JP5720980B2 - クッパー細胞の効率的増殖方法およびその利用 - Google Patents
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Description
(1) 哺乳動物の肝臓に由来し、少なくとも肝実質細胞とクッパー細胞とを含む細胞集団を初代培養することを特徴とする、クッパー細胞の増殖方法。
(2) 細胞集団が肝実質細胞画分である、(1)に記載の増殖方法。
(3) 肝実質細胞が実質的に存在しなくなった後も初代培養を継続する、(1)または(2)のいずれかに記載の増殖方法。
(4) 5日以上、初代培養を行う、(1)から(3)のいずれかに記載の増殖方法。
(5) クッパー細胞の増殖が停止するまでの任意の期間初代培養を行う、(1)から(4)のいずれかに記載の増殖方法。
(6) 初代培養を行っている培養器を振とうし、振とうにより培養液中に浮遊してくるクッパー細胞を回収し、回収したクッパー細胞からプラスチック容器に付着性のクッパー細胞を選抜し回収した場合において、回収したクッパー細胞の純度が90%以上になる期間、初代培養を行う、(1)から(5)のいずれかに記載の増殖方法。
(7) 被検化合物がクッパー細胞の増殖に影響を与えるか否かを評価する方法であって、
(a)培養液中に被検化合物が存在する条件下で、(1)から(6)のいずれかに記載の増殖方法を実施する工程、および
(b)クッパー細胞の増殖を検出する工程、を含む方法。
(8) クッパー細胞の製造方法であって、
(a)(1)から(6)のいずれかに記載の増殖方法を実施する工程、および
(b)増殖したクッパー細胞を回収する工程、を含む方法。
(9) クッパー細胞の製造方法であって、初代培養を行っている培養器を振とうし、振とうにより培養液中に浮遊してくるクッパー細胞を回収することにより、工程(b)におけるクッパー細胞の回収を行う、(8)に記載の方法。
(10) クッパー細胞の製造方法であって、さらに、回収したクッパー細胞からプラスチック容器に付着性の細胞を選抜し回収する工程を含む、(8)または(9)に記載の方法。
(11) クッパー細胞の製造方法であって、クッパー細胞が増殖した後にクッパー細胞の回収を行う、(8)から(10)のいずれかに記載の方法。
(12) クッパー細胞の製造方法であって、初代培養開始後5日目以降にクッパー細胞の回収を行う、(8)から(11)のいずれかに記載の方法。
(13) クッパー細胞の製造方法であって、クッパー細胞が増殖した後クッパー細胞の増殖が停止するまでの間またはクッパー細胞の増殖が停止した後にクッパー細胞の回収を行う、(8)から(12)のいずれかに記載の方法。
(14) クッパー細胞の製造方法であって、初代培養開始後5日目から20日目の間に、クッパー細胞の回収を行う、(8)から(13)のいずれかに記載の方法。
(15) 不死化されたクッパー細胞の製造方法であって、
(a)(8)から(14)のいずれかに記載の方法によりクッパー細胞を製造する工程、および
(b)製造されたクッパー細胞に対して、不死化処理を行う工程、を含む方法。
(16) 被検化合物がクッパー細胞の生物学的活性に影響を与えるか否かを評価する方法であって、
(a)(8)から(15)のいずれかに記載の方法によりクッパー細胞を製造する工程、
(b)製造されたクッパー細胞に被検化合物を接触させる工程、および
(c)クッパー細胞の生物学的活性を検出する工程、を含む方法。
(17) 肝臓に所望の薬物を送達させるためのDDS製剤の製造方法であって、
(a)(8)から(15)のいずれかに記載の方法によりクッパー細胞を製造する工程、および
(b)製造されたクッパー細胞に、肝臓に送達させたい所望の薬物を保持させる工程、を含む方法。
本発明は、哺乳動物の肝臓に由来する肝実質細胞とクッパー細胞とを含む細胞集団の初代培養において、クッパー細胞を効率的に増殖させるための混合培養系を確立することが可能であるという本発明者らの知見に基づく。従って、本発明は、哺乳動物の肝臓に由来し、少なくとも肝実質細胞とクッパー細胞とを含む細胞集団を初代培養することを特徴とする、クッパー細胞の効率的増殖方法を提供する。
本発明のクッパー細胞の増殖方法を被検化合物の存在下において実施することにより、当該被検化合物がクッパー細胞の増殖に影響を与えるか否かを評価することができる。従って、本発明は、被検化合物がクッパー細胞の増殖に影響を与えるか否かを評価する方法であって、培養液中に被検化合物が存在する条件下で、上記本発明のクッパー細胞の増殖方法を実施する工程、および、クッパー細胞の増殖を検出する工程、を含む方法を提供する。
本発明は、また、上記本発明のクッパー細胞の増殖方法を利用して、クッパー細胞を効率的に製造する方法を提供する。従って、本発明のクッパー細胞の製造方法は、上記本発明の増殖方法を実施する工程、および、増殖したクッパー細胞を回収する工程、を含む。
上記本発明のクッパー細胞の製造方法により回収したクッパー細胞(例えば、約3x106個/mlの密度)を細胞凍結保存液に懸濁したのち、凍結用バイアルに分注し、フリーザー内(例えば、−80℃)で凍結する。その後、液体窒素中に移し、長期間(例えば、約2年間)凍結保存することができる。融解時はバイアルを温水(例えば、37℃)に浸して急速に解凍することにより、凍結保存前と同様の状態にてクッパー細胞を使用することができる。
こうして製造したクッパー細胞は、不死化処理を行うことにより継続的に増殖させることが可能である。従って、本発明は、不死化されたクッパー細胞の製造方法であって、上記本発明のクッパー細胞の製造方法によりクッパー細胞を製造する工程、および、製造されたクッパー細胞に対して不死化処理を行う工程、を含む方法を提供する。
上記した本発明のクッパー細胞の製造方法により製造されたクッパー細胞を利用すれば、被検化合物がクッパー細胞の生物学的活性に影響を与えるか否かの評価を行うことができる。従って、本発明は、被検化合物がクッパー細胞の生物学的活性に影響を与えるか否かを評価する方法であって、上記本発明のクッパー細胞の製造方法によりクッパー細胞を製造する工程、製造されたクッパー細胞に被検化合物を接触させる工程、および、クッパー細胞の生物学的活性を検出する工程、を含む方法を提供する。
また、薬物療法の一つとして、薬物を輸送担体(キャリアー)に保持させて、必要な薬物を必要な時間に必要な部位に送達するためのドラッグデリバリーシステム(DDS)の研究開発が世界中で活発に行われているが、クッパー細胞は肝臓組織への移行性が知られていることから(非特許文献9)、本発明の方法により製造したクッパー細胞は、肝臓に所望の薬物を送達させるためのDDS製剤の製造に用いることが可能である。従って、本発明は、肝臓に所望の薬物を送達させるためのDDS製剤の製造方法であって、上記本発明のクッパー細胞の製造方法により、DDS製剤のキャリアーとしてのクッパー細胞を製造する工程、および、製造されたクッパー細胞に、肝臓に送達させたい所望の薬物を保持させる工程、を含む方法を提供する。
公知文献(非特許文献4)に記載された方法と同様にして、成体雄SDラット(10〜15週齢)の肝臓をコラゲナーゼ溶液で灌流し、消化した肝組織を摘出した。
ガラス製8穴チャンバースライド(BD Falcon 354118)(以下においては、特に記載しない限り同様の材質、大きさ、形状のチャンバースライドを使用)において、プラスチックディッシュへの付着性により選抜し回収した上記細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、固定液(95%エタノール+1%酢酸)で固定した。固定処理は、4℃で15分間行った。PBSにて固定液を洗浄後、ブロッキング液(10%正常ヤギ血清+1%ウシ血清アルブミン、PBS中)で抗体の非特異的結合部位をマスクした。マスク処理は、室温で15分間行った。希釈した一次抗体(1:200〜1:800)を固定処理した細胞に滴下し、室温で1時間インキュベートした後、PBSで10分間処理することで、8穴チャンバースライドを洗浄した。洗浄操作は、3回繰り返した。次いで、ペルオキシダーゼ標識二次抗体を室温で1時間反応させた後、PBSで10分間処理することにより8穴チャンバースライドを洗浄した。洗浄操作は、3回繰り返した。次いで、DAB発色試薬を滴下し、一次抗体の結合した部位を可視化した後(茶褐色に発色する)、慣用の方法にて標本を作製し、細胞の観察を行った。
ガラス製8穴チャンバースライド(またはプラスチックディッシュ)において、プラスチックディッシュへの付着性により選抜し回収した上記細胞に、FITC蛍光色素標識ラテックスビーズ(直径1μm、Polysciences,Inc.,Warrington,PA、培地中に1:800で希釈)を与え、37℃で1〜4時間培養後に、PBSで洗浄し、上記免疫染色の場合と同様の手法で細胞を固定した。次いで、DAPI色素(核染色用)を含む封入剤で封入し、蛍光顕微鏡で観察した。また、フローサイトメーターを用いて、FITC蛍光色素標識ラテックスビーズの取り込み(貪食)を定量的に解析した。
プラスチックディッシュへの付着性により選抜し回収した上記細胞を5000細胞/100μl/ウェルで96穴組織培養プレート(BD Falcon 353072)に播種し、各種組み換え型サイトカインを最終濃度3〜25ng/mlで添加した。4〜5日間培養後、各ウェルに細胞増殖アッセイ試薬であるWST-1を10μl/ウェルで添加し、37℃で2〜4時間反応させた。その後、440nmにおける吸光度を測定した。
プラスチックディッシュへの付着性により選抜し回収した上記細胞をプラスチックディッシュへ106細胞/60mmディッシュで播種した。培地を10μg/mlのLPSを添加した培地(約5ml)に交換し、炭酸ガス培養器に戻した。約30時間後に培養上清を回収し、ミリポアフィルター(ポアサイズ0.45μm)で濾過したのち、少量ずつ分注し、-80℃にて保管した。ラットサイトカイン測定用ELISAキット(Biosource社)を用いて、培養上清中の各種サイトカイン濃度を定量した。
上記ラットのクッパー細胞の場合と同様の製造方法にて、子ウシの肝臓より肝実質細胞を分離し、5x106細胞を組織培養フラスコ(底面積75cm2)へ播種し、初代培養した。この初代培養において、肝実質細胞は1週間目〜10日目で実質的に存在しなくなり、8日目〜2週間目において、繊維芽細胞様細胞の層が形成され、その層の上に、球形のマクロファージ様細胞が活発に増殖した(図8)。即ち、初代培養開始後、8日目〜2週間目に、組織培養フラスコにおいて、線維芽細胞様細胞とマクロファージ様細胞からなる混合培養系が形成された。
上記ラットと同様の手法により、C57BL/6マウス(オスで7週齢)から肝実質細胞分画を得て、組織培養フラスコ(底面積25cm2)に播種した。上記ラットと同様の培地を使用した。この初代培養において、肝実質細胞は5日目〜7日目で実質的に存在しなくなり、7日目〜14日目において、繊維芽細胞様細胞の層が形成され、その層の上に、球形のマクロファージ様細胞が活発に増殖した(図14)。
Claims (15)
- 哺乳動物の肝臓由来の細胞を遠心して沈降物として得られた肝実質細胞画分を初代培養し、肝実質細胞が実質的に存在しなくなった後も初代培養を継続することを特徴とする、クッパー細胞の増殖方法。
- 5日以上、初代培養を行う、請求項1に記載の増殖方法。
- クッパー細胞の増殖が停止するまでの任意の期間初代培養を行う、請求項1または2に記載の増殖方法。
- 初代培養を行っている培養器を振とうし、振とうにより培養液中に浮遊してくるクッパー細胞を回収し、回収したクッパー細胞からプラスチック容器に付着性のクッパー細胞を選抜し回収した場合において、選抜したクッパー細胞の純度が90%以上になる期間、初代培養を行う、請求項1から3のいずれかに記載の増殖方法。
- 被検化合物がクッパー細胞の増殖に影響を与えるか否かを評価する方法であって、
(a)培養液中に被検化合物が存在する条件下で、請求項1から4のいずれかに記載の増殖方法を実施する工程、および
(b)クッパー細胞の増殖を検出する工程、を含む方法。 - クッパー細胞の製造方法であって、
(a)請求項1から4のいずれかに記載の増殖方法を実施する工程、および
(b)増殖したクッパー細胞を回収する工程、を含む方法。 - クッパー細胞の製造方法であって、初代培養を行っている培養器を振とうし、振とうにより培養液中に浮遊してくるクッパー細胞を回収することにより、工程(b)におけるクッパー細胞の回収を行う、請求項6に記載の方法。
- クッパー細胞の製造方法であって、さらに、回収したクッパー細胞からプラスチック容器に付着性の細胞を選抜し回収する工程を含む、請求項6または7に記載の方法。
- クッパー細胞の製造方法であって、クッパー細胞が増殖した後にクッパー細胞の回収を行う、請求項6から8のいずれかに記載の方法。
- クッパー細胞の製造方法であって、初代培養開始後5日目以降にクッパー細胞の回収を行う、請求項6から9のいずれかに記載の方法。
- クッパー細胞の製造方法であって、クッパー細胞が増殖した後クッパー細胞の増殖が停止するまでの間またはクッパー細胞の増殖が停止した後にクッパー細胞の回収を行う、請求項6から10のいずれかに記載の方法。
- クッパー細胞の製造方法であって、初代培養開始後5日目から20日目の間に、クッパー細胞の回収を行う、請求項6から11のいずれかに記載の方法。
- 不死化されたクッパー細胞の製造方法であって、
(a)請求項6から12のいずれかに記載の方法によりクッパー細胞を製造する工程、および
(b)製造されたクッパー細胞に対して、不死化処理を行う工程、を含む方法。 - 被検化合物がクッパー細胞の生物学的活性に影響を与えるか否かを評価する方法であって、
(a)請求項6から13のいずれかに記載の方法によりクッパー細胞を製造する工程、
(b)製造されたクッパー細胞に被検化合物を接触させる工程、および
(c)クッパー細胞の生物学的活性を検出する工程、を含む方法。 - 肝臓に所望の薬物を送達させるためのDDS製剤の製造方法であって、
(a)請求項6から13のいずれかに記載の方法により、DDS製剤のキャリアーとしてのクッパー細胞を製造する工程、および
(b)製造されたクッパー細胞に、肝臓に送達させたい所望の薬物を保持させる工程、を含む方法。
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