KR102127218B1 - 뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도 - Google Patents
뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은 생물학적 의약품의 기술 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도에 관한 것이다.
교모세포종은 뇌 신경 교종 중에서 가장 악성인 신경 교종이다. 교모세포종 (Glioblastomas)은 대뇌 피질 아래에서 자라며 거의 대뇌 피질 대뇌 반구 전역에서 발견된다. 침윤성 성장을 통해 교모세포종은 대개 수개의 엽(또는 로브(lobe))을 침범하고 깊은 구조를 침범하고, 뇌들보(또는 뇌량, corpus callosum)를 통해 반대편 대뇌 반구에 퍼진다. 교모세포종은 주로 전두엽에서 발견되며, 다음으로 측두엽과 두정엽, 및 드물게 후두엽 / 시상, 기저핵 등에 발견된다.
교모세포종은 빨리 자라며, 경과가 짧다. 환자의 70-80 %는 3-6 개월의 질병 경과를 경험하고, 단 10 %만이 1 년 이상의 질병 경과를 경험한다. 드문 경우에 교모세포종 출혈은 뇌졸중 유사 발작(stroke-like episode)을 일으킨다. 신경 교모세포종(Glioblastomas)은 급속히 성장하여, 광범위한 뇌부종 및 명백한 두개 내 고혈압의 증상이 나타난다. 거의 모든 환자는 두통, 구토, 두통이 동반된 유두부종, 정신 상태의 변화, 사지의 약화, 의식 장애 및 언어 장애로 고통받는다. 교모세포종은 뇌 조직에 침윤성 손상을 일으켜, 일련의 병소 증상을 일으키며, 교모세포종 환자는 편측 마비, 편측이상감각, 실어증, 반맹증 등 다른 정도의 고통을 겪는다. 편측마비, 뇌 신경 병변, 편측이상감각, 및 반맹증은 신경학적 검사를 통하여 확인할 수 있다. 환자의 약 33 %가 간질 발작을 앓고 있으며, 약 20 %는 아파씨증, 치매 및 정신박약 등과 같은 정신과적 증상이 나타난다.
교모세포종은 두 종류로 분류할 수 있는데, 즉 보다 저등급 신경 교종에서 진행된 2차성 교모세포종과 저등급 전암성 병변을 나타내지 않는 1차성 교모세포종으로 분류할 수 있다.
1차성 교모세포종은 처음 진단될 때 IV-급 교모세포종이며, 가장 분명한 분자적 특징은 EGFR 증폭, 돌연변이 또는 과발현 (40 %), P53 돌연변이 (30 %), CDKN2A/B 결실 (30-40 %), RB1 돌연변이 또는 결실, 염색체 10의 상실 (70 %), PTEN 돌연변이 (30 %) 등을 포함한다.
대조적으로, 2차성 교모세포종은 보다 저-등급 뇌 신경 교종 (II 등급 또는 III 등급)부터 진행되는 IV-등급 신경 교종이다. 첫번째 임상 진단에서 저등급으로 발견된, 신경 교종은 수술이나 화학방사선요법 후에 다시 성장하여 IV-급 신경 교종으로 발전한다. 연구에 따르면 2차성 교모세포종의 분자 마커와 유전자 세포 경로가 1차성 교모세포종과는 다르다는 사실을 규명하였다. 이소구연산염 탈수소효소 (IDH)의 돌연변이는 2차성 교모세포종에서만 발견되었지만, 모든 2차성 교모세포종이 IDH 돌연변이를 갖는 것은 아니다. 현재 2차성 교모세포종의 분자 마커에 대한 연구는 IDH 1 돌연변이 (70 %), P53 돌연변이 (65 %), PDGFA와 PDGFRA 의 과발현 (60 %), 염색체 19의 긴 사슬의 결실 (50 %), RB1의 돌연변이 또는 결실 (25 %)에 초점을 두고 있다. 이러한 분자 마커의 발견은 교모세포종의 표적 치료를 위한 중요한 목표를 제공한다. 이러한 분자 마커를 표적하는 많은 표적 의약품이 있으나, 이 표적 의약품은 다양한 원인으로 임상 적용을 통과하지 못한다. 근본적인 원인은 일반적으로 표적 연계의 특이성이 낮아 치료 효과가 낮고 약의 부작용이 크다는 것이다. 이에, 이러한 표적 의약품은 임상 적용에 적합하지 않다.
따라서, 현재 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종에 대한, 보다 높은 표적 특이성을 가지고 정확한 치료를 할 수 있는 의약품이 요구된다.
간세포 성장 인자 수용체 (HGFR, c-Met라고도 함)는 met 유전자에 의해 코딩되고 수용체 티로신 키나아제 패밀리에 속한다. HGFR이 이의 리간드 간세포 성장 인자와 결합하면, HGFR의 세포내 도메인이 자동적으로 인산화되어 하류 신호 전달 경로를 활성화시켜, 세포 증식, 형태발생 및 운동성을 조절한다. 각각의 다른 종양에서 많은 c-Met 이상이 대부분 나타나는 것으로, 규명되었다. 또한, PTPRZ1 유전자 (수용체 단백질 티로신 키나아제 패밀리에 속함, RPRPB라고도 불림)에 의해 코딩된 포스파타제(인산가수분해효소)가 met 신호 전달 경로를 비활성화시키기 위해 c-Met으로부터 특정 인산화 부위를 제거할 수 있는 것으로 연구 결과 규명되었다. 따라서 이 단백질이 c-Met와 특정한 결합 관계를 가지고 있으며, 질병 발생 및 발달에 있어서 c-Met의 역할에 영향을 줄 수 있다고 결론지을 수 있다.
상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 높은 표적 특이성을 가지며 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종의 개인에 맞추어지고 정확한 치료를 달성할 수 있는 약물을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 많은 양의 연구를 통하여, 여타 c-Met 저해제와 비교하여, c-Met 저해제로서, 식 A로 표시되는 화합물은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종을 저해하는 것에 보다 현저한 효과를 갖는다는 것을 규명하였다. 특히, 상기 화합물은 특이적 융합 단백질을 발현시키고 이에 보다 예후가 좋지 않은, 교모세포종의 아형을 저해하는 것에 보다 현저한 효과를 가진다.
따라서, 본 발명은 다음의 기술적 해결책을 제공한다:
본 발명은 뇌 신경 교종 치료용 약물의 제조에서 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공한다.
식 A
식 A로 표시되는 화합물은 중국 특허 출원 공보 CN103122000A의 실시예 44에 개시된 바와 같은 단계 및 반응식에 의해 합성될 수 있다.
바람직하게는, 상기 뇌 신경 교종은 교모세포종(glioblastoma)이다.
보다 바람직하게, 뇌 신경 교종은 2차성 교모세포종이다.
연구에 따르면, 한편으로는, 특정 융합 단백질이 이차 교모세포종에서 발현될 수 있음이 밝혀졌다. 융합 단백질은 c-Met의 아미노산 서열의 대부분을 포함하고, c-Met의 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 PTPRZ1의 아미노산 서열의 일부를 포함한다. 식 A로 표시되는 화합물은 융합 단백질을 발현하는 아교형 교모세포종의 증식 및 종양 형성을 억제하는 효과가 보다 우수하다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명은 2차성 교모세포종의 치료용 약물의 제조에 있어서 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공하고, 여기서 상기 2차성 교모세포종은 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이고, 상기 융합 단백질(또한 본원에서 "ZM"이라 불림)은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 번역된 단백질 부분을, c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 번역된 단백질 부분에 융합하는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 단백질 부분은 c-Met의 단백질 부분의 N-말단에 위치한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 이의 N-말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 융합 단백질은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에 따르면, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 나타낸 바와 같다. 본원에서 서열 번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 융합 단백질을 "ZM1-2"라 명명하고; 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM2-2"로 명명되고; 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM3-2"로 명명되고; 및 서열 번호 6로 표시되는 아미노산 서열의 융합 단백질은 "ZM8-2"로 명명된다.
상기 과제의 해결 수단에 기초하여, 교모세포종 세포에서 본 발명의 상술된 융합 단백질의 발현은 면역블로팅을 통해 항체와 검출될 수 있다. 검출하고자 하는 단백질의 아미노산 서열이 알려져있는 경우, 단백질에 대한 항체 (예를 들면, 모노클로날 항체 또는 멀티 클로날 항체)를 사용하여 면역블로팅에 의해 특정 조직 또는 세포에서 단백질의 발현을 검출한다 이는 당 업계의 통상적인 기술이다. 검출은 융합 단백질의 단편 또는 전체 융합 단백질에 대해 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 실시 양태에 따라, 인간 c-Met 단백질에 대한 항체를 사용하여 상기 언급된 융합 단백질의 발현을 검출할 수 있다. 실제로, 임의의 상기 융합 단백질이 교모세포종 세포에서 발현되는지의 여부에 기초하여, 교모세포종은 아형화될 수 있고, 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물로 치료될 수 있다.
한편, 2차성 교모세포종은 특정 융합 전사물(체)을 포함할 수 있으며, 이 융합 전사물은 c-Met-코딩하는 RNA의 대부분과 이 c-Met-코딩 RNA 부분의 5'말단에 융합된 PTPRZ1-코딩 RNA의 일부를 포함한다. 식 A로 표시되는 화합물은 상기 융합 전사물(체)을 함유하는 교모세포종 아종의 증식 및 종양 형성을 억제하는데 있어서, 보다 우수한 효과를 갖는다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명은 2차성 교모세포종의 치료용 약물의 제조에서의 식 A로 표시되는 화합물의 용도를 제공하고, 여기서, 상기 2차성 교모세포종은 융합 전사물을 포함하는 2차성 교모세포종의 아종이고, 상기 융합 전사물은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3, 또는 엑손 1 내지 8로부터 전사된 RNA 부분과 c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 전사된 RNA 부분을 연결시키는 것으로부터 형성되고, 여기서 상기 PTPRZ1의 RNA 부분은 상기 c-Met의 RNA 부분의 5'말단에 위치된다.
바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 추가로 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열 및 그 5 '말단에 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다.
가장 바람직하게는, 상기 융합 전사물은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에 따르면, 융합 전사물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열로 구성된다.
이와 유사하게, 상기 과제의 해결 수단에 기초하여, 교모세포종 세포에서 본 발명의 상술된 융합 단백질의 발현은 또한 상기 서술된 융합 전사물, 즉 이의 RNA 코딩 서열에서 검출될 수 있다. 검출될 단백질의 아미노산 서열이 알려져 있을 때, RNA 코딩 서열을 검출하는 것은 또한 당 업계의 통상적인 기술에 속하며, 융합 단백질 단편 또는 전체 융합 단백질에 대해 검출이 수행될 수 있다. 예를 들어, 총 RNA를 추출하여 주형으로 사용할 수 있고, 또는 총 RNA를 주형으로 사용되는 cDNA로 역전사시킬 수 있다. 특정 프라이머가 PCR 증폭을 수행하는데 사용된다. 실제로 융합 전사물이 교모세포종 세포에 존재하는지 여부에 기초하여, 교모세포종을 아형화할 수 있고, 이에 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물로 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 각각 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 또는 서열 번호 10으로 나타낸 융합 단백질 ZM1-2, ZM2-2, ZM3-2 또는 ZM8-2의 cDNA 서열을 제공한다.
본 발명에 의해 제공된 과제의 해결 수단에 기초하여, 식 A로 표시되는 화합물은 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종을 치료하기 위해 임상적으로 사용될 수 있으며, 이를 필요로하는 대상에 식 A로 표시되는 화합물 또는 식 A로 표시되는 화합물을 함유하는 임의의 약학적 조성물의 유효량으로 투여될 수 있는 것을 포함하고, 복용량 및 투여 경로는 개인 건강 상태, 질환의 증상 및 중증도 등에 따라 다르며, 특정 상황에서 의사에 의해 판단될 필요가 있다.
구체적으로는, 정밀한 치료 계획이 필요한 경우에는, 치료된 대상의 교모세포종 샘플과 같은, 종양 샘플을 임상적으로 먼저 검출할 수 있고, 예를 들어, 상술된 융합 단백질이 발현되는지 여부 또는 상술된 융합 전사물이 상기 교모세포종 샘플에 함유되어 있는지 여부를 검출, 및/또는 상기 샘플에 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 전사물의 함량을 검출할 수 있다. 치료될 대상의 샘플이 상기 언급된 융합 단백질 또는 융합 전사물을 함유하는 경우, 또는 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 전사물의 함량이 정상의 대상의 것 또는 임의의 여타 관련 샘플 보다 높은 경우, 식 A로 표시되는 화합물 또는 이 화합물을 함유하는 약학적 조성물이 투여될 수 있다. 이러한 상황에서, 샘플에 융합 단백질 또는 융합 전사물의 존재 또는 함량은 통상적인 기술, 예를 들어, 상기 언급된 면역블로팅 및 PCR을 사용하여 검출될 수 있다.
임상 연구에 의하면, 본 발명에서 언급한 융합 단백질을 발현하거나, 또는 본 발명에서 언급한 융합 전사물을 함유하는 교모세포종은 예후가 좋지 않고, 이러한 환자의 생존 시간은 상기 융합 단백질 또는 융합 전사물을 갖지 않는 환자의 생존 시간에 비하여 명백히 짧다 (127일 VS 248일). 이러한 교모세포종을 가진 환자의 경우, 본 발명에 의해 제공된 식 A로 표시되는 화합물은 다른 유사한 약물과 비교하여 특별한 치료 이점을 갖는다.
또한, 뇌 신경 교종, 특히 교모세포종에 대한 치료 동안, 식 A로 표시되는 화합물은 다른 치료 또는 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 특정 시간 간격으로 사용될 수 있다. 복용량 및 투여 경로는 개개인의 건강 상태, 질환의 증상 및 중증도에 따라 다르며, 특정 상황에 따라 의사가 판단할 필요가 있다.
종래 기술과 비교하여, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 갖는다:
교모세포종 세포주의 인비보 종양형성 및 인비트로 증식에 대한 식 A로 표시되는 화합물의 실험을 통하여, 본 발명은 처음으로 상기 식 A로 표시되는 화합물이, 여타 c-Met와 비교하여, 보다 현저하게 교모세포종의 발달을 억제하는 것을 입증하였다. 구체적으로 말하자면, 실험은, 유사 구조의 c-Met 억제제와 비교하여, 식 A로 표시되는 화합물은 동물에서 종양 형성과 세포 생존률에 대한 보다 강력한 억제 효과를 가진다는 것을 입증한다. 세포 질험 및 인비보 실험 둘 모두의 결과는 식 A로 표시되는 화합물의 교모세포종에 대한 억제 효과가 크리조티닙과 가깝거나, 또는 보다 높다는 것을 입증한다. 특히, 크리조티닙의 분자량은 식 A로 표시되는 화합물의 분자량 보다 크므로, 크리조티닙이 혈액 뇌 장벽을 통과하는 것이 보다 어렵고, 크리조티닙은 교모세포종에 거의 도달할 수 없고, 역할 수행이 제한적이다. 게다가, 크리조티닙은 이중 표적(타깃) 약물이다. 연구에 따르면, 크리조티닙은 ALK를 억제함과 동시에 c-Met를 억제하고, 이에 상대적으로 큰 부작용을 가지는 것으로 확인된다. 비교하자면, 식 A로 표시되는 화합물은 오직 c-Met만을 표적하고, 이에 부작용은 보다 적다.
특히, 실험은, 식 A로 표시되는 화합물이 특정 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종을 억제하는 효과가 보다 현저하다는 것을 입증하고, 그 효과는 유사 화합물 또는 공지된 치료 약의 효과를 훨씬 상회하는 것임을 입증한다. 융합 단백질이 발현되는지 여부 또는 언급된 융합 전사물이 교모세포종에 존재하는지 여부를 검출함으로써, 상기 융합 단백질을 발현하거나, 또는 상기 융합 전사물을 함유하는 교모세포종의 아형을 다른 교모세포종과 구별할 수 있고, 식 A로 표시되는 화합물을 사용하여 효과적인 치료를 할 수 있고, 이로부터 교모세포종 환자에 대한 개인적이고 정밀한 치료를 구현하고, 이러한 특정 유형의 교모세포종에 의해 야기되는 예후가 좋지 않은 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 동싱에, 식 A로 표시되는 화합물의 작용 메카니즘에 기초하여, 부작용을 피할 수 있고, 환자의 고통을 경감시킬 수 있으며, 이 약물로의 치료를 보다 안전하고 보다 효과적으로 만들 수 있다. 마지막으로, 질환 치료 및 예후의 비용 이점이 향상된다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 의해 제공되는 서열 번호 3으로 표시되는 융합 단백질 (ZM1-2) 및 서열 번호 4로 표시되는 융합 단백질 (ZM2-2)의 cDNA 서열 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 구조를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에서 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 면역블로팅 결과를 나타내고, 여기서 레인 1은 융합 단백질 ZM8-2이고, 레인 2는 융합 단백질 ZM2-2이고, 레인 3 및 4는 각각 레퍼런스이다.
도 4는 렌트 바이러스 벡터 PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro의 구조적 표현이며, 여기서 융합 단백질을 코딩하는 서열에 대한 삽입 위치가 도시된다.
도 5는 실시예 5에서의 인비보 종양 성장 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 5에서 마우스 생존 실험의 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 5의 교모세포종의 인비보 종양 형성 실험의 뇌 자기 공명 영상 결과로서, 여기서 패널 7A는 모델링에 의해 얻어진 벡터 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7B는 모델링에 의해 얻어진 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7C는 식 A로 표시되는 화합물을 처음 투여한 후, 16 일째의 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7D는 식 A로 표시되는 화합물이 처음 투여된 후, 16 일째에 화합물 투여를 중지한 이래로 10일경 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌이미지를 나타낸다.
도 1은 본 발명에 의해 제공되는 서열 번호 3으로 표시되는 융합 단백질 (ZM1-2) 및 서열 번호 4로 표시되는 융합 단백질 (ZM2-2)의 cDNA 서열 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 구조를 나타낸다.
도 3은 실시예 3에서 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질의 면역블로팅 결과를 나타내고, 여기서 레인 1은 융합 단백질 ZM8-2이고, 레인 2는 융합 단백질 ZM2-2이고, 레인 3 및 4는 각각 레퍼런스이다.
도 4는 렌트 바이러스 벡터 PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro의 구조적 표현이며, 여기서 융합 단백질을 코딩하는 서열에 대한 삽입 위치가 도시된다.
도 5는 실시예 5에서의 인비보 종양 성장 억제 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 5에서 마우스 생존 실험의 결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 5의 교모세포종의 인비보 종양 형성 실험의 뇌 자기 공명 영상 결과로서, 여기서 패널 7A는 모델링에 의해 얻어진 벡터 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7B는 모델링에 의해 얻어진 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7C는 식 A로 표시되는 화합물을 처음 투여한 후, 16 일째의 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌 이미지를 나타내고, 패널 7D는 식 A로 표시되는 화합물이 처음 투여된 후, 16 일째에 화합물 투여를 중지한 이래로 10일경 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌이미지를 나타낸다.
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명한다. 당업자는 이들 실시예가 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하는 것은 아니고, 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용된 것임을 이해할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 다음 실시예의 방법은 일반적인 방법이다. 하기 실시예에서 사용된 원료 약물 재료 및 시약 재료 등 모두는 달리 명시하지 않는 한 시판되는 제품이다.
실시예 1 : 교모세포종의 RNA 및 cDNA 획득.
80 개의 교모세포종 샘플은 의료 윤리위원회(Medical Ethics Committee)의 기준에 부합하는 수술을 통해 수집되었다. 각 샘플은 샘플을 기증한 환자와 이 환자의 의사로부터 서면 동의를 얻어 수집하였다. 샘플의 성별, 나이 및 질병 유형을 표 1에 나타내었다.
Case No. | 성별 | 나이 | 교모세포종 유형 |
Case No. | 성별 | 나이 | 교모세포종 유형 |
|
1 | M | 44 | Primary | 41 | F | 55 | Primary | |
2 | F | 59 | Primary | 42 | M | 38 | Primary | |
3 | F | 56 | Primary | 43 | M | 54 | Primary | |
4 | F | 48 | Primary | 44 | F | 60 | Primary | |
5 | M | 64 | Primary | 45 | F | 37 | Primary | |
6 | M | 66 | Primary | 46 | F | 59 | Primary | |
7 | M | 59 | Primary | 47 | M | 54 | Primary | |
8 | F | 62 | Primary | 48 | M | 52 | Primary | |
9 | M | 42 | Primary | 49 | M | 46 | Primary | |
10 | M | 81 | Primary | 50 | M | 56 | Primary | |
11 | M | 60 | Primary | 51 | M | 60 | Primary | |
12 | M | 29 | Primary | 52 | F | 63 | Primary | |
13 | M | 26 | Primary | 53 | M | 44 | Primary | |
14 | M | 47 | Primary | 54 | F | 25 | Primary | |
15 | M | 42 | Primary | 55 | M | 42 | Primary | |
16 | F | 43 | Primary | 56 | M | 51 | Primary | |
17 | F | 40 | Primary | 57 | M | 45 | Primary | |
18 | M | 27 | Primary | 58 | F | 50 | Primary | |
19 | M | 42 | Primary | 59 | M | 61 | Primary | |
20 | F | 37 | Primary | 60 | M | 33 | Secondary | |
21 | M | 45 | Primary | 61 | M | 8 | Secondary | |
22 | M | 54 | Primary | 62 | M | 42 | Secondary | |
23 | F | 47 | Primary | 63 | M | 29 | Secondary | |
24 | M | 33 | Primary | 64 | M | 29 | Secondary | |
25 | M | 63 | Primary | 65 | F | 40 | Secondary | |
26 | M | 34 | Primary | 66 | M | 44 | Secondary | |
27 | M | 18 | Primary | 67 | M | 33 | Secondary | |
28 | M | 33 | Primary | 68 | M | 27 | Secondary | |
29 | M | 30 | Primary | 69 | F | 37 | Secondary | |
30 | M | 49 | Primary | 70 | F | 56 | Secondary | |
31 | M | 43 | Primary | 71 | F | 31 | Secondary | |
32 | F | 28 | Primary | 72 | M | 45 | Secondary | |
33 | M | 42 | Primary | 73 | F | 34 | Secondary | |
34 | F | 62 | Primary | 74 | M | 54 | Secondary | |
35 | M | 48 | Primary | 75 | M | 46 | Secondary | |
36 | F | 51 | Primary | 76 | M | 18 | Secondary | |
37 | F | 40 | Primary | 77 | M | 38 | Secondary | |
38 | F | 24 | Primary | 78 | M | 48 | Secondary | |
39 | F | 49 | Primary | 79 | M | 53 | Secondary | |
40 | M | 51 | Primary | 80 | M | 51 | Secondary |
RNA 추출 키트 (Qiagen으로부터 구입)를 사용하여 이의 지침에 따라 각 교모세포종 샘플의 총 mRNA를 추출하였다. 분석기를 이용하여 총 mRNA의 무결성을 확인하였고, 각 샘플의 총 mRNA의 RIN (RNA Integrity Number)이 7.0 보다 큰 것을 확인하였다.
역전사 키트 (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, K1622, 인비트로겐에서 구입)를 사용하여 이의 지시에 따라 주형인 각 샘플로부터의 총 mRNA를 취하는 것으로부터 20㎕ 반응계에서 역전사를 수행하여, 각 샘플에 대한 이중-가닥 cDNA를 합성하였다.
실시예 2 : 교모세포종에서의 본 발명에 따른 융합 단백질의 검출
실시예 1에서 제조된 각 샘플의 이중-가닥 cDNA를 주형으로 취하여 하기 프라이머 서열을 사용하여 증폭시켰다 :
정방향 프라이머 :
서열 번호 11 ATGCGAATCCTAAAGCGTTTCCTCG
역방향 프라이머 :
서열 번호 12 CTATGATGTCTCCCAGAAGGAGGCT
20 μl 증폭 시스템은 다음을 포함한다 : 10 μM 정방향 프라이머, 1 μl; 10 μM 역방향 프라이머, 1 μl; 100 ng 주형; 2X Phusion Master Mix (NEB, 제품 번호 M0531), 10 μl; 및 핵산 분해 효소가 없는(nuclease-free) 물, 최대 20 μl.
PCR 프로그램 설정은 다음을 포함한다 : 98 ℃ 30 초; 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1.5 분, 총 30 사이클; 72 ℃ 5 분; 12 ℃에서 유지.
PCR 생성물을 1 % 아가로즈 겔 전기 영동으로 분석하고, 생성된 밴드를 DNA 겔 회수 키트 (QIAquick PCR 정제 키트, Qiagen으로부터 구입)로 회수 한 후, T 벡터 (pGEM-T 이지 벡터, Promega로부터 구입)에 클로닝하고, DNA sequencer (ABI Prism 3730×l DNA sequencer, Applied Biosystems에서 구입)로 서열을 결정하였다.
시퀀싱 결과는 증폭을 통해 두 개의 상이한 뉴클레오티드 서열이 얻어짐을 보였다. 그들은 66 개의 상이한 뉴클레오티드를 가지며, 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 의해 나타난 바와 같다. 뉴클레오티드 서열의 시퀀싱 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 융합 단백질 ZM3-2 및 융합 단백질 ZM8-2의 게놈 DNA 서열은 특정 샘플의 전체 게놈 DNA를 시퀀싱함으로써 발견되었다.
샘플 출처에 기초하여, 표 1에 열거된 60번 샘플, 64번 샘플, 77번 샘플, 78번 샘플 및 80번 샘플은 상응하는 융합 단백질의 cDNA 또는 게놈 DNA를 갖는 것으로 규명되었다: 융합 단백질 ZM1-2가 60번 샘플에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM2-2가 64번 샘플과 78번 샘플 모두에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM3-2가 77번 단백질에서 발견되었고, 융합 단백질 ZM8-2가 80번 샘플에서 발견되었다. 결과에 따르면 본 발명에 따른 융합 단백질 및 이의 코딩 RNA 또는 게놈 DNA가 일부 교모세포종에 특이적으로 존재하고, 다른 부분의 교모세포종에는 존재하지 않고, 거의 모든 것은 2차성 교모세포종에서 발견된다는 것을 보여준다.
따라서, 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3 (융합 단백질 ZM1-2), 서열 번호 4 (융합 단백질 ZM2-2), 서열 번호 5 (융합 단백질 ZM3- 2) 및 서열 번호 6 (융합 단백질 ZM8-2)로 표시되는 바와 같이 얻어진다. 서열 정렬을 통해, 이들 4 가지 융합 단백질은 모두 PTPRZ1 단백질의 일부를 N-말단에서 C-말단까지 거의 모든 c-Met 단백질에 융합시킴으로써 형성된다는 것을 발견하였다. 특히, 융합 단백질 ZM1-2는 PTPRZ1의 엑손 1을 c-Met의 엑손 2 내지 24 에 융합시켜 얻었으며, 융합 단백질 ZM2-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 2를 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 수득하였으며, 융합 단백질 ZM3-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 3을 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 수득하였고, 융합 단백질 ZM8-2는 PTPRZ1의 엑손 1 내지 8을 c-Met의 엑손 2 내지 24에 융합시킴으로써 얻어졌고; 및, 상기 4 개의 융합 단백질은 모두 c-Met의 프로모터 및 엑손 1(비-기능성 요소)에 상응하는 부분을 포함하지 않았다. 따라서, 융합 유전자는 PTPRZ1의 프로모터로 전사되는 것으로 추측된다. 이 4 개의 융합 유전자의 구조적 표현을 도 2에 나타내었다.
게다가, 임상 연구에 따르면, 본 발명에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 가지는 교모세포종의 경우의 중앙값 생존은 127 일이었고, 보고된 교모세포종 경우 (248 일)의 중앙값 생존 보다 짧다. 따라서, 2차성 교모세포종 중에서, 본 발명에서 기술된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 아종은 보다 좋지 않은 예후를 가지는 것으로 판명되었다.
실시예 3 : 교모세포종에서의 융합 단백질의 면역블로팅 검증
실시예 1에서 수집 된 80 개의 교모세포종 샘플의 총 단백질을 융합 단백질의 면역블로팅 검증에 적용하였다.
면역블로팅 검증에 사용된 항체는 인간 c-Met 단백질에 대한 항체였다 (래빗 항체, Abcam으로부터 구입, 제품 번호 : ab51067). 비-융합 인간 c-Met 단백질의 분자량은 145 kDa 인 반면, 융합 단백질의 분자량은 더 크다. 면역블로팅 조작은 항체의 지시 및 면역블로팅 키트의 지시에 따라 수행하였다.
면역블로팅 결과는 얻어진 면역블로팅 밴드가 실시예 2의 결과와 일치한다는 것을 보여주었다 : 표 1에 열거된 샘플 중 60번, 64번, 77번, 78번 및 80번 샘플에서 면역블로팅 밴드가 발견되었다 (모두 2차성 교모세포종 샘플이었다). 도 3은 ZM8-2 및 ZM2-2의 면역블로팅 결과로서, 대략적으로 오버랩된 면역블로팅 밴드에 의하여 나타난 바와 같이, ZM8-2의 분자량은 약 190 kDa이고, ZM2-2의 분자량은 비-융합 인간 c-Met 단백질의 분자량에 가깝다는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명에서 기술된 바와 같은 융합 단백질은 교모세포종의 일부에서 특이적으로 발현되고, 교모세포종의 다른 부분에서는 특이적으로 발현되지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 교모세포종은 상기 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 하위 유형(아종)과 융합 단백질을 발현하지 않는 교모세포종의 하위 유형으로 분류될 수 있다.
실시예 4 : 교모세포종 세포 증식에 대한 식 A로 표시되는 화합물의 억제 활성 측정
교모세포종 세포 증식 억제 활성 시험의 실험은, 식 A로 표시되는 화합물과 크리조티닙뿐만 아니라, 각각 식 A의 구조와 유사한 구조를 갖는 식 B 내지 H로 표시되는 화합물을 사용하여 수행하였다.
식 A-H로 표시되는 화합물은 중국 특허 공개 CN103122000A에 개시된 단계 및 반응식에 따라 합성되었다.
식 A (CN103122000A 실시예 44)
식 B (CN103122000A 실시예 28)
식 C (CN103122000A 실시예 29)
식 D (CN103122000A 실시예 37)
식 E (CN103122000A 실시예 38)
식 F (CN103122000A 실시예 46)
식 G (CN103122000A 실시예 47)
식 H (CN103122000A 실시예 49)
크리조티닙 (CRIZOTINIB; PF-02341066) : 제품 번호 S1068, Selleck, USA로부터 구입함.
우선, 렌티 바이러스 벡터 PCDH (PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, SBI, 제품 번호 : CD510B-1,도 4에 나타낸 구조)를 사용하였고, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8로 표시되는 뉴클리오티드 서열을 이의 지시에 따라 상기 벡터에 클로닝하였고, 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 제조하였다. 상기 발현 벡터는 각각 "PCDH-ZM1-2" 및 "PCDH-ZM2-2"로 명명되고 표시되었다. 그 다음, 바이러스 패키징 플라스미드 (SBI, 제품 번호 LV500A-1)를 사용하여 293T 세포를 상기 벡터 중 하나와 공동 감염시켜 렌티 바이러스를 제조하였다. 동일한 방법으로 렌티 바이러스 벡터 PCDH를 패키징하고 293T 세포를 공동 감염시켜 블랭크 벡터를 갖는 렌티 바이러스를 제조하였고, 이 벡터는 "PCDH-blank"로 명명되었다.
본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질 중 어느 하나도 발현하지 않는, 인간 신경 교종 세포주 U87은 중국 과학원 세포 은행 (China Bank of Medical Sciences)에서 구입하였다. U87 세포를 상기 제조된 임의의 렌티 바이러스에 감염시키고, 융합 단백질을 안정하게 발현하는 세포 모델을 확립하기 위해 퓨로마이신 (스크리닝을 위해 0.5 ㎍/mL 및 유지를 위해 0.2 ㎍/mL)을 적용하여 스크리닝 하였다. 세포 모델은 면역블로팅 및 역전사 PCR에 의해 융합 유전자의 전사와 융합 단백질의 발현에 대하여 검증되었고, 각각 융합 단백질 ZM1-2 및 ZM2-2를 안정적으로 발현하는 세포주를 최종적으로 수득하고 "PCDH-ZM1-2 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"로 명명하였다. 유사하게, U87 세포를 블랭크 레퍼런스로서 블랭크 벡터를 갖는 렌티바이러스 PCDH-블랭크로 감염시켜 "PCDH-블랭크 발현 세포"를 수득하였다.
대형 접시에서 배양되고 대수 단계의 이 U87 세포를 멸균 PBS로 1회 세척한 다음, 0.25 % 트립신으로 2분 동안 분해시켰다. 모든 세포를 분리하기 위해 소화시킨 후, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 완전한 DMEM 배지를 사용하여 소화를 중단하였다. 세포를 계수하고, 세포 농도를 20,000 세포/ml로 맞추어 주었다. 이어서, 다중-채널 피펫을 사용하여 코닝 (Corning) 96-웰 플레이트 (2,000 세포/웰)에 세포를 접종하고, 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 시험될 화합물 (크리조티닙 및 식 A 내지 H로 표시되는 화합물)을 각각 DMSO에 용해시켜 스톡 용액을 제조한 후, 스톡 용액 및 완전한 배지를 사용하여 상이한 농도의 약물 (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 μM)을 갖는 용액을 제조하였다. 이 세포를 배양기(인큐베이터)에서 추가로 72 시간 동안 배양한 다음, 20 ㎕의 3-(4,5-디메틸티아졸-2)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 (MTT)를 각 웰에 첨가하였다. 인큐베이터에서 1 내지 3 시간 후, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 농도에 해당하는 억제율을 계산하고, GraphPad 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
세포 모델 | U87 초기 세포 |
블랭크 레퍼런스 |
PCDH-ZMI-2 발현 세포 |
PCDH-ZM2-2 발현 세포 |
|
세포에 시험된 화합물의 저해 활성 (IC50, μM) |
크리조티닙 | 2.99 | 3.27 | 8.26 | 9.76 |
식 A | 3.51 | 2.85 | 1.34 | 1.83 | |
식 B | 8.15 | 6.02 | 7.63 | 5.59 | |
식 C | 4.78 | 5.79 | 9.45 | 12.76 | |
식 D | 5.56 | 4.93 | 5.22 | 7.21 | |
식 E | 17.25 | 21.64 | 32.64 | 21.88 | |
식 F | 64.37 | 58.82 | 90.33 | 125.29 | |
식 G | 9.07 | 9.25 | 6.75 | 15.25 | |
식 H | 25.38 | 19.35 | 23.31 | 45.12 |
표 2로부터, 인간 신경 교종 세포주 U87 그 자체 및 블랭크 레퍼런스 세포주 U87에서, 유사한 구조를 갖는 식 F 내지 G로 표시되는 화합물과 비교하여, 식 A로 표시되는 화합물이 더욱 현저하게 세포 생존력을 억제하는 강력한 효과를 나타내며, 크리조티닙과 유사하거나, 훨씬 높은 증식 억제 효과를 달성하는 것을 알 수 있다.
또한, 실험 동안, 융합 단백질 ZM1-2 및 ZM2-2의 발현을 갖는 교모세포종이 명백히 빠르게 증식 함이 밝혀졌다. 세포 중, 식 A로 표시되는 화합물에 의해서만 세포 생존이 억제 되었고, 식 B 내지 H로 표시되는 화합물 및 크리조티닙의 세포 생존에 대한 억제 효과는 식 Afh 표시되는 화합물의 효과 대비 명백히 열등하였다.
실시예 5 : 식 A로 표시되는 화합물의 교모세포종의 인비보 종양 형성의 억제 활성의 측정
교모세포종의 인비보 종양 형성을 억제하는 실험을 식 A로 나타낸 화합물 및 크리조티닙으로 수행하였다.
(1) 종양 성장 억제 실험
먼저, 종양-보유 마우스 모델이 확립되었다. 6 - 8 주령의 체중이 약 16 - 18 g인 BALB/c (nu/nu) 모계 누드 마우스를 Vital River에서 구입했다. 실시예 4에서 제조된 "PCDH-블랭크 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 각각 PBS로 107 세포/ml의 현탁액으로 제조하였다. 75% 에탄올로 멸균된 누드 마우스 우측 견갑골 부위에 상기 세포 현탁액 100 ㎕를 피하 주사하였고, 여기서 PCDH-블랭크 발현 세포는 7 마리의 누드 마우스에 주사되었고, PCDH-ZM2-2 발현 세포는 21 마리의 누드 마우스에 주사되었다. 피하 접종 후 약 2-3 일째, 고형 종양의 형성을 관찰하기 시작하여 약 15 일 후에 종양이 형성되는 것으로 밝혀졌다. 종양 크기와 마우스 체중의 변화를 일주일에 두번 측정했다. "PCDH-블랭크 발현 세포"를 주사하여 얻어진 종양-보유 마우스는 "벡터 마우스 (1)"로 명명되었고, "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 주사하여 얻어진 종양 보유 마우스를 "ZM2-2 마우스 (1)"로 명명하였다.
종양이 약 100 mm3로 부피로 자랄 때, ZM2-2 마우스 (1)는 평균 종양 크기에 따라 3 그룹으로 나누었고, 각 식 A로 표시되는 화합물이 투여된 7마리의 마우스의 그룹, 크리조티닙이 투여된 7마리의 마우스의 그룹, 및 7마리 마우스의 대조군 그룹이었다. 앞의 두 그룹은 식 A로 표시되는 화합물 10 mg/KG/일의 양으로 주어지거나 또는 50 mg/KG/일의 양으로 크리조티닙이 위관 영양법으로 주어졌다. 이 두가지 약물은 각각 정상 식염수로 현택액으로 제조되고, 연속 투여를 위해 연속적으로 교반하면서 1일 1회 투여되었다. 대조군은 정상 식염수로 위관 투여되었다. 종양 크기 및 마우스 체중의 변화는 일주일에 두번 측정되었다. 종양 직경은 버니어 캘리퍼스로 측정되었고, 종양 부피를 계산하기 위한 식은: 종양 부피 = 0.5*길이*너비2 이었다. 종양 크기의 변화를 도 5에 나타내엇다. 결과로부터, 식 A로 표시되는 화합물은 ZM2-2 마우스 (1)에서 종양의 성장을 현저히 억제하고, 이 억제 효과는 크리조티닙의 효과 보다 강력하였다.
(2) 마우스의 생존 실험
먼저, 종양-보유 마우스 모델이 확립되었다. 실시예 4에서 제조된 "PCDH-블랭크 발현 세포" 및 "PCDH-ZM2-2 발현 세포"를 각각 PBS로 105 세포/5㎕의 현탁액으로 제조하였다. 75 % 에탄올로 멸균된 누드 마우스에 100㎕의 세포 현탁액을 접종하였다. 세포 접종 위치 (전방 십자 인대의 우측에서 2mm, 후방으로 2mm)는 마우스용 뇌 고정기구를 사용하여 측정되었다; 주입 깊이는 3.5mm이었고 0.6mm 상승했다; 각 5㎕의 세포 용액을 각각의 마우스에 주사 하였다. 주사 후, 마우스를 1 분 동안 유지시킨 후, 일반적인 피부 봉입을 실시하였다. 두개 내 종양이 관찰된 후, "PCDH-블랭크 발현 세포"로 수득된 종양 보유 마우스를 "벡터 마우스 (2)"로 명명하고, "PCDH-ZM2-2 발현 세포"로 수득된 종양 보유 마우스를 "ZM2-2 마우스 (2)"로 명명했다.
마우스의 두뇌는 핵 자기 공명 영상을 통해 탐지되었다. 벡터 마우스 (2)의 두개 내 종양은 분명히 ZM2-2 마우스 (2)의 두개 내 종양보다 작다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이는 본 발명에 의해 제공된 융합 단백질의 발현은 마우스에서 교모세포종의 종양 형성을 명백하게 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 결과는 패널 7A 및 패널 7B에 각각 도시되어 있다.
8 마리의 벡터 마우스 (2) 및 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에 각각 식 A로 표시되는 화합물을 50 mg/KG 중량/일의 양으로 투여하였다. 화합물을 위관 영양법으로 하루 1 회 투여하였다. 동시에, 다른 그룹의 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에게 대조군으로서 생리 식염수를 투여했다. 실험은 6 주 이상 지속되었다. 결과는 정상 식염수만을 투여한 ZM2-2 마우스 (2)는 20 일 이후 점진적으로 사망하는 반면, 식 A로 표시되는 화합물을 투여한 벡터 마우스 (2)는 모두 살아남았고, 식 A는 로 표시되는 화합물의 투여가 명백하게 도 6에 도시된 바와 같이 ZM2-2 마우스 (2)의 생존 시간을 연장시켰다.
식 A로 표시되는 화합물을 투여 한 ZM2-2 마우스 (2)의 뇌를, 식 A로 표시되는 화합물을 처음 투여한 후 16 일째에 핵 자기 공명 영상으로 검출하였다. 두개 내 종양이 분명히 작아지는 것을 확인하였다. 패널 7C의 결과를 참조한다. 유사하게, 식 A로 표시되는 화합물은 ZM2-2 마우스에서 종양의 성장을 명백하게 억제할 수 있음이 증명된다.
또 다른 8 마리의 ZM2-2 마우스 (2)에게 식 A로 표시되는 화합물을 50mg/KG 중량/일의 양으로 투여하였다. 화합물을 위관 영양법으로 하루 1 회 투여하였다. 이어서, 화합물 투여를 1 차 투여 후 16 일째에 중지하고, 화합물 중단 후 10 일째에 핵 자기 공명 영상을 통해 뇌를 검출하였다. 종양이 빠른 성장을 재개했다는 것이 발견되었다. 결과는 패널 7D에 나타냈다.
상기 실험 결과에 따르면, 식 A로 표시되는 화합물은 본 발명에 의해 제공되는 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 성장을 현저하게 억제할 수 있고, 환자의 생존 기간을 연장시킨다는 것을 알 수 있고, 교모세포종은 상기 화합물의 중단 후 재발하기 쉽다는 것을 알 수 있다. 식 A로 표시되는 화합물의 종양 억제 효과는 크리조티닙의 종양 억제 효과보다 더 강하므로, 상기 화합물은 크리조티닙의 대안으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 경우의 생존 기간의 중앙값은 다른 보고된 교모세포종의 경우보다 짧아서, 교모세포종 중에서 융합 단백질을 발현하는 교모세포종의 경우는 예후가 좋지 않다. 예후가 좋지 않은 이러한 교모세포종 아종의 경우, 식 A로 표시되는 화합물은 c-Met 억제제로 사용 가능한 여타 화합물 및 크리조티닙과 비교하여 보다 우수한 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 실시예에 대한 상기 설명은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 당업자는 본 발명에 따른 다양한 변경 및 변형을 할 수 있고, 이는 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고, 본 발명의 보호 범위에 있다.
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Glioma
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<210> 1
<211> 1394
<212> PRT
<213> Common c-Met portion of fusion proteins ZM
<400> 1
Lys Pro Leu Ile Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Phe Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu
20 25 30
Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro
35 40 45
Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His
50 55 60
His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His
85 90 95
Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser
100 105 110
Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr
115 120 125
Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr
130 135 140
Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser
145 150 155 160
Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys
165 170 175
Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val
180 185 190
Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser
195 200 205
Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys
210 215 220
Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp
225 230 235 240
Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr
260 265 270
Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile
275 280 285
Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu
290 295 300
Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile
305 310 315 320
Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln
325 330 335
Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln
340 345 350
Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala
355 360 365
Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys
370 375 380
Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His
385 390 395 400
Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg
405 410 415
Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp
420 425 430
Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr
435 440 445
Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly
450 455 460
Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His
465 470 475 480
Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val
485 490 495
Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys
500 505 510
Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln
515 520 525
Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp
530 535 540
Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp
545 550 555 560
Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser
565 570 575
Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe
580 585 590
Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu
595 600 605
Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn
610 615 620
Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met
625 630 635 640
Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe
645 650 655
Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro
660 665 670
Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser
675 680 685
Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys
690 695 700
Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile
705 710 715 720
Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu
725 730 735
Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His
740 745 750
Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly
755 760 765
Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His
770 775 780
Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser
785 790 795 800
Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln
805 810 815
Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser
820 825 830
Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe
835 840 845
Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile
850 855 860
Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys
865 870 875 880
Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val
885 890 895
Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn
900 905 910
Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile
915 920 925
Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser
930 935 940
Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys
945 950 955 960
Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp
965 970 975
Ala Arg Val His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser
980 985 990
Val Ser Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg
995 1000 1005
Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser
1010 1015 1020
Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr
1025 1030 1035 1040
Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His
1045 1050 1055
Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His
1060 1065 1070
Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile
1075 1080 1085
Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn
1090 1095 1100
Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile Thr
1105 1110 1115 1120
Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys
1125 1130 1135
Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg
1140 1145 1150
Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp
1155 1160 1165
Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp
1170 1175 1180
Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala
1185 1190 1195 1200
Ser Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu
1205 1210 1215
Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp
1220 1225 1230
Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys
1235 1240 1245
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe
1250 1255 1260
Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu
1265 1270 1275 1280
Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile
1285 1290 1295
Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys
1300 1305 1310
Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala
1315 1320 1325
Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ala Ile
1330 1335 1340
Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr
1345 1350 1355 1360
Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu
1365 1370 1375
Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu
1380 1385 1390
Thr Ser
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Common PTPRZ1 portion of fusion proteins ZM
<400> 2
Met Arg Ile Leu Lys Arg Phe Leu Ala Cys Ile Gln Leu Leu Cys Val
1 5 10 15
Cys Arg Leu Asp
20
<210> 3
<211> 1414
<212> PRT
<213> Fusion protein ZM1-2
<400> 3
Met Arg Ile Leu Lys Arg Phe Leu Ala Cys Ile Gln Leu Leu Cys Val
1 5 10 15
Cys Arg Leu Asp Lys Pro Leu Ile Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala
20 25 30
Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly
35 40 45
Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys
50 55 60
Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile
65 70 75 80
Leu His Glu His His Ile Phe Leu Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val
85 90 95
Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro
100 105 110
Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys
115 120 125
Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu
130 135 140
Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val
145 150 155 160
Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala
165 170 175
Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu
180 185 190
Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val
195 200 205
Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr
210 215 220
Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val
225 230 235 240
Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln
245 250 255
Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys
260 265 270
Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val
275 280 285
Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg
290 295 300
Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu
305 310 315 320
Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu
325 330 335
Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln
340 345 350
Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly
355 360 365
Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser
370 375 380
Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys
385 390 395 400
Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro
405 410 415
Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly
420 425 430
Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu
435 440 445
Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr
450 455 460
Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly
465 470 475 480
Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro
485 490 495
Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro
500 505 510
Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val
515 520 525
Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys
530 535 540
Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val
545 550 555 560
Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu
565 570 575
Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val
580 585 590
Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys
595 600 605
Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys
610 615 620
Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu
625 630 635 640
Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys
645 650 655
His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro
675 680 685
Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn
690 695 700
Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr
705 710 715 720
Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro
725 730 735
Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu
740 745 750
Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val
755 760 765
Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile
770 775 780
Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val
785 790 795 800
Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His
805 810 815
Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln
820 825 830
Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp
835 840 845
Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val
850 855 860
Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn
865 870 875 880
Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly
885 890 895
Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His
900 905 910
Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn
915 920 925
Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu
930 935 940
Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala
945 950 955 960
Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe
965 970 975
Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu
980 985 990
Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val
995 1000 1005
Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser
1010 1015 1020
Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser
1025 1030 1035 1040
Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser
1045 1050 1055
Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln
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Ala Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe
1090 1095 1100
Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr
1105 1110 1115 1120
Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu
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Claims (15)
- 제1항에 있어서,
상기 교모세포종이 2차성 교모세포종인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,
2차성 교모세포종이 융합 단백질을 발현하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이며, 상기 융합 단백질은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 번역된 단백질 부분을, c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 번역된 단백질 부분에 융합하는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 단백질 부분은 c-Met의 단백질 부분의 N-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 이의 N-말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항 또는 4항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항 또는 4항에 있어서,
상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 표시된 바와 같은 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,
2차성 교모세포종이 융합 전사물(transcript)을 포함하는 2차성 교모세포종의 아종(sub-type)이며, 상기 융합 전사물은 PTPRZ1의 엑손 1, 엑손 1 내지 2, 엑손 1 내지 3 또는 엑손 1 내지 8로부터 전사된 RNA 부분과 c-Met의 엑손 2 내지 24로부터 전사된 RNA 부분을 연결시키는 것으로부터 형성되고, 여기서 PTPRZ1의 RNA 부분은 c-Met의 RNA 부분의 5'-말단에 위치되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 융합 전사물은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 융합 전사물은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열과, 이의 5 '말단에 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 융합 전사물은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 융합 전사물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 삭제
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