ES2343972T3 - Conjugado que comprende la proteina p21 para el tratamiento del cancer. - Google Patents
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Abstract
Composición, que comprende: i) un conjugado que comprende (a) un primera zona que comprende la proteína P21 que presenta la secuencia de aminoácidos tal como se define en la SEC. ID. nº 1, o un homólogo de la misma que presenta por lo menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº 1 y que tiene la función de la proteína natural P21; y (b) una segunda zona que comprende homeodominio de antennapedia que presenta la secuencia de aminoácidos definida en la SEC. ID. nº 3; y ii) un fármaco quimioterapéutico.
Description
Conjugado que comprende la proteína P21 para el
tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere a conjugados de
la proteína P21 en composiciones que comprenden un fármaco
quimioterapéutico. Estas composiciones resultan particularmente
útiles en el tratamiento del cáncer.
El cáncer es una de las principales causas de
mortalidad humana y ha sido tema de intensa investigación. Es bien
conocido que casi todos los tumores malignos proceden de la
transformación de una sola célula en estado inmortal donde la
célula ha perdido la capacidad para controlar la proliferación.
La proliferación incontrolada procede de una
disfunción en el control del ciclo celular que, en los eucariotas,
está controlada en gran medida por las ciclinas y las cinasas
dependientes de la ciclina (CDK). Un mecanismo complejo de control
del estado de fosforilación de las ciclinas y las CDK controla si
los complejos cliclina/CDK son capaces de conducir la célula a la
fase siguiente del ciclo. La importancia del estado de fosforilación
de los complejos ciclina/CDK está reflejada por el hecho de que un
gran número de cánceres conlleva mutaciones en las proteínas P53 y
P21 supresoras del tumor, que son componentes clave en el control de
la fosforilación de cliclina/CDK y en la formación del complejo. En
particular, P21 bloquea la formación del complejo cycD/cdk4 y
origina la interrupción de G1. Los estudios que detallan la proteína
P21 y su función biológica pueden encontrarse en O'Reilly MA.,
Antioxid. Redox Signal. Ene.-Feb. 2005;
7(1-2):108-18 y Liu G &
Lozano G., Cancer Cell, Feb. 2005;
7(2):113-4.
El tratamiento del cáncer conlleva normalmente
una combinación de procedimientos quirúrgicos, radioterapia y
quimioterapia (incluyendo inmunoterapia). A pesar de los
significativos avances en las terapias del cáncer en los últimos
años, continúa existiendo la necesidad constante de desarrollar
terapias mejoradas. En el mejor de los casos, una terapia para el
cáncer se dirigirá específicamente y destruirá solamente las células
cancerosas.
Un problema adicional que necesita ser estudiado
es la resistencia al fármaco resultante de la quimioterapia. La
administración continuada de un fármaco citotóxico puede producir un
tumor, que era inicialmente sensible al fármaco, para volverse cada
vez más resistente de modo que el fármaco pierde su eficacia
terapéutica. Por consiguiente, se necesitan también procedimientos
para mejorar la sensibilidad de las células cancerosas a los
fármacos.
El documento US 2003133971 de JR. Smith et
al. describe un liposoma que comprende la proteína
SDI-1 o un ácido nucleico que la codifica, para
inhibir la proliferación celular, por ejemplo el cáncer (por ejemplo
párrafo 185).
El documento de Bonfanti M. et al. (1997)
Cancer Research vol. 57 págs. 1442-1446
describe la inhibición del crecimiento de la célula tumoral por las
proteínas de fusión constituidas por una secuencia peptídica de la
proteína p21 y de una secuencia de transposición procedente del
homeodominio de Antennapedia.
El documento US 2002068706 de Gyuris J. et
al. describe proteínas de fusión constituidas por un inhibidor
de CDK y un factor de transposición, y su utilización en el
tratamiento anticanceroso. De manera notable, reivindica la fusión
de p21 a una secuencia que favorece la transcitosis (reivindicación
26), en la que la proteína que favorece la transcitosis puede
proceder de la proteína de Antennapedia (reivindicación 43).
La patente US nº 6.521.602 describe ácidos
nucleicos que expresan el híbrido CDKI segregable e interiorizable
(es decir una fusión de un inhibidor CDK de CIP, un inhibidor CDK de
INK4 y un dominio de transducción de la proteína) y describe la
acción sinérgica con la proteína E4 adenovírica en la inducción de
la apoptosis de células neoplásicas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que se observa un efecto sinérgico cuando la
proteína P21 se administra junto con por lo menos un fármaco
quimioterapéutico.
Según un primer aspecto, la invención
proporciona una composición que comprende:
- i)
- un conjugado que comprende
- (a)
- un primera zona que comprende la proteína P21 que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se define en la SEC. ID. nº 1, o un homólogo de la misma que presenta por lo menos 60% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº 1 y que tiene la función de la proteína natural P21; y
- (b)
- una segunda zona que comprende homeodominio de antennapedia que presenta la secuencia de aminoácidos definida en la SEC. ID. nº 3; y
- ii)
- un fármaco quimioterapéutico.
En una forma de realización preferida, el
conjugado está en forma de una proteína de fusión.
En un aspecto adicional, dicha composición está
destinada a su utilización como medicamento.
Todavía en un aspecto adicional, la invención
proporciona la utilización de dicha composición para la preparación
de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.
La presente invención se describe haciendo
referencia a los siguientes dibujos, en los que:
La Figura 1 ilustra la citotoxicidad de la
proteína de fusión antennapedia/P21 administrada a la estirpe
celular SKOV-3 del carcinoma de ovario y a la
estirpe SAOS-2 del osteosarcoma, que se cultivaron
en placas ELISA de 96 pocillos en condiciones que se asemejan a la
situación en el cuerpo humano;
la Figura 2 ilustra la citotoxicidad de la
proteína de fusión antennapedia/P21 y su efecto sinérgico con
cisplatino y las células SKOV-3;
la Figura 3 ilustra la citotoxicidad de la
proteína de fusión antennapedia/P21 en combinación con cisplatino y
taxol, en células SKOV-3, indicando que la fusión
antennapedia/P21, cisplatino y taxol actúan sinérgicamente cuando
se utilizan en combinación;
la Figura 4 ilustra la depuración en la sangre
de la proteína de antennapedia purificada y radiomarcada (4A) y la
proteína de fusión antennapedia-P21 (4B) en ratones
sin tumor;
la Figura 5 ilustra las relaciones de órgano a
sangre y la acumulación de proteína en varios órganos, para la
proteína antennapedia (5A) y la proteína de fusión
antennapedia-P21 (5B);
la Figura 6 ilustra la reducción en el
crecimiento de tumores utilizando la proteína de fusión
antennapedia/P21;
la Figura 7 es una curva de supervivencia
Kaplan-Meyer que indica que la supervivencia de
ratones es mayor cuando reciben la proteína de fusión
antennapedia/P21 a su mayor concentración;
la Figura 8 demuestra un efecto sinérgico in
vivo cuando se utiliza la proteína de fusión antennapedia/P21,
taxol y cisplatino;
la Figura 9 ilustra la curva de supervivencia
Kaplan-Meyer para los ratones que reciben la
proteína de fusión antennapedia/P21 y quimioterapia, es evidente
que la mejor ganancia de supervivencia la demuestran los animales
que reciben tanto la proteína de fusión como quimioterapia
complementaria;
la Figura 10 ilustra las curvas de supervivencia
Kaplan-Meyer para los ratones que reciben la fusión
antennapedia/P21 y los animales que reciben además cisplatino y
taxol; y
la Figura 11 presenta las curvas de
supervivencia Kaplan-Meyer para los ratones que
reciben la fusión de antennapedia/P21 y un producto
quimio-terapéutico adicional.
La invención utiliza un conjugado de la proteína
P21 como agente terapéutico en una composición que comprende un
fármaco terapéutico. Cuando se utiliza en combinación con un fármaco
quimioterapéutico, se observa una sinergia sorprendente. La
proteína P21 está unida a un factor de transposición, para permitir
que la proteína P21 se introduzca en una célula diana.
Antes del presente descubrimiento, no se
apreciaba que P21 podía utilizarse extensamente en la terapia del
cáncer. La mayoría de los cánceres proceden de mutaciones en el gen
P53, lo que es por consiguiente obvio, y lo más favorecido, el
objetivo cuando se diseñan productos terapéuticos para el cáncer. La
proteína P21, que funciona además abajo de la cascada apoptósica,
no se ha considerado un agente terapéutico. La presente exposición
deriva la P53 y permite la administración directa de P21 activa,
para el tratamiento del cáncer.
La administración de P21 y un fármaco
quimioterapéutico proporciona una mejora sorprendente en la terapia
anticancerosa.
Tal como se utiliza la presente memoria, el
termino "proteína" se refiere a una molécula polimérica que
comprende una mayoría de restos de aminoácidos unidos mediante un
enlace peptídico, tal como apreciará un experto en la materia. Los
péptidos y polipéptidos están comprendidos en el término
"proteína".
La proteína P21 humana está definida en la
presente memoria como SEC. ID. nº 1.
La secuencia de P21 humana anotada puede
encontrarse en la base de datos SWISSPROT con el número de registro
primario P38936 (denominación de entrada CDN1A _HUMAN). Aunque se
prefiere la secuencia humana (SEC. ID. nº 1), una proteína P21 de
alguna especie puede utilizarse según la invención, por ejemplo la
proteína de Mus musculus (número de registro primario P39689
de SWISSPROT) o la proteína de Felis silvestris catus (gato)
(número de registro primario 019002 en SWISSPROT). Se describe
también un polinucleótido que codifica una proteína
P21.
P21.
Se describen además las variantes funcionales
(es decir homólogas) y los fragmentos de la proteína humana P21
(SEC. ID. nº 1). Las proteínas con elevadas concentraciones (por
ejemplo superiores al 60%, preferentemente superiores al 70%, más
preferentemente superiores al 80% y aún más preferentemente
superiores al 90%, por ejemplo superiores al 95%) de identidad de
secuencia a SEC. ID. nº 1 están comprendidas dentro del alcance del
presente descubrimiento. El término "identidad" es conocido en
la técnica. El término se refiere a una comparación entre las
secuencias de aminoácidos, y tiene en cuenta los aminoácidos
idénticos en las posiciones correspondientes. Similitud entre
secuencias de polipéptidos indica similitud funcional además de
similitud de secuencia.
Los niveles de identidad entre las secuencias de
aminoácidos pueden calcularse utilizando procedimientos conocidos.
Los procedimientos informáticos disponibles al público para
determinar la identidad o similitud incluyen los programas BLASTP,
BLASTN y FASTA, el programa BLASTX disponible en NCBI, y el programa
Gap del Genetics Computer Group, Madison WI. Los niveles de
identidad o similitud referidos en la presente memoria pueden
determinarse, por ejemplo, utilizando el programa Gap, con una
penalización por hueco de 12 y una penalización por longitud del
hueco de 4.
Pueden producirse variantes o fragmentos de P21
utilizando técnicas normalizadas de ADN recombinante tal como la
mutagénesis dirigida al sitio, como será evidente para una persona
cualificada, basadas en la tecnología convencional de proteínas.
Los fragmentos u homólogos de la proteína P21 deben conservar la
función de la proteína P21 natural, es decir deben ser un fragmento
u homólogo "funcional". La función que debe conservarse es la
capacidad para actuar como proteína supresora del tumor, y bloquear
la formación del complejo cycD/CDK4, y por consiguiente originar la
interrupción G1 de una célula eucariótica. Las pruebas para la
división celular y la viabilidad son bien conocidas en la técnica,
por ejemplo, los ensayos CellTiter 96® y CytoTox 96® disponibles
Promega Corp., Wisconsin
EE.UU.
EE.UU.
La proteína P21 está asociada a un factor de
transposición, formando un conjugado. Tal como se utiliza en la
presente memoria, el término "conjugado" se refiere a una
molécula híbrida formada a partir de un factor de transposición y
una proteína de P21. El conjugado es, por consiguiente, una molécula
híbrida no encontrada a la vez en su forma natural. La formación de
un conjugado no reduce ni afecta desfavorablemente la capacidad de
la proteína P21 o del factor de transposición para funcionar tal
como se pretende.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "transposición" se refiere a la administración de una
proteína a través de una membrana celular. Para un experto en la
materia, es evidente que se necesita un factor de transposición
para administrar la P21 a una célula diana. Tal como se utiliza en
la presente memoria, la expresión "factor de transposición" se
refiere a cualquier resto que tenga la capacidad de traspasar una
membrana celular, es decir una membrana celular externa. Cuando la
proteína P21 está asociada al factor de transposición en un
conjugado, P21 traspasa también la membrana celular.
El factor de transposición preferentemente será
una proteína. Numerosas proteínas con capacidad de traspasar las
membranas celulares son conocidas en la técnica, incluyendo las
proteínas histonas, la proteína VP22 del virus del herpes simple y
el dominio tat del VIH. La proteína tat del tipo I del VIH comprende
86 aminoácidos codificados por dos exones. Los primeros 72
aminoácidos son codificados por el exón 1 y presentan la actividad
transactivadora completa. Un grupo de restos de aminoácidos básicos
en está zona son conocidos por ser capaces de traspasar una
membrana celular. Este grupo está contenido en los restos de
aminoácidos 37-72.
\newpage
Más específicamente, los aminoácidos
49-58 son un factor de transposición tal como da a
conocer Vives et al., J. Biol. Chem.: 272 (1997); 25:
págs. 16010-16017.
Los aminoácidos 49-58 de tat del
VIH se numeran a continuación, como SEC. ID. nº 2:
-
200
Los motivos de aminoácidos específicos con
capacidad de transponer están descritos en el documento WO
03/
002598. Según la presente invención, el homeodominio de la proteína antennapedia de Drosophila se utiliza como factor de transposición. Pueden utilizarse también variantes y homólogos funcionales del homeodominio de antennapedia, con la condición de que mantengan la capacidad para transponerse. Una descripción completa del factor de transposición del homeodominio de antennapedia se da en el documento WO-A-99/11809. El homeodominio del gen Antp se presenta en la SEC. ID. nº 3.
002598. Según la presente invención, el homeodominio de la proteína antennapedia de Drosophila se utiliza como factor de transposición. Pueden utilizarse también variantes y homólogos funcionales del homeodominio de antennapedia, con la condición de que mantengan la capacidad para transponerse. Una descripción completa del factor de transposición del homeodominio de antennapedia se da en el documento WO-A-99/11809. El homeodominio del gen Antp se presenta en la SEC. ID. nº 3.
Para evitar dudas, la secuencia de aminoácidos
de la proteína antennapedia de Drodophila contiene un motivo
de aproximadamente 60 aminoácidos, conocido como el homeodominio que
tiene capacidad para funcionar como factor de transposición. La
proteína completa, el homeodominio o cualquier homólogo o fragmento
(de la proteína o del homeodominio) que mantiene capacidad de
transponer, puede utilizarse como factor de transposición. Un
homólogo preferentemente comprende una zona con un gran nivel (por
ejemplo superior al 60%, preferentemente superior al 70%, más
preferentemente mayor del 80% y aún más preferentemente superior al
90%, por ejemplo 95% o más) de similitud de secuencia con el
homeodominio antennapedia de Drosophila.
Aunque se prefieren el homeodominio de
Drosophila y la proteína completa antennapedia, un experto en
la materia reconocerá que los homólogos funcionales pueden
originarse en cualquier organismo. Los homólogos de antennapedia se
han encontrado en la mayoría de los organismos multicelulares y
están bien conservados.
Por ejemplo, los homeodominios humano y de
Drosophila se diferencian solamente en una sustitución
conservadora de aminoácidos. La capacidad de una secuencia natural
o artificial para transponer la membrana puede probarse por
procedimientos de rutina que son bien conocidos en la técnica.
Las variantes del homeodominio que conservan
capacidad de traspasar la membrana han sido descritas en la materia.
Por ejemplo, el documento
EP-B-0.485.578 de CNRS da a conocer
homeopéptidos que comprenden la secuencia de la hélice 3 de
pAntp.
El documento WO 97/12912 también de CNRS da a
conocer la secuencia real de la hélice 3 de pAntp, y variantes de
la misma. En particular, se dice que la hélice 3 posee la
secuencia:
-
400
Se dice que las variantes presentan la
secuencia:
en las que cada X representa un
\alpha-aminoácido, X6 representando triptofano;
comprendiendo dicho péptido entre 6 y 10 aminoácidos
hidrófobos.
Otras variantes se describen, por ejemplo, en
Gehring W. (1987) Homeo Boxes in the Study of Devolopment.
Science 236 1245-1252 da a conocer un
homeodominio de 62 aminoácidos, es decir glu en la posición 0 y lys
en la posición 61. Bloch-Gallego E. et al.
(1993) Antennapedia Homeobox Peptide Enhances Growth and Branching
of Embryonic Chicken Motoneurons In Vitro. The Journal of Cell
Biology 120(2) 485-492 da a conocer un
mutante denominado pAntp40P2 que era todavía capaz de traspasar la
membrana de la motoneurona y alcanzar el núcleo. En este mutante,
los restos de leucina y treonina en las posiciones de 40 y 41 fueron
sustituidos por dos restos de prolina. Le Roux et al. (1993)
Neurotropic activity of the Antennapedia homeodomain depends on its
specific DNA-binding properties. Proc. Natl.
Acad. Sci. 90 9120-9124 da a conocer dos
mutantes pAntp 50A y pAntp 40P2, tal como se muestra en la Figura 2
que conservan capacidad para traspasar la membrana neuronal.
Schtze-Redelmeier et al. (1996)
anteriormente dan a conocer que se ha utilizado un segmento del
terminal C (tercera hélice) de 16 aminoácidos para dirigir
oligonucliótidos y oligopéptidos al citoplasma y núcleos del cultivo
de células.
Se prefiere utilizar un homeodominio de
aproximadamente 60 restos.
Se prefiere que la proteína P21 y el factor de
transposición estén unidos por enlace covalente. El enlace
covalente puede ser en forma de una molécula química de enlace. Más
preferentemente, la proteína P21 y el factor de transposición son
producidos como una sola proteína de fusión. En la proteína de
fusión, la proteína P21 y el factor de transposición puede estar en
cualquier orden. Es preferible que el factor de transposición esté
colocado en el extremo del terminal amino de la proteína P21. Los
procedimientos de producción de proteínas son muy conocidos en la
técnica, utilizando procedimientos convencionales de ácido nucleico
recombinante, tal como se describe en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour
Laboratory Press). Los ácidos nucleicos que codifican una proteína
de fusión se dan a conocer, como son los vectores de expresión que
comprenden el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión y
por lo menos una zona activadora.
El conjugado que comprende la proteína P21 y el
homeodominio de antennapedia como factor de transposición está
incluido en una composición que contiene además un fármaco
quimioterapéutico. El fármaco es el utilizado en la terapia del
cáncer. En una fórmula de realización preferida, el fármaco es
cisplatino o taxol. Sin embargo, otros fármacos quimioterapéuticos
que se utilizan en la terapia del cáncer pueden combinarse también
con un conjugado según la invención, por ejemplo fármacos
antinflamatorios, anticuerpos (incluyendo los anticuerpos
monoclonales), fármacos inmunomoduladores, hormonas y antagonistas
hormonales, antibacterianos, antimicóticos y antivíricos. A
continuación, se proporcionan ejemplos no limitativos.
- (1)
- \underline{Fármacos \ citotóxicos/citostáticos}: agentes de alquilacion (por ejemplo ciclofosfamida, melfalán, etc.), antibióticos citotóxicos (doxorrubicina, epirrubicina, bleomicina, mitomicina, etc.) antimetabolitos (metotrexato, capecitabina, gemcitabina, fluoracilo, alcaloides de las vincas y etopósido (vinblastina, vincristina, etc.), compuestos de platino (carboplatino, cisplatino, oxaliplatino), taxanos (paclitaxel, docetaxel, etc.) inhibidores de topoisomerasa I (irinotecán, topotecán, etc.).
- (2)
- \underline{Modificadores \ de \ la \ respuesta \ inmunitaria}: inmunosupresores antiproliferantes, corticosteroides.
- (3)
- \underline{Inmunomoduladores}: interferones, interleucinas.
- (4)
- \underline{Monoclonales}: transtuzumab, rituximab, alemtuzumab.
- (5)
- \underline{Fármacos \ antibacterianos}: penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, tetraciclinas, macrólidos, aminoglucósidos, otros antibacterianos (cloranfelicol, ácido fusídico, vancomicina, etc.).
- (6)
- \underline{Hormonas}: hormonas tiroideas, estrógenos, progesterona, andrógenos y todos sus antagonistas.
- (7)
- \underline{Otros}: vitaminas, fármacos antinflamatorios no esteroideos (por ejemplo celecoxib, rofecoxib, etc), vacunas, antisueros, fármacos antimicóticos, fármacos antivíricos y esteroides.
Una composición farmacéutica que contiene el
componente activo puede estar en cualquier forma adecuada. Se
prefiere que el conjugado de la proteína P21 esté en una forma
adecuada para la administración transdérmica o intravenosa. Los
tampones, excipientes, diluyentes, etc. adecuados farmacéuticamente
aceptables pueden estar también presentes, tal como apreciará el
experto en la materia. La composición puede estar en una forma
deseada para la administración directa al tejido enfermo o puede
estar en una forma que se dirige indirectamente al tejido
enfermo.
La posología del orden de aproximadamente 0,1 mg
a 25 mg por kilogramo de peso corporal al día son útiles en
tratamiento de las enfermedades indicadas anteriormente
(aproximadamente 8 mg a 2 g. por paciente al día). Por ejemplo, las
concentraciones de aproximadamente 0,25 a 12,5 mg del compuesto P21
por kilogramo de peso corporal al día (aproximadamente 20 mg a 1 mg
por paciente al día) pueden ser eficaces.
La cantidad de ingrediente activo que puede
combinarse con los materiales del vehículo para producir una única
forma farmacéutica variará dependiendo del hospedador que va a
tratarse y del modo específico de administración. Las formas
farmacéuticas unitarias contendrán generalmente entre
aproximadamente 1 mg y 500 mg de ingrediente activo.
Debe sobrentenderse, sin embargo, que la
concentración de la dosis específica para cualquier paciente
concreto dependerá de varios factores incluyendo la actividad del
compuesto especifico empleado, la edad, el peso corporal, la salud
general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la cantidad
de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la
enfermedad específica que experimenta la terapia.
Además el compuesto P21 puede formularse para el
suministro a la zona de la enfermedad por unos medios mecánicos, o
para dirigirlo a la zona de la enfermedad mediante la utilización de
tecnologías de reconocimiento generalizado tales como liposomas
(con o sin modificación química que les proporciona afinidad para el
tejido enfermo), anticuerpos, aptámeros, lectinas o ligandos
químicos con afinidad por aspectos del tejido enfermo que son menos
abundantes o no están presentes en el tejido normal.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se describe con mayor detalle
mediante los siguientes Ejemplos.
Se construyeron clones de plásmido bacteriano
para la expresión de la proteína P21 sola o como fusión al péptido
antennapedia. La expresión de la fusión ANTP-P21
("proteína de fusión") fue máxima tres horas después de la
inducción, tras la cual siguió la purificación de la proteína en
condiciones desnaturalizantes con hidrocloruro de guanidinio y
urea. Durante la renaturalización y el replegamiento se observó
precipitación de la proteína. Esto sugirió que era necesario probar
varios tampones. Se probaron cinco tampones:
Tris-base 20 mM/NaCl 0,5 M/Tween-20
al 0,1% pH 8 mantuvo la proteína en solución.
La producción de la proteína de fusión permitió
realizar un experimento de transposición celular, para probar la
capacidad de la proteína de fusión que contiene antennapedia para
traspasar las membranas biológicas. Se utilizaron dos estirpes
celulares en este experimento ASPC1 y HeLa (ASPC1 - adenocarcinoma
pancreático humano, HeLa - adenocarcinoma cervical humano). La
proteína se incubó durante un periodo comprendido entre 10 y 60
min. en células en varias diluciones a 37ºC. La transposición de la
proteína de fusión fue evidente en ambas estirpes celulares, aún
después de sólo diez minutos de incubación. La P21 sola no parecía
traspasar las células. La interiorización de la proteína fue aún
evidente tras la incubación a 4ºC, lo que sugiere un mecanismo de
transposición independiente de la energía que no conlleva
endocitosis clásica.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de la proteína de fusión se aumentó
a escala para purificar suficiente material para llevar a cabo
ensayos de citotoxicidad. La proteína se dializó en solución de
hidrocloruro de guanidinio en lugar de Tris para evitar la
precipitación. Cabía esperar que, cuando eran absorbidas por las
células las disulfuro-isomerasas endocelulares y
las chaperonas produjeran una proteína funcional. La estirpe celular
SKOV-3 del carcinoma de ovario y la estirpe
SAOS-2 del osteosarcoma se cultivaron en placas
ELISA de 96 pocillos en condiciones que se asemejan a la situación
del cuerpo humano (medio de cultivo tisular).
La proteína de fusión y P21 sola se
administraron a las células a razón de 50 mg/ml durante 24 y 48
horas. Los controles incluían las células sin tratar para
proporcionar la muerte celular de fondo; las células a las que
solamente se añadió hidrocloruro de guanidinio; y las células que
estaban totalmente lisadas con detergente para dar 100% de muerte
celular. El experimento se finalizó a las 24 y 48 horas y en las
placas se evaluó la muerte celular apoptósica. Los resultados
indicaban que el tampón utilizado (hidrocloruro de guanidinio) era
autocitotóxico para las células tras la exposición durante un
periodo prolongado. Esta muerte celular de fondo no dejó ninguna
prueba de citotoxicidad debida a la proteína de fusión. Por
consiguiente, después del replegamiento se dializaron las proteínas
en tampón PBS, que es conocido por ser inocuo para las células. Se
retiró cualquier material precipitado por
centrifugación.
centrifugación.
Se aplicaron, a continuación, las proteínas a
los cultivos celulares. Se observó muerte celular significativa en
dos estirpes celulares de cáncer en la administración de la proteína
de fusión como se muestra en la Figura 1.
Se realizaron experimentos de optimización para
las condiciones de administración celular. Se determinó la duración
de la administración, así como la combinación de este agente
citotóxico (fusión Antp-P21) con otros agentes que
son conocidos por destruir las células SKOV-3. Un
agente utilizado en los experimentos fue el cisplatino. Este
fármaco inhibe la síntesis del ADN produciendo reticulaciones
intracatenarias e intercatenarias en el ADN. La síntesis de
proteínas y de ARN se inhiben también en menor medida. Los
resultados indicaban un efecto sinérgico entre los dos modos de
terapia, y un aumento sorprendente del efecto citotóxico en
presencia de ambos a concentraciones relativamente bajas, que
simularía la situación in vivo.
El conjunto de datos que demuestra claramente la
capacidad de destrucción de la molécula Antp-P21,
así como su efecto sinérgico con el agente de destrucción
cisplatino, se muestra en la Figura 2.
Se probó a continuación la proteína de fusión en
combinación con cisplatino y taxol. El taxol interrumpe el
equilibrio dinámico en el sistema microtubular y bloquea las células
en la fase G2 tardía y en la fase M del ciclo celular, inhibiendo
la replicación celular. Los resultados indican un efecto sinérgico
entre los tres modos de terapia, y un efecto citotóxico aumentado
en presencia de los fármacos junto con la proteína de fusión a
concentraciones relativamente bajas.
Los datos que demuestran la capacidad de
destrucción de la proteína de fusión junto con su efecto sinérgico
con los demás agentes de destrucción se muestra en la Figura 3. La
proteína de fusión Antp-P21 produjo un aumento de
la muerte celular cuando se incubaba con los agentes citotóxicos
cisplatino y taxol. Antp-P21, cisplatino y taxol
actúan sinérgicamente cuando se utilizan en combinación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la cinética y biodistribución de la
proteína antennapedia (sola) purificada y radiomarcada en ratones
sin tumor. Esto demuestra que la proteína se transfiere a través de
la sangre a todos los tejidos del cuerpo. Un resumen de los
resultados se muestra en la Figura 4A.
La proteína antennapedia parecía tener una
depuración inicial rápida, pero tardó más de quince horas en
depurarse completamente en la circulación. Este comportamiento cabe
esperar de las proteínas con carga positiva. Este intervalo dejaría
tiempo suficiente para que salga de los vasos sanguíneos y se
acumule en los tejidos. Tras la disecación y el recuento de todos
los órganos y tejidos del ratón, se calcularon las relaciones órgano
sangre y la acumulación de proteínas en varios órganos; tal como se
muestra en la Figura 5A.
La proteína no presentaba afinidad para ningún
tipo específico de tejido. Parece que se acumula en los tejidos muy
vascularizados.
Se determinaron, a continuación, la cinética y
biodistribución de la proteína de fusión
antennapedia-P21 purificada y radiomarcada en los
ratones sin tumor. Los resultados se muestran en las Figuras 4B y
5B. La proteína de fusión parecía tener una depuración inicial
rápida, pero tardó más de 17 horas en purificarse completamente en
la circulación (Figura 4B). Este comportamiento parecía que se
observaba cuando se determinaba la proteína antennapedia sola y era
de esperar en las proteínas con carga positiva. Este intervalo era
de esperar que permita tiempo suficiente para que salga de los
vasos sanguíneos y se acumule en los tejidos. Tras la disecación y
el recuento de todos los órganos y tejidos del ratón, se pudieron
calcular las relaciones órgano a sangre y representar la
biodistribución de la proteína, tal como se ilustra en la Figura
5B.
La proteína de fusión no presentaba afinidad
para ningún tipo especifico de tejido, como era de esperar. Parecía
acumularse en los tejidos muy vascuarizados. Se llevaron a cabo
experimentos que permitieron a los inventores localizar la proteína
en los tejidos tiñendo con anticuerpos anti-proteína
(anticuerpo anti-HIS-Qiagen). Estos
estudios de inmunohistoquímica se realizaron en secciones de tejido
congeladas.
Los resultados demostraron que la proteína de
fusión se acumulaba en los órganos principales, tal como se indica
en la Tabla 1, y se observó en forma de molécula completa. El
comportamiento de la molécula es probable que quede esencialmente
inalterado en los ratones con tumor, salvo que se acumule en grandes
cantidades en el tumor existente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó a continuación un experimento en
animales con un tumor que indicó el tiempo óptimo de acumulación de
proteínas en el tumor y, por consiguiente, el tiempo que tarda la
proteína de fusión en salir de la circulación sanguínea y entrar en
los tejidos adyacentes. Esta información es deseable cuando se
diseñan experimentos que implicaban dosis repetidas e intervalos
entre cada dosis.
\newpage
Se administró una proteína de fusión
radiomarcada en una sola dosis por la vena de la cola a ratones con
tumor y a los tumores examinados en varios puntos de tiempo. Los
resultados demostraron que el tiempo óptimo de localización del
tumor era de tres horas tras la administración. Tras este periodo,
disminuyó la intensidad de la tinción y por consiguiente la
cantidad de proteína. Los resultados se muestran selectivamente en
las tablas siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se probó la máxima dosis
tolerada que puede administrarse sin peligro a los ratones con
tumor. Se probaron tres concentraciones diferentes de la proteína
de fusión, así como las referencias, tanto por vía intravenosa como
intratumoral. Se controlaron en los animales los signos de molestias
y toxicidad, y se registraron las mediciones del diámetro del
tumor, del peso de los ratones y del recuento de glóbulos blancos.
La concentración de 2,5 mg/ml de la proteína de fusión se demostró
que era la más alta que puede utilizarse sin efectos tóxicos de
manera repetitiva y se utilizó por consiguiente en los estudios
posteriores.
Se utilizaron xenotrasplantes con adenocarcinoma
de ovario SKOV3. Los animales tratados con
Antennapedia-P21 estaban en grupos grandes de 8
animales, y el experimento incluía referencias tales como 8 animales
que reciben solución salina y 8 animales que reciben dosis
crecientes de proteína Antennapedia sola. Se pusieron seis
inyecciones a la semana. El día cero mostrado en la Figura 6 es el
primer día de las inyecciones.
Los resultados indicaron que la proteína de
fusión demostró un perfil de retardo máximo del tumor. La
concentración de 2,5 mg/ml de la proteína de fusión demostró ser la
que presentaba máxima eficacia. Al analizar los resultados con más
detalle, se identificó un perfil de supervivencia que apoyaba más el
modo de actuación del agente terapéutico de los inventores. Al
agrupar los animales por tamaño del tumor y aspecto en los animales
con tumores incipientes pequeños independientemente de los animales
con tumores incipientes mayores, se observó que el benefició del
tratamiento en los animales con tumor pequeño es mayor que en los
animales con tumores grandes. La penetración y el efecto
terapéutico de las proteínas se ha demostrado que ha mejorado en los
tumores más pequeños. La justificación subyacente a esto es que la
presión intersticial es mayor en el núcleo de los tumores grandes y
el medio es más difícil que penetre en las moléculas no dirigidas.
Por consiguiente, la ganancia terapéutica fue mayor en los tumores
más pequeños con presión intersticial inferior.
Esta teoría está apoyada por los datos de
Kaplan-Meier. El análisis de todos los animales en
conjunto proporciona ganancia de supervivencia evidente al grupo
que recibe la proteína de fusión en su concentración mayor, tal
como se indica en la Figura 7.
Se añadieron los fármacos quimioterapéuticos
convencionales cisplatino y taxol al protocolo terapéutico en las
dosis convencionales publicadas. Se observó un efecto positivo,
in vitro. Los resultados indicaban un efecto sinérgico entre
los tres modos de terapia, y un efecto aumentado de retardo del
crecimiento del tumor en presencia de los fármacos junto con la
proteína de fusión en las concentraciones seleccionadas, tal como
se indica en la Figura 8.
En la Figura 9 se proporciona la curva de
supervivencia de Kaplan-Meier para los animales que
reciben la proteína de fusión y quimioterapia. Es evidente que la
mejor ganancia de supervivencia fue demostrada por los animales que
reciben tanto la proteína de fusión como quimioterapia
complementaria.
Cuando se comparó la curva de supervivencia de
los animales que reciben la proteína de fusión frente a la curva de
los animales que reciben la proteína de fusión más quimioterapia
complementaria, en la Figura 10, es evidente que la adición de la
quimioterapia aumentaba el porcentaje de los animales vivos en todos
los tiempos. Esto demostró que los resultados in vitro se
correlacionaban bien con la situación que se observaba in
vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de los experimentos en los tumores
SKO-V3, se ensayó la proteína de fusión
Antennapedia-P21 en ratones lampiños
xenotrasplantados con células E6 de carcinoma de colon RKO. Estas
células contenían un ecogen E6 de papilomavirus humano (PVH)
integrado de forma estable bajo el control del activador de
citomegalovirus (CMV). El encogen E6 del PVH produce una
disminución en las concentraciones y funciones normales de p53, en
la medida en que está estirpe carece de p53 funcional
apreciable.
La falta de p53, bloquea la transactivación de
los genes diana mediada por p53 corriente debajo, tal como el
Cdk-inhibidor P21. La expresión de P21 produce la
inhibición de la fosforilación de Rb, y de este modo se bloquea la
expresión posterior de los genes dependientes de E2F.
La estirpe celular RKO-E6 se ha
utilizado frecuentemente para investigar los efectos de la perdida
de p53 sobre el parámetro celular tal como la transcripción mediada
por p53 y la apoptosis. En los experimentos descritos en la
presente memoria, se ha utilizado para estudiar los efectos de la
administración de P21 a las células, obviando, por consiguiente, la
necesidad de la activación de p53. La apoptosis se mide como la
muerte celular del tumor y la reducción del tamaño del tumor.
Se xenotrasplantaron ratones lampiños con
tumores E6 de RKO, seleccionados al azar en cuatro grupos y se
administraron a uno de los siguientes por inyección en la vena de
la cola:
- i.
- Solución taponada con fosfato (una vez a la semana durante 5 semanas)
- ii.
- 2,5 mg/ml de la fusión Antennapedia-P21 (una vez a la semana durante 5 semanas).
- iii.
- 2 mg de 5-fluorouracilo/1 mg de Leucovorín, 0,2 mg Oxaliplatino (una vez a la semana durante 5 semanas).
- iv.
- 2,5 mg/ml de la fusión Antennapedia-P21 + 2 mg de 5-fluorouracilo/1 mg de Leucovorin, 0,2 mg de Oxaliplatino (una vez a la semana durante 5 semanas).
Se administraron fármacos quimioterapéuticos en
las dosis documentadas anteriormente para producir reducciones
mensurables del tumor. Se evaluó la agresión del tumor, que a su vez
se tradujo en una ganancia de supervivencia.
Los resultados se presentan en la Figura 11. El
tratamiento con PBS, la proteína de fusión o la quimioterapia sola
tuvo poco efecto sobre la supervivencia en general, con una mediana
de supervivencia en el intervalo de 30 días para todos estos
grupos. Se observó una mejora significativa en la supervivencia en
los animales tratados con la Fusión en combinación con la
Quimioterapia, con una media de supervivencia de 45 días,
demostrando interacciones sinérgicas.
Debido a que una mayoría de los pacientes que
sucumbió al cáncer colorrectal lo hacen de este modo por enfermedad
metastásica generalizada secundaria, se necesitan estrategias
terapéuticas que podrían tener un efecto en la enfermedad
metastásica para tener un impacto significativo en este cáncer. Es
de esperar que la proteína de fusión
Antennapedia-P21 tenga dicho efecto ya que se ha
demostrado anteriormente que la administración de la misma que da
como resultado su acumulación en varios tejidos, y porque se ha
demostrado que su aplicación no está limitada por una toxicidad en
función de la dosis.
<110> Trojan Technologies Limited
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Conjugado que comprende la proteína
P21 para el tratamiento del cáncer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> JWJ01161WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0507598.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-04-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Variante de la hélice 3 de pAntp,
entre 6 y10 de los restos de aminoácidos son hidrófobos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\newpage
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Variante de la hélice 3 de pAntp,
entre 6 y10 de los restos de aminoácidos son hidrófobos.
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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Claims (4)
1. Composición, que comprende:
- i)
- un conjugado que comprende
- (a)
- un primera zona que comprende la proteína P21 que presenta la secuencia de aminoácidos tal como se define en la SEC. ID. nº 1, o un homólogo de la misma que presenta por lo menos el 60% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº 1 y que tiene la función de la proteína natural P21; y
- (b)
- una segunda zona que comprende homeodominio de antennapedia que presenta la secuencia de aminoácidos definida en la SEC. ID. nº 3; y
- ii)
- un fármaco quimioterapéutico.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que el conjugado está en forma de una proteína de fusión.
3. Composición según la reivindicación 1 ó 2
para su utilización como medicamento.
4. Utilización de una composición según la
reivindicación 1 ó 2 para la preparación de un medicamento destinado
al tratamiento del cáncer.
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