PT1869185E - Conjugado compreendendo proteína p21 para o tratamento do cancro - Google Patents

Conjugado compreendendo proteína p21 para o tratamento do cancro Download PDF

Info

Publication number
PT1869185E
PT1869185E PT06726802T PT06726802T PT1869185E PT 1869185 E PT1869185 E PT 1869185E PT 06726802 T PT06726802 T PT 06726802T PT 06726802 T PT06726802 T PT 06726802T PT 1869185 E PT1869185 E PT 1869185E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
protein
antennapedia
fusion protein
arg
cancer
Prior art date
Application number
PT06726802T
Other languages
English (en)
Inventor
Agamemnon Epenetos
Christina Kousparou
Original Assignee
Trojan Technologies Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Trojan Technologies Ltd filed Critical Trojan Technologies Ltd
Publication of PT1869185E publication Critical patent/PT1869185E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43577—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies
    • C07K14/43581—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies from Drosophila
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Conjugado compreendendo proteína P21 para o tratamento do cancro"
Campo da invenção A presente invenção refere-se a conjugados de proteína P21 em composições compreendendo um fármaco quimioterapêutico. Estas composições são particularmente úteis no tratamento do cancro.
Anterioridade da invenção 0 cancro é uma das principais causas de mortalidade humana e tem sido o objecto de investigação intensiva. É bem conhecido que quase todos os tumores malignos resultam da transformação de uma única célula para um estado imortal, onde a célula perdeu a capacidade de controlo da proliferação. A proliferação descontrolada resulta de um mau funcionamento no controlo do ciclo celular o qual, em eucariontes, é largamente controlado por ciclinas e quinases dependentes de ciclinas (CDK). Um mecanismo complexo de controlo sobre o estado de fosforilação das ciclinas e das CDK controla se os complexos ciclina/CDK são capazes de conduzir a célula para a fase seguinte do ciclo. A importância do estado de fosforilação dos complexos ciclina/CDK é reflectida pelo facto de um grande número de cancros envolver mutações nas proteínas supressoras de tumores P53 e P21, que são componentes chave no controlo da fosforilação de ciclina/CDK e formação do complexo. Em particular, a P21 bloqueia a formação do complexo cycD/cdk4 e provoca a paragem em G1. Podem encontrar-se revisões que detalham a proteína P21 e a sua função biológica em 0'Reilly MA, Antioxid Redox Signal. 2005 Jan-Feb; T_(l-2) :108-18 e Liu G & Lozano G, Câncer Cell. 2005 Feb; 7(2) :113-4 . O tratamento do cancro envolve usualmente uma combinação de procedimentos cirúrgicos, radioterapia e quimioterapia (incluindo imunoterapia) . Apesar de avanços significativos nas terapias do cancro em anos recentes, permanece uma necessidade constante de desenvolvimento de terapias melhoradas. 2 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
Idealmente, uma terapia de cancro terá especificamente como alvo e destruirá apenas células cancerosas.
Um outro problema que precisa de ser abordado é a resistência a fármacos que resulta da quimioterapia. A administração continuada de um fármaco citotóxico pode fazer com que um tumor, que era inicialmente sensível ao fármaco, fique progressivamente resistente ao fármaco de modo que o fármaco perde a sua eficácia terapêutica. Métodos para melhorar a sensibilidade de células cancerosas a fármacos são portanto também necessários. 0 documento US2003133971 de JR Smith et al. descreve um lipossoma compreendendo a proteína SDI-1 ou um ácido nucleico que a codifica, para inibição da proliferação celular e.g. o cancro {e.g. par.185). 0 documento de Bonfanti M et al. (1997) Câncer Research vol.57 pp.1442-1446 descreve a inibição do crescimento de células tumorais por proteínas de fusão consistindo numa sequência peptídica da proteína p21 e numa sequência de translocação derivada do homeodomínio de Antennapedia. 0 documento US2002068706 de Gyuris J et al. Descreve proteínas de fusão consistindo num inibidor de CDK e um factor de translocação, e a sua utilização em tratamento anticanceroso. Notavelmente, reivindica a fusão de p21 com uma sequência de promoção de transcitose (reivindicação 26), em que a proteína promotora da transcitose pode ser derivada de proteína Antennapedia (reivindicação 43). 0 documento US6521602 descreve ácidos nucleicos que expressam CDKi quimérica excretável e internalizável (i.e. uma fusão de um inibidor de CDK CIP, um inibidor de CDK INK4, e um domínio de transdução da proteína), e descreve a acção sinérgica com proteína adenoviral E4 na indução de apoptose de células neoplásicas.
Sumário da invenção A presente invenção baseia-se na verificação de que se observa um efeito sinérgico quando a proteína P21 é administrada juntamente com pelo menos um fármaco quimioterapêutico. 3 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
De acordo com um primeiro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo: i) um conjugado compreendendo (a) uma primeira região compreendendo a proteína P21 possuindo a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID N0:1, ou um seu homólogo possuindo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO:l e possuindo a função da proteína P21 nativa; e (b) uma segunda região compreendendo o homeodomínio de Antennapedia possuindo a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3; e ii) um fármaco quimioterapêutico.
Numa concretização preferida, o conjugado está na forma de uma proteína de fusão.
Num aspecto adicional, a referida composição destina-se a utilização como medicamento.
Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona a utilização da referida composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro.
Descrição dos Desenhos A invenção é descrita com referência aos seguintes desenhos, em que: a Figura 1 ilustra a citotoxicidade da proteína de fusão antennapedia/P21 administrada à linha celular de carcinoma ovariano SKOV-3 e à linha de osteossarcoma SAOS-2, que foram crescidas em placas de ELISA 96 poços em condições que se assemelham à situação no corpo humano; a Figura 2 ilustra a citotoxicidade da proteína de fusão antennapedia/P21 e seu efeito sinérgico com cisplatina, e células SKOV-3; a Figura 3 ilustra a citotoxicidade da proteína de fusão antennapedia/V21 em combinação com cisplatina e taxol, em células SKOV-3, indicando que na fusão antennapedia/P21, a 4 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ cisplatina e ο taxol actuam sinergicamente quando utilizados em combinação; a Figura 4 ilustra a depuração do sangue de proteína antennapedia purificada, radiomarcada (4A) e proteína de fusão antennapedia-P21 (4B) em ratinhos isentos de tumores; a Figura 5 ilustra as razões órgão-para-sangue e a acumulação de proteína em vários órgãos, para a proteína antennapedia (5A) e para a proteína de fusão antennapedia-P21 (5B); a Figura 6 ilustra a redução no crescimento de tumores utilizando proteína de fusão antennapedia/P21; a Figura 7 é uma curva de sobrevivência Kaplan-Meier indicando que a sobrevivência de ratinhos é maior quando estes recebem a proteína de fusão antennapedia/P21 na sua concentração mais elevada; a Figura 8 demonstra um efeito sinérgico in vivo quando se utiliza a proteína de fusão antennapedia/P21, taxol e cisplatina. a Figura 9 ilustra a curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para ratinhos que receberam a proteína de fusão antennapedia/P21 e quimioterapia, é evidente que o melhor benefício de sobrevivência é demonstrado pelos animais que recebem tanto a proteína de fusão como quimioterapia suplementar; a Figura 10 ilustra a curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para ratinhos que receberam a fusão antennapedia/P21 e animais que também receberam cisplatina e taxol; e a Figura 11 mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para ratinhos que receberam a fusão antennapedia/P21 e um quimioterapêutico adicional.
Descrição Detalhada da Invenção A invenção utiliza um conjugado de proteína P21 como agente terapêutico numa composição compreendendo um fármaco quimioterapêutico. Quando utilizada em combinação com um fármaco quimioterapêutico, observa-se uma surpreendente 5 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ sinergia. A proteína P21 é ligada a um factor de translocação, para permitir que a proteína P21 entre numa célula alvo.
Antes da presente divulgação, não foi notado que a P21 pudesse ser utilizada extensivamente em terapia do cancro. A maioria dos cancros resulta de mutações no gene de P53, que é portanto o alvo óbvio, e mais favorecido, quando se desenham terapêuticas do cancro. A proteína P21, que funciona mais abaixo da cascata apoptótica, não foi considerada como um agente terapêutico. A presente divulgação ultrapassa a P53 e permite a entrega directa de P21 activa, para o tratamento do cancro. A administração de P21 e de um fármaco quimioterapêutico proporciona uma surpreendente melhoria na terapia anticancerosa.
Como aqui se utiliza, o termo "proteína" refere-se a uma molécula polimérica compreendendo uma pluralidade de resíduos de aminoácido ligados através de ligações peptídicas, como será notado por um perito na especialidade. Os péptidos e polipéptidos estão abrangidos no termo "proteína". A proteína P21 humana é definida aqui como SEQ ID NO. 1.
SEQ 1D NO.1: SEPAGDVRQN PCGSKACRRL FGPVDSEQLS RDCDALMAGC IQEARERWNF DFVTETPLEG DFAWERVRGL GLPKLYLPTG PRRGRDELGG GRRPGTSPAL LQGTAEEDHV DLSLSCTLVP RSGEQAEGSP GGPGDSQGRK RRQTSMTDFY HSKRRLIFSK RKP A sequência de P21 humana anotada pode ser encontrada na base de dados de SWISSPROT com o número de acesso principal P38936 (Nome de Entrada CDN1A__HUMAN) . Embora a sequência humana (SEQ ID N0:1) seja preferida, pode ser utilizada uma proteína P21 de qualquer espécie de acordo com a invenção, por exemplo a proteína Mus musculus (número de acesso principal na SWISSPROT P39689) ou a proteína de Felis silvestris catus (Cat) (número de acesso principal na SWISSPROT 019002). É também descrito um polinucleótido que codifica uma proteína P21. 6 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ São também descritas variantes funcionais (i.e. homólogos) e fragmentos da proteina P21 humana (SEQ ID N0:1). Proteinas com níveis elevados (e.g. superiores a 60%, Preferivelmente superiores a 70%, mais preferivelmente superiores a 80% e o mais preferivelmente superiores a 90%, e.g. superiores a 95%) de identidade de sequência com SEQ ID NO:l estão dentro do âmbito da presente divulgação. O termo "identidade" é conhecido na especialidade. O termo refere-se a uma comparação entre sequências de aminoácidos, e tem em consideração aminoácidos idênticos em posições correspondentes. Similaridade entre sequências polipeptídicas indica similaridade funcional, em adição a similaridade de sequências.
Os níveis de identidade entre sequências de aminoácidos podem ser calculados utilizando métodos conhecidos. Os métodos baseados em computador disponíveis ao público para a determinação da identidade ou similaridade incluem os programas BLASTP, BLASTN e FASTA, o programa BLASTX disponível em NCBI, e o programa Gap de Genetics Computer Grupo, Madison WI. Os níveis de identidade ou similaridade aqui referidos podem ser determinados, por exemplo, utilizando o programa Gap, com uma penalidade de hiato (Gap) de 12 e uma penalidade de comprimento de hiato de 4.
Podem ser produzidos variantes ou fragmentos de P21 utilizando técnicas padrão de ADN recombinante tais como mutagénese dirigida ao local, como será evidente para os peritos com base na tecnologia convencional das proteínas. Os fragmentos ou homólogos da proteína P21 têm que reter a função da Proteína p21 nativa, i.e. têm que ser um fragmento ou homólogo "funcional". A função que tem que ser retida é a capacidade de actuar como proteína supressora tumoral, e bloquear a formação do complexo cycD/CDK4, e portanto provocar a paragem em G1 de uma célula eucariota. Testes para a divisão e a viabilidade celulares são bem conhecidos na especialidade, por exemplo os ensaios CellTiter 96® e CytoTox 96® disponíveis de Promega Corp., Wisconsin EUA. A proteína P21 está associada a um factor de translocação, formando um conjugado. Como aqui se utiliza, o termo "conjugado" refere-se a uma molécula quimérica formada a 7 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ partir de um factor de translocação e uma proteína P21. 0 conjugado é portanto uma molécula híbrida que não se encontra junto na sua forma natural. A formação de um conjugado não reduz nem de outro modo afecta adversamente a capacidade da proteína P21 ou do factor de translocação funcionarem como se pretende.
Como aqui se utiliza, o termo "translocação" refere-se à entrega de uma proteína através de uma membrana celular. Será evidente para um perito na especialidade que é necessário um factor de translocação para entregar a proteína P21 a uma célula alvo. Como aqui se utiliza, o termo "factor de translocação" refere-se a qualquer porção que tem a capacidade de se translocalizar através de uma membrana celular, i.e. uma membrana celular externa. Quando a proteína P21 está associada ao factor de translocação num conjugado, a P21 é também translocalizada através da membrana celular. 0 factor de translocação será preferivelmente uma proteína. São conhecidas na especialidade várias proteínas com a capacidade de se translocalizarem através de membranas celulares, incluindo proteínas histona, a proteína VP22 do vírus herpes simplex e o domínio tat do HIV. A proteína tat do HIV-tipo I compreende 86 aminoácidos codificados por dois exões. Os primeiros 72 aminoácidos são codificados pelo exão 1 e exibem actividade de trans-activação completa. Conhece-se um grupo de resíduos de aminoácido básicos nesta região capaz de se translocalizar através de uma membrana celular. Este grupo está contido dentro dos resíduos de aminoácido 37-72.
Mais especificamente, os aminoácidos 49-58 são um factor de translocação como descrito por Vives et al., J. Biol. Chem: 272 (1997); 25: ppl6010-16017. Os aminoácidos 49-58 de TAT de HIV estão listados adiante, em SEQ ID NO:2:
SEQ ID NO:2: RKKRRQRRR
Estão descritos em W003/002598 motivos específicos de aminoácidos com a capacidade de se translocalizar. De acordo com a presente invenção, o homeodomínio da proteína antennapedia de Drosophila é utilizado como factor de translocação. Podem também ser utilizadas variantes e homólogos funcionais do homeodomínio de antennapedia, desde 8 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ que mantenham a capacidade de se translocalizar. É dada em WO-A-99/11809 uma descrição completa do factor de translocação homeodomínio antennapedia. 0 homeodomínio do gene Antp está apresentado em SEQ ID No. 3.
SEQ ID NO. 3: RKRGRQTYTR YQTLELEKEF HFNRYLTRRR RIEIAHALCL TERQIKIWFQ NRRMKWKKEN
Para evitar qualquer dúvida, a sequência de aminoácidos da proteína antennapedia de Drosophila contém um motivo de aproximadamente 60 aminoácidos, conhecido como o homeodomínio, que tem a capacidade de funcionar como factor de translocação. A proteína de comprimento completo, o homeodomínio ou qualquer homólogo ou fragmento (da proteína ou do homeodomínio) que mantenha a capacidade de se translocalizar, podem ser utilizados como factor de translocação. Um homólogo preferivelmente compreende uma região com um nível elevado (eg superior a 60%, preferivelmente superior a 70%, mais preferivelmente superior a 80% e o mais preferivelmente superior a 90%, e.g. 95% ou mais) de similaridade de sequência com o homeodomínio de antennapedia de Drosophila.
Embora o homeodomínio de Drosophila e a proteína antennapedia de comprimento completo sejam preferidos, um perito na especialidade perceberá que podem ser originários de qualquer organismo homólogos funcionais. Encontraram-se homólogos de antennapedia na maioria dos organismos pluricelulares e estão bem conservados. Por exemplo, os homeodomínios humano e de Drosophila diferem em apenas uma substituição conservativa de aminoácidos. A capacidade de uma sequência de ocorrência natural ou artificial se translocalizar através da membrana pode ser testada por métodos de rotina que são bem conhecidos na especialidade.
Foram relatadas na especialidade variantes do homeodomínio que retêm a capacidade de se translocalizarem através da membrana. Por exemplo, a EP-B-0 485 578 de CNRS divulga homeopéptidos compreendendo a sequência da hélice 3 de pAntp. W097/12912, também de CNRS, divulga a sequência verdadeira da hélice 3 de pAntp, e suas variantes. Em particular, diz-se que a hélice 3 possui a sequência: 9 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:4: Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
Diz-se que as variantes têm a sequência: SEQ ID NO. 5: Χ1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15-X16 ou SEQ ID NO. 6: X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1 em que cada X representa um cx-aminoácido, com X6 representando triptofano; o referido péptido compreendendo entre 6 e 10 aminoácidos hidrófobos.
Outras variantes estão divulgadas, por exemplo, em Gehring W (1987) Homeo Boxes in the Study of Development. Science 236 1245-1252 divulga-se um homeodomínio de 62 aminoácidos, i.e. com glu na posição 0 e lys na posição 61. Bloch-Gallego E et al. (1993) Antennapedia Homeobox Peptide Enhances Growth and Branching of Embryonic Chicken Motoneurons In Vitro. The Journal of Cell Biology 120(2) 485-492 divulga um mutante denominado pAntp40P2 que foi ainda capaz de se translocalizar através da membrana motoneuronal e atingir o núcleo. Neste mutante os resíduos de leucina e treonina nas posições 40 e 41 foram substituídos por dois resíduos de prolina. Le Roux et al. (1993) Neurotropic activity of the
Antennapedia homeodomain depends on its specific DNA-binding properties. Proc. Natl. Acad. Sei 90 9120-9124 divulgam dois mutantes pAntp 50A e pAntp 40P2 como mostrado na Figura 2 que retêm a capacidade de se translocalizarem através da membrana neuronal. Schutze-Redelmeier et al. (1996) supra divulgam que um segmento de 16 aminoácidos C-terminal (terceira hélice) foi utilizado para direccionar oligonucleótidos e oligopéptidos para o citoplasma e núcleos de cultura de células.
Prefere-se a utilização de um homeodomínio de cerca de 60 resíduos.
Prefere-se que a proteína P21 e o factor de translocação estejam ligados covalentemente. A ligação covalente pode ser 10 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ na forma de uma molécula ligante química. Mais preferivelmente, a proteína P21 e o factor de translocação são produzidos na forma de uma única proteína de fusão. Na proteína de fusão, a proteína P21 e o factor de translocação podem estar por qualquer ordem. Prefere-se que o factor de translocação esteja localizado na extremidade amino-terminal da proteína P21. Os métodos de produção de proteínas de fusão são bem conhecidos na especialidade, utilizando procedimentos padrão de ácido nucleico recombinante, como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory Press). São divulgados ácidos nucleicos que codificam uma proteína de fusão, como vectores de expressão compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão e pelo menos uma região promotora. O conjugado compreendendo a proteína P21 e o homeodomínio de antennapedia como factor de translocação está incluído numa composição adicionalmente contendo pelo menos um fármaco quimioterapêutico. O fármaco é um fármaco utilizado na terapia do cancro. Numa concretização preferida, o fármaco é por exemplo, cisplatina ou taxol. Contudo, podem também ser combinados com um conjugado de acordo com a invenção fármacos quimioterapêuticos que são utilizados na terapia do cancro, por exemplo fármacos anti-inflamatórios, anticorpos (incluindo anticorpos monoclonais), fármacos imunomoduladores, hormonas e antagonistas de hormonas, antibacterianos, antifúngicos e antivirais. São dados adiante exemplos não limitantes. (1) Fármacos Citotóxicos/Citostáticos: agentes alquilantes (eg. ciclofosfamida, melfalano, etc.), antibióticos citotóxicos (doxorubicina, epirubicina, bleomicina, mitomicina, etc.), antimetabolitos (metotrexato, capecitabina, gemcitabina, fluorouracilo, alcaloides de vinca e etoposido (vinblastina, vincristina, etc.), compostos de platina (carboplatina, cisplatina, oxaliplatina), taxanos (paclitaxel, docetaxel, etc.), inibidores da topoisomerase I (irinotecano, topotecano, etc.). (2) Modificadores da Resposta Imunitária: imunossupressores antiproliferativos, corticosteróides. (3) Imunomoduladores: interferões, interleucinas. (4)
Monoclonais: transtuzumab, rituximab, alemtuzumab. 11 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ (5) Fármacos antibacterianos: penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, tetraciclinas, macrólidos, aminoglicósidos, outros antibacterianos (cloranfenicol, ácido fusidico, vancomicina, etc.). (6) Hormonas: hormonas da tiróide, estrogénios, progesteronas, androgénios, e todos os seus antagonistas. (7) Outros: vitaminas, fármacos anti-inflamatórios não esteróides (eg. celecoxib, rofecoxib, etc.), vacinas, anti-soros, fármacos antifúngicos, fármacos antivirais e esteróides.
Uma composição farmacêutica contendo a componente activa pode estar em qualquer forma adequada. Prefere-se que o conjugado de proteína P21 esteja numa forma adequada para administração transdérmica ou intravenosa. Tampões, excipientes, diluentes etc. adequados, farmaceuticamente aceitáveis, podem também estar presentes, como será notado pelo perito. A composição pode estar numa forma destinada a administração directamente no tecido doente ou pode estar numa forma que seja indirectamente direccionada para o tecido doente. Níveis de dosagem de cerca de 0,1 mg a cerca de 25 mg por quilograma de peso corporal por dia são úteis no tratamento das condições acima indicadas (cerca de 8 mg a cerca de 2 g por paciente por dia). Por exemplo, níveis de dosagem de cerca de 0,25 a 12,5 mg do composto P21 por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 20 mg a cerca de 1 mg por paciente por dia) podem ser eficazes. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem unitária variará dependendo do hospedeiro a tratar e do modo de administração particular. As formas unitárias de dosagem conterão geralmente entre de cerca de 1 mg e cerca de 500 mg do ingrediente activo.
Entender-se-á, contudo, que o nível específico da dose para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de factores incluindo a actividade do composto específico empregue, da idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de 12 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ excreção, combinação de fármacos e a gravidade da doença particular em terapia.
Em adição, o composto P21 pode ser formulado para entregar no local da doença por meios mecânicos, ou para direccionamento ao local da doença através da utilização de tecnologias de direccionamento tais como lipossomas (com ou sem modificação química que lhes proporciona, com afinidade, o tecido), anticorpos, aptâmeros, lectinas ou ligandos químicos com afinidade para com aspectos do tecido doente que são menos abundantes ou não presentes em tecido normal. A invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes Exemplos.
Exemplo 1
Construíram-se clones de plasmídeos bacterianos para a expressão da proteína P21 sozinha ou na forma de uma fusão com o péptido de antennapedia. A expressão da fusão ANTP-P21 (a "proteína de fusão") foi máxima três horas após a indução, após o que se seguiu a purificação proteína sob condições desnaturantes com Cloridrato de Guanidínio e Ureia. Durante a renaturação e a redobragem, observou-se precipitação da proteína. Isto sugeriu que era necessário testar vários tampões. Tentaram-se cinco tampões; Tris-base 20 mM/NaCl 0,5 M/Tween-20 0,1%, pH 8 manteve a proteína em solução. A produção da proteína de fusão permitiu a realização de uma experiência de translocação celular, para testar a capacidade da proteína de fusão contendo antennapedia se translocalizar através de membranas biológicas. Utilizaram-se duas linhas celulares nesta experiência, ASPC1 e HeLa (ASPC1 -adenocarcinoma pancreático humano, HeLa - adenocarcinoma cervical humano). Incubou-se a proteína durante 10 e 60 min sobre células em várias diluições a 37°C. A translocação da proteína de fusão foi evidente em ambas as linhas celulares, mesmo após apenas dez minutos de incubação. A proteína P21 sozinha não pareceu translocalizar-se através das células. A internalização da proteína era ainda evidente após incubação a 4°C, sugerindo um mecanismo de translocação independente da energia não envolvendo endocitose clássica. 13 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
Exemplo 2 A expressão da proteína de fusão foi aumentada de escala para purificar material suficiente para realizar ensaios de citotoxicidade. Dialisou-se a proteína em solução de Cloridrato de Guanidínio em vez de Tris para impedir que precipitasse. Esperava-se que, quando assimilada por células, as dissulfureto-isomerases endocelulares e as chaperones resultassem numa proteína funcional. A linha celular de carcinoma ovariano SKOV-3 e a linha de osteossarcoma SAOS-2 foram crescidas em placas de ELISA de 96 poços em condições que se assemelham à situação no corpo humano (equipamento de cultura de tecidos). A proteína de fusão e a P21 sozinha foram dadas às células a 50 mg/ml durante 24 e 48 horas. Os controlos incluíram células não tratadas para originar o fundo de morte celular; células às quais apenas foi adicionado Cloridrato de Guanidínio; e células que foram totalmente lisadas com detergente de modo a originar 100% de morte celular. A experiência foi terminada a 24 e 48 horas e as placas foram avaliadas quanto a morte celular apoptótica. Os resultados indicaram que o tampão (Cloridrato de Guanidínio) utilizado era ele próprio citotóxico para as células após exposição durante um período de tempo prolongado. Este fundo de morte celular não permitiu nenhuma evidência de citotoxicidade devido à proteína de fusão. Portanto, após redobragem as proteínas foram dialisadas em tampão PBS, que se sabe não ser tóxico para as células. Qualquer material precipitado foi removido por centrifugação.
As proteínas foram então aplicadas às culturas celulares. Observou-se morte celular significativa em duas linhas celulares de cancro após administração da proteína de fusão como mostrado na Figura 1.
Realizaram-se experiências de optimização para as condições de administração celular. Testou-se a duração da administração, assim como a combinação deste agente citotóxico (fusão Antp-P21) com outros agentes que se sabe matarem células SKOV-3. Um agente utilizado nas experiências foi a 14 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ cisplatina. Este fármaco inibe a síntese de ADN através da produção de ligações intra-cadeia e inter-cadeias no ADN. A síntese de proteína e de ARN foi também inibida em menor extensão. Os resultados indicaram um efeito sinérgico entre os dois modos de terapia, e um efeito citotóxico surpreendentemente aumentado na presença de ambos em concentrações relativamente baixas, que deverão imitar a situação in vivo. 0 conjunto de dados que demonstra claramente a capacidade de morte da molécula Antp-P21, assim como o seu efeito sinérgico com o agente de morte cisplatina, estão apresentados na Figura 2. A proteína de fusão foi então testada em combinação com cisplatina e taxol. 0 taxol destrói o equilíbrio dinâmico no interior do sistema de microtúbulos e bloqueia as células na fase G2 tardia e na fase M do ciclo celular, inibindo a replicação celular. Os resultados indicam um efeito sinérgico entre os três modos de terapia, e um efeito citotóxico aumentado na presença dos fármacos juntamente com a proteína de fusão em concentrações relativamente baixas.
Os dados que demonstram a capacidade de morte da proteína de fusão juntamente com o seu efeito sinérgico com os outros agentes de morte estão apresentados na Figura 3. A proteína de fusão Antp-P21 resultou em morte celular aumentada quando incubada com os agentes citotóxicos cisplatina e taxol. Antp-P21, cisplatina e taxol actuam sinergicamente quando utilizados em combinação.
Exemplo 3
Testou-se a cinética e a biodistribuição de proteína antennapedia (sozinha) purificada, radiomarcada, em ratinhos isentos de tumores. Isto demonstra que a proteína se translocaliza através do sangue para todos os tecidos do corpo. É mostrado na Figura 4A um sumário dos resultados. A proteína antennapedia pareceu ter uma rápida depuração inicial, mas demorou mais de quinze horas a depurar completamente da circulação. Este comportamento é esperado das 15 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ proteínas carregadas positivamente. Este intervalo deverá permitir tempo suficiente para sair dos vasos sanguíneos e se acumular nos tecidos. Após dissecção e contagem de todos os órgãos e tecidos dos ratinhos, calcularam-se as razões órgão-para-sangue e a acumulação de proteína em vários órgãos; como mostrado na Figura 5A. A proteína não teve afinidade para nenhum tipo particular de tecido. Pareceu acumular-se em tecidos altamente vascularizados.
Testaram-se a cinética e a biodistribuição de proteína de fusão antennapedia-P21 purificada, radiomarcada, em ratinhos isentos de tumores. Os resultados estão mostrados nas Figuras 4B e 5B. A proteína de fusão pareceu ter uma rápida depuração inicial, mas demorou de dezassete horas para depurar completamente da circulação (Figura 4B) . Este comportamento assemelhava-se ao observado quando se testou a proteína antennapedia sozinha, e era esperado das proteínas carregadas positivamente. Esperava-se que este intervalo permitisse tempo suficiente para sair dos vasos sanguíneos e acumular-se nos tecidos. Após dissecção e contagem todos os órgãos e tecidos dos ratinhos, foi possível calcular as razões órgão-para-sangue e representar em gráfico a biodistribuição da proteína, como ilustrado na Figura 5B. A proteína de fusão não teve afinidade para nenhum tipo particular de tecido, como esperado. Pareceu acumular-se em tecidos altamente vascularizados. Realizaram-se experiências que nos permitiram localizar a proteína nos tecidos por coloração com anticorpos anti-proteína (anticorpo anti-HIS -Qiagen). Estes estudos imuno-histoquímicos foram realizados com secções de tecidos congelados.
Os resultados mostraram que a proteína de fusão se acumulou em órgãos principais, como indicado na Tabela 1, e foi encontrada na forma de uma molécula de comprimento completo. É provável que o comportamento da molécula permaneça essencialmente inalterado em ratinhos portadores de tumores, com a excepção de se acumular em grandes quantidades no tumor actual. 16 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
Tabela 1 ÓRGÃO COLORAÇÃO MÚSCULO + CÓLON + + INTEST. DELGADO + BAÇO + + FÍGADO + + CORAÇÃO + CÉREBRO - PULMÕES - RINS -
Foi então realizada uma experiência com animais portadores de tumores que indicaram o tempo óptimo de acumulação de proteína no tumor e portanto o tempo que demora para a proteína de fusão sair da circulação sanguínea e entrar nos tecidos vizinhos. Esta informação é desejável quando se projectam experiências que se destinam a envolver doses repetidas e o intervalo de tempo entre cada dose. A proteína de fusão radiomarcada foi administrada na forma de um dose única através da veia da cauda a ratinhos portadores de tumores e os tumores foram examinados em vários pontos temporais. Os resultados demonstraram que o tempo óptimo de localização tumoral foi de três horas após a administração. Após este período, a intensidade de coloração e portanto a quantidade de proteína diminuíram. Os resultados estão selectivamente mostrados nas tabelas seguintes:
Tabela 2 T=15 MIN SKOV-3 ratinho nu fêmea portador de tumor injectado com 25pg de proteína de fusão Antennapedia-P21 marcada com I125 através da veia da cauda.
Essencialmente nenhuma coloração observada. % de i.d./g tecido 3,2211 17 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
Tabela 3 Τ=1 hora SKOV-3 ratinho nu fêmea portador de tumor injectado com 25yg de proteína de fusão Antennapedia-P21 marcada com I125 através da veia da cauda.
Coloração difusa observada em todas as células. %i.d./g tecido 1,7389
Tabela 4 T=3 horas SKOV-3 ratinho nu fêmea portador de tumor injectado com 25yg de proteína de fusão Antennapedia-P21 marcada com I125 através da veia da cauda.
Observada localização nuclear. Este é o ponto temporal em que é observada máxima coloração. %i.d./g tecido 1,4930
Tabela 5 T=6 horas SKOV-3 ratinho nu fêmea portador de tumor injectado com 25pg de proteína de fusão Antennapedia-P21 1 o c marcada com I através da vera da cauda.
Intensidade de Coloração diminuída. A proteína de fusão é possivelmente degradada intracelularmente. %i.d./g tecido 1,1064
Foi então testada a dose máxima tolerada que pode ser administrada com segurança a ratinhos portadores de tumores. Testaram-se três concentrações diferentes da proteína de fusão, assim como controlos, tanto intravenosa como intratumoralmente. Os animais foram monitorizados quanto a sinais de perturbação e toxicidade, e registaram-se as medições do diâmetro do tumor, do peso dos ratinhos e das contagens de glóbulos brancos. A concentração de 2,5 mg/ml de proteína de fusão mostrou ser a mais elevada que podia ser utilizada sem efeitos de toxicidade de uma maneira repetitiva e foi portanto utilizada em estudos subsequentes.
Utilizaram-se xenoenxertos portadores de adenocarcinoma ovariano SKOV3. Os animais tratados com Antennapedia-P21 18 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ estavam em grandes grupos de 8 animais, e a experiência incluiu controlos, como 8 animais que receberam solução salina e 8 animais que receberam doses crescentes da proteína Antennapedia sozinha. Realizaram-se seis injecções numa base semanal. 0 dia zero mostrado na Figura 6 é o primeiro dia das injecções.
Os resultados indicaram que a proteína de fusão demonstrou um perfil de atraso do tumor máximo. Mostrou-se que a concentração de 2,5 mg/ml da proteína de fusão era a que demonstrava a eficácia máxima. Quando se analisaram adicionalmente os resultados, identificou-se um perfil de sobrevivência que suportou adicionalmente o modo de acção do nosso agente terapêutico. Quando se agruparam os animais por tamanho do tumor e se procuraram animais com tumores de partida menores separadamente de animais com tumores de partida maiores, notou-se que o benefício do tratamento em animais com tumores menores é maior do que em animais com tumores maiores. Mostrou-se que a penetração e o efeito terapêutico das proteínas são melhorados em tumores menores. A explicação subjacente a isto é que a pressão intersticial é maior no núcleo de grandes tumores e o ambiente é mais difícil de penetrar para moléculas que não alvo. Portanto, o benefício terapêutico foi maior em tumores menores com menor pressão intersticial.
Esta teoria é suportada pelos dados de Kaplan-Meier. A análise de todos os animais em conjunto dá um claro benefício de sobrevivência ao grupo que recebeu a proteína de fusão na sua concentração mais elevada como indicado na Figura 7.
Os fármacos quimioterapêuticos convencionais cisplatina e taxol foram adicionados ao protocolo terapêutico em doses padrão publicadas. In vitro, observou-se um efeito positivo. Os resultados indicaram um efeito sinérgico entre os três modos de terapia, e um efeito de retardamento do crescimento tumoral melhorado na presença dos fármacos juntamente com a proteína de fusão nas concentrações escolhidas, como indicado pela Figura 8. A curva de sobrevivência de Kaplan-Meier para os animais que receberam a proteína de fusão e quimioterapia é dada na 19 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
Figura 9. É evidente que o melhor beneficio de sobrevivência foi demonstrado pelos animais que receberam tanto a proteína de fusão como a quimioterapia suplementar.
Quando se comparam a curva de sobrevivência dos animais que receberam a proteína de fusão versus a curva dos animais que receberam a proteína de fusão mais a quimioterapia complementar, na Figura 10, é evidente que a adição de quimioterapia aumentou a percentagem de animais vivos em todos os tempos. Isto demonstrou que os resultados in vitro se correlacionavam bem com a situação que foi observada in vivo.
Exemplo 4
Após experiências com tumores SKO-V3, a proteína de fusão Antennapedia-P21 foi testada em ratinhos nus xenoenxertados com células de carcinoma do cólon RKO-E6. Estas células contêm um oncogene E6 de papilomavírus humano (HPV) estavelmente integrado sob o controlo do promotor de citomegalovírus (CMV). O oncogene E6 de HPV causa uma diminuição nos níveis e funções normais de p53, na medida em que a esta linha falta p53 funcional apreciável. A falta de p53, bloqueia a transactivação mediada por p53 a jusante de genes alvo, tais como a P21 inibidora de Cdk. A expressão de P21 resulta na inibição de fosforilação de Rb, e, deste modo, é bloqueada a expressão subsequente de genes dependentes de E2F. A linha celular RKO-Εβ tem sido frequentemente utilizada para investigar os efeitos da perda de p53 em parâmetros celulares tais como transcrição mediada por p53 e apoptose. Nas experiências aqui descritas, utilizou-se para estudar os efeitos da administração de P21 a células, portanto ultrapassando a necessidade de activação de p53. A apoptose é medida na forma de morte celular tumoral e redução do tamanho do tumor.
Xenoenxertaram-se ratinhos nus com tumores de RKO-E6, distribuíram-se aleatoriamente por quatro grupos e administraram-se-lhes um dos seguintes por injecção na veia da cauda: 20 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ i. Solução Tamponada com Fosfato (uma vez por semana durante 5 semanas) ii. 2,5 mg/ml de Fusão Antennapedia-P21 (uma vez por semana durante 5 semanas) iii. 2 mg de 5-fluorouracilo/1 mg de Leucovorina, 0,2 mg de Oxaliplatina (uma vez por semana durante 5 semanas) iv. 2,5 mg/ml de Fusão Antennapedia-P21 + 2 mg de 5-fluorouracilo/1 mg de Leucovorina, 0,2 mg de Oxaliplatina (uma vez por semana durante 5 semanas)
Os fármacos quimioterapêuticos foram administrados em doses previamente documentadas para causar reduções mensuráveis do tumor. A regressão do tumor foi avaliada, o que por sua vez foi traduzido num beneficio de sobrevivência.
Os resultados estão apresentados na Figura 11. O tratamento com PBS, proteína de fusão ou quimioterapia sozinha teve pouco efeito sobre a sobrevivência global, com uma sobrevivência mediana na gama de 30 dias para todos estes grupos. Observou-se uma melhoria significativa na sobrevivência em animais tratados com a Fusão em combinação com Quimioterapia, com uma sobrevivência mediana de 45 dias, demonstrando interacções sinérgicas.
Como uma maioria de pacientes que sucumbe ao cancro colorrectal fazem-no perante uma doença metastática sistémica secundária, são necessárias estratégias terapêuticas que possam ter um efeito sobre a doença metastática para terem impacto significativo neste cancro. Espera-se que a proteína de fusão Antennapedia-P21 tenha este efeito pois observou-se anteriormente que a sua administração resulta na sua acumulação em vários tecidos, e porque se mostrou que a sua aplicação não está limitada por uma toxicidade dependente da dose. 21 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Trojan Technologies Limited <120> Conjugado Compreendendo Proteína P21 para o tratamento do Cancro <130> JWJ01161WO <150> <151> GB0507598.1 2005-04-14 <160> 6 <170> Patentln versão 3.3 <210> <211 > <212> <213> 1 163 PRT Homo sapiens <400> 1
Ser Glu Pro Ala Gly Asp Vai Arg Gin Asn Pro Cys Gly Ser Lys Ala 1 5 10 15 Cys Arg Arg Leu Phe Gly Pro Vai Asp Ser Glu Gin Leu Ser Arg Asp 20 25 30 Cys Asp Ala Leu Met Ala Gly Cys Ile Gin Glu Ala Arg Glu Arg Trp 35 40 45 Asn Phe Asp Phe Vai Thr Glu Thr Pro Leu Glu Gly Asp Phe Ala Trp 50 55 60 Glu Arg Vai Arg Gly Leu Gly Leu Pro Lys Leu Tyr Leu Pro Thr Gly 65 70 75 80 Pro Arg Arg Gly Arg Asp Glu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Pro Gly Thr 85 90 95 Ser Pro Ala Leu Leu Gin Gly Thr Ala Glu Glu Asp His Vai Asp Leu 100 105 110 Ser Leu Ser Cys Thr Leu Vai Pro Arg Ser Gly Glu Gin Ala Glu Gly 115 120 125 Ser Pro Gly Gly Pro Gly Asp Ser Gin Gly Arg Lys Arg Arg Gin Thr 130 135 140 Ser Met Thr Asp Phe Tyr His Ser Lys Arg Arg Leu Ile Phe Ser Lys 145 150 155 160
Arg Lys Pro 22 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ
<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana <400> 2
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5
<210> 3 <211> 60 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 3
Arg Lys Arg Gly Arg Gin Thr Tyr Thr Arg Tyr Gin Thr Leu Glu Leu 15 10 15
Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile 20 25 30
Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gin Ile Lys Ile Trp 35 40 45
Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn 50 55 60
<210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 4
Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante da Hélice 3 de pAntp; entre 6 e 10 dos resíduos aminoácido são hidrófobos. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <220> <221> misc_feature <222> (7)..(16) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural 23 ΕΡ 1 869 185/ΡΤ <400> 5
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <2 2 0 > <223> Variante da Hélice 3 de pAntp; entre 6 e 10 dos resíduos de aminoácido são hidrófobos. <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (7)..(16) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 6
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
Lisboa, 2010-05-24

Claims (4)

  1. ΕΡ 1 869 185/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo: i) um conjugado compreendendo (a) uma primeira região compreendendo a proteína P21 possuindo a sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID N0:1, ou um seu homólogo possuindo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO:l e possuindo a função da proteína P21 nativa; e (b) uma segunda região compreendendo o homeodomínio de antennapedia possuindo a sequência de aminoácidos como definida em SEQ ID NO:3; e ii) um fármaco quimioterapêutico.
  2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o conjugado está na forma de uma proteína de fusão.
  3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 para utilização como medicamento.
  4. 4. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro. Lisboa, 2010-05-24
PT06726802T 2005-04-14 2006-04-18 Conjugado compreendendo proteína p21 para o tratamento do cancro PT1869185E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0507598A GB0507598D0 (en) 2005-04-14 2005-04-14 Composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1869185E true PT1869185E (pt) 2010-05-28

Family

ID=34611144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT06726802T PT1869185E (pt) 2005-04-14 2006-04-18 Conjugado compreendendo proteína p21 para o tratamento do cancro

Country Status (16)

Country Link
US (3) US20080287357A1 (pt)
EP (1) EP1869185B1 (pt)
JP (1) JP4955654B2 (pt)
KR (1) KR20080016798A (pt)
CN (1) CN101194017B (pt)
AT (1) ATE458819T1 (pt)
AU (1) AU2006235742B2 (pt)
CA (1) CA2604536A1 (pt)
DE (1) DE602006012463D1 (pt)
DK (1) DK1869185T3 (pt)
ES (1) ES2343972T3 (pt)
GB (1) GB0507598D0 (pt)
PL (1) PL1869185T3 (pt)
PT (1) PT1869185E (pt)
SI (1) SI1869185T1 (pt)
WO (1) WO2006109092A1 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3007729B1 (en) * 2013-06-11 2019-07-24 Portage Pharmaceuticals Ltd. Structure, manufacturing and uses of human-derived cell-permeable peptides conjugated with specific biologically active cargo peptides
MA45491A (fr) * 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
CN110511273B (zh) * 2019-07-12 2021-06-01 福州市皮肤病防治院 一种细胞穿膜多肽的制备方法及其应用
CN111471096B (zh) * 2020-01-15 2022-02-18 上海众启生物科技有限公司 用于阿尔茨海默症自身抗体检测的含有adarb1蛋白片段组合物
GB202019864D0 (en) 2020-12-16 2021-01-27 Anastasis Biotec Ltd Improved cell-penetrating peptides and fusion proteins
CN112961865B (zh) * 2021-02-22 2023-06-02 广西大学 一种利用基因编辑鸡生物反应器表达的重组曲妥珠单抗及应用
WO2023104874A2 (en) * 2021-12-08 2023-06-15 Ferring B.V. Method

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6372249B1 (en) * 1991-12-16 2002-04-16 Baylor College Of Medicine Senscent cell-derived inhibitors of DNA synthesis
US6495526B2 (en) * 1996-01-23 2002-12-17 Gpc Biotech, Inc. Inhibitors of cell-cycle progression and uses related thereto
IL145067A0 (en) * 1999-03-01 2002-06-30 Cell Genesys Inc Nucleic acid composition containing a first sequence encoding a chimeric cyclin-dependent kinase protein and a second sequence encoding an adenovirus e4 protein
GB0003284D0 (en) * 2000-02-15 2000-04-05 Secr Defence Brit Anti-viral therapy
US20040110928A1 (en) * 2000-04-12 2004-06-10 Andrea Crisanti Peptide conjugates for drug delivery

Also Published As

Publication number Publication date
CA2604536A1 (en) 2006-10-19
KR20080016798A (ko) 2008-02-22
DK1869185T3 (da) 2010-06-21
US20080287357A1 (en) 2008-11-20
US10259852B2 (en) 2019-04-16
AU2006235742B2 (en) 2011-07-14
SI1869185T1 (sl) 2010-09-30
WO2006109092A1 (en) 2006-10-19
JP2008535512A (ja) 2008-09-04
GB0507598D0 (en) 2005-05-18
ATE458819T1 (de) 2010-03-15
DE602006012463D1 (de) 2010-04-08
US20110021441A1 (en) 2011-01-27
US9145446B2 (en) 2015-09-29
JP4955654B2 (ja) 2012-06-20
EP1869185B1 (en) 2010-02-24
US20160068582A1 (en) 2016-03-10
EP1869185A1 (en) 2007-12-26
PL1869185T3 (pl) 2010-10-29
AU2006235742A1 (en) 2006-10-19
CN101194017A (zh) 2008-06-04
CN101194017B (zh) 2013-08-28
ES2343972T3 (es) 2010-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10259852B2 (en) Conjugate comprising P21 protein for the treatment of cancer
ES2439950T3 (es) Péptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transducción de señales de la JNK
JP6030622B2 (ja) 癌の阻害剤としてのｍｕｃ−１細胞質ドメインペプチド
CN109563151A (zh) 用于治疗癌症的方法和组合物
CN101389651A (zh) 受体特异性肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(trail)的突变体
WO2016130966A1 (en) Compositions and methods for regulating blood pressure
US9314497B2 (en) E2F as a target of hormone refractory prostate cancer
Nakayama et al. Cellular internalization of fibroblast growth factor-12 exerts radioprotective effects on intestinal radiation damage independently of FGFR signaling
CN102993314B (zh) 一种抗肿瘤融合蛋白及其制备方法和用途
US8703503B2 (en) Methods and compositions for inhibition of BCL6 repression
US20190030126A1 (en) Inhibitors of the Interaction BCL-2 L10 / IP3 Receptors
ES2742856T3 (es) Composiciones farmacéuticas y procedimientos para el tratamiento y prevención del cáncer metastático
Kotula et al. Specific Accumulation of a Cell Penetrating Peptide Targeting AAC-11 in Melanoma Tumors
BR112012030668B1 (pt) Peptídeos, composição farmacêutica, e combinação farmacêutica