CN114478706B - 用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用 - Google Patents

用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该氨基酸呈纤维网状结构，能够用于细胞的三维培养构建类器官；本发明还公开了利用该多肽培养肺类器官或/和肺癌类器官的方法，本发明的方法可以加快肺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率。

Description

用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及用于三维培养纤维网状结构多肽，还涉及该肽在细胞三维培养中的应用。
背景技术
不适当的再生与包括肺癌在内的肺部疾病有关。肺癌是世界范围内的主要死亡原因之一，每年有近200万例新确诊病例。对于成功的治疗干预来说，诊断往往为时已晚。肺癌在个体之间表现出明显的表型和遗传异质性，这使得在动物身上建模很困难。类器官来源于肺上皮内的局部干/祖细胞，由于其在癌症治疗中的巨大潜力，在研究和临床中都引起了广泛的兴趣。各种肺癌类器官已被建立，以再现原发肺肿瘤的组织结构，并在体外长期扩张过程中维持原发肿瘤的基因组改变。
类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补，是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵监测信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。
类器官在抗肿瘤药物筛选领域表现出了巨大的潜力，药物的筛选测试展示了药物对类器官最直观的表现，高度模拟了药物对器官的效果。因此，亟需一种可以加快肺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率的培养方法，为肺癌类器官的培养提供了多样性。
多肽因其结构简单、可调、功能多样、成本较低等优点,在生物纳米技术领域备受关注。基于短肽自组装构建的纳米材料具有简单的制备工序、良好的生物相容性、较大的比表面积、易于修饰改造、较深的组织渗透性以及较高的生物活性等优势,已经成为生物催化、药物/基因控制释放、功能材料以及临床治疗等领域的热点研究对象。因此，合理设计短肽分子结构以及给予特定的环境刺激,能够多重非共价键相互作用自发的组织或聚集为具有特异形态和功能的纳米结构，可用于类器官三维培养对类器官培养具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于三维培养纤维网状结构多肽；本发明的目的之二在于提供所述多肽在用于细胞三维培养中的应用；本发明的目的之三在于提供所述多肽建立肺癌类器官的方法；本发明的目的之四在于提供建立肺癌类器官的培养基；本发明的目的之五在于提供所述培养基在肺癌类器官筛选抗肺癌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、用于三维培养纤维网状结构多肽，所述多肽的氨基酸序列为Arg Gln Glu ThrArg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr。
2、所述多肽在用于细胞三维培养中的应用。
优选的，所述细胞为正常组织细胞或癌细胞。
3、基于所述多肽建立肺癌类器官的方法，包括以下步骤：
（1）将获得的肺癌组织制备成单细胞悬液；
（2）将步骤（1）制备的单细胞悬液加入权利要求1所述多肽重悬，然后接种于培养装置中，加入所述的培养基，培养箱中扩大培养。
本发明中，步骤（1）中，所述肺癌组织来源于哺乳动物。
本发明中，步骤（1）中，所述肺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
本发明中，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、rh-EGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
本发明中，所述培养基组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3 100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、rh-EGF 1-10ng/ml、Noggin50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-27632 1-10μM、SB202190 100-1000ng、B27 10ng/ml、N -乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10%、青霉素/链霉素双抗体积分数1%。
4、一种建立肺癌类器官的培养基，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、rh-EGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N -乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
5、所述培养基在肺癌类器官筛选抗肺癌药物中的应用，优选的，所述药物包含化疗药物、放疗药物或/和靶向药物。
本发明的有益效果在于：本发明公开了用于三维培养纤维网状结构多肽，该多肽成纤维网状结构，能够用于三维细胞培养，用于培养肺癌细胞配合本发明的培养基第2天可形成类器官，培养至14天最大能达到900μm，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率，并且培养的类器官可以用于药物筛选，对肺癌的精准用药提供指导。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为多肽的投射显微镜图；
图2为配方1-3的培养基培养肺癌类器官14天生长形态图（标尺20μm）；
图3为配方1-3的培养基培养肺癌类器官培养14天的生长曲线图；
图4为配方1-3的培养基培养肺癌类器官和肺癌组织的第14天HE染色图（标尺50μm）；
图5为肺癌类器官筛选抗肿瘤药物的CCK-8肿瘤抑制率图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例中涉及的培养基组分雌二醇（β-estradiol），购自Sigma公司、氢化可的松（hydrocortisone），购自Sigma公司、R-Spondin 3，购自R&D公司；Neuregulin 1，购自Peprotech公司；rh-EGF，购自Peprotech公司；Noggin，购自Peprotech公司；A83-01，购自Tocris公司；Wnt3a，购自Gibco公司；Y-27632，购自Abmole公司；SB202190，购自Sigma公司；B27，购自Gibco公司；N-Acetylcysteine，购自Gibco公司；Nicotinamide，购自Sigma公司；GlutaMax，购自Sigma公司；FBS，购自Gibco公司；Penicillin/Streptomycin，购自Gibco公司；DMEM/F12，购自Gibco公司。
实施例1、多肽的制备
多肽的制备方法，具体步骤如下：
1）称取氨基树脂3 g（取代度0.3 mmol/g）于150 ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷（DCM）浸泡1h溶胀树脂；
2）用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干液体，洗涤四次，将抽干树脂待用；
3）向反应器中加入50ml的20%哌啶（哌啶/DMF），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc基团；脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤2次，3倍树脂体积的甲醇洗涤2次，3倍树脂体积的DMF洗涤2次，抽干树脂；
4）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
5）称取一定量的C端第一个天冬氨酸D和3倍摩尔量的1-羟基-苯骈三唑（HOBT）于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，活化氨基酸，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中震荡反应。
6）2小时后，抽干反应溶液，DMF洗涤两遍，用一定量的醋酸酐封头（醋酸酐 ：DIEA:DCM=1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7）向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去氨基酸上的Fmoc基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤2次，3倍树脂体积的甲醇洗涤2次，3倍树脂体积的DMF洗涤2次，抽干树脂。
8）取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。
9）称取后面一个谷氨酸和HOBT于50ml离心管,加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，活化氨基酸，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中震荡反应 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，需重投氨基酸再次反应。
10）待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤2次，3倍树脂体积的甲醇洗涤2次，3倍树脂体积的DMF洗涤2次，抽干树脂，取少量树脂用茚三酮法检测是否脱去Fmoc基团。
11）按照步骤9-11依次接上后面的氨基酸；
12）待接完最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇洗涤4遍，然后将树脂抽干。然后用95切割液（三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水=95:2:2:1）将多肽从树脂上切割下来（每克树脂加10ml切割液），并用冰乙醚（切割液：乙醚=1:9）离心沉降，并用乙醚洗涤离心3次，冷冻干燥粗品，最后用HPLC分离纯化，冻干纯品，得到一定纯度的多肽粉末，具体序列如下：Arg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr ArgGln Glu Thr；
13)最后用HPLC分离纯化，再冻干。使用时将多肽溶于PBS中形成多肽溶液，浓度大于10mg/ml。
经制得的多肽用原子力显微镜观察，结果如图1所示。结果显示，制得的多肽成纤维网状结构，表明具有三维细胞培养的潜力。
实施例2、建立肺类器官培养基
按下述浓度将各组分加入到DMEM/F12培养基中，得到用于培养肺癌类器官的培养基：
配方1：雌二醇100nM，氢化可的松50μg/ml、R-Spondin 3（250ng/ml）、Neuregulin1(5nM)、rh-EGF(5ng/ml)、Noggin(100ng/ml)、A83-01(TGF-βI型受体抑制剂，500nM)、Wnt3a(5nM)、Y-27632（蛋白激酶p160ROCK抑制剂，5μM）、SB202190（p38 MAPK抑制剂，500ng）、B27(10ng/ml)、N -乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，5nM)、烟酰胺（Nicotinamide，10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10%)、青链霉素（Penicillin/Streptomycin，1%)。
配方2：雌二醇10nM，氢化可的松0.1μg/ml、R-Spondin 3（100ng/ml）、Neuregulin1(1nM)、rh-EGF(1ng/ml)、Noggin(50ng/ml)、A83-01(100nM)、Wnt3a (1nM)、Y-27632(1μM)、SB202190(100ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine（1nM)、Nicotinamide（1nM)、GlutaMax添加剂(1nM)、FBS（10%)、Penicillin/Streptomycin（1%)。
配方3：雌二醇1000nM，氢化可的松100μg/ml、R-Spondin 3（500ng/ml）、Neuregulin 1(10nM)、rh-EGF(10ng/ml)、Noggin(500ng/ml)、A83-01(1000nM)、Wnt3a(5nM)、Y-27632(10μM)、SB202190(1000ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine（5nM)、Nicotinamide（10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、FBS（10%)、Penicillin/Streptomycin（1%)。
实施例3、建立肺癌类器官的方法
使用实施例2的培养基建立肺癌类器官的方法，具体操作步骤如下：
1）肺癌组织的获取
采集后将获得的肺癌组织/肺组织采用50ml的DMEM/F12+FBS（10%）+Penicillin/Streptomycin(1%)进行浸泡。
2）肺癌类器官的培养
（1）将得到的肺癌组织浸泡于1%的Penicillin/Streptomycin(青链霉素)中1h，将浸泡的肺癌样本取出，用一次性手术刀将细胞剪碎，剪碎的组织大约为1cm×1cm；用碾磨棒将1cm×1cm的肺癌手术样本碾碎，制备成为单细胞悬液；
（2）将单细胞悬液吸出，用200目的细胞滤网过滤2-3次，将多余的残留组织去除，加入PBS清洗3次，再加入多肽（10mg/ml）重悬细胞，接种于6孔板中；在六孔板中加入培养基A培养细胞，放置于37℃的培养箱中，每三天更换一次培养基，观察细胞的形态，光学显微镜下拍照记录，培养至14天。
使用配方1~3的培养基A培养1天，3天，5天，7天，10天和14天的结果如图2所示。类器官体积和细胞数量统计结果如图3所示，结果显示，培养过程中细胞逐渐增多，培养至第2天可形成类器官，培养至第4天类器官细胞数量快速增加，至7天呈对数增长；同时培养过程中类器官逐渐变大，培养至14天最大能达到900μm。
实施例5、肺癌类器官HE染色
将生长状态良好的类器官放入离心管内，200g转速离心10min，弃置部分上清液，在离心管内加入2ml蛋清，轻摇混匀，在蛋清液中悬浮细胞团，再加入5倍蛋清混合液体积的80%酒精，混匀，200 g转速离心10min，去除上清液，加入体积分数10%甲醛固定3h。
使用体积分数4%多聚甲醛溶液浸泡组织样本，48h后采用石蜡包埋并切片。
HE染色步骤如下：二甲苯（Ⅰ）15min；二甲苯（Ⅱ）15min；无水乙醇（Ⅰ）5min；无水乙醇（Ⅱ）5min；95%乙醇3min；80%乙醇2min；70%乙醇2min；蒸馏水5min；苏木精染色液6min；自来水冲洗1min；1%盐酸乙醇1-2s；自来水冲洗10-30s；0.2%氨水返蓝6min；自来水冲洗10-30s；0.5%伊红染色液1-3min；蒸馏水冲洗1-2s；70%乙醇1min；80%乙醇1min；95%乙醇2min；无水乙醇（Ⅰ）3min；二甲苯（Ⅰ）10min；二甲苯（Ⅱ）10min。结果如图4所示。结果显示，肺癌类器官形成细胞团，且与肺癌细胞具有高度的形态一致性。
实施例6、肺癌类器官评估药物效果的CCK-8毒性实验
1）制作标准曲线（用于测定细胞具体数量）
（1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
（2）按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
（3）接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量，使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。
2）细胞活性检测
（1）在96孔板中接种细胞悬液100 μL/孔，将培养板放在培养箱中37℃，5% CO2预培养一段时间。
（2）向每孔加入10 μL CCK-8溶液，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
（3）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（4）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（5）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3）细胞增殖-毒性检测
（1）在第七天，加入消化酶消化Matrigel，在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱37℃，5% CO2预培养24小时。
（2）向培养板加入10 μL不同浓度的化疗药物和靶向药物，包括但不限于5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨。
（3）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
（4）向每孔加入10 μL CCK-8溶液，注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
（5）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（6）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（7）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
（8）最终计算出5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、生理盐水对肿瘤类器官的抑制率。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可，结果如图5所示。相比较于生理盐水，5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨对肺癌类器官都有一定的抑制率，且顺铂对肿瘤类器官的抑制率最高，高达78%。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.用于三维培养纤维网状结构多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如为Arg GlnGlu Thr Arg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr Arg Gln Glu Thr。
2.权利要求1所述多肽在用于肺癌细胞三维培养中的应用。
3.基于权利要求1所述多肽建立肺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将获得的肺癌组织制备成单细胞悬液；
将步骤（1）制备的单细胞悬液加入权利要求1所述多肽重悬，然后接种于培养装置中，加入培养基，培养箱中扩大培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述肺癌组织来源于哺乳动物。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述肺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、rh-EGF、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N -乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养基组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3 100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、rh-EGF 1-10ng/ml、Noggin 50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-27632 1-10μM、SB202190 100-1000ng/ml、B27 10ng/ml、N -乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10%、青霉素/链霉素双抗体积分数1%。
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