JPH0779709B2 - Ｇｍ‐ｃｓｆの精製 - Google Patents
Ｇｍ‐ｃｓｆの精製Info
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- JPH0779709B2 JPH0779709B2 JP63506144A JP50614488A JPH0779709B2 JP H0779709 B2 JPH0779709 B2 JP H0779709B2 JP 63506144 A JP63506144 A JP 63506144A JP 50614488 A JP50614488 A JP 50614488A JP H0779709 B2 JPH0779709 B2 JP H0779709B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
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- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の要約 本発明は顆粒球−マイクロファージ−コロニー刺激因子
（GM−CSF）、特にヒトGM−CSFの精製法に関する。
（GM−CSF）、特にヒトGM−CSFの精製法に関する。
これらの因子の検出、単離および精製はきわめて困難で
ある。それは、それらが一般に含まれる上澄液の性質、
混合物中の各種成分の活性の相違（divergencies）およ
び交叉、これらの因子の特性を確認するために用いられ
るアッセイ法の感度（またはその欠如）、これらの因子
の分子量範囲その他の特性がしばしば類似すること、こ
れらの因子の濃度がそれらの天然状態においてきわめて
低いことなどによってしばしば複雑なためである。
ある。それは、それらが一般に含まれる上澄液の性質、
混合物中の各種成分の活性の相違（divergencies）およ
び交叉、これらの因子の特性を確認するために用いられ
るアッセイ法の感度（またはその欠如）、これらの因子
の分子量範囲その他の特性がしばしば類似すること、こ
れらの因子の濃度がそれらの天然状態においてきわめて
低いことなどによってしばしば複雑なためである。
本発明方法は、高い比生物活性、高い電気泳動純度を備
え、かつ発熱物質その他の汚染物質の水準が低いGM−CS
Fを与える特定の一連の精製工程を提供する。
え、かつ発熱物質その他の汚染物質の水準が低いGM−CS
Fを与える特定の一連の精製工程を提供する。
背景 循環している血球は絶えず新たに産生された血球で置換
されている。置換する血球は造皿と呼ばれる過程で形成
され、その際少なくとも下記の８種の系統の成熟血球が
産生される：赤血球、マクロファージ（単球）、好酸性
顆粒球、巨核球（血小板）、好中性顆粒球、好塩基性顆
粒球（肥満細胞）、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球〔バ
ーゲス（Burgess）およびニコラ（Nicola）、Growth Fa
ctors and Stem Cells（アカデミック・プレス、ニュー
ヨーク、1983年）参照〕。血球形成の制御の多くはコロ
ニー刺激因子（CSF）と呼ばれる一群の相互作用性糖蛋
白質によって媒介される。これらの糖蛋白質はそれらの
存在を検出するのに用いるインビボおよびインビトロア
ッセイ法によってこのように命名された。半固形培地に
おいて造血細胞をクローン培養する技術はインビトロア
ッセイ法の開発に特に重要であった。この種の培養にお
いて個々の幹細胞（progenitor cell）（すなわち、発
生的に特性の系統に拘束されてはいるが、なお増殖しう
るもの）は匹敵するインビボ過程と本質的に等しいと考
えられる様式で増殖し、成熟子孫のコロニーを形成しう
る。
されている。置換する血球は造皿と呼ばれる過程で形成
され、その際少なくとも下記の８種の系統の成熟血球が
産生される：赤血球、マクロファージ（単球）、好酸性
顆粒球、巨核球（血小板）、好中性顆粒球、好塩基性顆
粒球（肥満細胞）、Ｔリンパ球、およびＢリンパ球〔バ
ーゲス（Burgess）およびニコラ（Nicola）、Growth Fa
ctors and Stem Cells（アカデミック・プレス、ニュー
ヨーク、1983年）参照〕。血球形成の制御の多くはコロ
ニー刺激因子（CSF）と呼ばれる一群の相互作用性糖蛋
白質によって媒介される。これらの糖蛋白質はそれらの
存在を検出するのに用いるインビボおよびインビトロア
ッセイ法によってこのように命名された。半固形培地に
おいて造血細胞をクローン培養する技術はインビトロア
ッセイ法の開発に特に重要であった。この種の培養にお
いて個々の幹細胞（progenitor cell）（すなわち、発
生的に特性の系統に拘束されてはいるが、なお増殖しう
るもの）は匹敵するインビボ過程と本質的に等しいと考
えられる様式で増殖し、成熟子孫のコロニーを形成しう
る。
より多量のCSFが主として分子クローニングにより入手
可能となるのに伴って、これらの臨床的利用法を見出す
ことに関心が高まった。血球産生の刺激が望まれる幾つ
かの臨床的状況、たとえば腫瘍の化学療法または放射線
療法後のリハビリテーション療法、骨髄性発育不全の治
療、好中球欠乏症の治療、骨髄移植後の造血再生を高め
るための治療、および立証された感染症に対する宿主の
抵抗性を高めるための治療にこれらを利用することが示
唆された。
可能となるのに伴って、これらの臨床的利用法を見出す
ことに関心が高まった。血球産生の刺激が望まれる幾つ
かの臨床的状況、たとえば腫瘍の化学療法または放射線
療法後のリハビリテーション療法、骨髄性発育不全の治
療、好中球欠乏症の治療、骨髄移植後の造血再生を高め
るための治療、および立証された感染症に対する宿主の
抵抗性を高めるための治療にこれらを利用することが示
唆された。
GM−CSFに対する相補的DNA（cDNA）、すなわち顆粒球お
よびマクロファージの増殖および発生を支持する因子が
近年多数の研究所においてクローン化され、配列決定さ
れた。さらに非組換えGM−CSFがMO細胞系列の培養上澄
液から精製され（米国特許第4,438,032号明細書に記載
されている）、Ｎ未満から最初の16個のアミノ酸が配列
決定された〔ガソン（Gasson）ら、Science,Vol.226,pg
s.1339−1342（1984）〕。ヒトGM−CSF間にはヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列の異質性が認められた。た
とえばアミノ酸レベルではＮ未満アラニンに対する位置
100にスレオニンおよびイソロイシンの双方が見られ、
これはヒト集団内に幾つかの対立形質または多形性のGM
−CSFが存在することを示す。
よびマクロファージの増殖および発生を支持する因子が
近年多数の研究所においてクローン化され、配列決定さ
れた。さらに非組換えGM−CSFがMO細胞系列の培養上澄
液から精製され（米国特許第4,438,032号明細書に記載
されている）、Ｎ未満から最初の16個のアミノ酸が配列
決定された〔ガソン（Gasson）ら、Science,Vol.226,pg
s.1339−1342（1984）〕。ヒトGM−CSF間にはヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列の異質性が認められた。た
とえばアミノ酸レベルではＮ未満アラニンに対する位置
100にスレオニンおよびイソロイシンの双方が見られ、
これはヒト集団内に幾つかの対立形質または多形性のGM
−CSFが存在することを示す。
cDNAの再調製（de novo preparation）およびクローニ
ングのための、ならびにcDNAライブラリーの構成のため
の各種方法が現在得られる。
ングのための、ならびにcDNAライブラリーの構成のため
の各種方法が現在得られる。
たとえば目的活性を示すポリペプチドを産生する細胞
（たとえば形質転換していないヒトＴ細胞）から全mRNA
を抽出する。この全mRNAからプライマー開始による逆転
写を用いてまず各mRNA配列の相補体を形成し、次いで第
２鎖合成を開始することにより、二本鎖cDNAを構成する
ことができる。次いで、適切な制限部位を含むリンカー
セグメントを用いて形成された相補的ホモポリマー末端
または付着端を介してcDNAを適切なプラスミドまたはバ
クテリオファージベクターに結合させ、次いて適切な宿
主を形質転換することにより、cDANをクローン化するこ
とができる。広範な発現系（すなわち宿主−ベクターの
組合わせ）を用いて、本発明方法により精製される蛋白
質を産生させることができる。使用可能な種類の宿主細
胞には殺菌、酵母、昆虫、哺乳動物などのものが含まれ
るが、これらに限定されない。
（たとえば形質転換していないヒトＴ細胞）から全mRNA
を抽出する。この全mRNAからプライマー開始による逆転
写を用いてまず各mRNA配列の相補体を形成し、次いで第
２鎖合成を開始することにより、二本鎖cDNAを構成する
ことができる。次いで、適切な制限部位を含むリンカー
セグメントを用いて形成された相補的ホモポリマー末端
または付着端を介してcDNAを適切なプラスミドまたはバ
クテリオファージベクターに結合させ、次いて適切な宿
主を形質転換することにより、cDANをクローン化するこ
とができる。広範な発現系（すなわち宿主−ベクターの
組合わせ）を用いて、本発明方法により精製される蛋白
質を産生させることができる。使用可能な種類の宿主細
胞には殺菌、酵母、昆虫、哺乳動物などのものが含まれ
るが、これらに限定されない。
GM−CSFを宿主細胞から抽出し、次いでこれを精製する
各種の方法が示されているが、GM−CSFは必ずしも良好
な収率で、かつ生物活性を保持した状態で適切に精製さ
れるわけではない。
各種の方法が示されているが、GM−CSFは必ずしも良好
な収率で、かつ生物活性を保持した状態で適切に精製さ
れるわけではない。
詳細な説明 本発明はGM−CSFを95％以上の均質性にまで、生物活性
を保持した状態で、かつ良好な収率で精製するための新
規な一連のクロマトグラフィー工程からなる。
を保持した状態で、かつ良好な収率で精製するための新
規な一連のクロマトグラフィー工程からなる。
本方法は、 （ａ）GM−CSF発現微生物を死滅させる工程、 （ｂ）死滅させたGM−CSF発現微生物からGM−CSFを含有
する抽出物を得る工程、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたGM−CSFを含有する抽出物
に対して第四アミノエチル（QAE）アニオン交換カラム
クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFを含有
する抽出物からプロテアーゼを分離してプロテアーゼを
含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｄ）工程（ｃ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
レッド120トリアジニル色素−リガンドアフィニティカ
ラムクロマトグラフィーを行うことにより、実質的に疎
水性不純物を含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｅ）工程（ｄ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行うことによっ
て、実質的に高分子量および低分子量の不純物を含まな
いGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｆ）工程（ｅ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
逆相カラムクロマトグラフィーを行うことによって、均
質性95％以上の純度を有するGM−CSF含有画分を得る工
程 からなる。
する抽出物を得る工程、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたGM−CSFを含有する抽出物
に対して第四アミノエチル（QAE）アニオン交換カラム
クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFを含有
する抽出物からプロテアーゼを分離してプロテアーゼを
含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｄ）工程（ｃ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
レッド120トリアジニル色素−リガンドアフィニティカ
ラムクロマトグラフィーを行うことにより、実質的に疎
水性不純物を含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｅ）工程（ｄ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行うことによっ
て、実質的に高分子量および低分子量の不純物を含まな
いGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｆ）工程（ｅ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
逆相カラムクロマトグラフィーを行うことによって、均
質性95％以上の純度を有するGM−CSF含有画分を得る工
程 からなる。
アニオン交換カラムは宿主細胞を死滅させて過したの
ち得られる上澄液からプロテアーゼを除くために用いら
れる。第四アミノエチル、混合アミンその他の中間塩基
性樹脂、または弱塩基性樹脂、たとえばｐ−アミノベン
ジルセルロースが特に有用である。第四アミノエチルが
好ましいアニオン交換樹脂である。第四アミノエチルは
架橋したデキストラン、セルロース、アガロースまたは
アクリル系支持体に付着させることができる。
ち得られる上澄液からプロテアーゼを除くために用いら
れる。第四アミノエチル、混合アミンその他の中間塩基
性樹脂、または弱塩基性樹脂、たとえばｐ−アミノベン
ジルセルロースが特に有用である。第四アミノエチルが
好ましいアニオン交換樹脂である。第四アミノエチルは
架橋したデキストラン、セルロース、アガロースまたは
アクリル系支持体に付着させることができる。
色素−リガンドアフィニティカラムは疎水性不純物を除
くために用いられる。一般的なカラムは支持体アガロー
ス上のトリアジニル色素、たとえばプロシオン・レッド
（Procion Red）HE−3B（たとえばマトレックス・ゲル
・レッドＡ、アミコン・コーポレーション、サイエンテ
ィフィック・システムズ部門、マサチュセッツ州ダンバ
ーズ；一般名「レッド120」）からなる。
くために用いられる。一般的なカラムは支持体アガロー
ス上のトリアジニル色素、たとえばプロシオン・レッド
（Procion Red）HE−3B（たとえばマトレックス・ゲル
・レッドＡ、アミコン・コーポレーション、サイエンテ
ィフィック・システムズ部門、マサチュセッツ州ダンバ
ーズ；一般名「レッド120」）からなる。
ゲル過は高分子量および低分子量の不純物を分離する
ために用いられる。特に有用な過ゲルは架橋デキスト
ラン系ゲル、たとえば商標セファデックス（SEPHADEX）
Ｇ−100表わされるファルマシア・ファイン・ケミカル
ズ（ニュージャージ州ピスカッタウェイ）製のものであ
る。この樹脂の分画分子重量範囲は球状の蛋白質および
ペプチドについては4,000〜150,000、多糖類については
1,000〜100,000である。カットオフ範囲が蛋白質につき
約1,000〜約200,000である他の市販の樹脂も使用でき
る。
ために用いられる。特に有用な過ゲルは架橋デキスト
ラン系ゲル、たとえば商標セファデックス（SEPHADEX）
Ｇ−100表わされるファルマシア・ファイン・ケミカル
ズ（ニュージャージ州ピスカッタウェイ）製のものであ
る。この樹脂の分画分子重量範囲は球状の蛋白質および
ペプチドについては4,000〜150,000、多糖類については
1,000〜100,000である。カットオフ範囲が蛋白質につき
約1,000〜約200,000である他の市販の樹脂も使用でき
る。
逆相クロマトグラフィー、たとえば高速蛋白質用液体ク
ロマトグラフィー（FPLC）および高圧液体クロマトグラ
フィー（HPLC）が、明らかなGM−CSFの変性なしに、電
気泳動により同定しうるGM−CSF関連蛋白質を分離しう
る唯一の方法であることが見出された。いずれかのC4ま
たはC8カラム、たとえびFPLCについてはPRORPC−C8（フ
ァルマシア製）、HPLCについてはダイナマックス（Dyna
max）−C4たはダイナマックス−C8（レイニン・インス
ツルメンツ社製、マサチュセッツ州ウォーバーン）を使
用しうる。
ロマトグラフィー（FPLC）および高圧液体クロマトグラ
フィー（HPLC）が、明らかなGM−CSFの変性なしに、電
気泳動により同定しうるGM−CSF関連蛋白質を分離しう
る唯一の方法であることが見出された。いずれかのC4ま
たはC8カラム、たとえびFPLCについてはPRORPC−C8（フ
ァルマシア製）、HPLCについてはダイナマックス（Dyna
max）−C4たはダイナマックス−C8（レイニン・インス
ツルメンツ社製、マサチュセッツ州ウォーバーン）を使
用しうる。
特に本発明は大腸菌内に存する下記のクローンpcD−ヒ
ト−GM−CSFのcDNA挿入配列を含む蛋白質の精製に関す
るものであり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（マリーランド州ロックビル）に受入番
号39923で寄託されている。
ト−GM−CSFのcDNA挿入配列を含む蛋白質の精製に関す
るものであり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（マリーランド州ロックビル）に受入番
号39923で寄託されている。
以下は、のちに７段階に分けて詳述する精製プロトコー
ルの一般的観点である。
ルの一般的観点である。
特に指示しない限り、操作はすべて２〜15℃で行われ
た。蛋白質の濃度は各段でクマシー・ブルー結合アッセ
イ法により測定された。pH測定値は±0.2pH単位、導電
率は±3mSの偏差である。いずれのクロマトグラフィー
処理によっても予期した程度の精製が達成されない場
合、溶出した画分を同一種類のカラム上で再度クロマト
グラフィー処理するか、またはそれ以前の１工程もしく
はそれ以前の一連の工程に再循環することができる。た
とえば後記の工程IIIで蛋白質を濃縮および／または蓄
積するために、硫酸アンモニウム沈殿および／または限
外過を行うことができる。カラムの平衡化または溶離
のいずれかに用いられるものを含めて、溶剤はすべて使
用前に0.2μメンブレンにより過される。後記の工程I
Vの後のすべての溶剤の調製に米国薬局方XIXグレードの
水を用いた。
た。蛋白質の濃度は各段でクマシー・ブルー結合アッセ
イ法により測定された。pH測定値は±0.2pH単位、導電
率は±3mSの偏差である。いずれのクロマトグラフィー
処理によっても予期した程度の精製が達成されない場
合、溶出した画分を同一種類のカラム上で再度クロマト
グラフィー処理するか、またはそれ以前の１工程もしく
はそれ以前の一連の工程に再循環することができる。た
とえば後記の工程IIIで蛋白質を濃縮および／または蓄
積するために、硫酸アンモニウム沈殿および／または限
外過を行うことができる。カラムの平衡化または溶離
のいずれかに用いられるものを含めて、溶剤はすべて使
用前に0.2μメンブレンにより過される。後記の工程I
Vの後のすべての溶剤の調製に米国薬局方XIXグレードの
水を用いた。
工程I.細胞の死滅および蛋白質の抽出 適宜な酸を順次添加することにより、たとえば85％リン
酸を添加してpH4.5となし、50％トリクロロ酢酸を添加
してpH2.0となすことにより、pHを2.0（またはそれ以
下）に調整して細胞を死滅させる。次いで懸濁用液体を
すべて細胞から除いて廃棄し、細胞の第２懸濁液を調製
し、この懸濁液を中和し、たとえば0.2μメンブレンで
過することにより、GM−CSF含有液体を懸濁細胞から
分離する。次いで抽出液の導電率を水の添加によって15
〜20mSに調整する。GM−CSFをQAEカラムに結合させるの
に必要な希釈度を最小限に抑えるためには低い導電率が
必要である。
酸を添加してpH4.5となし、50％トリクロロ酢酸を添加
してpH2.0となすことにより、pHを2.0（またはそれ以
下）に調整して細胞を死滅させる。次いで懸濁用液体を
すべて細胞から除いて廃棄し、細胞の第２懸濁液を調製
し、この懸濁液を中和し、たとえば0.2μメンブレンで
過することにより、GM−CSF含有液体を懸濁細胞から
分離する。次いで抽出液の導電率を水の添加によって15
〜20mSに調整する。GM−CSFをQAEカラムに結合させるの
に必要な希釈度を最小限に抑えるためには低い導電率が
必要である。
工程II.第四アミノエチル（QAE）カラムクロマトグラフ
ィー 中和した抽出液を必要に応じ適宜水酸化ナトリウムまた
は塩酸でpH7.5となす。脱イオン水の添加により、中和
された抽出液の導電率を５〜10mSに調整する。QAEカラ
ムその他の適宜なアニオン交換カラムを少なくとも２〜
３カラム容量の適宜なpH7.5の緩衝液、たとえば20mMト
リス−HClで平衡化する。GM−CSFを含有する抽出液は樹
脂のml当たり20mgを越えない装入量でカラムに施され
る。カラムを平衡化したものと同一の緩衝液に溶解した
０〜0.5Mの濃度勾配の塩化ナトリウム10〜20カラム容量
でカラムを溶離する。塩化ナトリウムその他の適宜な塩
を添加して導電率を高め、これによりGM−CSFを溶離さ
せる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）に基づく画分を合わせて工程I
IIでクロマトグラフィー処理する。
ィー 中和した抽出液を必要に応じ適宜水酸化ナトリウムまた
は塩酸でpH7.5となす。脱イオン水の添加により、中和
された抽出液の導電率を５〜10mSに調整する。QAEカラ
ムその他の適宜なアニオン交換カラムを少なくとも２〜
３カラム容量の適宜なpH7.5の緩衝液、たとえば20mMト
リス−HClで平衡化する。GM−CSFを含有する抽出液は樹
脂のml当たり20mgを越えない装入量でカラムに施され
る。カラムを平衡化したものと同一の緩衝液に溶解した
０〜0.5Mの濃度勾配の塩化ナトリウム10〜20カラム容量
でカラムを溶離する。塩化ナトリウムその他の適宜な塩
を添加して導電率を高め、これによりGM−CSFを溶離さ
せる。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）に基づく画分を合わせて工程I
IIでクロマトグラフィー処理する。
工程III.色素アフィニティクロマトグラフィー アニオン交換（たとえばQAE）カラムからの画分を合わ
せて脱イオン水で希釈して５〜10mSの導電率となし、色
素−リガンドアフィニティカラム、たとえば支持体アガ
ロースに付着させたプロシオン・レッドHE3Bに装入す
る。これはあらかじめ２〜３カラム容量の適宜なpH7.5
の緩衝液、たとえば20mMトリス−HClで平衡化されてい
る。カラムに装入する蛋白質の量はゲルのml当たり10mg
を越えるべきでない。
せて脱イオン水で希釈して５〜10mSの導電率となし、色
素−リガンドアフィニティカラム、たとえば支持体アガ
ロースに付着させたプロシオン・レッドHE3Bに装入す
る。これはあらかじめ２〜３カラム容量の適宜なpH7.5
の緩衝液、たとえば20mMトリス−HClで平衡化されてい
る。カラムに装入する蛋白質の量はゲルのml当たり10mg
を越えるべきでない。
カラムを３〜４カラム容量の平衡化用緩衝液で洗浄す
る。溶離は平衡化用緩衝液に溶解した０〜0.75Mの濃度
勾配の塩化ナトリウムその他の適宜な塩５〜15容量によ
り行われる。工程IVに用いるべき画分をSDS−PAGEに基
づいて合わせる。
る。溶離は平衡化用緩衝液に溶解した０〜0.75Mの濃度
勾配の塩化ナトリウムその他の適宜な塩５〜15容量によ
り行われる。工程IVに用いるべき画分をSDS−PAGEに基
づいて合わせる。
工程IV.限外過および／または硫酸アンモニウム沈殿
による濃縮 前工程からの合わせた画分の蛋白質濃度が1.0mg/ml未満
である場合、3,000〜5,000分子量カットオフのメンブレ
ンを用いる限外過により溶液を濃縮する。最終蛋白質
濃度を1.0mg/ml以上とすべきである。硫酸アンモニウム
を最終濃度60〜70％となるまで添加する。沈殿を遠心分
離により採取し、次いで沈殿に用いたものと同一濃度の
硫酸アンモニウムを含有する20mMトリス−HCl（pH7.5）
その他の適宜な緩衝液で１回洗浄する。沈殿を遠心分離
により採取し、同一緩衝液に溶解する。
による濃縮 前工程からの合わせた画分の蛋白質濃度が1.0mg/ml未満
である場合、3,000〜5,000分子量カットオフのメンブレ
ンを用いる限外過により溶液を濃縮する。最終蛋白質
濃度を1.0mg/ml以上とすべきである。硫酸アンモニウム
を最終濃度60〜70％となるまで添加する。沈殿を遠心分
離により採取し、次いで沈殿に用いたものと同一濃度の
硫酸アンモニウムを含有する20mMトリス−HCl（pH7.5）
その他の適宜な緩衝液で１回洗浄する。沈殿を遠心分離
により採取し、同一緩衝液に溶解する。
工程V.ゲル過クロマトグラフィー 所望により、再溶解した硫酸アンモニウム沈殿を遠心分
離により透明化することができる。溶液を0.2μフィル
ターにより過し、pH7.5の適宜な緩衝液、たとえば20m
Mトリス−HClで平衡化したゲル過カラム、たとえばセ
ファデックスＧ−100カラムに装入する。カラムに装入
する蛋白質の量はゲルのml当たり3mgを越えるべきでな
い。カラムを同一の緩衝液で溶離する。工程VIの画分を
SDS−PAGEに基づいて合わせる。
離により透明化することができる。溶液を0.2μフィル
ターにより過し、pH7.5の適宜な緩衝液、たとえば20m
Mトリス−HClで平衡化したゲル過カラム、たとえばセ
ファデックスＧ−100カラムに装入する。カラムに装入
する蛋白質の量はゲルのml当たり3mgを越えるべきでな
い。カラムを同一の緩衝液で溶離する。工程VIの画分を
SDS−PAGEに基づいて合わせる。
工程VI.逆相カラムクロマトグラフィー ゲル過で得た合わせた画分を0.2μフィルターに導通
し、そして逆相カラム、たとえばFPLCまたはHPLCカラム
に装入する。カラムを酸性溶液、たとえば0.1％トリフ
ルオロ酢酸（TFA）で平衡化し、酸性溶液に溶解した０
〜100％の濃度勾配の不活性溶剤、たとえばアセトニト
リルを用いて溶離する。SDS−PAGEに基づいて画分を合
わせる。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末をpH7.2の緩衝
液、たとえば20mMリン酸ナトリウムに溶解する。
し、そして逆相カラム、たとえばFPLCまたはHPLCカラム
に装入する。カラムを酸性溶液、たとえば0.1％トリフ
ルオロ酢酸（TFA）で平衡化し、酸性溶液に溶解した０
〜100％の濃度勾配の不活性溶剤、たとえばアセトニト
リルを用いて溶離する。SDS−PAGEに基づいて画分を合
わせる。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末をpH7.2の緩衝
液、たとえば20mMリン酸ナトリウムに溶解する。
工程VII.精製したGM−CSFの透析 工程VIからの溶液をpH7.2の緩衝液、たとえば20mMリン
酸ナトリウムに対し透析する。２回の緩衝液交換を行
い、各交換の間を最低４〜５時間とする。必要により透
析した溶液を3,000〜5,000分子量カットオフのメンブレ
ンによる限外過によって少なくとも1.0mg/mlの蛋白質
濃度になるまで濃縮する。精製したGM−CSFの溶液を0.2
μフィルターに導通し、約−20℃以下で凍結保存する。
酸ナトリウムに対し透析する。２回の緩衝液交換を行
い、各交換の間を最低４〜５時間とする。必要により透
析した溶液を3,000〜5,000分子量カットオフのメンブレ
ンによる限外過によって少なくとも1.0mg/mlの蛋白質
濃度になるまで濃縮する。精製したGM−CSFの溶液を0.2
μフィルターに導通し、約−20℃以下で凍結保存する。
以下はGM−CSF精製の詳細な例である。ローマ数字は前
記の一般的記載の工程のものに相当する。
記の一般的記載の工程のものに相当する。
工程II.QAEカラムクロマトグラフィー 中和した蛋白質抽出液を水酸化ナトリウムでpH7.5に調
製した。次いで抽出液を脱イオン冷水で約２倍希釈して
最終導電率8mSとなした。6.5lのカラム〔バイオプロセ
ス（BIOPROCESS）252/15、ファルマシア製〕を３カラム
容量の20mMトリス−HCl（pH7.5）で平衡化した。抽出液
（50l）を樹脂のml当たり蛋白質8.6mgの装入量でカラム
に施した。カラムを400ml/分の流量で、まず平衡化用緩
衝液30lで、次いで35lの20mMトリス−HCl（pH7.5）およ
び35lの20mMトリス−HCl（pH7.5）−0.4M・NaClを含有
−の間で得られる濃度勾配70lで溶離した。画分（４〜5
l）をゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基づいて合わせ、プ
ールした蛋白質（2.0g）を工程IIIでクロマトグラフィ
ー処理した。
製した。次いで抽出液を脱イオン冷水で約２倍希釈して
最終導電率8mSとなした。6.5lのカラム〔バイオプロセ
ス（BIOPROCESS）252/15、ファルマシア製〕を３カラム
容量の20mMトリス−HCl（pH7.5）で平衡化した。抽出液
（50l）を樹脂のml当たり蛋白質8.6mgの装入量でカラム
に施した。カラムを400ml/分の流量で、まず平衡化用緩
衝液30lで、次いで35lの20mMトリス−HCl（pH7.5）およ
び35lの20mMトリス−HCl（pH7.5）−0.4M・NaClを含有
−の間で得られる濃度勾配70lで溶離した。画分（４〜5
l）をゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基づいて合わせ、プ
ールした蛋白質（2.0g）を工程IIIでクロマトグラフィ
ー処理した。
工程III.色素アフィニティクロマトグラフィー QAEカラムからの合わせた画分を限外過（3,000〜5,00
0分子量カットオフのメンブレン）により１にまで濃
縮し、次いで冷脱イオン冷水で５倍希釈して8mSの導電
率となした。次いでこのプール（5l）を6.7mg/mlの比率
で、あらかじめ３カラム容量の20mMトリス−HCl（pH7.
5）で平衡化した300mlのマトレックス・ゲル・レッド
（Matrex Gel Red A:一般名「レッド120」）Ａカラムに
装填した。次いでカラムを平衡化用緩衝液600mlで洗浄
し、2.0gの装入物を1.5lの20mMトリス−HCl（pH7.5）お
よび1.5lの20mMトリス−HCl（pH7.5）−0.75M・NaClを
含有−の間に得られる直線濃度勾配により溶離した。画
分をゲル電気泳動に基づいて合わせ、これらの画分（蛋
白質1.12gを含有する1.5l）を工程IVで限外過により
濃縮した。
0分子量カットオフのメンブレン）により１にまで濃
縮し、次いで冷脱イオン冷水で５倍希釈して8mSの導電
率となした。次いでこのプール（5l）を6.7mg/mlの比率
で、あらかじめ３カラム容量の20mMトリス−HCl（pH7.
5）で平衡化した300mlのマトレックス・ゲル・レッド
（Matrex Gel Red A:一般名「レッド120」）Ａカラムに
装填した。次いでカラムを平衡化用緩衝液600mlで洗浄
し、2.0gの装入物を1.5lの20mMトリス−HCl（pH7.5）お
よび1.5lの20mMトリス−HCl（pH7.5）−0.75M・NaClを
含有−の間に得られる直線濃度勾配により溶離した。画
分をゲル電気泳動に基づいて合わせ、これらの画分（蛋
白質1.12gを含有する1.5l）を工程IVで限外過により
濃縮した。
工程IV.限外過による、色素−リガンド溶出液の濃縮 色素−リガンドクロマトグラフィーの溶出液1.5lは0.75
mg/mlを含有していた。このプールの限外過をアミコ
ン高出力ステンレス鋼製攪拌セル（モデル2000）中で行
った。YM−５メンブレン（150mm）（アミコン）を流量1
0ml/分、80PSIおよび４℃で用いた。試料を75mlの容量
および10〜15mg/mlで濃縮した。限外過ののち、試料
を.22μの硝酸セルロースメンブレンにより過した。
硫酸アンモニウムを添加して最終濃度60％（390mg/ml）
となした。溶液を混合せずに２時間、４℃に保持し、次
いで4,000rpmで４℃において45分間遠心分離した。沈殿
を採取し、飽和硫酸アンモニウム60％を含有する20mMト
リス−HCl（pH7.5）１に４℃で再懸濁した。試料を4,
000rpmで４℃において45分間遠心分離した。
mg/mlを含有していた。このプールの限外過をアミコ
ン高出力ステンレス鋼製攪拌セル（モデル2000）中で行
った。YM−５メンブレン（150mm）（アミコン）を流量1
0ml/分、80PSIおよび４℃で用いた。試料を75mlの容量
および10〜15mg/mlで濃縮した。限外過ののち、試料
を.22μの硝酸セルロースメンブレンにより過した。
硫酸アンモニウムを添加して最終濃度60％（390mg/ml）
となした。溶液を混合せずに２時間、４℃に保持し、次
いで4,000rpmで４℃において45分間遠心分離した。沈殿
を採取し、飽和硫酸アンモニウム60％を含有する20mMト
リス−HCl（pH7.5）１に４℃で再懸濁した。試料を4,
000rpmで４℃において45分間遠心分離した。
工程V.セファデックスＧ−100クロマトグラフィー 再溶解した硫酸アンモニウムペレットを2lのカラムに2m
l/分の流量で装入した。樹脂のml当たり蛋白質0.5mgの
装入比を用い、試料を平衡化用緩衝液、20mMトリス−HC
l（pH7.5）で溶離した。画分をゲル電気泳動（SDS−PAG
E）に基づいて合わせ、蛋白質350mgを含有する300ml容
量をこれが逆相カラムに施されるまで−20℃で凍結し
た。
l/分の流量で装入した。樹脂のml当たり蛋白質0.5mgの
装入比を用い、試料を平衡化用緩衝液、20mMトリス−HC
l（pH7.5）で溶離した。画分をゲル電気泳動（SDS−PAG
E）に基づいて合わせ、蛋白質350mgを含有する300ml容
量をこれが逆相カラムに施されるまで−20℃で凍結し
た。
工程VI.逆相カラムクロマトグラフィー ゲル過カラムの画分を合わせて0.2μフィルターに導
通し、20mlのPRORPC−C2/C8（ファルマシア）に2.5ml/
分の流量で装入した。カラムはあらかじめ水中に0.1％T
FAを含有する溶剤で平衡化されていた。等しいクロマト
グラフィーを４回（各操作当たり100mg）行った。35％
アセトニトリル、0.1％TFA、および100％アセトニトリ
ル、0.1％TFAの間の直線濃度勾配を用いて試料を125分
間にわたって溶離した。画分をSDS−PAGEに基づいて合
わせた。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末を20mMリン酸ナト
リウム（pH7.2）に溶解した。
通し、20mlのPRORPC−C2/C8（ファルマシア）に2.5ml/
分の流量で装入した。カラムはあらかじめ水中に0.1％T
FAを含有する溶剤で平衡化されていた。等しいクロマト
グラフィーを４回（各操作当たり100mg）行った。35％
アセトニトリル、0.1％TFA、および100％アセトニトリ
ル、0.1％TFAの間の直線濃度勾配を用いて試料を125分
間にわたって溶離した。画分をSDS−PAGEに基づいて合
わせた。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末を20mMリン酸ナト
リウム（pH7.2）に溶解した。
工程VII.精製GM−CSFの透析 逆相カラムからのプールを20mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.2）３回交換に対し透析した。次いで溶液を0.2μ
フィルターにより無菌過し、−20℃で凍結した。
（pH7.2）３回交換に対し透析した。次いで溶液を0.2μ
フィルターにより無菌過し、−20℃で凍結した。
フロントページの続き (72)発明者 コセッキ，ロバート・エイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07054, パーシッパニー，ホワイト・バーチ・レー ン 29 (72)発明者 レイチェート，ポール アメリカ合衆国ニュージャージー州 07045，モントビル，カンブレー・ロード 11 (56)参考文献 特開 昭61−7296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−153752（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．69，Ｎｏ．１ （1987．１）Ｐ．43−51
Claims (2)
- 【請求項１】顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因
子（GM−CSF）を、GM−CSF発現微生物から精製する方法
であって、 前記方法は、 （ａ）GM−CSF発現微生物を死滅させる工程、 （ｂ）死滅させたGM−CSF発現微生物からGM−CSFを含有
する抽出物を得る工程、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたGM−CSFを含有する抽出物
に対して第四アミノエチル（QAE）アニオン交換カラム
クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFを含有
する抽出物からプロテアーゼを分離してプロテアーゼを
含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｄ）工程（ｃ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
レッド120トリアジニル色素−リガンドアフィニティカ
ラムクロマトグラフィーを行うことにより、実質的に疎
水性不純物を含まないGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｅ）工程（ｄ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行うことによっ
て、実質的に高分子量および低分子量の不純物を含まな
いGM−CSF含有画分を得る工程、 （ｆ）工程（ｅ）で得られたGM−CSF含有画分に対して
逆相カラムクロマトグラフィーを行うことによって、均
質性95％以上の純度を有するGM−CSF含有画分を得る工
程 からなる方法。 - 【請求項２】逆相カラムクロマトグラフィーを、高圧液
体クロマトグラフィー（HPLC）または高速蛋白質用液体
クロマトグラフィー（FPLC）により行う請求項１の方
法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7441087A | 1987-07-16 | 1987-07-16 | |
| US74410 | 1987-07-16 | ||
| PCT/US1988/002294 WO1989000579A1 (en) | 1987-07-16 | 1988-07-13 | Purification of gm-csf |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02502640A JPH02502640A (ja) | 1990-08-23 |
| JPH0779709B2 true JPH0779709B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=22119421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63506144A Expired - Lifetime JPH0779709B2 (ja) | 1987-07-16 | 1988-07-13 | Ｇｍ‐ｃｓｆの精製 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0368904A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0779709B2 (ja) |
| KR (1) | KR930007430B1 (ja) |
| AT (1) | ATE79884T1 (ja) |
| AU (1) | AU632460B2 (ja) |
| DE (1) | DE3874034T2 (ja) |
| DK (1) | DK11290D0 (ja) |
| ES (1) | ES2034239T3 (ja) |
| GR (1) | GR3006267T3 (ja) |
| HK (1) | HK182095A (ja) |
| IE (1) | IE63323B1 (ja) |
| IL (1) | IL87123A0 (ja) |
| MY (1) | MY103539A (ja) |
| NZ (1) | NZ225410A (ja) |
| WO (1) | WO1989000579A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA885100B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO1989010403A1 (en) * | 1988-04-21 | 1989-11-02 | Medvet Science Pty. Ltd. | Human gm-csf variants |
| KR100406019B1 (ko) * | 1998-09-30 | 2004-03-20 | 주식회사유한양행 | 겔여과컬럼크로마토그래피를이용한봉입체형태의인체과립성백혈구콜로니자극인자의재생방법 |
| US7598356B2 (en) | 2004-07-08 | 2009-10-06 | Board of Regents of the University of Nebraska by and on behalf of the University of Nebraska Medical Center | Method for purifying a protein of the cystine-knot superfamily |
| PT3116891T (pt) | 2014-03-10 | 2020-05-18 | Richter Gedeon Nyrt | Purificação de imunoglobulina utilizando passos de pré-limpeza |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS617296A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-13 | イミユネツクス、コ−ポレ−シヨン | インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ |
| JPS62153752A (ja) * | 1985-12-27 | 1987-07-08 | Showa Denko Kk | クロマトグラフイ−用吸着担体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0188479B1 (en) * | 1984-07-06 | 1991-09-11 | Sandoz Ag | Lymphokine production and purification |
| JPS61124392A (ja) * | 1984-11-22 | 1986-06-12 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 |
| EP0215126B1 (en) * | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
-
1988
- 1988-07-13 AT AT88306421T patent/ATE79884T1/de active
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- 1988-07-13 ES ES198888306421T patent/ES2034239T3/es not_active Expired - Lifetime
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- 1988-07-13 DE DE8888306421T patent/DE3874034T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-13 EP EP88306421A patent/EP0299746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-13 WO PCT/US1988/002294 patent/WO1989000579A1/en not_active Application Discontinuation
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- 1988-07-14 IE IE214688A patent/IE63323B1/en not_active IP Right Cessation
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- 1988-07-14 MY MYPI88000777A patent/MY103539A/en unknown
- 1988-07-15 IL IL87123A patent/IL87123A0/xx not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-01-15 DK DK011290A patent/DK11290D0/da not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-11-18 GR GR920402625T patent/GR3006267T3/el unknown
-
1995
- 1995-11-30 HK HK182095A patent/HK182095A/xx unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS617296A (ja) * | 1984-06-19 | 1986-01-13 | イミユネツクス、コ−ポレ−シヨン | インタ−ロイキン１の遺伝子の精製、クロ−ニング及び特性づけ |
| JPS62153752A (ja) * | 1985-12-27 | 1987-07-08 | Showa Denko Kk | クロマトグラフイ−用吸着担体 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．１（１９８７．１）Ｐ．４３−５１ |
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| DE3874034T2 (de) | 1993-01-07 |
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| AU2085188A (en) | 1989-02-13 |
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