ES2870909T3 - Usos de un compuesto en la preparación de fármacos para el tratamiento del glioma cerebral - Google Patents

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Abstract

El compuesto representado por la fórmula A: **(Ver fórmula)** para uso en el tratamiento de un glioma cerebral.

Description

DESCRIPCIÓN
Usos de un compuesto en la preparación de fármacos para el tratamiento del glioma cerebral
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo técnico de los medicamentos biológicos. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto para uso en el tratamiento de gliomas cerebrales, en particular glioblastomas.
Antecedentes de la invención
Los glioblastomas son los gliomas más malignos entre los gliomas cerebrales. Los glioblastomas crecen debajo de la corteza cerebral, y se encuentran en casi en todo el hemisferio cerebral supratentorial. A través de un crecimiento infiltrativo, los glioblastomas habitualmente invaden varios lóbulos, invaden estructuras profundas y, a través del cuerpo calloso, se diseminan en el hemisferio cerebral del lado opuesto. Los glioblastomas se encuentran principalmente en el lóbulo frontal, seguido del lóbulo temporal y el lóbulo parietal, y en pocos casos se observan en el lóbulo occipital/tálamo, ganglios basales, etc.
Los glioblastomas crecen rápidamente y tienen cursos cortos. El 70-80% de los pacientes experimenta un curso de la enfermedad de 3-6 meses, y solo el 10% experimenta un curso de la enfermedad de un 1 año. En casos raros, un sangrado del glioblastoma causa episodios similares a los de un accidente cerebrovascular. Los glioblastomas crecen rápidamente, lo que da lugar a síntomas evidentes de edema cerebral extenso e hipertensión intracraneal evidente. Casi todos los pacientes padecen dolores de cabeza, vómitos, edema papilar acompañado de dolor de cabeza, cambios en el estado mental, debilidad de las extremidades, trastornos de la conciencia y trastornos del habla. Los glioblastomas conducen a daños infiltrativos en los tejidos cerebrales, provocando una serie de síntomas focales, y los pacientes con glioblastoma padecen hemiplejía, hemidisestesia, afasias, hemianopsia, etc., en diferentes grados. La hemiplejía, las lesiones de los nervios craneales, la hemidisestesia y la hemianopsia se pueden encontrar a través de un examen neurológico. Aproximadamente el 33% de los pacientes ha sufrido un ataque epiléptico y aproximadamente el 20% tiene síntomas psiquiátricos como apatía, demencia e hipofrenia y similares.
Los glioblastomas se pueden clasificar en dos tipos, a saber, glioblastomas secundarios que progresan desde gliomas de grado inferior y glioblastomas primarios que no presentan lesiones precancerosas de grado bajo.
Los glioblastomas primarios son glioblastomas de grado IV cuando se diagnostican por primera vez, y sus características moleculares más obvias incluyen amplificación, mutación o sobreexpresión del EGFR (40%), mutación de P53 (30%), deleción de CDKN2A/B (30-40%), mutación o deleción de RB1, pérdida del cromosoma 10 (70%), mutación de Pt EN (30%), etc.
Por el contrario, los glioblastomas secundarios son gliomas de grado IV que progresan a partir de gliomas cerebrales de grado inferior (grado II o grado III). Los gliomas, que se encuentran en un grado bajo en el primer diagnóstico clínico, vuelven a crecer después de la cirugía o la quimio y radioterapia y se convierten en gliomas de grado IV. Estudios han encontrado que los marcadores moleculares y las vías celulares genéticas de los glioblastomas secundarios son diferentes de los de los glioblastomas primarios. La mutación de la isocitrato deshidrogenasa (IDH) se encontró solo en los glioblastomas secundarios, pero no todos los glioblastomas secundarios tienen la mutación IDH. En la actualidad, los estudios sobre los marcadores moleculares de los glioblastomas secundarios se centran en la mutación de IDH 1 (70%), la mutación de P53 (65%), la sobreexpresión de PDGFA y PDGFRA (60%), la deleción del brazo largo del cromosoma 19 (50%) y la mutación o deleción de RB1 (25%). El descubrimiento de esos marcadores moleculares proporciona dianas importantes para el tratamiento dirigido de los glioblastomas. Existen muchos medicamentos dirigidos a dianas que se dirigen a esos marcadores moleculares, pero los medicamentos dirigidos no entran en una aplicación clínica por diversas causas. La causa fundamental es generalmente que una baja especificidad en relación con la diana da como resultado unos efectos de tratamiento deficientes y fuertes efectos secundarios de los medicamentos. Por lo tanto, esos medicamentos dirigidos no son adecuados para una aplicación clínica.
Por lo tanto, para los gliomas cerebrales, en particular los glioblastomas, en la actualidad se necesitan medicamentos que tengan una mayor especificidad hacia la diana y puedan realizar un tratamiento de precisión.
El receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGFR, también denominado c-Met), está codificado por el gen met y pertenece a la familia de receptores de la tirosina cinasa. Después de que HGFR se une con su ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos, el dominio intracelular de HGFR se fosforila automáticamente para activar la vía de señalización aguas abajo, ajustando de ese modo la proliferación celular, la morfogénesis y la motilidad. Se han encontrado muchas anomalías de c-Met, que suelen aparecer en diferentes tumores. Además, unos estudios han encontrado que la fosfatasa codificada por el gen PTPRZ1 (que pertenece a la familia de la proteína tirosina cinasa receptora, también denominada RPRPB) puede eliminar un sitio de fosforilación específico de c-Met para desactivar la vía de señalización de met. Por tanto, se puede concluir que la proteína puede tener una cierta relación de unión con c-Met y afectar a la función de c-Met en la aparición y el desarrollo de enfermedades.
El documento WO2014/032498 A1 describe inhibidores de c-Met altamente selectivos como agentes anticancerígenos.
El documento US2012/028984 A1 se refiere a un inhibidor de c-Met o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, útil en el tratamiento del cáncer mediado por la actividad de los receptores c-Met.
El documento WO2014/000713 A1 describe nuevos derivados de quinazolina fusionados como inhibidores de c-Met, su síntesis y usos para tratar trastornos mediados por c-Met.
El documento US2015/0037280 A1 se refiere a nuevos compuestos de pirazolona sustituida útiles para modular la actividad de la proteína tirosina cinasa y para modular actividades celulares tales como la proliferación, la diferenciación, la apoptosis, la migración y la invasión. La descripción comprende además composiciones de esos compuestos y métodos de uso de las composiciones en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos en mamíferos, especialmente humanos.
Hui-Min Chen et al.; FEBS Letters 2015, vol. 589, n° 13, 1437-1443 se ocupa de la expresión mejorada y la fosforilación de la oncoproteína Met mediante fusiones PTPRZ1 -MET específicas del glioma.
Zhao-Shi Bao et al.; Genome Research 2014, vol. 24, n° 11, 1765-1773 describen que la secuencia de ARN de 272 gliomas reveló un nuevo transcrito de la fusión PTPRZ1-Met recurrente en glioblastomas secundarios.
Compendio de la invención
Teniendo como objetivo los problemas anteriores, el objeto de la presente invención es proporcionar un medicamento que tenga una especificidad elevada hacia la diana y pueda lograr un tratamiento personalizado y preciso de los gliomas cerebrales, en particular los glioblastomas.
Basándose en una gran cantidad de investigaciones, los inventores de la presente invención han encontrado que, en comparación con otros inhibidores de c-Met, el compuesto representado por la fórmula A, como inhibidor de c-Met, tiene un efecto más evidente para inhibir los gliomas cerebrales, en particular los glioblastomas. En particular, el compuesto tiene un efecto más evidente para inhibir un subtipo de glioblastoma que expresa una proteína de fusión específica y, por lo tanto, da lugar a un pronóstico peor. En consecuencia, la presente invención proporciona las siguientes soluciones técnicas:
La presente invención proporciona el compuesto representado por la fórmula A para uso en el tratamiento de un glioma cerebral
Figure imgf000003_0001
El compuesto representado por la fórmula A se puede sintetizar mediante las etapas y el esquema descritos en el Ejemplo 44 del documento de publicación de la solicitud de patente china CN103122000A.
Preferiblemente, el glioma cerebral es un glioblastoma.
Más preferiblemente, el glioma cerebral es un glioblastoma secundario.
Los estudios han encontrado, por un lado, que una proteína de fusión específica se puede expresar en un glioblastoma secundario. La proteína de fusión comprende una gran parte de la secuencia de aminoácidos de c-Met y una parte de la secuencia de aminoácidos de PTPRZ1 fusionada con el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de c-Met. El compuesto representado por la fórmula A tiene un mejor efecto para inhibir la proliferación y la formación de tumores del subtipo de glioblastoma que expresa la proteína de fusión.
Por lo tanto, preferiblemente, la presente invención proporciona el compuesto representado por la fórmula A para uso en el tratamiento de un glioblastoma secundario, en donde el glioblastoma secundario es un subtipo de glioblastoma secundario que expresa una proteína de fusión, y la proteína de fusión (también denominada "ZM" en este documento) se forma por la fusión de una porción de proteína traducida a partir del exón 1, exones 1 a 2, exones 1 a 3 o exones 1 a 8 de PTPRZ1, con una porción de proteína traducida a partir de los exones 2 a 24 de c-Met, en donde la porción de proteína de PTPRZ1 está ubicada en el extremo N-terminal de la porción de proteína de c-Met.
Preferiblemente, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1.
Preferiblemente, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.
Más preferiblemente, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 en el extremo N-terminal de la misma.
Lo más preferiblemente, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
De acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión es como se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. En esta memoria, la proteína de fusión cuya secuencia de aminoácidos es la que se muestra en SEQ ID NO: 3 se denomina "ZM1-2"; la proteína de fusión cuya secuencia de aminoácidos es la que se muestra en SEQ ID NO: 4 se denomina "ZM2-2"; la proteína de fusión cuya secuencia de aminoácidos es la que se muestra en SEQ ID NO: 5 se denomina "ZM3-2"; y la proteína de fusión cuya secuencia de aminoácidos es la que se muestra en SEQ ID NO: 6 se denomina "ZM8-2".
Basándose en las soluciones técnicas anteriores, la expresión de las proteínas de fusión mencionadas anteriormente en la presente invención en células de glioblastoma, se puede detectar con un anticuerpo mediante inmunotransferencia. Cuando se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína que se va a detectar, se utiliza un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo multiclonal) contra la proteína para detectar la expresión de la proteína en un tejido o células específicos mediante inmunotransferencia, que es una técnica convencional en esa materia. La detección se puede realizar para un fragmento de la proteína de fusión o para la proteína de fusión completa. De acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, se puede usar un anticuerpo contra la proteína c-Met humana para detectar la expresión de las proteínas de fusión mencionadas anteriormente. De hecho, basándose en si alguna de las proteínas de fusión se expresa o no en las células de glioblastoma, los glioblastomas se pueden subtipificar y luego tratar con el compuesto representado por la fórmula A, proporcionado por la presente invención.
Por otro lado, un glioblastoma secundario puede contener un transcrito de una fusión específica, y el transcrito de la fusión contiene una gran parte de los ARNs que codifican c-Met y una parte de los ARNs que codifican PTPRZ1 fusionados en el extremo 5'- terminal de la parte de los ARNs que codifican c-Met. El compuesto representado por la fórmula A tiene un mejor efecto para inhibir la proliferación y la formación de tumores de un subtipo de glioblastoma que contiene el transcrito de fusión.
Por lo tanto, preferiblemente, la presente invención proporciona el compuesto representado por la fórmula A para uso en el tratamiento de un glioblastoma secundario, en donde el glioblastoma secundario es un subtipo de glioblastoma secundario que contiene un transcrito de fusión, y el transcrito de fusión se forma conectando una porción de ARN que se transcribe a partir del exón 1, exones 1 a 2, exones 1 a 3 o exones 1 a 8 de PTPRZ1 y una porción de ARN que se transcribe a partir de los exones 2 a 24 de c-Met, en donde la porción de ARN de PTPRZ1 está ubicada en el extremo 5’ de la porción de ARN de c-Met.
Preferiblemente, el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1.
Preferiblemente, el transcrito de fusión comprende además una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.
Más preferiblemente, el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1, y una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 en el extremo 5’ de la misma.
Lo más preferiblemente, el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SeQ ID NO: 6. De acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, la secuencia de nucleótidos del transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
De manera similar, basándose en las soluciones técnicas anteriores, la expresión de las proteínas de fusión mencionadas anteriormente en la presente invención, en las células de glioblastoma también se puede detectar sobre los transcritos de fusión mencionados anteriormente, a saber, las secuencias de ARN que las codifican. Cuando se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína que se va a detectar, la detección de la secuencia de ARN que la codifica también pertenece a una técnica convencional en la materia, y la detección se puede realizar para un fragmento de la proteína de fusión o para la proteína de fusión completa. Por ejemplo, el ARN total se puede extraer y usar como molde, o el ARN total se puede transcribir de forma inversa en ADNc que se usa como molde. Se utilizan cebadores específicos para realizar una amplificación mediante PCR. De hecho, basándose en si el transcrito de fusión está presente o no en las células de glioblastoma, los glioblastomas se pueden subtipificar y luego tratar con el compuesto representado por la fórmula A, proporcionado por la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona la secuencia de ADNc de la proteína de fusión ZM1-2, ZM2-2, ZM3-2 o ZM8-2, respectivamente, que se muestra en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.
Basándose en las soluciones técnicas proporcionadas por la presente invención, el compuesto representado por la fórmula A se puede emplear clínicamente para tratar gliomas cerebrales, en particular glioblastomas, incluyendo un sujeto que lo necesite al que se le puede administrar una cantidad eficaz del compuesto representado por la fórmula A o cualquier composición farmacéutica que contenga el compuesto representado por la fórmula A. La dosis y la vía de administración dependen del estado de salud individual, los síntomas y la gravedad de la enfermedad y similares, y las debe determinar un médico según las situaciones específicas.
Específicamente, cuando se requiere una pauta de tratamiento de precisión, una muestra de tumor, tal como una muestra de glioblastoma de un sujeto que se va a tratar, se puede detectar clínicamente en primer lugar, por ejemplo, para detectar si se expresa o no la proteína de fusión mencionada anteriormente o si el transcrito de fusión mencionado anteriormente está contenido en la muestra de glioblastoma, y/o para detectar el contenido en proteína de fusión o transcrito de fusión en la muestra. Si la muestra del sujeto que se va a tratar contiene la proteína de fusión o el transcrito de fusión mencionados anteriormente, o si el contenido en proteína de fusión o transcrito de fusión es mayor que el que tiene un sujeto normal o en cualquier otra muestra relevante, se puede administrar el compuesto representado mediante la fórmula A o una composición farmacéutica que contenga el compuesto. En tales circunstancias, la presencia o el contenido en proteína de fusión o transcrito de fusión en la muestra se puede detectar usando una técnica convencional en la materia, por ejemplo, la inmunotransferencia y la PCR mencionadas anteriormente.
Un estudio clínico muestra que los glioblastomas que expresan la proteína de fusión que se menciona en la presente invención o que contienen el transcrito de fusión que se menciona en la presente invención, tienen un pronóstico peor, y el tiempo de supervivencia de esos pacientes es claramente más corto que el de pacientes sin la proteína de fusión o el transcrito de fusión (127 días frente a 248 días). Para pacientes con tales glioblastomas, el compuesto representado por la fórmula A proporcionado por la invención, tiene una ventaja especial para el tratamiento en comparación con otros medicamentos similares.
Además, durante el tratamiento de gliomas cerebrales, en particular glioblastomas, el compuesto representado por la fórmula A se puede utilizar junto con otras terapias o agentes terapéuticos, de forma simultánea, secuencial o en un determinado intervalo de tiempo. La dosis y la vía de administración dependen del estado de salud individual, los síntomas y la gravedad de la enfermedad y similares, y deben ser determinadas por un médico según las situaciones específicas.
En comparación con la técnica anterior, la presente invención tiene los siguientes efectos beneficiosos:
Mediante experimentos del compuesto representado por la fórmula A de proliferación in vitro y tumorigénesis in vivo de líneas celulares de glioblastoma, la presente invención confirma por primera vez que el compuesto representado por la fórmula A, en comparación con otros inhibidores de c-Met, puede inhibir más significativamente el desarrollo de glioblastomas. Hablando más específicamente, los experimentos demuestran que, en comparación con inhibidores de c-Met con estructuras similares, el compuesto representado por la fórmula A tiene un efecto inhibidor más potente sobre la viabilidad celular y la formación de tumores en animales. Los resultados tanto de los experimentos con células como de los experimentos in vivo demuestran que el efecto inhibidor sobre los glioblastomas, del compuesto representado por la fórmula A, es cercano o incluso mayor que el del crizotinib. En particular, el peso molecular de crizotinib es mayor que el del compuesto representado por la fórmula A, por lo que es más difícil que crizotinib atraviese la barrera hematoencefálica, y menos cantidad de crizotinib puede alcanzar los glioblastomas y puede tener un papel limitado. Además, crizotinib es un medicamento de doble diana. Un estudio muestra que crizotinib inhibe ALK mientras inhibe c-Met y, por lo tanto, tiene un efecto secundario relativamente fuerte. Comparativamente, el compuesto representado por la fórmula A solo se dirige a c-Met, por lo que el efecto secundario es menor.
En particular, los experimentos demuestran que el compuesto representado por la fórmula A tiene un efecto más significativo de inhibición de glioblastomas secundarios que expresan una proteína de fusión específica, y el efecto es mucho mayor que el de compuestos similares o medicamentos terapéuticos conocidos. Mediante la detección de si la proteína de fusión se expresa o no o si el transcrito de fusión mencionado está presente en un glioblastoma, se puede distinguir el subtipo de glioblastomas que expresa la proteína de fusión o que contiene el transcrito, de otros glioblastomas, y luego el compuesto representado por la fórmula A se adopta para proporcionar un tratamiento eficaz, logrando así un tratamiento personalizado de precisión en pacientes con glioblastomas, y resolviendo radicalmente el problema de un pronóstico grave causado por ese tipo específico de glioblastomas. Al mismo tiempo, basándose en el mecanismo de acción del compuesto representado por la fórmula A, se pueden evitar efectos secundarios y aliviar el dolor de los pacientes, haciendo que el tratamiento con el medicamento sea más seguro y eficaz. Por último, se mejoran las ventajas económicas del tratamiento de la enfermedad y el pronóstico.
Breve descripción de los dibujos
A continuación, se describirán detalladamente realizaciones de la presente invención haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 muestra los resultados de la secuenciación del ADNc de una proteína de fusión (ZM1-2) que se muestra en SEQ ID NO: 3 y de una proteína de fusión (ZM2-2) que se muestra en SEQ ID NO: 4, proporcionadas por la presente invención.
La Fig. 2 muestra las estructuras de las proteínas de fusión proporcionadas por la presente invención.
La Fig. 3 muestra los resultados de una inmunotransferencia de proteínas de fusión proporcionados por la presente invención en el Ejemplo 3, en donde el carril 1 es la proteína de fusión ZM8-2, el carril 2 es la proteína de fusión ZM2-2 y los carriles 3 y 4 son respectivamente referencias.
La Fig. 4 es una representación estructural de un vector lentivírico PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, en el que se muestra la posición de la inserción de la secuencia que codifica la proteína de fusión.
La Fig. 5 muestra los resultados experimentales de la inhibición del crecimiento tumoral in vivo en el Ejemplo 5. La Fig. 6 muestra los resultados del experimento de supervivencia de ratones en el Ejemplo 5.
La Fig. 7 muestra los resultados de la formación de imágenes cerebrales mediante resonancia magnética de un experimento de formación de tumores in vivo de glioblastoma en el Ejemplo 5, en donde el panel 7A muestra una imagen del cerebro de un ratón vector (2) obtenida por modelado, el panel 7B muestra una imagen del cerebro de un ratón ZM2-2 (2) obtenida por modelado, el panel 7C muestra una imagen del cerebro del ratón ZM2-2 (2), el día 16° después de que se administró el compuesto representado por la fórmula A por primera vez, y el panel 7D muestra una imagen del cerebro del ratón ZM2-2 (2), 10 días desde que se detuvo la administración del compuesto el día 16 después de que se administrara por primera vez el compuesto representado por la fórmula A.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
A continuación, la presente invención se describirá haciendo referencia a Ejemplos específicos. Los expertos en la técnica pueden entender que esos Ejemplos se utilizan simplemente para describir la presente invención, en lugar de limitar en algún modo el alcance de la presente invención.
A menos que se especifique lo contrario, los métodos de los siguientes Ejemplos son métodos convencionales. Las materias primas medicinales y materiales reactivos, etc. utilizados en los siguientes Ejemplos, son todos productos disponibles comercialmente, a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo 1: Obtención de los ARN y ADNc de glioblastomas
Se recogieron 80 muestras de glioblastoma a través de operaciones que cumplieron con los estándares del Comité de Ética Médica. Cada muestra se recogió con el consentimiento escrito del paciente que donó la muestra y del médico del paciente. El sexo, la edad y el tipo de enfermedad de las muestras se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
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Se usó un kit de extracción de ARN (adquirido en Qiagen) para extraer el ARNm total de cada una de las muestras de glioblastoma de acuerdo con las instrucciones contenidas en el mismo. La integridad de los ARNm totales se detectó usando un analizador y se confirmó que el RIN (RNA Integrity Number) del ARNm total de cada muestra era superior a 7,0.
Se utilizó un kit de transcripción inversa (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, K1622, adquirido en Invitrogen) para realizar la transcripción inversa en un sistema de reacción de 20 gl de acuerdo con las instrucciones del mismo, tomando el ARNm total de cada muestra como molde, sintetizando de este modo un ADNc bicatenario para cada muestra.
Ejemplo 2: Detección de las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención en glioblastomas
El ADNc de cadena doble de cada muestra preparada en el Ejemplo 1, se tomó como molde y se amplificó usando las siguientes secuencias de cebadores:
cebador directo: SEQ ID NO: 11 AT G CGAAT CCT AAAG CG TTT CCTCG
cebador inverso: SEQ ID NO: 12 CTATGATGTCTCCCAGAAGGAGGCT
En 20 gl del sistema de amplificación se incluía: cebador directo 10 gM, 1 gl; cebador inverso 10 gM, 1 gl; 100 ng de molde; mezcla maestra Phusion 2X (NEB, número de producto M0531), 10 gl; y agua exenta de nucleasas, hasta 20 gl.
La configuración del programa de PCR incluía: 98°C durante 30 segundos; 98°C durante 10 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 1,5 minutos, 30 ciclos en total; 72°C durante 5 min; mantenido a 12°C.
Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y las bandas generadas se recuperaron con un kit de recuperación de gel de ADN (kit de purificación de PCR QIAquick, adquirido en Qiagen) y luego se clonaron en un vector T (vector easy pGEM-T, adquirido en Promega), y se secuenció con un secuenciador de ADN (ABI Prism 3730x1 DNA Sequencer, adquirido en Applied Biosystems).
Los resultados de la secuenciación mostraron que se habían obtenido dos secuencias de nucleótidos diferentes mediante amplificación. Tienen 66 nucleótidos diferentes, y son respectivamente como se muestran en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Los resultados de la secuenciación de las secuencias de nucleótidos se muestran en la Fig. 1. Además, las secuencias de ADN genómico de la proteína de fusión ZM3-2 y la proteína de fusión ZM8-2 se encontraron mediante una secuenciación de los ADN del genoma completo de ciertas muestras.
Basándose en las fuentes de las muestras, se encontró que la muestra n° 60, la muestra n° 64, la muestra n° 77, la muestra n° 78 y la muestra n° 80, indicadas en la Tabla 1 tenían los ADNc o los ADN genómicos de las proteínas de fusión correspondientes: la proteína de fusión ZM1-2 se encontró en la muestra n° 60, la proteína de fusión ZM2-2 se encontró tanto en la muestra n° 64 como en la muestra n° 78, la proteína de fusión ZM3-2 se encontró en la muestra n° 77 y la proteína de fusión ZM8-2 se encontró en la muestra n° 80. Los resultados mostraban que las proteínas de fusión y los ARN codificantes o los ADN genómicos de las mismas según la presente invención, estaban presentes específicamente en una parte de los glioblastomas, no en otra parte de los glioblastomas, y casi todos se encontraban en glioblastomas secundarios.
Por tanto, se obtienen las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión, que se muestran en SEQ ID NO: 3 (proteína de fusión ZM1-2), SEQ ID NO: 4 (proteína de fusión ZM2-2), SEQ ID NO: 5 (proteína de fusión ZM3-2) y SEQ ID NO: 6 (proteína de fusión ZM8-2). A través de la alineación de secuencias, se encontró que esas cuatro proteínas de fusión todas ellas se habían formado fusionando parte de la proteína PTPRZ1 con casi la totalidad de la proteína c-Met, desde el extremo N-terminal al C-terminal. En particular, la proteína de fusión ZM1-2 se obtuvo fusionando el exón 1 de PTPRZ1 con los exones 2 a 24 de c-Met, la proteína de fusión ZM2-2 se obtuvo fusionando los exones 1 a 2 de PTPRZ1 con los exones 2 a 24 de c-Met, la proteína de fusión ZM3-2 se obtuvo fusionando los exones 1 a 3 de PTPRZ1 con los exones 2 a 24 de c-Met, y la proteína de fusión ZM8-2 se obtuvo fusionando los exones 1 a 8 de PTPRZ1 con los exones 2 a 24 de c-Met; y las cuatro proteínas de fusión no contenían ninguna porción correspondiente al promotor y al exón 1 de c-Met (elemento no funcional). Por lo tanto, se especuló que los genes de fusión se transcribían con el promotor de PTPRZ1. Las representaciones estructurales de los cuatro genes de fusión se muestran en la Fig. 2.
Además, una investigación clínica ha encontrado que la mediana de supervivencia de los casos de glioblastoma con las proteínas de fusión como las descritas en la presente invención, era de 127 días, más corta que la mediana de supervivencia de los casos de glioblastoma notificados (248 días). De este modo se demuestra que entre los glioblastomas secundarios, el subtipo de glioblastomas que expresan las proteínas de fusión como se describen en la presente invención, tiene un pronóstico peor.
Ejemplo 3: Verificación mediante inmunotransferencia de proteínas de fusión en glioblastomas
Las proteínas totales de las 80 muestras de glioblastoma recogidas en el Ejemplo 1, se sometieron a una verificación mediante inmunotransferencia de las proteínas de fusión.
El anticuerpo usado en la verificación de la inmunotransferencia era un anticuerpo contra la proteína c-Met humana (anticuerpo de conejo, adquirido en Abcam, número de producto: ab51067). El peso molecular de una proteína c-Met humana no fusionada era de 145 kDa, mientras que el peso molecular de una proteína de fusión era mayor. Las operaciones de inmunotransferencia se realizaron de acuerdo con las instrucciones del anticuerpo y las instrucciones del kit de inmunotransferencia.
Los resultados de la inmunotransferencia mostraban que las bandas de inmunotransferencia obtenidas eran consistentes con los resultados del Ejemplo 2: se encontraron bandas de inmunotransferencia en las muestras n° 60, n° 64, n° 77, n° 78 y n° 80 entre las muestras indicadas en la Tabla 1 (todas eran muestras de glioblastoma secundario). La Fig. 3 muestra los resultados de la inmunotransferencia de ZM8-2 y ZM2-2, en donde el peso molecular de ZM8-2 era de aproximadamente 190 kDa y el peso molecular de ZM2-2 era cercano al de una proteína c-Met humana no fusionada, como lo muestran las bandas de inmunotransferencia casi superpuestas.
Por tanto, se puede saber que las proteínas de fusión, tal y como se describen en la presente invención, se expresan específicamente en una parte de los glioblastomas, no en otra parte de los glioblastomas. Por tanto, los glioblastomas se pueden clasificar en un subtipo de glioblastomas que expresa las proteínas de fusión y el subtipo de glioblastomas que no expresa las proteínas de fusión.
Ejemplo 4: Determinación de la actividad inhibidora del compuesto representado por la fórmula A sobre la proliferación de células de glioblastoma
El compuesto representado por la fórmula A y crizotinib, así como los compuestos representados por las fórmulas B a H que tienen respectivamente una estructura similar a la estructura de la fórmula A, se emplearon para llevar a cabo el experimento de someter a ensayo la actividad de inhibir la proliferación de células de glioblastoma.
Los compuestos representados por las fórmulas A-H se sintetizaron mediante las etapas y el esquema descritos en el documento de publicación de solicitud de patente china CN103122000A.
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Crizotinib (CRIZOTINIB; PF-02341066): producto n° S1068, adquirido en Selleck, EE.UU.
En primer lugar, se usó un vector lentivírico PCDH (PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro, SBI, producto n°: CD510B-1, estructura mostrada en la Fig. 4), y la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, se clonó en el vector de acuerdo con las instrucciones del mismo, para preparar vectores de expresión que expresaban proteínas de fusión representadas respectivamente por SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Los vectores de expresión se denominaron y se marcaron respectivamente como "PCDH-ZM1-2" y "PCDH-ZM2-2". A continuación, se usó un plásmido de empaquetamiento vírico (SBI, producto n° LV500A-1) para coinfectar células 293T con uno de los vectores para preparar un lentivirus. Se realizó el mismo método para empaquetar el vector lentivírico PCDH y coinfectar las células 293T, para preparar un lentivirus con el vector en blanco, que se denominó "PCDH-blanco".
Se adquirió una línea celular de glioma humano U87, que no expresaba ninguna de las proteínas de fusión proporcionadas por la presente invención, a partir del “Cell Bank of Chinese Academy of Medical Sciences”. Las células U87 se infectaron con cualquiera de los lentivirus preparados anteriormente y se seleccionaron aplicando puromicina (0,5 pg/ml para la selección y 0,2 pg/ml para el mantenimiento) para establecer modelos celulares que expresaran de forma estable las proteínas de fusión. Los modelos celulares se verificaron en relación con la expresión de las proteínas de fusión y la transcripción de los genes de fusión mediante inmunotransferencia y PCR de transcripción inversa, y finalmente se obtuvieron líneas celulares que expresaban de manera estable las proteínas de fusión ZM1-2 y ZM2-2 respectivamente y se denominaron "células que expresan PCDH-ZM1-2” y “células que expresan PCDH-ZM2-2” respectivamente. De manera similar, las células U87 se infectaron con el PCDH-blanco de lentivirus con el vector en blanco para obtener "células que expresan PCDH-blanco" como referencia en blanco.
Las células U87 que se cultivaron en una placa grande y estaban en un estadio logarítmico, se lavaron una vez con PBS estéril y luego se digirieron con tripsina al 0,25% durante 2 min. Después de digerir todas las células para desprenderlas, se usó medio DMEM completo que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% para detener la digestión. Se contaron las células y se ajustó la concentración celular a 20.000 células/ml. A continuación, las células se sembraron en una placa Corning de 96 pocillos (2000 células/pocillo) usando una pipeta multicanal y se incubaron en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Los compuestos sometidos a ensayo (crizotinib y los compuestos representados por las fórmulas A a H) se disolvieron respectivamente en DMSO para preparar soluciones madre, y luego se utilizaron las soluciones madre y el medio completo para preparar soluciones con diferentes concentraciones de medicamentos (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 pM). Las células se incubaron en la incubadora durante 72 horas adicionales, y luego se añadió a cada pocillo 20 pl de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difenil tetrazolio (MTT). Después de 1-3 horas en la incubadora, se determinó la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas. Se calculó la tasa de inhibición correspondiente a cada concentración y el valor de CI50 se calculó con el programa informático GraphPad. Los resultados se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
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De la Tabla 2 se desprende que, en la propia línea celular de glioma humano U87 y la línea celular de referencia en blanco U87, en comparación con los compuestos representados por las fórmulas F a G que tienen estructuras similares, el compuesto representado por la fórmula A logra un efecto significativamente más potente de inhibición de la viabilidad celular, y logra un efecto de inhibición sobre la proliferación que es similar o incluso superior al de crizotinib.
Además, durante los experimentos, se encontró que los glioblastomas con expresión de las proteínas de fusión ZM1-2 y ZM2-2 proliferaban claramente más rápido. Entre las células, la viabilidad celular solo se podía inhibir con el compuesto representado por la fórmula A, y los efectos inhibidores sobre la viabilidad celular de los compuestos representados por las fórmulas B a H y el crizotinib eran claramente inferiores a los del compuesto representado por la fórmula A.
Ejemplo 5: Determinación de la actividad inhibidora del compuesto representado por la fórmula A, en la formación de tumores in vivo de glioblastomas
Se realizó un experimento de inhibición de la formación de tumores in vivo de glioblastoma con el compuesto representado por la fórmula A y crizotinib.
(1) Experimento de inhibición del crecimiento tumoral.
En primer lugar, se estableció un modelo de ratón portador de tumores. Se adquirieron ratones hembra sin pelo BALB/c (nu/nu), de 6-8 semanas de edad, con un peso de aproximadamente 16-18 g en Vital River. Las "células que expresan PCDH-blanco" y las "células que expresan PCDH-ZM2-2" preparadas en el Ejemplo 4, se prepararon en suspensiones de 107 células/ml con PBS, respectivamente. A los ratones sin pelo desinfectados con etanol al 75%, se les inyectó por vía subcutánea 100 pl de las suspensiones celulares en el área escapular derecha, en donde las células que expresaban PCDH-blanco se inyectaron en siete ratones sin pelo, y las células que expresaban PCDH-ZM2-2 se inyectaron en 21 ratones sin pelo. Aproximadamente 2-3 días después de la inoculación subcutánea, se comenzó a observar la formación de tumores sólidos, y se encontró que los tumores se formaban después de aproximadamente 15 días. El tamaño del tumor y las variaciones en el peso del ratón se midieron dos veces por semana. Los ratones portadores de tumores obtenidos mediante inyección de las "células que expresaban PCDH-blanco" se denominaron "ratones vectores (1)", y los ratones portadores de tumores obtenidos mediante inyección de "células que expresaban PCDH-ZM2-2" se denominaron "ratones ZM2-2 (1)".
Cuando los tumores crecieron hasta tener un volumen de aproximadamente 100 mm3, los ratones ZM2-2 (1) se dividieron en tres grupos según el tamaño medio del tumor, incluyendo un grupo de 7 ratones a los que se les administró el compuesto representado por la fórmula A, un grupo de 7 ratones a los que se les administró crizotinib y un grupo de control de 7 ratones. A los dos primeros grupos se les administró el compuesto representado por la fórmula A en una dosis de 10 mg/kg/día o crizotinib en una dosis de 50 mg/kg/día mediante una sonda nasogástrica. Los dos medicamentos se prepararon en suspensiones con solución salina normal, respectivamente, y fueron administrados una vez al día con agitación continua para una administración continua. Al grupo de control se le administró mediante una sonda nasogástrica solución salina normal. El tamaño del tumor y las variaciones del peso del ratón se midieron dos veces por semana. El diámetro del tumor se midió con un calibrador vernier y la ecuación para calcular el volumen del tumor era: volumen del tumor = 0,5*Largo*Ancho2. Las variaciones en el tamaño del tumor se muestran en la Fig. 5. Los resultados mostraron que el compuesto representado por la fórmula A podía inhibir significativamente el crecimiento de tumores en los ratones ZM2-2 (1), y el efecto de inhibición era más potente que el del crizotinib.
(2) Experimento de supervivencia en ratones.
En primer lugar, se estableció un modelo de ratón portador de tumores. Las "células que expresaban PCDH-blanco" y las "células que expresaban PCDH-ZM2-2" preparadas en el Ejemplo 4, se prepararon en suspensiones de 105 células/5 pl con PBS, respectivamente. Se inoculó a ratones sin pelo desinfectados con etanol al 75%, 100 pl de las suspensiones celulares. La posición de la inoculación celular (2 mm de distancia en el lado derecho de la fontanela anterior y 2 mm hacia atrás) se determinó usando un aparato estereotáxico cerebral para ratones; la profundidad de la inyección era de 3,5 mm y luego se aumentó en 0,6 mm; y se inyectó a cada ratón 5 pl de las soluciones de células, respectivamente. Después de la inyección, los ratones se mantuvieron quietos durante 1 minuto y luego recibieron un cierre cutáneo convencional. Después de que se observaran tumores intracraneales, los ratones portadores de tumores obtenidos con las "células que expresaban PCDH-blanco" se denominaron "ratones vectores (2)" y los ratones portadores de tumores obtenidos con las "células que expresaban PCDH-ZM2-2" se denominaron "ratones ZM2-2 (2)".
Los cerebros de los ratones se escanearon mediante formación de imágenes por resonancia magnética nuclear. Se encontró que los tumores intracraneales de los ratones vectores (2) eran claramente más pequeños que los tumores intracraneales de los ratones ZM2-2 (2). Por tanto, se demuestra que la expresión de las proteínas de fusión proporcionadas por la presente invención, daba como resultado una mejora clara en la formación de tumores de glioblastomas en ratones. Los resultados se muestran en el panel 7A y el panel 7B, respectivamente.
A 8 ratones vectores (2) y 8 ratones ZM2-2 (2) se les administró respectivamente el compuesto representado por la fórmula A, con una dosis de 50 mg/kg de peso/día. El compuesto se administró una vez al día mediante una sonda nasogástrica. Al mismo tiempo, a otro grupo de 8 ratones ZM2-2 (2) se les administró solución salina normal, como grupo de control. El experimento duró más de 6 semanas. Los resultados mostraron que los ratones ZM2-2 (2) que solo recibieron solución salina normal, morían gradualmente desde el día 20, mientras que los ratones vectores (2) que recibieron el compuesto representado por la fórmula A, sobrevivieron todos, y la administración del compuesto representado por la fórmula A prolongaba claramente el tiempo de supervivencia de los ratones ZM2-2 (2), como se muestra en la Fig. 6.
Los cerebros de los ratones ZM2-2 (2) a los que se administró el compuesto representado por la fórmula A, se analizaron mediante la formación de imágenes por resonancia magnética nuclear, el 16° día después de que se administrara por primera vez el compuesto representado por la fórmula A. Se encontró que el tumor intracraneal claramente se había reducido. Véanse los resultados en el panel 7C. De manera similar, se demuestra que el compuesto representado por la fórmula A puede inhibir claramente el crecimiento de tumores en los ratones ZM2-2.
A otros 8 ratones ZM2-2 (2) también se les administró el compuesto representado por la fórmula A con una dosis de 50 mg/kg de peso/día. El compuesto se administró una vez al día mediante sonda nasogástrica. A continuación, la administración del compuesto se detuvo el día 16 después de la primera administración, y los cerebros se analizaron mediante la formación de imágenes por resonancia magnética nuclear, el 10° día después de la retirada del compuesto. Se encontró que los tumores volvían a crecer rápidamente. Los resultados se muestran en el panel 7D.
De acuerdo con los resultados experimentales anteriores, se puede observar que el compuesto representado por la fórmula A puede inhibir significativamente el crecimiento de los glioblastomas que expresan las proteínas de fusión proporcionadas por la presente invención y prolongar la supervivencia de los pacientes, y los glioblastomas eran propensos a reaparecer después de la retirada del compuesto. El efecto de inhibición tumoral del compuesto representado por la fórmula A es incluso más fuerte que el del crizotinib, por lo que el compuesto se puede utilizar como un sustituto de crizotinib.
Además, se ha demostrado que el periodo de la mediana de supervivencia de los casos de glioblastomas que expresan las proteínas de fusión de la presente invención, es más corto que el de los casos de otros glioblastomas descritos, lo que significa que entre los glioblastomas, los casos de glioblastomas que expresan las proteínas de fusión tienen un pronóstico peor. Para un subtipo de glioblastoma de ese tipo con peor pronóstico, el compuesto representado por la fórmula A puede lograr un mejor efecto terapéutico, en comparación con otros compuestos capaces de servir como inhibidores de c-Met así como con crizotinib.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. El compuesto representado por la fórmula A:
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para uso en el tratamiento de un glioma cerebral.
2. El compuesto para uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el glioma cerebral es un glioblastoma.
3. El compuesto para uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el glioma cerebral es un glioblastoma secundario.
4. El compuesto para uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el glioblastoma secundario es un subtipo de glioblastoma secundario que expresa una proteína de fusión, y la proteína de fusión se forma fusionando una porción de proteína traducida desde el exón 1, exones 1 a 2, exones 1 a 3 o exones 1 a 8 de PTPRZ1 con una porción de proteína traducida desde los exones 2 a 24 de c-Met, en donde la porción de proteína de PTPRZ1 está ubicada en el extremo N-terminal de la porción de proteína de c-Met.
5. El compuesto para uso según la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1;
preferiblemente, la proteína de fusión comprende además la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2;
más preferiblemente, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 en el extremo N-terminal de la misma.
6. El compuesto para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6;
preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión es como se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
7. El compuesto para uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el glioblastoma secundario es un subtipo de glioblastoma secundario que contiene un transcrito de fusión, y el transcrito de fusión se forma conectando una porción de ARN que se transcribe desde el exón 1, exones 1 a 2, exones 1 a 3 o exones 1 a 8 de PTPRZ1 y una porción de ARN que se transcribe desde los exones 2 a 24 de c-Met, en donde la porción de ARN de PTPRZ1 está ubicada en el extremo 5’-terminal de la porción de ARN de c-Met.
8. El compuesto para uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1; preferiblemente, el transcrito de fusión comprende además una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2;
más preferiblemente, el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1, y una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2 en el extremo 5’-terminal de la misma.
9. El compuesto para uso según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque el transcrito de fusión comprende una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6;
preferiblemente, la secuencia de nucleótidos del transcrito de fusión está comprendida en una secuencia de ARN que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
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