CN101280001A - 人SDF-1α的制备及由此获得的人SDF-1α及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新颖的制备纯化人基质细胞衍生因子－1α(hSDF－1α)的方法，采用该方法能够大大简化纯化过程，节约成本，提高所得产物的纯度和得率。由此制得的人基质细胞衍生因子－1α具有促T细胞趋化活性及动员骨髓造血的功能。本发明还提供一种新的人基质细胞衍生因子－1α，其药学组合物及其用途。

Description

人SDF-1α的制备及由此获得的人SDF-1α及其用途

技术领域

本发明涉及人SDF-1α的制备及纯化、由此制得的人SDF-1α及其用途。

背景技术

趋化因子对骨髓造血的调节作用目前成为新一代造血系统药物研发的焦点。趋化因子对骨髓造血的作用包括：促进骨髓造血，抑制造血细胞凋亡；是骨髓中血小板发生所必需的因子，对化疗引起的血小板减少具有治疗作用；促进人造血细胞体外扩增和活性的维持；促进CD34+造血干/祖细胞归巢、增殖和成熟(柴克霞，贾乃镛.趋化因子及其受体对造血细胞调控作用的研究进展，临床荟萃，2003，18(8)：473-474)。骨髓基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor1，SDF-1)是目前仅有的、知道比较清楚的、对人和小鼠造血干细胞具有较强趋化作用的趋化因子，它是趋化因子CXC家族中的一个成员，又称前B细胞刺激因子。SDF1或CXCR4基因敲除的小鼠表现出相同的造血衰竭(Nagasawa T，Hirota S，Tachibana K等，Defects of B-cell lymphopoiesis and bone marrow myelopoiesis inmice lacking the CXC chemokine PB SF/SDF-1.Nature，1996，382(6592)：6352-638；Zou YR，Kottmann AH，Kuroda M等，Function of the chemokine receptorCXCR4 in haematopoiesis and cerebellar development.Nature，1998，393(6685)：595-599)。SDF1/CXCR4功能轴在造血干细胞/祖细胞的维持、扩增和穿梭迁移中均起关键作用(Lapidot T，Dar A，Kollet O.How do stem cells find way home？Blood，2005，106，(6)：1901-1910；Kucia M，Reca R，Miekus K，Trafficking ofnormal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms：pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis.Stem Cells，2005，23(7)：879-894)。

SDF-1分为两种亚型SDF-1α和SDF-1β，后者在羧基端比前者多了4个氨基酸残基，两者在表达和功能上未发现区别。人和小鼠的SDF-1只相差一个氨基酸，同源性99％(魏立，孔佩艳.SDF-1/CXCR-4系统与造血干细胞动员.重庆医学，2003，8 32(8)：1098-1100；Czech A.Stromal cell derived factor 1(SDF-1)：Itsstructure and function[J].Cas Lek Cesk，2001，140(12)：355；Shirozu M，NakanoJ，Inazawa K.Structure and chromosomal location of the human stromal cell-derivedfactor 1(SDF-1)gene[J].Genomics，1995，28(3)：495-500；Loetscher M，GeiserT，O’Reilly T等.Cloning of a human seven transmembrane domain receptor，LESTR，that is highly expressed in leukocytes[J].J Biol Chem，1994，269(11)：232-237)。

SDF-1对造血干/祖细胞、T细胞和单核细胞等能有效地起到趋化作用，是一种与骨髓造血功能密切相关的趋化因子。SDF-1与其受体CXCR4相互作用可以促进造血干/祖细胞的增殖和分化，并且与其他因子协同作用可促进造血干/祖细胞向外周血的动员；SDF-1能介导造血干/祖细胞跨越骨髓-内皮细胞层迁移的过程从而实现造血干细胞归巢至骨髓。因此深入研究SDF-1的作用及其机理并且开发蛋白重组药物对于治疗造血系统相关疾病及对于造血干细胞移植具有重要的意义。

现有技术公开了人基质细胞衍生因子-1α(hSDF-1α)重组突变体制备(中国专利申请03146833.0)及人基质细胞衍生因子-1β的纯化，但还未见人基质细胞衍生因子-1α的纯化方法的报道。在纯化人基质细胞衍生因子-1β的过程中，采用了金属离子螯合亲和层析、肠激酶消化以游离出SDF-1β，再经阳离子交换层析和逆向高效液相层析等步骤纯化得到目的蛋白(郑红等，趋化因子SDF-1β在大肠杆菌中的表达及其纯化，第三军医大学学报，2001，23(1)：62-65)。采用此法纯化重组蛋白缺点在于步骤繁琐，成本较高。另外，蛋白的得率不高，1L菌液只能得到400ug的蛋白，因此不利于大规模生产。

因此，仍需要一种制备人基质细胞衍生因子-α的方法，该方法步骤简单，可产生高纯度、高得率的蛋白。本发明提供了满足这样的要求的方法。

发明内容

本发明第一方面涉及一种纯化人基质细胞衍生因子-1α的方法，该方法包括：

(1)采用超声和/或溶菌酶处理诱导表达了以包涵体形式存在的人基质细胞衍生因子-1α的大肠杆菌，离心分离得到包涵体；

(2)将包涵体中的蛋白变性、复性，得到变性-复性后的蛋白溶液；

(3)将该变性-复性后的蛋白溶液经过阴离子交换层析纯化，得到纯度大于95％的人基质细胞衍生因子-1α。

在一个优选实施例中，本发明所述方法中的所述包涵体采用以下步骤获得：

(a)从人骨髓组织中克隆人基质细胞衍生因子-1α基因，将其插入到原核表达质粒中，构建并得到人基质细胞衍生因子-1α的原核表达载体；

(b)用该原核表达载体转化大肠杆菌，得到转化的大肠杆菌；

(c)在该转化的大肠杆菌中诱导表达，产生包含有人基质细胞衍生因子-1α的包涵体。

在一个优选实施例中，所述原核表达质粒为pET28a(+)。

在另一个优选实施例中，所述步骤(c)中的诱导表达是在30-40℃过夜进行。

在一个优选的实施例中，所述人基质细胞衍生因子-1α具有SEQ ID NO：2所示的第2-71位氨基酸序列。

在另一优选的实施例中，所述步骤(2)中，使用pH为10.5-12.0的含7-8M尿素的变性液进行变性。

在一个优选实施例中，通过用pH为10.0-12.0的含Tris-HCl、乙二胺四乙酸的溶液稀释，使变性后的蛋白复性。

本发明另一方面还涉及一种人基质细胞衍生因子-1α，它具有SEQ ID NO：2所示的第2-71位氨基酸序列。

本发明再一方面还涉及一种药物组合物，它含有本发明的人基质细胞衍生因子-1α。

本发明还涉及所述的人基质细胞衍生因子-1α在制备用于促进骨髓造血的药剂中的用途。

附图说明

图1显示hSDF-1α的克隆和重组蛋白制备的电泳结果。A：hSDF-1α的PCR产物电泳，其中泳道1为DNA标记物，泳道2为PCR产物。B：hSDF-1α的表达，其中泳道1为蛋白标记物，泳道2为IPTG诱导前的全菌液裂解液，泳道3为IPTG诱导后的全菌液裂解液，泳道4为超声破菌后的上清，泳道5为超声破菌后的包涵体沉淀。C：hSDF-1α重组蛋白电泳检测，其中泳道1为蛋白标记物，泳道2为经Sepharose Q F.F.阴离子纯化后的重组hSDF-1α。

图2显示标准蛋白曲线。

图3显示重组hSDF-1α体外促T细胞趋化活性。hSDF-1α(0ng/ml)为阴性对照组，数据皆为平均值±SE，y轴为趋化的T细胞数与加入的T细胞数的百分比。

图4显示重组人SDF-1α蛋白对正常小鼠骨髓细胞的作用。对照组：尾静脉注射100ul PBS组；第1组：尾静脉注射剂量5ug/kg/day重组蛋白；第2组：尾静脉注射剂量25ug/kg/day重组蛋白；第3组：尾静脉注射剂量125ug/kg/day重组蛋白。

具体实施方式

本发明一方面涉及人基质细胞衍生因子-α的制备及纯化方法。该方法首先构建了人基质细胞衍生因子-α基因的重组表达载体，然后将重组表达载体转化大肠杆菌DH5α菌株，进行测序，测序验证无误后，将该重组载体转入微生物表达菌株，并进行诱导表达，其后将该微生物表达菌株超声波裂解得到包涵体蛋白，对包涵体蛋白进行变性复性后再经阴离子交换层析，获得纯度为95％以上的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白，且该重组蛋白的得率为2mg/L菌液。

(1)重组质粒的构建

以人骨髓细胞cDNA为模板，根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站中提供的人基质细胞衍生因子-α基因序列设计引物，去掉信号肽(第1-19氨基酸)，克隆成熟肽序列213bp，引物序列为：

引物1：5′＞CATGCCATGGACGGGAAGCCCGTCAGCC＜3′(SEQ ID NO：3)

引物2：5′＞CCGCTCGAGTTACTTGTTTAAAGCTTTCTC＜3′(SEQ ID NO：4)

在引物1的5端添加NcoI酶切位点，引物2的5端含XhoI酶切位点，终止密码子，用上述引物进聚合酶链式反应扩增，再同步用Nco I和Xho I对聚合酶链式反应产物和质粒pET28a(+)进行双酶切，回收酶切产物并将人基质细胞衍生因子-1α定向插入pET28a(+)构建重组表达载体，即重组质粒pET28a(+)-SDF1α。

步骤(1)中，可采用本领域熟知的聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。优选的PCR为：取50ng/ul人的骨髓cDNA为模板2ul，10uM上述引物各1.5ul，2mM浓度的dNTP 4ul，25mM的MgSO₄2ul，5U/ul KOD高保真酶1ul，10×KOD缓冲液5ul，用双蒸水补足到总体系50ul。聚合酶链式反应循环为：94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；最后于68℃延伸5分钟；反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离得到200bp左右的条带，与理论213大小一致，用胶回收试剂盒(MK006-1A型，博大泰克公司)回收目的条带。

步骤(1)中，可采用如下所述的试剂进行双酶切，具体为：将质粒pET28a(+)和人基质细胞衍生因子-1α聚合酶链式反应产物同步双酶切；质粒pET28a(+)的酶切体系为，双蒸水9ul，质粒5ul，10×Tango缓冲液4ul，10U/ul Nco I 1ul，10U/ul Xho I 1ul；人基质细胞衍生因子-1α的酶切体系为，双蒸水3ul，聚合酶链式反应回收产物35ul，10×Tango缓冲液10ul，10U/ul Nco I 1ul，10U/ul XhoI 1ul；将上述酶切体系于37℃过夜，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收。

步骤(1)中，可采用以下试剂构建重组表达载体，具体为：将10×T4 DNA连接酶缓冲液2ul，4U/ul T4 DNA连接酶1ul，pET28a质粒4ul和人基质细胞衍生因子-1α质粒13ul，在16℃反应过夜，建立重组表达载体pET28a(+)-hSDF-1α。

上述试剂以及本文其它处描述的试剂的浓度和用量可以有大约20％、优选10％、更优选5％的浮动范围。例如，对于9μl的双蒸水，其用量范围可以是7.2-10.8μl。其它试剂也是如此，在此不一一列举。

可使用其他表达载体如PQE30，PGEX等，也可以采用酵母菌真核表达系统及哺乳动物细胞株如CHO进行表达。

(2)诱导表达

将该重组表达载体转化大肠杆菌DH5α菌株，而后测序，将序列正确的重组质粒转入大肠杆菌B121(DE3)表达菌株，用1mM浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)进行诱导表达，得到菌液，将菌液离心后获得菌体沉淀。

可采用本领域周知的方法进行测序，也可由商业公司代为测序。诱导表达在约30-40℃的温度下过夜进行，优选的温度是约35-38℃，更优选的温度是约37℃。

(3)包涵体的获得

将菌体进行超声和溶菌酶双重裂解，获得包涵体蛋白，表达产物存在于包涵体沉淀中，重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，会形成包涵体，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏，由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，采用超声波破碎结合溶菌酶处理，然后离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。

步骤(3)中，所述的超声和溶菌酶双重裂解优选为：将菌体悬浮于含1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、0.1mM苯甲基磺酰氟的1×磷酸缓冲液中，于冰浴中超声破碎细菌，超声400w，超声30s，停30s为一个循环，20-25个循环至菌液清亮，菌体破碎得到部分包涵体蛋白，然后将破碎未完全的菌体用磷酸缓冲液重悬加10mg/ml溶菌酶于冰上溶解37℃温育10min进行双重破菌，得到包涵体蛋白。

(4)变性和复性

将步骤(3)所得包涵体蛋白进行变性、复性，得到变性-复性后蛋白溶液，因包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白，其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强，去污剂如SDS(十二烷基硫酸钠)，可以破坏蛋白内的疏水键，虽然可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中。因此本发明中采用了含6-10M、优选7-8M、更优选8M尿素的变性液。

由于SDF1蛋白的等电点是9.70，尝试用低pH值的变性复性效果并不理想。因此将包涵体在大于等电点的情况下变性复性，将变性剂和复性剂的pH调整为10.0-13.0、优选10.5-12.0、更优选为11.0，最终复性完的pH为10.0-12.0、优选为10.5-11.0，更优选为10.5。为进一步去除变性剂等杂质，选用强阴离子交换层析Separose Q柱，由于它的pH承受范围是2-12，因此可以承受10.0-12.0的pH，用约1mol/L的盐进行浓度梯度洗脱，蛋白在约0.3mol/L洗脱条件下开始出峰。

包涵体蛋白在变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构，本发明中采用了稀释复性的方法。在本发明方法中，稀释复性法指将变性处理后的离心上清滴加到如5倍体积、10倍体积、12倍体积、15倍体积于该上清的pH为10.0-12.0、优选为10.5-11.5、更优选为11.0的含Tris-HCl、乙二胺四乙酸、NaCl的溶液中。在滴加过程维持溶液pH不变。然后按照1∶1的体积比加入相同pH值的含Tris-HCl、乙二胺四乙酸的溶液稀释，调节最终溶液的pH值10.0-11.0的范围，优选为10.5。在含Tris-HCl、乙二胺四乙酸、NaCl的溶液中，对Tris-HCl、乙二胺四乙酸、NaCl并无特殊限制。Tris-HCl和NaCl的浓度可以分别是如20-80mM、40-60mM，优选是50mM；乙二胺四乙酸的浓度可以是0.5-1.5mM，优选是1mM。在后一含Tris-HCl、乙二胺四乙酸的溶液中，Tris-HCl的浓度范围可以是如10-50mM、10-30mM，优选是20mM；乙二胺四乙酸的浓度可以是0.5-1.5mM，优选是1mM。

具体而言，优选的变性和复性方法是，将包涵体蛋白溶于pH11.0含8M尿素、50mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸、50mM NaCl、0.1M苯甲基磺酰氟的变性液中，室温条件下在摇床上缓慢振摇1小时，然后15000rpm离心15min，将离心后上清缓慢滴加到10倍体积的pH 11.0含50mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸、50mM NaCl的溶液中，滴加速度为2ml/min，持续检测溶液pH值，使之维持11.0，按照1∶1体积比，用pH 11.0、含20mM Tris-HCl、1mM乙二胺四乙酸的溶液稀释，滴加速度为2ml/min，调节溶液的pH值至10.5。

(5)纯化

将步骤(4)所得变性-复性后蛋白溶液经过阴离子交换层析纯化，获得纯度为95％以上的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白。

阴离子交换层析可采用如强阴离子交换层析Separose Q柱以及本领域常规的其它阴离子交换柱，按照供应商的说明书进行操作。

与现有的纯化方法相比，本发明的制备和纯化方法在基因克隆时不引入外源tag序列，因此不需要先通过Ni亲和柱获得带Tag的蛋白、然后再用肠激酶切除His-tag过HPLC柱的步骤，从而大大简化了制备和纯化过程，降低了成本，同时通过本发明方法的原核表达和纯化系统可以得到纯度大于95％并且具有生物学活性的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白；而且本发明方法的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白得率较高，蛋白定量结果表明，每1L菌液可得到2mg左右的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白。此外，采用本发明方法纯化制得的重组蛋白的内毒素含量低。因此，本发明还涉及采用本发明方法纯化制得的重组蛋白。

本发明另一方面还涉及一种人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白，它具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。活性测试表明，该蛋白对T细胞具有明显的趋化活性，而且具有动员骨髓造血的功能。

因此，本发明再一方面还涉及一种药物组合物，该组合物含有采用本发明方法制得的人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及所述人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白在制备用于促进骨髓造血的药剂中的用途。

再一方面，本发明还涉及该人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白的编码序列或简并的变异体、含有该编码序列的质粒以及含有该质粒的宿主细胞。。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

SDF-1对造血干/祖细胞、T细胞和单核细胞等能有效地起到趋化作用，是一种与骨髓造血功能密切相关的趋化因子。SDF-1与其受体CXCR4相互作用可以促进造血干/祖细胞的增殖和分化，并且与其他因子协同作用可促进造血干/祖细胞向外周血的动员；SDF-1能介导造血干/祖细胞跨越骨髓-内皮细胞层迁移的过程从而实现造血干细胞归巢至骨髓。因此深入研究SDF-1的作用及其机理并且开发蛋白重组药物对于治疗造血系统相关疾病及对于造血干细胞移植具有重要的意义。因此，本发明还涉及所述人基质细胞衍生因子-1α重组蛋白在制备用语促进造血干/祖细胞的增殖和分化、促进造血干/祖细胞向外周血的动员、治疗造血系统相关疾病等方面的药剂中的用途。

以下将以具体实施例的方式进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，不应将其视为对本发明范围的限制。本领域技术人员可对下述实施例中给出的试剂、剂量范围做出各种适当的改变。

实施例

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1表达质粒和菌株

大肠杆菌表达质粒pET28a(+)和大肠杆菌BL21(DE3)购自上海基因公司。采用常规的方法，通过抽提人骨髓细胞总RNA，反转录获得人骨髓cDNA。

1.1.2动物

SPF级雄性8周龄BALB/c小鼠，体重20±1g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.1.3相关试剂

DNA限制性内切酶Nco I，Xho I，10×PCR缓冲液，dNTP Mix，KOD聚合酶，T4DNA连接酶，T4DNA连接酶缓冲液，D2000 DNA Marker，6×Loading缓冲液和10×Tango缓冲液购自上海晶美生物公司。

PCR产物纯化试剂盒及质粒抽提试剂盒均购自天为时代公司；显色基质鲎试剂盒购自厦门鲎试剂厂。3μm插入式细胞培养皿和24孔细胞培养板为BD公司产品；IMDM培养基购自美国GIBCO公司；Sepharose Q.购自Armasham公司。考马斯亮蓝G-250、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、DTT、BSA、过硫氨酸、溶菌酶、Triton X-100购自上海生工。卡那霉素、氨苄青霉素、尿素、溴酚兰、十二烷基磺酸钠(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、低分子量标准蛋白购自鼎国公司。5-氟脲嘧啶注射液购自上海旭东海普药业有限公司；B型超纯质粒大量提取试剂盒，MK006-1A型小量DNA片段快速胶回收试剂盒购自博大泰克公司。显色法鲎试剂盒：包括东方鲎鲎试剂(TAL)，显色基质，内毒素工作品，细菌内毒素检查用水，反应终止剂HCl，偶氮化试剂1，偶氮化试剂2，偶氮化试剂3，无热源试管，无热源枪头，厦门鲎试剂厂。

SDS，NaCl，甘油，甘氨酸，无水乙酸钠，HCl，KCl，Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，尿素，蛋白胨，酵母膏，琼脂粉，琼脂糖，国药试剂。

PMSF，Tris碱，考马斯亮蓝R-250，考马斯亮蓝G-250购自鼎国试剂。

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，DTT，BSA，过硫氨酸，溶菌酶，Agarose，Triton X-100，上海生工试剂。

无水乙醇，异丙醇，冰乙酸，乙二胺四乙酸钠EDTA-Na2，肝素，冰醋酸，上海振兴化工一厂。

LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g和双蒸水1000mL配制而成，分装后121℃高压灭菌20min，临用前加适量的抗生素。

LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5％琼脂，高压灭菌后室温冷却至50℃时加入适量的抗生素(100ug/mL)混匀，倒入已灭菌的玻璃培养皿中，待凝固后4℃保存备用。

PBS(磷酸盐缓冲液)：在800ml去离子水中加入8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄和0.248KH₂PO₄，用盐酸调节PH至7.4，加去离子水定容至1000mL。

500mM IPTG：称取IPTG干粉0.477g，加入双蒸水4mL混匀。

100mM PMSF(苯甲基磺酰氟)：0.087g PMSF，5mL异丙醇，-20℃贮存。

10mg/mL溶菌酶：0.02g溶菌酶，加入2mL双蒸水。

1M Tris-HCl(pH8.0)：Tris 60.6g溶于400mL水，双蒸水定容至500mL加浓盐酸调节pH值至8.0。

5M NaCl：NaCl 58.4g双蒸水定容至200mL。

蛋白浓度测定Bradford溶液：考马斯亮蓝G-250 100mg，95％乙醇50mL，85％H₃PO₄100mL，双蒸水定容至1000mL。

1.2方法

1.2.1PCR引物的设计

根据NCBI(美国国立信息中心网站)中提供的人SDF1α基因序列设计引物，去掉信号肽仅克隆成熟肽序列213bp(SEQ ID NO：1)，由上海生工生物工程公司合成，引物序列为：

有义：5′-CATGCCATGGACGGGAAGCCCGTCAGCC-3′(SEQ ID NO：3)

反义：5′-CCGCTCGAGTTACTTGTTTAAAGCTTTCTC-3′(SEQ ID NO：4)

有义引物端酶切位点为NcoI，反义引物端酶切位点为XhoI。

1.2.2人SDF-1α的克隆与测序

以人的骨髓cDNA为模板，用上述引物使用如下体系进行PCR扩增：

双蒸水           33μL

2mM dNTP         4μL

10×KOD缓冲液    5μL

25mM MgSO₄       2μL

有义引物         1.5μL

反义引物         1.5μL

模板(cDNA)         2μL

KOD聚合酶          1μL

总体系             50μL

程序：94℃预变性2分钟；94℃变性15秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分钟，共35个循环；最后68℃延伸5分钟。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将质粒pET28a(+)和目的片段经Nco I和Xho I双酶切，割胶回收。PCR回收产物按以下酶切体系进行双酶切，酶切体系37℃过夜：

双蒸水             3μL

PCR回收产物        35μL

10×Tango缓冲液    10μL

Nco I              1μL

Xho I              1μL

pET28a(+)质粒按以下酶切体系进行双酶切，37℃过夜酶切：

双蒸水             9μL

pET28a质粒         5μL

10×Tango缓冲液    4μL

Nco I              1μL

Xho I              1μL

将酶切后产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后，根据制造商的说明书用胶回收试剂盒(博大泰克公司)回收酶切后片段。

将hSDF-1α和pET28a双酶切片段按如下连接体系进行连接，16℃过夜：

10×T4DNA连接酶缓冲液     2μL

T4DNA连接酶               1μL

酶切后pET28a质粒          4μL

酶切后hSDF-1α片段        13μL

总体系                    20μL

建立原核表达载体pET28a(+)-hSDF-1α。

按如下方法制备感受态细胞(CaCl₂法)：

(1)将-80℃冰箱内冻存的DH5α和BL21(DE3)菌株，在冰上融化后，分别用接种环挑取菌液在没有添加抗生素的LB平板上划线，37℃培养箱内倒置培养过夜；

(2)从平板上挑取DH5α和BL21(DE3)的单菌落接种于3mL LB培养基37℃倒置培养过夜；

(3)转接2mL菌液到100mL灭菌LB培养基中，37℃振荡培养，观察菌液生长情况，至OD＝0.4-0.6之间停止培养；

(4)取灭菌的50mL离心管5000rpm，10min离心收集菌体；

(5)在超净台内倾去上清，加入10mL 0.1M CaCl₂悬浮菌体，三管并一管，冰上15min；

(6)5000rpm，离心10min，倾去上清，加入10mL 0.1MCaCl2重悬，冰上30min，5000rpm，10min；

(7)去上清，加8mL 0.1M CaCl₂，0.2mL甘油，混匀后用灭菌Ep管分装，每管200μL，于-80℃冰箱内保存备用。

然后按如下方法转化大肠杆菌：

(1)感受态DH5α200μL在冰上解冻后加入1μL前述步骤制得的连接产物)，混匀后冰浴30min；

(2)42℃热激90s后立即冰浴5min，加入不含氨苄抗生素的LB培养基800μL，37℃振荡培养80min；

(3)4000rpm离心5min，弃上清，留少许上清和沉淀；

(4)将沉淀重悬后加入到LB平板，用涂棒涂均匀，37℃培养箱内过夜培养。

挑选阳性克隆，采用以下方法进行质粒抽提(碱裂解法)：

(1)从平板上挑取单菌落接种于3mL LB培养基，37℃过夜培养；

(2)取2.8mL菌液分两次在Ep管内5000rpm离心5min，吸尽上层清夜，收集沉淀；

(3)加入100μL溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))重悬菌体，彻底混匀；

(4)加入200μL溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)，上下轻柔混匀4-6次，冰浴1-2min；

(5)加入150μL溶液III(60mL 5M醋酸钾，11.5mL冰醋酸，2805mLddH₂O)，上下颠倒混匀，静置2-5min，12000rpm离心5min，转移上清，加1μL RNAase，室温30min；

(6)加等体积酚氯仿抽提，剧烈振荡15s，静置2min，12000rpm，2min；

(7)转移上清，2倍无水乙醇沉淀，室温静置2min，12000rpm，15min；

(8)1mL 70％乙醇洗沉淀2次，12000rpm，5min；

(9)将沉淀干燥，溶于30μL灭菌水，4℃保存备用。

并按前述方法进行酶切后送上海晶美生物公司测序。

1.2.3人SDF-1α的诱导表达和纯化

将测序正确的克隆抽提质粒转化原核表达菌株BL21(DE3)，挑取平板上的阳性克隆于50ml LB培养基(含100mg/L卡那霉素)中37℃振荡培养，转接30ml到1L新的LB培养基中，培养至OD600为0.8以上时加入500mM IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃过夜。8000rpm离心15分钟，收集菌体，并按以下步骤进行纯化：

(1)将菌体用磷酸缓冲液充分悬浮，之后将菌液合并至1个50mL灭菌离心管内，5000rpm×10min离心，再收集菌体，菌体称重；

(2)将步骤(1)得到的菌体用30ml预冷超声缓冲液(1mM乙二胺四乙酸，5mM二硫苏糖醇，0.1mM苯甲基磺酰氟，1×磷酸缓冲液)重悬，然后进行超声破菌，破菌条件为：用超声波破碎仪(soniprep150，SANYO公司)超声破菌，超声400w，超声30秒，停30秒为一个循环，超声20-25个循环，至菌液清亮；

(3)将菌液于4℃、15000rpm下离心20min，将超声并离心后的上清取样50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，收集超声并离心后的沉淀，待用；

(4)用15ml预冷1×磷酸缓冲液重悬步骤(3)所得沉淀，将重悬液取样50l用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，加150μl溶菌酶(10mg/ml)，置于冰上20min，搅拌混合，然后37℃温育10min；

(5)将上述溶菌酶作用后的重悬液于4℃在10000rpm下离心15min，离心后去上清，将沉淀沥干；

(6)将上述沥干后的沉淀称重，然后按每克沉淀对应18ml包涵体洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100，10mM乙二胺四乙酸，0.1mM苯甲基磺酰氟)的用量充分悬浮，离心，去上清，重复以上步骤两次，保留沉淀；

(7)将步骤(6)所得沉淀称重，用1×磷酸缓冲液重悬，然后在10000rpm下离心5min，去上清，保留沉淀，再次称重，把沉淀在漩涡振荡器上震散，然后按每克沉淀加9ml pH11.0的变性缓冲液(8M尿素，pH8.05mM Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸，50mM NaCl，0.1mM苯甲基磺酰氟)的用量，于室温下置于摇床上缓慢振摇，重悬1小时，得到重悬液；

(8)将步骤(7)所得重悬液，于4℃在10000rpm下离心15min，离心后，把上清转移至一洁净的50ml离心管中，并取上清50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，离心所得沉淀备用；

(9)将步骤(8)所得沉淀用1ml双蒸水充分悬浮，然后取50μL悬浮液用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(10)用流动泵将步骤(8)所得的上清缓慢滴加到10倍于变性缓冲液体积的pH11.0的复性液(50mM Na₂HPO₄，1mM乙二胺四乙酸，50mM NaCl)内，流速2ml/min，同时进行搅拌，并持续检测溶液，使之维持pH为11；

(11)按照1∶1的比例，用流动泵加pH11.0的稀释液(20mM Na₂HPO₄，1mM乙二胺四乙酸)使复性后的溶液稀释(稀释完毕后尿素浓度为0.36M)，流速2mL/min，调节溶液的pH值至10.5，将此变性-复性后蛋白溶液取样50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

(12)将步骤(11)所得变性-复性后蛋白溶液于18000rpm离心30min，离心后，收集上清液，装入50ml灭菌离心管内待上柱。

将上述变性-复性后蛋白溶液离心所得的上清液经过FPLC蛋白纯化仪(GE公司)用Sepharose.Q柱按以下步骤纯化：①双蒸水洗整个管路及柱子，流速为3ml/min，直至电导、UV值平衡；②取洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，50mM NaCl，1mM DTT，pH10.5)洗整个管路及柱子，流速为3ml/min，直至电导、UV值平衡；③上样：关闭B泵，从A泵上样，上样量50ml，流速0.5ml/min；④上样结束后以洗脱缓冲液再冲洗并平衡柱子，直至电导、UV值平衡(0.5-1ml/min)；⑤用1M NaCl进行梯度洗脱蛋白，流速2ml/min，出峰时开始收集蛋白，5ml收为一管。洗脱组分用SDS-PAGE鉴定。

1.2.4 SDS-PAGE和蛋白定量

蛋白电泳样品用2×SDS-PAGE上样缓冲液溶解，100℃变性5min，进行15％的SDS-PAGE(30％丙烯酰胺、1.5M Tris-HCl pH8.8、1.0M Tris-HCl pH6.8、10％过硫酸胺、10％SDS、TEMED(四甲基乙烯基二胺)。蛋白定量用Bradford法(见《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年1月)进行。

1.2.5 BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞的分离

取BALB/c小鼠脾脏，置于盛有预冷的IMDM培养液的平皿中，剪去结缔组织和脂肪，研磨，用300目细胞筛网过滤得到纯化的小鼠T淋巴细胞。用IMDM培养液调整细胞浓度为3.0×10⁷。

1.2.6蛋白活性测定

用T细胞体外趋化活性测定法。将不同浓度(2ng/mL、5ng/mL、50ng/mL和250ng/mL)的重组hSDF-1α蛋白加入24孔板中，每孔1.0ml，PBS作为对照，每组设3个复孔，将BD公司生产的插入式细胞培养皿(底部膜孔径3.0um)插入各受试孔中。在插入式细胞培养皿内加入0.1ml小鼠脾脏T细胞悬液(细胞浓度3.0×10⁶)。于37℃5％CO₂培养箱中孵育3小时后，在10倍显微镜下取10μL计数透过膜孔进入下层小孔中的T细胞数。根据迁移和未迁移的细胞数目计算趋化指数。

1.2.7蛋白内毒素含量测定

根据显色基质鲎试剂盒提供的方法进行。用无热源水配制内毒素，浓度为0.1、0.25、0.5、1.0EU/ml。待检hSDF-1α蛋白用无热源水进行稀释，取100ul浓度为0.5ug/ml的待检样品和内毒素标准品加入到鲎试剂中，另用等体积的无热源水作阴性对照。按方法中步骤进行，最后用分光光度计测各管在OD545nm吸光度。根据吸光度值作出标准曲线并按此曲线计算待检样品的内毒素含量EU/ml，最终以EU/ug表示。

1.2.8 hSDF-1α重组蛋白注射正常小鼠

将实验小鼠分成4组，每组4只，实验组尾静脉注射100ul不同浓度的hSDF-1α蛋白，剂量分别为5ug/kg/day，25ug/kg/day和125ug/kg/day，每天注射一次，连续注射7天，对照组给予等量的PBS，第0、5、10、15天检测小鼠外周血和骨髓细胞数目。

1.2.9数据分析

试验重复3次，计算平均数和标准差，采用student’s t检验检测统计数据，p＜0.05认为是有显著差异。

2结果

2.1 PET28a(+)-hSDF1α表达载体的构建和鉴定

以人骨髓cDNA为模板进行PCR，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可清晰看到扩增出目的条带，条带大小为200bp左右，与理论相符(图1A)。割胶回收，产物与质粒载体pET28a(+)经Nco I，Xho I双酶切并纯化后，在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，后转化感受态细胞BL21(DE3)。挑取平板上菌落小量提取质粒经双酶切后电泳鉴定。测序结果表明所克隆的hSDF1α序列与理论序列一致，为去除天然基质细胞衍生因子-1α部分信号肽(氨基端19个氨基酸)，序列是人基质细胞衍生因子-1α的第20-89个氨基酸(SEQ ID NO：2的第2-71位氨基酸，该序列中第1个氨基酸是由于添加了启动子ATG而编码得到的甲硫氨酸。

2.2诱导表达

重组工程菌经过夜诱导后，将诱导前后的菌液处理后经15％的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色液和脱色液处理后可观察到一分子量为8kD的条带，大小与理论相符，重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的40％-50％，而未诱导的菌没有目的条带。冰浴超声破碎后离心，将上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，显示hSDF-1α蛋白主要位于沉淀中，说明表达的hSDF-1α是以包涵体的形式存在，在细胞质中含量很少(图1B)。

2.3重组hSDF1α蛋白的纯化

将包涵体变性复性后，复性后产物经Sepharose-Q阴离子交换层析，用0-1.0mol/L的NaCl进行梯度洗脱，hSDF-1α蛋白主要存在于0.3mol/L的NaCl洗脱峰，将得到的蛋白进行15％SDS-PAGE电泳，在凝胶上可清晰看到目的条带大小约为8kD，与理论相符，且无其它杂带(图1C)。说明用上述纯化方法从pET28a(+)-hSDF1原核表达系统获得了hSDF-1α蛋白，且用凝胶软件分析此重组蛋白纯度达95％以上。

2.4 Bradford法测定重组蛋白的浓度

用Bradford法测定得到标准蛋白曲线，用Oringin软件画出标准曲线，得到该曲线函数Y＝A+B×X中A和B的值。将待测蛋白溶液OD595处的吸光值代入该函数，计算得到的蛋白浓度为0.67mg/mL(图2)。

2.5活性测定

T细胞体外趋化实验结果表明，与阴性对照组相比，纯化的hSDF-1α在浓度5ng/ml-50ng/ml之间具有明显的趋化活性(p＜0.05)。随浓度增高趋化的T细胞数呈正比例增高趋势，蛋白浓度为50ng/ml时可以趋化40％的T细胞，但当浓度大于50ng/ml时对T细胞的趋化活性明显下降(图3)。结果显示获得的hSDF-1重组蛋白具有生物活性。

2.6内毒素含量测定

根据鲎试剂盒方法，将待测的重组蛋白(0.5ug/ml)在OD545nm处的吸光度代入标准曲线y＝1.0086x+0.023(|r|＝0.993)，计算得到重组hSDF-1α蛋白的内毒素含量为0.84EU/ug。

2.7重组hSDF-1α蛋白注射正常小鼠

用纯化的hSDF-1α重组蛋白注射正常小鼠后，15天内给药组和实验组小鼠的外周血在统计学上没有差异，但25ug/kg/day和125ug/kg/day这两个剂量组的骨髓细胞第5天开始上升，第10天时至最高后下降，第10天和第15天的这两个点与对照组相比有极显著差异(p＜0.01)。提示通过连续注射蛋白提高血液中SDF-1α的水平可以发挥动员骨髓造血的功能(图4)。

序列表

<110>再生医药有限公司

<120>人SDF-1α的制备及由此获得的人SDF-1α及其用途

<130>071847

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>213

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gacgggaagc ccgtcagcct gagctacaga tgcccatgcc gattcttcga aagccatgtt      60

gccagagcca acgtcaagca tctcaaaatt ctcaacactc caaactgtgc ccttcagatt     120

gtagcccggc tgaagaacaa caacagacaa gtgtgcattg acccgaagct aaagtggatt     180

caggagtacc tggagaaagc tttaaacaag taa                                  213

<210>2

<211>71

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe

1                5                   10                   15

Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu

             20                  25                  30

Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn

         35                  40                  45

Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr

    50                   55                  60

Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys

65                   70

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

catgccatgg acgggaagcc cgtcagccc    29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ccgctcgagt tacttgttta aagctttct    29

Claims (10)

1. 一种纯化人基质细胞衍生因子-1α的方法，其特征在于，该方法包括：

(1)采用超声和/或溶菌酶处理诱导表达了以包涵体形式存在的人基质细胞衍生因子-1α的大肠杆菌，离心分离得到包涵体；

(2)将包涵体中的蛋白变性、复性，得到变性-复性后的蛋白溶液；

(3)将该变性-复性后的蛋白溶液经过阴离子交换层析纯化，得到纯度大于95％的人基质细胞衍生因子-1α。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包涵体采用以下步骤获得：

(a)从人骨髓组织中克隆人基质细胞衍生因子-1α基因，将其插入到原核表达质粒中，构建并得到人基质细胞衍生因子-1α的原核表达载体；

(b)用该原核表达载体转化大肠杆菌，得到转化的大肠杆菌；

(c)在该转化的大肠杆菌中诱导表达，产生包含有人基质细胞衍生因子-1α的包涵体。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原核表达质粒为pET28a(+)。

4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的诱导表达是在30-40℃过夜进行。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人基质细胞衍生因子-1α具有SEQ ID NO：2所示的第2-71位氨基酸序列。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，使用pH为10.5-12.0的含7-8M尿素的变性液进行变性。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过用pH为10.0-12.0的含Tris-HCl、乙二胺四乙酸的溶液稀释，使变性后的蛋白复性。

8. 一种人基质细胞衍生因子-1α，它具有SEQ ID NO：2所示的第2-71位氨基酸序列。

9. 一种药物组合物，它含有权利要求9所述的人基质细胞衍生因子-1α。

10. 权利要求8所述的人基质细胞衍生因子-1α在制备用于促进骨髓造血的药剂中的用途。

Images