CN111217890A

CN111217890A - 一种抑制mkk7-jnk通路信号传递的靶向抗癌多肽及其应用

Info

Publication number: CN111217890A
Application number: CN201811421278.0A
Authority: CN
Inventors: 支钦; 李新宇; 付玉清; 邱心敏
Original assignee: Shenzhen Jx Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shenzhen Jx Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN111217890B

Abstract

本发明公开了一种抑制肿瘤细胞中MKK7‑JNK通路信号传递的多肽及其应用。该多肽具有以下氨基酸序列：序列表中的SEQ ID NO.1。本发明的多肽可以进入细胞，并在体内外特异性地结合MKK7，通过抑制MKK7与RACK1结合，进一步抑制MKK7‑JNK通路的信号传递，最终抑制肿瘤细胞的生长。

Description

一种抑制MKK7-JNK通路信号传递的靶向抗癌多肽及其应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，特别涉及一种特异性抑制MKK7-JNK通路信号传递的多肽，及其在制备治疗RACK1过表达且JNK异常活化的癌症疾病药物中的应用。

背景技术

JNK是MAPK家族的重要成员之一，JNK通过级联活化对细胞因子(如肿瘤坏死因子α、白介素1、表皮生长因子)及环境应激(渗透压、电力损伤、紫外辐射、氧化损伤)做出反应。其上游激酶包括MKK4和MKK7，它们能各自同时磷酸化JNK的183位苏氨酸和185位酪氨酸，使JNK发生双磷酸化而活化。此外，MKK4还可以活化P38，而MKK7仅特异性地活化JNK。JNK活化后可以参与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、炎症因子的产生、迁移等。JNK的异常活化可促进多种疾病的发生及发展。JNK在肝癌、吸烟引起的肺癌、肾细胞癌、食管鳞状细胞癌、胶质瘤、黑色素瘤等肿瘤细胞中，均呈现高水平的活化。利用JNK抑制剂抑制JNK的活性，可以增强肿瘤细胞对DNA损伤药物的敏感性，表明JNK在肿瘤细胞中发挥抗凋亡作用(Potapova O,Haghighi A,Bost F,et al.The Jun kinase/stress-activated protein kinasepathway functions to regulate DNA repair and inhibition of the pathwaysensitizes tumor cells to cisplatin[J].Biol Chem 1997,272:14041–4.)。敲除JNK1/2基因，降低JNK的表达则会明显抑制肿瘤的生长。

目前通过JNK途径可治疗炎症疾病、癌症疾病、心血管疾病、自身免疫系统疾病等，由于JNK信号通道在细胞中发挥的作用比较复杂，以ASK、MKK4为靶点的JNK信号通道抑制剂对抗肿瘤的治疗并不具有靶向性，这不仅导致该类药物对抗肿瘤的疗效不高，而且对其他脏器的毒性较大，因此通过JNK途径寻找靶向性的抗肿瘤药物至关重要。在肿瘤细胞中MKK7经磷酸化后能特异性的活化JNK，通过该信号促进肿瘤细胞生长的同时抑制肿瘤细胞的凋亡，由此可知MKK7-JNK途径在肿瘤细胞的生长发挥重要作用，因此，调控这一途径可能成为治疗癌症的新靶点。

RACK1在肝癌、非小细胞肺癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、黑色素瘤等肿瘤细胞中高表达，其中在非小细胞肺癌中的表达比正常肺组织高出近4倍；在结肠癌中，RACK1表达水平较正常结肠组织高约20倍。文献报道，在关于黑色素瘤的实验中减少RACK1的表达可导致JNK活化减弱，从而使黑色素瘤细胞对UV诱导的凋亡敏感性增加，裸鼠成瘤也被抑制(PabloLópez-Bergami,Hasem Habelhah,Anindita Bhoumik,Weizhou Zhang,Lu-Hai Wang,Ze’evRonai.Receptor for RACK1Mediates Activation of JNK by Protein Kinase C[J].Molecular Cell,2005,19(3).)。在肝癌的实验中显示RACK1在肝癌中高表达，并且存在与

MKK7的特异性结合位点，使得RACK1能直接与MKK7相互作用。通过RACK1与MKK7相互作用，增强上游激酶磷酸化MKK7，从而增强了JNK在HCC中的活化水平，发挥促进肿瘤生长的作用，并且增加肝癌对Fas、TRAIL诱导的凋亡的抵抗(Guo Y,Wang W,Wang J,etal.Receptor for activated C kinase 1 promotes hepatocellular carcinoma growthby enhancing mitogen-activated protein kinase kinase 7 activity[J].Hepatology.2013,57:140–151.)。以上研究对开发基于MKK7-JNK通路的特异性抗癌药物提供了启示。

生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要的作用,但由于细胞膜的天然屏障作用,这使得一些有治疗价值但无细胞膜穿透性的分子在药学领域的应用受到极大的限制。细胞穿膜肽(CPPs)是一类具有细胞膜穿透功能、长度多数小于40个的短肽，具有水溶性、低裂解性，并能够有效地将蛋白质、多肽、聚合物等以多种方式导入多种哺乳动物细胞,其转导效率高且不会造成细胞损伤。其中，研究最多的穿膜肽是来源于1型人免疫缺陷病毒反式转录激活因子TAT。TAT的应用为通过控制胞内信号治疗疾病的药物研发提供。

发明内容

基于以上问题，本发明通过RACK1与MKK7的相互作用位点设计新型的抑制MKK7-JNK通路的靶向抗癌多肽药物。

为达到此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种抑制MKK7-JNK通路信号传递的靶向抗癌多肽，其多肽的序列为：YGRKKRRQRRRISTSSK，将其命名为TAT-RACK-1，将RACK1与MKK7的特异结合位点序列(ISTSSK)与TAT序列(YGRKKRRQRRR)创造性地结合起来，使得TAT-RACK-1特异性地与MKK7结合，阻止RACK1与MKK7的结合，阻断RACK1增强上游激酶磷酸化MKK7的机制，从而抑制MKK7-JNK通路信号的传递。同时TAT-RACK-1能穿透细胞膜，直接对细胞内信号传导进行干预。

第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码权利要求1所述肽的核苷酸系列。

第三方面，本发明进一步提供了一种药物组合物，该药物组合物由本发明提供的序列号为SEQ ID NO.1的多肽与能杀伤癌细胞的制剂所组成。

优选地，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

优选地，所述的载体为纳米材料，脂质体、聚合物胶束或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

本发明的多肽，具有靶向MKK7的作用，与其他抗癌的药物或者载有药物的载体组合，能增强药物的疗效，制成新型的更有效的靶向抗癌药物。

优选地，本发明的多肽，对RACK1过表达且JNK异常活化的癌症尤其有效，这类癌症的RACK1表达越高且JNK异常表达，RACK1通过增强上游激酶磷酸化MKK7，调节MKK7-JNK通路信号从而促进肿瘤生长的几率就越大，因此这类多肽抑制肿瘤细胞生长的可能性就越高。

优选地，所述的癌症为肝癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、黑色素瘤。

附图说明

图1、TAT-RAMK-1与MKK7的体外结合情况。

图2、TAT-RAMK-1刺激肝癌细胞后,MKK7、JNK的磷酸化水平与对照组的比较。

图3、TAT-RAMK-1对肝癌细胞、黑色素瘤细胞的抑制情况。

图4、TAT-RAMK-1对肝癌大鼠实体瘤的生长抑制情况。

具体实施方式

实施例1.TAT-RAMK-1与MKK7的体外结合实验

合成序列表中的SEQ ID NO.1的编码序列，将该编码序列连接入pGEX4T-1的BamHI与XhoI酶切识别位点之间。在大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)菌株中表达，并亲和纯化，得到GST融合的编码该序列的融合蛋白GST-TAT-RAMK。通过Pull-Down法检测TAT-RAMK-1与MKK7激酶的体外结合活性将20μg BSA，10μg his-MKK7分别与5μg的GST蛋白、GST融合蛋白GST-TAT-RAMK在PBS，PH7.4缓冲液中与30μl Ni2+-NTAAgarose于4℃孵育4小时，离心收集Ni2+-NTAAgarose并洗涤3次，弃去上清后，剩余的结合在Ni-Agarose上的蛋白加SDS上样缓冲液收集。蛋白样品经12％SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝G250染色检测，即可见到明显的被结合蛋白的条带。结果如图1所示(“+”分别表示该样品中加入指定量的该蛋白，“-”表示未加入)，结果证明TAT-RAMK-1具有结合MKK7的活性。

实施例2.TAT-RAMK-1的固相合成

称量树脂并投入到多肽固相反应器中，加入合适的DMF溶胀半小时以上。抽掉DMF，用脱树脂保护剂进行Fmoc去保护反应，置于摇床上10min。抽掉去保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进入氨基酸缩合反应。按照TAT-RAMK-1的氨基酸序列SEQ ID NO.1，取相应Fmoc氨基酸和、HOBt，用DMF溶解，冰浴下加入DIC活化5min，投入到反应器中，搅拌反应，1-2h后，从反应器中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉反映其中的液体，用DMF、DCM洗涤2次，得到第一个氨基酸所和后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc去保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到携有TAT-RAMK-1的肽树脂。反应完毕后，DCM洗涤2次，甲醇洗涤2次，继续抽干15-20min。将肽树脂置于裂解反应器中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA/水/EDT＝95:5：(V/V))(裂解试剂10mL/g树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3h。反应混合物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并绿叶后减压浓缩，加入无水乙醚沉降，抽干得到白色或类白色粉末，即可得到TAT-RAMK-1粗肽，粗肽使用制备型HPLC纯化后，使用HPLC检测纯度大于90％，TAT-RAMK-1的相关理化性质如表1所示

肽名称	TAT-RAMK-1
		颜色	白色或类白色粉末
溶解性	易溶于水，乙腈等
		茚三酮反应	呈蓝色
HPLC结果	供试品主峰的保留时间与对照品一致

表1

实施例3.TAT-RAMK-1对肝癌细胞内的MKK7-JNK通路的影响

取对数生长期的人肝癌HepG2细胞按4×10⁵个细胞/孔，接种于24孔板中，用新鲜的含10％FBS的RPMI-1640培养基培养24h后，分别用(5μM、10μM、20μM)干预细胞，同时设阴性对照组。干预24h后用预冷的PBS溶液洗涤细胞，加入500μLRIPA裂解液，反复吹打混匀，置于冰上裂解30min，4℃、1200rpm条件下离心15min，吸去上层清液，收集细胞总蛋白。进行SDS-PAGE电泳并电转至PVDF膜。分别使用磷酸化JNK抗体、磷酸化MKK7抗体进行Westernblot，检测多肽干预后的肿瘤细胞中MKK7和JNK的磷酸化情况。结果如图2所示，多肽能明显抑制肿瘤细胞的MKK7和JNK的磷酸化，影响MKK7-JNK通道信号的传递，且抑制作用与多肽的含量呈正相关。

实施例4.TAT-RAMK-1对癌细胞生长的影响

取对数生长期的人肝癌HepG2细胞和黑色素瘤B16F10细胞，于37℃条件下用0.25％胰蛋白酶消化细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔板中，每孔体积100μL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。设空白对照组、高浓度试验组、低浓度试验组及阳性对照组，试验药及阳性对照药均用RPMI-1640培养基溶解，每孔加入100μL，每组设4个复孔。高浓度试验组加入80μM TAT-RAMK-1；低浓度试验组加入40μM TAT-RAMK-1；阳性对照组加入20μM顺铂；空白对照组加入RPMI-1640培养基。继续培养24h后，检测细胞生长抑制率。检测前4h加入CCK-8试剂(20μL/孔)，继续培养4h后测定于波长490nm下吸光度值，按一下公式计算肿瘤细胞生长抑制率肿瘤细胞的生长抑制率(％)＝(1-试验组A值/对照组A值)×100％。TAT-RAMK-1对人肝癌HepG2细胞生长影响如图3A所示，TAT-RAMK-1对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制作用，且高浓度多肽抑制率比低浓度多肽抑制率高。TAT-RAMK-1对黑色素瘤B16F10细胞生长影响如图3B所示，TAT-RAMK-1对黑色素瘤B16F10细胞有明显的抑制作用，且高浓度多肽抑制率比低浓度多肽抑制率高。

实施例5.TAT-RAMK-1对肝癌小鼠实体瘤的生长

将H₂₂肝癌细胞与37℃、95％湿度和5％CO₂培养箱培养，增殖传代后，稀释细胞至1×10⁷个/mL，制成H₂₂肝癌细胞悬液。抽取H₂₂肝癌细胞悬液，将其注射到昆明小鼠的右后肢腋窝皮下，注射量为0.2mL/只，每组6只。接种24h后，腹腔注射给药，连续给药12天，模型组注射生理盐水0.2mL；低浓度试验组注射0.5mM TAT-RAMK-1 0.2mL；高浓度试验组注射1mMTAT-RAMK-10.2mL；阳性对照组0.1mM注射顺铂0.2mL。分别在第1天和第13天，称量小鼠体重。小鼠从接种第2天开始腋窝接种部位即可触及米粒大小的瘤结节，从第3天开始用游标卡尺测量肿瘤长和宽，隔天测量一次，并计算实体瘤体积。给药12天后，停药一天后处死小鼠，取出小鼠瘤组织，称重，计算平均瘤重。其中抑瘤率＝(模型组平均瘤体积-给药组平均瘤体积)/模型组平均瘤体积。结果如图4所示，TAT-RAMK-1多肽能显著抑制肿瘤生长，且高浓度多肽抑制率比低浓度多肽抑制率高。从表2中肿瘤的质量比较同样证明了多肽的肿瘤抑制作用，且从给药前后肿瘤小鼠的体重证明多肽的毒性较阳性对照药顺铂小。

表2

序列表

<110> 深圳市健翔生物制药有限公司

<120> 一种抑制MKK7-JNK通路信号传递的靶向抗癌多肽及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ile Ser Thr Ser Ser

1 5 10 15

Lys

Claims

1.一种抑制MKK7-JNK通路信号传递的靶向抗癌多肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1所述肽的核苷酸系列。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的肽和能杀伤癌细胞的制剂。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为纳米材料，脂质体、聚合物胶束或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

6.权利要求1所述的多肽在制备用于治疗癌症的药物的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌症为RACK1过表达且JNK异常活化的癌症。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌症为肝癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、黑色素瘤中的任意一种。