc 1680 attaagtatg tccatgcctt tgaaagcaac aattttattt acttcttgac ggtccaaagg 1740 gaaactctag atgctcagac ttttcacaca agaataatca ggttctgttc cataaactct 1800 ggattgcatt cctacatgga aatgcctctg gagtgtattc tcacagaaaa gagaaaaaag 1860 agatccacaa agaaggaagt gtttaatata cttcaggctg cgtatgtcag caagcctggg 1920 gcccagcttg ctagacaaat aggagccagc ctgaatgatg acattctttt cggggtgttc 1980 gcacaaagca agccagattc tgccgaacca atggatcgat ctgccatgtg tgcattccct 2040 atcaaatatg tcaacgactt cttcaacaag atcgtcaaca aaaacaatgt gagatgtctc 2100 cagcattttt acggacccaa tcatgagcac tgctttaata ggacacttct gagaaattca 2160 tcaggctgtg aagcgcgccg tgatgaatat cgaacagagt ttaccacagc tttgcagcgc 2220 gttgacttat tcatgggtca attcagcgaa gtcctcttaa catctatatc caccttcatt 2280 aaaggagacc tcaccatagc taatcttggg acatcagagg gtcgcttcat gcaggttgtg 2340 gtttctcgat caggaccatc aacccctcat gtgaattttc tcctggactc ccatccagtg 2400 tctccagaag tgattgtgga gcatacatta aaccaaaatg gctacacact ggttatcact 2460 gggaagaaga tcacgaagat cccattgaat ggcttgggct gcagacattt ccagtcctgc 2520 agtcaatgcc tctctgcccc accctttgtt cagtgtggct ggtgccacga caaatgtgtg 2580 cgatcggagg aatgcctgag cgggacatgg actcaacaga tctgtctgcc tgcaatctac 2640 aaggttttcc caaatagtgc accccttgaa ggagggacaa ggctgaccat atgtggctgg 2700 gactttggat ttcggaggaa taataaattt gatttaaaga aaactagagt tctccttgga 2760 aatgagagct gcaccttgac tttaagtgag agcacgatga atacattgaa atgcacagtt 2820 ggtcctgcca tgaataagca tttcaatatg tccataatta tttcaaatgg ccacgggaca 2880 acacaataca gtacattctc ctatgtggat cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac 2940 ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat 3000 tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt 3060 cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt 3120 gacttagcca accgagagac aagcatcttc agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa 3180 attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac 3240 ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt 3300 acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca gagataatct gttgtaccac tccttccctg 3360 caacagctga atctgcaact ccccctgaaa accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc 3420 ctttccaaat actttgatct catttatgta cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag 3480 ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac 3540 cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa gttggaaata agagctgtga gaatatacac 3600 ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag 3660 ctaaatatag agtggaagca agcaatttct tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa 3720 ccagatcaga atttcacagg attgattgct ggtgttgtct caatatcaac agcactgtta 3780 ttactacttg ggtttttcct gtggctgaaa aagagaaagc aaattaaaga tctgggcagt 3840 gaattagttc gctacgatgc aagagtacac actcctcatt tggataggct tgtaagtgcc 3900 cgaagtgtaa gcccaactac agaaatggtt tcaaatgaat ctgtagacta ccgagctact 3960 tttccagaag atcagtttcc taattcatct cagaacggtt catgccgaca agtgcagtat 4020 cctctgacag acatgtcccc catcctaact agtggggact ctgatatatc cagtccatta 4080 ctgcaaaata ctgtccacat tgacctcagt gctctaaatc cagagctggt ccaggcagtg 4140 cagcatgtag tgattgggcc cagtagcctg attgtgcatt tcaatgaagt cataggaaga 4200 gggcattttg gttgtgtata tcatgggact ttgttggaca atgatggcaa gaaaattcac 4260 tgtgctgtga aatccttgaa cagaatcact gacataggag aagtttccca atttctgacc 4320 gagggaatca tcatgaaaga ttttagtcat cccaatgtcc tctcgctcct gggaatctgc 4380 ctgcgaagtg aagggtctcc gctggtggtc ctaccataca tgaaacatgg agatcttcga 4440 aatttcattc gaaatgagac tcataatcca actgtaaaag atcttattgg ctttggtctt 4500 caagtagcca aaggcatgaa atatcttgca agcaaaaagt ttgtccacag agacttggct 4560 gcaagaaact gtatgctgga tgaaaaattc acagtcaagg ttgctgattt tggtcttgcc 4620 agagacatgt atgataaaga atactatagt gtacacaaca aaacaggtgc aaagctgcca 4680 gtgaagtgga tggctttgga aagtctgcaa actcaaaagt ttaccaccaa gtcagatgtg 4740 tggtcctttg gcgtgctcct ctgggagctg atgacaagag gagccccacc ttatcctgac 4800 gtaaacacct ttgatataac tgtttacttg ttgcaaggga gaagactcct acaacccgaa 4860 tactgcccag accccttata tgaagtaatg ctaaaatgct ggcaccctaa agccgaaatg 4920 cgcccatcct tttctgaact ggtgtcccgg atatcagcga tcttctctac tttcattggg 4980 gagcactatg tccatgtgaa cgctacttat gtgaacgtaa aatgtgtcgc tccgtatcct 5040 tctctgttgt catcagaaga taacgctgat gatgaggtgg acacacgacc agcctccttc 5100 tgggagacat catag 5115 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 11 atgcgaatcc taaagcgttt cctcg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 12 ctatgatgtc tcccagaagg aggct 25

Claims (15)

  1. 식 A로 표시되는 화합물을 함유하는 교모세포종(glioblastoma)의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112019130768313-pct00010

    식 A.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 교모세포종이 2차성 교모세포종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    2차성 교모세포종이 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이며, 상기 융합 단백질은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 번역된 단백질 부분을, c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 번역된 단백질 부분에 융합하는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 단백질 부분은 c-Met의 단백질 부분의 N-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 이의 N-말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제3항 또는 4항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제3항 또는 4항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 표시된 바와 같은 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제2항에 있어서,
    2차성 교모세포종이 융합 전사물(transcript)을 포함하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이며, 상기 융합 전사물은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 전사된 RNA 부분과 c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 전사된 RNA 부분을 연결시키는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 RNA 부분은 c-Met의 RNA 부분의 5'-말단에 위치되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 융합 전사물은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열과, 이의 5 '말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 융합 전사물은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 융합 전사물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 삭제
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