CN111534502A

CN111534502A - 一种抗癌活性蛋白妙沙林及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN111534502A
Application number: CN202010304746.7A
Authority: CN
Inventors: 刘树柏; 何英英
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-04-17
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-04-17
Also published as: CN111534502B

Abstract

本发明提供了一种全新结构的特异抑制肿瘤干细胞增殖的抗癌活性蛋白妙沙林(Musarin)及其编码基因和应用，属于医药技术领域，所述抗癌活性蛋白妙沙林的氨基酸序列如SEQ ID No.1。本发明提供的妙沙林分离自药用云芝菌丝体提取物，具有低细胞毒性、水溶性好等特点，能够强烈抑制酪氨酸激酶活性，能够显著下调表皮生长因子受体的表达和磷酸化水平；所述妙沙林在体内外实验中均表现出强烈的抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖活性，尤其是针对最具侵袭性的肿瘤干细胞，能够在不引起肿瘤干细胞坏死或凋亡的情况下，通过作用于上皮间质转化的主要信号通路，显著抑制肿瘤生长和转移；对于结直肠癌的治疗具有重要的临床应用价值。

Description

一种抗癌活性蛋白妙沙林及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种抗癌活性蛋白妙沙林及其编码基因和应用。

背景技术

目前，恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题。根据国家癌症中心最新的全国癌症发病统计数据，2015年中国恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人，因恶性肿瘤导致的死亡占全国居民死亡原因的23.91％。近10年来，恶性肿瘤的发病率、死亡率均呈持续上升趋势，发病率保持约每年3.9％的增幅，死亡率保持每年2.5％的增幅，恶性肿瘤新发病例和死亡病例分别占全球的23.7％和30.2％，每年医疗花费超过 2200亿。

结直肠癌是全球常见的癌症之一，也是中国恶性肿瘤新发病率和死亡病率的前十。在大多数结直肠癌患者人群中，超过一半的人在70岁时发展成恶性结直肠癌，其中10％会转移。早期(I期)的检测和治疗可使5年生存率>90％，III/IV期下降到67％，转移性结直肠癌下降到8％。目前，结直肠癌的主要治疗方法是手术和化疗。临床研究表明，多种亚型的结直肠癌对特定的化疗药物具有抗药性，并表现出包括腹痛、疲劳、呕吐和腹泻等副作用，导致患者身体更虚弱。最新研究进展表明，靶向药物，即针对特定促进肿瘤生长的信号通路的靶标，能够显著抑制肠癌上皮细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤内部和周围血管的形成，或抑制由原癌基因编码的酶的活性。因此，发现和筛选特异性的靶向药物，以及活性蛋白/先导化合物，针对结直肠癌，给予低副作用的预防性和前瞻性早期治疗，是极具吸引力的研究。

药用蘑菇是传统中医药不可或缺的一部分，数千年来已经被广泛使用以预防或治疗各种疾病。药用蘑菇含有多种生物活性物质，包括矿物质、维生素(例如硫胺素，核黄素，抗坏血酸和维生素D)、活性蛋白和其他有机化合物等。目前，药用蘑菇中发现的抗癌活性成分主要包括葡聚多糖、糖蛋白或结合肽/活性蛋白等。这些活性蛋白能够调节免疫系统，或者特异性抑制癌细胞中异常激活的信号通路，能够调节肿瘤细胞功能相关特定分子靶标的表达，抑制肿瘤细胞增殖、细胞存活和血管生成等，从而实现免疫调节、治疗癌症，改善患者的生存状态，发挥促进健康或治疗疾病的功能。目前，蘑菇或其提取物以膳食补充剂的形式在全球范围内使用。亚洲的流行病学研究结果表明，摄入药用蘑菇可显著预防癌症，特别是胃肠道癌症和乳腺癌。

云芝(Tremetes versicolor)是一种北半球最常见的药用蘑菇，常年可在原木、树桩、树干和树枝上生长，广泛分布亚洲、欧洲和北美的树木繁茂的温带地区，作为重要传统药材被列入东亚药典。目前，临床中最广泛使用的药用蘑菇是云芝提取物，云芝提取物是由养殖的云芝菌丝体通过热水提取而制备的粉末，包含多种具有生物活性的蛋白或多肽。云芝提取物具有免疫调节活性和显著的抗肿瘤活性，特别对乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌，例如部分发现的活性多肽能够通过p53和Bcl-2依赖性和独立机制诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，并通过抑制转录因子NF-κB而下调 COX-2表达的机制诱导白血病细胞凋亡。因此，云芝提取物被广泛用作化疗药物的替代品。云芝提取物所包含的主要成分为β-葡聚糖大分子的高度异质混合物，例如蛋白质结合多糖K(多糖克雷斯汀，PSK)和多糖肽(PSP)，分子量在100～500kDa之间，包含结合到β-葡聚糖骨架的不同肽部分。目前，蛋白质结合多糖K和多糖肽在亚洲已获药监部门批准，临床用于肿瘤免疫治疗或作为免疫调节剂。但是，因高分子量和混合物的复杂性使得其作用机制的研究变得困难，阻碍它们获得药监部门批准，进入西药药典。同时，因含有高分子量菌丝细胞壁的β-葡聚糖，不易被肠道酶消化，很难被吸收并循环到病灶，很难发挥作用。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种抗癌活性蛋白妙沙林及其编码基因和应用；所述抗癌活性蛋白妙沙林分离自云芝菌丝体提取物，对人结直肠上皮癌细胞系显示出强抑制增殖活性，能够高效的抑制人结直肠癌细胞增殖，对肿瘤中最具攻击性的肿瘤干细胞具有显著抑制增殖活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种全新抗癌活性蛋白妙沙林，所述抗癌活性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1。

本发明提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林的制备方法，通过组合层析的方法从药用云芝中分离纯化获得

本发明提供了所述抗癌活性蛋白妙沙林的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备抗癌药物中的应用。

优选的，所述抗癌药物包括抗结直肠癌的靶向药物。

本发明提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖的药物中的应用。

优选的，所述结直肠癌肿瘤细胞包括结直肠癌肿瘤干细胞。

本发明提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

本发明提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备核糖核酸酶中的应用。

本发明还提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备下调表皮生长因子受体EGFR表达的药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的抗癌活性蛋白妙沙林分离自云芝菌丝体提取物，具有低细胞毒性、水溶性好等特点，所述抗癌活性蛋白妙沙林在体内外均表现出强烈的抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖活性，尤其是针对最具侵袭性的肿瘤干细胞，所述抗癌活性蛋白妙沙林能够在不引起肿瘤坏死或凋亡的情况下，减弱肿瘤生长和转移的主要信号通路。根据实施例记载，所述抗癌活性蛋白妙沙林能够抑制肿瘤细胞自身的增殖，并能够显著抑制具有 CD44⁺/CD24⁺的肿瘤干细胞的增殖，显著性抑制体外基质胶细胞克隆和软琼脂细胞克隆形成。小鼠体内实验表明，所述抗癌活性蛋白妙沙林能够抑制小鼠体内肿瘤生长；口服所述抗癌活性蛋白妙沙林的小鼠体内肿瘤的平均尺寸显著减小；口服所述抗癌活性蛋白妙沙林6mg/kg小鼠的体内肿瘤生长抑制的程度与吉非替尼(1.25mg/小鼠)灌喂组小鼠体内的肿瘤生长抑制程度等效；并且口服所述抗癌活性蛋白的小鼠无皮疹、脱毛副作用。

附图说明

图1为从云芝提取物中分离纯化所述抗癌活性蛋白妙沙林流程；

图2为体外实验所述抗癌活性蛋白妙沙林显著抑制多种结直肠癌细胞增殖活性；

图3为AnnexinV/PI流式细胞双染色法检测所述抗癌活性蛋白妙沙林处理的HT29细胞凋亡和坏死效果评估；

图4为所述抗癌活性蛋白妙沙林对肿瘤干细胞亚群的增殖抑制效果；

图5为所述抗癌活性蛋白妙沙林抑制免疫缺陷小鼠体内肿瘤干细胞样 HT29-CD24⁺/CD44⁺细胞的增殖；

图6为所述抗癌活性蛋白妙沙林的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)活性检测及免疫印记法检测EGFR信号通路影响；

图7为所述抗癌活性蛋白妙沙林体外核糖核酸酶活性(RNAase)检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗癌活性蛋白妙沙林，所述抗癌活性蛋白的氨基酸序列如SEQID No.1，具体如下：

Met Ser Ser Val Ser Met Ser Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Ile Leu Trp M S SV S M S A L Y A S A I L W 1 10

Tyr Ile Asp Gln Gln Cys Leu Asn Val Gly Asp Glu Ala Trp Val Val Y I DQ Q C L N V G D E A W V V 20 30

Leu Ala Gly Arg Arg Ser Pro Asp Leu Gln Gly Glu Thr Thr Ala Tyr L A GR R S P D L Q G E T T A Y 40

Pro Ala Ile Arg Met Gly Asp Leu Arg Gly Leu Ala Glu Leu Asp Val P A IR M G D L R G L A E L D V 50 60

Asn Ala Ala Asn Asp Val Phe His Arg Phe Leu Gly Arg Ser Gly Glu N A AN D V F H R F L G R S G E 70 80

Tyr Tyr Arg Glu Gly Ala Ser Pro Thr Pro Arg Gly Tyr Leu Leu Thr Y Y RE G A S P T P R G Y L L T 90

Ile Phe Ala Ala Ile Ala Gly Leu Phe Ala Leu Gly Val Tyr Cys Tyr I F AA I A G L F A L G V Y C Y 100 110＊

在本发明中，所述抗癌活性蛋白妙沙林包括112个氨基酸，分子量为 12249.42道尔顿，等电点为4.90。在本发明中，所述抗癌活性蛋白妙沙林首次分离纯化自云芝菌丝体提取物，本发明对所述抗癌活性蛋白妙沙林的制备方法没有特殊限定，可以采用分离提取的方法从云芝菌丝提取物中提取，也可以通过人工合成或基因工程的方法制备获得。

本发明提供了所述抗癌活性蛋白妙沙林的编码基因，所述编码基因包括 336个核苷酸，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸和氨基酸对应序列具体如下：

ATGAGCAGCGTCAGCATGAG CGCCTTATAC GCCAGCGCGATCTTATGGTA M S S V S M S AL Y A S A I L W Y 1

CATTGATCAACAATGCCTGAACGTCGGCGATGAAGCTTGG GTGGTGCTCG I D Q Q C L N V GD E A W V V L 51

CAGGCAGACGATCGCCTGATCTGCAGGGGGAAACCACAGC GTATCCCGCG A G R R S P D L QG E T T A Y P A 101

ATACGTATGGGGGATTTGCG GGGCCTGGCG GAGCTGGACG TCAACGCTGC I R M G D L R GL A E L D V N A A 151

AAACGACGTG TTCCACCGGTTTCTGGGCCG CAGTGGAGAG TACTACCGCG N D V F H R F LG R S G E Y Y R E 201

AAGGGGCAAG CCCAACTCCT CGTGGGTACC TTCTGACGATATTTGCGGCC G A S P T P R GY L L T I F A A 251

ATCGCAGGAC TGTTCGCCCT GGGGGTCTAC TGCTACTAG I A G L F A L G V Y C Y＊

本发明还提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备抗癌药物中的应用。在本发明中，所述抗癌药物优选的包括抗结直肠癌的靶向药物。

本发明还提供了所述的抗癌活性蛋白妙沙林或所述的编码基因在制备抑制结直肠癌肿瘤细胞的增殖的药物中的应用。在本发明中，所述结直肠癌肿瘤细胞优选的包括结直肠癌肿瘤干细胞；所述结直肠癌肿瘤干细胞更优选的包括具有侵袭性的HT29-CD24⁺-CD44⁺肿瘤干细胞样亚群。

本发明对上述药物的剂型、制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的药物剂型和制备方法即可。

本发明提供的抗癌活性蛋白妙沙林能够强烈抑制酪氨酸激酶活性，能够显著下调表皮生长因子受体(EGFR)的表达和磷酸化水平；所述抗癌活性蛋白妙沙林具有显著的核糖核酸酶活性，能够在体外显著降解核糖核酸，从而抑制结直肠肿瘤细胞增殖。本发明提供的所述抗癌活性蛋白妙沙林显著抑制具有高侵袭性的CD24⁺-CD44⁺HT29肿瘤干细胞亚群的体外生长和集落形成，不诱导细胞坏死或凋亡。实验动物体内实验结果表明，所述抗癌活性蛋白妙沙林(6mg/kg)能够显著抑制CD24+-CD44+HT29肿瘤细胞移植到肿瘤免疫缺陷SCID/NOD小鼠中的生长。通过分析所述抗癌活性蛋白妙沙林对 CD24⁺-CD44⁺HT29肿瘤细胞的全转录表达谱，发现所述抗癌活性蛋白妙沙林能够作用细胞周期的上游EGFR信号通路，调节控制上皮细胞向间质转化的信号网络，实现抑制高侵袭性的肿瘤干细胞的增殖及低毒性杀伤肿瘤细胞。本发明提供的抗癌活性蛋白妙沙林对于结直肠癌的治疗具有重要的临床应用价值，可作为创新药物的先导分子，修饰和改善尤其对于结直肠癌患者的治疗具有重要的临床应用价值。

本发明将所述抗癌活性蛋白命名为妙沙林，在实施例和说明书附图中均以妙沙林表示。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

妙沙林的分离、纯化

将云芝菌丝体提取物(市售产品，商品名为多糖肽，PSP)粉末(0.5g)溶解在100mL去离子水，煮沸2h充分溶解，冷却后离心处理(3000×g，4℃，40min)，上清液采用截流分子量为3-30k道尔顿超滤杯进行超滤，收集滤出液进行冷冻干燥。以10mL缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8)溶解粗提物冻干粉，将其加载到缓冲液预先平衡好的Sepharose Q柱，进行梯度洗脱(A液：50mM Tris-HCl，pH7.8；B液：50mM Tris-HCl，pH7.8，2MNaCl；体积比A液:B 液＝1:1)，通过280nm的吸收值来追踪蛋白分离峰。具有强抗肿瘤增殖活性的妙沙林分离峰在梯度0.5MNaCl时被洗脱(如图1中的B箭头所示)。收集粗制妙沙林活性组分，冷冻干燥后采用去离子水重新溶解，上样于Sephadex G25色谱柱进行脱盐，采用MilliQ级去离子水作为流动相。通过G25分子筛色谱柱进一步分离为4个分离峰(图1中的C)。其中具有高抗肿瘤增殖活性的妙沙林主要分布在G1峰。将组分G1加载到反相碳C18柱，采用含0.1％三氟乙酸去离子水(TFA)-乙腈(ACN)溶液系统进行梯度洗脱，妙沙林在乙腈(ACN)梯度为20％时获得。纯化的妙沙林在4-20％Tricine Protein Gel(Invitrogen，Grand Island，NY)进行蛋白质电泳检验纯度。考马斯亮蓝 R250及硝酸银染色结果均显示只有一条分子量约为13kDa的条带，命名为妙沙林(英文名：musarin)(图1中的D)。

实施例2

妙沙林性质鉴定

纯化妙沙林冷冻干燥后，表现为一种水溶性棕色粉末，不溶于乙醇。采用茚三酮、双缩脲和硫酸-苯酚反应测试纯化的妙沙林，采用牛血清白蛋白、细胞色素c和β-葡聚糖作为阳性对照。

结果表明：妙沙林对茚三酮反应呈阳性，但生色团强度仅为牛血清白蛋白等重的68％；妙沙林对双缩脲反应为阳性，双缩脲生色团强度仅为细胞色素c等重的25％；妙沙林对硫酸-苯酚反应为阴性(<0.1％)。综合这些测试结果，提示妙沙林为蛋白质，妙沙林中碳水化合物含量微少，可以忽略。

实施例3

妙沙林蛋白序列鉴定

纯化的妙沙林蛋白(2mg)经还原样品处理液处理后，经4-10％Tricine ProteinGel凝胶分离，固定染色，割胶带，转移到离心管，加入1mL 100mM NH₄HCO₃/30％ACN脱色，清洗至透明，去除上清，冻干。每管加入90μL 100mMNH₄HCO₃，10μL 100mM DTT，56℃孵育30min，还原蛋白质。每管加入100μL 100mM NH₄HCO₃，50μL 200mM IAM，避光20min，还原保护。处理结束后，去上清，每管加入100μL 100mMNH₄HCO₃，室温孵育15min。去上清，加入100μL缓冲液(50mMNH₄HCO₃，pH 7.8)，分别采用胰蛋白酶/ 糜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶组合37℃酶切过夜。酶切结束，采用100μL 抽提液(60％ACN/0.1％TFA)抽提蛋白片段，采用串联质谱进行分析鉴定。获取不同酶切组合的妙沙林酶切蛋白片段数据后，使用国际蛋白质谱数据库进行检索，根据蛋白酶切肽片段数据的覆盖率，最终确定妙沙林的蛋白全序列，根据蛋白序列推导出基因编码序列。

结果表明：采用胰蛋白酶/糜蛋白酶组合酶切，抽提肽片段，通过串联质谱进行肽指纹图谱分析，通过数据库检索，下划线部分为质谱鉴定的酶切肽片段，根据覆盖的肽指纹片段通过数据库检索确定妙沙林的蛋白全序列，包含112个氨基酸，分子量为12249.42道尔顿(图1中的E)。

实施例4

通过T84肿瘤细胞增殖抑制活性追踪云芝菌丝体提取物活性成分妙沙林的分离

T84是一种来源于人结肠癌的细胞株，被广泛作为评价抗肿瘤药物的典型实验室细胞模型。采用T84细胞增殖抑制来追踪PSP中增殖抑制活性成分妙沙林的分离，溶剂系统处理作为对照组，活性组分处理T84细胞48h后，采用 MTT法测定T84细胞生长增殖抑制效应，从而确定抗增殖活性组分的分布。

结果表明：云芝菌丝体提取物、超滤的分子量约为3～30k道尔顿部分的活性组分均能够显著抑制T84细胞的增殖(图1中的A)。

实施例5

妙沙林抑制肿瘤细胞增殖、细胞毒性和细胞凋亡活性测试

多株结直肠癌细胞(购自ATCC)，分别培养于包含10％胎牛血清-青链霉素双抗生素的不同培养基中：DMEM(T84和Caco2)，RPMI 1640(WiDr， Colo320 DM，colo205，HCT-15，SW620，SW480，SW1116)和McCoy 5a(HCT116，HT29)。来源于人正常肠表皮细胞分离出的细胞株FHs74则在含有10％胎牛血清-青链霉素双抗生素-30ng/mL EGF(表皮生长因子)的X-46培养基(购自ATCC)中培养。所有细胞均采用37℃，5％CO₂恒温培养。将每株细胞按10³/孔的密度接种到96孔板。过夜培养后，状态良好的细胞，分别采用妙沙林(浓度变化：0.1-50μg/mL)或对照试剂处理，于37℃连续培养7 天。在药物处理后第2、5、6和7天更换新鲜培养基，并在不同时间点通过阿拉玛蓝(AlarmaBlue)活性染色指示剂(购自Invitrogen)实现对活细胞的数量定量测量，计算妙沙林对多个结直肠细胞株的增殖速率的影响。通过 ApoTox-Glo^TM三重检测细胞活力和毒性的试剂盒(购自Promega)，测量妙沙林对肿瘤细胞的三重细胞毒效应，包括抑制细胞增殖、诱导细胞坏死及诱导细胞凋亡活性。ApoTox-Glo^TM检测能够对每个孔同时进行三种测量：通过特异性检测标记蛋白酶降解透过细胞膜释放的荧光肽底物，从而实现量化测量活细胞的膜完整性；细胞坏死的指标则主要测量因细胞死亡而激活的蛋白水解酶降解不可渗透细胞膜的肽底物而释放出的独特荧光团；细胞凋亡则主要测量因caspase3/7激活而酶切特定标记底物释放的发光产物。HT29细胞 (1×10⁵/孔)接种于24孔板，过夜培养并观察细胞正常生长后，妙沙林 (3μg/mL)、依托泊苷(Etoposide，50μM，阳性对照)、溶剂(PBS，阴性对照) 处理孵育细胞48h。依托泊苷是一种临床抗肿瘤药，能够阻断拓扑异构酶II，诱导细胞分裂过程中DNA断裂，通过坏死和凋亡导致细胞死亡。

结果表明：妙沙林显著抑制多株结直肠癌表皮细胞的增殖。妙沙林 (0.1～50μg/mL)呈剂量依赖性抑制T84细胞增殖(图2中的A)。根据第7天的抑制增殖效应构建的量效曲线，计算出妙沙林抑制T84细胞增殖的IC50为 1.8μg/mL(图2中的B)。妙沙林(3μg/ml)对多株结直肠癌表皮细胞T84、Widr、 Caco2、HCT15、HCT116、HT29、Colo205、Colo320dm、SW480、SW620 及SW1116均表现出显著的增殖抑制活性，但对正常小肠细胞FHS74细胞无显著抑制作用。妙沙林对测试的多株结直肠癌表皮细胞的增殖抑制作用具有选择性。妙沙林对生长最快、侵袭性强的HCT15细胞的增殖抑制作用最显著。妙沙林(3μg/mL)处理的HCT15增殖抑制率为87％，对HT29细胞的增殖抑制率为73％，T84细胞增殖抑制率为39％，强烈提示妙沙林特异性抑制肿瘤干细胞(图2中的C)。因为HT29细胞对妙沙林的增殖抑制作用的敏感性居中，选择HT29细胞进一步深入研究妙沙林抑制结直肠癌细胞增殖的机制。

实施例6

免疫荧光染色、TUNEL染色、Annexin V/PI双染色检测妙沙林的细胞增殖抑制/凋亡效应。

免疫荧光染色：HT29细胞接种到6孔培养板中盖玻片(浓度为100个细胞/孔)。使用含妙沙林(3μg/mL)的培养基孵育10天。每三天更换一次含妙沙林培养基。使用Invitrogen固定和穿透试剂盒进行HT29细胞固定、通透和封闭处理(Grand Island，NY)，将鼠抗人Ki67一抗与细胞4℃孵育过夜。洗涤后，用FITC标记羊抗鼠二抗(Santa Cruz，Dallas，TX)染色，并使用 DAPI染色细胞核。封片后在共聚焦显微镜下(Zeiss,German)观察染色结果。

TUNEL染色：在TUNEL法中，通过UTP末端标记法标记末端脱氧核苷酸转移酶检测细胞凋亡。当标记的dUDP掺入DNA片段时，可定量测量凋亡细胞中的绿色荧光。将HT29细胞(10⁵细胞/mL)接种于细胞培养小室的盖玻片上(Millipore，Billerica，MA)。妙沙林(3μg/mL)孵育细胞48h后，使用Invitrogen固定和穿透试剂盒将细胞固定通透后，使用TUNEL测定法 (Roche，Nutley，NJ)测量凋亡。以依托泊苷(Etoposide，50μM)作为阳性对照，以溶剂(PBS)作为阴性对照。

AnnexinV/PI双染色：分别用妙沙林(3μg/mL)、PBS(阴性对照)、依托泊苷(Etoposide，50μM，阳性对照)处理HT29细胞48h后，将细胞从培养孔转移至染色管中。用4mL不含酚红的RMPI 1640(含有5％(v/v)的胎牛血清, Hyclone，UT)4℃洗涤一次。经200×g，4℃离心10min收集细胞。采用100μL Annexin V结合缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂、2.5mM CaCl₂，pH 7.4，含2μg/mLAnnexinV)(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)重悬浮细胞，然后将染色管在冰上避光孵育10min。用含有 5％(v/v)胎牛血清的无酚红RMPI 1640培养基洗涤细胞三次，并用100μLPI 溶液(1μg/mL，Sigma)在冰上染色10min。用0.1％低聚甲醛固定细胞。通过流式细胞仪分析PI和AnnexinV-FITC双染色细胞。如果两种标记物呈阳性信号，均表明细胞坏死；仅AnnexinV-FITC(细胞外染料)呈阳性信号，则代表细胞凋亡。

结果表明：免疫荧光Ki67染色结果表明，PBS处理的对照组，在细胞簇周围可观察到活跃增殖的标志物，Ki67染色阳性明亮；妙沙林处理组细胞，未观察到细胞簇周围的Ki67染色阳性信号(图2中的F)。TUNEL染色结果表明，依托泊苷(Etoposide)处理的HT29细胞，凋亡细胞(箭头所示)显著增加，而妙沙林处理的HT29细胞则无明显的阳性信号(图2中的E)。流式细胞仪分析结果表明，依托泊苷(Etoposide)处理后的细胞能够被Annexin V-FITC染色，显示细胞凋亡发生(图3中的A)；妙沙林处理HT29细胞，细胞活力无显著改变，无显著的凋亡或坏死的阳性信号(图3中的B和C)。因此，妙沙林抑制肿瘤细胞增殖效应是通过抑制细胞本身的增殖，而非通过诱导细胞坏死或凋亡引起的细胞丢失而导致结肠直肠癌细胞数量的减少。

实施例7

妙沙林抑制CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞亚群落的增殖

采用双荧光标记组合(FITC标记的鼠抗人CD44抗体和PE标记的鼠抗人CD24的抗体)，通过流式细胞仪分选并收集表面高表达CD44及CD24的 HT29肿瘤干细胞亚群落，同时分选CD44⁺/CD24^－-HT29及CD44^－/CD24⁺ -HT29细胞亚群作为对照。分选的细胞亚群，经细胞筛过滤，均制备成单细胞悬液，应用于细胞增殖实验的评估。

结果表明：通过流式细胞仪采用CD44和CD24作为肿瘤干细胞的特定标记，成功从HT29细胞中实现分选了CD44⁺/CD24⁺-HT29细胞，代表肿瘤干细胞样亚群；同时分选CD44⁺/CD24^－-HT29细胞、CD44^－/CD24⁺-HT29 细胞亚群作为对照。经妙沙林(3μg/mL)处理2天(48h)后，CD44⁺/CD24⁺ -HT29肿瘤干细胞的增殖被抑制45％。妙沙林对CD44⁺/CD24⁺-HT29亚细胞群的增殖抑制效应显著高于对HT29混合细胞群(增殖抑制率约20％)(图4 中的A)。妙沙林(3μg/mL)处理4天后，对CD44⁺/CD24⁺-HT29细胞亚群落的增殖抑制率为82％，对CD44^-/CD24^--HT29细胞亚群落的增殖抑制率则为 10％，对CD44^－/CD24⁺-HT29细胞亚群落的增殖抑制率为65％(图4中的B)。这些细胞亚群均来自同一HT29细胞株。因此，妙沙林抑制增殖效应的差异主要归因于由它们的细胞标记不同而表现出来的肿瘤干细胞性质的差异。

实施例8

妙沙林抑制体外结直肠癌干细胞基质胶细胞克隆和软琼脂细胞克隆的形成

采用上述双荧光标记组合筛选到CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞亚群落、CD44⁺/CD24^－-HT29、CD44^－/CD24⁺-HT29细胞亚群。分选的细胞亚群，经细胞筛过滤，制备成单细胞悬液。该单细胞悬液应用于肿瘤干细胞的基质胶肿瘤集落模型，以评估妙沙林对肿瘤集落形成能力的抑制。将单细胞悬液注射到免疫缺陷小鼠体内构建肿瘤在体模型，用以评估妙沙林对肿瘤干细胞在体生长和转移的抑制效应。

基质胶肿瘤集落模型分析：将分选的CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞通过细胞筛制备成单细胞悬液，细胞计数后重悬于基质胶(matrigel)(BD Biosciences)和培养基的1:1混合物，接种到24孔板。经培养基平衡6h后，加入含妙沙林(3μg/mL)的新鲜培养基,在含5％CO₂-37℃的细胞培养箱中培养，每三天更换一次新鲜培养基，持续培养2周。培养结束后，染色、固定，采用倒置显微镜拍摄单个孔中单细胞形成的克隆，采用Image J进行定量计算。

软琼脂细胞克隆形成分析：三维软琼脂细胞培养体系(下层为基础琼脂层，上层为0.7％软琼脂上层)允许肿瘤细胞迁移，从而更接近真实的体内环境。通过流式细胞仪分选表面表达CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞亚群落并通过细胞筛制备成单细胞悬液，同时分选CD44⁺-CD24^－-HT29细胞、CD44 ^－-CD24⁺-HT29细胞亚群作为对照。细胞计数后将收集的最高1％双重阳性标记的100个单细胞接种到三维软琼脂细胞培养体系表面，加入培养基平衡 6h。加入含妙沙林(3μg/mL)的培养基，放入5％CO₂的细胞培养箱中37℃培养，每三天更换一次新鲜培养基，持续培养2周。孵育结束后，吸去培养基，用0.5mL结晶紫(结晶紫浓度0.4％，溶于20％乙醇溶液)染色细胞克隆 10min。染色结束后，PBS洗涤三次，采用奥德赛扫描仪(LI-COR)扫描结晶紫染色克隆获得图像。使用Image J软件对细胞克隆定量计数。

结果表明：妙沙林显著抑制CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞的增殖。通过倒置显微镜观察，基质胶肿瘤集落模型中，单个CD44⁺/CD24⁺-HT29细胞在基质胶包被的培养板经过2周培养，能够生长为大的、圆形的、透明的细胞克隆。含妙沙林(3μg/mL)的培养基处理后，细胞克隆形成的尺寸显著减小 (图4中的C)。三维软琼脂细胞培养体系中，妙沙林处理能够剂量依赖地限制了CD44⁺/CD24⁺-HT29细胞克隆的数目和克隆尺寸的大小。妙沙林(3μg/mL)处理显示出与抗肿瘤药依托泊苷(Etoposide,50μM，阳性对照)相当的抑制细胞增殖的活性(图4中的D)。因此，妙沙林能够显著抑制具有 CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞的增殖，显著性抑制体外基质胶细胞克隆和软琼脂细胞克隆形成。

实施例9

妙沙林抑制小鼠体内肿瘤生长

含荧光素报告系统的HT29细胞构建：将包含Luc2-pGL4慢病毒质粒 (PerkinElmer)转染HT29细胞；通过梯度稀释培养，使用含(2μg/mL)嘌呤霉素的培养基筛选表达响应D-荧光素信号的HT29阳性细胞克隆。持续使用筛选培养基3周后，通过流式细胞仪分选包含荧光素报告系统的HT29细胞，收集 CD24⁺/CD44⁺-HT 29细胞亚群落。收集信号最高1％双重阳性标记的细胞，使之重悬于1:1的基质胶和无血清培养基(含1％青链霉素的DMEM)的混合溶液中。将含有1000个细胞的100μL细胞悬液注射于8周龄雄性NOD/SCID免疫缺陷小鼠(Jackson Lab)背部双侧皮下。肿瘤细胞注射接种1周后，通过活体影像观察两侧肿瘤生长。同时，通过灌喂法向实验小鼠灌服妙沙林(浓度6 mg/kg，溶于PBS中，约150μg/小鼠)；阴性组小鼠灌喂相同体积含5％DMSO 的PBS；阳性对照组小鼠灌喂吉非替尼(50mg/kg，溶于5％DMSO，约1.25mg/ 小鼠)，每周灌喂三次。八周后，通过Xenogen IVIS-200光学体内成像系统 (PerkinElmer，W altham，MA)活体检测小鼠背部皮下肿瘤，通过萤光素酶的图像监测体内肿瘤大小。实验结束后，处死小鼠，取出肿瘤组织，通过测量肿瘤组织块的长宽高，计算肿瘤组织的大小，称量记录肿瘤组织块的重量。

结果表明：PBS处理组的实验小鼠体内出现肿瘤平均尺寸约为2000立方毫米，平均重量约为1克(图5中的B～D)。灌喂妙沙林的小鼠体内肿瘤的平均尺寸显著减小，平均值大约仅为400立方毫米，平均重量为0.3克。口服妙沙林(6mg/kg)小鼠的体内肿瘤生长抑制的程度与吉非替尼(1.25mg/小鼠)灌喂组小鼠体内的肿瘤生长抑制程度等效(图5中的B～D)。妙沙林灌喂的小鼠组，未观察到文献报道的吉非替尼治疗试验小鼠肿瘤所带来的皮疹、脱毛等副作用。

实施例10

妙沙林体外酪氨酸激酶抑制剂(TKI)活性分析

使用Promega(Madison，WI)的ADP-Glo ^TM激酶测定试剂盒分析妙沙林的体外酪氨酸激酶抑制剂TKI活性。将妙沙林与EGFR、ATP和底物与5×酪氨酸激酶缓冲液充分混匀，并于室温孵育60min；继而加入 ADP-Glo试剂一起室温孵育40min。使用Versa Max酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量底物发光。吉非替尼(一种能够结合EGFR的 ATP结合位点的TKI)作阳性对照。

结果表明：妙沙林具有酪氨酸激酶抑制剂活性，能够剂量依赖性方式抑制EGFR酪氨酸激酶活性，根据妙沙林的TKI量效曲线，计算出妙沙林的IC50 约为17μg/mL(图6中的C和D)。

实施例11

免疫印迹检测妙沙林调节肿瘤干细胞的信号通路

妙沙林(3μg/mL)孵育CD24⁺/CD44⁺双阳性HT29细胞48h后，采用预冷PBS洗涤细胞两次，加入新鲜配制的、含有混合蛋白酶抑制剂(Cell Signaling，Danvers，MA)的裂解缓冲液冰上裂解细胞。收集细胞裂解液上清，经蛋白定量(BCA，Pierce)，50μg总蛋白的细胞样品通过SDS-PAGE电泳胶 (Invitrogen)分离，转移到PVDF膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。封闭平衡后，与多个抗体及相应二抗孵育。免疫印迹分析测量多个调节细胞增殖的关键调控信号分子的蛋白表达和磷酸化修饰水平，包括EGFR、磷酸化肌醇3-激酶 (p-PI3K)、蛋白激酶B、Akt、p21、细胞周期蛋白D1、p-PTEN、p-Akt和磷酸肌醇依赖性激酶(PDK1和PDK2)。分别采用多种信号蛋白[EGFR，Akt， P21，细胞周期蛋白D1，p-PI3K，p-PTEN，PDK1，PDK2和p-Akt，EGFR 不同位点的磷酸化抗体为Y1045，Y1173和S1046/1047(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)]的特异抗体识别靶分子，使用山羊抗小鼠IRDye 680CW或山羊抗兔IRDye800CW荧光二抗，采用Odyssey扫描仪(LI-COR Biosciences，林肯，NE)可视化定量分析目标信号分子的变化，使用β-肌动蛋白(Abcam，Cambridge，MA)作为内参校准。

结果表明：阳性对照药物吉非替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，通过作用于EGFR ATP结合位点，可抑制特定类型的EGFR自磷酸化，从而抑制限EGFR磷酸化介导的下游信号分子激活的信号通路。因此，吉非替尼在临床上被用作靶向化疗药物治疗肿瘤。妙沙林 (3μg/mL)处理48h后，CD24⁺/CD44⁺双阳性HT29细胞EGFR、cyclin D1(细胞周期蛋白)和PDK2蛋白表达水平显著降低，p-PI3K和 p-Akt(Ser473)的磷酸化水平显著降低，p21和Akt的蛋白表达水平显著增加(图6中的A-B)。EGFR的Tyr1045(p-EGFR-Y1045)、 Tyr1173(p-EGFR-Y1173)、Ser1046/1047(p-EGFR-S1046/1047)是调节 EGFR活性的不同磷酸化位点，能够被不同酪氨酸激酶特异性修饰，通过调节其磷酸化水平而改变EGFR的活性状态，实现不同的生理功能。妙沙林(3μg/mL)处理48h，EGFR的p-EGFR-Y1045磷酸化水平显著增高，EGFR的p-EGFR-Y1173磷酸化水平显著降低，EGFR的 p-EGFR-S1046/1047磷酸化水平无显著变化(图6中的E-F)。因此，妙沙林抑制CD44⁺/CD24⁺-HT29细胞的酪氨酸激酶，调节表皮生长因子受体(EGFR)的特定位点磷酸化水平，使EGFR失活，淬灭EGFR调节增殖相关的关键信号通路网络，从而实现抑制CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞的增殖。

实施例12

全基因组转录表达谱分析妙沙林调节CD44⁺/CD24⁺-HT29肿瘤干细胞的关键信号通路

经流式细胞仪分选的CD24⁺/CD44⁺-HT29细胞(5×10⁵)接种于25cm²培养瓶中，在含5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养过夜。更换新鲜培养基后，将妙沙林(3μg/mL)加入培养瓶中孵育2天,PBS处理作为阴性对照。使用Trizol溶液(Invitrogen)提取总RNA,全基因转录表达谱(WTAtlas)试剂盒(Affymetrix)来扩增、标记、合成处理细胞的cDNA，通过芯片杂交工作站实现全基因转录表达谱芯片与样品杂交(AffymetrixArray人源全基因转录组芯片2.0)、洗涤和扫描。将扫描好的样本芯片图像数据导入Expression Console(Affymetrix)，经过内参校准、参数分析、质量控制检验和背景校正，符合质控标准的样本经过标准化和log2数据转换处理，获得样本的全基因表达谱数据。使用带有R包'samr'的微阵列(SAM)进行表达显著性分析，从全基因列表中设置筛选差异性表达基因的标准(上调>1.3或下调<0.7倍)，筛选鉴定妙沙林处理和对照组之间显著性差异表达的基因，使用TMeV 4.8软件生成显著性差异表达基因的二维聚类图。

信号通路分析：信号通路分析基于已知的基因或蛋白质之间的相互作用，并通过实验验证而建立的信号网络，从而构建的相关基因的差异调控的生物功能信号网络。通过内参标准校正后，将妙沙林调节的全基因转录表达谱显著差异基因的样本数据导入Ingenuity信号分析系统 (www.ingenuity.com)，采用数据库中基因-基因相互作用全信号通路库进行注解，筛选和分析妙沙林处理引起的显著差异表达的关键信号通路网络，设置基因显著差异表达的标准为上调(FC>1.3)或下调(FC<0.7)的筛选参数，并对多个比较进行校正。将筛选确定的信号网络按其一致性的重要性进行排序，表示为Fisher精确测试P值。根据已知的信号通路经典途径、IPA生成的相关率进行排序，创造力途径分析(IPA)在计算上对转录产物进行了聚类，分析妙沙林调节的最显著的信号通路。

结果表明：通过IPA鉴定出，妙沙林调控降低的经典信号通路包括巨噬细胞信号转导、血小板衍生生长因子(PDGF)信号转导、p-21激活激酶(PAK) 信号转导、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号转导和多功能性人类胚胎干细胞的激活信号等通路。妙沙林治疗与抑制生长促进和癌症相关的信号通路与妙沙林抑制肿瘤干细胞增殖的信号通路密切相关，结果表明妙沙林调节基因表达显著减弱的前三主要信号途径是巨胞饮作用、PDGF和PAK 信号通路。同时，Metacore(GeneGo)的集成软件的功能分析结果表明，妙沙林抑制肌动蛋白与肿瘤转移相关的细胞骨架重组。富集分析结果表明，上皮间质转化(EMT)的发育调节信号通路能够通过修饰肌动蛋白细胞控制骨骼，促进干细胞行为和癌症进展。妙沙林调节EMT信号通路中关键信号分子的表达，包括E-cadherin、TGF-β2、SP1、jagged1、DLL4、Claudin1、WNT、 EGFR、ZO-1、PDGF-D和PDGF-R-β。这些数据表明，妙沙林主要通过调节上皮向间质转化(EMT)调节信号通路以抑制CD24⁺/CD44⁺HT29细胞增殖。

实施例13

妙沙林体外核糖核酸酶活性(RNAase)分析

核糖核酸酶(RNase)能够切割RNA。妙沙林(1.4mg，10μg/uL)与Trizol 抽提得到的T84细胞总RNA(溶于50μL PCR级别水中)37℃金属浴孵育不同时间(0，10s,60s,5min,10min,20min)后，在260nm测定RNA浓度(RNA浓度＝OD260×40μg/μL)。

结果表明：妙沙林具有核糖核酸酶活性，能够能够时间依赖性的降低体外总核糖核酸RNA的浓度，其在20min时酶活性为21.30μg/mg妙沙林。

说明书附图说明详解如下：

图1为从云芝提取物中分离纯化所述抗癌活性蛋白妙沙林流程；采用抑制大肠癌T84细胞增殖的活性来追踪所述抗癌活性蛋白妙沙林的分离；

其中A图为云芝菌丝体粗提物和小分子量亚组分(3～30kDa)具有显著抑制T84细胞增殖活性；PSP表示云芝粗提物；PBS，溶液对照，将PBS处理组的T84细胞增殖定义为100％；B图为通过Sepharose Q柱进一步分离小分子量亚组分(3～30kDa)。如箭头所示，具有强抗肿瘤活性的分离组分在 0.5MNaCl梯度时被洗脱，命名为粗制抗癌活性蛋白妙沙林；C图为将粗制所述抗癌活性蛋白妙沙林组分通过Sephadex G25柱进一步分离，抗癌活性的组分主要分布于G1峰；D图通过HPLC反相C18柱将G1组分进一步分离、纯化所述抗癌活性蛋白妙沙林；采用含有0.1％三氟乙酸的去离子水-乙腈作为流动相，所述抗癌活性蛋白妙沙林在20％乙腈梯度洗脱下来，纯化的所述抗癌活性蛋白妙沙林在SDS-PAGE电泳胶中为分子量约13KDa的单一蛋白条带；E图中将该蛋白条带割胶、脱色，采用胰蛋白酶/糜蛋白酶组合酶切，抽提肽片段，通过串联质谱进行肽指纹图谱分析；通过数据库检索，根据覆盖的肽指纹片段确定所述抗癌活性蛋白妙沙林的蛋白全序列，其中下划线部分为质谱鉴定的肽片段。

其中A图为所述抗癌活性蛋白妙沙林(0.1-50μg/mL)能够显著抑制T84 细胞的增殖，PBS作为阴性对照；B图为测定所述抗癌活性蛋白妙沙林抑制 T84细胞增殖的量效曲线，其EC50浓度为1.8μg/mL；C图为多株结直肠癌细胞对所述抗癌活性蛋白妙沙林抑制增殖的敏感性比较，PBS作为阴性对照；D图为所述抗癌活性蛋白妙沙林对HT29肿瘤细胞三种效应：包括抑制细胞增殖、细胞坏死或凋亡；肿瘤化疗药物依托泊苷为阳性对照；PBS为阴性对照；E图为TUNEL法检测所述抗癌活性蛋白妙沙林诱导HT29肿瘤细胞细胞凋亡效应，依托泊苷为阳性对照，PBS为阴性对照；F图为Ki67荧光染色法检测所述抗癌活性蛋白妙沙林处理肿瘤细胞增殖。所有数据均表示为平均值±标准方差，代表6次生物学独立重复实验。*，p<0.05；**，p<0.01； ***，p<0.001；N.S.，无显著差异。

其中A图为膜联蛋白(V-FITC)和碘化丙啶(PI)双重染色测试细胞凋亡流式细胞仪散点图，依托泊苷(29μg/Ml)为阳性对照；PBS处理的细胞为阴性对照；从左至右依次为PBS、依托泊苷和所述抗癌活性蛋白妙沙林处理结果。结果显示，依托泊苷处理组细胞既诱导细胞凋亡(Annexin V-FITC 染色阳性)，又产生细胞坏死(annexinV-FITC和PI染色双重阳性)；所述抗癌活性蛋白妙沙林处理不诱导产生凋亡或坏死细胞；B图和C图为通过流式细胞仪测量活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的百分比；所有数据均表示为平均值 ±标准方差，代表6次生物学独立重复实验。

其中，A图中所述抗癌活性蛋白妙沙林(3μg/mL)对HT29-CD24⁺/CD44⁺细胞亚群的增殖抑制率为45％，对HT29细胞总数的增殖抑制率为20％，具有显著性差异；B图中所述抗癌活性蛋白妙沙林(3μg/mL，4天)对HT29 中CD24⁺/CD44⁺亚群的增殖抑制率为82％，对CD24⁺/CD44^-亚群的增殖抑制率为65％，对CD24^-/CD44^-亚群细胞无显著的抑制增殖效应；C图中所述抗癌活性蛋白(3μg/mL)处理基质胶包被平板的CD24⁺/CD44⁺HT29亚群细胞4 周后，依托泊苷作为阳性对照，PBS作为阴性对照，肿瘤细胞形成的克隆尺寸相比对照组显著性减小；D图中所述抗癌活性蛋白(0.2-3μg/mL，4周)处理软琼脂培养的HT29-CD24⁺/CD44⁺亚群细胞，采用结晶紫染色法鉴定细胞形成的克隆数目，使用Image J软件计算肿瘤细胞形成克隆的数目；所述抗癌活性蛋白能够以剂量依赖性方式显著抑制HT29-CD24⁺/CD44⁺亚群细胞形成的克隆数；所有数据均表示为平均值±标准方差，代表6次生物学独立重复实验。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；N.S.，无明显差异。

图5为所述抗癌活性蛋白妙沙林抑制免疫缺陷小鼠体内肿瘤干细胞样 HT29-CD24⁺/CD44⁺细胞的增殖。

其中A图为通过流式细胞仪分选经荧光素酶(Luc2)转染的 HT29-CD24⁺/CD44⁺细胞亚群；分选最高HT29-CD24⁺/CD44⁺的1％细胞亚群 (如右上象限内的小紫色矩形所示)，作为免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的肿瘤细胞异种移植的种子；B图为采用灌喂给药所述抗癌活性蛋白妙沙林(6mg/kg) 的方式，测试所述抗癌活性蛋白妙沙林对HT29-CD24⁺/CD44⁺肿瘤细胞在小鼠体内生长的抑制效应，吉非替尼(Gefitinib)灌喂为阳性对照，PBS灌喂组为阴性对照；给药14天后，采用活体成像仪检测小鼠体内移植肿瘤细胞的生长图像，并与对照组的图像进行对比分析；图A、B中的结果代表6次生物学独立重复实验；C图为各实验组小鼠体内肿瘤生长尺寸；D图实验结束后，各组小鼠肿瘤组织重量；PBS对照组和抗癌活性蛋白妙沙林处理组小鼠 (n＝6)，吉非替尼治疗组小鼠(n＝4)。

其中A图为免疫印记实验结果；所述抗癌活性蛋白妙沙林(3μg/mL) 可显著降低EGFR信号通路中关键信号分子(EGFR、PDK2和cyclin D1)的蛋白表达和(p-PI3K、p-Akt(Ser473))磷酸化修饰水平，同时可显著增加P21的蛋白表达水平；B图为采用β-肌动蛋白作为内参标准，标准定量化测量免疫印记中关键信号分子的条带信号强度，结果代表3次生物学独立重复实验； C图为所述抗癌活性蛋白妙沙林的TKI活性测试，吉非替尼为阳性对照；D 图为所述抗癌活性蛋白妙沙林的TKI量效曲线，IC50约为17μg/mL；E图为所述抗癌活性蛋白妙沙林对EGFR不同磷酸化位点的影响；所述抗癌活性蛋白妙沙林抑制EGFRTyr1173磷酸化(该位点磷酸化将激活EGFR)；所述抗癌活性蛋白妙沙林增强EGFR Tyr1045的磷酸化(该位点磷酸化将使 EGFR失活)；而所述抗癌活性蛋白妙沙林对Ser1046/1047的磷酸化没有显着影响；F图为采用β-肌动蛋白作为内参标准，标准定量化测量免疫印记中代表EGFR不同部位磷酸化位点的条带信号强度；结果代表3次生物学独立重复实验。

图7为所述抗癌活性蛋白妙沙林体外核糖核酸酶活性(RNAase)检测结果；所述抗癌活性蛋白妙沙林(1.4mg，10μg/μL)与Trizol抽提得到的T84细胞总RNA(溶于50μLPCR级别水中)37℃金属浴孵育不同时间(0，10s,60s, 5min,10min,20min)，其在20min时酶活性为21.30μg/mg所述抗癌活性蛋白。

序列表

<110> 中国科学院昆明植物研究所

<120> 一种抗癌活性蛋白妙沙林及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ser Ser Val Ser Met Ser Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Ile Leu Trp

1 5 10 15

Tyr Ile Asp Gln Gln Cys Leu Asn Val Gly Asp Glu Ala Trp Val Val

20 25 30

Leu Ala Gly Arg Arg Ser Pro Asp Leu Gln Gly Glu Thr Thr Ala Tyr

35 40 45

Pro Ala Ile Arg Met Gly Asp Leu Arg Gly Leu Ala Glu Leu Asp Val

50 55 60

Asn Ala Ala Asn Asp Val Phe His Arg Phe Leu Gly Arg Ser Gly Glu

65 70 75 80

Tyr Tyr Arg Glu Gly Ala Ser Pro Thr Pro Arg Gly Tyr Leu Leu Thr

85 90 95

Ile Phe Ala Ala Ile Ala Gly Leu Phe Ala Leu Gly Val Tyr Cys Tyr

100 105 110

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgagcagcg tcagcatgag cgccttatac gccagcgcga tcttatggta cattgatcaa 60

caatgcctga acgtcggcga tgaagcttgg gtggtgctcg caggcagacg atcgcctgat 120

ctgcaggggg aaaccacagc gtatcccgcg atacgtatgg gggatttgcg gggcctggcg 180

gagctggacg tcaacgctgc aaacgacgtg ttccaccggt ttctgggccg cagtggagag 240

tactaccgcg aaggggcaag cccaactcct cgtgggtacc ttctgacgat atttgcggcc 300

atcgcaggac tgttcgccct gggggtctac tgctactag 339

Claims

1.一种全新抗癌活性蛋白妙沙林，其特征在于，所述抗癌活性蛋白妙沙林的氨基酸序列如SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林的制备方法，其特征在于，通过组合层析的方法从药用云芝中分离纯化获得。

3.权利要求1中所述抗癌活性蛋白妙沙林的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林或权利要求2所述的编码基因在制备抗癌药物中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物包括抗结直肠癌的靶向药物。

6.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林或权利要求2所述的编码基因在制备抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌肿瘤细胞包括结直肠癌肿瘤干细胞。

8.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林或权利要求2所述的编码基因在制备酪氨酸激酶抑制剂中的应用。

9.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林或权利要求2所述的编码基因在制备核糖核酸酶中的应用。

10.权利要求1所述的抗癌活性蛋白妙沙林或权利要求2所述的编码基因在制备下调表皮生长因子受体EGFR表达的药物中的应用。