CN107022004B

CN107022004B - 一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用

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Publication number: CN107022004B
Application number: CN201710197374.0A
Authority: CN
Inventors: 郑丽端; 童强松; 宋华杰; 方二虎; 王晓静; 叶霖; 李聃; 杨枫
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN107022004A

Abstract

本发明涉及一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽及其应用。本发明的优点在于，本发明的多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞靶向结构域后，有明显的改变肿瘤增殖、迁移侵袭行为的效应。本发明的多肽可成为筛选靶向性生物治疗肿瘤的活性多肽。

Description

一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种靶向肿瘤细的多肽及其应用，还涉及一种促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽及其应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命的重大疾病，已成为人类死亡的主要原因。随着医疗技术和基础研究的进步，多种肿瘤的治疗已经取得了明显的改善，但常规肿瘤治疗方法(包括手术、化疗、放疗及免疫疗法)给机体正常组织带来损伤，造成很大的副作用，给肿瘤患者带来极大的痛苦。

肿瘤靶向治疗是指通过干扰调控肿瘤发生、发展的关键靶标，针对性地治疗肿瘤。与传统放化疗方法比较，肿瘤靶向疗法能减少对正常组织的损害，降低治疗的副反应，减轻患者痛苦。蛋白质作为生物学功能的执行者，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。近年来，研究者发现具有生物学活性的短肽可能成为肿瘤靶向治疗的有力工具之一。

生物活性多肽的研究始于内源性分泌肽和神经肽的发现。除分泌性短肽和神经肽之外，机体内是否还存在未知的其他短肽序列一直困扰着研究者。随着RNA深度测序及核糖体图谱技术的发展，研究人员发现数以万计了的小开放阅读框(sORF)，其中部分编码产物已经被证实。

细胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是一类具有很强穿透细胞膜能力的短肽，带有正电荷，可以直接穿透细胞膜，进入细胞浆和细胞核，可作为药物载体进行肿瘤治疗。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

肝细胞核因子4A(HNF4A)在多种肿瘤中发挥重要的生物学作用。发明人通过RNA-seq分析，发现其上游序列存在多个sORF，通过构建sORF表达载体，发现sORF编码产物能明显调控肿瘤细胞内HNF4A表达水平，且影响多种肿瘤细胞的生物学活性。为进一步明确sORF编码产物对肿瘤发生、发展的调控作用，发现靶向活性治疗肽，人工合成了基于内源性sORF编码序列的活性肽。

基于该研究，本发明提供了一种靶向肿瘤细胞的多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明还提供了上述靶向肿瘤细胞的多肽在抗肿瘤药物研究中的应用。

本发明还提供了一种促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽，其包括肿瘤细胞靶向结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞靶向结构域的N端。

本发明还提供了上述促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽在抗肿瘤药物研究中的应用。

本发明的优点在于，本发明的多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞靶向结构域后，有明显的改变肿瘤增殖、迁移侵袭行为的效应。本发明的多肽可成为筛选靶向性生物治疗肿瘤的活性多肽。

附图说明

图1为用本发明的多肽和对照多肽孵育肿瘤细胞后的荧光显微镜照片；

图2为不同浓度的多肽对SK-N-SH细胞增殖活性影响的统计图；

图3为不同浓度的多肽对PC-3细胞增殖活性影响的统计图；

图4为含有不同浓度多肽的软琼脂培养基培养SK-N-SH细胞10-14天后的培养孔的四甲基偶氮唑蓝染色照片；

图5为Transwell实验的结晶紫染色照片。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.促进肿瘤细胞增殖的多肽的合成

通过固相合成法合成一种促进肿瘤细胞增殖的多肽，其包括一个肿瘤细胞靶向结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞靶向结构域序列如SEQ ID NO:1所示，穿膜结构域序列如SEQ ID NO:2所示，连接于肿瘤细胞靶向结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-MNRSTTRSAPCRPMLGVYYRYKNSLWSII(SEQ ID NO:3)。为了研究方便，我们还在抗肿瘤多肽的C端标记的异硫氰酸荧光素标记FITC。由百意欣多肽(武汉)有限公司外包合成，最终得到纯度为95％以上外源性合成短肽。

2.多肽的细胞定位检测

采用人前列腺癌细胞株PC-3细胞进行实验。将对数期生长的细胞种植在24孔板内的盖玻片上，每孔约8000-12000个细胞。以10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养，并加入10-50μM的多肽，培养12、24和36小时。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。

弃去培养基，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室温固定细胞10-20分钟，弃去多聚甲醛，1×PBS清洗两次，每次5分钟。

加入DAPI溶液200μl/孔，室温染细胞核5-10分钟，1×PBS充分洗涤5次，每次5分钟。纯甘油封片，将盖玻片固定于载玻片上。采用激光共聚焦显微镜检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。

实验结果如图1所示，该多肽在加入细胞培养体系12小时之后，能有效穿透肿瘤细胞膜进入细胞，显示强胞浆及胞核染色，并随着时间的延长穿透入胞量增加，说明该多肽能够有效进入肿瘤细胞的胞浆和胞核内。

3.MTT比色法分析检测该多肽对SK-N-SH和PC-3细胞增殖的影响

分别采用人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、人前列腺癌细胞系PC-3进行了检测。在96孔细胞培养板中，每孔种植5000个细胞培养，每个样品设定10个复孔。过夜后，加入合成活性肽及其对照肽。多肽浓度分别为10、30、50和100μM，观测12、24、36和48小时。

吸弃培养上清，用1×PBS清洗样品孔3次，每次5分钟。再向样品孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)溶液。将培养板静置于37℃，10分钟。取出后轻轻混匀孔内样品。用酶标仪检测570nm吸光度。

实验结果如图2和3所示：与对照肽比较，该合成活性肽能显著促进多种肿瘤细胞的增殖活性，以50μM浓度24小时时较为明显。而对照错序肽并不体现出明显的增强或抑制增殖效应。

4.合成肽对肿瘤细胞软琼脂集落形成的影响

用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

取对数生长期人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，进行活细胞计数。六孔板每孔细胞数控制在300-500个。

将多肽按照50μM浓度加入培养基中，再按1:1比例使1.2％的琼脂糖和2×1640培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入六孔板，冷却凝固，可作底层琼脂置CO₂温箱中备用。

按1:1比例让0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混，以后制备2ml上层胶，再向管中加入0.2ml的细胞悬液，充分混匀，注入底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃、5％CO₂温箱中培养10-14天，待肉眼可见形成细胞集落为止。

向培养完成的六孔板中加入0.5％MTT溶液，4℃染色2-3小时，取出观察照相。显微镜下计数细胞集落形成数目。

实验结果如图4所示：与对照肽比较，浓度50μM的合成活性肽能显著促进肿瘤细胞的软琼脂集落形成

5.检测合成肽对肿瘤细胞迁移活性的影响

在24孔培养板中放置Transwell小室(购自Corning公司，货号：3422)，向底层加入含15％胎牛血清的完全培养基，并向培养基中加入不同浓度的合成肽以及对照肽。

用无血清培养基制备单细胞悬液，以200μl无血清培养基向Transwell上室中加入人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞悬液，约1-2×10⁴个细胞。并向上室内加入与下室相同浓度的合成肽。

37℃、5％CO₂条件下培养24小时。取出小室放入4％多聚甲醛中固定10-20分钟，再放入0.5％结晶紫染色液中染色1小时。

用含5％乙醇的双蒸水清洗小室，用棉签轻轻去除上室中未穿过多孔膜的细胞，在倒置显微镜下对多孔膜进行照相计数。

实验结果如图5所示：与对照肽比较，浓度50μM的合成活性肽能显著促进肿瘤细胞迁移能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种可杀伤肿瘤细胞的多肽及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Arg Ser Thr Thr Arg Ser Ala Pro Cys Arg Pro Met Leu Gly

1 5 10 15

Val Tyr Tyr Arg Tyr Lys Asn Ser Leu Trp Ser Ile Ile

20 25

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Asn Arg Ser Thr

1 5 10 15

Thr Arg Ser Ala Pro Cys Arg Pro Met Leu Gly Val Tyr Tyr Arg Tyr

20 25 30

Lys Asn Ser Leu Trp Ser Ile Ile

35 40

Claims

1.一种靶向肿瘤细胞的多肽在制备促进肿瘤细胞增殖和/或迁移试剂中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述肿瘤为人神经母细胞瘤或前列腺癌。

2.一种促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞靶向结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞靶向结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求2或3所述的促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞靶向结构域的N端。

5.权利要求2-4中任一项所述的促进肿瘤细胞增殖和/或迁移的多肽在制备促进肿瘤细胞增殖和/或迁移试剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为人神经母细胞瘤或前列腺癌。