CN105586306A - 一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离纯化细胞的方法，尤其涉及一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，属于医学技术领域。本发明首次通过小鼠肝脏机械循环灌注和免疫磁珠成功分离了肝脏枯否细胞，该方法获得的枯否细胞纯度高、活性好、操作简单、可推广性强，且具有特定的F4/80⁺CD11c^-表型，具有更强的巨噬细胞特征。该细胞分选技术的成功建立，为枯否细胞的进一步功能研究提供了一种新的实验方法。

Description

一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化细胞的方法，尤其涉及一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，属于医学技术领域。

背景技术

肝脏的免疫应答反应与肝癌、肝炎病毒感染和慢性肝病肝损伤等多种肝脏疾病相关，已经得到越来越多的关注和研究。巨噬细胞是人体重要的免疫细胞，且肝内的枯否细胞对于肝脏本身和全身的免疫应答都极为重要。肝脏枯否细胞约占肝脏总细胞的15％，全身巨噬细胞的50％，主要位于肝窦壁，是肠源性病原体在肝内首先接触的细胞，是肝内重要的固有免疫细胞之一，参与固有免疫反应，还能通过分泌促炎因子和趋化因子，影响其他免疫细胞，如T细胞、中性粒细胞等的活化和肝内的聚集，参与影响固有免疫和先天免疫的交互影响，产生进一步的免疫应答。对枯否细胞的进一步深入的研究，首先必须建立一种高效的细胞分离纯化方法。1977年首次通过实验分离出鼠类肝脏枯否细胞，上世纪90年代通过密度梯度离心获得了较高纯度和活性的鼠肝脏枯否细胞，本世纪初Valatas等人又根据枯否细胞贴壁的特性，对分离纯化方法作了进一步改进，通过肝脏组织消化处理、密度梯度离心、密度梯度离心和贴壁选择四步法，使枯否细胞纯度达95％左右，细胞得率达80-100×10⁶个/肝。但是，密度梯度法设备昂贵复杂，在未具备条件的实验室难以开展，耗时长，且无法得到所需特定表型的枯否细胞。综上所述，机械灌注和密度梯度离心法，虽然可以获得较高纯度和活性的枯否细胞，但存在以下缺点：一，密度梯度离心法设备较为昂贵，一些实验室不能够满足实验条件；二，分选时间较长，对细胞活性及后续实验可能存在影响；三，操作较为复杂，技术掌握较为困难。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，满足实验条件，操作简单，耗时短的同时获得高纯度的肝脏枯否细胞。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，包括在无菌条件下进行以下步骤：

第一步、建立肝脏机械灌注系统，在离体的肝脏、门静脉、肝下下腔静脉及行门静脉置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心房行上腔静脉置管并固定，结扎肝下下腔静脉后，分别将门静脉置管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路；

第二步、获得细胞，利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝脏灌注消化，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细胞悬液经200目滤网滤过，转至离心管后置于旋转摇荡器，37℃、140rpm震荡10分钟，50G离心1分钟后取上清，再150G离心8分钟弃上清，即得富含肝非实质性细胞悬液；

第三步、免疫磁珠三标两步法分离F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞，先进行阴选，根据细胞计数结果，加入相应剂量CD11bFITC，CD11cPE抗体，4℃15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti-PEMicrobeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃15分钟，LS分选柱行阴选，收集过磁柱后的细胞悬液；再进行阳选，根据阴选后细胞悬液细胞数量，加入相应剂量的F4/80APC抗体，4℃15分钟，PBS洗涤一次，加入Anti-APCMicrobeads，4℃15分钟，MS分选柱行阳选，收集磁柱中的细胞，即为F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞；

第四步、纯度检测，取肝脏机械循环灌注后10⁵级细胞重悬于100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流式抗体，4℃避光孵育30-45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检测细胞表型和纯度。

上述方法的所述第二步中，消化的条件为EMEM4ml/min*10min，0.45％Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。离心管内含有10μg/ml、40ml的DNase。

免疫磁珠分选是一种新型细胞分选技术。磁珠结合细胞表面抗原的特异性标记后通过阴选或阳选获得目标细胞，该方法获得的目的细胞具有操作简易、耗时短、纯度高、细胞活性损伤小等优点。然而，枯否细胞的表面分子标记较为复杂，无公认的特异性标记，因此尚无磁珠分选枯否细胞的相关报道。F4/80是小鼠单核巨噬细胞的表面标记物之一，主要表达于树突状细胞，枯否细胞和多形核白细胞，具有F4/80⁺表型的枯否细胞拥有更强的吞噬能力和活性氧生成能力。CD11c常作为树突状细胞特异性表面分子标记之一并与巨噬细胞激活相关。本发明首次通过肝脏机械循环灌注结合免疫磁珠三标两步法获得了纯度高、活性好的F4/80⁺CD11c^-枯否细胞。建立了一种能够分离纯化具有F4/80⁺CD11c^-表型的枯否细胞的方法。按照本发明的方法所分选出的F4/80⁺CD11c^-枯否细胞亚群，亦有更高的内吞活性及氧自由基生成能力，更低的IL-10，IL-12p40和TNF分泌，更为符合机体处于免疫稳态时枯否细胞的功能状态，而这是传统的密度梯度离心法和贴壁法所无法完成的。另外，本发明采用的肝脏机械循环灌注，其优势如下：1，灌注速度由机器控制，避免人为操作不当压力过大导致灌注液漏出或肝脏撕裂而致实验失败；2，灌注液循环使用，减少灌注液用量，降低了实验成本；3，密闭系统，整套灌注系统处于密闭环路中，最大可能减少了污染机会；4，减少了人为操作步骤和实验工作量。本发明首次通过小鼠肝脏机械循环灌注和免疫磁珠三标两步法成功分离了肝脏枯否细胞，该方法获得的枯否细胞纯度高、活性好、操作简单、可推广性强，且具有特定的F4/80⁺CD11c^-表型，具有更强的巨噬细胞特征。该细胞分选技术的成功建立，为枯否细胞的进一步功能研究提供了一种新的实验方法。

附图说明

图1为肝脏机械灌注系统示意图。

图2为磁珠分选法和梯度离心法结果对比图。

图3为分离后的Kupffer细胞图。

图4为本发明的流程示意图。

具体实施方式

实施例

实验材料

1.1小鼠选择

从南京医科大学动物实验中心获得C57BL/6小鼠。

1.2所需试剂和实验器材

DMEM/Ham’sF-121:11×培养基(Hyclonecat#SH30023.01)、Pronase(BoehringerMannheimcat#1459643)、Collagenase(typeIV,sigmacat#C3155)、DNase(sigmacat#:D4527)、CD11cPE流式抗体(MiltenyiBiotecOrderNO130-097-982)、Anti-PEMicrobeads磁珠(MiltenyiBiotecMat120-000-294)、Anti-FITCMicrobeads磁珠(MiltenyiBiotecMat120-000-742)、F4/80APC流式抗体(MiltenyiBiotecOrderNO130-099-435)、Anti-APCMicrobeads(MiltenyiBiotecOrderNO130-048-801)、培养基(RPMI1640,10％FBS,100mg/mlstreptomycin,10000U/mlpenicilin,Gibco)、Peristalticpump(Masterflex)、Shaker震荡仪(GuohuaTHZ-82)、LS/MScolumn磁柱(MiltenyiBiotec)、MidiMACS(MACS)、Flowcytometer流式细胞仪(BD)、细胞培养箱(Thermo)、显微镜(ZeissAxiovert)。

2方法

2.1肝脏机械灌注系统的建立

5％水合氯醛腹腔注射成功麻醉小鼠，开腹后分别游离肝脏、门静脉和肝下下腔静脉，行门静脉置管并固定，注入0.1ml肝素(40U/ml)。开胸，经右心房行上腔静脉置管并固定。结扎肝下下腔静脉后，分别将门静脉置管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路，成功建立肝脏机械循环灌注系统(图1)。图中，A机械灌注系统示意图B试剂消耗量对比C获得总细胞对比

2.2肝脏机械循环灌注消化和肝非实质细胞的获得

利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝脏灌注消化(EMEM4ml/min*10min，0.45％Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min)，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细胞悬液经200目滤网滤过，小心转至含DNase(10μg/ml，40ml)的离心管后置于旋转摇荡器，37℃、140rpm震荡10分钟。50G离心1分钟后取上清，再150G离心8分钟弃上清，即得富含肝非实质性细胞悬液。

2.3免疫磁珠三标两步法分离F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞

阴选：根据细胞计数结果，加入相应剂量CD11bFITC，CD11cPE抗体，4℃15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti-PEMicrobeads和Anti-FITCMicrobeads磁珠，4℃15分钟，LS分选柱行阴选(根据细胞数选择)，收集过磁柱后的细胞悬液。

阳选：根据阴选后细胞悬液细胞数量，加入相应剂量的F4/80APC抗体，4℃15分钟，PBS洗涤一次，加入Anti-APCMicrobeads磁珠，4℃15分钟，MS分选柱行阳选(根据细胞数选择)，收集磁柱中的细胞，即为F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞。

2.4细胞表型和纯度检测

取肝脏机械循环灌注后细胞(10^5级)重悬于100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流式抗体，4℃避光孵育30-45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检测细胞表型(图2)。图中，A操作时间对比B获得细胞量对比C纯度对比。

同法行经上述免疫磁珠分选法得到的F4/80+CD11b-CD11c-枯否细胞的纯度检测。

2.5细胞培养及镜下观察

将按上述方法分得的细胞体外常规培养，每天显微镜下观察细胞状态，通过磁珠分选方法获得的细胞具有KC细胞的正常形态和吞噬功能(图3)。图中，A新分选出的细胞形态B培养3天后显示出Kupffer细胞形态特征C墨水吞噬实验。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种分离纯化肝脏枯否细胞的方法，包括在无菌条件下，进行以下步骤：

第一步、建立肝脏机械灌注系统，在离体的肝脏、门静脉、肝下下腔静脉及行门静脉置管并固定，管中注入0.1ml肝素，在右心房行上腔静脉置管并固定，结扎肝下下腔静脉后，分别将门静脉置管和上腔静脉置管连接至机械灌注蠕动泵形成闭合环路；

第二步、获得细胞，利用肝脏机械循环灌注系统，依次行肝脏灌注消化，切取肝脏置于培养皿内，分离去除肝脏包膜，将细胞悬液经200目滤网滤过，转至离心管后置于旋转摇荡器，将实验室水浴震荡器设定至37℃、140rpm，震荡10分钟，而后转入离心机中50G离心1分钟后取上清，再将上清以150G离心8分钟弃上清，即得富含肝非实质性细胞悬液；

第三步、免疫磁珠分离F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞，先进行阴选，根据细胞计数结果，加入5ul/10⁷的CD11bFITC，CD11cPE抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，同时加入Anti-PEMicrobeads和Anti-FITCMicrobeads，4℃孵育15分钟，LS分选柱行阴选，收集过磁柱后的细胞悬液；

再进行阳选，根据阴选后细胞悬液细胞数量，加入5ul/10⁷的F4/80APC抗体，4℃孵育15分钟，PBS洗涤一次，加入Anti-APCMicrobeads，4℃孵育15分钟，MS分选柱行阳选，收集磁柱中的细胞，即为F4/80⁺CD11b^-CD11c^-枯否细胞。

第四步、纯度检测，取肝脏机械循环灌注后10^5级细胞重悬于100微升PBS中，加入CD11bFITC、CD11cPE、F4/80APC流式抗体，4℃避光孵育30-45分钟，PBS洗涤两次，流式细胞仪检测细胞表型和纯度。

2.根据权利要求1所述分离纯化肝脏枯否细胞的方法，其特征是：所述第二步中，消化的条件为EMEM4ml/min*10min，0.45％Pronase4ml/min*15min，0.02％Collagenase4ml/min*8min。

3.根据权利要求1所述分离纯化肝脏枯否细胞的方法，其特征是：所述第二步中，离心管内含有10μg/ml、40ml的DNase。