CN113354726B - 乳铁蛋白活性肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乳铁蛋白活性肽及其应用。本申请的第一方面，提供乳铁蛋白活性肽，该乳铁蛋白活性肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1～3中任一种，或为SEQ ID No.1～3中任一种所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得氨基酸序列。根据本申请实施例的乳铁蛋白活性肽，至少具有如下有益效果：本申请实施例通过对蛋白酶消化的乳铁蛋白的分离、表征、稳定性鉴定以及对癌细胞特异性和细胞毒性研究，发现了具有良好稳定性和抗癌活性的乳铁蛋白活性肽。这些乳铁蛋白活性肽与全长乳铁蛋白(flHLF)相比，对人类癌症细胞系的抗癌活性有了明显提高。

Description

乳铁蛋白活性肽及其应用
技术领域
本申请涉及癌症治疗技术领域，尤其是涉及乳铁蛋白活性肽及其应用。
背景技术
癌症是死亡率位居前列的疾病，每年导致的死亡人数占到全球疾病死亡人数的很大一部分。目前，癌症的治疗方法主要包括手术、放疗和化疗等。手术通常只能够切除治疗部位的癌症发生组织，对于已经发生转移的癌症则难以发挥作用。放疗与手术类似，属于局域性治疗。相比较而言，化疗则是一种全身治疗的手段。化疗药物被注入病人体内后，会通过血液运输到全身的绝大部分组织和器官，因而对于扩散性强和已经发生转移的肿瘤有明显的治疗作用。虽然这些治疗方法可以减缓和治疗癌症，但其在杀死癌细胞的同时往往也会对正常细胞造成不同程度的杀伤，产生很多副作用，使患者预后和生活质量大大下降。因此，迫切需要寻找新的抗癌疗法。
乳铁蛋白是一种天然形成的铁结合糖蛋白，具有抗菌、抗氧化等多种作用。乳铁蛋白作为先天性免疫的必要元素，还具有诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力。而许多体内外研究也证实了乳铁蛋白具有抗肿瘤活性。免疫调节是乳铁蛋白发挥抗肿瘤作用的重要机制，可以通过诱导产生细胞因子、增加免疫细胞数量及活性来提高宿主防御肿瘤的能力。此外，乳铁蛋白还可能通过多种途径抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。部分研究表明，经蛋白酶消化后的乳铁蛋白与全长乳铁蛋白相比，具有更好的抗微生物和抗菌性能。然而，当前对于消化后的乳铁蛋白的抗癌活性的研究仍然有限。因此，有必要提供一种抗癌活性更好的乳铁蛋白活性肽。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种乳铁蛋白活性肽及其应用，该乳铁蛋白活性肽相比于全长乳铁蛋白具有更优良的抗癌活性。
本申请的第一方面，提供乳铁蛋白活性肽，该乳铁蛋白活性肽的氨基酸序列为SEQID No.1～3中任一种，或为SEQ ID No.1～3中任一种所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得氨基酸序列。
根据本申请实施例的乳铁蛋白活性肽，至少具有如下有益效果：
本申请实施例通过对蛋白酶消化的乳铁蛋白的分离、表征、稳定性鉴定以及对癌细胞特异性和细胞毒性研究，发现了具有良好稳定性和抗癌活性的乳铁蛋白活性肽。这些乳铁蛋白活性肽与全长乳铁蛋白(flHLF)相比，对人类癌症细胞系的抗癌活性有了明显提高。
本申请的第二方面，提供偶联物，该偶联物包括上述的乳铁蛋白活性肽和偶联部分。通过在上述乳铁蛋白活性肽上结合偶联部分从而实现多重功能的组合。偶联部分的非限制性实例包括其它功能性多肽或蛋白(例如穿膜肽、蛋白标签以及用于靶向的抗原、抗体等)、检测标记(例如荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性核素、量子点等)中的至少一种。
本申请的第三方面，提供分离的核酸分子，所述核酸分子编码前述乳铁蛋白活性肽或其偶联物。
在其中一些实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.4～6中任一项所示。
本申请的第四方面，提供重组载体，该重组载体包括前述的核酸分子。
本申请的第五方面，提供重组细胞，该重组细胞包括前述的核酸分子或重组载体。
本申请的第六方面，提供制备前述的乳铁蛋白活性肽的方法，该方法包括以下步骤：培养前述的宿主细胞，获得培养物；从培养物中分离得到乳铁蛋白活性肽。
通过这种方式获得的乳铁蛋白活性肽相比于现有的人源乳铁蛋白在抗癌活性等方便有明显提升，用于治疗时能够获得更好的疗效。
本申请的第七方面，提供组合物，该组合物包括前述的乳铁蛋白活性肽，或包括前述的偶联物，或包括前述的核酸分子，或包括前述的重组载体，或包括前述的重组细胞。
在其中一些实施例中，组合物还包括药学上可接受的载体。通过载体将乳铁蛋白活性肽形成药物制剂，施用后相比于现有的人源乳铁蛋白具有更好的抗肿瘤作用。
本申请的第八方面，提供上述乳铁蛋白活性肽、偶联物、核酸分子、重组载体、重组细胞或组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
在其中一些实施例中，癌症为胃癌、乳腺癌、结直肠癌中的至少一种。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1为本申请的实施例1中分离出的肽段的抗癌效果实验结果。其中，a为胰蛋白酶和胃蛋白酶消化乳铁蛋白和相应对照组的SDS-PAGE图。b为经胰蛋白酶和胃蛋白酶消化得到的不同肽段对CT26、HCT116、MCF7和AGS四种癌细胞的抗癌活性实验的结果，c为三种肽段在37℃下随时间的稳定性变化情况，d为三种肽段在不同pH条件下12小时后的稳定性变化情况，e为三种肽段与乳铁蛋白及其他乳铁蛋白衍生片段比较的序列比较。
图2是本申请的实施例1中rtHLF4的相关实验结果。其中，a为乳铁蛋白和rtHLF4的铁离子饱和度百分比，b为rtHLF4结构建模结果，c为乳铁蛋白的晶体结构，d和e分别为重组乳铁蛋白和rtHLF4的尺寸排斥分离。f为纯化乳铁蛋白(左侧深色)和rtHLF4(右侧浅色)对人红细胞的溶血试验结果。
图3为乳铁蛋白与rtHLF4的序列比对结果。
图4为实施例2的细胞毒性实验结果。其中，a～f分别表示经flHLF(左侧深色)与rtHLF4(右侧浅色)处理3hr、24hr和72hr后，乳腺癌细胞株MCF7、胃癌细胞株HGC27、胃癌细胞株AGS、结直肠癌细胞系Caco2、结直肠癌细胞系LoVo、结直肠癌细胞系HCT116的半抑制率IC50结果。
图5为乳铁蛋白对MCF7人乳腺腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的MCF7细胞形态(标尺＝100μm)。
图6为乳铁蛋白对HGC27人胃腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的HGC27细胞形态(标尺＝100μm)。
图7为乳铁蛋白对AGS人胃腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的AGS细胞形态(标尺＝100μm)。
图8为乳铁蛋白对Caco2人结直肠腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的Caco2细胞形态(标尺＝100μm)。
图9为乳铁蛋白对LoVo人结直肠腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的LoVo细胞形态(标尺＝100μm)。
图10为乳铁蛋白对HCT116人结直肠腺癌细胞的抗癌活性实验结果。其中，a和b分别表示flHLF与rtHLF4的抗癌活性，c为不同浓度flHLF和rtHLF4处理不同时间后的HCT116细胞形态(标尺＝100μm)。
图11中a为胃癌、结肠癌和乳腺癌细胞经flHLF和rtHLF4处理后不同基因的定量PCR结果，b为rtHLF4在癌细胞系中的不同抗癌途径。
图12为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导MCF7人乳腺癌细胞中的TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Westernblot结果。
图13为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导HGC27人胃腺癌细胞中的TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Westernblot结果。
图14为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导AGS人胃腺癌细胞中的TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Westernblot结果。
图15为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导Caco2人结直肠腺癌细胞中TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Western blot结果。
图16为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导LoVo人结直肠腺癌细胞中TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Western blot结果。
图17为不同浓度、不同处理时间flHLF和rtHLF4诱导HCT116人结直肠腺癌细胞中TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Western blot结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下述各个实施例中的所有数据均来自三个独立实验。采用SigmaPlot和GraphPad软件进行统计学分析，计算p值，确定观察差异的统计学意义。结果用星号表示(*，P<；0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。
实施例1
乳铁蛋白活性肽分离实验
重组表达的人源乳铁蛋白与胃蛋白酶(5mg/mL)和反应缓冲液(0.1M甘氨酸-HCL，pH3.0)在37℃条件下孵育3h，随后用氢氧化钠调节pH至6.8，终止消化。
重组表达的人源乳铁蛋白与胰蛋白酶(0.15mg/mL)和反应缓冲液(0.05M Tris，0.02MCaCl2，pH 7.8)在37℃下孵育24h，随后加入生理盐水终止消化。
上述两组分别设置不加胃蛋白酶和胰蛋白酶的对照，并对消化产物进行SDS-PAGE电泳，结果如图1的a所示，从左到右分别为Marker(M)、阴性对照(-)、胰蛋白酶组(T)、胃蛋白酶组(P)、胰蛋白酶对照组(-T)、胃蛋白酶对照组(-P)。从图中可以看出，经过胰蛋白酶和胃蛋白酶消化，能够得到不同大小的乳铁蛋白的片段。
采用CT26小鼠结肠癌细胞、HCT116人结肠癌细胞、MCF7人乳腺腺癌细胞、AGS人胃腺癌细胞作为对象，检测消化得到的不同片段的抗癌活性。具体方法如下：
根据大小对片段进行分类，将目标片段从SDS-PAGE中切除，用MALDI-TOF质谱进行测序。根据测序结果利用引物从乳铁蛋白全长中扩增出各个片段基因，扩增产物用限制性内切酶克隆到pET28b载体上。转化pET28b质粒的BL21(DE3)在37℃，以0.5mM的IPTG在OD600＝0.6诱导下，以225rpm培养，20℃,160rpm表达。收集细胞，在裂解缓冲液中重悬(50mMTris-HCL，300mM NaCl，10％甘油，3mMβ-巯基乙醇，pH7.5)，使用高压匀质机裂解。通过IMACNi-NTA纯化，然后使用高效Superdex 200柱(GE)进行尺寸层析(SEC)，从而得到纯化后的目标片段。
将对数期的癌细胞吹打成单细胞悬液，按照一定的接种量接种到96孔板中，37℃、5％CO2、100％湿度下培养24h以保证细胞状态良好，贴壁正常。随后加入多肽片段的溶液继续培养24h。使用CellTiter
Figure BDA0003112823890000041
One水溶液试剂盒(Promega，USA)检测细胞活力。
结果如图1的b所示，从图中可以看出，三个肽段(rtHLF4，rteHLF1和rpHLF2)对4种癌细胞株有较好的抑制作用，抑制了50％以上的癌细胞，因此，初步判断这三个肽段可以作为乳铁蛋白活性肽使用。进一步比较三个肽段在37℃下的稳定性，结果如图1的c所示，从图中可以看出，随着孵育时间的延长，rteHLF1和rpHLF2的浓度有明显的下降，而rtHLF4则几乎仅有轻微的下降。而这三个肽段在不同pH条件下孵育12h后的比较结果如图1的d所示，从图中可以看出，pH为6～8孵育12h后，rteHLF1和rpHLF2的浓度有明显的下降。根据图1的c和d的结果发现，在这三个肽段中，只有肽段rtHLF4在人生理温度和pH下的稳定性较好。
对获得的rtHLF4序列的基因合成进行优化，通过进一步修饰去除蛋白酶敏感序列，以提高rtHLF4的稳定性。
rtHLF4、rteHLF1和rpHLF2的氨基酸序列如下：
YKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVGEQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDEGYVYTAGKCGLVPVLAENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGAFRC(rtHLF4，SEQ ID No.1)；
YKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVP(rteHLF1，SEQ ID No.2)；
QWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAENRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIR(rpHLF2，SEQ IDNo.3)。
与乳铁蛋白及其他乳铁蛋白衍生片段比较，结果如图1的e所示，从图中可以看出，这三个肽段都在N端和C端被截断。
由于rtHLF4在人的生理条件下表现出的稳定性，因此，对rtHLF4进行进一步研究。根据图1的e，假设rtHLF4截断了C端以稳定乳铁蛋白，而缺少C端结构域的rteHLF1和rpHLF2在不同的pH和温度变化下稳定性较差。图2的a为乳铁蛋白、重组乳铁蛋白和rtHLF4的铁离子饱和度，从图中可以看出，rtHLF4的结构域内铁含量仅为乳铁蛋白和重组乳铁蛋白的铁含量的约1/3。
因为全长乳铁蛋白(flHLF)由两个球状叶组成，每个叶有一个铁结合位点。而rtHLF4的铁离子占比降低到约1/3，说明由于失去了铁离子结合残基，被截断的氮端和被破坏的碳端不能保持铁离子结合活性。图2的b和c分别为模拟的rtHLF4结构与乳铁蛋白晶体结构，d和e为重组乳铁蛋白和reHLF4的大小排除分离。从上述图中可以看出，与flHLF结构相比，模拟的rtHLF4结构显示其碳端的扰动影响了铁结合袋。此外，rtHLF4既可以存在于单体构象中，也可以存在于二聚构象中，而flHLF倾向于处于二聚态。这些结果表明，截断的碳端有助于蛋白质稳定，但会导致铁结合的损失，并干扰二聚界面。
进一步将rtHLF4进行溶血实验，步骤如下：
采集健康志愿者(年龄25～40岁，实验前2周未服用任何非甾体抗炎药物)的新鲜血液。然后，将血液与等量的灭菌Alsever溶液(2％的葡萄糖，0.8％的柠檬酸钠，0.5％的柠檬酸和0.42％的氯化钠)混合。3000rpm离心5分钟。填充细胞用等生理盐水(0.9％w/vNaCl)洗涤，用10％的等生理盐水制成悬液。用蛋白缓冲液配制不同浓度的蛋白(100μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM)，分别加入1mL磷酸盐缓冲液、2mL降钙素和0.5mL HRBC(人红细胞)悬液。37℃孵育30min，3000rpm离心20min。在560nm波长下测定上清液中的血红蛋白含量。
结果如图2的f所示，从图中可以看出，不同浓度rtHLF4处理条件下均无溶血现象发生。
实施例2
分别检测flHLF和rtHLF4对癌细胞的细胞毒性。其中，所有细胞系均来自ATCC，人乳腺腺癌细胞MCF7在DMEM培养基中培养，人胃腺癌细胞HGC27在RPMI-1640培养基中培养，人结肠腺癌细胞Caco2在MEM培养基中培养，人结肠癌细胞HCT116在McCoy’s 5A培养基中培养，人结肠腺癌细胞LoVo和人胃腺癌细胞AGS在Hum’s F12培养基中培养。所有细胞培养基均购自Hyclone，添加1％抗生素(青霉素/链霉素)和10％胎牛血清(v/v)。所有细胞培养在37℃，5％CO2中保持。
步骤如下：将细胞分别接种于96孔板中，并分别与不同浓度的flHLF和rtHLF4共孵育至3小时、24小时和72小时。使用CellTiter
Figure BDA0003112823890000051
One水溶液试剂盒(Promega,USA)检测细胞活力。抽吸细胞培养基，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，然后用MTS在37℃ 5％CO2中孵育1-4h。加入10％SDS终止反应。所有孔的吸光度波长为490nm。
flHLF和rtHLF4对各个癌细胞株的半数最大抑制浓度IC50的结果如图4所示，其中，a～e分别为乳腺癌细胞MCF7、胃癌细胞HGC27、胃癌细胞AGS、结直肠癌细胞Caco2、结直肠癌细胞LoVo和结直肠癌细胞HCT116的结果，同一时间下左侧深色为flHLF，右侧浅色为rtHLF4。图5～图10分别为乳腺癌细胞MCF7、胃癌细胞HGC27、胃癌细胞AGS、结直肠癌细胞Caco2、结直肠癌细胞LoVo和结直肠癌细胞HCT116在flHLF和rtHLF4处理后的细胞形态(图5～图10的c)以及flHLF和rtHLF4对应的抗癌活性(图5～图10的a～b)。
从图4中可以看出，对于a～e中的癌细胞而言，共孵育时间无论是3小时、24小时还是72小时，rtHLF4相比于flHLF的IC50都普遍更低。对比图5～图10的a与b，可以发现rtHLF4对癌细胞的杀伤效率比flHLF高出1～2个数量级。同时结合图5～图10的c，阴性对照组细胞形态正常，rtHLF4处理24小时后大部分癌细胞已经完全失去其正常细胞形态，对癌细胞完全抑制，而flHLF在相同条件下则需要更长的处理时间。rtHLF4对不同癌细胞株的剂量依赖性细胞活性试验显示其疗效和敏感性都有所提高。
综合上述实验结果可以看出，本申请实施例所提供的rtHLF4相比于flHLF具有更好的杀伤效果，会显著改变其细胞形态。
实施例3
分别取实施例2中3hr、24hr和72hr共孵育处理后的癌细胞，使用
Figure BDA0003112823890000061
superTotal RNA提取试剂盒(Promega,UAS)提取6种不同癌细胞中的RNA。逆转录成cDNA，每个样品的1μg RNAs使用GoScriptTM逆转录系统(Promega,USA)，按照说明书逆转录成cDNA。随后，20ng cDNA与特异性引物混合，采用FasStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Promega)，ABI StepOne Plus Realtime PCR System(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)进行定量PCR(qPCR)。引物序列见表1。数据采用经典的2-ΔΔCt方法进行分析，并用GAPDH进行归一化。
表1.RT-PCR引物
Figure BDA0003112823890000062
图11中a为定量PCR结果，b为rtHLF4在癌细胞系中的不同抗癌途径。图11的a显示了rtHLF4和flHLF处理的癌细胞培养物中促凋亡、血管生成和转移蛋白的基因表达。与flHLF相比，rtHLF4的抗癌机制涉及死亡受体通路(caspase3、caspase8)、线粒体外膜通透(bax/bak、bcl2)和p53相关通路(p53、GDF15、TAZ)。
另外，采用western blot检测蛋白表达水平。分别取实施例2中3hr、24hr和72hr共孵育处理后的癌细胞，磷酸缓冲盐(PBS)洗涤细胞并用RIPA缓冲液冲悬，离心，收集上层清液。随后，将20μL的全细胞提取液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移到PVDF膜上。5％脱脂牛奶封闭细胞膜，然后与一抗(Abcam,UK)：GAPDH、TAZ、GDF15、Bcl-2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8在4℃过夜孵育。然后将膜与二抗(Abcam,UK)孵育2h。采用增强化学发光法(ECL)观察印迹。
图12～图17为不同浓度和不同时间rtHLF4处理条件下前述六种癌细胞的TAZ、GDF15、Bcl2、Bax、Bak、p53、Caspase3和Caspase8基因的表达情况及对应蛋白的Westernblot结果。结合图11中的a和b可以看到，rtHLF4的抗癌作用机制与flHLF可能存在一定的不同。rtHLF4可以上调多种促凋亡标志物，下调参与血管生成和转移的信号蛋白。在HGC27、HCT116和MCF7中，rtHLF4处理后Caspase3和Caspase8基因表达上调。这表明rtHLF4触发Caspase8的激活，导致Caspase3的蛋白裂解。具有fas相关死亡结构域的乳铁蛋白结合受体可诱导Caspase8的激活，触发死亡受体通路。然后，Caspase8激活Caspase3，进而切割关键的细胞蛋白，导致癌症细胞凋亡。rtHLF4还上调HGC27、AGS、Caco2、LoVo和HCT116细胞的线粒体外膜蛋白bax/bak。
综合上述实施例结果可以看到，与flHLF相比，蛋白酶消化得到的三种人乳铁蛋白活性肽相比于全长人源乳铁蛋白具有更好的抗癌特性。其中rtHLF4对人体生理条件的稳定性和耐受性最好。而进一步研究rtHLF4的作用机制，结果显示其对不同类型的癌细胞具有不同的抗癌作用。
实施例4
本实施例提供一种偶联物，该偶联物包括实施例1中的rtHLF4活性肽和偶联在该多肽上的靶向胃癌细胞的抗体。该偶联物在进入患者体内后，可以增加癌细胞对rtHLF4活性肽的选择性摄取。
实施例5
本实施例提供一种药物组合物。该药物组合物包括PEG-PLGA高分子纳米颗粒药物载体和负载在该药物载体内的rtHLF4活性肽。患者施用该药物组合物后，能够有效杀伤胃癌、乳腺癌和结直肠癌细胞，起到高效的治疗作用。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 乳铁蛋白活性肽及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Lys Leu Arg Pro Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln
1 5 10 15
Pro Arg Thr His Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser
20 25 30
Phe Gln Leu Asn Glu Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu
35 40 45
Arg Arg Thr Ala Gly Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe
50 55 60
Leu Asn Trp Thr Gly Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg
65 70 75 80
Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro
85 90 95
Asn Leu Cys Arg Leu Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe
100 105 110
Ser Ser Gln Glu Pro Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu
115 120 125
Arg Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe
130 135 140
Glu Asp Leu Ser Asp Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys
145 150 155 160
Pro Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu
165 170 175
Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys
180 185 190
Glu Asp Ala Ile Trp Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly
195 200 205
Lys Asp Lys Ser Pro Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln
210 215 220
Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro
225 230 235 240
Pro Arg Ile Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala
245 250 255
Ile Gln Asn Leu Arg Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala
260 265 270
Arg Val Val Trp Cys Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn
275 280 285
Gln Trp Ser Gly Leu Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser
290 295 300
Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala
305 310 315 320
Met Ser Leu Asp Glu Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu
325 330 335
Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro
340 345 350
Asp Pro Asn Cys Val Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala
355 360 365
Val Val Arg Arg Ser Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly
370 375 380
Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile
385 390 395 400
Pro Met Gly Leu Leu Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu
405 410 415
Tyr Phe Ser Gln Ser Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu
420 425 430
Cys Ala Leu Cys Ile Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro
435 440 445
Asn Ser Asn Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys
450 455 460
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Lys Leu Arg Pro Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln
1 5 10 15
Pro Arg Thr His Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser
20 25 30
Phe Gln Leu Asn Glu Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu
35 40 45
Arg Arg Thr Ala Gly Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe
50 55 60
Leu Asn Trp Thr Gly Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg
65 70 75 80
Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro
85 90 95
Asn Leu Cys Arg Leu Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe
100 105 110
Ser Ser Gln Glu Pro Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu
115 120 125
Arg Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe
130 135 140
Glu Asp Leu Ser Asp Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys
145 150 155 160
Pro Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu
165 170 175
Ala Arg Val Pro Ser His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys
180 185 190
Glu Asp Ala Ile Trp Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly
195 200 205
Lys Asp Lys Ser Pro Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln
210 215 220
Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro
225 230 235 240
<210> 3
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp
1 5 10 15
Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys
20 25 30
Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala
35 40 45
Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala
50 55 60
Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg
65 70 75 80
Gln Pro Arg Thr His Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly
85 90 95
Ser Phe Gln Leu Asn Glu Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly
100 105 110
Leu Arg Arg Thr Ala Gly Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro
115 120 125
Phe Leu Asn Trp Thr Gly Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala
130 135 140
Arg Phe Phe Ser Ala Ser Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe
145 150 155 160
Pro Asn Leu Cys Arg Leu Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala
165 170 175
Phe Ser Ser Gln Glu Pro Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys
180 185 190
Leu Arg Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Ile Arg
195 200
<210> 4
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tacaagttaa gaccagttgc tgctgaagtt tacggtactg aaagacaacc tagaactcat 60
tattacgctg ttgccgttgt taagaagggt ggttcttttc aattgaacga attgcaaggt 120
ttgaagtctt gtcataccgg tttgagaaga actgctggtt ggaatgttcc aatcggtact 180
ttaagaccat tcttgaattg gactggtcca ccagaaccta ttgaagctgc tgttgctaga 240
tttttctctg cttcttgtgt tccaggtgct gataagggtc aatttccaaa tttgtgtaga 300
ttgtgtgctg gtactggtga aaacaagtgt gctttttcat ctcaagaacc atacttctct 360
tactccggtg cttttaagtg tttgagagat ggtgctggtg atgttgcttt cattagagaa 420
tctaccgttt tcgaagattt gtccgatgaa gctgaaagag atgaatacga attattgtgc 480
ccagacaaca ctagaaagcc agttgataag ttcaaggatt gccatttggc tagagttcca 540
tctcatgctg ttgttgcaag atctgttaac ggtaaagaag atgccatttg gaacttgttg 600
agacaagctc aagaaaagtt cggtaaggat aagtctccaa agttccaatt attcggttct 660
ccatctggtc aaaaggactt gttgtttaag gattccgcta tcggtttttc tagagttcca 720
ccaagaattg actctggtct atatttgggt tctggttact tcaccgctat ccaaaatttg 780
agaaagtccg aagaagaagt tgctgctaga agagctagag ttgtttggtg tgcagttggt 840
gaacaagaat tgagaaagtg caatcaatgg tccggtttgt ctgaaggttc tgttacttgt 900
tcttctgctt ctactaccga agattgcatt gctttggttt tgaaaggtga agctgatgcc 960
atgtctttgg atgaaggtta tgtttacact gctggtaagt gtggtttggt tccagttttg 1020
gctgaaaact acaagtccca acaatcttct gatccagatc caaactgtgt tgatagacca 1080
gttgaaggtt atttggctgt tgctgttgtc agaagatctg atacttcttt gacttggaac 1140
tccgttaagg gtaaaaagtc atgtcatact gctgttgata gaacagccgg ttggaatatt 1200
cctatgggtt tgttgtttaa tcaaaccggt tcttgcaagt tcgacgaata cttttctcaa 1260
tcttgtgctc caggttcaga tccaagatct aatttgtgtg ctttgtgcat cggtgatgaa 1320
caaggtgaaa acaaatgcgt tccaaactcc aacgaaagat attacggtta cactggtgct 1380
ttcagatgc 1389
<210> 5
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tacaagttaa gaccagttgc tgctgaagtt tacggtactg aaagacaacc tagaactcat 60
tattacgctg ttgccgttgt taagaagggt ggttcttttc aattgaacga attgcaaggt 120
ttgaagtctt gtcataccgg tttgagaaga actgctggtt ggaatgttcc aatcggtact 180
ttaagaccat tcttgaattg gactggtcca ccagaaccta ttgaagctgc tgttgctaga 240
tttttctctg cttcttgtgt tccaggtgct gataagggtc aatttccaaa tttgtgtaga 300
ttgtgtgctg gtactggtga aaacaagtgt gctttttcat ctcaagaacc atacttctct 360
tactccggtg cttttaagtg tttgagagat ggtgctggtg atgttgcttt cattagagaa 420
tctaccgttt tcgaagattt gtccgatgaa gctgaaagag atgaatacga attattgtgc 480
ccagacaaca ctagaaagcc agttgataag ttcaaggatt gccatttggc tagagttcca 540
tctcatgctg ttgttgcaag atctgttaac ggtaaagaag atgccatttg gaacttgttg 600
agacaagctc aagaaaagtt cggtaaggat aagtctccaa agttccaatt attcggttct 660
ccatctggtc aaaaggactt gttgtttaag gattccgcta tcggtttttc tagagttcca 720
<210> 6
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatggtgtg ctgtttctca acctgaagct actaagtgtt ttcaatggca aagaaacatg 60
agaaaggtta gaggtccacc agtttcttgc attaagagag attctccaat ccaatgcatt 120
caagctattg ctgaaaacag agctgatgct gttactttgg atggtggttt tatctatgaa 180
gctggtttgg ctccatacaa gttaagacca gttgctgctg aagtttacgg tactgaaaga 240
caacctagaa ctcattatta cgctgttgcc gttgttaaga agggtggttc ttttcaattg 300
aacgaattgc aaggtttgaa gtcttgtcat accggtttga gaagaactgc tggttggaat 360
gttccaatcg gtactttaag accattcttg aattggactg gtccaccaga acctattgaa 420
gctgctgttg ctagattttt ctctgcttct tgtgttccag gtgctgataa gggtcaattt 480
ccaaatttgt gtagattgtg tgctggtact ggtgaaaaca agtgtgcttt ttcatctcaa 540
gaaccatact tctcttactc cggtgctttt aagtgtttga gagatggtgc tggtgatgtt 600
gctttcatta ga 612
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caggaggcat tgctgatgat 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaaggctggg gctcattt 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cggctgtgga gatgcggaaa g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aggctggagg tggttgtgga g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctggtgttgc tggtgctctc g 21
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcggaatctg gagtcttcgg agtg 24
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tacgagtggg atgcgggaga tg 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ccgggctggg aggagaagat g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gattgccgcc gtggacacag 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccccagttga agttgccgtc ag 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggacgacatc aaccgacgct atg 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacaggctgg tggcaatctt gg 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttggtcggt gggttggtag tttc 24
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cagggtgtgg gatggggtga g 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cagggcacac aggacttgga aag 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aggccaggag cagagcacag 20
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cctgacaagc ggtgatgtgg ac 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gagcagctca tcctcaagca atcc 24

Claims (10)

1.乳铁蛋白活性肽，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID No.1。
2.偶联物，其特征在于，包括权利要求1所述的乳铁蛋白活性肽和偶联部分。
3.分离的核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的乳铁蛋白活性肽或权利要求2所述的偶联物。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
5.重组载体，其特征在于，包括权利要求3至4中任一项所述的核酸分子。
6.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3至4中任一项所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体。
7.制备权利要求1所述的乳铁蛋白活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；从所述培养物中分离得到所述乳铁蛋白活性肽。
8.组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的乳铁蛋白活性肽，或包括权利要求2所述的偶联物，或包括权利要求3至4中任一项所述的核酸分子，或包括权利要求5所述的重组载体，或包括权利要求6所述的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。
10.权利要求1所述的乳铁蛋白活性肽、或权利要求2所述的偶联物、或权利要求3至4中任一项所述的核酸分子、或权利要求5所述的重组载体、或权利要求6所述的宿主细胞、或权利要求8至9任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途，所述癌症为胃癌、乳腺癌、结直肠癌中的至少一种。
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