JPH02115196A - エリスロポエチンの精製法 - Google Patents
エリスロポエチンの精製法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、外因性DNA配列の原核生物または真核生物
宿主発現の産物であるヒト・エリスロポエチン(EPO
)糖蛋白を、それを含有する培養物から精製する方法お
よびかく得られたヒトEPO糖蛋白に関する。
宿主発現の産物であるヒト・エリスロポエチン(EPO
)糖蛋白を、それを含有する培養物から精製する方法お
よびかく得られたヒトEPO糖蛋白に関する。
発明の背景
EPOは分子量が約34000ダルトンの酸性糖蛋白で
ある。該ポリペプチド鎖は166個のアミノ酸よりなり
、リーダー鎖が27個のアミノ酸で、糖含量は24−3
1%である。EPOは哺乳動物における赤血球細胞形成
の一次レギュレーターである。EPOは、骨髄中の原始
前駆体細胞を、ヘモグロビンを成熟させ、合成し、かつ
赤血球細胞として循環系に放出される前赤芽球へ変換す
るのを刺激することによって赤血球生産を増加させる。
ある。該ポリペプチド鎖は166個のアミノ酸よりなり
、リーダー鎖が27個のアミノ酸で、糖含量は24−3
1%である。EPOは哺乳動物における赤血球細胞形成
の一次レギュレーターである。EPOは、骨髄中の原始
前駆体細胞を、ヘモグロビンを成熟させ、合成し、かつ
赤血球細胞として循環系に放出される前赤芽球へ変換す
るのを刺激することによって赤血球生産を増加させる。
EPOは腎臓によって産生される。
DNA組換え技術の出現前においては、貧血ヒツジの血
漿からの精製によって少量のEPOが得られ、ヒトEP
Oは無形成貧血患者の尿から得られていた。ヒトEPO
精製の1つの方法は、ティ・ミャケ、シイ・ワンプおよ
びイー・ゴールドワサー(T Miyake、 CKu
ng and E Goldwasser)による「ヒ
ト・エリスロボエチンの精製(Purificatio
nor Human ErYt、hropoietin
)Jなる標題の報告文、ザ・ジャーナル・オブ・バイオ
口・ジカル・ケミストリー(丁he Journal
of Biological Chemistry)、
252巻、15号、5558−5564頁、1977年
、に詳細に記載されている。この報告文に従い、無形成
貧血患者の尿由来のヒトEPOが見たところ均質に精製
された。イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈
澱、ゲル濾過、および吸着クロマトグラフィーを含む7
エ程法により、70400ユニット/mg蛋白の効力の
ものが21 %の収率で調製された。これは、930の
純化ファクター(purification fact
or)を示す。該精製されたホルモンはp H’lのポ
リアクリルアミドゲルにおいて、pH7のドデンル硫酸
ナトリウムの存在において、およびpH6のTrito
n X−100の存在において単一の成分を有していた
。ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によって、効力
および分子サイズが同一であるがp H9における移動
度がわずかに異なる2つの画分が分画の最終工程で得ら
れた。
漿からの精製によって少量のEPOが得られ、ヒトEP
Oは無形成貧血患者の尿から得られていた。ヒトEPO
精製の1つの方法は、ティ・ミャケ、シイ・ワンプおよ
びイー・ゴールドワサー(T Miyake、 CKu
ng and E Goldwasser)による「ヒ
ト・エリスロボエチンの精製(Purificatio
nor Human ErYt、hropoietin
)Jなる標題の報告文、ザ・ジャーナル・オブ・バイオ
口・ジカル・ケミストリー(丁he Journal
of Biological Chemistry)、
252巻、15号、5558−5564頁、1977年
、に詳細に記載されている。この報告文に従い、無形成
貧血患者の尿由来のヒトEPOが見たところ均質に精製
された。イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈
澱、ゲル濾過、および吸着クロマトグラフィーを含む7
エ程法により、70400ユニット/mg蛋白の効力の
ものが21 %の収率で調製された。これは、930の
純化ファクター(purification fact
or)を示す。該精製されたホルモンはp H’lのポ
リアクリルアミドゲルにおいて、pH7のドデンル硫酸
ナトリウムの存在において、およびpH6のTrito
n X−100の存在において単一の成分を有していた
。ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によって、効力
および分子サイズが同一であるがp H9における移動
度がわずかに異なる2つの画分が分画の最終工程で得ら
れた。
ヒト・エリスロボエチンについての引き続いて(7)
研究成果は、エム・ニス・ドーダル、エフ・エフ・ワン
プおよびイー・ゴールドワサー(M S D。
研究成果は、エム・ニス・ドーダル、エフ・エフ・ワン
プおよびイー・ゴールドワサー(M S D。
rdal、F F Wang and E Goldw
asser)による「エリスロポエチン作用における炭
化水素の役割(TheRole of Carbohy
draLe in Erythropoietin A
ction)Jなる標題の報告文、エンドクリノロジー
(Endocrinology)、116巻、6号、2
293−2299頁、1985年、に報告されている。
asser)による「エリスロポエチン作用における炭
化水素の役割(TheRole of Carbohy
draLe in Erythropoietin A
ction)Jなる標題の報告文、エンドクリノロジー
(Endocrinology)、116巻、6号、2
293−2299頁、1985年、に報告されている。
この報告文はミャケら(Miyake at al)に
よる報告文に詳細に記載されている方法で得られI:ヒ
トEPOの2つの形態の炭化水素組成を扱っている。ド
ルダールら(Dordal et al)によって決定
されたごとくσ−EPOおよびβ−EPOと名付けられ
た2つの画分の炭化水素組成を以下の表に記載する。
よる報告文に詳細に記載されている方法で得られI:ヒ
トEPOの2つの形態の炭化水素組成を扱っている。ド
ルダールら(Dordal et al)によって決定
されたごとくσ−EPOおよびβ−EPOと名付けられ
た2つの画分の炭化水素組成を以下の表に記載する。
第1表
EPOの炭化水素組成
糖(ng/μg)
t −EPOI−EPOP
フコース 18土3.5 16士0.4
NSCガラクトース 56土6.4 48±0.
7 NSDマンノース 41土6.0 3
4±4.2 N5DN−アセチル 69±0.
9 48±3.2 P<0.001グルコサミン N−アセチル 130±17,7 95土7.6 P<0.05 ノイラミン酸 この報告文は、ヒト尿由来のEPOはその炭化水素組成
に関して不均質であることを示す。
NSCガラクトース 56土6.4 48±0.
7 NSDマンノース 41土6.0 3
4±4.2 N5DN−アセチル 69±0.
9 48±3.2 P<0.001グルコサミン N−アセチル 130±17,7 95土7.6 P<0.05 ノイラミン酸 この報告文は、ヒト尿由来のEPOはその炭化水素組成
に関して不均質であることを示す。
エクスベレンチア(Experentia)、29.7
58X(1973)の注において、シーバー、イスコブ
およびウィンターハルター(Sieber、1scov
e andWinterhalt6r)は、安息香酸吸
着によって糖蛋白含量について、およびサイズの均一性
についてすでに選択されたヒトvP、EPOの調製物の
さらなる精製にコンカナバリン−A−セファロースを適
用したことを報告している。Can−A−セファロース
カラムに非付着性の物質はずべての初期EPO活性を含
んでいた。彼らは、レクチンを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーによって、同様のサイズの不純物糖蛋
白(該不純物糖蛋白はそれに付着しないEPOと共にレ
クチンに付着している)をEPO調製物から選択的に除
くことができると結論した。
58X(1973)の注において、シーバー、イスコブ
およびウィンターハルター(Sieber、1scov
e andWinterhalt6r)は、安息香酸吸
着によって糖蛋白含量について、およびサイズの均一性
についてすでに選択されたヒトvP、EPOの調製物の
さらなる精製にコンカナバリン−A−セファロースを適
用したことを報告している。Can−A−セファロース
カラムに非付着性の物質はずべての初期EPO活性を含
んでいた。彼らは、レクチンを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーによって、同様のサイズの不純物糖蛋
白(該不純物糖蛋白はそれに付着しないEPOと共にレ
クチンに付着している)をEPO調製物から選択的に除
くことができると結論した。
[不溶化したフィトヘマグルチニン上でのヒト尿エリス
ロポエチンおよび顆粒細胞コロニー刺激因子のクロマト
グラフィー(Chromatography ofHu
man Urinary Erythropoieti
n and GranulocyteColony−5
timulating Factor on Inso
lublizedphytohaemaggtutin
in)」なる標題の後期の報告文、バイオシミ力・工・
バイオフィジカ・アクタ(Bi−ochimica e
t Biophysica Acta)、496(19
77)146−154において、シーバー(Siebe
r)は、ヒト尿EPOが、アガロースまたは多孔性ガラ
スにカップリングしたフィトヘマグルチニン、インゲン
マメ属ゴガツササゲ(Phaseo 1us)からのレ
クチンに吸着され、塩化マグネシウム飽和溶液によって
定量的な溶出されてその部分的精製物が達成されること
を報告している。シーバー(S 1eber)によって
用いられたEPOは、最初、安息香酸への吸着、イオン
交換クロマトグラフィーによるさらなる精製、およびあ
る場合にはコンカナバリン−A−セファロース上でのさ
らなるアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過お
よびリン酸カルシウム上でのクロマトグラフィーによっ
て尿から抽出された。ヒト尿EP○のDEAE−セルロ
ース−18’IJI K 料をフィトヘマグルチニン−
セファ0−ス上のクロマトグラフィーに付すと、実質的
にすべての活性が結合された。MgC0,2の飽和溶液
でほとんど定量的な溶出を行って11゜8倍増加した特
異的活性を有する物質が得られた。
ロポエチンおよび顆粒細胞コロニー刺激因子のクロマト
グラフィー(Chromatography ofHu
man Urinary Erythropoieti
n and GranulocyteColony−5
timulating Factor on Inso
lublizedphytohaemaggtutin
in)」なる標題の後期の報告文、バイオシミ力・工・
バイオフィジカ・アクタ(Bi−ochimica e
t Biophysica Acta)、496(19
77)146−154において、シーバー(Siebe
r)は、ヒト尿EPOが、アガロースまたは多孔性ガラ
スにカップリングしたフィトヘマグルチニン、インゲン
マメ属ゴガツササゲ(Phaseo 1us)からのレ
クチンに吸着され、塩化マグネシウム飽和溶液によって
定量的な溶出されてその部分的精製物が達成されること
を報告している。シーバー(S 1eber)によって
用いられたEPOは、最初、安息香酸への吸着、イオン
交換クロマトグラフィーによるさらなる精製、およびあ
る場合にはコンカナバリン−A−セファロース上でのさ
らなるアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過お
よびリン酸カルシウム上でのクロマトグラフィーによっ
て尿から抽出された。ヒト尿EP○のDEAE−セルロ
ース−18’IJI K 料をフィトヘマグルチニン−
セファ0−ス上のクロマトグラフィーに付すと、実質的
にすべての活性が結合された。MgC0,2の飽和溶液
でほとんど定量的な溶出を行って11゜8倍増加した特
異的活性を有する物質が得られた。
さらに、安息香酸への吸着およびDEAEセルロース、
コンカナバリン−A−セファロース、セファデックスc
−iooおよびリン酸カルシウム上のクロマトグラフィ
ーによってすでに精製されたヒ)1iEPOの試料をフ
ィトヘマグルチニン−セファロース上のクロマトグラフ
ィーに付すと、さらに6.7倍の特異的活性の増加が達
成された。この物質は、電気泳動に付すと、3つのブロ
ードなバンド、1つのシャープなバンドおよび種々の非
常に弱いバンドを示した。かくして、該精製法はEPO
を含有する均質な調製物を得るには至もなかっtこ。
コンカナバリン−A−セファロース、セファデックスc
−iooおよびリン酸カルシウム上のクロマトグラフィ
ーによってすでに精製されたヒ)1iEPOの試料をフ
ィトヘマグルチニン−セファロース上のクロマトグラフ
ィーに付すと、さらに6.7倍の特異的活性の増加が達
成された。この物質は、電気泳動に付すと、3つのブロ
ードなバンド、1つのシャープなバンドおよび種々の非
常に弱いバンドを示した。かくして、該精製法はEPO
を含有する均質な調製物を得るには至もなかっtこ。
[エリスロポエチン:レクチンーアガロース誘導体での
アフィニティークロマトグラフィーによる単離(Ery
thropoietin: l5olation by
affinitychromatography w
ith Iectin−agarose deriva
t−ives)J、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ(Proc、
Natl。
アフィニティークロマトグラフィーによる単離(Ery
thropoietin: l5olation by
affinitychromatography w
ith Iectin−agarose deriva
t−ives)J、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ(Proc、
Natl。
Acad、 Sci、 )U S A、 74巻、10
号、4633−4635頁、1977年8月、なる探題
の報告文において、スピバク、スモールおよびホレンベ
ルグ(Spivak、Sma11 and Ho11e
nberg)は、アガロース−結合レクチンを用いるア
フィニティークロマトグラフィーを用いてヒツジ血漿お
よびヒト尿EP○の粗製調製物からEPOを単離したこ
とを報告している。6種のレクチン(麦芽凝集素、フィ
トヘマグルチニン、リンナス・コミュニス(Rici−
nus communis) l 20、大豆凝集素、
フンカナバリンA1およびリムリン(limulin)
)が調べられた。麦芽凝集素−アガロースおよびフィト
ヘマグルチニン−アガロース誘導体のみがエリスロポエ
チンについて有意な親和性を有していた。ヒト尿EPO
については、麦芽凝集素−アガロースカラムを用い、適
当なN−アセチルグルコサミンのごとき適当なレクチン
−特異的糖で溶出し、EPOは95%を越える最初の出
発蛋白から分離でき、その結果8倍の精製および40%
の回収が達成された。著者らによると、回収されたEP
Oの特異的活性および糖溶出物からの蛋白の電気泳動分
析により、アフィニティークロマトグラフィーによって
精製された物質は、出発物質よりはるかに少ない成分よ
り成るものの、なおEP○以外に多数の蛋白を含有する
ことが示された。
号、4633−4635頁、1977年8月、なる探題
の報告文において、スピバク、スモールおよびホレンベ
ルグ(Spivak、Sma11 and Ho11e
nberg)は、アガロース−結合レクチンを用いるア
フィニティークロマトグラフィーを用いてヒツジ血漿お
よびヒト尿EP○の粗製調製物からEPOを単離したこ
とを報告している。6種のレクチン(麦芽凝集素、フィ
トヘマグルチニン、リンナス・コミュニス(Rici−
nus communis) l 20、大豆凝集素、
フンカナバリンA1およびリムリン(limulin)
)が調べられた。麦芽凝集素−アガロースおよびフィト
ヘマグルチニン−アガロース誘導体のみがエリスロポエ
チンについて有意な親和性を有していた。ヒト尿EPO
については、麦芽凝集素−アガロースカラムを用い、適
当なN−アセチルグルコサミンのごとき適当なレクチン
−特異的糖で溶出し、EPOは95%を越える最初の出
発蛋白から分離でき、その結果8倍の精製および40%
の回収が達成された。著者らによると、回収されたEP
Oの特異的活性および糖溶出物からの蛋白の電気泳動分
析により、アフィニティークロマトグラフィーによって
精製された物質は、出発物質よりはるかに少ない成分よ
り成るものの、なおEP○以外に多数の蛋白を含有する
ことが示された。
「エリスロボエチンの部分的精製についての固定化レク
チンおよび他のりガントの使用(Use ofImmo
bilizedLectinsandOtherLig
andsforthe Partial Purifi
cation of Erythropoietin)
」、ブラッド(Blood)、52巻、6号(12月)
、1978年、なる標題のさらなる報告文において、ス
ビバク、スモール、シャーペルおよびホレンベルグ(S
pivak、 Sma11、 5haper and
)(o11enberg)は、該ホルモンの粗製調製物
中の汚染蛋白がらEPOを単離するための種々のアフィ
ニティー吸着剤の能力について報告している。彼らは、
アフィニティータロマドグラフィーはEPOの部分的精
製を達成するのに用いることができるが、均質に精製さ
れたEPOを得るには、アフィニティークロマトグラフ
ィー以外に他の分離技術に頼る必要があると結論した。
チンおよび他のりガントの使用(Use ofImmo
bilizedLectinsandOtherLig
andsforthe Partial Purifi
cation of Erythropoietin)
」、ブラッド(Blood)、52巻、6号(12月)
、1978年、なる標題のさらなる報告文において、ス
ビバク、スモール、シャーペルおよびホレンベルグ(S
pivak、 Sma11、 5haper and
)(o11enberg)は、該ホルモンの粗製調製物
中の汚染蛋白がらEPOを単離するための種々のアフィ
ニティー吸着剤の能力について報告している。彼らは、
アフィニティータロマドグラフィーはEPOの部分的精
製を達成するのに用いることができるが、均質に精製さ
れたEPOを得るには、アフィニティークロマトグラフ
ィー以外に他の分離技術に頼る必要があると結論した。
ヒト尿EPOについては、彼らはアガロース−結合Co
n−A上のクロマトグラフィーで2倍の精製および80
%回収を得;アガロース−結合WGAまたはPHAで、
該ホルモンをアフィニティー吸着剤から放出させるのに
選択した剤に依存して、2ないし8倍の精製を達成した
。
n−A上のクロマトグラフィーで2倍の精製および80
%回収を得;アガロース−結合WGAまたはPHAで、
該ホルモンをアフィニティー吸着剤から放出させるのに
選択した剤に依存して、2ないし8倍の精製を達成した
。
それらのデータは、EPOをアガロース−WGAから溶
出させるにおいて、二糖N、N−ジアセチルキトビオー
スは単糖N−アセチルグルコサミンよりも効果的であり
、一方、塩酸グアニジンはアガロース−PHAをリガン
ドとして使用した場合に効果的な溶出剤であることを示
している。
出させるにおいて、二糖N、N−ジアセチルキトビオー
スは単糖N−アセチルグルコサミンよりも効果的であり
、一方、塩酸グアニジンはアガロース−PHAをリガン
ドとして使用した場合に効果的な溶出剤であることを示
している。
「疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いるヒト・エ
リスロボエチンの単離についての新しい調製方法(A
New Preparative Method fo
r l5olation of Human E
rythropoietin with Hydr
ophob−ic Interaction Chro
matography)j 、ブラッド(Blood)
、56巻、4号(10月)、1980年、620頁、な
る標題の報告文において、リー・ファン(Lee−Hu
ang)は、フェニル−セファロースCLJB上の疎水
性相互作用クロマトグラフィーを用いるヒト尿EPOの
単離についての新しい調製方法について報告している。
リスロボエチンの単離についての新しい調製方法(A
New Preparative Method fo
r l5olation of Human E
rythropoietin with Hydr
ophob−ic Interaction Chro
matography)j 、ブラッド(Blood)
、56巻、4号(10月)、1980年、620頁、な
る標題の報告文において、リー・ファン(Lee−Hu
ang)は、フェニル−セファロースCLJB上の疎水
性相互作用クロマトグラフィーを用いるヒト尿EPOの
単離についての新しい調製方法について報告している。
この報告文において、リー・ファン(Lee−Huan
g)は、Con−A−セファロース4B、続いてのWG
−セファロース6MBまたはPHA (E)−セファロ
ース4B上のアフィニティークロマトグラフィーは粗製
尿濃縮物の剋理における最初の工程として同等に有用で
あると述べている。しかしながら、銀色素および他の不
純物がこれらのレクチンに不可逆的に結合し、それらの
能力の十分な再生は可能ではなかった。これらのカラム
の価格およびそれらの維持は例外的に高いものであった
。加えて、溶出剤N−アセチルグルコサミンまたはN、
N−ジアセチルキトビオースはNaOHおよびエチレン
グリコールよりもかなり高価である。操作費用は大き過
ぎて、それらのレクチンを粗製尿試料の調製処理にルー
チン的に使用するには適さない。しかしながら、最初の
疎水性相互作用クロマトグラフィーの後、後期段階にお
いてこれらの技術を精製手法への取り入れるのは価値あ
ることが判明した。尿素色素の大部分はフェニル−セフ
ァロースCL4Bによって除去され、かくして、これら
のレクチンの十分な再生を達成することができる。
g)は、Con−A−セファロース4B、続いてのWG
−セファロース6MBまたはPHA (E)−セファロ
ース4B上のアフィニティークロマトグラフィーは粗製
尿濃縮物の剋理における最初の工程として同等に有用で
あると述べている。しかしながら、銀色素および他の不
純物がこれらのレクチンに不可逆的に結合し、それらの
能力の十分な再生は可能ではなかった。これらのカラム
の価格およびそれらの維持は例外的に高いものであった
。加えて、溶出剤N−アセチルグルコサミンまたはN、
N−ジアセチルキトビオースはNaOHおよびエチレン
グリコールよりもかなり高価である。操作費用は大き過
ぎて、それらのレクチンを粗製尿試料の調製処理にルー
チン的に使用するには適さない。しかしながら、最初の
疎水性相互作用クロマトグラフィーの後、後期段階にお
いてこれらの技術を精製手法への取り入れるのは価値あ
ることが判明した。尿素色素の大部分はフェニル−セフ
ァロースCL4Bによって除去され、かくして、これら
のレクチンの十分な再生を達成することができる。
「急速5工程法によるヒト・エリスロポエチンの均質物
への精製(Purification of Huma
n Eryt−hropoietin to Homo
geneity by a Rapid Five−3
Lep Procedure)J 、ブラッド(Blo
od)、67巻、1号(1月)、1986年、71ない
し79頁、なる標題の報告文において、クリスタル、バ
ンクラツ、ファルバーおよびスマート(Krystal
、 Pankratz、Farber and Sma
rt)は、5工程法を用いてヒト尿EPOを精製して収
率25%で80000/mgの能力を持つ調製物を得た
ことを報告している。該5工程は、(1)CMアフィー
ゲルブル−(Affi−Gel Blue)上のアフィ
ニティークロマトグラフィー (2)クロマトフオーカ
シング、(3)麦芽レクチン(またはヒドロキシル−ア
パタイト)クロマトグラフィー (4)フェニルカラム
を用いる逆相高速液体クロマトグラフィ=(HPLC)
、および(5)調製ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を含む。
への精製(Purification of Huma
n Eryt−hropoietin to Homo
geneity by a Rapid Five−3
Lep Procedure)J 、ブラッド(Blo
od)、67巻、1号(1月)、1986年、71ない
し79頁、なる標題の報告文において、クリスタル、バ
ンクラツ、ファルバーおよびスマート(Krystal
、 Pankratz、Farber and Sma
rt)は、5工程法を用いてヒト尿EPOを精製して収
率25%で80000/mgの能力を持つ調製物を得た
ことを報告している。該5工程は、(1)CMアフィー
ゲルブル−(Affi−Gel Blue)上のアフィ
ニティークロマトグラフィー (2)クロマトフオーカ
シング、(3)麦芽レクチン(またはヒドロキシル−ア
パタイト)クロマトグラフィー (4)フェニルカラム
を用いる逆相高速液体クロマトグラフィ=(HPLC)
、および(5)調製ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を含む。
この報告文の著者がクロマトフォー力シング工程からの
ある種のEPO調製物は麦芽分別によく適合していない
、すなわちEPO活性のほとんどはレクチンに結合しな
いことを指摘しているのは注目すべきである。これらの
場合、著者はヒドロキンルーアパタイトクロマトグラフ
ィーを用いた。
ある種のEPO調製物は麦芽分別によく適合していない
、すなわちEPO活性のほとんどはレクチンに結合しな
いことを指摘しているのは注目すべきである。これらの
場合、著者はヒドロキンルーアパタイトクロマトグラフ
ィーを用いた。
要約すると、いくつかの報告文はレクチン類を用いるヒ
トR試料からのEPOの部分的精製を教示するが、この
プロセスはEPOの精製についての単一工程プロセスと
して効果的でなく、さらにこのプロセスを用いると特異
的活性が最大12倍の精製が達成できるにすぎないと結
論される。
トR試料からのEPOの部分的精製を教示するが、この
プロセスはEPOの精製についての単一工程プロセスと
して効果的でなく、さらにこのプロセスを用いると特異
的活性が最大12倍の精製が達成できるにすぎないと結
論される。
DNA組換え技術の出現とともに、ヒトEP○の第一次
構造コンフォメーションの一部またはすべておよび生物
学的特性の1またはそれ以上を有する糖蛋白が産生され
てきた(該糖蛋白は外因性DNA配列の原核生物または
真核生物宿主発現の産物である)。例えば、EPOまた
はその同族体のアミノ酸残基の配列の一部またはすべて
についてコード付けするゲノミックDNA、cDNAお
よび製造されたDNA配列が、使用される自律複製プラ
スミドまたはウィルスベクターに組み込まれて培地中の
細菌、酵母またはを椎動物細胞のごとき適当な原核生物
または真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェ
クトすることが行われてきた。かかる細胞の培養の結果
、EPOについてコード付けする遺伝子または遺伝子類
が発現され、ヒトEPOの一次構造コンフォメージョン
の一部またはすべておよび生物学的特性の1またはそれ
以上ををするポリペプチドが産生され、次いで、細胞培
養においてかかるポリペプチドがグリコジル化されてE
PO[蛋白が産生される。培養培地または細胞溶解物も
しくは断片からの単離に際し、DNA配列発現の産物は
、例えば、ヒトまたはサル種起源のEPOの免疫学的特
性ならびにin vitroおよびin vivo生物
学的活性を示す。これらの遺伝子工学によるEPO糖蛋
白はそれらの精製について新しい方法が開発されるのを
必要としている。
構造コンフォメーションの一部またはすべておよび生物
学的特性の1またはそれ以上を有する糖蛋白が産生され
てきた(該糖蛋白は外因性DNA配列の原核生物または
真核生物宿主発現の産物である)。例えば、EPOまた
はその同族体のアミノ酸残基の配列の一部またはすべて
についてコード付けするゲノミックDNA、cDNAお
よび製造されたDNA配列が、使用される自律複製プラ
スミドまたはウィルスベクターに組み込まれて培地中の
細菌、酵母またはを椎動物細胞のごとき適当な原核生物
または真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェ
クトすることが行われてきた。かかる細胞の培養の結果
、EPOについてコード付けする遺伝子または遺伝子類
が発現され、ヒトEPOの一次構造コンフォメージョン
の一部またはすべておよび生物学的特性の1またはそれ
以上ををするポリペプチドが産生され、次いで、細胞培
養においてかかるポリペプチドがグリコジル化されてE
PO[蛋白が産生される。培養培地または細胞溶解物も
しくは断片からの単離に際し、DNA配列発現の産物は
、例えば、ヒトまたはサル種起源のEPOの免疫学的特
性ならびにin vitroおよびin vivo生物
学的活性を示す。これらの遺伝子工学によるEPO糖蛋
白はそれらの精製について新しい方法が開発されるのを
必要としている。
ヘウィソク・アンド・シーク(Hewick and
5ee−hra)に与えられた米国特許第467719
5号は、280ナノメーターにおいて吸光度単位当り少
なくとも約80000 1Uの特異的活性を有する部分
的に精製されたEPOを逆相高速液体クロマトグラフィ
ーによって処理し、次いで逆相高速液体クロマトグラフ
ィー上で単一のピークとして移動しかつ280ナノメー
タにおける吸光度単位当り少なくとも+60000 1
0の特異的活性によって特徴付けられる均質なヒトEP
Oをそれから溶出させることを特徴とする(無形成貧血
に罹った患者の血液または尿からのもの、または細胞培
養および発酵法によるEPOの産生用生物中に導入され
た遺伝子工学ベクターの発現からのものであってもよい
)ヒトEPOの精製法を開示している。しかしながら、
この精製法は、ヒトEPOを含有する少量の培養物を扱
うことができるにすぎず、しかも費用がかかるという不
利を有している。
5ee−hra)に与えられた米国特許第467719
5号は、280ナノメーターにおいて吸光度単位当り少
なくとも約80000 1Uの特異的活性を有する部分
的に精製されたEPOを逆相高速液体クロマトグラフィ
ーによって処理し、次いで逆相高速液体クロマトグラフ
ィー上で単一のピークとして移動しかつ280ナノメー
タにおける吸光度単位当り少なくとも+60000 1
0の特異的活性によって特徴付けられる均質なヒトEP
Oをそれから溶出させることを特徴とする(無形成貧血
に罹った患者の血液または尿からのもの、または細胞培
養および発酵法によるEPOの産生用生物中に導入され
た遺伝子工学ベクターの発現からのものであってもよい
)ヒトEPOの精製法を開示している。しかしながら、
この精製法は、ヒトEPOを含有する少量の培養物を扱
うことができるにすぎず、しかも費用がかかるという不
利を有している。
かくして、外因性DNA配列の原核生物または真核生物
宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白の精製法の改良
が望まれている。
宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白の精製法の改良
が望まれている。
発明の開示
本発明により、
(a)レクチンが付着するクロマトグラフィーで用いる
のに適した支持体に培養物を接触させて選択的にヒトE
PO糖蛋白を結合させ;次いで、(b)適当な溶出剤で
該支持体からヒトEPO糖蛋白を溶出させる工程を包含
することを特徴とする外因性DNA配列の原核生物また
は真核生物宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白を、
それを含有する培養物から精製する方法が提供される。
のに適した支持体に培養物を接触させて選択的にヒトE
PO糖蛋白を結合させ;次いで、(b)適当な溶出剤で
該支持体からヒトEPO糖蛋白を溶出させる工程を包含
することを特徴とする外因性DNA配列の原核生物また
は真核生物宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白を、
それを含有する培養物から精製する方法が提供される。
本発明の方法は、工程(a)に先立つ培養物から工程(
b)の後の溶出物にかけて50倍、より好ま゛しくは8
0倍、EPOの特異的活性を増加させる。
b)の後の溶出物にかけて50倍、より好ま゛しくは8
0倍、EPOの特異的活性を増加させる。
好ましくは、本発明の方法は、例えば、クロマトグラフ
ィーによってヒトEPO糖蛋白を溶出物から分離するこ
とよりなる第3の工程、すなわち工程(C)を含む。
ィーによってヒトEPO糖蛋白を溶出物から分離するこ
とよりなる第3の工程、すなわち工程(C)を含む。
工程(b)において、適当な溶出剤は好ましくはN−ア
セチルグルコサミンである。
セチルグルコサミンである。
精製されるべき培養物はいずれの先行精製工程にも付さ
れていない1種またはそれ以上のヒトEPO糖蛋白を含
有する培養物上澄みであってよい。
れていない1種またはそれ以上のヒトEPO糖蛋白を含
有する培養物上澄みであってよい。
別法として、精製されるべき培養物は、1種またはそれ
以上のヒトEPO糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフ
ィニティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒト
EPOf11?i白または糖蛋白類を選択的に結合させ
、次いで適当な溶出剤でヒトEPOM蛋白または糖蛋白
類を該支持体から溶出させて溶出物を得ることよりなる
前処理工程からの溶出物であってもよい。
以上のヒトEPO糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフ
ィニティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒト
EPOf11?i白または糖蛋白類を選択的に結合させ
、次いで適当な溶出剤でヒトEPOM蛋白または糖蛋白
類を該支持体から溶出させて溶出物を得ることよりなる
前処理工程からの溶出物であってもよい。
好ましくは、ヒトEPOは、ジエイ・ニス・ボウエル、
ケイ・エル・バーフナ−、アール・ブイ・レボ、および
ジェイ・ダブリュー・アダムソン(J S Powe1
1、にL Berkner、 RV Levo、 an
d J WAdamson’)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(
Proc、 Na−tl、 Acad、 Sci、 )
、83巻、6465ないし6449頁、1986年9月
、の方法に従い、哺乳動物細胞系、より好ましくはベビ
ー・ハムスター腎細胞系によって産生されたものである
。
ケイ・エル・バーフナ−、アール・ブイ・レボ、および
ジェイ・ダブリュー・アダムソン(J S Powe1
1、にL Berkner、 RV Levo、 an
d J WAdamson’)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(
Proc、 Na−tl、 Acad、 Sci、 )
、83巻、6465ないし6449頁、1986年9月
、の方法に従い、哺乳動物細胞系、より好ましくはベビ
ー・ハムスター腎細胞系によって産生されたものである
。
本発明のもう1つの態様により、本発明の方法による産
生物が提供される。
生物が提供される。
本発明の方法は、得られる産生物が実質的に均質である
ように、培養物に含有され得る他のヒトEPO糖蛋白よ
りも特定のヒトEPO糖蛋白または特定のクラスのヒト
EPO糖蛋白類について選択的であると考えられる。
ように、培養物に含有され得る他のヒトEPO糖蛋白よ
りも特定のヒトEPO糖蛋白または特定のクラスのヒト
EPO糖蛋白類について選択的であると考えられる。
本発明のさらなる態様により、腎臓病についての腎透析
中の患者で見い出される貧血、癌に伴う貧血、無形成貧
血、血液喪失に起因する貧血、慢性腎臓病に伴う貧血を
包含する貧血の治療に用いるだめの、および供血に先立
って赤血球細胞質量を増加させるための本発明の方法に
よる産生物が提供される。
中の患者で見い出される貧血、癌に伴う貧血、無形成貧
血、血液喪失に起因する貧血、慢性腎臓病に伴う貧血を
包含する貧血の治療に用いるだめの、および供血に先立
って赤血球細胞質量を増加させるための本発明の方法に
よる産生物が提供される。
本発明のなおさらなる態様により、本発明の方法による
産生物を含有する医薬組成物が提供される。
産生物を含有する医薬組成物が提供される。
本発明の第1の態様は、外因性DNA配列の原核生物ま
たは真核生物宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白を
それを含有する培地から精製する方法である。
たは真核生物宿主発現の産物であるヒトEPO糖蛋白を
それを含有する培地から精製する方法である。
本発明の方法の第1の工程では、レクチンが付着するク
ロマトグラフィーで用いるのに適した支持体に培養物を
接触させて選択的にヒトEPO糖蛋白を結合させる。
ロマトグラフィーで用いるのに適した支持体に培養物を
接触させて選択的にヒトEPO糖蛋白を結合させる。
該支持体は、レクチンの活性を変化させることなくレク
チンを付着させることができるいずれの適当な支持体で
あってもよい。適当な支持体はセファロースである。
チンを付着させることができるいずれの適当な支持体で
あってもよい。適当な支持体はセファロースである。
レクチンはいずれの適当なレクチンであってもよい。レ
クチンはN−アセチルグルコサミンおよび/まt;は(
N−アセチルノイラミン酸としても公知である)シアル
酸残基を認識できなければならない。例えば、レクチン
はジャガイモレクチンまたは麦芽レクチンであってよい
。好ましいレクチンは麦芽レクチンである。
クチンはN−アセチルグルコサミンおよび/まt;は(
N−アセチルノイラミン酸としても公知である)シアル
酸残基を認識できなければならない。例えば、レクチン
はジャガイモレクチンまたは麦芽レクチンであってよい
。好ましいレクチンは麦芽レクチンである。
一般に、レクチンが付着する支持体は、ヒトEPO糖蛋
白を含有する培養物がカラムを通過できるように適当な
カラム中に入れる。
白を含有する培養物がカラムを通過できるように適当な
カラム中に入れる。
本発明の方法はヒトEPO糖蛋白を含有する培養物を最
初に精製してなくても実施できることは注目すべきであ
る。かくして、該培養物は、例えば、いずれの先行精製
工程にも付されていない1種またはそれ以上のヒトEP
○糖蛋白を含有する培養物上澄みであってもよい。
初に精製してなくても実施できることは注目すべきであ
る。かくして、該培養物は、例えば、いずれの先行精製
工程にも付されていない1種またはそれ以上のヒトEP
○糖蛋白を含有する培養物上澄みであってもよい。
別法として、精製すべき培養物は、1種またはそれ以上
のヒトEPO糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフィニ
ティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒトEP
O糖蛋白または糖蛋白類を選択的に結合させ、次いで適
当な溶出剤でヒトEPO糖蛋白または糖蛋白類を該支持
体から溶出させて溶出物を得ることよりなる前処理工程
からの溶出物であってもよい。該支持体は、例えば、ブ
ルー・セファ0−ス(Blue 5epharose)
のごときセフ70−スであってよく、溶出剤は塩化ナト
リウムのリン酸ナトリウムのごとき適当な緩衝液中溶液
であってよい。
のヒトEPO糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフィニ
ティークロマトグラフィー支持体と接触させてヒトEP
O糖蛋白または糖蛋白類を選択的に結合させ、次いで適
当な溶出剤でヒトEPO糖蛋白または糖蛋白類を該支持
体から溶出させて溶出物を得ることよりなる前処理工程
からの溶出物であってもよい。該支持体は、例えば、ブ
ルー・セファ0−ス(Blue 5epharose)
のごときセフ70−スであってよく、溶出剤は塩化ナト
リウムのリン酸ナトリウムのごとき適当な緩衝液中溶液
であってよい。
本発明の方法の第2の工程において、該支持体に結合し
たヒトEPO糖蛋白を適当な溶出剤でそこから溶出させ
る。好ましい溶出剤はN−アセチルグルコサミンである
。
たヒトEPO糖蛋白を適当な溶出剤でそこから溶出させ
る。好ましい溶出剤はN−アセチルグルコサミンである
。
本発明の方法の第3の任意的工程では、ヒトEPO糖蛋
白を溶出剤から分離する。ヒl−E P O糖蛋白を溶
出剤および他の少量不純物から分離する好ましい方法は
、例えばDEAE−セファロースカラム上のクロマトグ
ラフィーによる。
白を溶出剤から分離する。ヒl−E P O糖蛋白を溶
出剤および他の少量不純物から分離する好ましい方法は
、例えばDEAE−セファロースカラム上のクロマトグ
ラフィーによる。
出発培養物は培養物上澄みであってもよいか、あるいは
1種またはそれ以上のヒトEPO糖蛋白を含有していて
もよい培養物上澄みから得たものであってもよい。好ま
しくは、培養物上澄みは哺乳動物細胞系によって産生さ
れたもの、好ましくはベビー・ハムスター腎細胞系によ
って産生されたものである。
1種またはそれ以上のヒトEPO糖蛋白を含有していて
もよい培養物上澄みから得たものであってもよい。好ま
しくは、培養物上澄みは哺乳動物細胞系によって産生さ
れたもの、好ましくはベビー・ハムスター腎細胞系によ
って産生されたものである。
本発明の方法は培養物中に見い出すことができる他のヒ
トEPO糖蛋白よりも特定のヒトEPO糖蛋白または特
定のクラスのヒトEPO糖蛋白類について選択すること
が判明した。
トEPO糖蛋白よりも特定のヒトEPO糖蛋白または特
定のクラスのヒトEPO糖蛋白類について選択すること
が判明した。
本発明の方法を用いると、蛋白1mg当り2000Uの
特異的活性を有する培養物から、標準的な公知濃度、す
なわち1罰当り組換体ヒトEPO50μgを用いて決定
して蛋白1mg当り200000 U±10000
Uの特異的活性を有する組換体ヒトEPO糖蛋白を産生
できた。すなわち、特異的活性の100倍増加である。
特異的活性を有する培養物から、標準的な公知濃度、す
なわち1罰当り組換体ヒトEPO50μgを用いて決定
して蛋白1mg当り200000 U±10000
Uの特異的活性を有する組換体ヒトEPO糖蛋白を産生
できた。すなわち、特異的活性の100倍増加である。
これは、従前の公知プロセスを利用して行ったものより
も特異的活性がかなり改良されている。
も特異的活性がかなり改良されている。
本発明の第2の態様は均質に精製されたヒトEPOまた
はヒトEPO類のクラスであると考えられる本発明の方
法による産生物である。
はヒトEPO類のクラスであると考えられる本発明の方
法による産生物である。
本発明の方法による産生物は種々のタイプの貧血の治療
に用いることができ、この目的にはかがる使用に適した
医薬組成物に処方できる。
に用いることができ、この目的にはかがる使用に適した
医薬組成物に処方できる。
衷亙久
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例1
本実施例は2工程法を用いる細胞培養物上澄み流体(C
S F)から直接にヒト組換体EP○を精製する方法に
関する。
S F)から直接にヒト組換体EP○を精製する方法に
関する。
粗製細胞培養物上澄み流体をリン酸ナトリウム(pH7
,0−7,5、終濃度0.01M)で緩衝化し、麦芽レ
クチン−セファロースカラムに直接適用する。このカラ
ムを5倍容量の0.01M!Jン酸ナトツナトリウム緩
衝液して非結合物質を除去し、次いで、0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液中の0.2M N−アセチルグルコ
サミンで溶出してEPOを放出させる。このカラムから
溶出した物質を、あらかじめリン酸塩緩衝液(0,01
M、pH7,0)で平衡化したDEAE−セファロース
カラムに直接ポンプを使用して導入する。
,0−7,5、終濃度0.01M)で緩衝化し、麦芽レ
クチン−セファロースカラムに直接適用する。このカラ
ムを5倍容量の0.01M!Jン酸ナトツナトリウム緩
衝液して非結合物質を除去し、次いで、0.01Mリン
酸ナトリウム緩衝液中の0.2M N−アセチルグルコ
サミンで溶出してEPOを放出させる。このカラムから
溶出した物質を、あらかじめリン酸塩緩衝液(0,01
M、pH7,0)で平衡化したDEAE−セファロース
カラムに直接ポンプを使用して導入する。
該カラムを10倍容量の緩衝液で洗浄してN−アセチル
グルコサミンの完全除去を確実とし、次いでリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)で溶出して結合EPOを放出させ
る。
グルコサミンの完全除去を確実とし、次いでリン酸緩衝
生理食塩水(PBS)で溶出して結合EPOを放出させ
る。
コーマシーブルーおよび銀染色両法で可視化した場合、
精製EPOは5DS−PAGE (用いた15%ゲル)
上で単一のバンドとして移動した。
精製EPOは5DS−PAGE (用いた15%ゲル)
上で単一のバンドとして移動した。
逆相HPLCによる分析は、以下の条件下、精製EPO
は単一ピークとして溶出され、保持時間は36−37分
であることを示した。
は単一ピークとして溶出され、保持時間は36−37分
であることを示した。
カラム:ベックマン・ウルトラポア(Beckman口
1trapore) RPSCC34,6mm内径x
75cm 溶媒A:氷水中0.05%トリフルオロ酢酸溶媒Bニア
セトニトリル中の0.05%トリフルオロ酢酸 グラジェント:1分当り1%にて0%Bないし70% 検出:206nmにおけるUV吸吸光 木本法より調製した物質をクリスタル・シイ(Krys
tal G、 )、イクスペリメンタル・ヘマトロジ−
(Exp、 HemaLol、)、I 1 (1983
)649の3H−チミジンアッセイに従って生物学的活
性について検定すると、蛋白1ミリグラム当り2000
00ユニット以上の特異的活性を呈する。
1trapore) RPSCC34,6mm内径x
75cm 溶媒A:氷水中0.05%トリフルオロ酢酸溶媒Bニア
セトニトリル中の0.05%トリフルオロ酢酸 グラジェント:1分当り1%にて0%Bないし70% 検出:206nmにおけるUV吸吸光 木本法より調製した物質をクリスタル・シイ(Krys
tal G、 )、イクスペリメンタル・ヘマトロジ−
(Exp、 HemaLol、)、I 1 (1983
)649の3H−チミジンアッセイに従って生物学的活
性について検定すると、蛋白1ミリグラム当り2000
00ユニット以上の特異的活性を呈する。
前記実施例の6回の試行の結果を以下の第2表に記載す
る。
る。
第2表
C3F EPO
試行No (mff) (μg)
WGL DEAE WGLについての(μg)
(μg)%収率 154 133 61.6 156 137 62.4 156 148 62.4 155 122 62.0 153 134 61.2 6 20 250 151 127 60.
4C3F−培養物上澄み流体 WGL=麦芽レクチン支持体上で回収されたEPO量 DEAE=DEAE−セファロース上で溶出剤の除去後
に回収されたEPO量 結果は、麦芽レクチン支持体上で少なくとも61−62
%の一致する収率を示す。
(μg)%収率 154 133 61.6 156 137 62.4 156 148 62.4 155 122 62.0 153 134 61.2 6 20 250 151 127 60.
4C3F−培養物上澄み流体 WGL=麦芽レクチン支持体上で回収されたEPO量 DEAE=DEAE−セファロース上で溶出剤の除去後
に回収されたEPO量 結果は、麦芽レクチン支持体上で少なくとも61−62
%の一致する収率を示す。
残存するEPOは0.1M N−アセチルノイラミン酸
および最終的には4M塩酸グアニジニウムのごときカオ
トロピック(chaotropic)剤でカラムを順次
溶出させることによって回収できる。
および最終的には4M塩酸グアニジニウムのごときカオ
トロピック(chaotropic)剤でカラムを順次
溶出させることによって回収できる。
実施例2
細胞培養物上澄み流体(C5F)から直接にヒト組換体
EPOを精製する別法として、C5Fをまず以下の前処
理に付す。
EPOを精製する別法として、C5Fをまず以下の前処
理に付す。
1.5mQ/分で供給するよう設定したマルチチャネル
襦動ポンプを用い、ブルー−セファロースCL−6B(
ファルマシア(Pharmac 1a))を含有する4
本カラム(lomf2ゲルキャバンティ)に、粗製C3
F(400m12/カラム)をポンプで送り込む。粗製
溶液を負荷した後、該カラムを同液速にて0.01Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7,0(20mQlカラム)
で洗浄する。
襦動ポンプを用い、ブルー−セファロースCL−6B(
ファルマシア(Pharmac 1a))を含有する4
本カラム(lomf2ゲルキャバンティ)に、粗製C3
F(400m12/カラム)をポンプで送り込む。粗製
溶液を負荷した後、該カラムを同液速にて0.01Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液pH7,0(20mQlカラム)
で洗浄する。
次いで、圧倒的にEPOを含有する結合物質を0.0μ
Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7,0(20mQ/カラ
ム)中の1M塩化ナトリウムで該カラムから溶出させる
。この段階で、逆相HPLCによって検定して調製物は
65%の純度であり、ブルー−セファロースからの回収
率は80%である。
Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7,0(20mQ/カラ
ム)中の1M塩化ナトリウムで該カラムから溶出させる
。この段階で、逆相HPLCによって検定して調製物は
65%の純度であり、ブルー−セファロースからの回収
率は80%である。
ブルー−セファロースは血清アルブミンの除去で第一に
使用されるかなりブロードな特異性のアフィニティー・
マトリックスである。該マトリックスはゲル1mQ当り
1.7−2−3μモルのチバクロンブルー(C4bac
ron Blue)F 3 G −A (商品名)を含
有する。
使用されるかなりブロードな特異性のアフィニティー・
マトリックスである。該マトリックスはゲル1mQ当り
1.7−2−3μモルのチバクロンブルー(C4bac
ron Blue)F 3 G −A (商品名)を含
有する。
次いで、この前処理工程により得られた調製物を実施例
1に記載した2工程法に付す。
1に記載した2工程法に付す。
本発明の方法により、容易かつ経済的に、ヒトEPO糖
蛋白を含有する培養物からかなりの量のヒトEPO糖蛋
白を回収することが可能となる。
蛋白を含有する培養物からかなりの量のヒトEPO糖蛋
白を回収することが可能となる。
さらに、本発明の方法は、精製されるべきヒトEPOを
含有する多量の培養物を扱うことができるという利点を
有する。
含有する多量の培養物を扱うことができるという利点を
有する。
発明の背景に記載したごとき先行技術を考慮しても、先
行技術が特異的活性の最大12倍増加を教示するとして
、本発明の方法が出発培養物と溶出物の間で特異的活性
を100倍増加させるのは予期せぬことである。さらに
、本発明の方法はEPOを含有する培養物の先行精製な
くして利用できることも予期せぬことである。最後に、
本発明の方法により実質的に均質である産生物が得られ
ることも予期せぬことである。
行技術が特異的活性の最大12倍増加を教示するとして
、本発明の方法が出発培養物と溶出物の間で特異的活性
を100倍増加させるのは予期せぬことである。さらに
、本発明の方法はEPOを含有する培養物の先行精製な
くして利用できることも予期せぬことである。最後に、
本発明の方法により実質的に均質である産生物が得られ
ることも予期せぬことである。
特許出願人 バイオクローンズ・
リミテッド
(プロプリエタリ)
Claims (16)
- (1)(a)レクチンが付着するクロマトグラフィーで
用いるのに適した支持体に培養物を接触させて選択的に
ヒト・エリスロポエチン(EPO)糖蛋白を結合させ;
次いで、 (b)適当な溶出剤で該支持体からヒトEPO糖蛋白を
溶出させる工程を包含することを特徴とする外因性DN
A配列の原核生物または真核生物宿主発現の産物である
ヒトEPO糖蛋白を、それを含有する培養物から精製す
る方法。 - (2)(c)ヒトEPO糖蛋白を該溶出剤から分離する
第3の工程を包含する請求項第(1)記載の方法。 - (3)該工程(c)において、ヒトEPO糖蛋白をクロ
マトグラフィーによって該溶出剤から分離する請求項第
(2)記載の方法。 - (4)該工程(a)において、該支持体がセファロース
である請求項第(1)ないし第(3)いずれか1つに記
載の方法。 - (5)該工程(a)において、該レクチンがジャガイモ
・レクチンである請求項第(1)ないし第(4)いずれ
か1つに記載の方法。 - (6)該工程(a)において、該レクチンが麦芽レクチ
ンである請求項第(1)ないし第(4)いずれか1つに
記載の方法。 - (7)該工程(b)において、該溶出剤がN−アセチル
グルコサミンである請求項第(1)ないし第(6)いず
れか1つに記載の方法。 - (8)該培養物がいずれの先行精製工程にも付されてい
ない1種またはそれ以上のヒトEPO糖蛋白を含有する
培養物上澄みである請求項第(1)ないし第(7)いず
れか1つに記載の方法。 - (9)該培養物上澄みが哺乳動物細胞系によって産生さ
れたものである請求項第(8)記載の方法。 - (10)該培養物上澄みがベビー・ハムスター腎臓細胞
系によって産生されたものである請求項第(9)記載の
方法。 - (11)該培養物が、1種またはそれ以上のヒトEPO
糖蛋白を含有する培養物上澄みをアフィニティークロマ
トグラフィー支持体に接触させてヒトEPO糖蛋白また
は糖蛋白類を選択的に結合させ、次いで溶出物を得るの
に適した溶出剤で該支持体からヒトEPO糖蛋白または
糖蛋白類を溶出させることよりなる前処理工程からの溶
出物である請求項第(1)ないし第(7)いずれか1つ
に記載の方法。 - (12)該培養物上澄みが哺乳動物細胞系によって産生
されたものである請求項第(11)記載の方法。 - (13)該培養物上澄みがベビー・ハムスター腎臓細胞
系によつて産生されたものである請求項第(12)記載
の方法。 - (14)ヒトEPO糖蛋白を含有する培養物から請求項
第(1)ないし第(13)いずれか1つに記載した方法
によって得た外因性DNA配列の原核生物または真核生
物宿主発現の産物であつて、蛋白1mg当り20000
0Uの特異的活性を有することを特徴とする精製したヒ
トEPO糖蛋白。 - (15)腎臓病についての腎透析中の患者で見い出され
る貧血、癌に伴う貧血、無形成貧血、血液喪失に起因す
る貧血、慢性腎臓病に伴う貧血を包含する貧血の治療用
の、および供血に先立って赤血球細胞質量を増加させる
ための請求項第(14)記載の精製したヒトEPO糖蛋
白。 - (16)請求項第(14)記載の精製したヒトEPO糖
蛋白を活性成分として含有することを特徴とする医薬組
成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ZA88/6645 | 1988-09-07 | ||
ZA886645 | 1988-09-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02115196A true JPH02115196A (ja) | 1990-04-27 |
Family
ID=25579406
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1232690A Pending JPH02115196A (ja) | 1988-09-07 | 1989-09-07 | エリスロポエチンの精製法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0358463A1 (ja) |
JP (1) | JPH02115196A (ja) |
AU (1) | AU4104889A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8304534B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-11-06 | Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd. | Process for producing difructose dianhydride III crystals |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100321446B1 (ko) * | 1994-02-14 | 2002-05-13 | 성재갑 | 유전자재조합곤충세포에서발현시킨인간적혈구성장인자의정제방법 |
IL117849A (en) * | 1995-04-14 | 2002-07-25 | Lepetit Spa | Chromatographic process for clearing glycoproteins |
IL118201A (en) | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
US5981716A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Gruppo Lepettit, S.P.A. | Process for the purification of proteins |
PT935752E (pt) * | 1996-09-20 | 2002-03-28 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Metodos para a determinacao da bioactividade da eritropoietina in vitro |
EP2334699B1 (en) | 2008-09-23 | 2013-09-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Purification of erythropoietin |
EP3613486B1 (de) * | 2018-08-24 | 2020-10-07 | UGA Biopharma GmbH | Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62171696A (ja) * | 1986-01-23 | 1987-07-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトエリスロポエチンの製造方法 |
-
1989
- 1989-09-04 AU AU41048/89A patent/AU4104889A/en not_active Abandoned
- 1989-09-05 EP EP89308989A patent/EP0358463A1/en not_active Withdrawn
- 1989-09-07 JP JP1232690A patent/JPH02115196A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8304534B2 (en) | 2004-12-28 | 2012-11-06 | Nippon Beet Sugar Manufacturing Co., Ltd. | Process for producing difructose dianhydride III crystals |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0358463A1 (en) | 1990-03-14 |
AU4104889A (en) | 1990-03-15 |
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