CN110734492A - 抗f4/80的多克隆抗体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种抗F4/80的多克隆抗体及制备方法，其中制备方法为：所述的抗F4/80的多克隆抗体通过F4/80蛋白片段作为抗原免疫获得。本发明的多克隆抗体对巨噬细胞具有显著的免疫荧光染色性能。

Description

抗F4/80的多克隆抗体及制备方法

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，尤其涉及一种抗F4/80的多克隆抗体及制备方法。

背景技术

巨噬细胞是一种具有多种生理功能的免疫细胞，在感染应答、机体免疫、肿瘤、炎性反应等生理病理过程中均具有重要作用。巨噬细胞的这些重要生理作用，使其成为多种疾病治疗的重要靶点细胞，包括抗肿瘤、抗炎性、抗感染等多个方面。

特异的表面标志物是对巨噬细胞进行识别或靶向给药的基础。近年来，有关巨噬细胞表面标志的研究不断取得新的进展，许多在巨噬细胞表面表达的特殊蛋白及多糖类抗原被揭示，有望作为巨噬细胞的靶向标志物。其中，F4/80较受关注的巨噬细胞标志物之一。F4/80是巨噬细胞表面表达的一种特殊糖蛋白，其在肠、肺等部位巨噬细胞中均具有较高的表达。Laroui等[17]在肠炎小鼠模型中，利用F4/80抗体修饰的纳米颗粒携带核酸分子开展了肠巨噬细胞靶向性药物递送研究，显著提高了治疗效果，提示以F4/80作为受体分子在相关疾病的靶向干预研究中具有重要前景。

F4/80蛋白包含931个氨基酸(aa)，其中第645-931aa为7次跨膜和胞内序列，不能作为表面受体，1-644aa为胞外序列，也是一般抗体识别的序列。现有的抗F4/80抗体一般由特定的胞外序列片段作为抗原免疫动物制备。然而，由于F4/80胞外序列较长(644aa)，大多片段可能为无免疫活性的无效片段。以全长胞外序列进行动物免疫时，无免疫活性的片段可能对免疫活性片段产生屏蔽或干扰作用，影响抗体的产生；以较短的免疫活性片段进行动物免疫时，较短的抗原序列可能导致免疫刺激作用显著降低，甚至无法诱导抗体的产生。目前，商业化的抗F4/80抗体主要是以该蛋白的部分胞外序列为抗原免疫动物获得，最常用的是氮端50-150氨基酸序列或350-650氨基酸序列片段。现有的商业化抗体中，尽管免疫动物所用的蛋白片段仅有部分甚至少数氨基酸差异，但所获得抗体性能差异显著，表明F4/80蛋白片段的选择对其免疫原性及获得的抗体性能具有显著影响，明确F4/80优势免疫序列对于稳定获得高性能抗F4/80抗体具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一种抗F4/80的多克隆抗体及制备方法。与商业化同类抗体相比，该多克隆抗体对巨噬细胞具有显著更强的免疫荧光染色性能。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明第一方面的实施例提供了一种抗F4/80的多克隆抗体的制备方法，所述的抗F4/80的多克隆抗体通过F4/80蛋白片段作为抗原免疫获得。

进一步的，所述的F4/80蛋白片段包含序列为F4/80蛋白第1至179氨基酸序列。

进一步的，所述的抗原的获得方法是将所述的F4/80蛋白片段与GST标签融合表达获得。

进一步的，所述的抗F4/80的多克隆抗体为免疫兔获得的抗兔多克隆抗体。

本发明第二方面的实施例提供了一种抗F4/80的多克隆抗体，所述的抗F4/80的多克隆抗体由上述的制备方法制备而得。

本发明的有益效果是所使用的F4/80氮端1-179aa多肽具有良好的免疫原性，是F4/80蛋白胞外序列中具有优势免疫表位的序列；使用该多肽作为抗原免疫兔子所获得的抗F4/80多克隆抗体较现有的利用其他氮端多肽获得的商业化同类兔多克隆抗体相比具有明显更好的亲和性能，免疫荧光染色巨噬细胞灵敏度高。

附图说明

图1为本发明一实施例中BioSun预测F4/80蛋白免疫表位分布情况；

图2为本发明一实施例中不同时间点血清抗体效价测定；

图3为本发明一实施例中纯化后的电泳检测；

图4为本发明一实施例中抗体与现有商业化同类抗体性能比较。

具体实施方式

下面通过以下实施例对本发明作进一步详细描述，以便本领域的技术人员进一步理解本发明，但不对本发明构成任何限制。

一种抗F4/80的多克隆抗体的其制备方法：

(1)通过Biosun表位预测软件预测F4/80胞外区段(1-644aa)免疫表位分布情况，并根据预测曲线选择1-179aa片段为优势抗原；

(2)收集小鼠巨噬细胞系Raw264.7，提取基因组mRNA，并使用Oliga引物反转录获得全基因组cDNA；

(3)设计并合成1-179aa片段两端引物，两端分别加上xhol，xbal酶切位点，(上游引物：GCCTCGAGATGTGGGGCTTTTGGCTGCTCCTC；下游引物：GCTCTAGAAGTCACACATTCATCTTCATC)基因文库)，通过PCR扩增获得1-179aa多肽所对应的DNA序列；

(4)PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化，随后连接到T载体，并转化HB101感受态细胞，并涂到LB固体培养基(AMP+)，培养过夜；

(5)在固体培养基中长出的多个单集落中，挑取10个单集落，接种到LB液体培养基中(AMP+)，37℃摇床扩增；扩增出的菌落中，挑取5个送天辉一远公司测序；选择测序正确的菌株，扩增并提取质粒；

(6)使用xhol，xbal限制性内切酶双酶切质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳电泳并根据片段的长度切胶回收纯化F4/80蛋白1-179aa片段的DNA序列，随后连接到pBV/IL1及pBV/GST载体，连接产物HB101感受态菌，并涂板LB固体培养基(Amp+)；

(7)挑取固体培养基中长出的10个单集落，接种到3mL LB液体培养基中，37℃摇床中扩增，菌落PCR鉴定基因片段的成功插入，并挑取5个送样测序；将测序正确的一株菌液，首先接种到40mL LB液体培养基中，37℃培养6小时；

(8)取10mL转种于200mL LB培养基中，37℃培养3小时，转于42℃水浴中培养诱导过夜；收集菌液，25mM PH8.5的Tis-HCl悬浮并定容至100mL，加入1mL溶菌酶，超声破碎后，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，重复三次，获得包涵体；

(9)将包涵体用25mM Tis-HCl pH8.5定容至60ml，加脲至90ml，待溶解后加入0.9ml巯基乙醇，煮沸5min，用棉花过滤后，通过Ni柱纯化抗原，250mM咪唑6M脲25mM Tis-HCl 0.1％B-ME pH8.5洗脱；SDS-PAGE电泳鉴定；

(10)利用上述克隆的pBV/GST/F4/8蛋白1-179aa作为抗原，取抗原1mg，无菌水稀释到1mL，加入1mL佛氏完全佐剂混合，高速搅拌乳化，成年新西兰大耳白兔，雌性，背部皮下多点注射(不少于6点)进行免疫，每月免疫一次，连续免疫3次，第二次与第三次免疫均使用佛氏不完全佐剂；

(11)分别在第一次免疫后2周，1月，2月，2.5月耳静脉取血，Elisa测定血清抗体效价，第三次免疫后2周，心脏取动物全血用于抗体提取，离心取上清；

(12)应用辛酸-硫酸铵沉淀法，先将血清与生理盐水1∶1混合，加2倍体积的醋酸(0.01M，pH 4.0)，用6N HCl调pH至4.8，磁力搅拌下，按每1mL血清25uL正辛酸计算，缓慢滴加正辛酸，室温搅拌30min；

(13)离心(12000r/min，30min，4℃)，取上清液，加入1/10体积的PBS(0.2M，pH7.2)，用5N NaOH调pH至7.6，于磁力搅拌下加硫酸铵，使终浓度为0.23g/mL，4℃过夜；

(14)离心(12000r/min，30min，4℃)，弃上清，沉淀用PBS(0.2M，pH 7.2)溶解，置于透析袋中透析24h以上；

(15)离心(12000r/min，20min，4℃)，除去不溶物，产物于-20℃保存，即为纯化好的IgG；

(16)通过UV-754型紫外分光光度计测出样品的蛋白含量。

本发明实施例所使用的F4/80氮端1-179aa多肽具有良好的免疫原性，是经过Biosun软件预测的F4/80蛋白胞外序列中具有优势免疫表位的序列；使用该多肽作为抗原免疫兔子所获得的抗F4/80多克隆抗体较现有的利用其他氮端多肽获得的商业化同类兔多克隆抗体相比具有明显更好的亲和性能，免疫荧光染色巨噬细胞灵敏度高。

实施例1：F4/80胞外序列优势免疫表位多肽片段的获得

1.1 F4/80(1-179aa)抗原基因的克隆与目的蛋白片段的获得

1.1.1通过Biosun表位预测软件预测F4/80胞外区段(1-644aa)免疫表位分布情况，如图1所示，并根据预测曲线选择1-179aa片段为优势抗原，序列如SEQ ID No.1所示。

1.1.2收集小鼠巨噬细胞系Raw264.7，提取基因组mRNA，并使用Oliga引物反转录获得全基因组cDNA；

1.1.3合成1-179aa片段两端引物，如下表1所示，两端分别添加xhol，xbal酶切位点，以适合表达载体pBVIL1(参见中国专利ZL00100695.9：表达载体pBVIL1及其构建方法和用途)和pBV/GST，通过PGR扩增获得1-179aa多肽所对应的DNA序列；表1两端添加酶切位点的引物序列如表1所示

表1两端添加酶切位点的引物序列

1.1.4 PCR产物回收：PCR产物按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)中所述的方法用2％琼脂糖凝胶进行分离，并用百泰克生物技术有限公司的小量胶回收试剂盒进行纯化回收。即在紫外灯下分别切下含目的片段的琼脂糖凝胶，放于Eeppendorf离心管中，各加入溶胶/结合液，置65℃水浴5分钟使胶溶解，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。

1.1.5连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上纯化后的PCR产物2μl、PMD-18T载体2μl，T4 DNA Ligase 4μl，置16℃连接5h以上。

1.1.6转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl HB101感受态细胞(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法制备)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物8μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分钟。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入1ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。

1.1.7鉴定：挑选菌落分别接种于LB中(5ml/管)，培养3小时后，全菌PCR鉴定，有扩增片段的菌液，经测序鉴定所插入的基因片段完全正确。

1.1.8质粒抽提：采用百泰克生物技术有限公司的小量质粒抽提试剂盒按试剂盒说明书操作，获得PMD-18T/F4/80(1-179aa)质粒。

1.1.9酶切：取以上获得质粒及pBVIL1和pBV/GST表达载体各82μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)10μl、Xba l(10u/μl)和Xho l(12u/μl)各3μl，BSA 2μl，置37℃水浴酶切过夜。

1.1.10酶切产物的纯化和回收：基因产物及载体pBVIL1经双酶切后，按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)中所述的方法进行用2％琼脂糖凝胶进行分离，并用百泰克生物技术有限公司的小量胶回收试剂盒进行回收。即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖凝胶，放于Eeppendorf离心管中，各加入溶胶/结合液，置65℃水浴5分钟使胶溶解，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。

1.2 F4/80(1-179aa)抗原表达质粒的构建与转化

1.2.1连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上纯化获得的目的片段2μl、pBVIL1载体或pBV/GST载体2μl，T4 DNA Ligase 4μl，置16℃连接5h以上。

1.2.2转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl HB101感受态细胞(感受态细胞按照《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法制备)悬液于Eppendorf中，加入(3)中的连接物8μl，轻轻旋转混匀，冰浴30min，立即转移到42℃水浴中放置2min，每管加入1ml LB培养基(不加抗生素)，37℃水浴摇床培养1h后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。

1.2.3鉴定：挑选菌落分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3h，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并经测序鉴定载体中所插入的基因片段完全正确。

1.3 pBVIL1/F4/80(1-179aa)和pBV/GST/F4/80(1-179aa)抗原的表达与纯化

1.3.1表达菌株的培养

取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，37℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，37℃空气摇床培养约3h，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20min，弃上清，收集沉淀部分。

1.3.2提取包涵体

将沉淀称湿重，用10倍体积的25mM PH8.5的Tis-HCl缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10min。在冰浴中超声波破碎菌，每次超声3s，间隔7s，共超声20min。4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用25mM PH8.5的Tis-HCl配制)洗一次，再用25mM PH8.5的Tis-HCl洗2次，收集沉淀。沉淀用6M脲(用pH8.525mM PH8.5的Tis-HCl配制)溶解，加1％β-巯基乙醇，过滤去沉淀取上清。

1.3.3纯化

将上述溶解的包涵体溶液过Ni柱，用平衡液(pH8.5，25mM Tis-HCl，含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用250mM咪唑(用平衡液配制)洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，目的蛋白于洗脱峰中。纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。通过上述的Ni柱纯化，获得了pBVIL1/F4/80(1-179aa)和pBV/GST/F4/80(1-179aa)抗原的纯品。

1.4抗原的活性鉴定

通过以下实验步骤进行活性测定：抗原包被板的制备：将纯化的两个抗原用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为2.5μg/ml，取100μl于酶联板中，4℃包被过夜，洗板2次，加入120μl封闭液，室温封闭6小时，甩掉封闭液，拍干，室温干燥；加经系列稀释的商业化的鼠F4/80多克隆抗体100μl，37℃反应30min；洗板5次，加入羊抗鼠IgG-HRP 100μl，37℃反应20min；洗板5次，加入A、B显示液各50μl，37℃反应10min；加入终止液50μl，终止后10分钟内，450nm波长测定测0D值。

经测定结果如下表所示：

pBVIL1/F4/80(1-179aa)活性测定结果

pBV/GST/F4/80(1-179aa)活性测定结果

实施例2：抗F4/80多克隆抗体的制备与鉴定

(1)利用上述克隆的pBV/GST/F4/8蛋白1-179aa作为抗原，取抗原1mg，无菌水稀释到1mL，加入1mL佛氏完全佐剂混合，高速搅拌乳化，成年新西兰大耳白兔，雌性，背部皮下多点注射(不少于6点)进行免疫；

(2)每月免疫一次，连续免疫3次；第二次与第三次免疫均使用佛氏不完全佐剂；

(3)分别在第一次面以后2周，1月，2月，2.5月耳静脉取血，Elisa测定血清抗体效价；如图2所示；结果显示，第一次免疫两周既已出现较高滴度的F4/80抗体，第一次免疫后1月血清抗体滴度增加；1月时加强免疫一次，随后第二月血清抗体滴度进一步显著上升；2月时第二次加强免疫，随后2.5月血清抗体滴度与两月时基本相当，表明血清抗体滴度以达到最大值。

(4)第三次免疫后2周，心脏取动物全血用于抗体提取，离心取上清；

(5)应用辛酸-硫酸铵沉淀法，先将血清与生理盐水1：1混合，加2倍体积的醋酸(0.01M，pH 4.0)，用6N HCl调pH至4.8；

(6)磁力搅拌下，按每1mL血清25uL正辛酸计算，缓慢滴加正辛酸，室温搅拌30min；(29)离心(12000r/min，30min，4℃)，取上清液，加入1/10体积的PBS(0.2M，pH 7.2)，用5NNaOH调pH至7.6，于磁力搅拌下加硫酸铵，使终浓度为0.23g/mL，4℃过夜；

(7)离心(12000r/min，30min，4℃)，弃上清，沉淀用PBS(0.2M，pH 7.2)溶解，置于透析袋中透析24h以上；

(8)离心(12000r/min，20min，4℃)，除去不溶物，产物于-20℃保存，即为纯化好的IgG；

(9)通过UV-754型紫外分光光度计测出样品在280nm处的吸收值，为11.89，运用以下经验性公式计算蛋白的含量：C(mg/mL蛋白)＝OD280nm/1.4，计算结果为8.5mg/mL；

(10)为了评价提纯的IgG蛋白，通过SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示；SDS-PAGE电泳分析可看出在66.2～43kDa、31～22.0kDa之间的两个明显条带，符合IgG典型特征，纯度较好。

(11)进一步，将自制的F4/80抗体与商业化的鼠F4/80多克隆抗体(大鼠抗F4/80单克隆抗体，Abcam公司，货号：ab6640)、兔F4/80多克隆抗体(兔抗F4/80多克隆抗体，Abcam公司，货号：ab100790)分别对Raw264.7进行免疫荧光染色，并进行比较。结果如图4所示，可看到F4/80抗体与Raw264.8细胞呈较为典型的核周型结合，在相同条件下，可以看出自制的兔F4/80抗体免疫染色效果明显优于两株商业化多克隆抗体。

免疫荧光染色结果显示，在同样曝光条件下本发明提供的F4/80抗体具有显著更好的染色性能，明显优于两株商业化同类抗体。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 抗F4/80的多克隆抗体及制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

atgtggggct tttggctgct cctcttctgg ggcttcagtg ggatgtacag atgggggatg 60

accacacttc ccaccctggg acaaacactt ggtggtgtga atgagtgtca agatactacc 120

acttgcccag cttatgccac ctgcactgac accacagaca gttattactg cacctgtaaa 180

cgaggcttcc tgtccagcaa tggacaaacc aactttcaag gcccaggagt ggaatgtcaa 240

gatgttaacg aatgtcttca aagtgactca ccttgtggtc ctaactcagt ctgcaccaat 300

atcctgggga gagccaagtg cagctgtctt agaggcttct cttcttccac tgggaaagac 360

tggattctgg gaagtttgga taattttctc tgcgcagatg ttgatgagtg tctgacaatt 420

gggatctgcc ctaagtattc caactgctct aactctgtgg gaagctacag ctgtacctgt 480

caaccaggct ttgtcttgaa tggctccatt tgtgaagatg aagatgaatg tgtgact 537

Claims (5)

1.一种抗F4/80的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗F4/80的多克隆抗体通过F4/80蛋白片段作为抗原免疫获得。

2.根据权利要求1所述的抗F4/80的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的F4/80蛋白片段包含序列为F4/80蛋白第1至179氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗F4/80的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗原的获得方法是将所述的F4/80蛋白片段与GST标签融合表达获得。

4.根据权利要求3所述的抗F4/80的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的抗F4/80的多克隆抗体为免疫兔获得的抗兔多克隆抗体。

5.一种抗F4/80的多克隆抗体，其特征在于，所述的抗F4/80的多克隆抗体由权利要求1-4任一项所述的制备方法制备而得。

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