JPS5889196A - インタ−フエロンの精製法 - Google Patents
インタ−フエロンの精製法Info
- Publication number
- JPS5889196A JPS5889196A JP56188898A JP18889881A JPS5889196A JP S5889196 A JPS5889196 A JP S5889196A JP 56188898 A JP56188898 A JP 56188898A JP 18889881 A JP18889881 A JP 18889881A JP S5889196 A JPS5889196 A JP S5889196A
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- JP
- Japan
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- interferon
- solution
- ethanol
- potassium thiocyanate
- ultrafiltration
- Prior art date
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明はインターフェロンの新規な精製法に関するも
のである。
のである。
この発明者等はインターフェロンの精製法について種々
研究の結果、高収率で高純度のインターフェロンの精製
法を見い出し、さらに鋭意研究の結果、この発明を完成
した。
研究の結果、高収率で高純度のインターフェロンの精製
法を見い出し、さらに鋭意研究の結果、この発明を完成
した。
この発明の方法は、粗製インターフェロン水溶液を強酸
性陽べ、オン交換体で処理し、次いで、得られたインタ
ーフェロン含有分画にトリクロル酢酸を加え、次いで得
られた沈でんをアルカリ水に溶解し、透析後、透析内液
をチオビアン酸カリウム塩析に付し、次いで、得られた
沈でんをアルカリ水に溶解し、ゲル濾過後、得られたイ
ンターフェロン含有分画を限外濾過に付し、次いで得ら
れた限外濾過残留液を多孔性ガラス粒子に接触させ、次
いで多孔性ガラス粒子に吸着したインターフェロンをチ
オシアン酸カリウム溶液で溶出し、次いで得られたイン
ターフェロン含有分画を弱酸性に調整し、生ずる沈でん
をアルカリ水に溶解し、ゲル許過後、得られたインター
フェロン含有分画を限外濾過に付し、次いで得られた限
外濾過残留液を酸エタノール分別法でん法に付し、得ら
れたインターフェロン含有分画を透析することからなる
インターフェロンの精製法である。
性陽べ、オン交換体で処理し、次いで、得られたインタ
ーフェロン含有分画にトリクロル酢酸を加え、次いで得
られた沈でんをアルカリ水に溶解し、透析後、透析内液
をチオビアン酸カリウム塩析に付し、次いで、得られた
沈でんをアルカリ水に溶解し、ゲル濾過後、得られたイ
ンターフェロン含有分画を限外濾過に付し、次いで得ら
れた限外濾過残留液を多孔性ガラス粒子に接触させ、次
いで多孔性ガラス粒子に吸着したインターフェロンをチ
オシアン酸カリウム溶液で溶出し、次いで得られたイン
ターフェロン含有分画を弱酸性に調整し、生ずる沈でん
をアルカリ水に溶解し、ゲル許過後、得られたインター
フェロン含有分画を限外濾過に付し、次いで得られた限
外濾過残留液を酸エタノール分別法でん法に付し、得ら
れたインターフェロン含有分画を透析することからなる
インターフェロンの精製法である。
この発明の精製法の対象である粗製インターフェロン水
溶液としては、例えば白血球、リンパ芽球様細胞、その
他の樹立株細胞系等のヒトインターフェロン産生細胞の
培養液、マウスインターフェロン産生細胞の培養液、マ
ウスインターフェロン産生臓器のホモジネート、インタ
ーフェロン産生能を付与された微生物の培養液などの他
、これらから部分精製したインターフェロン含有水溶液
が挙げられる。
溶液としては、例えば白血球、リンパ芽球様細胞、その
他の樹立株細胞系等のヒトインターフェロン産生細胞の
培養液、マウスインターフェロン産生細胞の培養液、マ
ウスインターフェロン産生臓器のホモジネート、インタ
ーフェロン産生能を付与された微生物の培養液などの他
、これらから部分精製したインターフェロン含有水溶液
が挙げられる。
この発明の精製法で用いられる強酸性陽イオン交換体と
しては、例えばスルホ基、スルホエチル基、スルホプロ
ピル基等のスルホ基を官能基として有する架橋デキスト
ラン、アガロース、セルロースなどが含まれ、その代表
例としては、ｓｐ−セファデックスＣ−２５（Ｓ Ｐ
−５ｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、商標、ファルマシア社
製）等のスルホプロピル基を有する架橋デキストランが
挙げられる。−この発明の精製法では、まず粗製インタ
ーフェロン水溶液を上記の強酸性陽イオン交換体で処理
するが、処理に先立ち、粗製インターフェロン水溶液の
ｐＨを弱酸性に、好ましく Ｉ／′ｉｐＨ２〜４に調整
しておくの・が望ましく、次いでこの粗製インターフェ
ロン水溶液を強酸性陽イオン交換体にカラへ式またはパ
ッチ式で接触させ、インターフェロンを強酸性陽イオン
交換体に吸着させる。吸着されたインターフェロンを溶
出することは、該強酸性陽イオン交換体を中性ないしア
ルＶ７１Ｊ性の水溶液、好ましくは弱アルカリ性の緩衝
液に接触させることにより行なわれる。
しては、例えばスルホ基、スルホエチル基、スルホプロ
ピル基等のスルホ基を官能基として有する架橋デキスト
ラン、アガロース、セルロースなどが含まれ、その代表
例としては、ｓｐ−セファデックスＣ−２５（Ｓ Ｐ
−５ｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５、商標、ファルマシア社
製）等のスルホプロピル基を有する架橋デキストランが
挙げられる。−この発明の精製法では、まず粗製インタ
ーフェロン水溶液を上記の強酸性陽イオン交換体で処理
するが、処理に先立ち、粗製インターフェロン水溶液の
ｐＨを弱酸性に、好ましく Ｉ／′ｉｐＨ２〜４に調整
しておくの・が望ましく、次いでこの粗製インターフェ
ロン水溶液を強酸性陽イオン交換体にカラへ式またはパ
ッチ式で接触させ、インターフェロンを強酸性陽イオン
交換体に吸着させる。吸着されたインターフェロンを溶
出することは、該強酸性陽イオン交換体を中性ないしア
ルＶ７１Ｊ性の水溶液、好ましくは弱アルカリ性の緩衝
液に接触させることにより行なわれる。
このようにして得られたインターフェロン含有分画にト
リクロル酢酸を加え、インターフェロンを沈でんさせる
。この際、トリクロル酢酸は約２〜５チ最終濃度となる
ように加えれば、インターフェロンは十分に沈でんする
。
リクロル酢酸を加え、インターフェロンを沈でんさせる
。この際、トリクロル酢酸は約２〜５チ最終濃度となる
ように加えれば、インターフェロンは十分に沈でんする
。
次に生じた沈でんをアルカリ水に溶解する。この際、用
いられるアルカリ水としては水酸化ナトリクム水溶液、
炭酸水素す） ＩＪクム水溶液が繁用される。このアル
カリ水を液性が約ｐＨ７〜８になる程度に加えれば、イ
ンターフェロンを含有スる尤ス社容易に溶解する。
いられるアルカリ水としては水酸化ナトリクム水溶液、
炭酸水素す） ＩＪクム水溶液が繁用される。このアル
カリ水を液性が約ｐＨ７〜８になる程度に加えれば、イ
ンターフェロンを含有スる尤ス社容易に溶解する。
次いで得られたイどターフェロン溶液を透析する。用い
られる透析チューブとしては通常の透析用セルロースチ
ューブでよく、透析外液としては約ｐＨ７，０〜８．０
程度の緩衝液が繁用され、必要ニ応じ、シュークロース
、マンニトール等の安定剤をこれに含有せしめてもよい
。透析時間は約２〜５チ最終濃度で十分である。
られる透析チューブとしては通常の透析用セルロースチ
ューブでよく、透析外液としては約ｐＨ７，０〜８．０
程度の緩衝液が繁用され、必要ニ応じ、シュークロース
、マンニトール等の安定剤をこれに含有せしめてもよい
。透析時間は約２〜５チ最終濃度で十分である。
次いで得られた透析内液をチオシアン酸カリクム塩析に
付す。このチオシアン酸カリクム塩析はインターフェロ
ンを精製するためのチオジアジ酸カリウム塩析の通常の
方法と同様にして行なわれる。すなわち、該透析内液に
チオシアン酸カリクムを約０．５Ｍ最終濃度となるよう
に添加溶解し、次いで塩酸、硫酸等の鉱酸で液性を約ｐ
Ｈ３〜４に調整すると、インターフェロンが沈でんして
くる。
付す。このチオシアン酸カリクム塩析はインターフェロ
ンを精製するためのチオジアジ酸カリウム塩析の通常の
方法と同様にして行なわれる。すなわち、該透析内液に
チオシアン酸カリクムを約０．５Ｍ最終濃度となるよう
に添加溶解し、次いで塩酸、硫酸等の鉱酸で液性を約ｐ
Ｈ３〜４に調整すると、インターフェロンが沈でんして
くる。
次いで得られた沈でんにアルカリ水を加え、溶解する。
この際のアルカリ水としては水酸化ナトリクム水溶液、
炭酸水素ナトリクム水溶液等が繁用され、インターフェ
ロン含有法でんを溶解するためのアルカリ水の量は液性
が約ｐＨ７〜８程度になる程度で十分である。
炭酸水素ナトリクム水溶液等が繁用され、インターフェ
ロン含有法でんを溶解するためのアルカリ水の量は液性
が約ｐＨ７〜８程度になる程度で十分である。
次に、得られたインターフェロン溶液をゲル濾過に付す
。用いられるゲル一過却としては分子量約１万〜１０万
の物質を精製できるゲルであればよく、ゲルの基材上し
ては架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス等か挙げられ、好ましいものとしては、例えば、セフ
ァクリルＳ −２００（５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０
０，商標、ファルマシア社製）等のＮＩ Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミドとアリルデキス′トランの架橋体
が挙げられる。
。用いられるゲル一過却としては分子量約１万〜１０万
の物質を精製できるゲルであればよく、ゲルの基材上し
ては架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス等か挙げられ、好ましいものとしては、例えば、セフ
ァクリルＳ −２００（５ｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２０
０，商標、ファルマシア社製）等のＮＩ Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミドとアリルデキス′トランの架橋体
が挙げられる。
ゲル涙過剤の平衡化およびゲル濾過剤からインターフェ
ロンの溶出のためには、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７
〜Ｂの水溶液が用いられるが、その中でも、例えばシュ
ークロース等の糖類または糖アルコールなどの安定剤を
含有する緩衝液が繁用される。ゲル濾過は高分子物質の
精製に適用される通常のゲル濾過操作法により行なわれ
る。
ロンの溶出のためには、ｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ７
〜Ｂの水溶液が用いられるが、その中でも、例えばシュ
ークロース等の糖類または糖アルコールなどの安定剤を
含有する緩衝液が繁用される。ゲル濾過は高分子物質の
精製に適用される通常のゲル濾過操作法により行なわれ
る。
ゲル濾過後、得られたインターフェロン含有分画を限外
濾過に付す、この際使用される限外濾過膜としては、分
画分子量約５千〜１０万程度の多糖類を基材とするもの
が用いられ、その例としては、例えば、ダイアフローメ
ンブレンＹＭ５．ＹＭＩＯ，ＹＭ３０ （商標、アミコ
ン社製）等の限外濾過膜が繁用される。この限外濾過の
操作は高分子物質の精製に適用される限外濾過の常法に
より行なえばよい。
濾過に付す、この際使用される限外濾過膜としては、分
画分子量約５千〜１０万程度の多糖類を基材とするもの
が用いられ、その例としては、例えば、ダイアフローメ
ンブレンＹＭ５．ＹＭＩＯ，ＹＭ３０ （商標、アミコ
ン社製）等の限外濾過膜が繁用される。この限外濾過の
操作は高分子物質の精製に適用される限外濾過の常法に
より行なえばよい。
次いで得られた限外濾過残留液を多孔性ガラス粒子にカ
ラム式またはバッチ式で接触させる。ここで用いられる
多孔性ガラス粒子としては、例えばコンドロールド・ボ
ア・グラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ） ＣＰ Ｇ １０ （商標、エレクトロヌクレオニ
クス社製）等が繁用される。多孔性ガラス粒子に吸着し
たインターフェロンはチオシアン酸カリクム溶液により
、溶出される。溶離剤として使用されるチオシアン酸カ
リウム溶Ｈ／ｌｉ ｐＨｓ〜９、好ましくは約ｐＨ１３
の液性で０．７５ Ｍ以上の濃度のチオシアン酸カリク
ムを含有する緩衝液が繁用される。
ラム式またはバッチ式で接触させる。ここで用いられる
多孔性ガラス粒子としては、例えばコンドロールド・ボ
ア・グラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓ
ｓ） ＣＰ Ｇ １０ （商標、エレクトロヌクレオニ
クス社製）等が繁用される。多孔性ガラス粒子に吸着し
たインターフェロンはチオシアン酸カリクム溶液により
、溶出される。溶離剤として使用されるチオシアン酸カ
リウム溶Ｈ／ｌｉ ｐＨｓ〜９、好ましくは約ｐＨ１３
の液性で０．７５ Ｍ以上の濃度のチオシアン酸カリク
ムを含有する緩衝液が繁用される。
次いで、得られたインターフェロン含有分画を弱酸性に
調整し、生ずる沈でんを上記と同様のアルカリ永に溶解
する。この溶液を次にゲル濾過に付す。ここで行なわれ
るゲル濾過は前記のゲル濾過と同様にして行なえばよい
。
調整し、生ずる沈でんを上記と同様のアルカリ永に溶解
する。この溶液を次にゲル濾過に付す。ここで行なわれ
るゲル濾過は前記のゲル濾過と同様にして行なえばよい
。
ゲル濾過後、得られたインターフェロン含有分画一を限
外濾過に付す、ここで行なわれる限外濾過も前記の限外
濾過と同様にして行なえばよい。
外濾過に付す、ここで行なわれる限外濾過も前記の限外
濾過と同様にして行なえばよい。
次いで得られた限外濾過残留液を酸エタノ分別法分別沈
でん法に付す。この酸エフノー１分別法でん法とは、例
えば、ジャーナル・オプ・ゼネラル０ピロロジー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
；第３９巻第５４１〜５４３頁（１９７８年）記載のケ
イ・カンチル（Ｋ、 Ｃａｎｔｅｌｌ ）氏により創
案されたインターフ“エロンの部分精製法のことであり
、インターフェロン水溶液にチオジアジ酸力１ノウムを
添加溶解し、次に液性を約ｐＨ３，５に調整し、インタ
ーフェロンを沈でんせしめ（チオシアン酸カリウム塩析
）、この沈でんをエタノールに溶解し、得られたインタ
ーフェロンのチオシアン酸カリクム・エタノール溶液の
液性をｐＨ５，５およびｐＨ５，８に変化せしめ、それ
ぞれ生ずる不純物の沈でんを除去し、ついで該エタノー
ル溶液の液性をｐＨ８，０に調整し、インターフェロン
を沈でんせしめ、部分精製インターフェロンを採取する
ことからなる。方法である。上記方法において、チオシ
アン酸カリウム塩析で生じたインターフェロンの沈でん
はかなりの量のチオシアン酸カリクムを含有し、これを
エタノールに溶解せしめることは、例えば、京都府赤十
字血液センター発行の技術情報第３巻第５Ｊｊ＋（１９
７８年９月２０日発） 行）第２６頁右欄の「２．エ
タノールに溶解」の項第１〜第１４行に、［あらかじめ
９５％エタノールと組織破砕用ワーリングブレングーを
一２０°Ｃのフリーザーで冷却しておく。ロダンカリ塩
析で得られた沈渣を一２０℃エタノール４，０００ｍ１
！（粗インターフェロンの１７５量）に溶解する。容易
には溶解しないので沈渣をまず少量の一２０℃エタノー
ルでほぐし、ブレンダー（冷却済）で５秒づつ４回計２
０秒程度撹拌し溶解せしめる。理由はさたかでないが、
この５秒４回が重要だと、係の女性はストップクオツチ
を見ながらプレンダのス、イッチを断続していた。」と
記載の通り、容易ではなく、所望のインターフェロンの
チオシアン酸カリクム・エタノール溶液を得るには、こ
の方法では特殊な操作と熟練を要し、インターフェロン
の工業的製造工程として適当ではない。そこで、この発
明者等は従来の酸エタノール分別法の改良について鋭意
研究の結果、上記め酸エタノール分別法でん法において
、チオシアン酸カリウム塩析を行ない、生じた沈でんを
エタノールに溶解させる工程に換え、直接、インターフ
ェロン水溶液を約ｐＨ３，５のチオシアン酸カリウム・
エタノ、 −ル溶液に加え（好ましくは滴下し）、イン
ターフェロンのチオシアン酸カリウム・エタノール溶液
を得、この溶液を用いて、上記と同様に分別比でん操作
を行なっても、インターフェロンが精製できることを見
い出した。この方法によれば、特殊な操作および熟練も
要せず、きわめて簡単にインターフ六ロンのチオシアン
酸カリウム・エタノール溶液を得ることができ、インタ
ーフェロンの工業的製造にとって好適な工程である。
でん法に付す。この酸エフノー１分別法でん法とは、例
えば、ジャーナル・オプ・ゼネラル０ピロロジー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
；第３９巻第５４１〜５４３頁（１９７８年）記載のケ
イ・カンチル（Ｋ、 Ｃａｎｔｅｌｌ ）氏により創
案されたインターフ“エロンの部分精製法のことであり
、インターフェロン水溶液にチオジアジ酸力１ノウムを
添加溶解し、次に液性を約ｐＨ３，５に調整し、インタ
ーフェロンを沈でんせしめ（チオシアン酸カリウム塩析
）、この沈でんをエタノールに溶解し、得られたインタ
ーフェロンのチオシアン酸カリクム・エタノール溶液の
液性をｐＨ５，５およびｐＨ５，８に変化せしめ、それ
ぞれ生ずる不純物の沈でんを除去し、ついで該エタノー
ル溶液の液性をｐＨ８，０に調整し、インターフェロン
を沈でんせしめ、部分精製インターフェロンを採取する
ことからなる。方法である。上記方法において、チオシ
アン酸カリウム塩析で生じたインターフェロンの沈でん
はかなりの量のチオシアン酸カリクムを含有し、これを
エタノールに溶解せしめることは、例えば、京都府赤十
字血液センター発行の技術情報第３巻第５Ｊｊ＋（１９
７８年９月２０日発） 行）第２６頁右欄の「２．エ
タノールに溶解」の項第１〜第１４行に、［あらかじめ
９５％エタノールと組織破砕用ワーリングブレングーを
一２０°Ｃのフリーザーで冷却しておく。ロダンカリ塩
析で得られた沈渣を一２０℃エタノール４，０００ｍ１
！（粗インターフェロンの１７５量）に溶解する。容易
には溶解しないので沈渣をまず少量の一２０℃エタノー
ルでほぐし、ブレンダー（冷却済）で５秒づつ４回計２
０秒程度撹拌し溶解せしめる。理由はさたかでないが、
この５秒４回が重要だと、係の女性はストップクオツチ
を見ながらプレンダのス、イッチを断続していた。」と
記載の通り、容易ではなく、所望のインターフェロンの
チオシアン酸カリクム・エタノール溶液を得るには、こ
の方法では特殊な操作と熟練を要し、インターフェロン
の工業的製造工程として適当ではない。そこで、この発
明者等は従来の酸エタノール分別法の改良について鋭意
研究の結果、上記め酸エタノール分別法でん法において
、チオシアン酸カリウム塩析を行ない、生じた沈でんを
エタノールに溶解させる工程に換え、直接、インターフ
ェロン水溶液を約ｐＨ３，５のチオシアン酸カリウム・
エタノ、 −ル溶液に加え（好ましくは滴下し）、イン
ターフェロンのチオシアン酸カリウム・エタノール溶液
を得、この溶液を用いて、上記と同様に分別比でん操作
を行なっても、インターフェロンが精製できることを見
い出した。この方法によれば、特殊な操作および熟練も
要せず、きわめて簡単にインターフ六ロンのチオシアン
酸カリウム・エタノール溶液を得ることができ、インタ
ーフェロンの工業的製造にとって好適な工程である。
酸エタノール分別法でん法により得られたインターフェ
ロン含有分画はさらに透析により精製される。この透析
の操作も上記で述べた透析の操作と同様にして行なわれ
る。
ロン含有分画はさらに透析により精製される。この透析
の操作も上記で述べた透析の操作と同様にして行なわれ
る。
なお、この精製法の上述の全工程はインターフェロンの
失活を避けるため、低温、例えば、４℃で行なうのがよ
い。
失活を避けるため、低温、例えば、４℃で行なうのがよ
い。
次に実施例によりこの発明の詳細な説明する。
なお、実施例中のインターフェロンの活性は、水泡性口
炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓＶｉｒｕ８ ）と人のＦＬ細胞を用い細胞変性効果（
ＣＰＥ’）抑制法〔例えば、最新医学！＠２９巻４号（
１９７４年）第６６０〜６６４ページ参照１で測定した
。
炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉ
ｓＶｉｒｕ８ ）と人のＦＬ細胞を用い細胞変性効果（
ＣＰＥ’）抑制法〔例えば、最新医学！＠２９巻４号（
１９７４年）第６６０〜６６４ページ参照１で測定した
。
実施例
（１）ヒトリンパ芽球様細胞［ナマルバ（＆ｍａｌｖａ
）株］の培養液にセンダイウィルスをかけてインターフ
ェロンを産生させた後、ｐＨ２でセンダイウィルスを不
活化し、遠心分離して得た粗製インターフェロン水溶液
［蛋白質含量：３７．１．ｉ９．インターフェロン総活
性：５４．６Ｘｌ心６ＩＵ、インターフェロン比活性：
１．４７Ｘ１０”ＩＵ／ｑ−蛋白質ｐＨ３，５）を４
℃でマクルパイン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ）クエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ３，５）で平衡化したｓｐ−セファデ
ックスＣ−２５３，６／中に入れ、−夜ゆ′っくりと撹
拌する。この混合液をグラスフィルクーにより４℃で吸
引濾過する。ｐ液はすてる。濾過したｓｐ−セファデッ
クスＣ−２５を平衡化に用いた緩衝液１．８／で２回洗
浄する。ｐ液はすてる。洗浄したｓｐ−セファデックス
Ｃ−２５にマクルパインクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
７，８）１．２１！を加え、ゆっくりと撹拌する。４℃
で撹拌下、４Ｎ水酸化ナトリクム水溶液を滴下してｐＨ
７，８に調整し、２時間ゆっくりと撹拌する。その後４
℃でグラスフィルターにより吸引濾過して、ｐ液を得る
。さらに、濾過したｓｐ−セファデックスＣ−２ｊヲマ
クルパインクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７，８） １
．２ ／を用いて上記き同様の操作で２回溶出し、濾過
する。ｐＨ７，８で溶出したＰ液（４，５１りを合し、
これに４℃で撹拌下、７０チドリクロロ酢酸３４６ ｆ
ｎｌを１時間で滴下し５チドリクロロ酢酸濃度となるよ
うにする。その後、１時間、４℃で撹拌し、次いで４℃
、７０００ ｒ。
）株］の培養液にセンダイウィルスをかけてインターフ
ェロンを産生させた後、ｐＨ２でセンダイウィルスを不
活化し、遠心分離して得た粗製インターフェロン水溶液
［蛋白質含量：３７．１．ｉ９．インターフェロン総活
性：５４．６Ｘｌ心６ＩＵ、インターフェロン比活性：
１．４７Ｘ１０”ＩＵ／ｑ−蛋白質ｐＨ３，５）を４
℃でマクルパイン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ）クエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ３，５）で平衡化したｓｐ−セファデ
ックスＣ−２５３，６／中に入れ、−夜ゆ′っくりと撹
拌する。この混合液をグラスフィルクーにより４℃で吸
引濾過する。ｐ液はすてる。濾過したｓｐ−セファデッ
クスＣ−２５を平衡化に用いた緩衝液１．８／で２回洗
浄する。ｐ液はすてる。洗浄したｓｐ−セファデックス
Ｃ−２５にマクルパインクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
７，８）１．２１！を加え、ゆっくりと撹拌する。４℃
で撹拌下、４Ｎ水酸化ナトリクム水溶液を滴下してｐＨ
７，８に調整し、２時間ゆっくりと撹拌する。その後４
℃でグラスフィルターにより吸引濾過して、ｐ液を得る
。さらに、濾過したｓｐ−セファデックスＣ−２ｊヲマ
クルパインクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７，８） １
．２ ／を用いて上記き同様の操作で２回溶出し、濾過
する。ｐＨ７，８で溶出したＰ液（４，５１りを合し、
これに４℃で撹拌下、７０チドリクロロ酢酸３４６ ｆ
ｎｌを１時間で滴下し５チドリクロロ酢酸濃度となるよ
うにする。その後、１時間、４℃で撹拌し、次いで４℃
、７０００ ｒ。
ｐ、 ｎｉ、で２０分間遠心分離する。得られた沈でん
に４℃で水を加え撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液
を滴下してｐＨ７，０〜７，５に調整して溶解するーこ
の溶解液３４８ ｍｌをセルロースチューブに入れ、０
．０１５Ｍ塩化ナトリウム含有０． ＯＩ Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０，） ３０ ／で一夜透析する。
に４℃で水を加え撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液
を滴下してｐＨ７，０〜７，５に調整して溶解するーこ
の溶解液３４８ ｍｌをセルロースチューブに入れ、０
．０１５Ｍ塩化ナトリウム含有０． ＯＩ Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０，） ３０ ／で一夜透析する。
透析後４℃＋ ９０００ ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分
離し、上清を得る。上清に４℃で水２５２ ｍｅを加え
、全量を６００ ｍｅにする。４℃で撹拌下、チオシア
ン酸カリウム２９．２ ｙを添加溶解し％０．５Ｍチオ
ンシアン酸カリクム濃度にする。その後４℃で撹拌下、
ＩＮ塩酸をゆっくりと滴下し、ｐＨ３，５に調整する。
離し、上清を得る。上清に４℃で水２５２ ｍｅを加え
、全量を６００ ｍｅにする。４℃で撹拌下、チオシア
ン酸カリウム２９．２ ｙを添加溶解し％０．５Ｍチオ
ンシアン酸カリクム濃度にする。その後４℃で撹拌下、
ＩＮ塩酸をゆっくりと滴下し、ｐＨ３，５に調整する。
４℃で１時間撹拌後、４℃、９０００ｒ、 ｐ、 ｍで
１０分間遠心分離する。沈でんに４℃で少量の水と飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、撹拌し、ＩＮ塩酸ま
たは、ＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０〜７．５に調
整する。４℃で１時間撹拌した後４℃、１５０００ ｒ
、ｐ、ｍで２０分間遠心分゛離して沈でんを除去する。
１０分間遠心分離する。沈でんに４℃で少量の水と飽和
炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、撹拌し、ＩＮ塩酸ま
たは、ＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７，０〜７．５に調
整する。４℃で１時間撹拌した後４℃、１５０００ ｒ
、ｐ、ｍで２０分間遠心分゛離して沈でんを除去する。
上清液を、０．５チシュークロース、０．０２Ｍ塩化ナ
トリクム含有の０．０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で平衡化したセフアラクリルＳ−２００スーパーフア
イン（５ｕｐｅｒｆｉｎｅ） ２５００ ｍｅを２本の
カラム（カラムサイズ：５Ｘ＝７７ｃＩｎおよび５×５
１ ａｍ ）を塩化ビニールチューブで接続して作成し
たカラムに２．１ｍｅ／分の流速でゲル濾過を行う。
トリクム含有の０．０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で平衡化したセフアラクリルＳ−２００スーパーフア
イン（５ｕｐｅｒｆｉｎｅ） ２５００ ｍｅを２本の
カラム（カラムサイズ：５Ｘ＝７７ｃＩｎおよび５×５
１ ａｍ ）を塩化ビニールチューブで接続して作成し
たカラムに２．１ｍｅ／分の流速でゲル濾過を行う。
通液開始後１５４９−〜２１２８−目の溶出液を集める
。これを限外ｐ過膜、グイアフロ−メンブレンｙ、Ｍ１
０ （７６Ｍ）を用いて４℃窒素加圧下（４Ｋｙ／ｃｉ
１以下）で限外濾過する。限外濾過残留液量は１４．２
−でインターフェロン総活性４４．７Ｘ １０’ Ｉ
Ｕを含有し、インターフェロン比活性は１、０７ Ｘ
１０５工Ｕ／岬蛋白質、精製度は７３０倍、回収率は、
８１．９％である（以下、この限外濾過残留液を“部分
精製インターフェロン溶液”と称する）。
。これを限外ｐ過膜、グイアフロ−メンブレンｙ、Ｍ１
０ （７６Ｍ）を用いて４℃窒素加圧下（４Ｋｙ／ｃｉ
１以下）で限外濾過する。限外濾過残留液量は１４．２
−でインターフェロン総活性４４．７Ｘ １０’ Ｉ
Ｕを含有し、インターフェロン比活性は１、０７ Ｘ
１０５工Ｕ／岬蛋白質、精製度は７３０倍、回収率は、
８１．９％である（以下、この限外濾過残留液を“部分
精製インターフェロン溶液”と称する）。
（２）上記と同様にして精製したインターフェロン含衰
液の凍結（−８０℃）試料を３７℃の温水中で融解する
。これを１０，０００ ｒ、ｐ、ｍで１５分間遠心分離
する。−上清液は、８４ｒｎｌで蛋白質含量８１９ｔｎ
ｇ、インターフェロン総活性２．０Ｘ１０”工Ｕを含有
し、比活性（／ｆ２．４Ｘ１０’ＩＵ／■蛋白質である
。上清液を４℃で０． ＯＩ Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）で平衡化した多孔性ガラス粒子、フントロール
ド・ボア・グラスＣＰＧ−１０（３ｓ。
液の凍結（−８０℃）試料を３７℃の温水中で融解する
。これを１０，０００ ｒ、ｐ、ｍで１５分間遠心分離
する。−上清液は、８４ｒｎｌで蛋白質含量８１９ｔｎ
ｇ、インターフェロン総活性２．０Ｘ１０”工Ｕを含有
し、比活性（／ｆ２．４Ｘ１０’ＩＵ／■蛋白質である
。上清液を４℃で０． ＯＩ Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）で平衡化した多孔性ガラス粒子、フントロール
ド・ボア・グラスＣＰＧ−１０（３ｓ。
Ａ、２００〜４００メツーシュ＋５Ｘ２２ｃｍ）のカラ
ムに、０．５ｍｅ／分で流す。平衡化に用いたのと同じ
緩衝液（２１３０ｄ）を用いて、流速２．５−７分で洗
浄した後、０．１ Ｍ ） ＩＪス酢酸緩衝液（ｐＨ８
，０，３５２０ｍｅ）を用イテ流速１ｆｆｉｅ／分で洗
浄する。次に０．７５ Ｍのチオシアン酸カリウムを含
む０゜ＩＭ）リス酢酸緩衝液（ｐＨ８，０，１３２０ｍ
ｅ ）を用いて、流速１ｍｅ１分で溶出する。溶出開始
後６３０〜１１００ｍｔ’の溶出液（４７０ｍｔ’）を
集−める。
ムに、０．５ｍｅ／分で流す。平衡化に用いたのと同じ
緩衝液（２１３０ｄ）を用いて、流速２．５−７分で洗
浄した後、０．１ Ｍ ） ＩＪス酢酸緩衝液（ｐＨ８
，０，３５２０ｍｅ）を用イテ流速１ｆｆｉｅ／分で洗
浄する。次に０．７５ Ｍのチオシアン酸カリウムを含
む０゜ＩＭ）リス酢酸緩衝液（ｐＨ８，０，１３２０ｍ
ｅ ）を用いて、流速１ｍｅ１分で溶出する。溶出開始
後６３０〜１１００ｍｔ’の溶出液（４７０ｍｔ’）を
集−める。
これに、４℃撹拌下に、６Ｎ塩酸を加えｐＨ３，５とし
た後、３０分間撹拌する。ついで、４℃。
た後、３０分間撹拌する。ついで、４℃。
７０００ｒ、ｐ、ｍで、３０分間遠心分離する。沈でん
に、飽和炭酸水素す） ＩＪクム溶液０．５ ｍｅ及び
水４ ｍｅを４℃で加え、沈でんを溶解する。
に、飽和炭酸水素す） ＩＪクム溶液０．５ ｍｅ及び
水４ ｍｅを４℃で加え、沈でんを溶解する。
この溶解液（４，５ｍｅ）を、０．５％シュークロース
含有の０．０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡
化シタセファクリルＳ−２００スーパーフアイン（１，
６Ｘ９０σ、１８０ｍｅ）のカラムに、流速・０．１５
ｍｅ１分で流し、４℃でゲル濾過を行なう。
含有の０．０２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡
化シタセファクリルＳ−２００スーパーフアイン（１，
６Ｘ９０σ、１８０ｍｅ）のカラムに、流速・０．１５
ｍｅ１分で流し、４℃でゲル濾過を行なう。
通液開始後、９０．３〜１５０．５−目の溶出液を集め
る。溶出液を限外濾過膜Ｙ Ｍ １０ （４３ｍ）を用
いて、４℃で限外濾過して濃縮する。
る。溶出液を限外濾過膜Ｙ Ｍ １０ （４３ｍ）を用
いて、４℃で限外濾過して濃縮する。
−２０℃でチオシアン酸カリウムを飽和し、ＩＮ塩酸で
ｐＨ３，５としたエタノール８０ｍ１！を、−２０℃で
冷却下撹拌する。このチオシアン酸カリウム・エタノー
ル溶液に、限外ｐ過残留液５ｍ／にＩＮ塩酸を加え、ｐ
Ｈ３，５に調整した溶液を８５分間要して徐々に滴下す
る。−２０°Ｃで２０分撹拌後、−１０℃〜−５℃、３
０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離する。沈でんを除
き、上清液に、４℃撹拌下０．ＩＮ水酸化ナトリウム水
溶液を、１１５分かけて加えｐＨ５，５とする。４℃で
２０分撹拌した後、θ℃３０００ｒ、ｐ、ｍで、２０分
間遠心分−離する。沈でんを除いた後、上清液に、４℃
撹拌下０．ＩＮ水酸化ナトリクム水溶液を３０分間を要
して加え１． ｐＨ５，，８とする。４°Ｃで２０分間
撹拌した後、０℃、３０００ｒ、ｐ、ｍで、２０分間遠
心分離する。沈でんを除いた後、上清液に、４℃撹拌下
０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を４０分を要して加え
ｐＨ８，０とする。４℃で２０分間撹拌した後、０℃、
３０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離する。上清を除
いた後、沈でんに、０．５％マンニトールを含む０．０
１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）５０ｍｅを加え、沈
でんを、溶解する。溶解液を、−〇、５％マンニトール
を含む０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４，８ｊ
’）を用いて、４℃で１夜透析する。透析した後の液量
は、５２ ｍｅで蛋白質含量４、８ ＷＩｇインターフ
ェロン総活性１３．５×１０７／工Ｕ／／ を含有し、インターフェロン比？ｌＪ、ｓ Ｘ １０７
ＩＵ／〜蛋白質であり、上記部分精製インターフェロ
ン溶液からの精製率は１１７倍で回収率は６７．５係で
あり、粗製インターフェロン溶液からのインターフェロ
ンの精製率は１９，０００倍で、回収率は５４．７％で
ある。
ｐＨ３，５としたエタノール８０ｍ１！を、−２０℃で
冷却下撹拌する。このチオシアン酸カリウム・エタノー
ル溶液に、限外ｐ過残留液５ｍ／にＩＮ塩酸を加え、ｐ
Ｈ３，５に調整した溶液を８５分間要して徐々に滴下す
る。−２０°Ｃで２０分撹拌後、−１０℃〜−５℃、３
０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離する。沈でんを除
き、上清液に、４℃撹拌下０．ＩＮ水酸化ナトリウム水
溶液を、１１５分かけて加えｐＨ５，５とする。４℃で
２０分撹拌した後、θ℃３０００ｒ、ｐ、ｍで、２０分
間遠心分−離する。沈でんを除いた後、上清液に、４℃
撹拌下０．ＩＮ水酸化ナトリクム水溶液を３０分間を要
して加え１． ｐＨ５，，８とする。４°Ｃで２０分間
撹拌した後、０℃、３０００ｒ、ｐ、ｍで、２０分間遠
心分離する。沈でんを除いた後、上清液に、４℃撹拌下
０．ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を４０分を要して加え
ｐＨ８，０とする。４℃で２０分間撹拌した後、０℃、
３０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離する。上清を除
いた後、沈でんに、０．５％マンニトールを含む０．０
１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）５０ｍｅを加え、沈
でんを、溶解する。溶解液を、−〇、５％マンニトール
を含む０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４，８ｊ
’）を用いて、４℃で１夜透析する。透析した後の液量
は、５２ ｍｅで蛋白質含量４、８ ＷＩｇインターフ
ェロン総活性１３．５×１０７／工Ｕ／／ を含有し、インターフェロン比？ｌＪ、ｓ Ｘ １０７
ＩＵ／〜蛋白質であり、上記部分精製インターフェロ
ン溶液からの精製率は１１７倍で回収率は６７．５係で
あり、粗製インターフェロン溶液からのインターフェロ
ンの精製率は１９，０００倍で、回収率は５４．７％で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ｔ＋） インターフェロンを酸エタノール分別性でん
法で精製する操作において、インターフ１．エロン水溶
液を、約ｐＨ３，５のチオシアン酸カリウム・エタノー
ル溶液に加え、インターフェロンのチオシアン酸カリウ
ム・エタノール溶液を得ることを特徴とするインターフ
ェロンの精製法。 （２） 粗製インターフェロン水溶液を強酸性陽イオ
ン交換体で処理し、次いで、得られたインターフェロン
含有分画にトリクロル酢酸を加え、得られた沈でんをア
ルカリ水に溶解し、透析後、透析−内液をチオシアン酸
カリウム塩析に付し、次いで、得られた沈でんをアルカ
リ水に溶解し、ゲレレ許過後、得られたインターフェロ
ン含有分画を限外濾過に付し、次いで得られた限外ｐ過
残留液を多孔性ガラス粒子に接舶させ、次いで多孔性ガ
ラス粒子に吸着したインターフェロンをチオシアン酸カ
リウム溶液で溶出し、次いで得られたインターフェロン
含有分画を弱酸性に調整し、生ずる沈でんをアルカリ水
に溶解し、ゲル濾過後、得られたインターフェロン含有
分画を限外濾過に付し、次いで得られた限外ｐ過残留液
を酸エタノール分別性でん法に付し、得らねだインター
フェロン含有分画を透析することを特徴とするインター
フェロンの精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56188898A JPS5889196A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | インタ−フエロンの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56188898A JPS5889196A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | インタ−フエロンの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5889196A true JPS5889196A (ja) | 1983-05-27 |
| JPH0361440B2 JPH0361440B2 (ja) | 1991-09-19 |
Family
ID=16231805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56188898A Granted JPS5889196A (ja) | 1981-11-24 | 1981-11-24 | インタ−フエロンの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5889196A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0226639A1 (en) * | 1985-05-29 | 1987-07-01 | The Green Cross Corporation | Process for preparing heterogenic protein |
| JPH01281097A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-11-13 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | ヒトインターフェロンの製造方法 |
| KR100369582B1 (ko) * | 1995-09-04 | 2003-04-03 | 동아제약 주식회사 | 재조합알파-인터페론의정제방법 |
| WO2003027138A1 (fr) * | 2001-09-25 | 2003-04-03 | Japan As Represented By President Of National Cancer Center | Nouveau procede de criblage dans la recherche d'un marqueur du cancer |
-
1981
- 1981-11-24 JP JP56188898A patent/JPS5889196A/ja active Granted
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0226639A1 (en) * | 1985-05-29 | 1987-07-01 | The Green Cross Corporation | Process for preparing heterogenic protein |
| EP0226639A4 (en) * | 1985-05-29 | 1988-09-07 | Green Cross Corp | PROCESS FOR THE PREPARATION OF A HETEROGENEOUS PROTEIN. |
| JPH01281097A (ja) * | 1988-03-04 | 1989-11-13 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | ヒトインターフェロンの製造方法 |
| KR100369582B1 (ko) * | 1995-09-04 | 2003-04-03 | 동아제약 주식회사 | 재조합알파-인터페론의정제방법 |
| WO2003027138A1 (fr) * | 2001-09-25 | 2003-04-03 | Japan As Represented By President Of National Cancer Center | Nouveau procede de criblage dans la recherche d'un marqueur du cancer |
| US7868137B2 (en) | 2001-09-25 | 2011-01-11 | Japan As Represented By President Of National Cancer Center | Search for cancer markers by a novel screening method |
| US7868136B2 (en) | 2001-09-25 | 2011-01-11 | Japan As Represented By President Of National Cancer Center | Search for cancer markers by a screening method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0361440B2 (ja) | 1991-09-19 |
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