NO166727B

NO166727B - Fremgangsmaate for fremstilling av rekombinant alfa-interferon

Info

Publication number: NO166727B
Application number: NO861635A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Bodo; Ingrid Maurer-Fogy; Edgar Falkner; Silvia Jutta Lindner
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1985-04-27
Filing date: 1986-04-25
Publication date: 1991-05-21
Also published as: PT82452A; DE3515336A1; NO861635L; PT82452B; ES8707554A1; JPS61282098A; NZ215969A; DE3689008D1; DK186486A; PH30912A; JP2566919B2; CA1340281C; KR940010024B1; FI861748A; DE3515336C2; IE61444B1; SU1591814A3; IL78604A; AU5677586A; KR860008270A

Description

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant, homogent, rent, ikke-immunogent, antiviralt og immunregulatorisk virksomt a-interferon. Det hen-vises forøvrig til det medfølgende krav 1.

Interferoner er kroppsegne proteiner som kan påvises i de forskjelligste arter. De antivirale og immunregulatoriske egenskaper som er spesielle for dem, har ført til at de allerede tidlig har syntes å være egnet for de forskjelligste anvendelses-områder. Undersøkelser har vist at det finnes forskjellige in-terferonklasser. Ved siden av interferonene a, 3 og y ble det nylig funnet frem til interf eron-u> og dets struktur.

De høye forventninger som har knyttet seg til interferonene som virksomt middel mot virus-sykdommer og mot kreft har allerede tidlig ført til undersøkelser med interferonpreparater av na-turlig materiale, hvorved det dog har opptrådt alvorlige bivirkninger. De ved disse undersøkelser anvendte preparater inneholdt selv etter svært grundig rensning komplekse blandinger av forskjellige interferoner og i mange tilfeller også andre proteiner. Årsaken ligger i at det hos noen av interferonene finnes under-typer som adskiller seg mer eller mindre fra hverandre. Således er det for eksempel av interferon-a hittil kjent mer enn 20 forskjellige typer.

Først ved fremstilling av interferonene ved genteknologiske metoder har typerene interferonpreparater latt seg undersøke.

Til disse teller også de i de kliniske tester anvendte rekombinante interferoner-o<2 (også kalt a A) .

Ved fremstillingen av human-proteiner ved hjelp av mikro-organismer har rensning av proteinene utslagsgivende betydning. Enhver tilblanding som stammer fra vertsorganismen, ville ved anvendelse av produktet på mennesker føre til immunavstøpningsre-aksjoner som kunne være livstruende. Fraskillelse av tilblandinger av denne art byr i dag dog knapt på problemer, og de yt-terst ømfintlige analytiske metoder lar endotoksiner påvise i de minste konsentrasjoner. Også på området interferonforskning er det utviklet rensemetoder som gjør det mulig å tilveiebringe interferonpreparater som inneholder så godt som ingen endotoksiner mer. Eksempelvis kan her nevnes arbeidet av Staehelin et al, J. Biol. Chem., 256, 9750 (1981).

Alle rek. a-interferoner som er anvendt for kliniske tester er praktisk talt endotoksinfrie.

Desto mer overraskende var derfor opptreden av bivirkninger som til og med har gjort det nødvendig med avbrudd av interferon-behandlingen. Noen rak. a-interferoner viste seg overraskende nok å være immunogene. Antistoffer mot interferonet var blitt stimulert.

(Quesada et al., J. Nati.. Cancer Inst., 70, nr. 6, 1041-1046 [1983]; Protzman et al., J. Immunol. Methods 75, 317-323

[1984] ) .

Disse antistoffer kan føre til farlige resultater hvis de influerer på virkningen av interferonet. De innvirker da nemlig ikke bare på rek. a-interferonet, men da rek. a-interferonet er identisk med det kroppsegne interferon, også i like stor grad på det kroppsegne interferon.

I denne forbindelse er det betenkelig at disse antistoffer også virker videre etter avslutning av interferon-behandlingen og kan forverre sykdomsforløpet, svekke det kroppsegne forsvar mot virusinfeksjoner og dermed gjøre organismen lettere mottage-lig for videre infeksjoner.

Disse virkninger ble allerede bekreftet i dyreforsøk. For

å kunne ha en maksimal legemiddelsikkerhet må man derfor kreve at rek.-interferon-a^ er typerent, praktisk talt endotoksinfritt og sist, men ikke minst, ikke-immunogent.

Oppgaven for foreliggende oppfinnelse var altså å utvik-

le en fremgangsmåte for fremstilling av et ikke-immunogent, antiviralt og immunregulatorisk virksomt rek. a-interferon.

Årsaken til immunogeniteten til de nevnte a-interferoner er. ikke kjent. Det kan bare utelukkes at endotoksiske tilblandinger er ansvarlig for denne.

De preparater som er anvendt for testing adskiller seg pri-mært ved svært små variasjoner i sin aminosyresekvens.

Ved siden av de strukturelle forskjeller i primærstrukturen til de klinisk benyttede proteiner er det kjent at det ved gen-teknologisk fremstilte a-interferoner alltid dreier seg om en blanding av monomere, lavmolekylære, reduserte og oligomere former av interferonet (se for eksempel EPA 108 585, 110 302 og 118 808). Noen av disse former viser in vitro like, andre imidlertid også reduserte virkninger, og noen sies å ikke være i be-sittelse av mulige immunogene egenskaper (se EPA 108 585 og 110 302).

I de nevnte patentsøknader er det beskrevet fremgangsmåter for å fraskille disse interferonformer.

I EPA 108 585 beskrives en fremgangsmåte for separering av en "Slow moving monomer" og av oligomerer, ved hvilken interfe-ronprøven ved en pH-verdi på 3-5 inkuberes en viss tid ved en temperatur på 28-40°C.

EPA 110 302 beskriver en fremgangsmåte ved hvilken monomer-en dannes av oligomerene ved reduksjon med et redoks-system.

I EPA 118 808 renses rekombinant interferon-a ved hjelp av metallchelatharpikser fra de oligomere former.

De i henhold til disse fremgangsmåter oppnådde feroner skulle inneholde monomert interferon i nesten kvantitativ form; immunogenitetstester foreligger imidlertid ikke.

Inngående egne analytiske undersøkelser har vist at det ved rekombinant fremstilte a-interferoner dreier seg om en blanding av forskjellige interferonformer i vekslende konsentrasjoner.

Til disse hører oligomerer, tetramerer, trimerer og dimerer av interferonet, metionin-interferon, reduserte former og bruddstykker av interferonet og overraskende også forskjellige monomere former av interferonet.

Hos oligomerene dreier det seg om a-interferoner med en mo-lekylvekt på > 70 000, ved de reduserte a-interferoner om proteinet med frie SH-grupper og ved metionin-interferonet om et a-interferon som ved den N-terminale ende i tillegg bærer et metionin (betinget av den mikrobiologiske fremstilling av a-interferonet).

De forskjellige monomere former utgjør forskjellige S-S-isomerer av a-interferon, noe som er vist ved analyse.

For å skjelne disse isomerer språklig blir i det følgende uttrykket ikke-nativ monomer anvendt for isomerene av den hovedsakelig forekommende a-interferon-monomer og denne betegnet som nativt monomert a-interferon. Med dette skal det dog ikke utelukkes at de ikke-native monomerer likeledes også kan fore-komme i det "naturlige" materiale.

Ved en E. coli-fermenteringssats for fremstilling av interferon-a2 lot det seg for eksempel påvise minst 7 forskjellige interferonkomponenter (K 1 - K 7).

Analysen viste at det dreier seg om oligomerer, di-/trimerer, metionin-interferon, reduserte interferoner og om en S-S-isomer av det nativ-monomere interf eron.-a^, som hver oppviser en disulfidbro mellom aminosyrene i posisjon 1 og 98 og 29 og 138 (se også Wetzel et al., J. Interferon. Res., Vol. 1, nr. 3, 381-391 (1981).

Som allerede angitt ovenfor, er årsaken til immunogeniteten til rek» a-interferon ikke kjent. Det er dog også nærliggende at alle formene til a-interferon virker immunogent, som atskiller seg fra de kroppsegne. Til disse hører også de lavmolekylære, dimerene og oligomerene og også de ikke-native monomerer som inneholder annerledes tilknyttede disulfidbroer.

Så lenge årsakene til immunogeniitet ikke er oppklart ennå, skal det ved fremgangsmåten for fremstilling av rek. a-interferoner ikke anvendes noen betingelser som kunne kreve dannelse av disse, i sin virkning ukjente former. Det vil si at også rensning av interferonet må utføres under de mest skånende betingelser, som ikke setter nativiteten i fare. Forhøyet temperatur og reduksjonsmidler hører ikke til disse betingelser.

Selvfølgelig må man ved alle rensetrinn sørge for at det ik-ke føres inn noen fremmedstoffer, eksempelvis ved anvendelse av metallchelatharpikser eller lignende problematiske reagenser.

Gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant a-interferon, som er karakterisert ved de i krav 1 angitte kjennetegn. Fremgangsmåten er egnet til fremstilling og rensning av a-interferoner av forskjellige arter, for eksempel human- eller dyre-a-interferoner. Den for fremstillingen anvendte vertsorganisme kan være en prokaryot eller eukaryot, eksempelvis E. coli eller Saccharomyces cerevisiae, fortrinnsvis E. coli. Dyrkningsbetingelsene for de forskjellige vertsorganismer er godt kjent for fagmannen.

Det ble overraskende funnet at veksttiden ikke bare har innflytelse på utbyttet av a-interferon, men fremfor alt også er medansvarlig i avgjørende grad for hvordan interferonblandingen er sammensatt. Således endret eksempelvis sammensetningen av interferonblandingen seg ved anvendelse av E. coli hva angår mengden av metionin-interferon alt etter varigheten av veksten.

Fordelaktig kontrolleres derfor fermenteringssatsen med korte tidsmellomrom angående dannelse av a-interferonderivater som fremkalles av vertsorganismen, som indikator for den beste veksttid. Metionin-interferon kan tjene som én slik indikator. Ved tidsriktig avbrudd, for eksempel etter dannelse av mindre enn 20 %, fortrinnsvis av mindre enn 5 %, særlig å foretrekke mindre enn 1 %, metionin-interferon, får man derfor allerede et særlig rent interferon med ideelle forutsetninger for den etterfølgende renseprosess i henhold til oppfinnelsen.

Særlig godt egnet er fremgangsmåten til fremstilling av sy-restabilt a-interferon. I denne forbindelse kan eksempelvis fremgangsmåten i henhold til DE 34 12 196.9, ved hvilken cellene ødelegges ved pH 2 i en homogenisator, anvendes.

Ved anvendelse av en tandem-kromatografi, dvs. med etter hverandre koblede kromatografiske trinn med forskjellige adsorp-sjonsmidler, med egnede vaske- og elueringsløsninger, kan en stor del av forurensningene overraskende nok fraskilles. Fortrinnsvis blir da én kombinasjon av en cellulose-for-kolonne anvendt som er direkte forbundet med en affinitetskolonne. Særlig foretrukket er en DE-52-cellulose med et til en bærer, for eksempel Sepharose, koblet monoklonalt anti-interferon IgG-antistoff, som for eksempel det EBI 1 antistoff som er beskrevet i BRD-off.-skrift 33 06 060.

Som egnet vaskeløsning har for eksempel en TRIS/NaCl-puffer pH 7,5 vist seg å være, men det er også vaskeløsninger som er egnet som'ikke influerer på bindingen av interferonet til antistoffet, men som allikevel vasker ut forurensningene og lar de be-standdeler som har negativ innflytelse på egenskapene til antistoffkolonnen, forbli bundet til forkolonnen.

Et egnet elueringsmiddel for interferonet er eksempelvis en pufferløsning av 0,1 M sitronsyre i 25 %ig etylenglykol, men også andre elueringsmidler er egnet som har lignende egenskaper. Generelt må elueringsmidlet være avstemt til det a-interferon som skal renses.

En del av forurensningene til "tandem-eluatet" lot seg overraskende allerede skille fra ved avpufring av pH-verdien til 4,0-4,8, særlig fordelaktig til pH 4,5. pH-verdien bør velges slik at det i bunnfallet finnes minst mulig av monomert a-interferon.

Sluttrensning.en av interferonet lot seg oppnå ved kromatografi på en kationebytter, fortrinnsvis med en M0N0-S, type HR 10/10 kationebytter. For eluering av det høyrensede a-interferon ble det anvendt en flat trinngradient med en flyktig puffer, eksempelvis en ammoniumacetatpuffer, hvor pH-verdien var konstant og konsentrasjonen ble variert (konsentrasjonsgradient). Like godt lot også konsentrasjonen seg holde konstant og pH-verdien variere (pH-gradient). Det er avgjørende at elueringsmidlet er i stand til å separere interferontilblandinger, særlig S-S-isomerer av de hovedsakelig opptredende monomerer. Særlig godt egnet er for dette formål en flat konsentrasjonsgradient av en ammoniumacetatpuffer, fremstilt av 0,1-1,0 M, fortrinnsvis av 0,1-0,5 M ammoniumacetat i et pH-område på 4,0-5,0, fortrinnsvis på pH 4,5. Denne puffer kan dessuten fjernes ved lyofilisering, slik at de høyrensede a-interferoner for første gang kan oppnås i fast form, fri for puffersalter og fellingsmidler.

Særlig godt egnet er fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen til fremstilling av a-interferoner av forskjellige arter, som etter anvendelse i de tilsvarende arter ikke stimulerer noen antistoffer .

Fremgangsmåten i henhold til. oppfinnelsen gjelder fremstilling av et rekombinant, homogent, rent og ikke-immunogent a-interferon som er fritt for reduserte former og bruddstykker av interferonet, som oppviser mindre enn 0,2 % oligomerer og mindre enn 2 % dimerer/trimerer/tetramerer og mindre enn 5 % metionin-interferon og ved hvilket mer enn 90 % av monomerinnholdet består av nativ-monomert a-interferon.

Som særlig fordelaktig lar fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen seg anvende ved fremstilling av et a-interferon som beskrevet ovenfor, hos hvilket vertsorganismen inneholder det gen som koder for human-a-interferonet i overensstemmelse med aminosyresekvensen:

og det nativt monomere a-interferon i hvert tilfelle oppviser en disulfidbro mellom cysteinene i posisjon 1 og 98 og 29 og 138.

Betinget av valget av vertsorganisme og arten av

fermenteringsbetingelsene kan rekombinant fremstilte a-interferoner ved siden av metionin-interferonet også inneholde di-, tri-, tetra- og oligomere, reduserte former og bruddstykker og S-S-isomerer av det hovedsakelig opptredende monomere a-interferon i vekslende mengder, som, som beskrevet, for første gang kan undertrykkes, respektive fjernes, i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Rekombinante a-interferoner som fremstilles ved oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis ingen oligo-, tetra-, tri- og dimerer, fortrinnsvis inneholder de mer enn 90 % nativ monomer, og fortrinnsvis er de fullstendig fri for S-S-isomerer av det nativ-monomere a-interferon.

Ved oppfinnelsen fremstilles således rekombinante a-interferoner av forskjellige arter, som etter anvendelse i de aktuelle arter ikke stimulerer noen antistoffer, likeså faste interferoner.

Foretrukket er et rekombinant human-a-interferon med de ovenfor beskrevne egenskaper, fortrinnsvis et rekombinant human-a-interferon ifølge aminosyresekvensen

Særlig foretrukket er et rekombinant, ikke-immunogent, fast human-a-interferon, som tilsvarer aminosyresekvensen

og foreligger i homogen, ren form, med mindre enn 5 % metionin-interf eron , som er fritt for reduserte former og bruddstykker av interferonet, med mindre enn 0,2 % oligomerer og mindre enn 2 % dimerer/trimerer/tetramerer og ved hvilket mer enn .95 % av monomerinnholdet består av det nativ-monomere a-interferon med i hvert tilfelle en disulfidbro mellom cysteinene i posisjon 1 og 98 og 29 og 138. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen muliggjør separering av forurensningene og interferon-innblandingene under de mest skånende betingelser. Den skal nærmere forklares ved som eksempel å benytte interferon-a2Arg i henhold til aminosyresekvensen

men også andre a-interferoner kan fremstilles og renses ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, om nødvendig med små modi-fikasjoner som ikke hører inn under oppfinnelsen.

Den syreutfelte dypfrosne biomasse ble opptinet ved røring

i 1-prosentig eddiksyre. Disse og alle de etterfølgende manipu-lasjoner ble utført ved ca. 5°C.

Ekstraksjonen av proteinet fra cellene foregikk, som utfør-lig beskrevet i DRB-off.skrift 34 32 196.9, ved oppbrytning av bakteriecellene i en homogenisator, tilsetning av et fellings-hjelpemiddel, for eksempel polyetylenimin PEI-600 i et konsentra-sjonsområde på 0,1-0,25 %, innstilling av pH-verdien ved hjelp av NaOH til 7,5-10,0'og røring av suspensjonen i flere timer. Deretter ble pH-ver.dlen innstilt til 7,5, råekstrakten klarnet på skånende måte ogi prøver tatt ut for proteinbestemmelse og interferon-test.

Til tross for den kjente ømfintlighet hos polypeptidene, som interferon i forhold til de skjærkrefter som opptrer ved mekaniske påvirkninger (Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 146, 249-253

(1974)) kunne denne, fremgangsmåte ved disse pH-betingelser overraskende gi høye utbytter av rå-interferon.

Kontroll av forskjellige fermenteringssatser viste at sammensetningen av blandingen endret seg i avhengighet av fermenteringsbetingelsene.

Særlig andelen; av komponent 1, metionin-interferon-a, en knapt separerbar komponent, endret seg med varigheten av fermenteringen: metioninr-interferon-a ble først dannet etter 8-9 timers fermenteringsvarighet.

Ved tidsriktig avbrudd av fermenteringen er det også mulig

å oppnå interferonpreparater som ikke inneholder noe metionin-interf eron.

Til den klarnede råløsning ble det under røring tilsatt fast ammoniumsulfat tiII 6 5 % metning. Etter fullstendig oppløsning av ammoniumsulfatet ble satsen holdt avkjølt natten over, bunnfallet som hadde: dannet seg, ble fraskilt og oppbevart ved -20°C til videre anvendelse.

Fra det klare; overstående materiale ble det igjen tatt ut prøver for interférontesten, for å kontrollere fellingen av interferonet. Det skulle ikke bli igjen mer enn 5 % av interferonet i det overstående.

Ammoniumsulfat-pelleten ble oppløst i 0,01 M NaCl, pH-verdien ble justert til. 7,5 med NaOH og løsningen omrørt i 2 timer. Den uløselige andel' ble skilt fra og eventuelt ekstrahert igjen med 0,01 M NaCl.

De kombinerte? klare løsninger ble dialysert ved hjelp av en steril, pyrogenfri. dialyseringspatron mot 0,01 M NaCl. Osmolari-teten til interferon-løsningen skulle etter 2-3 gangers gjennom-føring utgjøre ca.. 390-430 mOsmol/1. Av den klarnede løsning ble det tatt ut alikvoÆer for interferon-testen.

For ytterligere rensning ble det anvendt "tandem-kromatografi"; en kombinasjon av en cellulose-forkolonne og en etter-innkoblet affinitetskromatografi med høyspesifikke, monoklonale antistoffer. Forkolonnen, en ionebytte-kolonne, tjente til å holde vekk tungtløselige prøvebestanddeler fra antistoffkolonnen.

For forkolonnen ble DE-52-cellulose (Fa. Whatman) rørt godt med TRIS/NaCl-puffer, pH 7,5 og fylt i en kromatografi-kolonne. Absorbenset ble vasket med pufferen inntil eluatet ikke lenger viste noen pH- og osmolaritetsendringer. For forkolonnen ble det anvendt 0,5-1,0 g DE 52-Cellulosei 0,025 M TRIS/HC1 + 0,2 M NaCl pr. gram biomasse; den ble friskt tilberedt for hver rensning .

For antistoffkolonnen ble monoklonalt anti-interferon-IgG som var utvunnet fra muse-ascites og renset, koblet til BrCN-aktivert Sepharose 4B som bærer. Det ferdige ko-

lonnemateriale ble oppbevart i fosfatpufret koksaltløsning (PBS) med natriumazid i kjølerom. Før første gangs bruk eller etter lang oppbevaring ble antistoffkolonnen vasket med 0,1 M sitronsyre i 25 % etylenglykol, for fjerning av eventuelle løselige andeler, og til slutt vasket nøytral med PBS. Pr. gram biomasse var det nødvendig med et kolonnevolum på 0,2-1,0 ml i antistoffkolonnen; denne kolonne kunne anvendes flere ganger. Den dialyserte interferonløsning ble først pumpet over begge kolonner (forkolonne og antistoff-kolonne) og eluatet kontrollert ved måling av ekstinksjonen ved 280 nm. Etter påføring av interferon-løsningen ble det vasket så lenge med TRIS/NaCl-puffer pH 7,5

at proteinmengden i eluatet falt til 1/20 av platå-verdien. For å kontrollere at interferonet var blitt bundet til antistoffkolonnen ble eluatet testet angående interferoninnhold. Anti-stof f-kolonnen ble etterpå skilt fra forkolonnen og vasket alene med TRIS/NaCl-puffer pH 7,5, til det i eluatet ikke kunne påvises noe protein.

Elueringen av det til antistoffet bundne interferon foregikk med 0,1 M sitronsyre i 25 % etylenglykol, hvorved ekstinksjonen av eluatet ble målt ved 280 nm. Proteintoppen som inneholdt interferonet, ble oppsamlet. Til sluttrensningen ble interferon-poolen oppbevart ved -20°C. Interferontest, proteinbestemmelse og den reverse-fase-HPLC-analyse viste at ved denne rensning ble det oppnådd 60-90 % rent IFN-a. Ved siden av oligomere former inneholdt denne interferon-pool reduserte former med frie SH-grupper, dimerer, trimerer, tetramerer og den ikke-native monomer. Disse komponenter er alle biologisk og immunologisk karakteriserbare som IFN. Overraskende nok lot en del av dis-

se komponenter seg; ved utfelling ved pH 4,5 (med ammoniakk) fjerne. Herved ble særlig andelene av komponentene med reduserte svovelbroer, redusert, også formene med frie SH-grupper (komponent 5 og 6). Analysen av dette bunnfall viser at det monomere interferon bare ble medrevet i små mengder.

For sluttrensning ble det anvendt en FPLC-apparatur fra firma Pharmacia med en MONO-S-kolonne, type HR 10/10 (kationebytter) som kunne fylles med opp til 60 mg protein. Dette kolonnemateriale utgjør en høy-effektsionebytter med fremragende skil-leeffekt og den store fordel at til tross for den relativt store mengde av protein, som skal renses, varte sluttrensningen bare få timer, pufferløsningene kunne anvendes sterilfiltrert og det kunne arbeides ved romtemperatur.

Det etter fellingen oppnådde klare overstående materiale ble påført på kolonnen. Av særlig betydning var den puffer som ble anvendt ved FPLC-separasjonen. Den måtte eluere interferon-komponentene slik at de tydelig kunne skjelnes fra hverandre og etterpå kunne fjernes fullstendig. Disse egenskaper hadde den anvendte ammoniumacetat-puffer med hvilken interferonet ble eluert 1 et gradientprogram. Interferon ble eluert som skarp topp med en svak skulder.. Såvel "skulder"-fraksjonen (K 3) som de senere eluerte andeler- (K 5 - K 7) ble skilt fra hovedtoppen til det re-ne interferon. Toppen til det rene interferon ble samlet og alikvoter tatt ut av. dette for HPLC-analyse, SDS-gelelektroforese, proteinbestemmelse, interferon-test og endotoksinbestemmelse.

Ved hjelp av denne kromatografi ble praktisk talt alle komponenter skilt fra hovedtoppen og et homogent interferon oppnådd som ved gelgjennomtrengnings-HPLC viste et monomerinnhold på over 99 %. Revers-fase-HPLC viste bare ca. 1 % av den ikke-native monomer, kromatofokuseringen en andel av 2,5 % ikke-nativ monomer.

MONO-S-kolonnen ble før gjenanvendelsen vasket med 0,5 M NaCl + 0,1 M Na— fosfat, pH 8,0, for å fjerne adsorberte forurensninger; den ble oppbevart i 25 % etanol.

Den flyktige- puffer kunne fjernes fullstendig ved lyofilisering. For dette, ble IFN-pooten fylt i porsjoner på opp til høyst 2 ml i autoklaverte lyo-ampuller (volum 8 ml); dette tilsvarte pr. ampulle en mengde av 1 til ca. 8 mg rent interferon. Ampul-lene ble så forsynt med forhåndsvaskede og autoklaverte lyo-propper og avkjølt til minst 20°C. Lyofiliseringen foregikk ved -10°C og et vakuum på under 1 Torr. Etter fjerning av puffer-løsningen ble temperaturen hevet til 25°C, og det ble lyofilisert videre i minst 1 time. Vakuumet ble opphevet og proppene straks trykket fast til. Forsynt med aluminiumdeksler ble am-pullene etterpå lagret i kjølerom eller ved -20°C.

Som det ble vist, har det ved hjelp av god fermenterings-føring (relativt tidlig innhøsting) sammen med fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for første gang blitt mulig å fremstille et interferon-a som ikke bare med hensyn til sitt interferoninnhold ligger på over 98 % renhet, men også hva homogeni-teten angår, regnet på de forskjellige interferonkomponenter, består i en grad av mer enn 95 % av nativt monomert interferon-a.

Denne høye renhets- og homogenitetsgrad muliggjorde i tillegg at interferon for første gang kunne oppnås, fritt for salter og pufferbestanddeler, i fast form. Det er derfor for første gang mulig å lagre a-interferon i måneder uten stabilisatorer, noe som byr på betydelige fordeler, hva lagring, forsendelse og ikke minst for de galeniske utviklinger, i forhold til de hittil alltid med albumin stabiliserte interferoner. Også etter 11 måneders lagring ved 4°C kunne det ikke fastslås noe innholdstap.

Ved det i EPA 83 734 beskrevne krystalline human-leukocytt-interferon dreier det seg om krystaller av polyetylenglykol som fellingsmiddel med interferon, dog ikke om rent, homogent og krystallinsk interferon slik tittelen kunne få en til å tro.

Det i henhold til oppfinnelsen fremstilte interferon-a ble som kjent oppløst ved tilsetning av human-serum-albumin, sterilfiltrert og fordelt aseptisk på flasker; alt etter anvendelse i egnede konsentrasjoner.

Ved de kliniske undersøkelser viste det ved hjelp av oppfinnelsen fremstilte interferon-a seg som ikke-immunogent og fremragende tolererbart.

I alt ble inntil januar 1985 75 pasienter behandlet med det ikke-immunogene interferon-a: 58 pasienter med tumorindikasjoner og 17 med virale indikasjoner.

Ikke hos en eneste pasient ble antistoffer stimulert under terapien, hvorved behandlingens varighet delvis utgjorde 15 uker

og mer, opp til 35' uker.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gjorde det for første gang mulig å tilveiebringe et høyrent, regnet på det native monomere interferon homogent, fast, fritt for salter og pufferbestanddeler og; ikke-immunogent interferon-c^ •

Aminosyresekvensanalysen i henhold til kjente metoder gav følgende aminosyresekvens:

De følgende: eksempler skal belyse oppfinnelsen nærmere, uten på noen måte å begrense den.

Fremfor alt med hensyn til fermenteringssatsen er fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ubegrenset anvendelig innen vide grenser.

Således er det likeledes mulig å anvende biomasse fra andre vertsorganismer, som etter den mekaniske oppslutning gir sammen-lignbare IFN-utbytter og hos interferoner, som på lignende måte reagerer spesifikt med det EBI-l-monoklonale antistoff, for eksempel IFN-a^. Også andre interferoner med svak homologi med interferon-a lar seg ved anvendelse av et tilsvarende høyspesifikt monoklonalt antistoff rense ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen .

Gjenstand for: foreliggende oppfinnelse er i detalj fremgangsmåter til fremstilling av rekombinant a-interferon som er karakterisert ved at den vertsorganisme som inneholder interferon-genet dyrkes under vanlige betingelser, cellene drepes etter vanlig veksttid og innhøstes, det eksprimerte interferon fraskilles på vanlig måte, cellerester fraskilles i svakt alkalisk miljø, interferonet konsentreres og forhåndsrenses ved hjelp av en tandem-kromatografi, eluatet innstilles til pH 4,0-4,8 for fraskillelse av forurensninger, interferonet sluttrenses ved kromatografi på en kationebyttesøyle med en flyktig puffer som elueringsmiddel og lyofiliseres deretter.

Vertsorganismen som anvendes ved fremgangsmåten er fortrinnsvis E. coli; cellene drepes etter en veksttid, i hvilken ikke mer enn 20 %, fortrinnsvis ikke mer enn 5 %, særlig foretrukket ikke mer enn 1 % metionin-interferon dannes.

Cellene ødelegges i en homogenisator ved pH 2 og interferonet fraskilles.

Ved en utførelsesform består tandem-kromatografien av en cellulose-forkolonne og en affinitetskromatografi, og den substans som skal renses over begge kolonner vaskes med en egnet vaskeløsning, og deretter elueres a-interferonet med et egnet elueringsmiddel fra affinitetskolonnen.

I en utførelsesform fylles forkolonnen med DE-52 cellulose, affinitetskolonnen med et monoklonalt anti-interferon-IgG-antistoff som er koblet til en bærer, og den substans som skal renses, vaskes med en TRIS-NaCl-puffer, pH 7,5 over begge kolonner, og etterpå elueres a-interferonet med 0,1 M sitronsyre i 25 %ig etylenglykol fra affinitetskolonnen.

Fortrinnsvis anvendes det monoklonale antistoff EBI 1.

Det er å foretrekke at eluatet fra tandem-kromatografien innstilles til pH 4,5 for fraskillelse av forurensninger.

For sluttrensning anvendes fortrinnsvis en MONO-S, type HR 10/10 kationebytter.

For eluering anvendes fortrinnsvis en flat konsentrasjonsgradient fremstilt av 0,1-1,0 M, fortrinnsvis av 0,1-0,5 M, ammoniumacetat-puffer ved pH-verdier på 4,0-5,0, fortrinnsvis ved pH 4,5.

En utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et fast a-interferon.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et ikke-immunogent a-interferon.

En annen fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen går ut

på å fremstille et rekombinant, homogent, rent a-interferon som oppviser mindre enn 5 % metionin-interferon, som er fritt for reduserte former og bruddstykker av interferon, som inneholder mindre enn 0,2 % oligomer og mindre enn 2 % dimer/trimer/tetramer og ved hvilket mer enn 90 % av monomerinnholdet består av nativ-monomert interferon.

En ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant, homogent,

rent human-a-interferon av aminosyresekvensen:

som oppviser mindre enn 5 % metionin-interferon, som er fritt for reduserte former og bruddstykker av a-interferon, som inneholder mindre: enn 0,2 % oligomer og mindre enn 2 % dimer/- trimer/tetramer og ved hvilket det nativ-monomere a-interferon i hvert tilfelle oppviser en disulfidbro mellom cysteinene i posisjon 1 og 98 og 29 og 138.

Det rekombinante human-a-interferon som fremstilles i henhold til oppfinnelsen har fortrinnsvis følgende aminosyresekvens:

Det foreligger i homogen, ren form, har mindre enn 5 % metionin-interf eron, mindre enn 0,2 % oligomerer og mindre enn 2 % dimerer/trimerer/tetramerer, det er fritt for reduserte former og bruddstykker av a-interferonet og mer enn 90 % av monomerinnholdet av det nativ-monomere a-interferon består med i hvert tilfelle en disulfidbro mellom cysteinene i posisjon 1 og 98 og 29 og 138.

a-interferonet som fremstilles i henhold til oppfinnelsen er anvendelig ved terapeutisk behandling av virale og tumorale sykdommer.

Farmasøytiske midler for terapeutisk behandling vil inneholde et a-interferon fremstilt i henhold til oppfinnelsen og et eller flere farmasøytiske, inerte hjelpe- og/eller bærerstoffer.

Eksempel 1

(E. coli; IFN-a2Arg; 28°C)

a) 251 g syrefelt biomasse, som var lagret ved -20°C, ble

tatt opp i 2500 ml av 1-prosentig eddiksyre, omrørt 1/2 h i isbad og homogenisert 2x1 min. ved hjelp av Ultraturax type 45/6. Polymin P ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon av 0,25 %, pH-verdien justert til 10,0 med 5 N NaOH og omrørt 2 h i isbad, og til slutt ble pH-verdien tilbakejustert til 7,50 med 5 N HC1. 1 times sentrifugering i en Christ Cryofuge 6-6 S ved 4°C og 3000 opm gav 2540 ml klar råekstrakt med et interferoninnhold på 17,1 x IO<9> I.E. (=100 %) og et protein-innhold på 5330 mg, hvorav det kunne beregnes en spesifikk aktivitet på 3,21 x 10^ I.E./mg protein.

b) Ammoniumsulfat ble tilsatt til 65-prosentig metning (430 g/ liter ekstrakt). Blandingen ble oppbevart natten over ved

4-8°C og bunnfallet som hadde dannet seg, avsentrifugert innen-for en halv time i. en Beckmann J 2-21 Highspeed sentrifuge,

Rotor JA 10 ved 4°C, 10 000 opm. Det klare overstående materiale, 3120 ml, inneholdt 0,7 % av det i råekstrakten inneholdte interferon (120 x IO<6> I.E.).

Pelleten ble tatt opp i 0,01 M NaCl og, rørt i 2 h ved 4-8°C. pH-verdien ble innstilt til 7,50 med 5 N NaOH og løsningen sent-rifugert klart, som beskrevet ovenfor. Den klare løsning ble ved hjelp av en dialyseringspatron (Nephross Allegro, firma Organon Technika)' dialysert mot 0,01 M NaCl på 390 mOsmol/1. Interferoninnhol'det var 13,3 x 10<9>I.E. 77,6 %) .

c) Dialysatet ble deretter kromatografert (tandem-kromatografi). For forkolonnen'ble det anvendt 125 g DE 52-cellulose-pulver fra

firma Whatman i TRIS/NaCl-puffer pH 7,5 (0,025 M TRIS/HC1 + 0,2 M NaCl); dette tilsvarte 0,5 g kolonnemateriale/g biomasse. For affinitetskolonnen ble det anvendt monoklonalt anti-interferon-IgG (EBI 1) somi var koblet til Br-CN-aktivert Sepharose 4 B (firma Pharmacia). Det ferdige kolonnemateriale ble oppbevart i fosfatpufret koksalVtløsning (PBS) med natriumazid ved 4-8°C. Før anvendelsen ble antistoffkolonnen vasket med 0,1 M sitronsyre i 25 % etylenglykol og deretter spylt nøytralt med PBS. Pr. gram biomasse var det ved antistoffkolonnen nødvendig med et kolonnevolum på 0,2-1,0' ml. Den dialyserte interferonløsning ble først pumpet over begge^ kolonner (forkolonne og antistoffkolonne) og eluatet kontrollert ved måling av ekstinksjonen ved 280 nm. Etter påføring av interferonløsningen ble det vasket med TRIS/NaCl-puf fer pH 7,5, inntil proteinmengden i eluatet var falt til 1/20 av platåverdien. Antistoffkolonnen ble deretter skilt fra forkolonnen og vasket alene med TRIS/NaCl-puffer pH 7,5 til det i eluatet ikke kunne påvises mer protein.

Elueringen av, det til antistoffet bundne interferon foregikk med 0,1 M sitronsyre i 25 % etylenglykol, hvorved ekstinksjonen for eluatet igjen, ble undersøkt ved 280 nm. Proteintoppen som inneholdt interferonet ble oppsamlet. Man oppnådde 16,8 ml eluat med et interferoninnhold på 12,3 x lo<9>I.E. (=' 71,9 %). Den totale proteinmengde utgjorde 54,4 mg, hvorav man kunne bereg-

ne en spesifikk aktivitet på 226 x 10^ I.E./mg protein.

d) For ytterligere rensning ble eluatet justert til pH 4,5 med ammoniakk og bunnfallet skilt fra. Det klare overstående materiale (18,3 ml) inneholdt 46,3 mg protein og en interferonandel på 11,8 x 10 Q I.E. regnet på råproteinet. Dette tilsvarte et utbyt-te på 65 % (255 x IO<6> I.E./mg protein). e) For sluttrensning ble det anvendt en FPLC-apparatur fra firma Pharmacia med en MONO-S-kolonne, type HR 10/10 (kationebytter).

Det klare overstående materiale som ble oppnådd etter fellingen ble påført på kolonnen som var forhåndsvasket med 0,1 M ammoniumacetatpuffer, pH 4,5-5,0 og vasket inntil ekstinksjonen ved 280 nm var gått tilbake til utgangsverdien. Elueringen av det absorberte interferon foregikk med en flat saltgradient ved tilblanding av 0,5 M ammoniumacetatpuffer, pH 4,5-5,0. Interferon ble eluert som skarp topp. Såvel "skulder"-fraksjonen (K 3) som de senere eluerte andeler (K5 - K7) ble skilt fra hovedtoppen av det rene interferon. Toppen av det rene interferon ble samlet opp, og av denne ble det tatt alikvoter for HPLC-analyse, SDS-gelektroforese, proteinbestemmelse, interferon-test og endotoksinbestemmelse. I "skulder"-fraksjonen (9,1 ml) ble det i alt fastslått 4,1 mg protein; interferoninnholdet var 1,3 3 x 10q I.E. (7,7 %). Av dette kunne man slutte seg til 324 x IO<6> I.E./ mg protein.

Hoved-poolen på 9,8 ml inneholdt 5,18 x 10<9>I.E. (30,3 %)

av det reneste interferon og i alt 16,1 mg protein. Av dette fremkom en spesifikk aktivitet på 322 x 10^ I.E./mg protein.

f;a) IFN-poolen ble i porsjoner på opp til høyst 2 ml fylt i autoklaverte Lyo-ampuller (volum 8 ml), hvilket pr. ampulle tilsvarte en mengde på 1 og opp til ca. 8 mg rent interferon. Am-pullene ble så forsynt med forhåndsvaskede og autoklaverte Lyo-propper og avkjølt til minst -20°C. Lyofiliseringen foregikk ved -10°C og et vakuum på under 1 Torr. Etter fjerning av puf-ferløsningen ble temperaturen .øket til 25°C, og det ble videre-lyofilisert i minst 1 time. Vakuumet ble opphevet og proppene straks trykket fast til. Forsynt med aluminium-deksler ble am-pullene deretter lagret i kjølerom eller ved -20°C.

/3) For undersøkelse av stabiliteten ble fire forskjellige fermenteringssatser lyofilisert, uavhengig fra eksempel la-f;a men renset på analog måte.

Lyofilisatene ble oppløst i IRMA-fortynningspuffer og analysert ved hjelp av NK2-IRMA for humant IFN-alfa (firma Celltech

U.K.).

Lyofiliseringen gav altså ingen tap. Etter 11 måneders lagring av lyofilisatet; ved ca. 4°C (i kjøleskap) ble det oppløst i 0,1 M ammoniumacetat og kontrollert med hensyn til renhet (ved gelgjennomtrengning-HPLC)som innhold (ved NK2-IRMA-tester).

Eksempel 2

For kontroll av fermenteringstidens innflytelse på sammensetningen av interferonkomponentene ble det fra en fermenteringssats (E. coli HB 101; 28°C) tatt prøver etter 8, 9, 10 eller 11 timer, i henhold til den vanlige teknikk ved pH 2 utfelt med syre og opparbeidet og? analysert i henhold til metodikken ifølge oppfinnelsen. Den følgende tabell viser innholdet i prøvene av Kl, K 2 og K 3 (;K. 1: Met - I FN, K 2: nativt IFN; K 3: ikke-nativt IFN). Verdiene ble oppnådd ved hjelp av kromatofokusering.

Eksempel 3

Kobling av EBI- 1- antistoff til CNBr- aktivert

Sepharose 4 B ( kfr. DE- off. skrift 33 06 060)

EBI-l-antistoff ble først oppløst med 0,5 M NaCl/0,2 M NaHCO-j, pH 8,4 (i minst mulig puffer) og dialysert mot puf feren til det ikke lenger kunne påvises noen sulfationer i eksternløs-ningen med bariumklorid. En omhyggelig fjerning av ammoniumsulfatet var absolutt nødvendig, da ammoniumioner forstyrret den på-følgende kobling til bæreren. Proteinkonsentrasjonen ble så innstilt til 5 mg/ml med puffer. For kobling ble det som bærer anvendt CNBr-aktivert Sepharose 4 B . Denne ble i hen-

hold til forskriften fra produsenten (følgeseddel) forhåndsvasket. For hver 25 mg EBI-l-antistoff ble det anvendt 1 g aktivert Sepharose. Koblingen foregikk i ovennevnte puffer, pH 8,4 ved romtemperatur i 2 timer. Deretter ble EBI-l-Sepharose i henhold til forskriften på følgeseddelen avnutsjet og vasket. I filtrat-et måtte det ikke være igjen mer enn 5 % av det anvendte EBI-l-antistof f. Den ferdige EBI-l-Sepharose ble oppbevart i PBS/azid i kjølerom.

PBS/ azid:

PBS: 7,30 g, natriumklorid p.a. (Merck 6404)

3,00 g Na2HP04 x 2 H20 p.a. (Merck 6580)

1,15 g NaH2P0^ x H20 p.a. (Merck 6346) oppløst og

fylt opp til 1000 ml; pH 7,0

Azid: Til PBS ble det tilsatt 1,0 g/l natriumazid av reneste type (Merck 6688).

Den ferdige løsning ble sterilfiltrert (0,2 pm porevidde) og oppbevart i kjølerom.

Interferon- antlstoff- assay ( nøytralisasjons- assay)

Materiale

Celler

Human-lunge-karsinom-celler "A-549" ATGC CCL 185.

Virus

Encephalomyocarditis virus (EMC), ATCC VR 129.

Interferon- standard

HS-11 (1 ampulle "HS-11" = lyofilisert Hu IFN ra-A, tatt opp

i 1,2 ml H20>,i gir 12 000 iU/ml)

Vevskulturpla- ter

96 skåler med. lokk, flat bunn, Corning, New York, nr. 25 860, skål-diameter: 6,4 mm, vevskultur behandlet.

Medier

DMEM = Dulbecco's modifisert Eagle Medium, med glutamin, uten natriumbikarbonat, Flow Kat. nr. 10-331-24 (1F-017D)

HEPES Sigma nr.. H-3375

TRICINE Calbiochem nr. 33468, kvalitet A

FCS = føtalt kalveserum Boehringer Mannheim

HUMANSERUM-ALBUMIN Behring Inst., 20 %, for infusjon antibiotikum, Tlamulinhydrogenfumarat Biochemie Kundl/Tirol, Østerrike (Sandoz C.)

Vekstmedium: DMEM = 10 % FCS/inaktivert 30 min/56°C

Assay-medium: Som vekstmedium, men 5 % FCS istedenfor

10 % og tilsetning av 5 ug Tiamulin/ml

Fortynningsmedium: Vekstmedium uten serum, med

5 ug/ml Tiamulin

Virus-medium: vekstmedium uten serum ; med 5 ug/ml Tiamulin og med 3,5 mg/ml human-serum-albumin.

Cellene ble behandlet som en permanent cellelinje. Det ble forplantet ved trypsinisering og fortynning i vekstmediet. For utførelse av assay ble cellene hellet i hemocytometer og suspen-dert i assay-medium slik at man skulle oppnå en podeløsning på 4 - 5 x 10^ celler pr. ml pr. skål; denne ble fordelt på platene. Inkuberingen ble foretatt i en atmosfære av 5 % CO2 og 80 % luft-fuktighet ved 37°C.

Etter 8-24 h var monosjiktet vanligvis fullstendig. På dette tidspunkt ble interferon og serumfortynningene forberedt i ad-skilte reagensrør.

For kontrollplaten ble HS-11 fortynninger på 1 : 1000,

1 : 2000 ..... til 1 : 32 000 inkubert ved 37°C i 1 h.

For prøveplaten ble serumprøvene fortynnet til 1:4,1:8

..... til 1 : 64 med et fortynningsmedium som inneholdt så meget HS-11 at man oppnådde en sluttkonsentrasjon på 10 iU HS-ll/ml i

hvert glass, og dette ble likeledes inkubert i 1 h ved 37°C.

Platene ble dekantert og hver skål ble fylt med 100 ml av fortynningsmediet ((rad 2, 3, 10 og 11) ell er med 100 Ml av for-tynningene (rad 4 - 9). Platene ble som ovenfor inkubert i 4 h ved 37°C. Deretter ble platene oversjiktet med 100 pl av virus-mediet (uten virus), pr. skål og 50 ul av virusfortynningen (rad 3, 11, 4 - 9) for å oppnå en cytopatisk effekt på tilnærmet 90 % i løpet av 36 h og fornyet inkubert. Etter 24 h og mikro-skopisk kontroll ble cellene farvet med metylfiolett.

Resultatene er vist i figurene 12a-12f, se vedlagte skjema.

METODIKK

For analyse ble det anvendt følgende metoder: Proteinbestemmelse

BIORAD- PROTEIN- ASSAY: Denne assay anvender farvestoffet Coomassie Brilliant Blue og måler protein/farvestoff-komp-lekset ved 595 nm. Den anvendte standard er okseserumalbumin.

Planimetrisk bestemmelse for de ved 214 nm målte toppflater,

som ble opptegnet ved gelgjennomtrengnings-HPLC. Omregn-ingen foregikk ved hjelp av en faktor av kalibreringssub-stansene okseserumalbumin, ovalbumin, trypsinogen og lysozym. Denne bestemmelse ble fremfor alt foretatt i tillegg eller utelukkende på preparatene etter rensetrinnet tandem-kroma-tograf i, pH 4,5- felling og FPLC ved MONO-S.

Interferonbestemmelse

Det fra firma CELLTECH (U.K.) tilgjengelige "NK2-IRMA2

for human-interferon-a ble anvendt. Som standard tjente en laboratoriestandard "HS-11", som ved hjelp av en biologisk assay (plakk-reduksjonstest WISH-celler og vesicular stomatitis virus) ble justert til den internasjonale standard B 69/19.

SDS- gelelektroforese

Metoden til LAEMMLI (Nature 227, 680, 1980) ble anvendt. Farvestoffet som ble anvendt for farvning av proteinene var Coomassie Briliant Blue. Ved renhetskontrollene av inter-feronpreparatene ble det i hvert tilfelle anvendt 20 \ xg..

Kromatofokusering

Man anvendte metoden til Bodo og Adolf ("Separation and Characterization of Human IFN-alpha Subtype" i "The Biology of the Interferon System", s. 113-118, Elsevier 1983, utg. E. DeMaeyer og H. Schellekens), hvorved en MONO-P kromatofokuserkolonne HR 5/20 (Pharmacia) ble anvendt i et pH-område på 4-7. Pufferne inneholdt, istedenfor den angitte tilsetning av 25 % 1,2-propandiol, 25 % acetonitril for at strømningshastigheten kunne forhøyes. Registrering-en av proteinkonsentrasjonen foregikk ved 280 nm, pH-re-gistreringen foregikk automatisk. Prøvene som skulle ana-lyseres ble lyofilisert, oppløst i vann til 1 mg/ml og så fortynnet med 5 volumdeler puffer A (pH 7,1). Det ble anvendt 0,2-1,0 mg interferon pr. analyse.

Gelgjennomtrengnings- HPLC ( høytrykksvæskekromatografi)

Stasjonær fase:

WATERS 1-125, 2 x (300 mm x 7,8 mm);

10 pm partikkeldiameter

Mobil fase:

0,5 M NaoS0.

2 4

0,02 M NaH2P04, justert til pH 7,0 med NaOH

0,04 % Tween 20

25 % propylenglykol

S trømningshastighet:

0,5 ml/min

Påvisning:

UV-absorpsjon ved 214 mm

Molekylvektskalibrering:

Revers fase- HPLC ( høytrykksvæskekromatografi)

Stasjonær fase:

Bakerbond WP C 18; 250 mm x 4,6 mm; 5 nm partikkeldiameter;

30 nm porediameter

Mobil fase:.

A: 0,.I % trifluoreddiksyre i vann, pH 2,2

B: 0„1 % trifluoreddiksyre i acetonitril Gradientprogram:

0 - 2 min: 45 % B

2-32 min: 45-53 % B 32 - 40 min: 53 % B 40 - 50 min: 45 % B

S trømningshastighet:

1 ml/min

Påvisning:;

UV-absorpsjon ved 214 nm

Forklaring til figurene

Figur 1: Kromatogram for revers-fase-HPLC av det sure eluat etter, tandem-kromatografi; fremvisning av komponentene K 1 - K 7. Figur 2: Kromatogram av gelgjennomtrengnings-HPLC for det sure

eluat etter tandem-kromatografi.

Figur 3: Kromatogram for revers-fase-HPLC etter felling ved pH

4,5;; fremvisning av komponentene Kl, K2, K 3 og X 6. Figur 4: Kromatogram av gelgjennomtrengnings-HPLC etter felling ved pH 4,5. Figur 5: Kromatogram av FPLC på M0N0-S ved pH 4,5 ved hjelp av

en ammoniumacetatgradient på 0,1-0,5 M

Figur 6: Kromatogram av revers-fase HPLC til "skulder-fraksjon en" til MONO-S-toppen. Figur 7: Kromatogram for gelgjennomtrengnings-HPLC til

"skulder-fraksjonen" til MONO-S-toppen.

Figur 8: Kromatogram for revers-fase-HPLC av "hoved-fraksjonen"

til MøNO-S-toppen.

Figur 9: Kromatogram av gelgjennomtrengnings-HPLC for "hoved- fraksjonen" til MONO-S-toppen. Figur 10: Kromatogram for kromatofokuseringen til "hovedfraksjon-en" til MONO-S-toppen. Figur 11: Foto av gelelektroforesen av det sure eluat etter tandem-kromatografi såvel som av revers-fase-HPLC-atskilte komponenter K 1 - K 7.

Figur 12a - 12f:

Resultater av anti-IFN-a-antistoffer;

undersøkelser ved forskjellige indikasjoner

Figur 13: Skjema for anti-interferon-a-antistoff-assay Tabell 1: Oversikt over rensning

Tabell 2: Bedømmelse av renheten ved hjelp

av HPLC

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant, homogent, rent, ikke-immunogent, antiviralt og immunregulatorisk virksomt a-interferon som oppviser mindre enn 5% metionin-interf eron, som er fritt for reduserte former og bruddstykker av interferonet, som inneholder mindre enn 0,2% oligomerer og mindre enn 2% dimerer/trimerer/ tetramerer og ved hvilket mer enn 90% av monomerinnholdet består av nativ-monomert interferon, ved fermentering av en vertsorganisme, fortrinnsvis E. coli, som inneholder interferon-genet, fortrinnsvis det gen som koder for human-a-interferonet med aminosyresekvensen karakterisert ved at den transformerte mikroorganisme dyrkes under vanlige betingelser, cellene lyses etter en veksttid;,,, avhengig av den anvendte mikroorganisme, i hvilken ikke mer enn 20%, fortrinnsvis ikke mer enn 5%, spesielt foretrukket ikke mer enn 1%, metionin-interferon blir dannet, hvorved fortrinnsvis cellene ødelegges i en homogenisator ved pH 2 og høstes-, cellerester fraskilles i svakt alkalisk miljø, interferonet konsentreres og forhåndsrenses ved hjelp av en tandem-kromatografi, som består av en cellulose-forkolonne og en affinitetskromatografi, eluatet innstilles til pH 4,0-4,8 for fraskillelse av forurensninger, interferonet sluttrenses ved kromatografi på en kationbytterkolonne, fortrinnsvis med en MONO-S, type HR 10/10 kationbytter med en flyktig puffer som elueringsmiddel, fortrinnsvis med en flat konsentrasjonsgradient, fremstilt av 0,1-1,0 M, fortrinnsvis av 0,1-0,5 M, ammoniumacetat-puffer ved pH-verdier på 4,0-5,0, fortrinnsvis ved pH 4,5, og lyofiliseres deretter.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at tandem-kromatografien består av en celluloseforkolonne med DE-52 cellulose, og en affinitetskromatografi med et monoklonalt anti-interferon IgG-antistoff som er koblet til en bærer, særlig foretrukket med det monoklonale antistoff EBI 1, og at den substans som skal renses, vaskes over begge kolonner med en egnet vaskeløsning, fortrinnsvis med en TRIS-NaCl-puffer pH 7,5, og at a-interferonet deretter elueres med et egnet elueringsmiddel, fortrinnsvis med 0,1 M sitronsyre i 25%ig etylenglykol, fra affinitetskolonnen.

3. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at eluatet i tandem-kromatograf ien justeres til pH 4,5 for fraskillelse av forurensninger.