CN102656186A - 治疗剂 - Google Patents
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Abstract
在此描述了一种纯化的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽、以及该肽的修饰和同源形式。该肽的修饰或/和同源形式包含5个以上连续氨基酸,与限定一个基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性,该基序选自由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成的组。这种或这些肽可以由扩展短杆菌(一种在奶酪生产中常用的短杆菌)产生。还提供了一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法,包括用有效量的该肽或一种蛋白质(其胃蛋白酶切割产生该肽)治疗哺乳动物。
Description
发明领域
本发明涉及对于癌细胞具有抗增殖活性的肽。本发明还涉及预防或治疗癌症的组合物和方法。
发明背景
阳离子抗微生物肽被发现于大多数有生命的生物,作为其非特异性防御病原体的组分。它们已经在细菌、真菌、植物、昆虫、两栖类、甲壳类、鱼类、鸟类和包括人的哺乳动物中被鉴定,并可以响应于微生物的存在而被组成型表达或诱导。虽然阳离子肽的作用方式并不十分清楚,但这些肽被认为与细胞膜相互作用,作为其抗微生物作用的部分。线性阳离子序列RGRAK(SEQ ID.No.1)是形成可以选择性靶向在哺乳动物细胞上的细菌细胞的两亲性β-折叠构象的阳离子抗微生物肽类的特征。
NPXY共有基序(SEQ ID No.2)是存在于蛋白质的胞质结构域中的分选信号,并且对于将跨膜蛋白质分为核内质溶酶体系统的不同区室非常重要。NPXY基序是基于酪氨酸的分选信号,并且被与膜的胞质表面周围缔合的蛋白质外壳的组分识别。假定的NPXY信号识别蛋白是网格蛋白、AP-2和Dab2。
其中越来越多的能够渗透细胞膜并将不同物质转移至细胞中的细胞穿透肽是构成被称为TAT(48-60)(GRKKRRQRRRPPQ)(SEQ ID.No.3)的病毒肽的原型序列(prototypical sequence),其衍生自HIV-1Tat蛋白。同时,整个Tat蛋白的长度是86个氨基酸,并包含转移活性所需的高碱性区,Tat(48-60)肽是包含膜溶解活性所需的碱性残基的9氨基酸段(amino acid stretch)的最低活性序列。已显示Tat48-60在将DNA跨细胞膜转移中是有用的,导致相对于对照肽的转染效力增加。
扩展短杆菌(Brevibacterium linens)由于其在许多奶酪(如Limburger、Münster,Brick、Tilster、Appenzeller和Camembert)的表面的应用而长期以来被认为是重要的乳制品微生物,提供味道、颜色并且抑制其他细菌的生长(例如,参见Onraedt等人,2005)。扩展短杆菌是具有杆-球状生长周期的需氧微生物,具有20℃至30℃的最适生长温度。它是一种具有6.5至8.5的最适生长pH的耐盐生物。扩展短杆菌的生长被认为是涂抹表面成熟的奶酪的香味的必要前提。
转座酶是普遍存在的非分泌性细胞内酶,其通过一系列金属依赖性磷酰基转移反应来催化基因组之内和基因组之间的基因重排。假定的DNA转座酶可通过编码的转座酶的序列相似性和/或特异标志来鉴定。
发明概述
本发明源于令人惊讶的发现:由假定的扩展短杆菌的DNA转座酶(GenBank登录号O68604)编码的肽片段展示出对癌细胞的抗增殖活性。该肽含有类似功能上定义的基序的部分氨基酸序列。而且,由于该肽对胃蛋白酶消化具有抗性,在口服摄入该肽时可保持肽的完全性以及这些氨基序列之间的空间关系。同时该肽的抗癌活性机制是未知的,该意外的发现本身有助于该肽和基于该肽的肽试剂在预防或治疗癌症中的应用。此外,扩展短杆菌在软奶酪的生产中已建立的应用表明,这种试剂在人体内,特别是在胃肠道上皮的正常细胞中展示出低毒性或无毒性。
本发明一方面提供了纯化的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(即DDVRRRVQQETTGHRGRAKDPL(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
本发明另一方面提供了预防或治疗在哺乳动物中的癌症的方法,包括用有效量的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式治疗哺乳动物,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
本发明另一方面提供了抑制癌细胞生长的方法,包括使细胞接触有效量的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
本发明另一方面提供了药物组合物,该药物组合物包含由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ IDNo.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性;连同药学上可接受的载体和/或赋形剂。
由于被本发明的一种或多种形式所包括的肽可由奶酪生产中常用的短杆菌(Brevibacterium)产生,经常摄入含有这种细菌的奶酪可提供癌症的预防或治疗。因此,还提供了一种预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法,包括用有效量的含有扩展短杆菌或其他短杆菌的奶酪治疗哺乳动物,该扩展短杆菌或其他短杆菌产生一种蛋白质,该蛋白质的胃蛋白酶切割产生由本发明所包括的肽,该治疗包括这种奶酪的消费。
本发明再一方面提供了用于哺乳动物消费的营养增补剂,该营养增补剂包含纯化的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性;连同可食用的载体和/或赋形剂。
本发明在一方面提供了一种预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法,包括用有效量的细菌生物或细菌生物的提取物治疗哺乳动物,该细菌生物表达本发明所包括的肽或在被胃蛋白酶切割时释放本发明的肽的蛋白质,该提取物含有该肽或蛋白质,并且该治疗包括该细菌生物或提取物的消费。
该细菌生物可被工程化以表达该蛋白质或肽,并且可以是短杆菌。
另一方面提供了本发明所包括的肽在预防或治疗在哺乳动物中的癌症中的应用。
在一个或多个实施方案中,在此所述的药物组合物或营养增补剂包括表达根据本发明的蛋白质或抗癌肽的生物的细胞制剂或其提取物。
而且,在至少一些形式中,本发明所包括的肽的修饰或同源形式可以包括DPL基序(SEQ ID No.6)的完全、部分或同源形式。
典型地,本发明锁所包括的肽的修饰或同源形式与限定一个基序的具有Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性,该基序选自下组,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成。
在本发明所包括的肽的至少一些修饰形式中,肽的基序分别位于SEQ ID No.4的一个或多个相应基序的相对位置上。最通常地,修饰肽的基序(或其一个或多个部分序列)将位于SEQ ID.No.4的一个或多个相应基序的同源位置上。肽的修饰或同源形式可以例如包括由GenBank登录号O68604(SEQ ID No.7)的氨基酸266-289组成的肽,在此也被称为肽24-NH2。
肽的修饰或同源形式的一个或多个基序将通常分别包含由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的肽的相应基序的至少大部分氨基酸。
本发明所包括的肽可以分别具有RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)基序的完全或部分形式。
典型地,本发明所包括的分别具有RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)两者基序的完全或部分形式的肽在这些基序之间将不具有胃蛋白酶切割位点。
在至少一些形式中,肽的同源形式可以是DNA转座酶的肽片段。
应当理解的是,本发明所包括的肽可以是天然发生的、重组的或通过任何适当的常规已知手段制备的人工合成或衍生的肽。
在另外的方面,提供了编码本发明所包括的肽的核酸序列、以及结合该核酸的重组载体。通常,重组载体是用于宿主细胞中表达肽的表达载体。
另一方面,提供了用结合编码根据本发明的抗癌肽的核酸序列的重组载体转化的宿主细胞。
另一方面,提供了用编码根据本发明的抗癌肽的核酸序列转化的宿主细胞,其中该核酸序列被整合到该宿主细胞的基因组中。
此外,本发明涉及本发明所包括的肽在制造用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
如本发明上下文所用,术语“癌症”包括任何类型的失去控制的细胞增殖癌症可以是任何组织来源的癌症。
进一步,本发明的肽的上下文中的术语“纯化”包括已至少部分纯化的肽、以及包含与一种或多种其他组分混合的肽的制剂。例如,本发明所包括的营养增补剂或组合物是这种制剂的实例。
哺乳动物可以是用本发明的方法可治疗的任何哺乳动物,并且可以是牛、猪、羊或马科动物、实验室测试动物如鼠、兔、豚鼠、猫或狗、灵长动物或人类中的成员。
贯穿本说明书中,单词“包括”(comprise)或变形如“comprises”或“comprising”应当被理解为隐含包括所陈述的要素、整体或步骤,或要素、整体或步骤的组,但不排除其他其他要素、整体或步骤,或要素、整体或步骤的组。
根据以下非限制性实施方案连同附图的说明,本发明的特征和优点将变得更加明显。
附图简要说明
图1是可用于在此所述的方法的一个或多个实施方案的一类肽树枝状化合物的示意性说明;
图2(A)是结合八个肽单体的多抗原肽树枝状化合物(MAP)的示意性说明。(B)Lys分支单元数量的增加增加了表面胺基的数量。
图3显示扩展短杆菌的假定的DNA转座酶(GenBank登录号O68604)的部分氨基酸序列(SEQ ID No.8),理论上用胃蛋白酶形式Pn2(在pH>2具有活性)和Pn1.3(在pH 1.3具有活性)消化时,在此被称为“22C”(以粗体显示)的肽(SEQ ID No.4)从该扩展短杆菌衍生。
图4显示扩展短杆菌肽24-NH2的BLAST-P分析,该扩展短杆菌肽24-NH2识别6个24-NH2样序列(SEQ ID No.9-14),其中每一个居于假定的转座酶蛋白质中。保守氨基酸以粗体显示,理论上胃蛋白酶消化后产生的肽片段以下划线显示(Expasy肽剪切程序,ExpasyPeptide Cutter program)。(i)24-NH2;(ii)节杆菌属(Arthrobacter sp.TM1.(Acc.AAC28267);(iii)orf2耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)(Acc.AAA98489);(iv)质粒pEST1226(Acc.AAC64902);(v)痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)KPA171202(Acc.YP_055571);(vi)红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)PR4(Acc.YP_345706);(vii)本发明所包括的肽的共有序列,其中X表示不导致完全或部分RRRVQQ(SEQ ID No.5)、RGRAK(SEQ ID No.1)与DPL(SEQ ID No.6)基序之间产生胃蛋白酶切割位点的氨基酸。
图5(A)是显示在含血清MTT细胞增殖试验中扩展短杆菌肽24-NH2(SEQ ID.No.7)对HT29结肠直肠腺癌细胞的生长的影响的曲线图。(B)显示衍生自扩展短杆菌肽22C(SEQ ID.No.4)的两个肽14C(SEQ ID No.15)和8C(SEQ ID No.16)的氨基酸序列。(C)是显示在无血清MTT细胞增殖试验中扩展短杆菌肽22C、14C和8C对HT29结肠直肠腺癌细胞的生长的影响的曲线图。(D)是显示在含血清MTT细胞增殖试验中扩展短杆菌肽22C、14C和8C对HT29结肠直肠腺癌细胞的生长的影响的曲线图。
图6是显示在含血清MTT细胞增殖试验中扩展短杆菌肽22C(SEQ ID No.4)对HT20结肠直肠腺癌细胞、SW480结肠癌细胞和MKN45胃癌细胞的生长的影响的曲线图。发明的示例性实施方案的详细说明
诸位发明人已经鉴定了扩展短杆菌的假定的DNA转座酶中所包含的具有抑制癌细胞生长的能力的肽序列(GenBank登录号O68604,国家生物技术信息中心,美国国家医学图书馆,8600Rockville Pike,Bethesda,MD,美国)。该肽含有若干类似于官能限定的线性肽序列的肽基序,并且虽然该肽的抗增殖活性机制未知,但诸位发明人进行的研究表明这些基序或其至少部分序列与该肽的抗增殖活性有关。肽从具有抗癌性质的扩展短杆菌的衍生表明,发酵该生物或其他可以产生蛋白质(其胃蛋白酶切割产生本发明所包括的肽)的短杆菌的涂抹表面成熟的奶酪的消费在癌症,特别是胃肠来源的癌症的预防中可能具有相当的健康益处。
由Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)限定的肽的修饰和同源形式包括该肽的活性片段,并保持对癌细胞的抗增殖活性。例如,SEQ ID No.4的活性片段是保持由SEQ ID No.4限定的肽的至少某一抗癌活性的片段。
相比于SEQ ID No.4或其活性肽片段,本发明所包括的肽的修饰或同源形式的氨基酸序列可以具有一个或多个氨基酸变化。该肽的抗癌活性也将典型地基本被保持或由修饰或同源的肽提供。
本发明所包括的修饰肽可以例如通过相对于SEQ ID No.4添加、缺失和/或置换一个或多个氨基酸而提供。氨基酸的倒位和导致氨基酸序列改变的其他突变也被包括在内。可以通过如下制备修饰肽:引入编码SEQ ID No.4的氨基酸序列的核酸序列的核苷酸改变,这样使得在诱变核酸表达时或例如通过合成结合所希望的氨基酸改变的氨基酸序列实现所希望的氨基酸改变。
氨基酸的置换可以包括保守性或非保守性氨基酸置换。对于保守性氨基酸置换,表示将氨基酸残基用具有类似电荷和立体化学性质的不明显影响该肽的抗癌活性的另一氨基酸取代。优选的修饰肽包括具有以下氨基酸序列的肽:其中一个或多个氨基酸已经被丙氨酸或其他的一个或多个电中性氨基酸残基置换,或者已经对其添加一个或多个这样的氨基酸残基。修饰肽也可以结合不是被遗传密码编码的一个氨基酸或多个氨基酸或一个或多个氨基酸类似物。例如,可以利用D-氨基酸,而非L-氨基酸。事实上,在此所述的肽可部分或全部由D氨基酸组成。可以利用本领域熟知的技术通过化学合成来产生D-肽。因此,肽的一些实施方案可以包括L-氨基酸、D-氨基酸或L-和D-氨基酸的混合物。如本领域已知,包括D-氨基酸的肽的合成可以抑制肽酶活性(例如,内肽酶),由此相对于相应的L-肽而增强肽在体内的稳定性并且增加其半衰期。
进一步,在此所述的肽可以例如是N-和/或C-受保护的,从而使其更少地抵抗被体内蛋白酶降解或抑制其通过肾脏从循环中清除。如肽的聚乙二醇化的方法在本领域是熟知的,并且特别地包括所有这样的方法。典型地,用于本发明所包括的方法中的聚乙二醇化肽/蛋白质将被偶联到2个或更多个聚乙二醇(PEG)单体(例如,(PEG)n)上,其中典型地n在大约2至大约11的范围内。
在此所述的修饰或同源肽与SEQ ID No.4(或SEQ ID No.4的活性片段)之间的同源性通过比较在序列中的各个位置上的氨基酸来确定(当为了比较而最佳比对时)。如果在一个位置上的氨基酸相同,则在该位置上的序列被认为是同源的。可以使用任何适当的程序或算法,例如,通过Needleman and Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970)来进行序列比对。使用标准软件程序(如GAP)可以方便地进行计算机辅助的序列比对,GAP为Wisconsin Package 10.1版(Genetics Computer Group,麦迪逊,威斯康辛州,美国)的一部分,其使用默认的计分矩阵,具有空位生成罚分50和空位延伸罚分3。
本发明所包括的活性片段、修饰或同源肽可以具有5个以上的氨基酸直至大约35个氨基酸或更多个氨基酸的序列长度。在一种或多种形式中,修饰或同源肽的长度可以为大约20至30个氨基酸,例如具有20、21、22、23、24、25、26、26、27、28、29或30个氨基酸。典型地,活性片段、修饰或同源肽的长度将是5个以上、通常高达大约22个氨基酸,例如具有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸等。然而,应当理解的是,还特别包括长度为31、32、33和34个氨基酸的肽,正如落入以上指示的长度范围的范围之内的肽。例如,长度在8至35个氨基酸、14至25个氨基酸或例如17至26个氨基酸或类似的范围内的活性片段、修饰或同源肽均被本发明具体包括。
典型地,包括完全或部分RGRAK基序(SEQ ID No.1)的肽的长度将是至少8个氨基酸。包括完全或部分RRRVQQ基序(SEQ IDNo.5)的肽的长度将典型地是至少14个氨基酸。
本发明所包括的进一步修饰的肽包括氨基酸序列DX1X2RRRVQQX3TX4GHRGRX5KDPL(SEQ ID No.14),其中Xn表示不导致完全或部分RRRVQQ(SEQ ID No.5)、RGRAK(SEQID No.1)和DPL(SEQ ID No.6)基序之间的胃蛋白酶切割位点产生的氨基酸或氨基酸类似物(例如,不被遗传密码或充当天然/野生型氨基酸的替换物的分子所包括的合成氨基酸)。五个X位置的任何之一的氨基酸可以例如独立地选自二十种已知的氨基酸或已知氨基酸类似物中的任一种,其中所选氨基酸实质上不降低天然肽的抗增殖活性。在一些实施方案中,X1的氨基酸或氨基酸类似物可以带有负电荷,X2的氨基酸或氨基酸类似物可以是极性的,X3的氨基酸或氨基酸类似物可以是疏水的,并且X4和X5的氨基酸或氨基酸类似物可以是极性的。
在此所述的修饰肽还可以包括氨基酸序列DRRRVQQTGHRGRKDPL(SEQ ID No.17)或由其组成。
在一些实施方案中,修饰肽可包括氨基酸序列SEQ ID No.7(肽24-NH2)。
进一步,本发明所包括的活性片段包括14链节(mer)肽DDVRRRVQQETTGH(SEQ ID No.15)和8链节肽RGRAKDPL(SEQ ID No.16)。还可以提供这样的活性片段或修饰和/或同源肽,其包括在它们之间有或无胃蛋白酶切割位点的这两种序列。修饰和/或同源肽还可以例如,包括SEQ ID No.15或SEQ No.16之一以及SEQ ID No.15或SEQ ID No.16其中另一个的修饰或同源形式,而且那些序列之间有或无胃蛋白酶切割位点。
由RGRAK(SEQ ID No.1)限定的基序的部分形式包括RSRAK(SEQ ID No.18)、RGRSK(SEQ ID No.19)和RSRSK(SEQ IDNo.20)。基序DPL(SEQ ID No.6)类似于功能基序NPXY(SEQID No.2),并且SEQ ID No.6的部分形式包括NPL(SEQ ID No.21)。因此,在此所述的肽的修饰和同源形式包括具有这些部分基序的一个或多个的那些。典型地,包括RGRAK基序(SEQ ID No.1)的部分或完全形式的肽将包括DPL基序(SEQ No.6)(或在此所述的其部分形式)C-末端至完全或部分RGRAK基序(SEQ ID No.1)。
典型地,被发明所包括的修饰或同源肽的一个或多个基序将分别与SEQ ID.No.4的相应基序具有至少大约80%的序列一致性,更通常地与SEQ ID No.4的相应基序具有大约85%、90%或95%或更多的序列一致性。修饰或同源肽也将通常与SEQ ID.No.4、SEQ ID.No.15或SEQ ID.No.16具有至少大约50%、60%、65%、70%、75%或更多、最优选大约80%、90%、95%或98%或更多的总体氨基酸序列一致性。还应当理解的是,以上指定范围内的所有可能的具体序列一致性百分比也特别地被本发明包括。
可以将本发明所包括的肽限制于抗增殖活性的三维构象。例如,它可以被合成为具有侧链结构或形成二硫桥键的半胱氨酸残基,或另外被结合在体内的具有已知的稳定结构的分子中。例如,该肽可以被结合到至少其部分折叠成β-折叠片或螺旋结构(如α-螺旋)的氨基酸序列中。
肽也可被环化以提供增强的刚性,从而提供增强的体内稳定性。多种环化肽和融合蛋白的方法是已知的。例如,结合两个彼此沿该肽间隔的半胱氨酸残基的合成肽可以通过这些残基的硫醇基的氧化以在它们之间形成二硫桥键而被环化。也可以通过如下实现环化:在合成肽的N-末端与C-末端氨基酸之间形成肽键;或例如在赖氨酸残基的侧链上的带正电的氨基与在谷氨酸残基的侧链上的带负电的羧基之间形成一个键。如将被理解的,在其间形成这些键的不同氨基酸残基的位置将决定环的大小。可以通过合成其中用于实现环化的氨基酸位置已经被改变的肽而获得用于优化结合亲和力的环的大小的变化。为了实现所希望的三维构象的氨基酸之间的直接化学键的形成或任何适合的连接物的使用也完全在技术人员的范围之内。
典型地,本发明所包括的具有抗增殖活性的肽的N-末端和/或C-末端将被修饰,以防止或抑制被内肽酶体内降解。例如,这些肽的C-末端可被酰胺化,以防止内肽酶降解,并且具有C-末端酰胺基的肽优选用于本发明的方法中。
用于鉴定适合用于本发明方法中的肽的策略包括大规模筛选技术。例如,肽文库试验方案,特别是噬菌体肽展示文库,提供了测试大量潜在试剂的有效方式。这些文库及其应用是熟知的。然后可以进一步评价所鉴定的预期试剂的适当活性、竞争分析和其他分析。筛选一种肽或评价一种肽是否能够抑制癌细胞生长的方法将典型地包括在用该肽处理癌细胞的条件下的分析中应用该肽,并且与对照肽相比确定细胞生长的抑制是否出现。
作为一个向哺乳动物给予本发明的肽的替代方案,可以将编码肽或融合蛋白的核酸分子给予哺乳动物,以在癌细胞中表达该肽或融合蛋白,从而引起癌细胞生长的抑制。在肽或融合蛋白表达之前,可以将核酸序列以适当的表达载体引入细胞中,用于染色体外核酸序列的表达或用于通过重组事件将核酸序列整合到基因组DNA中。可替代地,用核酸分子转染这些细胞,该核酸分子结合有在编码肽或融合蛋白的序列的侧翼的核苷酸序列,这些核苷酸序列促进与基因组DNA的重组,以在转染细胞的自身转录调节序列的控制下表达编码的试剂。
特别优选的实现肽、核酸和其他试剂的细胞内递送的方式是使用“促进部分”,如载体肽,其具有以不依赖能量的方式递送运载大分子(cargo macro-molecule)穿过细胞膜的能力。这种载体肽提供了在测试细胞培养物中的不明显改变细胞膜完全性的潜在试剂和在体内递送试剂的可能性。本领域已知的载体肽包括穿膜肽及其变体(例如,Derossi D等人,1994,1996)、人类免疫缺陷病毒Tat衍生的肽(例如,Prochiantz A,1996)、transportan衍生的肽(例如,Pooga M等人,1998)和包括修饰形式及其部分序列的信号肽,所有这些分子均可用于本发明所包括的方法中。
与载体肽不同,促进部分可以是增加试剂的细胞膜溶解性从而促进该试剂穿越通过细胞膜的脂质部分或其他非肽部分。脂质部分可以例如选自甘油三酯,包括混合的甘油三酯。优选脂肪酸,特别是C16-C20脂肪酸。典型地,脂肪酸是饱和脂肪酸,最优选是硬脂酸。本发明不限于任何这种非肽促进部分的使用,并且可以使用提供所希望的细胞膜溶解性的生理学可接受的任何分子。
在实例中,该试剂是编码本发明的肽的核酸,该促进部分典型地也将能够通过真核细胞的核膜,从而引起附连的核酸转移进入细胞核中。
本发明所包括的肽可以按任何常规已知的方式而被连接到促进部分上。例如,可以使用交联试剂通过肽键或非肽共价键由氨基酸连接序列将一种肽直接到载体肽上。对于带负电的试剂如核酸,可以通过载体肽或连接序列中带负电的试剂与带正电的氨基酸之间的电荷结合(charge-association)而将该试剂连接到载体肽上。也可以使用化学连接法在载体肽或连接序列的羧基末端氨基酸与本发明所包括的肽之间产生共价键。
也可以应用不同的另外的方法来增加本发明所包括的肽的半衰期或用于促进这些肽进入目标癌细胞中。这样的方法包括使一个或多个肽结合进入树枝状化合物中。
提供处于树枝状化合物形式的肽特别适合于促进这些肽递送到目标细胞。树枝状化合物包括多个肽拷贝偶联到其上的相对大的分支的骨架/支架(framework/scaffolding)。树枝状化合物可以是被认为适合于在本发明所包括的方法中使用的任何树枝状化合物。例如,树枝状化合物可可以具有这些肽偶联到其上的分支的有机骨架,如由聚(酰胺-胺)(PAMAM)、三(乙烯胺)氨或聚(丙烯亚胺)(AstramolTM)形成的骨架。在其他形式中,树枝状化合物可以具有结合聚氨基酸的骨架,这些聚氨基酸形成肽偶联到其上的分支单元。氨基酸可以由遗传密码编码和/或是其他的氨基酸。在至少一些实施方案中,树枝状化合物具有由赖氨酸氨基酸残基形成的分支单元骨架,并且本发明的肽被偶联到这些赖氨酸残基上。
肽树枝状化合物特别适合于在本发明的方法中以及本发明的至少一些实施方案中使用,包括偶联至聚氨基酸分支骨架(典型地,赖氨酸分支单元)上的多肽。树枝状化合物典型地将具有至少3层/代氨基酸分支单元,多肽被偶联至这些氨基酸分支单元的最外层/代上,这样使得该树枝状化合物呈现出多个多肽单元,如进一步在以下所描述。虽然优选多肽的单体单元,但在其他实施方案中可以使用结合有多个多肽单元(例如,DDVRRRVQQETTGH)n,即,(SEQ ID No.15)n,其中n是偶联至树枝状化合物的聚氨基酸分支单元上的多肽单元数(典型地1-3个))的树枝状化合物。
可以将多肽接枝到形成树枝状化合物的骨架的聚氨基酸分支单元的最外层/代的表面上,或者被合成地组装在树枝状化合物的聚氨基酸分支单元上。更具体地,可用于本发明所包括的一种或多种方法中的树枝状化合物的合成可以通过发散或汇集合成策略来实现。
发散策略是通过固相合成在固相支持体上的连续运行中逐步构成树枝状化合物的直接方法。逐步合成包括树枝状化合物的分支核心的合成,然后是以连续方式的多肽抑制剂的合成。发散策略特别适合于合成具有三官能团酸(例如,聚氨基酸)的骨架的树枝状化合物。这种固相合成方案是合成赖氨酸分支单元的选择方法,其中双保护赖氨酸用于产生具有多个赖氨酸水平的分支骨架。赖氨酸的二氨基性质导致每个另外的赖氨酸水平有效地使其上多肽抑制剂可以直接合成的位点数量加倍。
汇集策略是间接的模块化方法,借此分开制备多肽和分支核心单元,然后将它们偶联在一起。用于树枝状化合物的汇集合成中的具有分支骨架的核心单元是可商购的,并且典型地由有机氨基化合物如聚(酰胺-胺)(PAMAM)、三(乙烯胺)氨或聚(丙烯亚胺)(AstramolTM)形成,单独制备的抑制剂通常共价连接到其上。
适合的在此所述的肽可偶联到其上的肽树枝状化合物骨架、以及用于提供这些肽树枝状化合物的方法例如描述于Lee等人,2005;Sadler and Tam,2002;和Cloninger,2002中,在此将其全部内容通过引用结合在此。适合于在本发明的实施方案中使用的肽树枝状化合物的实例被示意性说明于
图1和图2中(Sadler,K.,and Tam,J.P.,Rev.inMol.Biotechnology,Vol.90,Issues 3-4,May 2002,195-229页)。
典型地,树枝状化合物将呈现出4、6、8或更多个本发明所包括的肽单元,通常是至少8个肽单体单元,更通常是至少10个肽单元。此外,树枝状化合物中呈现的肽可以如上所述被聚乙二醇化。
将本发明包括的肽直接靶向癌细胞的另一种方法包括使用纳米大小的颗粒,也被称为微细胞(minicell),其包封高浓度的肽并通过包被微细胞的双特异性抗体而靶向到肿瘤细胞表面的受体上(例如,参见MacDiarmid,J.A.2007,在此特别地将其全部内容通过交叉引用结合在此)。特别地,可以利用细菌微细胞。这些是由于使控制正常细菌细胞分裂的基因失活而产生的无核纳米颗粒(De Boer P.A.,1989)。受体的接合导致微细胞内吞作用、细胞内降解和癌细胞内的活性肽释放,使用所有这样的微细胞来包封本发明的肽并且将其递送至特别地本发明所包括的目标癌细胞。这样的微细胞可以被制成用于注射或口服消费,于是该肽随后从微细胞中释放以经由小肠摄入。还应当理解的是,微细胞可以用来将在此所述的树枝状化合物递送至目标癌细胞。
本发明所包括的肽可通过已建立的合成方法而直接合成。可替代地,通过细菌的大规模发酵,该肽可以来源于天然发生的短杆菌种类,其方法在本领域是已知的,并且被描述于例如美国专利号5470732中。因此,本发明所包括的肽可以直接从天然发生的细菌纯化。
可替代地,该肽可以从重组来源获得,例如,用包含编码该肽的核酸序列的表达载体转染的短杆菌或其他宿主细菌。可以通过重组DNA技术获得的肽的其他形式包括结合该肽的重组融合蛋白。因此,提供融合蛋白以及结合有本发明所包括的肽的融合蛋白的使用特别地由本发明提供。可以使用常规的肽合成或重组技术来合成或生产在此所述的肽和融合蛋白或类似物。可以例如通过如下来提供编码融合蛋白的核酸:通过使用平末端和寡核苷酸连接物将单独的编码具有所希望的三维构象和/或氨基酸序列的肽或多肽的DNA片段连接,进行消化以提供适合的交错末端,并且对粘性末端进行连接。可替代地,可以利用产生具有可以随后连接在一起的互补末端的扩增子的引物,应用DNA片段的PCR扩增(例如,参见Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology,USA,Vol.1 and 2,John Wiley & Sons,1992;Sambrook et al(1998)Molecular cloning:A Laboratory Manual,Second Ed.,Cold Spring Harbour Laboratory Press,纽约)。
可以将肽和融合蛋白在体外表达,并且从用于给予哺乳动物受试者的细胞培养物纯化,或者可以用编码肽或融合蛋白的核酸转染细胞,以将其体外或体内表达。核酸将典型地首先被引入克隆载体中,并在宿主细胞中扩增,然后该核酸被切除,并且被结合进入用于转染细胞的适当表达载体中。
典型的克隆载体结合有允许载体有效复制的复制起点(ori)、能够选择用载体转化的宿主细胞的报道基因或标记基因、以及促使目标核酸序列插入并随后切除的限制性内切酶切割位点。优选地,克隆载体具有结合一个阵列的限制酶切位点的多连接序列。标记基因可以是抗药基因(例如,氨苄西林抗性的Ampr)、编码酶如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-内酰胺酶、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)或例如大肠杆菌(E.coli)lacZ基因(Lac Z′)编码的β-半乳糖苷酶的基因。酵母报道基因包括咪唑甘油磷酸酯脱水酶(HIS3)、N-(5′-磷酸核糖)-邻氨基苯甲酸盐异构酶(TRP1)和β-异丙基苹果酸脱氢酶(LEU2)。如将理解,本发明的表达载体也可以结合有这样的标记基因。
克隆载体包括用于哺乳动物、酵母和昆虫细胞的克隆载体。发现应用的具体载体包括基于pBR322的载体和pUC载体如pUC118和pUC119。适当的表达和克隆载体还例如描述于Sambrook等人(1998)Molecular Cloning.A Laboratory Manual.,Sambrook等人,2nd Ed.ColdSpring Harbour Laboratory,1989中。
适当的表达载体包括能表达DNA(例如,基因组DNA或cDNA)插入片段的质粒和粘粒。表达载体典型地包括插入的核酸序列可操作地连接到其上的转录调控序列。对于“可操作地连接”表示核酸插入片段被连接到转录调控序列上,以允许插入的序列转录而无需在插入片段的阅读框中移动。这种转录调控序列包括促进RNA聚合酶的结合从而启动转录的启动子、能使核糖体结合于转录的mRNA的表达控制元件、以及调节启动子活性的增强子。启动子可以是促进核酸插入片段仅在特定细胞谱系中而不在其他细胞类型中或者在这样的其他细胞类型中仅以相对低水平转录的组织特异性启动子。表达载体的设计将取决于有待转染的宿主细胞、转染方式以及所希望的核酸插入片段的转录水平。
许多适合于原核生物(例如,细菌)或真核生物(例如,酵母菌,昆虫或哺乳动物细胞)转染的表达载体在本领域是已知的。适合于真核细胞转染的表达载体包括pSV2neo、pEF.PGK.puro、pTk2、pRc/CNV、pcDNAI/neo、结合聚腺苷酸化位点和延伸因子1-α启动子的非复制型腺病毒穿梭载体以及基于pAdEasy的最优选结合有巨细胞病毒(CMV)启动子的表达载体。对于昆虫细胞中的表达,可以利用杆状病毒表达载体,其实例包括基于pVL的载体如pVL1392和pVL941、以及基于pAcUW的载体如pAcUW1。
任何用于实现将核酸引入目标细胞的手段均可使用。本领域已知的转移方法包括病毒和非病毒转移方法。可以将适当的病毒表达载体包装在其中以递送至目标细胞的适当病毒包括腺病毒、痘苗病毒、禽类、鼠类和人类来源的逆转录病毒、疱疹病毒-包括单纯疱疹病毒(HSV)和EBV、乳多空病毒如SV40以及腺相关病毒。特别优选的病毒是复制缺陷型重组腺病毒。工程化的病毒可被局部或全身给予,从而实现将核酸序列递送至目标细胞中。
不同于利用病毒介导的细胞转染,核酸序列和其他试剂可通过脂质体介导的转染而被引入到在体外或体内的细胞中。脂质体可以携带将其中所含的核酸最大限度地递送至特定的感兴趣的细胞类型的靶向分子。这种靶向分子包括如上所述的抗体或其结合片段、促进脂质体融合到特定的感兴趣的细胞中的配体或细胞表面受体。也可以使用本领域已知的常规的冷休克或热休克技术或例如磷酸钙共沉淀或电穿孔方案,将核酸从体外递送至细胞内。还有另一个策略是设计具有穿过细胞脂质双层的固有能力的试剂。
虽然本发明的蛋白质或肽的表达可以通过用如上所述的表达载体转化适当的宿主细胞来实现,可替代地,编码本发明的蛋白质或肽的核酸可以被直接整合到宿主细胞的基因组中(典型地连同适当的驱动宿主细胞内的蛋白质或肽的表达的启动子序列)。将核酸插入到宿主细胞之后,可以筛选细胞以鉴定呈现稳定、可复现表达的核酸并且同时产生所希望的蛋白质、融合蛋白或肽的培养物或细胞系。在多种宿主细胞中的核酸的稳定整合和表达在本领域是熟知的,包括例如使用酵母菌(EP19880870152)和细菌表达系统。
可以用于多肽或融合蛋白表达的宿主细胞包括细菌和益生菌,如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、链霉菌(Streptomyces)和假单胞菌(Pseudomonas)、短杆菌(特别是扩展短杆菌细菌菌株)、酵母菌(如酵母(Sacchromyces)和毕赤酵母(Pichia))、昆虫细胞、鸟类细胞以及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS、HeLa、HaRas、WI38、SW480和NIH3T3细胞)。在促进所引入的核酸表达的条件下在适当的培养基中培养宿主细胞,然后根据具体情况而定使用标准纯化技术从宿主细胞和/或上清液纯化表达产物。
可以通过细胞形态学评价、台盼蓝排除、凋亡评定以及细胞增殖研究(例如,细胞计数、3H-胸苷摄入和MTT测定法)测试肽对正常细胞和癌细胞的毒性特征。
也可以将在此所述的具有对癌细胞的抗增殖活性的肽与一种或多种其他化合物或药物共同给予。例如,可以组合或结合反义治疗或一种或多种化学治疗药物而共同给予一种或多种试剂。特别地,在治疗抗药性癌症的实例中,可以组合或结合癌细胞对其具有抗性的化学治疗药物向哺乳动物共同给予一种或多种试剂。对于“共同给予”表示在同一制剂中或通过相同或不同的途径在两个不同的制剂中同时给予;或通过相同或不同的途径顺序给予,这样使得肽和药物/试剂在重叠的治疗窗中发挥其作用。对于“顺序”给予,表示一种制剂在另一制剂之后给予,虽然典型地但非必然地,具有从很短的(从一分钟或数分钟)至数小时的时间延迟。
典型地将一种或多种肽制成药物组合物,其结合了药学上可接受的载体和/或赋形剂以给予预期的受试者。药物组合物包括适于注射的无菌水溶液(其中一种或多种试剂是水溶性的)和用于临时配制无菌注射液的无菌粉末。载体可以是包含生理盐水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、液态聚乙二醇及类似物)、植物油及其混合物中的一种或多种的溶剂或分散介质。可以通过使用包衣(如卵磷脂)和通过使用表面活性剂保持流动性。
典型地通过在选择的溶剂中将期望量的肽与以上列举的多种其他组分结合,然后通过过滤对溶液进行灭菌来制备注射液。通常,通过使肽结合包含分散介质和其他组分的载体来制备分散体。
为了口服给予,可以将一种或多种肽配制在被认为适合的口服可接受的载体中。特别地,可以将肽与惰性稀释剂、可同化可食用的载体一起配制,或者其可被包封在硬壳或软壳胶囊中。而且,可以将在此所述的肽与赋形剂结合,并且以可摄取的片剂、含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液或糖浆的形式使用。用于促进通过胃以经由小肠摄入/延迟摄入的肠制剂对于技术人员也是熟知的,并且特别地被本发明包括。
也可以将本发明所包括的肽配制在局部可接受的载体中,这些载体常规用于形成用于内部或外部施用的膏剂、洗剂或油膏。可以通过浸渍有该制剂的敷料及类似物将局部制剂施用于有待治疗的部位。
典型地,本发明的组合物结合一种或多种防腐剂,如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。在许多情况下,组合物可以进一步包括等渗剂,如糖或氯化钠。延迟吸收剂如单硬脂酸铝和明胶在组合物中的应用可造成肽的延长吸收/摄入。
片剂、糖锭、栓剂、丸剂、胶囊还可以含有以下的一种或多种:粘合剂,如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;崩解剂,如玉米淀粉,马铃薯淀粉或海藻酸;以及润滑剂,如硬脂酸镁。当口服给予试剂时,组合物还可以含有甜味剂,如蔗糖,乳糖或糖精;以及调味剂。
药学上可接受的载体包括任何适当的常规已知的溶剂、分散介质和等渗制剂或溶液。用于药学活性物质的成分和介质的使用是熟知的。除了与活性剂不相容以外,任何常规的介质或试剂的使用均被包括在治疗性和预防性组合物中。如果需要,也可以将增补性活性成分掺入组合物中。
特别优选的是以剂量单位的形式来配制口服组合物,以便易于给药并且剂量一致。如在此所使用的剂量单位形式应当被理解为表示适合于作为针对有待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理离散单位,每一单位包含预定量的本发明所包括的肽,该预定量经计算与所使用的载体结合以产生所希望的治疗或预防效果。
当剂量单位形式是胶囊时,除了一种或多种以上成分以外,它还可以含有液态载体。多种其他成分可以作为包衣或另外地改变剂量单位的物理形式而存在。例如,可以用虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂或胶囊。
此外,药物组合物可以含有本发明的能够转染目标细胞的载体。载体可以例如被封装在适当的病毒中,以便将该载体递送到以上所述的目标细胞中。
药物组合物通常包含按重量计至少大约1%的肽或树枝状化合物。当然该百分比可以改变,并且合宜地可以在组合物或制剂的大约5%w/w至大约80%w/w之间。如将理解的是,在这样的组合物中的肽的量将是这样一个适合的有效剂量,即在考虑所提出的给药方式下递送至受试者。优选的根据本发明的口服组合物将含有大约0.1μg与4000mg之间的肽。
典型地,当口服给予时,将以高达大约200mg/kg个体体重的肽剂量给予该肽,优选地在从大约20mg/kg至40mg/kg体重的范围内。在至少一些实施方案中,将给予该肽以提供在从大约5至25mg/kg体重范围内的肽的口服剂量,通常在大约5mg/kg至大约20mg/kg的范围内,更通常地在10mg/kg至大约20mg/kg的范围内。当作为肽树枝状化合物给予时,每天可给予高达大约20g的树枝状化合物(例如,4个口服剂量,各自含有5g的树枝状化合物)。
肽的剂量将取决于许多因素,包括有待给予的肽是用于预防还是治疗、针对预期给予的试剂的病症、病症的严重程度、受试者的年龄、以及相关因素,包括受试者的重量以及如医师或医疗助理根据公认的原则所确定的总体健康状况。例如,最初可以给予一个低剂量,随后在每次给予时根据受试者的反应的评价而增加剂量。类似地,可以按相同的方式,即通过连续监测每次用药之间的受试者的反应来确定给药频率,并且如果必要的话,增加给药频率或者可替代地减少给药频率。
药物组合物的给药途径将再次取决于针对有待给予的该组合物的癌症的性质。适当的给药途径包括但不限于:口服、静脉内、皮下、直肠和局部。关于静脉内途径,特别适合的途径是经由注射而进入供给有待治疗的肿瘤或特定器官的血管中。也可以将这些肽递送到这样的腔(例如胸膜腔或腹膜腔)中,或者直接注射到肿瘤组织中。
实际上,在一个或多个实施方案中,通过摄取或消费该肽或表达该肽或表达当胃蛋白酶消化时释放出本发明包括的肽的蛋白质的细菌或其他生物(如酵母菌)而将肽递送至哺乳动物中。这可以例如通过消费包含短杆菌或其他细菌的奶酪来实现:该短杆菌或其他细菌产生肽或蛋白质,该蛋白质的胃蛋白酶切割释放本发明包括的肽或另外影响本发明包括的预防性或治疗性处理。也可以通过向哺乳动物直接给予表达该肽或蛋白质的细菌生物来实现肽剂的递送。
可以胶囊或片剂形式或以松散粉末形式给予短杆菌(例如,扩展短杆菌)或其他生物。可替代地,可以通过被哺乳动物消费适合于哺乳动物消费的食品或营养增补剂的形式而给予扩展短杆菌或其他生物。这也适用于肽或蛋白质的纯化形式。本领域技术人员已知的任何适当的食品或增补剂可被用作载体。例如,可以通过奶酪或发酵型或非发酵型饮品如基于乳制品的饮品(发酵型或非发酵型)或果汁的消费来给予细菌、肽或蛋白质。
此外,能够以活的或杀死的形式来给予扩展短杆菌或其他生物。可以通过声处理或本领域技术人员已知的用于本发明目的的任何其他适当的方法来实现生物的杀死。扩展短杆菌或其他生物的剂量可以在以单剂量或多剂量给予的108至1012个生物的范围内。应当理解的是,大约109、1010或1011的剂量也被特别地包括在内。生物提取物可以例如是该生物的溶解或碎裂的制剂的声处理部分或其他部分。例如,当该生物是适当的细菌时,它可以活的形式或者作为适当载体中的细菌细胞制剂被给予。在一些实施方案中,细菌制剂的溶解或声处理和/或分馏提取物可被提供在适当的载体中,用作药物组合物或作为营养增补剂。虽然描述了使用细菌生物来产生本发明所述的蛋白质和肽,也可以使用其他生物来表达/产生本发明的蛋白质或肽。例如,可以在酵母中表达这些蛋白质或肽以提供细胞制剂或其提取物(通过声处理、溶解和/或分馏),然后给予受试者,或者将其包含在营养增补剂中。
在本发明的组合物中有用的适当的药学上可接受的载体和制剂可以例如发现于本领域技术人员熟知的手册和教科书中,如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Mack PublishingCo.,1995)”,将其全部内容通过引用结合在此。
根据本发明的实施方案的肽所治疗的癌症可以选自下组,该组由以下各项组成:癌、肉瘤、淋巴瘤、头颈部癌、白血病以及以下部位的癌:肝、舌、唾液腺、齿龈、口底和口中其他区域、口咽、鼻咽、下咽以及口腔其他部位、食道、胰、胃肠道、胃、小肠、十二指肠、结肠、结肠直肠、直肠、胆囊、胰、喉、气管、支气管、肺(包括非小细胞肺癌)、乳房、子宫、宫颈、卵巢、阴道、外阴、前列腺、睾丸、阴茎、膀胱、肾、甲状腺、骨、骨髓和皮肤(包括黑素瘤)。典型地,癌症是上皮起源的。最通常地,癌症选自由胃肠道癌症组成的组,包括胃癌、结肠癌和结肠直肠癌。
可以将在此所述的肽或树枝状化合物与常规用于治疗癌症的一种或多种其他化合物或药物共同给予。例如,肽或树枝状化合物可以组合或结合一种或多种化学治疗药物共同给予,该一种或多种化学治疗药物选自下组,该组由以下各项组成:基于常规金属和非金属的抗癌药物、以及其他抗癌药物。基于金属的药物可以是有机、无机、混合配体配位化合物或螯合物,包括铂和钯的络合物。基于铂的化学治疗药物的实例包括顺铂(顺式-二氨二氯铂(II)、奥沙利铂(oxaliplatin)([Pt((1R),(2R)-环己烷-1,2-二胺)(草酸根)]络合物、以及卡铂(顺式-1,1-环丁烷二羧酸二氨铂)(II)。非金属化学治疗药物的实例包括紫杉醇、格列卫(gleevac)、多西他赛(docetaxel)、紫杉酚、5-氟尿嘧啶、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱(Oncovin)、长春碱、长春地辛、喜树碱(camplothecin)、吉西他滨(gemcitabine)、阿霉素以及拓扑异构酶抑制剂如伊立替康(irinotecan)(CPT-11)。可以与肽/树枝状化合物共同给予的其他抗癌药物包括处于非树枝状化合物形式的src激酶抑制剂和抗癌多肽(如具有抗src激酶活性或结合β整联蛋白的亚单位的结合结构域的那些多肽(或其修饰形式)。
参考多个非限制性实施例,下文进一步示例本发明。
实施例1:扩展短杆菌假定DNA转座酶的理论性胃蛋白酶消化
衍生自细菌扩展短杆菌的假定DNA转座酶(登录号O68604)的理论性胃蛋白酶消化(Expasy肽剪切:http://au.expasy.org/tools/peptidecutter)揭示了一种肽,在下文中称为22C(SEQ ID No.4)(图3):含有多个类似于功能限定的线性肽序列的基序。该22C肽含有线性阳离子序列RGRAK(SEQ ID No.1)(图3;虚线下划线),该序列是阳离子抗微生物肽类的特征(Jin等人,2005);部分NPXY基序(SEQ ID.2),特别是羧基末端的DPL(SEQ ID No.15)(图3;双下划线),它是已知的针对细胞内接头蛋白(intracellular adaptor)和支架蛋白的停泊位点(dockingsite),并可以在信号转导途径的调节中发挥作用(Trommsdorff等人1998),以及碱性肽序列RRRVQQ(SEQ ID No.5)(图3;实线下划线),其类似于TAT 48-60肽GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID No.3)的一部分,相似的区段被加下划线。TAT 48-60肽是许多已经证明具有转运小分子或大分子穿过细胞膜的能力的肽之一。
使用延伸型式的肽22C(在下文中称为肽24-NH2(SEQ ID.No.7)(图3),其包含完整NPLYR(SEQ ID.22)同源基序)利用设置在默认参数的www.Ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/来进行BLAST-P分析。该搜索产生了六个24-NH2样序列(SEQ ID No.9-14),其全部居于假定的转座酶蛋白质中(图4)。在这六个序列之间的保守氨基酸存在于阳离子抗微生物肽中发现的线性阳离子序列中的TAT样基序中,以及在部分NPXY基序(SEQ ID No.2)(图4;粗体表示的残基)中。然而,这些序列的不同之处在于理论胃蛋白酶消化(Expasy肽剪切程序)(图4;下划线表示的消化片段)之后产生的肽的特征,其中胃蛋白酶消化通常损害在22C(SEQ ID No.4)中鉴定的三个定义基序的完整性。在22C中的这些基序的组合表明,该肽可以穿过细胞膜并且影响涉及细胞生长的细胞内信号通路。
实施例2:肽24-NH2(SEQ ID No.7)、22C(SEQ ID No.4)和肽22C(SEQ ID No.4)的修饰形式的抗增殖活性的评定
2.1HT29人结肠直肠腺癌细胞、SW480结肠癌细胞和MKN45胃癌细胞的培养
HT29(结肠直肠腺癌)(ATCC HTB-38;马纳萨斯(Manassas),VA)。SW480结肠癌细胞(ATCC)和MKN45胃癌细胞(癌症研究实验室,新南威尔士大学,悉尼,澳大利亚)被保持在DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,该DMEM含有10%热灭活的、过滤的胎牛血清(FBS;Invitrogen)和20mM HEPES缓冲液。在设定在37℃、空气中5%CO2的培养箱中进行细胞培养。细胞在组织培养瓶中生长至大约80%汇合,之后通过胰酶消化从基底回收。简要地,去除留存的培养基,并用无菌磷酸盐缓冲盐水溶液将细胞洗涤两次。以足以覆盖细胞的量添加一定体积的在EDTA中的10X胰蛋白酶(提供0.5%胰酶w/w)。当细胞已充分脱离基底时,通过添加在DMEM中的10%FBS来终止胰蛋白酶活性。将脱离的细胞移至无菌锥形管中,并且使悬浮的细胞上下通过10ml移液管十次,以产生适合于计数的单细胞悬浮液。使用成活力染料(台盼蓝)并且使用血细胞计数器计数来测定活细胞的数量。
2.2MTT细胞增殖测定
MTT细胞增殖测定测量细胞增殖率,并且在细胞成活力受损的的情况下,该测定表明在细胞成活力方面的相对降低。
将胰酶消化后的活细胞的单细胞悬浮液以每孔2x103个细胞的密度接种于96孔组织培养板中,每孔体积为100μl的有或没有血清的培养基。针对被测试的化合物的每个浓制备了一组一式三份的孔。将另外的含有未处理的细胞或仅有介质的样品孔设立于各个处理板中,并且将其平行处理作为参考对照。同时制备具有未处理的细胞和仅有介质的孔的零时板(zero-time plate),并且在将化合物添加至处理板(参见以下步骤)时对该板进行MTT测定。在添加化合物之前,将所有板培养24小时。
通过将新制备的在生理盐水中的无菌1mM母液稀释到细胞培养基中以提供200μl的最终培养孔体积来制成适当的化合物浓度。此时通过添加MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑;Sigma,St Louis MO)处理零时板。在添加在PBS中的20μl MTT(5mg/ml,0.2μm过滤灭菌)之前,将细胞继续培养另外的48小时。在MTT存在下孵育3小时之后,在450g下将板旋转5分钟,通过轻轻吸取除去上清液,并将沉淀的四唑盐再悬浮到150μl DMSO:甘氨酸(0.1M甘氨酸,0.1M NaCl pH 10.5)(6∶1v/v)溶液中。将板轻轻涡旋至晶体物质完全溶解,并在540nm下使用酶标仪读取吸光度。处理样本数据,从而确定处理后样本相对于未处理对照的相对生长。所有实验均进行至少三次。
2.3结果
在如以上所述的MTT细胞增殖测定中测量了这些感兴趣的肽的抗增殖活性。将肽24-NH2(SEQ ID No.7)合成并且酰胺化以提供保护从而免于被包含在添加有血清的细胞培养基中的血清衍生的外肽酶引起降解的可能。以作为延长血清或血浆半衰期的手段的这样一种方式来修饰许多天然发生的哺乳动物肽(Adessi and Soto,2002)。
特别地,通过MTT测定(72小时)用肽24-NH2(SEQ ID No.7)激发HT29人结肠直肠腺癌细胞,并且将结果显示在图5a中。正如可以看出的,结果表明,肽24-NH2在50μM浓度下以高达36%抑制了结肠癌细胞在体外的细胞增殖。
然后通过MTT测定但在无血清的培养条件下测试了肽22C(SEQ ID No.4)的抗增殖活性。游离的COOH基团被包含在肽22C的羧基末端,以模拟在胃的细菌转座酶蛋白的胃蛋白酶消化之后将产生的肽形式。平行地测试了来自22C的两种肽衍生物:一种被称为14C(H-DDVRRRVQQETTGH-COOH)(SEQ ID NO.15)(图5b),其含有TAT样基序;另一种被称为8C(图5b;SEQ ID No.16),其含有线性阳离子序列以及部分NPXY-基序(SEQ ID No.2)(图5c)。所有肽均在缺乏血清的情况下抑制了HT29结肠癌细胞的生长(72小时测定)。
然后通过含血清的MTT测定(24小时分析)(图5d)测试同样的肽。结果表明,肽22C在35uM的浓度下以高达54%抑制了结肠癌细胞的体外细胞增殖,比在添加有血清的培养基中的肽14C和肽8C更有效(图5d),而且比24-NH2肽更有效(图5a)。
随后通过48小时MTT测定将肽22C在血清存在下对HT20结肠直肠腺癌细胞的生长抑制效果与其对SW480人结肠癌细胞和MKN45人胃癌细胞的效果进行比较。发现在48小时测定中22C肽对SW480和MKN45细胞的增殖抑制的程度与其对HT29细胞相似(图6)。
本领域的技术人员应当理解的是,可以进行多种改变和/或修改而不偏离正如宽泛地描述的本发明的范围。因此,这些实施方案将在所有的方面被认为是用作说明性的而不是限制性的。
参考文献
Adessi C and Soto C.Converting a peptide into a drug:strategies toimprove stability and bioavailability.Curr Med Chem.2002;9:963-978.Cloninger,MJ,Biological applications of dendrimers.Curr.Opin.Chem.Biology.6,742-748(2002).
De Boer PA,Crossley,RE,and Rothfield,LI.A division inhibitor andtopological specific factor coded for by the miicell locus determine properplacement of the division septum in E.coli.Cell 1989,56;641-649.
Derossi D,Calvet S,Trembleau A et al J Biol Chem 1996,271:18188-18193.
Derossi D,Joliot AH,Chassaing G and Prochiantz A.J Biol Chem 1994,269:10444-10450.
Jin Y,Hammer J,Pate M,Zhang Y,Zhu F,Zmuda E and Blazyk J.Antimicrobial Activities and Structures of Two Linear Cationic PeptideFamilies with Various Amphipathic -Sheet and -Helical Potentials.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2005;49:4957-4964.
Lee,CC,MacKay,JA,Frechet,JM.and Szoka,FC.Designingdendrimers for biological applications.Nature Biotech.23,1517-1526(2005).
MacDiarmid,JA.,Mugridge,NB.,Wiess,JC.Bacterially derived 400nmparticles for encapsulation and cancer cell targeting of chemotherapeutics.Cancer Cell 2007;11;431-445.
Needlemen,S.B.,and Wunsch,C.C.A general method applicable tothe search for similarities in the amino acid sequence of two proteins.J.Mol.Biol.48(3),443-53,1970.
Onraedt A,Soetaert W and Vandamme E.Industrial importance of thegenus Brevibacterium.Biotechnology Letters.2005;27:527-533.
Pooga M,Hallbrink,Zorko M,Lange IU.Faseb J 1998,12(1),67-77
Prochiantz A,Curr Opin Neurobiol 1996,6(5):629-634.
Rice PA and Baker TA Comparative architecture of transposase andintegrase complexes.2001 Nature Structural Biology 8:302-307.
Sadler,K.and Tam,JP.Peptide dendrimers:applications andsynthesis.Rev.Mol.Biotechnology.90,195-229,(2002).
Trommsdorff M,Borg J-P,Margolis B,and Herz J.Interaction ofCytosolic Adaptor Proteins with Neuronal Apolipoprotein E Receptors andthe Amyloid Precursor Protein.
J Biol Chem.1998;273:33556-33560.
Claims (25)
1.一种纯化的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
2.根据权利要求1所述的肽,由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287组成。
3.根据权利要求1所述的肽,是由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的肽的修饰或同源形式。
4.根据权利要求3所述的肽,其中该肽的所述修饰或同源形式的至少8个连续氨基酸与限定该基序的氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
5.根据权利要求3或4所述的肽,其中该基序与SEQ ID No.4在同源位置。
6.根据权利要求3至5的任一项所述的肽,各自包含所述完全或部分RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID.No 1)基序。
7.根据权利要求3至6的任一项所述的肽,包含DPL基序(SEQ ID No.6)的完全或部分形式。
8.根据权利要求1所述的肽,包含DDVRRRVQQETTGH(SEQ ID No.15)或其修饰或同源形式。
9.根据权利要求1所述的肽,包含RGRAKDPL(SEQ ID No.16)或其修饰或同源形式。
10.根据权利要求1至9的任一项所述的肽,任何这些基序之间不具有内部胃蛋白酶切割位点。
11.根据权利要求1至5的任一项所述的肽,是Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的活性片段。
12.根据权利要求11所述的肽,选自由DDVRRRVQQETTGH(SEQ ID No.15)和RGRAKDPL(SEQ ID No.16)组成的组。
13.根据权利要求1至12的任一项所述的肽,该肽结合到促进该肽进入癌细胞的促进部分上。
14.一种树枝状化合物,存在如在权利要求1至13的任一项中所限定的肽的多个拷贝。
15.一种微细胞,结合有如在权利要求1至13的任一项中所限定的肽。
16.一种预防或治疗哺乳动物中的癌症的方法,包括用有效量的蛋白质治疗哺乳动物,该蛋白质包含由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)编码的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ IDNo.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
17.根据权利要求16所述的方法,包括由哺乳动物消费有效量的一种细菌生物或该细菌生物的提取物或将其给予至哺乳动物,该细菌生物表达该肽或者在被胃蛋白酶切割时释放该肽的蛋白质,该提取物含有该肽或蛋白质。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述细菌生物是扩展短杆菌。
19.根据权利要求16所述的方法,包括向该哺乳动物给予含有该肽或蛋白质的食品或营养增补剂。
20.一种抑制癌细胞生长的方法,包括使细胞接触有效量的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ IDNo.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
21.一种药物组合物,包含由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式、连同药学上可接受的载体和/或赋形剂,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQID No.5)和RGRAK(SEQ ID No.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
22.根据权利要求20所述的药物组合物,包含表达权利要求1至13的任一项限定的肽的生物的细胞制剂或其提取物。
23.一种用于哺乳动物消费的营养增补剂,所述营养增补剂包含纯化的由Genbank登录号O68604的氨基酸266至287(SEQ ID No.4)组成的抗癌肽或该肽的修饰或同源形式、连同可食用的载体和/或赋形剂,该肽的修饰或同源形式包括选自下组的基序的至少一种完全或部分形式,该组由RRRVQQ(SEQ ID No.5)和RGRAK(SEQ IDNo.1)组成,并且5个以上连续氨基酸与限定该基序的Genbank登录号O68604的氨基酸266-287(SEQ ID No.4)的至少8个连续氨基酸具有至少75%的氨基酸序列一致性。
24.根据权利要求23所述的营养增补剂,包含表达该肽的生物的细胞制剂或其提取物。
25.一种用核酸序列转化的宿主细胞,该宿主细胞用于表达如在权利要求1至13的任一项中所限定的抗癌肽。
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Citations (2)
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---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5830667A (en) * | 1991-06-17 | 1998-11-03 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale-Inserm | Human P450 IID6 cytochrome-derived peptide fragments, anti-peptide fragment antibodies, applications thereof in the diagnosis of autoimmune hepatitis |
WO1996028563A1 (en) * | 1995-03-09 | 1996-09-19 | Bavarian Nordic | Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
POLARD P ET AL: "Bacterial transposases and retroviral integrases", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY》 * |
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