CN107082799B

CN107082799B - 一种抗肿瘤多肽husp-48及其应用

Info

Publication number: CN107082799B
Application number: CN201710197929.1A
Authority: CN
Inventors: 童强松; 郑丽端; 王晓静; 方二虎; 叶霖; 李聃; 宋华杰; 杨枫
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN107082799A

Abstract

本发明提供了一种可杀伤肿瘤细胞的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

一种抗肿瘤多肽HUSP-48及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可杀伤肿瘤细胞的多肽及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病。在传染病得到控制之后，恶性肿瘤、心脑血管病已成为人类死亡的主要原因。据世界卫生组织统计，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，男性530万，女性470万，占总死亡人数的12％，在多数发达国家高达25％。在我国，恶性肿瘤已成为城乡居民的主要死因，占死亡原因20％以上。对恶性肿瘤的治疗需要投入大量的人力与资金，严重影响着经济建设与社会的发展。因此，寻找并开发安全、有效的抗肿瘤药物或方法已成为国际上的研究热点。

以神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)为例，是常见的好发于幼儿期的交感或副交感神经节的异质性恶性实体肿瘤，占幼儿恶性肿瘤的8-10％，其发病率为0.3-5.5/10万，仅低于白血病和中枢神经系统肿瘤。60％的病例为2岁以下，96％的病例发生在10岁以前。根据NB不同的分期，治疗方式也不尽相同；对于低危组，手术治疗往往可以治愈；对于中危组，采取手术切除并辅以化疗，治愈率介于70-90％；对于高危组，采取大剂量化疗、手术切除和放疗等，然而其治愈率仅为30％左右。近几年来，随着自然科学的发展，恶性肿瘤的临床与基础研究取得了可喜的成就，生物疗法在临床应用中起到了举足轻重的作用，使部分患者的生活质量大大提高，并且使他们看到了根治的曙光。

近年来，具有抗肿瘤活性的天然多肽和人工合成多肽受到广泛关注。目前全球多肽类药物的研发已广泛涉足疫苗、抗肿瘤药物、心脑血管药物、抗病毒多肽以及抗菌活性肽、诊断试剂盒等方面。比如，一种含有NF-kB核定位序列(NLS)的细胞渗透肽证实能成为一个潜在的控制动脉粥样硬化性疾病发展的治疗试剂；来自伊利诺伊大学的研究者通过对小鼠研究揭示，注射大豆肽lunasin可以明显降低其结肠癌的转移。这种多肽分子量小、穿透能力强、免疫原性及毒性低，而且易于合成，因此抗癌活性肽的研究对于肿瘤的临床治疗有重要价值。

因此，需要构建一种既能抑制肿瘤细胞生物学活性，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

为解决以上问题，发明人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

基于该研究，本发明提供了一种可杀伤肿瘤细胞的多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提供了上述可杀伤肿瘤细胞的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

附图说明

图1为多肽HUSP-48的HPLC图谱；

图2为多肽HUSP-48的蛋白质谱检测图谱；

图3为不同浓度的多肽HUSP-48处理人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y24小时后使用四甲基偶氮唑蓝比色法测得的OD₄₉₀的曲线图；

图4为不同浓度的多肽HUSP-48处理人正常对照细胞胚肾细胞HEK-293 24小时后使用四甲基偶氮唑蓝比色法测得的OD₄₉₀的曲线图；

图5为多肽HUSP-48处理人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 24小时后的激光共聚焦显微镜照片；

图6为Transwell实验的结晶紫染色照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.多肽HUSP-48的制备

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中，肿瘤细胞杀伤结构域位于C端，序列如SEQ ID NO：1所示，穿膜结构域位于N端，序列如SEQ ID NO：2所示，所得肽氨基酸序列为：YGRKKRRQRRR-MVSSARPPTPSDSQHSSHFFFSLKTQKSDSFSREKGTWVPFSPSSFRV(SEQ ID NO：3)，命名为HUSP-48。为了研究方便，我们还在抗肿瘤多肽的C端标记的异硫氰酸荧光素标记FITC。

本发明合成的小分子多肽HUSP-48经高效液相色谱仪(HPLC)分析，纯度达到95.05％以上(图1)，并经ESI-MS鉴定结构(图2)。

2.HUSP-48对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的抑制作用

收集处于对数生长期的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y悬液，调整细胞密度至2×10⁶个/ml，按照200μl/孔的体积种入96孔板，细胞在37℃、5％CO₂的条件下过夜贴壁。第二天分别加入终浓度为0μM、10μM、20μM、40μM、80μM的小分子多肽HUSP-48。细胞培养24小时后，每孔加入20μl5mg/ml的四甲基偶氮唑蓝(MTT)MTT溶液，继续培养4小时。培养结束后吸出孔内培养基，每孔加入200μl的二甲亚砜，将96孔板置摇床上低速摇动10分钟充分溶解细胞内的结晶物。用酶标仪检测490nm处96孔板的吸光度值OD₄₉₀，注意设置调零孔、对照孔。结果如图3所示：小分子多肽HUSP-48在10-80μM浓度范围内以梯度依赖的形式对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y具有明显的抑制生长的作用。

3.HUSP-48对人正常细胞胚肾细胞HEK-293的作用

收集处于对数生长期的人正常细胞胚肾细胞HEK-293悬液，调整细胞密度至2×10⁶个/ml，按照200μl/孔的体积种入96孔板，细胞在37℃、5％的CO₂的条件下过夜贴壁。第二天分别加入终浓度为0μM、10μM、20μM、40μM、80μM的小分子多肽HUSP-48。细胞培养24小时后，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4小时。培养结束后吸出孔内培养基，每孔加入200μl的二甲亚砜，将96孔板置摇床上低速摇动10分钟充分溶解细胞内的结晶物。用酶标仪检测490nm处96孔板的吸光度值OD₄₉₀，注意设置调零孔、对照孔。结果如图4所示：小分子多肽HUSP-48在10-80μM浓度范围内对人正常细胞胚肾细胞HEK-293无明显的抑制生长的作用。

4.HUSP-48在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中的定位

将玻璃盖玻片泡酸至少24小时，然后将玻片从酸液中捞出，用小眼科镊夹持每一片玻片，在流动的清水下冲洗5分钟，再泡蒸馏水两次，取出，摊开，干燥。把玻璃盖玻片装入小饭盒或培养皿中，高温高压灭菌，再烘干。将玻片放入24孔板的孔内后，收集处于对数生长期的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y悬液，调整细胞密度至2×10³个/ml，按照500μl/孔的体积种入24孔板，细胞在37℃、5％的CO₂的条件下过夜贴壁。第二天加入终浓度为10μM(此处取较低浓度的多肽即可)的小分子多肽HUSP-48，继续培养24小时。培养结束后吸出孔内培养基，用37℃预热的PBS缓冲液轻柔冲洗细胞两遍，4％的多聚甲醛固定1小时，后在激光共聚焦显微镜下观察多肽的定位，结果如图5所示：小分子多肽HUSP-48定位在细胞质中。

5.HUSP-48对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y侵袭活力的影响

收集处于对数生长期的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y悬液，调整细胞密度至0.3×10⁶个/ml，按照1ml/孔的体积种入6孔板，细胞在37℃、5％的CO₂的条件下过夜贴壁。第二天加入终浓度为20μM(此处取抑制率50％时小分子多肽HUSP-48的浓度)的小分子多肽HUSP-48，继续培养24小时待用。将冻存于-80度冰箱的BD matrigel 4度过夜，变成液态；按无血清培养基和基质胶按1∶5稀释，加入上室各50μl，在37℃培养箱中1-2小时；此间经常观察，当出现″白色层″时，说明已经变为固态。消化经小分子多肽HUSP-48孵育24小时的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，无血清培养基洗3次，配成细胞悬液，调整细胞密度至4×10⁶个/ml；用无血清培养基洗Matrigel洗1次；每孔加入100μl细胞悬液；下腔室中加入500μl含有20％FBS条件培养基；37℃培养箱中，孵育20-24小时；取出transwell用PBS洗2遍，常温甲醇固定1小时；加入结晶紫(0.1％)染色或Giemsa染色(5-10分钟)，室温0.5小时，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞显微镜下观察。结果如图6所示合成的小分子多肽HUSP-48对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y侵袭活力有明显的抑制作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种抗肿瘤多肽HUSP-48及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Val Ser Ser Ala Arg Pro Pro Thr Pro Ser Asp Ser Gln His Ser

1 5 10 15

Ser His Phe Phe Phe Ser Leu Lys Thr Gln Lys Ser Asp Ser Phe Ser

20 25 30

Arg Glu Lys Gly Thr Trp Val Pro Phe Ser Pro Ser Ser Phe Arg Val

35 40 45

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Val Ser Ser Ala

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ser Asp Ser Gln His Ser Ser His Phe Phe Phe

20 25 30

Ser Leu Lys Thr Gln Lys Ser Asp Ser Phe Ser Arg Glu Lys Gly Thr

35 40 45

Trp Val Pro Phe Ser Pro Ser Ser Phe Arg Val

50 55

Claims

1.一种可杀伤肿瘤细胞的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的可杀伤肿瘤细胞的多肽在制备抗神经母细胞瘤药物中的应用。

3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗神经母细胞瘤药物中的应用。