CN111647088B - 细胞渗透短肽tat-hns-3及对炎性疾病的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞渗透短肽TAT‑HNS‑3及对炎性疾病的应用，其特征在于：对由炎症因子升高导致的炎性疾病的细胞渗透短肽TAT‑HNS‑3，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR‑SPMGVDHMSGLSGVNVPGNASSG，针对由炎症因子升高导致的炎性疾病包括肺部炎症，哮喘，花粉过敏，肾炎药品中的应用；其能够特异性的抑制HuR‑PARP1/HuR‑HuR相互作用，以及炎症因子的表达，对细胞的增殖和生存均没有影响，这为细胞穿膜肽的药物开发提供了保障，是一种应用于治疗炎症疾病的新方法。

Description

细胞渗透短肽TAT-HNS-3及对炎性疾病的应用
技术领域
本发明涉及一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3对炎性疾病的应用，属于医学领域。
背景技术
真核生物的基因表达调控错综复杂，转录后水平调控在基因精确严密表达的过程中发挥重要的作用，其中mRNA降解决定mRNA稳定性，进而影响蛋白质的表达量[1]。mRNA表达的多少决定了将要被翻译出的蛋白质的含量，在这种情况下mRNA即使发生微小的变化都会引起蛋白质含量的巨大改变。炎症因子，细胞因子的mRNA通常情况下在细胞内为低表达，只有在细胞受到外界的刺激情况下才会引起它们的累积，以此翻译出帮助细胞应对外界刺激反应的细胞因子。在整个过程平息之后，这些mRNA也会随之降解。如果在这个过程中，某一个环节出现了错误，使得这些与炎症相关的mRNA没有正常的被降解，就会引起细胞因子的过表达，从而引起细胞的过度反应，导致一些自身免疫疾病，慢性炎症甚至是癌症的发生[1-3]。哺乳动物细胞中大约8％的mRNA在其3’非翻译区含有ARE元件，ARE元件是一段AU富集序列。含有ARE元件的mRNA均为容易降解的mRNA[4]。mRNA的稳定性受到RNA结合蛋白的调控。多数的ARE结合蛋白都介导了mRNA的降解作用，而HuR是为数不多的对mRNA起到稳定性的RNA结合蛋白，因此受到人们的广泛关注。
作为在基因的转录后调控中扮演重要角色的RNA结合蛋白，HuR能在诸如癌症、炎症等疾病的产生和发展过程中起到重要作用。在巨噬细胞、内皮细胞、肠上皮细胞，以及在结肠癌、胃癌和宫颈癌细胞中，HuR能够结合促炎细胞因子IL-8、TGF-β和IFN-γ的mRNA，进而增强这些因子的表达[5-7]。炎症相关的疾病中，如风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)中HuR促进TNF-α的表达[8,9]。在风湿性软骨和骨关节炎中，HuR参与了COX-2的调节[10]。在肠道炎症(inflammatory bowel disease)中，HuR能够上调肠上皮细胞中的COX-2的表达[11]。在慢性炎症疾病哮喘中，HuR参与了TNF-α,GM-CSF等因子表达的上调[12]。目前已知，HuR能够通过与促炎因子的mRNA相互作用发挥显著地促进炎症反应的作用。
HuR的功能主要是通过蛋白修饰来实现，我们实验室前期工作中发现，细胞受到外界刺激时，HuR能够发生一种聚ADP核糖化(PARylation)修饰。PARP1，身为PARP家族中最重要的成员，参与了细胞内最多的聚ADP核糖化修饰[13]。在细胞受到外界刺激的情况下，PARP1能够与HuR相互作用，进而对HuR进行PAR化修饰，HuR发生PAR化修饰后，HuR的出核受到促进[14]。除此之外，有研究证实HuR蛋白能够发生寡聚化，即，HuR-HuR相互作用，并且这种寡聚化对于HuR发挥稳定mRNA的作用是必须的[15,16]。我们前期的结果发现，PAR化修饰同样能够促进HuR-HuR的相互作用。我们前期的实验已经证明HuR的HNS结构域能够介导HuR-PARP1以及HuR-HuR的相互作用[14]。
细胞穿膜肽(CPPs)是一大类由10～30个氨基酸组成的序列，也称为蛋白质转导域或转导肽等。到目前为止，人们发现的细胞穿膜肽包括：Pep-1,pVEC,MAP,pAntp,Transportan,Polyarginines,TAT等。其中TAT是一种十分经典的细胞穿膜肽，穿膜效率较高[17,18]。TAT含有11个氨基酸，氨基酸序列为YGRKKRRQRRR，TAT在细胞核以及细胞质中均可定位，目前已经被广泛应用为生物大分子的递送标签[19]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3对由炎症因子升高导致的炎性疾病的应用，其设计的特异性抑制HuR-PARP1/HuR-HuR相互作用的氨基酸序列HNS-3短肽，利用细胞穿膜肽TAT作为载体，将这段氨基酸序列(短肽)运送进入细胞，筛选得到的细胞穿膜肽TAT-HNS-3能够抑制HuR-PARP1/HuR-HuR相互作用；这段细胞穿膜肽对细胞的增殖和生存均没有影响，这为细胞穿膜肽的药物提供了保障，并且细胞穿膜肽能够有效抑制炎症因子CCL2,CXCL2,TNF-α,IL-1β的表达，细胞穿膜肽TAT-HNS-3对治疗炎症疾病的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3，其特征在于：对由炎症因子升高导致的炎性疾病的细胞渗透短肽TAT-HNS-3，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-SPMGVDHMSGLSGVNVPGNASSG。
所述的一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3，其特征在于所述的含HNS-3的氨基酸序列针对由炎症因子升高导致的炎性疾病包括肺部炎症，哮喘，花粉过敏，肾炎药品中的应用。
所述的含HNS-3的氨基酸序列作为运输工作的载体包括：Pep-1,pVEC,MAP,pAntp,Transportan,Polyarginines。
所述的含HNS-3的氨基酸序列的连接载体以纳米或其他小分子材料作为载体。
所述的TAT-HNS-3以及其他载体连接的HNS-3短肽或其他形式含有HNS-3序列的药物及在由于炎症因子升高导致的肺部以及其他组织的炎性疾病中的应用。
本发明的积极效果在于：
1.细胞穿膜肽TAT-HNS-3抑制HuR-PARP1/HuR-HuR相互作用
在本实验中，采用TAT作为递送标签，TAT来源于HIV病毒Tat蛋白,共11个氨基酸，这段序列比全长Tat蛋白穿膜效率高，并且在细胞核以及细胞质中均有定位，目前已经被广泛应用为生物大分子的递送标签。将HuR的HNS结构域分为相互具有重叠部分的3段，N端连接细胞穿膜肽TAT作为递送载体：TAT,TAT-HNS-1,TAT-HNS-2,TAT-HNS-3(如图1所示)。接下来，我们提取人肾上皮细胞HEK293全细胞裂解液作为游离相，与GST，GST-HuR还原性谷胱甘肽4B珠子固定相4℃孵育，在此过程中分别加入TAT、TAT-HNS-1、TAT-HNS-2、TAT-HNS-3干扰HuR与PARP1之间的相互作用，其中细胞穿膜肽的工作浓度为25μM。通过Western Blot检测，结果证明TAT-HNS-3短肽能够显著抑制HuR-PARP1得相互作用(如图2所示)。
进一步，我们将GST，GST-HuR还原性谷胱甘肽4B珠子与诱导纯化好的His-HuR蛋白4℃孵育，在此过程中分别加入TAT、TAT-HNS-1、TAT-HNS-2、TAT-HNS-3干扰HuR-HuR的相互作用，其中细胞穿膜肽的工作浓度为25μM。通过Western Blot检测，实验结果证明TAT-HNS-3的加入能够明显抑制HuR与HuR的相互作用(如图3)。
接下来，我们探究了这种细胞穿膜肽在细胞内对HuR与PARP1以及HuR与HuR相互作用的影响。通过蛋白质免疫共沉淀以及免疫印迹实验，结果显示在加入TNA-HNS-3短肽的细胞中，HuR-PARP1(如图4)以及HuR-HuR(如图5)的相互作用在细胞内明显收到了抑制。
2.细胞穿膜肽TAT-HNS-3在细胞水平抑制炎症因子表达
在巨噬细胞，内皮细胞，肠上皮细胞以及在结肠癌，胃癌和宫颈癌细胞中，HuR结合炎症因子TNF-α，IL-6，IL-8，TGF-β，IFN-γ的mRNA，从而增强它们的表达。实验室前期实验结果已经发现，C-X-C细胞趋化因子、白介素、肿瘤坏死因子家族属于受HuR调控的靶mRNA。我们分别在小鼠肺上皮细胞MLE12以及小鼠巨噬细胞RAW264.7中检测了细胞因子的表达，如：TNF-α，IL-1β，CXCL2。细胞穿膜肽TAT-HNS-3提前0.5h预处理细胞，之后用LPS刺激细胞,1h后后提取不同刺激组的RNA，反转录之后的cDNA用于进行PCR实验，检测不同炎症因子的表达情况。olaparib，是一种PARP抑制剂，能够抑制炎症因子的表达，在这里做为阳性对照。我们的实验结果显示TAT-HNS-3在细胞中能够抑制小鼠肺上皮细胞MLE12中炎症因子CXCL2(如图6)，TNF-α(如图7)的mRNA水平。
此外，我们在RAW264.7小鼠巨噬细胞中同样检测了细胞渗透肽TAT-HNS-3对炎性刺激条件下炎症因子表达的影响。我们用TNF-α刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，并加入TAT-HNS-3短肽，1h之后提取不同刺激组的RNA，反转录之后的cDNA用于进行PCR实验，检测不同炎症因子的表达情况。结果显示TAT-HNS-3短肽的加入，同样抑制了炎症因子CXCL2(如图8)，IL-1β(如图9)，TNF-α(如图10)的mRNA水平。
同时，我们在RAW264.7小鼠巨噬细胞中重复实验，我们用LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7并加入TAT-HNS-3短肽，1h之后提取不同刺激组的RNA，反转录之后的cDNA用于进行PCR实验，检测不同炎症因子的表达情况。结果显示TAT-HNS-3短肽的加入，同样抑制了炎症因子CXCL2(如图11)，IL-1β(如图12)，TNF-α(如图12)的mRNA水平。综上，我们可以得出结论TNF-α,IL-1β,CXCL2等炎症反应的应答因子，在受到TNF-α或者LPS刺激后表达上调，若提前用细胞穿膜肽TAT-HNS-3预处理细胞，mRNA水平呈现明显下调。
3.细胞穿膜肽TAT-HNS-3抑制小鼠肺部炎症发生
为了进一步证实筛选出的细胞穿膜肽TAT-HNS-3具有抑制炎症发生的作用，我们用LPS滴鼻的方式建立小鼠肺部炎症模型。比较不同组内小鼠肺部炎症情况，Saline(生理盐水)组，LPS组，TAT-HNS-3组以及LPS+TAT-HNS-3组。经过不同刺激处理的小鼠，首先取肺泡灌洗液，涂片进行瑞士吉姆萨染色。LPS刺激后的小鼠肺泡灌洗液中含有大量中性粒细胞，若用细胞穿膜肽TAT-HNS-3提前处理，那么中性粒细胞的数量呈现明显降低(如图14)。接下来，我们将Saline(生理盐水)组，LPS组，TAT-HNS-3组以及LPS+TAT-HNS-3组处理的小鼠肺部进行研磨，提取RNA，反转录后进行real-time PCR检测炎症因子CCL2,CXCL2,IL1β以及TNFαmRNA水平。如图15所示，单独用细胞穿膜肽TAT处理小鼠，不能引起炎症反应。LPS刺激1h后的小鼠肺部发生炎症反应，CCL2，CXCL2，IL-1β，TNF-α的mRNA表达均上调。若用细胞穿膜肽TAT-HNS-3提前处理，则相较于LPS组，炎症因子表达呈现明显下调。综上，细胞穿膜肽TAT-HNS-3抑制小鼠肺部炎症。
附图说明
图1为HNS区域细胞穿膜肽的氨基酸序列。
图2为TAT-HNS-3短肽能够抑制HuR与PARP1的相互作用。选用人肾上皮细胞HEK293，提取全细胞裂解液作为游离相，与GST，GST-HuR还原性谷胱甘肽4B珠子固定相4℃孵育3h，分别加入TAT、TAT-HNS-1、TAT-HNS-2、TAT-HNS-3干扰HuR-PARP1的相互作用，其中细胞穿膜肽的工作浓度为25μM。通过Western Blot检测，HNS-3短肽能够抑制HuR-PARP1的相互作用。
图3为His-HuR与GST，GST-HuR还原性谷胱甘肽4B珠子固定相4℃孵育3h，分别加入HNS-1、HNS-2、HNS-3干扰HuR-HuR的相互作用，其中细胞穿膜肽的工作浓度为25μM。通过Western Blot检测：HNS-3短肽能够抑制HuR-HuR的相互作用。
图4为TAT,TAT-HNS3提前半小时加入到细胞培养基中，然后TNF-α刺激MLE12细胞5h后提取全细胞裂解液，用HuR抗体进行免疫共沉淀实验。PARP1与HuR的结合情况利用免疫印迹法进行检测。细胞穿膜肽TAT,TAT-HNS-3工作浓度为25μM。
图5为细胞转染GFP以及GFP-HuR,24h后TAT,TAT-HNS3提前半小时加入到细胞培养基中，然后TNF-α刺激HEK293细胞1h后提取全细胞裂解液，用GFP抗体进行免疫共沉淀实验。GFP-HuR结合内源HuR的情况利用免疫印迹法进行检测。细胞穿膜肽TAT,TAT-HNS-3工作浓度为25μM。
图6为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，LPS刺激MLE12细胞1h，Realtime PCR检测CXCL2 mRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。**P<0.01,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图7为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，LPS刺激MLE12细胞1h，Realtime PCR检测TNF-αmRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。**P<0.01,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图8为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测CXCL2 mRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。***P<0.001,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图9为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测IL-1βmRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。***P<0.001,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图10为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测TNF-αmRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。***P<0.001,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图11为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，LPS刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测CXCL2 mRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。**P<0.01,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图12为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，LPS刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测IL-1βmRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。**P<0.01,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图13为TAT，TAT-HNS-3以及olaparib提前0.5h加到细胞培养基中，LPS刺激RAW264.7细胞1h，Realtime PCR检测TNF-αmRNA的表达。细胞穿膜肽工作浓度为25μM。**P<0.01,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
图14为TAT-HNS-3短肽抑制了小鼠肺部中性粒细胞的聚集。Saline组麻醉后滴鼻给以生理盐水，LPS组麻醉后滴鼻给药LPS，LPS+HNS-3组，麻醉后，TAT-HNS-3短肽滴鼻给药，1h后滴鼻给药LPS所有组，滴鼻处理后16h时时间点处死小鼠，提取各组小鼠肺泡灌洗液，涂片进行瑞士吉姆萨染色。LPS刺激后的小鼠肺泡灌洗液中含有大量中性粒细胞，若用细胞穿膜肽TAT-HNS-3提前处理，那么中性粒细胞的数量呈现明显降低。
图15为TAT-HNS-3短肽抑制了小鼠肺部炎症因子的表达。Saline组麻醉后滴鼻给以生理盐水，LPS组麻醉后滴鼻给药LPS，LPS+HNS-3组，麻醉后，TAT-HNS-3短肽滴鼻给药，1h后滴鼻给药LPS，所有组滴鼻处理后1h时时间点处死小鼠，提取肺组织总RNA，反转录后检测炎症因子mRNA的表达情况，real time PCR结果表明与LPS处理组相比，LPS+HNS-3组CCL2,CXCL2,IL-1β以及TNF-α的mRNA明显下降。***P<0.001,细胞穿膜肽对于炎症因子mRNA表达水平的影响，均与LPS刺激组进行比较，n＝3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例：实验材料
1细胞株
肾上皮细胞HEK293，小鼠巨噬细胞RAW264.7，小鼠肺上皮细胞MLE12来源于实验室已有细胞库。
2试剂、抗体和酶
药品名称 货号 购买公司
TNF-α 300-01A PeproTech
LPS L2630 Sigma
Olaparib AZD2281 SELLECT
Anti-His antibody HT501 北京全式金公司
Anti-GFP antibody HT801 北京全式金公司
Anti-HuR antibody 3A2,sc-5261 Santa Cruz Biotechnology
Anti-PARP1 antibody B-10,sc-74470 Santa Cruz Biotechnology
3培养基和主要试液
1、DMEM细胞培养基(2L)：商品化DMEM培养基，7.4g NaHCO3。
PBS(1L)：8g NaCl，0.2g KCl，3.576g Na2HPO4·12H2O，0.24g KH2PO4。分装，灭菌之后再使用。
2、全细胞裂解液(低盐)：150mM NaCl，20mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA，1mM EGTA，1％NP-40，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-磷酸甘油，1mM Na3VO4，5μg/ml aprotinin/leupeptin
3、免疫印迹实验相关试剂
(1)10x电泳缓冲液(1L)：30g Tris，144g甘氨酸，10g SDS
1x电泳缓冲液(500ml)：50ml10x电泳缓冲液，450ml双蒸水
(2)10x转移缓冲液(1L)：30.3g Tris，144g甘氨酸
1x转移缓冲液(1L)：100ml 10x转移缓冲液，900ml双蒸水
(3)10x TBS(1L)：24.2g Tris，80g NaCl
1x TBST(1L)：100ml 10xTBS，900ml双蒸水，1ml Tween，700μl浓盐酸
(4)Stripping Buffer(100ml)：6.88mlβ-巯基乙醇，20ml 10％SDS，12.5ml 0.5MTris-HCl(PH6.8)
(5)封闭液(5％脱脂牛奶)：1g脱脂奶粉，20ml TBST
(6)2x Loading Buffer(100ml)：20ml 0.5M Tris-HCl(PH6.8)，20ml甘油,40ml10％SDS，0.1g 0.1％溴酚蓝，10mlβ-巯基乙醇
(7)考马斯亮蓝染液(2L)：1g考马斯亮蓝R250，900ml甲醇，900ml双蒸水，200ml冰醋酸
(8)蛋白质脱色液(500ml)：50ml甲醇，50ml冰醋酸，400ml双蒸水
(9)蛋白胶配制方法：
分离胶：
Figure BDA0002560933990000061
Figure BDA0002560933990000071
浓缩胶：
Figure BDA0002560933990000072
4、蛋白诱导纯化以及GST-pull down实验相关试剂：
(1)置换液：50mM Tris-HCl(pH＞8.0)，100mM KCl
(2)洗脱液：1ml置换液+40mM还原型谷胱甘肽(用时加入PMSF)
(3)菌裂解液：
25ml 100ml
Hepes(μl) 500 20000
NaCl(μl) 960 2769
50％甘油(ml) 5 20
EDTA(μl) 100 400
Leu+Apr(μl) 10 40
PMSF(μl) 25 100
<![CDATA[H<sub>2</sub>O(ml)]]> 18.42 73.68
(4)TEN100：20mM Tris(pH7.5)，0.1mM EDTA，100mM NaCl
(5)NETN：20mM Tris(pH7.5)，0.1mM EDTA，100mM NaCl，0.5％NP-40
5常规PCR检测
鼠源：β-actin引物(primer)序列：
上游引物(F):5’-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3’，
下游引物(R):5’-CGATGACATCCGTAAAGACC-3’；
CXCL-2引物(primer)序列：
上游引物(F)：5′－TCAATGCCTGAAGACCC－3′
下游引物(R)：5′－TGGTTCTTCCGTTGAGG－3′
IL-1β引物(primer)序列：
上游引物(F)：5′－CAGGATGAGGACATGAGCACC－3′
下游引物(R)：5′－CTCTGCAGACTCAAACTCCAC－3′
TNF-α引物(primer)序列：
上游引物(F)：5’-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3’
下游引物(R)：5’-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC-3‘
CCL2引物(primer)序列：
上游引物(F)：5’-AAGTTGACCCGTAAATCTGA-3’
下游引物(R)：5’-TGAAAGGGAATACCATAACA-3’
实验仪器
脱水摇床和水平摇床(北京六一)，电泳仪及转膜装置(BioRad)，CO2培养箱(Thermo Forma 3111)，PCR仪(Thermo Electron Corporation)，激光共聚焦显微镜(Zeiss)，Sigma低温高速离心机，细胞超声破碎仪(宁波机械厂)，星宇DAKW-D水浴锅，ND-1000分光光度计，荧光定量基因扩增仪，台式高速冷冻离心机(Beckman Coulter)，超净工作台(Air Tech，苏州净化仪器厂)，化学发光图像分析系统，漩涡震荡器(Vortex genie-2，Scientific industries)等。
实验方法
如图2所示：
1GST标签蛋白的诱导表达与纯化
1、菌种活化：前一天晚上，将带有GST以及GST-HuR菌种以1:100比例活化。40μl菌种加入到4ml LB培氧基中，在37℃培养箱中振荡培养过夜。
2、诱导蛋白表达：将过夜培养的菌液按照1:8比例扩增。4ml菌液加入到28ml LB培养基中,在37℃培养箱中振荡培养1h。加入蛋白质表达诱导剂64μl 0.5M IPTG，64μl 20mMZNSO4，在37℃培养箱中振荡培养3～4h。
3、平衡珠子：200μl还原型谷胱甘肽4B珠子加入到800μl PBS中，离心，4℃，500G，5min，弃上清液。再加入800μl PBS悬起珠子，在4℃层析柜rotator上平衡1h。离心，4℃，500G，5min，弃上清液待用。
4、超声裂菌：首先收集菌体，离心，4℃，4000rpm，10min；弃上清液，加入菌裂解液(32ml菌液加入7.2ml菌裂解液)，充分吹打菌体成悬液。用超声破碎仪裂解菌体。超声条件如下：
Figure BDA0002560933990000081
Figure BDA0002560933990000091
超声后的菌液呈现成透亮，分装菌液，离心，4℃，12000rpm，25min。取上清，加10％NP40待用，NP40终浓度为0.5％。
2蛋白质纯化
1、将平衡好的还原型谷胱甘肽4B珠子与菌裂解液上清4℃rotator上孵育3h或过夜。用封口膜将离心管封好，避免漏液。
2、洗珠子：用NETN/和TEN100各洗2次，每次用1ml NETN/TEN100洗珠子，离心条件为：4℃，500G，5min。期间，将珠子转移到1.5EP管中。然后用TEN100悬起珠子，4℃层析柜rotator平衡1h。离心去除上清液后，可以加PBS保存。
3GST pull-down实验
1、提取全细胞裂解液。
2、将带有GST以及GST-HuR与提取细胞裂解液4℃孵育3h或者过夜。在此过程中分别加入HNS-1,HNS-2以及HNS-3三种短肽。
3、用TEN100洗4次以去除杂蛋白，离心弃上清液后，加入和珠子等体积的2xloading buffer，沸水煮样5min。
4、取10μl蛋白上样，通过蛋白质电泳以及免疫印迹实验检测蛋白相互作用情况。如图3所示：
(1)GST/HiS标签蛋白的诱导表达与纯化
1、菌种活化：前一天晚上，将带有GST,GST-HuR以及His-HuR蛋白菌种以1:100比例活化。40μl菌种加入到4ml LB培氧基中，在37℃培养箱中振荡培养过夜。
2、诱导蛋白表达：将过夜培养的菌液按照1:8比例扩增。4ml菌液加入到28ml LB培养基中,在37℃培养箱中振荡培养1h。加入蛋白质表达诱导剂64μl 0.5M IPTG，64μl 20mMZNSO4，在37℃培养箱中振荡培养3～4h。
3、平衡珠子：200μl还原型谷胱甘肽4B珠子加入到800μl PBS中，离心，4℃，500G，5min，弃上清液。再加入800μl PBS悬起珠子，在4℃层析柜rotator上平衡1h。离心，4℃，500G，5min，弃上清液待用。
4、超声裂菌：首先收集菌体，离心，4℃，4000rpm，10min；弃上清液，加入菌裂解液(32ml菌液加入7.2ml菌裂解液)，充分吹打菌体成悬液。用超声破碎仪裂解菌体。超声条件如下：
Figure BDA0002560933990000092
Figure BDA0002560933990000101
超声后的菌液呈现成透亮，分装菌液，离心，4℃，12000rpm，25min。取上清，加10％NP40待用，NP40终浓度为0.5％。
(2)GST以及GST-HuR蛋白质纯化
1、将平衡好的还原型谷胱甘肽4B珠子与菌裂解液上清4℃rotator上孵育3h或过夜。用封口膜将离心管封好，避免漏液。
2、洗珠子：用NETN/和TEN100各洗2次，每次用1ml NETN/TEN100洗珠子，离心条件为：4℃，500G，5min。期间，将珠子转移到1.5EP管中。然后用TEN100悬起珠子，4℃层析柜rotator平衡1h。离心去除上清液后，可以加PBS保存，也可以继续洗脱下来。
3、洗脱蛋白：加入1ml置换液悬起珠子，离心，共用置换液洗珠子2次。弃上清液后，加150μl洗脱液，室温下在摇床洗脱1h，期间需要多次轻弹管底，使其洗脱充分。离心，上清即洗脱液，转移到新的1.5ml EP管中。带有蛋白质的4B珠子和蛋白质洗脱液需要在-80℃长期保存，避免反复冻融。
4、蛋白质电泳：考马斯亮蓝R250染胶，可以看纯化后蛋白质的含量。
(3)Pull-down实验
1、His-HuR与洗脱的GST以及GST-HuR蛋白4℃孵育3h或者过夜，在此过程中分别加入HNS-1,HNS-2以及HNS-3三种短肽。
2、用TEN100洗4次以去除杂蛋白，离心弃上清液后，加入和珠子等体积的2xloading buffer，沸水煮样5min。
3、取10μl蛋白上样，通过蛋白质电泳以及免疫印迹实验检测蛋白相互作用情况。如图4所示：
1、TAT,TAT-HNS-3提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α刺激HEK293细胞1h。
2、提取不同刺激组的全细胞裂解液，之后用HuR抗体以及磁珠进行免疫共沉淀实验。
3、用低，中，高盐全细胞裂解液分别洗1次以去除杂蛋白，离心弃上清液后，加入和珠子等体积的2x loading buffer，沸水煮样5min。
4、取10μl蛋白上样，通过蛋白质电泳以及免疫印迹实验检测蛋白相互作用情况。如图5所示：
1、将GFP以及GFP-HuR转染到HEK293细胞中，6小时后换液。
2、细胞转染24h后，将TAT,TAT-HNS-3提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α刺激HEK293细胞1h。
3、提取不同刺激组的全细胞裂解液，之后用HuR抗体以及磁珠进行免疫共沉淀实验。
4、用低，中，高盐全细胞裂解液分别洗1次以去除杂蛋白，离心弃上清液后，加入和珠子等体积的2x loading buffer，沸水煮样5min。
5、取10μl蛋白上样，通过蛋白质电泳以及免疫印迹实验检测蛋白相互作用情况。如图6-图13所示细胞炎症因子mRNA表达的检测
1)细胞的处理
TAT,TAT-HNS-3提前0.5h加到细胞培养基中，TNF-α和LPS分别刺激MLE12或RAW264.7细胞1h。
2)细胞RNA提取
RNA提取过程均采用RNA-free级别的枪头、1.5ml EP离心管以及试剂，以6孔板为例，具体过程如下：
1、收细胞：取经过处理的细胞，弃尽培养基后，用提前预冷的PBS清洗细胞，弃PBS。加1ml Trizol，充分吹打细胞直至澄清，然后转移到相应的1.5ml EP管中。
2、RNA的分离：室温放置10min，使得核酸与蛋白质分离。加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡1min，室温静止3min，12000rpm离心5min。此时，RNA在上层相中。
3、RNA的沉淀：取400μl上层液至于新的1.5ml EP管中，加400μl异丙醇，剧烈震荡1min后，室温放置1min或者-20℃过夜。12000rpm离心5min后，可见RNA沉淀。
4、RNA的洗涤：弃上清液，加入1ml 70％乙醇，震荡混匀后，12000rpm离心5min。弃上清液，只留RNA沉淀。室温晾数分钟，直至没有乙醇残留。注意：不能将RNA晾到透明色。
5、RNA的溶解：晾好的RNA沉淀，视沉淀量加入相应体积的DEPC水(20～30μl)，溶解10min左右。使用ND-1000测RNA浓度，OD260/OD280>1.9表明RNA纯度较高，杂质少。RNA不稳定，提取出来后及时放在冰上，长期保存需要在-80℃冰箱中。
3)反式聚合酶链式反应(RT-PCR)
反式聚合酶链式反应是将提取的细胞中总RNA反转录成cDNA。采用Sigma反转录试剂盒，具体步骤如下：
(1)42℃恒温水浴锅中，5min；
Figure BDA0002560933990000111
(2)42℃恒温水浴锅中，15min；85℃恒温水浴锅中，5s。
Primer sc RT en mx 1μl
RT primer mix 1μl
5x primer buffer 4μl
<![CDATA[RNase free H<sub>2</sub>O]]> 4μl
4)real time PCR(实时荧光定量检测)
对PCR产物进行定量分析，运用荧光能量传递技术，加入荧光标记探针，借助荧光信号检测PCR产物。cDNA需要提前按照比例稀释好。上样之后，荧光定量PCR仪检测，数据分析。PCR体系(25μl)如下：
cDNA 2μl
SYBR 12.5μl
Rox 0.5μl
无菌水 8μl
Primer(引物) 2μl
如图14,图15所示小鼠相关实验操作
1)小鼠的麻醉
按标准姿势抓好小鼠后，腹腔注射戊巴比妥钠(3min左右小鼠进入昏迷状态，昏迷状态持续约40min左右)。
2)小鼠的滴鼻给药
将处于麻醉状态的小鼠按腹腔注射姿势抓好，使头部处于仰起的状态，用移液器在小鼠鼻孔处轻轻滴加TAT-HNS-3，LPS或生理盐水(Saline)，(每滴约15ul)，按照左右鼻孔，缓慢依次滴加，(液体会随小鼠呼吸迅速被吸入鼻腔)加完后保持约一分钟。
3)小鼠肺泡灌洗液的提取
尾静脉注射EDTA处死小鼠，将小鼠以仰卧姿势固定于解剖台上，用剪刀轻轻剪开颈部胸部毛皮，剥离器官周围肌肉组织，使气管暴露(注意避免剪破颈部血管)。将针头从口腔中插入，顺着气管轻轻送入直至针头到达气管末端，用手术线将插有针头的气管扎紧，避免之后操作过程中针头在气管内滑动。将吸好预冷PBS的注射器与针头连接，将PBS缓缓注入，完全注入后，再缓缓吸出(比注入时费力，整个过程能够观察到胸腔的隆起与收缩)，吸出的液体中有大量白色泡沫状物质。将吸出的液体转移到标记好的1.5ml Ep管中，冰上保存，待用。
4)肺泡提取液细胞染色观察
肺泡灌洗液成分包括多种细胞及可溶系蛋白等细胞分泌物，2000rpm/min，4℃离心5min，可将细胞与其它小分子分开，细胞位于沉淀中，可溶性蛋白等分子位于上清中。由于刺激引起的肺损伤或操作中引起的损伤，肺泡灌洗液中可能会有红细胞，为了后续实验效果，因此，需要裂解红细胞的处理。将离心后肺泡灌洗液中上清移走，加入适量红细胞裂解液，悬起细胞，吹打均匀，室温，作用2min。300g/min，离心10min。(根据具体裂解情况，可重复几次)。
5)细胞涂片，染色
(1)将上诉经过红细胞裂解液处理，除去红细胞的肺泡灌洗液细胞组分用PBS重新悬起，混匀，按比例取出稀释。
(2)吸取适量稀释好的细胞悬液滴加到干净的载玻片上，用盖玻片轻轻涂开。
(3)待载玻片上水分蒸发之后，滴加纯甲醇固定至少30s。
(4)倾斜载玻片，移去甲醇，将载玻片平放，滴加适量染液，染色2min。
(5)滴加等量Sorensen’s buffer，与染液轻轻混匀，不要触及载玻片(液体表面会呈现金属光泽)。作用3min。
(6)超纯水中，轻轻漂洗载玻片30s，倾斜载玻片，晾干(切勿用滤纸吸干)。
(7)观察(细胞分类，计数)。
6)小鼠肺组织的提取
尾静脉注射EDTA处死小鼠后，解剖，摘取肺，预冷PBS中洗两次，滤纸吸去表面水分，置于冰上，待用。
7)小鼠肺部RNA的提取
(1)、组织匀浆：称取100mg肺组织，盛入培养皿中至于冰上剪碎，用3ml预冷的PBS悬起后转移到研磨器中，充分研磨后转移到离心管中,1200rpm/min,4℃离心5min，去掉上清，沉淀中加入1mlTrizol，悬起，反复吹打混匀，转移到1.5ml EP管中反复吹打细胞，转移到1.5mL Ep管中。
(2)、RNA的分离：将1.5mL Ep管颠倒混匀，在室温下静止放置10min，使核蛋白与RNA分离；加入200μL氯仿(三氯甲烷)，涡旋振荡90s，室温静止放置3min。12000rpm/min，4℃离心5min，取出后可以看到Ep管中液体分为两层，上层为RNA。
以下步骤用RNase-free级别的Ep管及枪头操作。
(3)、RNA的沉淀：将含有RNA的上层水相，约400μL，小心将上层含有RNA的液体转移到已标号的1.5mL RNase-free Ep管中(注意不要吸搅动下层液面，防止蛋白质污染)，加入等体积(约400μL)的异丙醇，混匀(轻轻晃动，由折光性看是否混匀)，室温放置10min，12000rpm/min，4℃离心10min。用移液器吸取上清(注意不要倒掉沉淀)。
(4)、RNA的洗涤：按照每毫升Trizol中至少加入1mL 70％乙醇(DEPC处理水配制)的比例，向步骤3EP管中加入乙醇，轻轻振荡，使RNA沉淀悬起不贴壁；12000rpm/min，4℃离心10min；弃清。
(5)、重复步骤4，弃上清后，瞬时离心，尽量用移液器吸尽残余液体。
(6)、RNA的溶解：RNA洗涤后，在室温条件下，开盖，干燥5～10min(沉淀的边缘趋于透明即可，注意：切勿干燥至沉淀完全透明的程度。)，按照沉淀体积加入10～20μL DEPC水溶解RNA，轻轻吹打8～10次，室温下放置10～20min，使RNA彻底溶解，保存于-80℃中待用。
(7)、RNA浓度的测定,ND-1000分光光度计测定RNA浓度。
8)反式聚合酶链式反应(RT-PCR)
反式聚合酶链式反将之前提取的细胞中总RNA反转录成cDNA。采用Sigma反转录试剂盒，具体步骤如下：
(1)42℃恒温水浴锅中，5min；
Figure BDA0002560933990000141
(2)42℃恒温水浴锅中，15min；85℃恒温水浴锅中，5s。
Primer sc RT en mx 1μl
RT primer mix 1μl
5x primer buffer 4μl
<![CDATA[RNase free H<sub>2</sub>O]]> 4μl
9)real time PCR(实时荧光定量检测)
对PCR产物进行定量分析，运用荧光能量传递技术，加入荧光标记探针，借助荧光信号检测PCR产物。cDNA需要提前按照比例稀释好。上样之后，荧光定量PCR仪检测，数据分析。PCR体系(25μl)如下：
cDNA 2μl
SYBR 12.5μl
Rox 0.5μl
无菌水 8μl
Primer(引物) 2μl
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                         序列表
<110>  东北师范大学
<120>  TAT-HNS-3
<141>  2020-06-29
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  34
<212>  PRT
<213>  Plumbago capensis
<400>  1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ser Pro Met Gly Val
1               5                   10                  15
Asp His Met Ser Gly Leu Ser Gly Val Asn Val Pro Gly Asn Ala Ser
            20                  25                  30
Ser Gly

Claims (2)

1.一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3，其特征在于：能够特异性的抑制HuR-PARP1以及HuR-HuR的相互作用，进而抑制炎症因子的表达，其氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-SPMGVDHMSGLSGVNVPGNASSG。
2.根据权利要求1所述的一种细胞渗透短肽TAT-HNS-3的应用，其特征在于所述的TAT-HNS-3在制备由于CCL2, CXCL2, TNF-α, IL-1β炎症因子升高导致的肺部炎性疾病的药物。
CN202010605471.0A 2020-06-29 2020-06-29 细胞渗透短肽tat-hns-3及对炎性疾病的应用 Active CN111647088B (zh)

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