KR100369582B1

KR100369582B1 - 재조합알파-인터페론의정제방법

Info

Publication number: KR100369582B1
Application number: KR1019950028755A
Authority: KR
Inventors: 강수형; 박충일; 박장현; 나규흠; 박범수
Original assignee: 동아제약 주식회사
Priority date: 1995-09-04
Filing date: 1995-09-04
Publication date: 2003-04-03
Also published as: KR970015744A

Abstract

대장균에서 발현된 봉입체 형태로 회수된 α-인터페론 봉입체 용액을 활성형으로 재생시키고, 산침전시키고, 양이온 교환 크로마토그라피, 염석, 투석하고, 크로마토 포커싱하고, 겔 여과 크로마토그라피하여 정제된 α-인터페론은 다량의 대장균 숙주세포의 단백질을 비롯하여 올리고머형, 미스폴드형, 슬로우 모노머형 등의 변이체를 제거하며 특히, 등전점 변이체를 제거하여, 활성형의 α-인터페론을 고순도로 정제할 수 있으며, 공정이 간편하고 재사용이 가능하며, 수율 또한 매우 높다.

Description

재조합 α-인터페론의 정제방법

[산업상이용분야]

본 발명은 유전공학 기술로 제작된 대장균으로부터 α-인터페론을 정제하는방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 활성화 공정에 이은 산침전법, 양이온 교환 크로마토그라피, 크로마토 포커싱, 겔 여과 크로마토그라피 등의 방법을 사용하여 α-인터페론 변이체들을 효과적으로 제거하는 한편 활성형의 α-인터페론을 고순도로 정제하는 재조합 α-인터페론의 정제방법에 관한 것이다.

[종래 기술]

사람의 B임파구, 거식세포 등으로 부터 생성되는 α-인터페론은 카포시육종, 모상세포 백혈병, 악성 흑색종, 비호드킨 임파종에 대한 암치료제로 쓰이고 있을 뿐만 아니라, 만성 B형 간염, C형 간염, 및 안구감염 등에 대한 항바이러스 치료제로도 널리 쓰이고 있으며(Biotechnology, 7, 549, 1989, Brunt J.V), 이와 같은 α-인터페론으로는 유전공학기술에 의해 생산되는 재조합 α-인터페론 또는 세포배양법에 의해 생산되는 인터페론이 사용되고 있다.

이와 같이 생산되는 인터페론중 재조합 α-인터페론은 대장균과 같은 미생물로부터 대량 생산을 이를 수 있다는 장점이 있으나 숙주 세포 또는 배양 물질로부터 불순물이 오염될 수 있으므로 고순도의 의약품으로 정제하기 위해서는 까다로운 정제공정을 거쳐야만 한다. 지금까지 α-인터페론을 비롯한 여러가지 재조합 단백질들을 효과적으로 정제하기 위해 각종 크로마트그라피 공정이 기능에 따라 사용되어 왔는데 목적하는 정제 물질에 적합하도록 그 방법이 특이화되어 왔다. 기존의 α-인터페론 정제방법중 특이화된 방법으로는 단일클론 항체 면역흡착 크로마토그라피(Methods Enzymol, 119, 153, 1986, S. J. Tarnowsky et. al.)가 대표적인 사례로 들 수 있다. 이 방법은 항체-항원 반응에 따라 α-인터페론을 선택적으로 분리해낼수 있다는 장점이 있는 반면에 다음과 같은 여러가지 문제점을 가지고 있다. 첫째, 단일클론 항체를 제작하는 과정이 어렵다는 점이다. 특히 적당한 해리상수 (10^-6~10^-8M)를 가지는 단일클론 항체가 아니면 특이성이 저하되어 정제 물질의 순도가 떨어지게 되거나 또한 완전한 용출이 이루어지지 못하여 수율이 감소하게 되므로 단일클론 항체 면역흡착 크로마토그라피를 확립하기 위해서는 사전의 많은 노력이 필요하며 이에 따라 인적, 물적 투자가 상당히 요구되어진다. 둘째, 단일클론 항체에 결합한 α-인터페론을 용출하기 위해서는 필연적으로 산, 알칼리, 또는 고농도의 카오트로픽염을 사용하여야 하는데 이들에 의해 조성되는 가혹한 조건 때문에 용출되는 α-인터페론이 부분적으로 변성이 되어 생물학적 활성이 저하될 수 있으며 또한 α-인터페론과 함께 컬럼으로 부터 단일클론 항체가 동시에 용출되어져 α-인터페론 정제액을 오염시키는 단점도 있다. 셋째, 재조합 DNA 기술로 대장균과 같은 미생물에서 생산된 α-인터페론은 비활성의 봉입체 형태로 세포내에 축적되므로 활성형으로의 전환을 필요로 하는데, 이 공정중 단백질의 1차 구조는 같지만 3차 구조가 다른 변이체들이 생성되어진다. 이들은 서로 같은 항원성을 유지하는 경우가 대부분이므로 항원성의 차이에 따라 분리하는 면역흡착 크로마토그라피는 이들을 효과적으로 분리할 수가 없다. 넷째, 일반적으로 면역흡착 크로마토그라피 방법은 컬럼의 관리유지가 어렵고 재사용에 따라 일어나는 변화에 대해 규격화가 용이하지 않다는 것이 공정관리상 커다란 단점이 되고 있다.

한편 기존의 α-인터페론 정제방법에서는 대부분 활성화 공정을 독립적으로진행하지 않아 천연의 구조와는 다소 다른 올리고머형, 미스폴드(misfold)형, 슬로우 모노머(slow monomer)형 등이 정제공정중에 다량으로 혼재되어 있으며, 결국 이들을 분리해내기 위해서는 크로마토그라피의 분획 범위가 줄어들게 되었고 이에 따라 정제 수율도 자연히 감소하게 된다는 문제점이 있다. 이와 더불어 α-인터페론온 비슷한 분자크기를 갖는 다른 단백질들에 비해 비교적 친수성이 강한 단백질로 알려져 있는데 이는 구성 아미노산의 분포로도 쉽게 알 수 있다. 즉 α-인터페론은 친수성이 강한 아미노산을 많이 포함하고 있어 외부환경에 의해 쉽게 변이를 일으킬 수 있는데 예를 들어, α-인터페론을 구성하는 각 아미노산의 잔기들은 수용액 상태에서 일련의 화학반응에 의해 변이가 쉽게 일어나 등전점등이 변화될 수 있다. 이와 같이 등전점이 변화된 α-인터페론의 변이체는 본래의 이온강도, 분자량 등의 기본적인 생화학적성질은 거의 변화되지 않은 상태이므로 기존 정제방법인 면역친화성 크로마토그라피, 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피 등으로는 효과적으로 분리되지 못한다는 문제점이 있다.

[발명이 해결하려 하고자 하는 과제]

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은, 첫째 정제방법이 간단하고, 재사용이 가능하며, 정제수율이 높은 α-인터페론의 정제방법을 제공하고, 둘째 정제시 α-인터페론의 변성이 발생하지 않는 α-인터페론의 정제방법을 제공하고, 셋째 활성형 전환시 부분적으로 생성되는 3차 구조 변이체를 제거할 수 있는 α-인터페론의 정제방법을 제공하고, 네째 등전점이 전이된 α-인터페론 변이체를 제거할 수 있는 α-인터페론의 정제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 대장균에서 발현된 봉입체 형태로 회수된 α-인터페론 용입체 용액의 pH를 상승시켜 α-인터페론을 활성형으로 재생시키는 활성형 재생공정과; 상기한 활성화된 α-인터페론 용액의 pH를 하강시켜 변이체를 침전시키는 산침전공정과; α-인터페론을 포함하는 상기한 산침전 공정의 상등액을 양이온 교환 크로마토그라피로 용출시켜 분리하는 양이온 교환 크로마토그라피 공정과; 상기한 양이온 교환 크로마토그라피 공정에서 α-인터페론의 활성이 높은 분획들을 포함하는 용액내에 α-인터페론를 침전시키고 투석하는 투석공정과; 상기한 투석공정에서 회수한 α-인터페른을 크로마토 포커싱하는 크로마토 포커싱공정과; 상기한 크로마토 포커싱 공정에서 회수한 α-인터페론을 겔 여과 크로마토그라피하는 겔 여과 크로마토그라피공정을; 포함하는 α-인터페론의 정제방법을 제공한다.

상기한 본 발명에 있어서, 상기한 산침전공정은 pH를 4.0-6.0의 범위로 조절하므로써 불활성형의 α-인터페론과 대장균 유래단백질을 침전시켜 제거하는 것이 바람직하다.

그리고 상기한 본 발명의 양이온 크로마토그라피 공정에 있어서, 상기한 양이온 크로마토그라피 수지는 SP 세파로스 패스트 플로우인 것이 바람직하며, 상기한 양이온 크로마토그라피의 완충용액은 40mM 인산일나트륨(pH 4.8)인 것이 바람직하며, α-인터페론을 용출시킬 때 용출액은 상기한 인산일나트륨과 염화나트륨 용액이며, 이때 염화나트륨의 농도는 0에서 0.8몰까지 선형농도구배 시킨 것이 바람직하다.

본 발명의 상기한 투석공정에서 침전은 40 중량% 황산암모늄염을 첨가하여 실시하는 것이 바람직하다.

또 상기한 본 발명의 크로마토 포커싱 공정에 있어서, 상기한 크로마토포커싱 수지는 PBE94인 것이 바람직하며, 상기한 크로마토 포커싱 공정의 세척용 완충용액은 25mM 이미다졸 (pH 7.4)이 바람직하며, 상기한 크로마토포커싱 공정에서 용출액은 증류수로 10배 희석한 후 묽은 염산으로 pH를 5.5로 조절한 PB74 완충용액인 것이 바람직하며, 상기한 크로마토 포커싱공정은 pH 6.0인 용출액에 포함된 α-인터페론을 회수하는 것이 바람직하며, 이와 같이 회수된 pH 6.0인 용출액에 포함된 α-인터페론이 함유된 용출액에 황산암모늄을 L당 313g 가하여 α-인터페론을 침전으로 회수하는 것이 바람직하다.

그리고 상기한 본 발명에 있어서, 상기한 겔 여과 크로마토그라피 수지는 세파덱스 G-75 슈퍼파인인 것이 바람직하다.

본 발명에서는 α-인터페론의 특수한 분자적 성질을 기초로 하여 효과적인 정제방법을 확립하고자 하였으며, 이에 대한 구체적인 방법으로는 활성화공정에 이은 산 침전 방법으로 다량의 대장균 숙주세포의 단백질을 비롯하여 올리고머형, 미스폴드형, 슬로우 모노머형 등의 변이체를 제거한 다음 크로마토 그라피를 실시하는 방법이다. 또한 크로마토그라피 공정에서는 활성형의 α-인터페론을 고순도로 정제하기 위하여 양이온 크로마토그라피, 크로마토 포커싱, 겔 여과 크로마토그라피법을 연속적으로 사용하였는데 특히 크로마토 포커싱 단계를 도입하여 등전점 변이체를 제거하여 사람에게 투여시 이를 통해 유발될 수 있는 부작용들을 최소화하고자 하였다.

[실시예]

이하 발명의 내용을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

대장균으로부터 추출한 α-인터페론을 함유하는 봉입체를 1.5-6몰 농도의 구아니딘 염산(guanidine-HC1)용액, 2-8몰농도의 요소(urea)용액 등을 사용하거나 1몰 농도의 수산화나트륨(NaOH)용액으로 수용액의 pH을 알칼리로 조절하는 방법 또는 이들 방법을 혼합시킨 방법으로 용해시킨 후 활성화 공정을 수행하여 활성형의 α-인터페론으로 전환시킨다. 활성화과정을 종료시키고 다량의 대장균 유래 단백질을 비롯하여 올리고머형, 미스폴드(misfold)형, 슬로우모노머(slow monomer) 등의 변이체들을 효과적으로 제거시키기 위해 수용액의 pH를 산성으로 조절하여 이들이 침전을 형성하도록 하였다. 이때 최적 pH는 5.0이었으며 또한 산 침전과정을 전후로 하여 상등액에 존재하는 단백질의 조성을 SDS 전기영동 및 C₈역상 크로마토그라피로 확인하였는데 산침전 과정전에 상등액에 혼재되어 있던 대부분의 대장균 유래 단백질과 올리고머형, 미스폴드형, 슬로우 모노머등이 침전으로 제거됨을 알 수 있었다. 위의 산침전 과정에서 제거되는 올리고머형, 미스폴드형, 슬로우 모노머 등은 기존 방법의 친화성 크로마토그라피 등의 방법으로는 제거가 어려워서 이들의 제거를 위해서는 까다로운 공정이 반복적으로 필요하였는데, 본 발명에서 사용하는산침전법은 간단한 pH조절로 많은 양의 불순물에 해당하는 단백질을 제거하므로써 이후 진행과정의 효율을 극대화하며 공정의 규모도 최소화할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 침전이 제거된 상등액을 40mM 인산일나트륨(NaH₂PO₄)완충용액(pH 4.8)으로 평형화시킨 SP-세파로스 패스트 플로우(SP-Sepharose fast flow)컬럼에 흡착시킨 후 염화나트륨 선형농도구배에 의한 용출 및 분획을 하여 α-인터페론을 함유하는 부분만을 회수한다. SP-세파로스에 부분 정제된 α-인터페론 용액을 황산암모늄염에 의한 염석으로 침전시키고 그 침전을 회수하여 25mM 이미다졸(imidazole) 완충용액(pH 7.4)으로 용해하고 동일한 완충액으로 투석하여 황산암모늄을 제거한다. 투석이 끝난 용액을 이미다졸 완충액으로 평형화시킨 PBE96(Pharmacia)에 흡착시킨 후, 10배 희석하고 pH를 묽은 염산에 의해서 5.5로 조절된 PB74(Pharmacia)를 흘려보내면서 선형 pH구배가 이루어지도록하여 α-인터페론이 등전점에서 용출되도록 하였다. 이러한 크로마토 포커싱 과정을 통해 용출액의 pH가 6.0과 5.5부근에서 각각 α-인터페론을 함유하는 용액을 얻을 수 있었는데 이는 이미 보고된 바[Klein et all, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 276, 531.]와같이 등전점이 5.7이고 N말단이 카르복시메틸기로 블록되어 있는 변이체 등이 존재하기 때문이다. 본 발명에서는 등전점의 차이를 이용하여 단백질을 분리정제하는 기술인 크로마토 포커싱[Pharmacia Fine Chemicals AB Publications(1981) Chromatofocusing with Polybuffer and PBE]을 이용하므로써 혼재될 수 있는 등전점 변이체를 효과적으로 제거할 수 있었는데 이러한 형태의 변이체는 면역 친화성 크로마토그라피, 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피등 기존정제방법에 의해서는 분리가 되지 않는 것으로 보고되어 있으며[Shizue Nakagawa el. al., 1987, J. IFN. Res. 7, 285.], 따라서 이러한 등전점 차이에 의한 분리 방법이 아니면 효과적인 분리가 불가능하다. 한편 Klein등은 이런 변이체들이 항원성이나 독성이 천연형 보다 크다고 하였는데 실제로 인성장 호르몬(Lu. H. S. et al., 1988, Biochem. Biophys, Res, Comun., 156, 807)등에서 이러한 현상이 나타난다고 보고되어 있다. 따라서 본 발명에서 사용하는 크로마토 포커싱에 의한 정제방법은 α-인터페론 변이체를 효과적으로 제거하여 이로 인한 부작용의 가능성을 최소화하는데 중요한 역할을 하고 있다. 크로마토 포커싱에서 pH 6.0의 용출액에 포함되어 있는 α-인터페론 함유 용액을 황산암모늄에 의한 염석으로 침전시키고 침전을 회수하여 200mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 40mM 인산일나트륨 완충액으로 용해시킨다. 이 용해액을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 G-75 세파덱스 겔 여과 크로마토그라피를 수행하여 최종적으로 얻어진 α-인터페론을 SDS-전기영동법, C₈역상 고속 크로마토그라피로 분석한 결과 99%이상의 순도를 가지고 있었으며 박테리아 내독소, 대장균유래 단백질 및 DNA가 완전히 제거되어 임상용으로 적합한 수준이었다.

따라서 본 발명은 α-인터페론 봉입체 용해액을 출발물질로 하여 산침전법, 양이온교환 크로마토그라피법, 크로마토포커싱, 겔 여과 크로마토그라피법을 사용하여 고순도의 활성형 α-인터페론을 고수율로 정제하는 방법을 특징으로 하는 것이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

상기 내용을 실시예를 통하여 좀더 자세히 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1)

pH 10-11의 활성화 공정이 끝난 α-인터페론 봉입체 용액 50L에 1몰 농도의 인산용액을 적량 가하여 pH를 5.0으로 조절한 후 생성된 침전을 3,000g에서 10분 동안 원심분리하여 제거하고 상등액만을 회수하였다.

여기서 얻어진 상등액중 인터페론은 SDS폴리아크릴 아미드젤 전기영동 및 제 1 도에 도시한 C₈역상 크로마토그라피로 확인한 결과 80%이상의 순도를 나타내었다.

(실시예 2)

40mM 인산일나트륨 완충액으로 평형화시킨 SP세파로스 패스트 플로우컬럼(7×8cm)에 산침전 후의 상등액을 시간당 5L의 유속으로 통과시킨 다음 동일한 완충용액으로 용출액의 280nm에서 흡광도가 0.05 이하로 될 때까지 세척하였다. 동일한 완충액과 여기에 염화나트륨을 0.8M되게 첨가한 용액을 각각 4L로하여 선형농도구배에 의한 용출 및 분획을 하였다. 이때 활성형의 α-인터페론은 염화나트륨의 농도가 0.6몰인 용출액에서 가장 많이 존재하였으며 순도를 SDS 폴리아크릴 아미드젤 전기영동으로 측정한 결과 약 97%의 순도를 보였다.

(실시예 3)

양이온 교환 크로마토그라피에서 분획한 활성형의 α-인터페론을 모으고 황산암모늄을 L당 243g의 양이되도록 서서히 가하면서 교반하여 α-인터페론의 침전이 생기도록 하였다. α-인터페론 침전을 3,000g에서 20분간 원심분리하여 회수하고 소량의 25mM 이미다졸 완충액(pH 7.4)으로 용해시키고 동일한 완충액에 대하여 투석하여 황산암모늄을 제거하였다.

(실시예 4)

투석이 끝난 부분 정제된 α-인터페론을 회수하여 10,000g에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 25mM 이미다졸 완충액으로 평형화시킨 PBE94 컬럼(5×25cm)에 시간당 250㎖의 유속으로 통과시킨 다음 동일한 완충액으로 흘려 보내면서 용출액의 흡광도가 280nm에서 0.05 이하로 될 때까지 세척하였다. 중류수로 10배 회석후 묽은 염산으로 pH가 5.5로 조절된 PB74를 흘려보내면서 pH 선형구배가 이루어지도록 하여 α-인터페론의 용출 및 분획을 진행하였으며, 그 결과는 제 2 도에 도시하였다. 용출액의 pH가 6.0과 5.5인 곳에서 각각 α-인터페론이 용출되었는데 등전점 전기영동으로 확인한 결과 등전점이 각각 6.0과 5.7인 α-인터페론의 분리가 이루어진 것을 알 수 있었다. 용출액의 pH가 6.0인 상태에서 용출된 α-인터페론만을 모아서 SDS 폴리아크릴 아미드젤 전기영동 및 C₈고속 역상액체 크로마토그라피로 순도를 확인한 결과 99%이상의 순도를 보였다.

(실시예 5)

크로마토 포커싱에서 용출시 pH 6.0에서 얻어진 α-인터페론 용액에 황산암모늄을 313g 서서히 교반하면서 가하여 α-인터페론을 침전시키고 3,000g에서 20분간 원심분리하여 침전으로 회수하였다. 회수된 침전을 60% 황산암모늄 용액에 현탁시키고 3,000g에서 20분간 원심분리하여 회수하는 조작을 3회 되풀이하여 잔존하는 PB74를 α-인터페론 침전으로부터 제거하였다. 최종적으로 얻어진 α-인터페론 침전을 200mM의 염화나트륨을 포함하는 40mM 인산일나트륨 완충액(pH 4.8)에 용해시키고 10,000g에서 30분간 원심분리한 후 그 상등액을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 세파덱스 G-75 슈퍼파인(4.4×90cm)에 시간당 15㎖의 유속으로 통과시키면서 분획을 하였다. 용출액의 부피가 638㎖인 곳에서 α-인터페론이 용출되었는데 이는 표준분자량 마커와 대조하였을때 분자량 18,000에 해당하였으며 이는 보고된 결과(Nkagawa et al., 1987, J. IFN. research. 7, 285)와 일치하였다. 상기의 겔 여과 크로마토그라피에서 최종적으로 정제된 α-인터페론을 SDS 폴리아크릴 아미드젤 전기영동 및 C₈역상 크로마토그라피로 순도를 확인한 결과 99% 이상의 순도를 보였으며, 그 결과는 제 3 도 및 제 4 도에 도시하였다.

(실시예 6)

상용대조품(3×10⁶IU/㎖)과 최종 정제된 α-인터페론용액(15μg/㎖)을 EMEM배지로 10⁵까지 회석하고 이를 96웰에 100㎕씩 넣고 EMEM배지로 재차 2⁷배까지 회석한다. 분석용 세포 (MDBK)를 3×10⁵/100㎕되게 각 웰에 더해주고 37℃의 CO₂배양기에서 1시간 배양후 지시용 바이러스액을(Vesicular stomatitis virus) 50㎕씩 (7×10³PFU) 각 웰에 더해준다. 37℃의 CO₂배양기에서 18시간 더 배양한 후 각 웰의 배지를 제거하고 100㎕의 neutral Red용액을 넣은 후 37℃에서 2시간 더 배양하여 세포내로 염색제가 흡착되도록 한다. Neutral Red 용액을 제거하고 D-PBS용액으로 2회 세척한후 100㎕ 용출액 (초산:에탄올 = 1:1)을 첨가하여 흡수된 염색제가 용출되도록한 후 540nm에서 흡광도를 측정하고 다음의 식으로 활성도를 계산한다.

위의 식에 따라 정제된 α-인터페론의 활성도를 계산한 결과 2.5 × 10⁸I.U/mg의 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.

[효 과]

상기한 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 α-인터페론 정제방법은 다량의 대장균 숙주세포의 단백질을 비롯하여 올리고머형, 미스폴드형, 슬로우 모노머형 등의 변이체를 제거하며 특히, 등전점 번이체를 제거하여, 활성형의 α-인터페론을 고순도로 정제할 수 있으며, 공정이 간편하고 재사용이 가능하며, 수율 또한 매우 높다. 이와 같이 본 발명에 따라 정제된 α-인터페론을 사용할 경우, 변이체를 통해 유발될 수 있는 부작용들을 최소화할 수 있다.

제1도는 활성화공정이 끝난 α-인터페론 봉입체 용해액을 pH 5.0로 낮추었을 때 상등액에 존재하는 활성형 α-인터페론의 순도를 C₈역상 고속액체 크로마토그라피로 분석한 크로마토그람이다.

제2도는 크로마토 포커싱 과정중 PBE94에 흡착시킨 후 용출시키는 과정에서 용출액의 흡광도를 파장 280nm에서 측정한 크로마토그람이다.

제3도는 세파덱스 G-75 슈퍼파인 컬럼을 통과시켜 최종적으로 정제한 α-인터페론을 C₈역상고속액체 크로마토그라피로 분석한 크로마토그람이다.

제4도는 세파덱스 G-75 슈퍼파인 컬럼을 통과시켜 최종적으로 정제한 α-인터페론의 순도를 SDS 폴리아크릴 아미드젤 전기영동으로 확인한 전기영동 사진이다.

Claims

대장균에서 발현된 봉입체 형태로 회수된 α-인터페론 봉입체 용액의 pH를 상승시켜 α-인터페론을 활성형으로 재생시키는 활성형 재생공정과;

상기한 활성화된 α-인터페론 용액의 pH를 하강시켜 변이체를 침전시키는 산침전공정과;

α-인터페론을 포함하는 상기한 산침전 공정의 상등액을 양이온 교환 크로마토그라피로 용출시켜 분리하는 양이온 교환 크로마토그라피 공정과;

상기한 양이온 교환 크로마토그라피 공정에서 α-인터페론의 활성이 높은 분획들을 포함하는 용액내에 α-인터페론을 침전시키고 투석하는 투석공정과;

상기한 투석공정에서 회수한 α-인터페론을 크로마토 포커싱하는 크로마토 포커싱공정과;

상기한 크로마토 포커싱 공정에서 회수한 α-인터페론을 겔 여과 크로마토그라피하는 겔 여과 크로마토그라피공정을;

포함하는 α-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기한 산침전공정은 pH을 4.0-6.0의 범위로 조절하므로써 불활성형의 α-인터페론과 대장균 유래단백질을 침전시켜 제거하는 것인 α-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기한 양이온 크로마토그라피 수지는 SP 세파로스패스트 플로우인 α-인터페론의 정제방법.
제3항에 있어서, 상기한 양이온 크로마토그라피의 완충용액은 40mM 인산일나트륨 (pH 4.8)인 α-인터페론의 정제방법.
제3항에 있어서, 상기한 α-인터페론을 용출시킬 때 용출액은 상기한 인산일나트륨과 염화나트륨 용액이며, 이때 염화나트륨의 농도는 0에서 0.8몰까지 선형농도구배 시킨 것인 α-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기한 투석공정에서 침전은 40 중량% 황산암모늄염을 첨가하여 실시하는 것인 α-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기한 크로마토 포커싱 수지는 PSE94인 α-인터페론의 정제방법.
제7항에 있어서, 상기한 크로마토 포커싱 공정의 완충용액은 25mM 이미다졸 (pH 7.4)인 α-인터페론의 정제방법.
제7항에 있어서, 상기한 크로마토 포커싱 공정에서 용출액은 증류수로 10배회석한 후 묽은 염산으로 pH를 5.5로 조절한 PB74 완충용액인 α-인터페론의 정제방법.
제9항에 있어서, 상기한 코로마토 포커싱 공정은 pH 6.0인 용출액에 포함된 α-인터페론을 회수하는 것인 α-인터페론의 정제방법.
제10항에 있어서, 상기한 pH 6.0인 용출액에 포함된 α-인터페론이 함유된 용출액에 황산암모늄을 L당 313g 가하여 α-인터페론을 침전으로 회수하는 것인 α-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기한 겔 여과 크로마토그라피 수지는 세파덱스 G-75 슈퍼파인인 α-인터페론의 정제방법.