CN110305207B

CN110305207B - 一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110305207B
Application number: CN201910514327.3A
Authority: CN
Inventors: 张海珍; 杨正根; 余波光; 陈臻毅; 王云喜; 林大鸿; 陈校园
Original assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110305207A

Abstract

本发明提供了一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白及其制备方法与应用，涉及生物工程领域和血液净化技术、通过重组基因技术高效表达与IgE有高结合力的受体蛋白FcεRIα‑D1‑D2，将其作为血液吸附剂的配基，固定于固相载体上制备得到的吸附剂可用于去除过敏反应病人血液中过量的IgE，治疗重症的过敏性疾病。

Description

一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法及应用。

背景技术

过敏性疾病在全世界范围内呈逐年增加的趋势，在近30年间发病率至少增加了3倍，预计在今后的20年内，工业化国家50％的人口将染上过敏症。过敏性疾病发生的机理是IgE介导的免疫变态反应，常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎、药物性间质性肺炎、支气管肺曲菌病、麻风、类天疱疮及某些寄生虫感染等。过敏性疾病是人体内IgE与受体蛋白(FcεR)的结合导致的一系列免疫变态反应。FcεR位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，也存在于人体单核细胞、巨噬细胞和血小板上，可分为FcεRI和FcεRII两类。FcεRI表达于肥大细胞及嗜酸性粒细胞表面，是IgE的高亲和力受体(Kd＝l0^-9-10^-10M)。FcεRII也称作CD23，是IgE低亲和力受体(Kd＝l0^-5M)。通过表达重组的高亲和力受体蛋白，并将其偶联至固相载体合成免疫吸附剂，通过体外循环快速清除体内的IgE能够达到有效控制病情的目的。

目前治疗过敏性疾病比较有效的方法有：1)药物治疗如奥马珠单抗。奥马珠单抗是人源化的抗IgE抗体，用量大，生产成本高，患者的经济压力大。且药物治疗有一定的局限性，对于重症过敏患者，体内IgE水平可达500-10000IU以上，甚至达到10万IU以上(SilvanaBalzar,MD1等，2007；M.Carlsson等，2015)，单抗药物用量非常大。Omalizumab药剂量主要依据患者的体重及IgE的起始水平，最低用量为2700mg-5400mg(Philip J.Lowe，2009)，药物引起的其它副作用会明显加大，且价格昂贵，每年的治疗费用达10万元以上。2)血液净化治疗法。血液净化疗法是通过体外循环的方法，用血浆分离器分离出病人的血浆，通过吸附剂吸附清除机体内的目标物质。目前商品化的产品有德国美天旎公司开发的第一代Ig吸附产品Therasorb-Ig Adsorber，配基是多克隆羊抗人免疫球蛋白抗体。2015年，Daeschlein等人报道了另一项采用Ig-Therasorb吸附器重复进行免疫吸附(IA)治疗高血清IgE水平的重症过敏性皮炎患者的临床研究，结果显示免疫吸附对重症过敏性皮炎具有较好的疗效。美天旎的二代吸附柱Therasorb-IgE Adsorber以鼠单抗为配基，对过敏性皮炎病人血清IgE水平在每个疗程的降低水平达92％。德国费森尤斯IgE Adsorber(IgEnio)是单链抗体，该产品单次吸附治疗的IgE下降率为79％。C.Lupinek等人报道称IgEnio能在奥玛珠单抗存在的情况下吸附IgE。说明体外吸附IgE能够有效控制病情。但是上述产品存在一些缺点：如美天旎的产品羊抗和鼠抗含外源蛋白，安全性差。费森尤斯的单链抗体吸附能力弱，是将鼠源的单抗可变区VH和VL重组得到的抗体，在大肠杆菌表达。

本发明用受体蛋白截短蛋白作为配基合成吸附剂，由于受体蛋白是人体内已存在的蛋白，安全性好，不存在外源哺乳动物蛋白带来的免疫反应。截短蛋白用原核大肠杆菌进行表达，工艺简单，生产成本低，更易于大规模使用。因合成吸附剂的蛋白用量非常大，表达纯化大量的受体蛋白是首要任务。

2016年，宁夏医科大学邢慧慧等利用原核表达载体PET-32a将FCεRIα整个胞外区基因转入原核表达宿主BL21(DE3)中，表达出分子量为42KDa的可溶型FCεRIα蛋白，但是文章指出测序结果有2个氨基酸发生突变，蛋白的构象可能与天然蛋白不同。大连理工大学贾凌云教授(CN 102660569 B)用大肠杆菌PET23质粒表达了FCεRIα-D2，通过包涵体复性得到可溶性蛋白，将蛋白连接到固相载体上，合成吸附剂对IgE的吸附能力为285-355IU/mL胶，吸附效果较差，说明仅含有D2区的蛋白活性低。北京大学深圳医院王庆文等发表专利用大肠杆菌载体PET32M，体外表达了可溶性的受体蛋白，但是没有公开表达量，未鉴定活性。

发明内容

基于上述原因本发明提供吸附率较高的一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面本发明提供了一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面本发明提供了一种编码如上所述可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面本发明提供了制备如上所述可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)人工合成如SEQ ID No：2所示的核酸序列，将目的基因片段插入表达质粒序列上的克隆位点转入表达菌株；

(2)将表达菌株扩大培养，待菌体OD600值到达0.5～1.0时，加入诱导剂进行诱导表达，继续培养，待OD600值开始下降前离心，收集菌体；

(3)将收集的菌体破碎，离心收集的蛋白上清用镍亲和层析纯化，收集洗脱峰后透析浓缩，并置换缓冲液；

(4)在将步骤(3)所得的蛋白中加入SUMO蛋白酶进行酶切后，将所得蛋白溶液采用镍亲和层析柱纯化，标签蛋白SUMO将会吸附至柱子上，而目的蛋白因不带标签会流穿柱子，收集穿流峰即得目的蛋白；

(5)取活化的琼脂糖加入步骤(4)所得到的受体蛋白溶液，将其与琼脂糖偶联。

上述方法中，所述步骤(1)中使用的表达质粒为pET SUMO质粒；表达菌株为大肠杆菌。

上述方法中，所述步骤(2)中培养温度为20～40℃；所述诱导剂为诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)。

上述方法中，所述步骤(3)中菌体破碎采用以下方法实现：菌体按体积比1:5加入PBS溶液，超声破碎，功率为300～800W，破碎时间为3～10min。

上述方法中，所述步骤(3)中透析浓缩采用分子量为3K的超滤管透析浓缩。

上述方法中，所述步骤(3)中置换的缓冲液为硼酸盐缓冲体系(含0.247mol/L的硼酸，0.006mol/L的硼砂)。

上述方法中，所述步骤(3)或(4)中镍亲和层析纯化采用以下试剂：平衡液为PBS(含8.0mmol/L的磷酸氢二钠、2.0mmol/L的磷酸二氢钾和131mmol/L的NaCl)，洗脱液为PBS溶液中加入180mM的咪唑，调节pH＝7.0～7.2。

上述方法中，所述步骤(5)之前还包括活化琼脂糖，并通过以下方法实现：取适量的琼脂糖加入0.5～2M的氢氧化钠及双缩水甘油醚进行活化反应，10～40℃，100～200rpm，反应时间为5～16h，反应完后，将填料过滤，用约100mL的纯化水抽洗填料至中性，得到活化的琼脂糖。

上述方法中，所述步骤(5)中受体蛋白偶联至琼脂糖的方法，包括以下步骤：取活化的琼脂糖加入受体蛋白溶液进行蛋白的偶联，10～40℃，100～200rpm，反应时间为5～16h，反应完后，用纯化水抽洗填料至中性；最后加入0.5～1.5M的乙醇胺(PH＝8.0)溶液进行封端以消除特异性吸附，10～40℃，100～200rpm，反应时间为5～24h，反应结束后用纯化水抽洗填料至中性。

第四方面本发明提供了如上所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白在制备预防或治疗过敏性疾病药物中的应用。

第五方面本发明提供了如上所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白在制备IgE抗体纯化或制备IgE吸附剂中的应用。

本发明的有益效果：(1)本发明的受体蛋白对IgE有很强的亲和力，能选择性地结合IgE，从而保证IgE的去除效果；(2)基因重组表达的受体蛋白序列为人体自身IgE受体蛋白序列，不含有任何外源基因，与鼠源抗体相比，安全性更高；且将受体蛋白偶联至固相载体，增加了蛋白的稳定性，在血液净化过程中，仅有微量的配基脱落至人体中。对于过敏性病人，外源蛋白引起的免疫反应会更加强烈，产品的安全性要求更高。(3)通过密码子优化，用大肠杆菌原核表达体系高效表达蛋白，培养周期短，操作简便，大大降低了配基的制备成本。利用PET-SUMO质粒进行表达，SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高蛋白可溶性等功能。另外，SUMO蛋白水解酶能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO标签，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白，保证治疗时的安全性。表达菌株Rosetta gami 2能够促进蛋白的可溶性表达。(4)本发明中菌种培养后外源蛋白表达量占总蛋白的60％以上，表达量达到50mg/L培养液。所合成的吸附剂对人体血浆中IgE的吸附能力达到1万IU/mL填料，远远优于现有技术报道的原核表达蛋白的效果。

附图说明

图1为菌体破碎后的SDS-PAGE图(其中泳道1为Marker；泳道2为破碎上清，含有SUMO标签，分子量约40KD；3表示目的蛋白)。

图2为本发明受体蛋白截短蛋白纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图(其中泳道1为低分子量蛋白marker，由上往下分子量大小分别为180kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa、10kDa；泳道2为实施例2得到的终蛋白溶液，酶切后受体蛋白的分子量大小约为21±2kDa)。

图3为实施例1中阳性克隆提取质粒后DNA电泳结果图(其中质粒大小530bp，与目标片段大小相符)。

图4为构建重组质粒DNA电泳所用的DNA marker示意图。

图5为测序得到的序列与设计的目的序列的比对图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1：大肠杆菌表达菌株的构建

将含有如SEQ ID NO：2所示的目的基因(委托广州艾基生物技术有限公司合成)的质粒PET SUMO与Rosetta gami 2感受态细胞，于冰上解冻。解冻完全后于超净工作台中将两者充分混匀(质粒取50～100ul(10ng/ul)，感受态细胞取100～200ul，冰上放置30min，42度热激90s，迅速冰上放置2～5min，加入800～1000μL SOC培养基，37℃，180rpm培养1h后，5000rpm，离心5～10min，去掉大部分上清，留下约50～100μL培养基重悬菌体，均匀涂布于(AMP+)LB培养基中，37℃过夜培养。挑取菌落形态正常的阳性克隆，作为菌种。用LB培养基扩大培养后取少量培养液，送至生工生物工程上海(股份)有限公司进行质粒的提取、测序，验证序列是正确的。质粒的DNA电泳图如图3，图4所示，通过图3、图4的条带比对得出图3的DNA片段大小。基因序列的比对图如图5所示，比对结果100％相符合。

实施例2：受体蛋白截短蛋白的表达及纯化

准备灭菌好的LB液体培养基(外加入2g/L的葡萄糖)，加入卡那霉素(终浓度为100μg/ml)，用枪头挑入一个单菌落，37℃，180rpm培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，记录数据，并于快速生长期加入诱导剂IPTG(终浓度为1mol/L)，继续培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，记录数据，最终得到其生长曲线，测定OD₆₀₀时，观察吸光值变化不明显时，停止培养，5000rpm，离心10min收集菌体。冰浴，1g菌体加入5mL的PBS溶液，超声破碎功率为300W，破碎4s停4s，总时间为5min，然后8000rpm离心5min，收集破碎上清。镍亲和层析填料用5倍柱体积的PBS溶液平衡，将破碎上清上样至层析柱，继续用5倍柱体积的PBS溶液平衡，然后用含有180mM咪唑的PBS溶液洗脱蛋白，收集洗脱峰。最后用3K的超滤管浓缩并置换为硼酸缓冲液(含0.247mol/L的硼酸，0.006mol/L的硼砂)。按照蛋白浓度1mg蛋白加入300U的SUMO酶，进行酶切反应，30℃反应1.5h，然后将所得蛋白溶液上样至镍亲和层析柱，标签蛋白SUMO将会吸附至柱子上，而目的蛋白因不带标签会流穿柱子，收集穿流峰即得目的蛋白，即得本发明的受体蛋白截短蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。按照上述方法发酵菌体，并表达纯化后，1L的培养液共得到约5g菌体，纯化后蛋白得率约10mg/g菌体，计算得蛋白表达量为50mg/L发酵液。

实施例3：IgE免疫吸附剂的合成

取5mL的琼脂糖GE Sepharose 6FF加入8mL 2M的氢氧化钠及5mL双缩水甘油醚，40℃，180rpm,5h，反应完后，将填料过滤，用约100mL的纯化水抽洗填料至中性。取活化的琼脂糖加入5mL浓度为15mg/mL的受体蛋白溶液，20℃，180rpm，反应15h。反应完成后，用约100ml的纯化水抽洗填料至中性。最后加入10mL 1M的乙醇胺(pH＝8.0)溶液混合，20℃，180rpm，反应10h。用约100ml的纯化水抽洗填料，即得IgE免疫吸附剂。

实施例4：合成吸附剂对人血清中IgE的吸附性能测定

用10mL EP管分别装入1mL的上述合成填料及5mL的重症过敏病人血清(本公司储存)，25℃，100rpm接触1～2h后，将填料置于一次性亲和层析柱中，抽干填料。分别用人IgEELISA试剂盒(ab108650)检测吸附前后血清中的IgE含量变化(血清稀释1000倍)。以空白的琼脂糖GE Sepharose 6FF作为对照。标准曲线：y＝2.4402X+0.1692R²＝0.9976，吸附前：40139ng/mL(16725IU/mL)，吸附后：11560ng/mL(4817Iu/mL)。计算得吸附性能为11908Iu/mL，IgE下降率71.2％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州康盛生物科技有限公司

<120> 一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白及其制备方法与应用

<130> 6.12

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 174

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Met Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg

1 5 10 15

Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe

20 25 30

Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu

35 40 45

Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser

50 55 60

Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val

65 70 75 80

Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu

85 90 95

Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg

100 105 110

Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu

115 120 125

Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val

130 135 140

Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp

145 150 155 160

Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro

165 170

<210> 2

<211> 525

<212> DNA

<213> 人源

<400> 2

atggttccgc agaaaccgaa agtttctctg aacccgccgt ggaaccgtat cttcaaaggt 60

gaaaacgtta ccctgacctg caacggtaac aacttttttg aagtgagctc taccaaatgg 120

ttccacaacg gttctctgtc tgaagaaacc aactcttctc tgaacatcgt taacgctaaa 180

ttcgaagact ctggtgaata caaatgccag caccagcagg ttaacgaatc tgaaccggtt 240

tacctcgaag tcttcagcga ctggctgctg ctgcaggctt ctgctgaagt tgttatggaa 300

ggtcagccgc tgttcctgcg ttgccacggt tggcgtaact gggacgttta caaagttatc 360

tactacaaag acggtgaagc tctgaaatac tggtacgaaa accacaacat ctctatcacc 420

aacgctaccg ttgaagactc tggtacctac tactgcaccg gtaaagtttg gcagctggac 480

tacgaatctg aaccgctgaa catcaccgtt atcaaagctc cgtaa 525

Claims

1.一种可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）人工合成如SEQ ID No：2所示的核酸序列，将目的基因片段插入表达质粒序列上的克隆位点转入表达菌株；

（2）将表达菌株扩大培养，待菌体OD600值到达0.5～1.0时，加入诱导剂进行诱导表达，继续培养，待OD600值开始下降前离心，收集菌体；

（3）将收集的菌体破碎，离心收集的蛋白上清用镍亲和层析纯化，收集洗脱峰后透析浓缩，并置换缓冲液；

（4）在将步骤（3）所得的蛋白中加入SUMO蛋白酶进行酶切后，将所得蛋白溶液采用镍亲和层析柱纯化，标签蛋白SUMO将会吸附至柱子上，而目的蛋白因不带标签会流穿柱子，收集穿流峰即得目的蛋白；

（5）取活化的琼脂糖加入步骤（4）所得到的受体蛋白溶液，将其与琼脂糖偶联；

所述步骤（1）中使用的表达质粒为pET SUMO质粒；表达菌株为大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中培养温度为20～40℃；所述诱导剂为诱导剂IPTG。

3.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中透析浓缩采用分子量为3K的超滤管透析浓缩。

4.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）或（4）中镍亲和层析纯化采用以下试剂：平衡液为PBS，洗脱液为PBS溶液中加入180mM的咪唑，调节pH=7.0～7.2。

5.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中受体蛋白偶联至琼脂糖的方法，包括以下步骤：取活化的琼脂糖加入受体蛋白溶液进行蛋白的偶联，10～40℃，100～200rpm，反应时间为5～16h，反应完后，用纯化水抽洗填料至中性；最后加入0.5～1.5M的乙醇胺（pH=8.0）溶液，10～40℃，100～200rpm，反应时间为5～24h，反应结束后用纯化水抽洗填料至中性。

6.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法在制备预防或治疗过敏性疾病药物中的应用。

7.如权利要求1所述的可溶性人IgE受体蛋白截短蛋白的制备方法在制备IgE抗体或制备IgE吸附剂中的应用。