JP2573767B2 - 分泌大腸菌突然変異体からのヒトインターロイキン―4の精製 - Google Patents
分泌大腸菌突然変異体からのヒトインターロイキン―4の精製Info
- Publication number
- JP2573767B2 JP2573767B2 JP3503528A JP50352891A JP2573767B2 JP 2573767 B2 JP2573767 B2 JP 2573767B2 JP 3503528 A JP3503528 A JP 3503528A JP 50352891 A JP50352891 A JP 50352891A JP 2573767 B2 JP2573767 B2 JP 2573767B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- active
- buffer
- human interleukin
- sodium chloride
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5406—IL-4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、細菌からタンパク質を抽出し且つ精製する
方法、更に詳しくは、大腸菌(Escherichia Coli)(E.
Coli)において発現された可溶性活性ヒトインターロイ
キン−4を抽出し且つ精製する方法に関する。
方法、更に詳しくは、大腸菌(Escherichia Coli)(E.
Coli)において発現された可溶性活性ヒトインターロイ
キン−4を抽出し且つ精製する方法に関する。
背景 ヒトインターロイキン−4(IL-4)は、感染、癌およ
び自己免疫疾患に対して治療の可能性を有すると考えら
れる天然のタンパク質であり、ヨコタ(Yokota)ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA,83,5894〜5898(1986)によっ
て特徴化された。マウスIL-4は、リー(Lee)ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,83,2061〜2065(1986)およびノー
マ(Noma)ら、Nature,319,640〜646(1986)に報告さ
れている。
び自己免疫疾患に対して治療の可能性を有すると考えら
れる天然のタンパク質であり、ヨコタ(Yokota)ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA,83,5894〜5898(1986)によっ
て特徴化された。マウスIL-4は、リー(Lee)ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,83,2061〜2065(1986)およびノー
マ(Noma)ら、Nature,319,640〜646(1986)に報告さ
れている。
遺伝子工学処理されたIL-4の製造において、形質転換
された宿主細胞またはそれらの培養物上澄みからの発現
されたタンパク質の分離は主要な問題であることがあ
る、ドワイアー(Dwyer)、Biotechnology,2,957(198
4)。
された宿主細胞またはそれらの培養物上澄みからの発現
されたタンパク質の分離は主要な問題であることがあ
る、ドワイアー(Dwyer)、Biotechnology,2,957(198
4)。
大腸菌におけるIL-4の大腸菌発現は、細胞内不溶性凝
集体(本体を含む)または周辺腔若しくは培地(発酵ブ
イヨン)中に分泌された活性可溶性物質であることがで
きる。本発明は、大腸菌のある種の菌株における発現か
ら得られた活性可溶性IL-4を抽出し且つ精製することに
関する。
集体(本体を含む)または周辺腔若しくは培地(発酵ブ
イヨン)中に分泌された活性可溶性物質であることがで
きる。本発明は、大腸菌のある種の菌株における発現か
ら得られた活性可溶性IL-4を抽出し且つ精製することに
関する。
活性IL-4の臨床的使用は、IL-4発現細胞の細胞成分ま
たは細胞破片が混入していない高純度の物質を必要とす
る。したがって、IL-4発現性大腸菌の発酵ブイヨン中の
活性IL-4を高収率および高純度で精製することは不可欠
である。
たは細胞破片が混入していない高純度の物質を必要とす
る。したがって、IL-4発現性大腸菌の発酵ブイヨン中の
活性IL-4を高収率および高純度で精製することは不可欠
である。
発明の要約 本発明は、高純度の活性IL-4を、IL-4発現性大腸菌の
発酵ブイヨンから下記の三工程処理で得ることができる
という知見に基づく。
発酵ブイヨンから下記の三工程処理で得ることができる
という知見に基づく。
1.粗製発酵ブイヨンに、金属キレート−アガロースゲル
カラム、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ピスカタウェイ、ニュ
ージャージ州からキレート−セファロース・ファスト・
フロー(Sepharose Fast Flow)およびキレート−セ
ファロース(Sepharose )6Bの名称で入手可能なキレ
ート−セファロースゲル上でアフィニティークロマトグ
ラフィーを施す。キレートセファロース・ファスト・フ
ローは、セファロース6ファスト・フローに対して安定
なエーテル結合によって結合したスペーサー上のイミノ
二酢酸基から成る。セファロース6ファスト・フローは
6%の架橋アガロースである。緩衝液、好ましくは、リ
ン酸緩衝液を用いる。用いられたリン酸緩衝液は、高塩
化ナトリウム濃度、すなわち、約0.5〜1.5M、好ましく
は、1.0Mの、中性〜僅かにアルカリ性pH、すなわち、約
pH6.7〜8、好ましくは、約7.2のものである。高塩濃度
および中性付近の約7.2のpHは、カラムに対する活性イ
ンターロイキン−4の結合を最大にし且つ他のタンパク
質の結合を最小にするのに役立つ。好ましい金属キレー
トは亜鉛であるが、他の金属キレート、例えば、銅、コ
バルトまたはニッケルを用いることもできる。結合が完
了した後に、カラムを、最初に、20mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.2および1.0M塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液
で2回洗浄する。次に、それを約10%グリセロールおよ
び低濃度の塩化ナトリウム、すなわち、約150mMを20mM
リン酸ナトリウム緩衝液中に含むリン酸緩衝液で洗浄す
る。第二の洗浄で、不純物を分離するのが難しい極めて
類似のものを含む不純物を除去する。最後に、活性IL-4
を、0.50M塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液を用いてpH
5.0で溶離する。
カラム、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ピスカタウェイ、ニュ
ージャージ州からキレート−セファロース・ファスト・
フロー(Sepharose Fast Flow)およびキレート−セ
ファロース(Sepharose )6Bの名称で入手可能なキレ
ート−セファロースゲル上でアフィニティークロマトグ
ラフィーを施す。キレートセファロース・ファスト・フ
ローは、セファロース6ファスト・フローに対して安定
なエーテル結合によって結合したスペーサー上のイミノ
二酢酸基から成る。セファロース6ファスト・フローは
6%の架橋アガロースである。緩衝液、好ましくは、リ
ン酸緩衝液を用いる。用いられたリン酸緩衝液は、高塩
化ナトリウム濃度、すなわち、約0.5〜1.5M、好ましく
は、1.0Mの、中性〜僅かにアルカリ性pH、すなわち、約
pH6.7〜8、好ましくは、約7.2のものである。高塩濃度
および中性付近の約7.2のpHは、カラムに対する活性イ
ンターロイキン−4の結合を最大にし且つ他のタンパク
質の結合を最小にするのに役立つ。好ましい金属キレー
トは亜鉛であるが、他の金属キレート、例えば、銅、コ
バルトまたはニッケルを用いることもできる。結合が完
了した後に、カラムを、最初に、20mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.2および1.0M塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液
で2回洗浄する。次に、それを約10%グリセロールおよ
び低濃度の塩化ナトリウム、すなわち、約150mMを20mM
リン酸ナトリウム緩衝液中に含むリン酸緩衝液で洗浄す
る。第二の洗浄で、不純物を分離するのが難しい極めて
類似のものを含む不純物を除去する。最後に、活性IL-4
を、0.50M塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液を用いてpH
5.0で溶離する。
2.工程1からの活性IL-4の溶液に、S−セファロース・
ファスト・フローカラム上において大部分の不純物が結
合しない中性付近の約6.75のpHおよび15mS(導電率)で
陽イオン交換クロマトグラフィーを施した。次に、緩衝
液中で更に精製したIL-4をカラムから溶離し;そして 3.活性IL-4溶液に、pH4.5で最大20mg/mlまで濃縮後に、
pH4.5の10mMクエン酸ナトリウムで平衡にしたサイズ排
除カラム上のゲル濾過クロマトグラフィーを施す。次
に、95%〜99%純度の精製活性IL-4溶液を集める。
ファスト・フローカラム上において大部分の不純物が結
合しない中性付近の約6.75のpHおよび15mS(導電率)で
陽イオン交換クロマトグラフィーを施した。次に、緩衝
液中で更に精製したIL-4をカラムから溶離し;そして 3.活性IL-4溶液に、pH4.5で最大20mg/mlまで濃縮後に、
pH4.5の10mMクエン酸ナトリウムで平衡にしたサイズ排
除カラム上のゲル濾過クロマトグラフィーを施す。次
に、95%〜99%純度の精製活性IL-4溶液を集める。
詳細な説明 本発明の方法は、活性組換え体ヒトインターロイキン
4の粗製溶液に、アフィニティークロマトグラフィー、
陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロ
マトグラフィーを施して、高純度の活性IL-4を得ること
を可能にする。中性付近、好ましくはpH7.2および高濃
度の塩化ナトリウム、好ましくは、1M塩化ナトリウムで
緩衝液を用いることにより、活性IL-4分子を、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって金属キレート−アガ
ロースゲルカラム、好ましくは、キレートセファロース
・ファスト・フローまたはセファロース6Bに対して選択
的に結合して、溶液中に存在する混入しているタンパク
質を実質的に排除する。
4の粗製溶液に、アフィニティークロマトグラフィー、
陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロ
マトグラフィーを施して、高純度の活性IL-4を得ること
を可能にする。中性付近、好ましくはpH7.2および高濃
度の塩化ナトリウム、好ましくは、1M塩化ナトリウムで
緩衝液を用いることにより、活性IL-4分子を、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって金属キレート−アガ
ロースゲルカラム、好ましくは、キレートセファロース
・ファスト・フローまたはセファロース6Bに対して選択
的に結合して、溶液中に存在する混入しているタンパク
質を実質的に排除する。
活性IL-4の粗製溶液源は本発明の方法に対して臨界的
ではない。好ましい源は、その中に溶解したまたは分泌
された活性ヒトIL-4を含む発酵ブイヨンである。好まし
くは、活性ヒトIL-4を、大腸菌のある種の菌株によって
ブイヨン中に発現させる。
ではない。好ましい源は、その中に溶解したまたは分泌
された活性ヒトIL-4を含む発酵ブイヨンである。好まし
くは、活性ヒトIL-4を、大腸菌のある種の菌株によって
ブイヨン中に発現させる。
したがって、本発明は、活性組換え体ヒトIL-4の粗製
溶液を精製する方法であって、 (a)中性〜僅かにアルカリ性pHで且つ約0.5〜1.5モル
塩化ナトリウムを含む該IL-4の緩衝粗製溶液に、金属キ
レート−アガロースゲル上のアフィニティークロマトグ
ラフィーを施してIL-4を選択的に結合させ; (b)カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2の20mMリン酸平衡緩衝液で、次に、10容量%グリセ
ロールおよび約150mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗
浄し; (c)結合したIL-4を、酸性pHの溶離用緩衝液またはキ
レート化剤、ヒスチジン類似物若しくはアミノ酸を含む
中性pH緩衝液で溶離し; (d)工程(c)からの活性IL-4溶離液を、陽イオン交
換クロマトグラフィーカラム、例えば、S−セファロー
ス(ファーマシア・ファイン・ケミカルズから入手可
能)を用いて中性付近〜僅かに酸性pHで且つ導電率15mS
で処理し、S−セファロースは、それに結合したイオン
交換基−CH2−、SO3−、Na+を有する架橋アガロースマ
トリックスであり; (e)工程(d)からの溶離液を、限外濾過膜(10,000
分子量カットオフ)を用いて濃縮し; (f)濃縮された保持物質を、サイズ排除カラム上のゲ
ル濾過クロマトグラフィーによって処理し;そして (g)精製活性IL-4を集めること を含む前記の方法である。
溶液を精製する方法であって、 (a)中性〜僅かにアルカリ性pHで且つ約0.5〜1.5モル
塩化ナトリウムを含む該IL-4の緩衝粗製溶液に、金属キ
レート−アガロースゲル上のアフィニティークロマトグ
ラフィーを施してIL-4を選択的に結合させ; (b)カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2の20mMリン酸平衡緩衝液で、次に、10容量%グリセ
ロールおよび約150mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗
浄し; (c)結合したIL-4を、酸性pHの溶離用緩衝液またはキ
レート化剤、ヒスチジン類似物若しくはアミノ酸を含む
中性pH緩衝液で溶離し; (d)工程(c)からの活性IL-4溶離液を、陽イオン交
換クロマトグラフィーカラム、例えば、S−セファロー
ス(ファーマシア・ファイン・ケミカルズから入手可
能)を用いて中性付近〜僅かに酸性pHで且つ導電率15mS
で処理し、S−セファロースは、それに結合したイオン
交換基−CH2−、SO3−、Na+を有する架橋アガロースマ
トリックスであり; (e)工程(d)からの溶離液を、限外濾過膜(10,000
分子量カットオフ)を用いて濃縮し; (f)濃縮された保持物質を、サイズ排除カラム上のゲ
ル濾過クロマトグラフィーによって処理し;そして (g)精製活性IL-4を集めること を含む前記の方法である。
最も好ましい実施態様において、本発明の方法は下
記、すなわち、 (a)活性組換え体ヒトIL-4の粗製溶液を、金属キレー
ト−アガロースゲル、好ましくは、キレートセファロー
ス・ファスト・フローのアフィニティークロマトグラフ
ィーカラムに対して1.0M塩化ナトリウムを含む中性〜僅
かにアルカリ性pHリン酸緩衝液中において充填し; (b)カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2〜7.5のリン酸緩衝液で、次に、グリセロール10容量
%および約150mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で
2回洗浄し; (c)活性IL-4をカラムから、0.5M塩化ナトリウムを含
むpH5.0の溶離用酢酸緩衝液を用いて無勾配に溶離し; (d)工程(c)からのpH6.75で導電率15mSの緩衝液中
の活性IL-4溶離液に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.75および0.12M塩化ナトリウムで平衡にしたS−セフ
ァロースなどのカラム上の陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを施し;そして0.12〜0.6M-NaClを有するpH6.75の
リン酸緩衝液で勾配溶離し; (e)工程(d)からの溶離液を、限外濾過膜を用いて
濃縮し; (f)濃縮された溶離液を、pH4.5の10mMクエン酸ナト
リウム緩衝液で平衡にしたサイズ排除カラム上のゲル濾
過クロマトグラフィーによって処理し;そして (g)精製活性IL-4溶液を集める という工程を含む前記の方法である。
記、すなわち、 (a)活性組換え体ヒトIL-4の粗製溶液を、金属キレー
ト−アガロースゲル、好ましくは、キレートセファロー
ス・ファスト・フローのアフィニティークロマトグラフ
ィーカラムに対して1.0M塩化ナトリウムを含む中性〜僅
かにアルカリ性pHリン酸緩衝液中において充填し; (b)カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2〜7.5のリン酸緩衝液で、次に、グリセロール10容量
%および約150mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で
2回洗浄し; (c)活性IL-4をカラムから、0.5M塩化ナトリウムを含
むpH5.0の溶離用酢酸緩衝液を用いて無勾配に溶離し; (d)工程(c)からのpH6.75で導電率15mSの緩衝液中
の活性IL-4溶離液に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.75および0.12M塩化ナトリウムで平衡にしたS−セフ
ァロースなどのカラム上の陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを施し;そして0.12〜0.6M-NaClを有するpH6.75の
リン酸緩衝液で勾配溶離し; (e)工程(d)からの溶離液を、限外濾過膜を用いて
濃縮し; (f)濃縮された溶離液を、pH4.5の10mMクエン酸ナト
リウム緩衝液で平衡にしたサイズ排除カラム上のゲル濾
過クロマトグラフィーによって処理し;そして (g)精製活性IL-4溶液を集める という工程を含む前記の方法である。
工程(a)において、金属キレートアガロースカラム
に充填された粗製溶液はいずれの源からであることもで
きるが、しかしながら、本発明の実施においては、予め
処理されて、発酵工程から生じた細胞破片および他の大
型粒子が除去された発酵ブイヨンを利用するのが好適で
ある。更に詳しくは、本発明の方法は、活性ヒトIL-4を
生産し且つその活性ヒトIL-4を培地(発酵ブイヨン)中
に分泌するように遺伝子工学処理されている大腸菌菌株
によって生産される活性ヒトIL-4の精製に適用しうる。
本明細書中で用いられる「活性ヒトIL-4」という用語
は、生物学的に活性の自然のコンホメーションで存在し
ている非変性組換え体ヒトIL-4を意味する。
に充填された粗製溶液はいずれの源からであることもで
きるが、しかしながら、本発明の実施においては、予め
処理されて、発酵工程から生じた細胞破片および他の大
型粒子が除去された発酵ブイヨンを利用するのが好適で
ある。更に詳しくは、本発明の方法は、活性ヒトIL-4を
生産し且つその活性ヒトIL-4を培地(発酵ブイヨン)中
に分泌するように遺伝子工学処理されている大腸菌菌株
によって生産される活性ヒトIL-4の精製に適用しうる。
本明細書中で用いられる「活性ヒトIL-4」という用語
は、生物学的に活性の自然のコンホメーションで存在し
ている非変性組換え体ヒトIL-4を意味する。
このような遺伝子工学処理は、通常、細菌中への発現
ベクターの導入を伴う。発現ベクターは、細菌ゲノムの
遺伝子に関して自律複製およびタンパク質発現が可能で
ある。細菌ベクターの構築は、当該技術分野において、
望ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列が知
られているかさもなければ入手可能であるという条件に
おいて周知である。
ベクターの導入を伴う。発現ベクターは、細菌ゲノムの
遺伝子に関して自律複製およびタンパク質発現が可能で
ある。細菌ベクターの構築は、当該技術分野において、
望ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列が知
られているかさもなければ入手可能であるという条件に
おいて周知である。
好ましくは、IL-4は、1989年10月31日出願の出願人譲
受人の米国特許出願第07/429,588号明細書に記載の分泌
大腸菌菌株によって生産され、その出願を完全に本明細
書中に参考文献として後述する。特に関連するのは、25
〜33頁の実施例、34〜36頁のデータ、36頁の培養付着物
の詳説および図面である。
受人の米国特許出願第07/429,588号明細書に記載の分泌
大腸菌菌株によって生産され、その出願を完全に本明細
書中に参考文献として後述する。特に関連するのは、25
〜33頁の実施例、34〜36頁のデータ、36頁の培養付着物
の詳説および図面である。
本発明によって精製された活性IL-4を製造するのに用
いられた好ましい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11お
よびRL7321/pRGT857-11である。
いられた好ましい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11お
よびRL7321/pRGT857-11である。
工程(a)で用いられた好ましい金属キレート−アガ
ロースはキレートセファロース・ファスト・フローであ
るが、キレートセファロース6Bでも十分である。セファ
ロースはファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ピスカ
タウェイ、ニュージャージー州の製品である。本発明で
用いるのに好ましい亜鉛キレートセファロースカラムを
製造する好ましい方法は、セファロースゲルをクロマト
グラフィーカラムに注入し、脱イオン水で洗浄した後、
塩、好ましくは酢酸亜鉛溶液および脱イオン水をカラム
を介してポンプ輸送し、次に、平衡緩衝液、すなわち、
20mMリン酸ナトリウム、pH7.2、1.0MのNaCl溶液をカラ
ムを介してポンプ輸送することによる。酢酸亜鉛の代わ
りに他の亜鉛塩、例えば、塩化亜鉛または硫酸亜鉛を用
いてもよい。
ロースはキレートセファロース・ファスト・フローであ
るが、キレートセファロース6Bでも十分である。セファ
ロースはファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ピスカ
タウェイ、ニュージャージー州の製品である。本発明で
用いるのに好ましい亜鉛キレートセファロースカラムを
製造する好ましい方法は、セファロースゲルをクロマト
グラフィーカラムに注入し、脱イオン水で洗浄した後、
塩、好ましくは酢酸亜鉛溶液および脱イオン水をカラム
を介してポンプ輸送し、次に、平衡緩衝液、すなわち、
20mMリン酸ナトリウム、pH7.2、1.0MのNaCl溶液をカラ
ムを介してポンプ輸送することによる。酢酸亜鉛の代わ
りに他の亜鉛塩、例えば、塩化亜鉛または硫酸亜鉛を用
いてもよい。
クロマトグラフィーカラムは連通した2本のカラムで
ある。第一のすなわち上部カラムは亜鉛キレート−セフ
ァロースゲルを含み、第二のすなわち下部カラムは、亜
鉛塩または他の金属塩で処理されたなかったキレートセ
ファロースゲルを含む。2本のカラムの容量比は、亜鉛
処理したキレートセファロース約3容量対未処理キレー
トセファロース1容量である。
ある。第一のすなわち上部カラムは亜鉛キレート−セフ
ァロースゲルを含み、第二のすなわち下部カラムは、亜
鉛塩または他の金属塩で処理されたなかったキレートセ
ファロースゲルを含む。2本のカラムの容量比は、亜鉛
処理したキレートセファロース約3容量対未処理キレー
トセファロース1容量である。
カラムを平衡にするのに用いられる好ましい緩衝液は
1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2〜7.5のリン酸緩衝液で
ある。
1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2〜7.5のリン酸緩衝液で
ある。
工程(b)において、最初に、平衡緩衝液として1.0M
塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液を用い、次
に、10%グリセロールおよび低濃度の塩化ナトリウム
(150mM)を含むpH7.2〜7.5のリン酸ナトリウム緩衝液
を用いる特別の二部洗浄液をカラムに充填する。洗浄に
よって、極めて類似であり且つ分離するのが難しいもの
を含む不純物を除去する。
塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液を用い、次
に、10%グリセロールおよび低濃度の塩化ナトリウム
(150mM)を含むpH7.2〜7.5のリン酸ナトリウム緩衝液
を用いる特別の二部洗浄液をカラムに充填する。洗浄に
よって、極めて類似であり且つ分離するのが難しいもの
を含む不純物を除去する。
活性IL-4の溶液のpHを保持するのに好ましい緩衝液
は、1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液で
ある。緩衝された粗製活性IL-4溶液をカラムに通過させ
た時に、IL-4はゲルに対して選択的に吸着する。
は、1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液で
ある。緩衝された粗製活性IL-4溶液をカラムに通過させ
た時に、IL-4はゲルに対して選択的に吸着する。
工程(c)において、亜鉛キレート−セファロースお
よび未処理キレートセファロースゲルを、1.0M塩化ナト
リウムを含むpH6.75のリン酸緩衝液で平衡にした後、吸
着した活性IL-4を、亜鉛キレート−セファロースから未
処理キレート−セファロースを介して、0.5N塩化ナトリ
ウムを含むpH5.0の酢酸緩衝液を用いて或いは50mMのEDT
A(エチチレンジアミン四酢酸)などのキレート化剤若
しくは50mMイミダゾールなどのヒスチジン類似体または
50mMヒスチジンなどのアミノ酸を含む中性pHの緩衝液を
用いて無勾配に溶離する。活性IL-4を含む溶離液を集め
る。慣用的なSDS-PAGEおよびタンパク質検定法に基づい
て最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプールする。
よび未処理キレートセファロースゲルを、1.0M塩化ナト
リウムを含むpH6.75のリン酸緩衝液で平衡にした後、吸
着した活性IL-4を、亜鉛キレート−セファロースから未
処理キレート−セファロースを介して、0.5N塩化ナトリ
ウムを含むpH5.0の酢酸緩衝液を用いて或いは50mMのEDT
A(エチチレンジアミン四酢酸)などのキレート化剤若
しくは50mMイミダゾールなどのヒスチジン類似体または
50mMヒスチジンなどのアミノ酸を含む中性pHの緩衝液を
用いて無勾配に溶離する。活性IL-4を含む溶離液を集め
る。慣用的なSDS-PAGEおよびタンパク質検定法に基づい
て最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプールする。
工程(d)において、工程(c)からプールした画分
のpHをpH6.75まで調整し且つpH6.75の20mM緩衝液で稀釈
して、導電率が15mSになるようにする。クロマトグラフ
ィーカラム中の陽イオン交換ゲル材料を、0.12M塩化ナ
トリウムを含むpH6.75の20mMリン酸緩衝液で平衡にす
る。好ましい陽イオン交換は、基−CH2−、SO3 -、Na+で
置換した架橋アガロース、例えば、ファーマシアから入
手可能なS−セファロース・ファスト・フローである。
活性IL-4を、0.12〜0.6M-NaClを含むpH6.75の20mMリン
酸緩衝液で勾配溶離する。SDS-PAGEおよびタンパク質検
定法に基づいて最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプ
ールする。陽イオン交換クロマトグラフィーの条件を選
択して、活性IL-4画分が陽イオン交換器マトリックスに
結合することを確実にする。陽イオン交換クロマトグラ
フィー用には比較的高い中性付近のpH6.75およびイオン
交換クロマトグラフィー用には比較的高い15mSの導電率
によって、大部分の不純物がカラムに結合しない穏やか
な結合条件が得られ、溶離は比較的容易であり、そして
高純度の、すなわち、約90%〜95%の活性IL-4溶液が得
られる。
のpHをpH6.75まで調整し且つpH6.75の20mM緩衝液で稀釈
して、導電率が15mSになるようにする。クロマトグラフ
ィーカラム中の陽イオン交換ゲル材料を、0.12M塩化ナ
トリウムを含むpH6.75の20mMリン酸緩衝液で平衡にす
る。好ましい陽イオン交換は、基−CH2−、SO3 -、Na+で
置換した架橋アガロース、例えば、ファーマシアから入
手可能なS−セファロース・ファスト・フローである。
活性IL-4を、0.12〜0.6M-NaClを含むpH6.75の20mMリン
酸緩衝液で勾配溶離する。SDS-PAGEおよびタンパク質検
定法に基づいて最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプ
ールする。陽イオン交換クロマトグラフィーの条件を選
択して、活性IL-4画分が陽イオン交換器マトリックスに
結合することを確実にする。陽イオン交換クロマトグラ
フィー用には比較的高い中性付近のpH6.75およびイオン
交換クロマトグラフィー用には比較的高い15mSの導電率
によって、大部分の不純物がカラムに結合しない穏やか
な結合条件が得られ、溶離は比較的容易であり、そして
高純度の、すなわち、約90%〜95%の活性IL-4溶液が得
られる。
工程(e)において、工程(d)でプールした溶離画
分を、分子量が10,000より大きい材料全部を保持する膜
を備えた撹拌されたセルの上で濃縮する。これは活性IL
-4を含む。この処理状態での活性IL-4溶液は約90〜95%
純度であるので、膜の上部に残った濃縮溶液中にあるの
は活性IL-を除いては極めて少量である。好ましい膜
は、アミコン・カンパニー(Amicon Co.),U.S.A.によ
って製造されたYM-10である。得られた濃縮度は活性IL-
4が最大約20mg/mlまでである。
分を、分子量が10,000より大きい材料全部を保持する膜
を備えた撹拌されたセルの上で濃縮する。これは活性IL
-4を含む。この処理状態での活性IL-4溶液は約90〜95%
純度であるので、膜の上部に残った濃縮溶液中にあるの
は活性IL-を除いては極めて少量である。好ましい膜
は、アミコン・カンパニー(Amicon Co.),U.S.A.によ
って製造されたYM-10である。得られた濃縮度は活性IL-
4が最大約20mg/mlまでである。
工程(f)において、工程(e)からプールされた活
性IL-4の濃縮溶離液を、分子量によって溶液中のタンパ
ク質を分別するサイズ排除ゲル濾過カラムに充填する。
適当である典型的なカラムは、セファクリル(Sephacry
l )S-200HRまたはS-100HR(ファーマシア)ゲル濾過
カラムである。セファクリルS-200HR(高分離度)およ
びS-100HRは、アリルデキストランおよびN,N′−メチレ
ンビスアクリルアミドの架橋コポリマーである。ダルト
ンでのそれらの分別範囲は、それぞれ5,000〜250,000お
よび1,000〜100,000である。他の適当な材料は、架橋デ
キストランゲルであるセファデックシズ(Sephadexe
s )(ファーマシア)である。好ましくは、活性IL-4
の溶液を、pH4.5の10mMクエン酸緩衝液で予め平衡にし
たS-200HRカラムに充填する。工程(g)の条件下にお
いて、安定なIL-4濃縮物は最大20mg/mlまで達すること
ができる。これによって、ゲル濾過クロマトグラフィー
の容量および性能が増大する。
性IL-4の濃縮溶離液を、分子量によって溶液中のタンパ
ク質を分別するサイズ排除ゲル濾過カラムに充填する。
適当である典型的なカラムは、セファクリル(Sephacry
l )S-200HRまたはS-100HR(ファーマシア)ゲル濾過
カラムである。セファクリルS-200HR(高分離度)およ
びS-100HRは、アリルデキストランおよびN,N′−メチレ
ンビスアクリルアミドの架橋コポリマーである。ダルト
ンでのそれらの分別範囲は、それぞれ5,000〜250,000お
よび1,000〜100,000である。他の適当な材料は、架橋デ
キストランゲルであるセファデックシズ(Sephadexe
s )(ファーマシア)である。好ましくは、活性IL-4
の溶液を、pH4.5の10mMクエン酸緩衝液で予め平衡にし
たS-200HRカラムに充填する。工程(g)の条件下にお
いて、安定なIL-4濃縮物は最大20mg/mlまで達すること
ができる。これによって、ゲル濾過クロマトグラフィー
の容量および性能が増大する。
SDS-PAGEおよびタンパク質検定法によって決定される
最も高い濃度の活性IL-4を含む溶離液の画分を集め且つ
プールして、95〜99%純度の活性IL-4溶液を得る。
最も高い濃度の活性IL-4を含む溶離液の画分を集め且つ
プールして、95〜99%純度の活性IL-4溶液を得る。
可溶化された生物学的に活性の不純な組換え体ヒトイ
ンターロイキン−4はいずれも本発明の方法によって精
製することができるが、最も実際的には、本発明の方法
は、活性IL-4を培地中に分泌する細菌である大腸菌によ
って発現された組換え体ヒト活性IL-4に適用しうる。
ンターロイキン−4はいずれも本発明の方法によって精
製することができるが、最も実際的には、本発明の方法
は、活性IL-4を培地中に分泌する細菌である大腸菌によ
って発現された組換え体ヒト活性IL-4に適用しうる。
その好ましい実施態様において、本発明の方法は、活
性ヒトIL-4を生産し且つそれを発酵ブイヨンの溶液中に
排泄するように遺伝子工学処理された大腸菌によって生
産された活性ヒトIL-4の抽出および精製用に提供され
る。
性ヒトIL-4を生産し且つそれを発酵ブイヨンの溶液中に
排泄するように遺伝子工学処理された大腸菌によって生
産された活性ヒトIL-4の抽出および精製用に提供され
る。
上記に示したように、本発明の好ましい実施態様によ
って精製された活性IL-4を製造するのに用いられた好ま
しい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11およびRL7321/pR
GT855-11である。
って精製された活性IL-4を製造するのに用いられた好ま
しい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11およびRL7321/pR
GT855-11である。
培地からの活性IL-4の回収は、培地を遠心分離して細
胞破片および他の比較的大型の粒子を除去することによ
って行うのが好ましい。次に、得られた溶液に、分子量
が10,000より大きいタンパク質を保持するYM-10膜また
はペリコン(Pellicon)フィルターPTGCカセット(ミリ
ポア・コーポレーション(Millipore Corp.),ベッド
フォード、マサチューセッツ州)などのフィルター上で
の限外濾過を施す。活性IL-4の濃縮粗製溶液である保持
物質を、1.0M-NaClを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液を用
いてダイアフィルトレーションを行う。
胞破片および他の比較的大型の粒子を除去することによ
って行うのが好ましい。次に、得られた溶液に、分子量
が10,000より大きいタンパク質を保持するYM-10膜また
はペリコン(Pellicon)フィルターPTGCカセット(ミリ
ポア・コーポレーション(Millipore Corp.),ベッド
フォード、マサチューセッツ州)などのフィルター上で
の限外濾過を施す。活性IL-4の濃縮粗製溶液である保持
物質を、1.0M-NaClを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液を用
いてダイアフィルトレーションを行う。
次に、このように処理されたIL-4の粗製溶液を前記に
記載したように精製する。
記載したように精製する。
本発明によって精製することができる粗製ブイヨンを
得るための変法は、培地を遠心分離して細胞破片および
他の比較的大型の粒子を除去し、リン酸でpH4.0に調整
した0.50Mトリクロロ酢酸ナトリウムを用いてタンパク
質の沈殿を生成させた後、そのタンパク質を、0.1M-NaC
lを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液で可溶化して、活性IL
-4の濃縮溶液を得ることである。次に、粗製溶液を前記
に記載したように精製する。
得るための変法は、培地を遠心分離して細胞破片および
他の比較的大型の粒子を除去し、リン酸でpH4.0に調整
した0.50Mトリクロロ酢酸ナトリウムを用いてタンパク
質の沈殿を生成させた後、そのタンパク質を、0.1M-NaC
lを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液で可溶化して、活性IL
-4の濃縮溶液を得ることである。次に、粗製溶液を前記
に記載したように精製する。
本発明の方法で用いられた緩衝液は、それらが、活性
IL-4をクロマトグラフィーゲルに吸着させるかまたは選
択的にそれらを介して溶離させるのに適切な結合、洗浄
および溶離の条件を提供するという理由で選択される。
好ましい緩衝液は、20mM濃度のリン酸ナトリウム緩衝液
または実施例に示されたような濃度およびpH、更には、
指示された塩化ナトリウムの具体的な量でのクエン酸ナ
トリウム若しくは酢酸ナトリウム緩衝液である。pHを水
酸化ナトリウムまたは酸で調整する。工程(b)の二部
洗浄において、第一の洗浄は1.0N塩化ナトリウムを含む
pH7.2の20mMリン酸ナトリウム平衡緩衝液を用い、そし
て第二の洗浄は、第二の洗浄緩衝液に必要とされる約15
mM塩化ナトリウムおよび10%グリセロールを含むリン酸
緩衝液を用いる。
IL-4をクロマトグラフィーゲルに吸着させるかまたは選
択的にそれらを介して溶離させるのに適切な結合、洗浄
および溶離の条件を提供するという理由で選択される。
好ましい緩衝液は、20mM濃度のリン酸ナトリウム緩衝液
または実施例に示されたような濃度およびpH、更には、
指示された塩化ナトリウムの具体的な量でのクエン酸ナ
トリウム若しくは酢酸ナトリウム緩衝液である。pHを水
酸化ナトリウムまたは酸で調整する。工程(b)の二部
洗浄において、第一の洗浄は1.0N塩化ナトリウムを含む
pH7.2の20mMリン酸ナトリウム平衡緩衝液を用い、そし
て第二の洗浄は、第二の洗浄緩衝液に必要とされる約15
mM塩化ナトリウムおよび10%グリセロールを含むリン酸
緩衝液を用いる。
亜鉛キレート−セファロースカラムと一緒に用いられ
た緩衝液中の塩化ナトリウム濃度は、高塩、好ましく
は、1M塩化ナトリウムがトリクロロ酢酸(TCA)ペレッ
トからの可溶化活性IL-4の回収を改良し、更には、金属
キレートセファロースに対する活性IL-4の結合を強化す
るので、本発明に対して臨界的である。濃度は、IL-4
が、亜鉛キレートセファロースカラムに対して発酵ブイ
ヨン中の不純物よりも選択的に吸着することを可能にす
る。
た緩衝液中の塩化ナトリウム濃度は、高塩、好ましく
は、1M塩化ナトリウムがトリクロロ酢酸(TCA)ペレッ
トからの可溶化活性IL-4の回収を改良し、更には、金属
キレートセファロースに対する活性IL-4の結合を強化す
るので、本発明に対して臨界的である。濃度は、IL-4
が、亜鉛キレートセファロースカラムに対して発酵ブイ
ヨン中の不純物よりも選択的に吸着することを可能にす
る。
下記の実施例で、本発明の好ましい実施態様を例証す
る。
る。
実施例1 亜鉛キレート−セファロース・ファスト・フローの製造 キレートセファロース・ファスト・フローゲルを脱イ
オン水中のスラリーにする。3リットルのカラムを製造
するために、そのスラリーを高さ500mmで直径180mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入する。カラム中の液体
を、カラムの底部を介して流動させるかまたはポンプ輸
送させる。
オン水中のスラリーにする。3リットルのカラムを製造
するために、そのスラリーを高さ500mmで直径180mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入する。カラム中の液体
を、カラムの底部を介して流動させるかまたはポンプ輸
送させる。
カラム上に上部フローアダプターを置き、脱イオン水
を用いてゲルを充填/洗浄する。水をカラムを介して約
1cm/分の線速度でポンプ輸送する。上部フローアダプタ
ーを調整して樹脂床の上部にしっかりと加圧する。少く
とも5床容量の脱イオン水をカラムを介して約1cm/分の
線速度でポンプ輸送する。
を用いてゲルを充填/洗浄する。水をカラムを介して約
1cm/分の線速度でポンプ輸送する。上部フローアダプタ
ーを調整して樹脂床の上部にしっかりと加圧する。少く
とも5床容量の脱イオン水をカラムを介して約1cm/分の
線速度でポンプ輸送する。
約5床容量の0.025M酢酸亜鉛溶液を、カラムを介して
約1cm/分の線速度でポンプ輸送する。約10床容量の脱イ
オン水を、カラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸
送する。
約1cm/分の線速度でポンプ輸送する。約10床容量の脱イ
オン水を、カラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸
送する。
リン酸緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度でポ
ンプ輸送することを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで
続ける。
ンプ輸送することを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで
続ける。
実施例2 キレートセファロース・ファスト・フロー(金属塩で未
処理)の製造 キレートセファロース・ファスト・フローゲルを、1.
0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸ナトリウムから成る
緩衝液中のスラリーにする。1リットルのカラムを製造
するために、そのゲルを直径140mmおよび高さ500mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入し且つカラム底部から溶
離する。ゲルを、1.0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸
ナトリウムから成る約5床容量の緩衝液で平衡にする。
緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸送
する。緩衝液をカラムを介して同一流量でポンプ輸送す
ることを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで続ける。
処理)の製造 キレートセファロース・ファスト・フローゲルを、1.
0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸ナトリウムから成る
緩衝液中のスラリーにする。1リットルのカラムを製造
するために、そのゲルを直径140mmおよび高さ500mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入し且つカラム底部から溶
離する。ゲルを、1.0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸
ナトリウムから成る約5床容量の緩衝液で平衡にする。
緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸送
する。緩衝液をカラムを介して同一流量でポンプ輸送す
ることを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで続ける。
実施例3 連続カラムの製造 亜鉛キレートセファロース・ファスト・フローおよび
未処理キレートセファロースのカラムを実施例1および
2にしたがって製造した後、カラムを連続して連通させ
て、流れが最初に亜鉛キレートカラム中に入り、次に、
非亜鉛(未処理)キレートカラム中に入るようにする。
バブルトラップをカラム間に挿入してはならない。
未処理キレートセファロースのカラムを実施例1および
2にしたがって製造した後、カラムを連続して連通させ
て、流れが最初に亜鉛キレートカラム中に入り、次に、
非亜鉛(未処理)キレートカラム中に入るようにする。
バブルトラップをカラム間に挿入してはならない。
実施例4 S−セファロースカラムの製造 S−セファロースゲル陽イオン交換樹脂を、20mMリン
酸ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaClおよび0.001Mエチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)から成る緩衝液中のスラリー
にする。ゲルを直径100mmで高さ45cmのクロマトグラフ
ィーカラムに注入し且つ液体をカラム底部を介して流動
させまたはポンプ輸送させる。
酸ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaClおよび0.001Mエチレ
ンジアミン四酢酸(EDTA)から成る緩衝液中のスラリー
にする。ゲルを直径100mmで高さ45cmのクロマトグラフ
ィーカラムに注入し且つ液体をカラム底部を介して流動
させまたはポンプ輸送させる。
カラム上に上部フローアダプターを置き、20mMリン酸
ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成
る5床容量の緩衝液を用いてその緩衝液をカラムを介し
て約1cm/分の線速度でポンプ輸送することによって平衡
にする。上部フローアダプターを調整して樹脂床の上部
にしっかりと加圧する。次に、20mMリン酸ナトリウム、
pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成る少なくとも
約5床容量の緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度
でポンプ輸送し、必要ならば、緩衝液をカラムを介して
同一流量でポンプ輸送することを、流出液のpHが6.6〜
6.9になるまで続ける。
ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成
る5床容量の緩衝液を用いてその緩衝液をカラムを介し
て約1cm/分の線速度でポンプ輸送することによって平衡
にする。上部フローアダプターを調整して樹脂床の上部
にしっかりと加圧する。次に、20mMリン酸ナトリウム、
pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成る少なくとも
約5床容量の緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度
でポンプ輸送し、必要ならば、緩衝液をカラムを介して
同一流量でポンプ輸送することを、流出液のpHが6.6〜
6.9になるまで続ける。
実施例5 セファクリルS-200HRカラムの製造 10mMクエン酸ナトリウム、pH4.5から成る少なくとも
1床容量の緩衝液を、直径50mmで高さ100cmのクロマト
グラフィーカラム中のS200HRゲルを介して約0.2cm/分の
線速度でポンプ輸送してカラムを平衡にする。
1床容量の緩衝液を、直径50mmで高さ100cmのクロマト
グラフィーカラム中のS200HRゲルを介して約0.2cm/分の
線速度でポンプ輸送してカラムを平衡にする。
実施例6 緩衝液の製造 (a)0.02Mリン酸ナトリウム、pH7.2、1.0M塩化ナトリ
ウム 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム−塩基−水
和物2.78g/L、塩化ナトリウム58.44g/LおよびpHを7.2
(±0.1)まで調整するのに十分な量の6.3N水酸化ナト
リウムを一緒に混合する。バッチは、金属キレートセフ
ァロースカラム中のゲル1リットル当り少くとも30リッ
トルを与えるように十分に大きくなければならない。
ウム 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム−塩基−水
和物2.78g/L、塩化ナトリウム58.44g/LおよびpHを7.2
(±0.1)まで調整するのに十分な量の6.3N水酸化ナト
リウムを一緒に混合する。バッチは、金属キレートセフ
ァロースカラム中のゲル1リットル当り少くとも30リッ
トルを与えるように十分に大きくなければならない。
(b)0.02Mリン酸ナトリウム、pH7.2、0.15M塩化ナト
リウム、10%グリセロール 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム一塩基一水
和物2.78g/Lおよび塩化ナトリウム8.7g/Lを一緒に混合
する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2(±0.1)
まで調整する。0.1L/Lにするのに十分なグリセロールを
加える。緩衝液が用いられるゲル1リットル当り少くと
も6リットルを与える十分な量の緩衝液を製造する。
リウム、10%グリセロール 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム一塩基一水
和物2.78g/Lおよび塩化ナトリウム8.7g/Lを一緒に混合
する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2(±0.1)
まで調整する。0.1L/Lにするのに十分なグリセロールを
加える。緩衝液が用いられるゲル1リットル当り少くと
も6リットルを与える十分な量の緩衝液を製造する。
(c)0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0、0.5M塩化ナトリウ
ム 脱イオン水中において、99.7%酢酸1.15ml/Lおよび塩
化ナトリウム29.2g/Lを一緒に混合する。6.3N水酸化ナ
トリウムを用いてpHを5.0(±0.1)まで調整する。緩衝
液が用いられるゲル1リットル当り少なくとも10リット
ルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。
ム 脱イオン水中において、99.7%酢酸1.15ml/Lおよび塩
化ナトリウム29.2g/Lを一緒に混合する。6.3N水酸化ナ
トリウムを用いてpHを5.0(±0.1)まで調整する。緩衝
液が用いられるゲル1リットル当り少なくとも10リット
ルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。
(d)0.03Mリン酸ナトリウム、pH7.0、0.003M-EDTA 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム一塩基一水
和物4.17g/Lおよび四ナトリウムEDTA1.14g/Lを一緒に混
合する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0(±0.
1)まで調整する。ゲル1リットル当り少なくとも2リ
ットルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。
和物4.17g/Lおよび四ナトリウムEDTA1.14g/Lを一緒に混
合する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0(±0.
1)まで調整する。ゲル1リットル当り少なくとも2リ
ットルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。
(e)10mMクエン酸ナトリウム、pH4.5 クエン酸一水和物210グラム(2.1g/L)を脱イオン水1
00Lと一緒に、クエン酸一水和物が溶解するまで混合す
る。必要ならば、4N塩酸および6.3N水酸化ナトリウムを
用いて緩衝液のpHを4.5まで調整する。この緩衝液を、
ダイアフィルトレーションおよび限外濾過並びにゲル濾
過クロマトグラフィーに用いる。
00Lと一緒に、クエン酸一水和物が溶解するまで混合す
る。必要ならば、4N塩酸および6.3N水酸化ナトリウムを
用いて緩衝液のpHを4.5まで調整する。この緩衝液を、
ダイアフィルトレーションおよび限外濾過並びにゲル濾
過クロマトグラフィーに用いる。
実施例7 活性組換え体ヒトインターロイキン−4の精製 (亜鉛キレートセファロースクロマトグラフィー) 活性ヒト組換え体IL-4が溶解している発酵ブイヨン70
リットルを20リットルまで濃縮した後、その溶液に、実
施例6(a)の緩衝液に対する25倍ダイアフィルトレー
ションを施す。4N-HClおよび/または6.3N塩化ナトリウ
ムを用いて溶液のpHを7.2(±0.1)まで調整する。溶液
の導電率を70〜90mSに調整する。
リットルを20リットルまで濃縮した後、その溶液に、実
施例6(a)の緩衝液に対する25倍ダイアフィルトレー
ションを施す。4N-HClおよび/または6.3N塩化ナトリウ
ムを用いて溶液のpHを7.2(±0.1)まで調整する。溶液
の導電率を70〜90mSに調整する。
溶液を濾過によって透明にし且つ濃縮する。フィルタ
ーを実施例6(a)の緩衝液で洗浄して溶液の容量を20
リットルに戻す。
ーを実施例6(a)の緩衝液で洗浄して溶液の容量を20
リットルに戻す。
溶液を亜鉛キレートセファロース・ファスト・フロー
および未処理セファロース・ファスト・フローのカラム
を介して約0.5cm/分の線速度でポンプ輸送する。フロー
スルーを1個の画分に集める。
および未処理セファロース・ファスト・フローのカラム
を介して約0.5cm/分の線速度でポンプ輸送する。フロー
スルーを1個の画分に集める。
カラムを2回洗浄しなければならないが、最初に、約
10床容量の実施例6(a)で製造した緩衝液を約0.5cm/
分の線速度で用い、洗浄液を5個以下の画分に集め、次
に、約5床容量の実施例6(b)で製造した緩衝液を約
0.5cm/分の線速度で用い、そして洗浄液を1個の画分に
集める。
10床容量の実施例6(a)で製造した緩衝液を約0.5cm/
分の線速度で用い、洗浄液を5個以下の画分に集め、次
に、約5床容量の実施例6(b)で製造した緩衝液を約
0.5cm/分の線速度で用い、そして洗浄液を1個の画分に
集める。
活性IL-4をカラムから、約8床容量の実施例6(c)
で製造した緩衝液を用いて約0.25cm/分の線速度で溶離
する。容量が約0.2床容量の画分を、採取用に0.5ml/ml
の稀釈剤として実施例6(d)で製造した緩衝液が入っ
ている別個の容器に集める。
で製造した緩衝液を用いて約0.25cm/分の線速度で溶離
する。容量が約0.2床容量の画分を、採取用に0.5ml/ml
の稀釈剤として実施例6(d)で製造した緩衝液が入っ
ている別個の容器に集める。
各試料の活性IL-4についてSDS-PAGEおよびタンパク質
検定法によって試験する。
検定法によって試験する。
実施例7によって処理された活性IL-4溶液の純度は約
20%〜40%である。粗製発酵ブイヨン中の量に基づく活
性IL-4の収率は90%である。
20%〜40%である。粗製発酵ブイヨン中の量に基づく活
性IL-4の収率は90%である。
実施例8 S−セファロースクロマトグラフィー用緩衝液の製造 (a)20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.12M塩化ナトリ
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム7.03g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオ
ン水1L/Lを適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム7.03g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオ
ン水1L/Lを適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。
緩衝液のpHを6.3N水酸化ナトリウムを用いて6.75(±
0.1)まで調整する。
0.1)まで調整する。
(b)20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.55M塩化ナトリ
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム32.14g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イ
オン水を適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。緩
衝液のpHを6.3N水酸化ナトリウムを用いて6.75(±0.
1)まで調整する。
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム32.14g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イ
オン水を適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。緩
衝液のpHを6.3N水酸化ナトリウムを用いて6.75(±0.
1)まで調整する。
(c)20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、四ナトリ
ウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオン水を保持するのに十分
な大きさの容器に入れる。溶解するまで撹拌し、必要な
らば、緩衝液のpHを6.3N-NaOHを用いて6.75(±0.1)ま
で調整する。
ウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオン水を保持するのに十分
な大きさの容器に入れる。溶解するまで撹拌し、必要な
らば、緩衝液のpHを6.3N-NaOHを用いて6.75(±0.1)ま
で調整する。
実施例9 精製活性インターロイキン−4溶液の陽イオン交換カラ
ムでの勾配溶離 実施例7によって製造された活性IL-4溶液のpHを、必
要ならば、4N-HClかまたは6.3N-NaOHを用いて6.75(±
0.1)に調整する。
ムでの勾配溶離 実施例7によって製造された活性IL-4溶液のpHを、必
要ならば、4N-HClかまたは6.3N-NaOHを用いて6.75(±
0.1)に調整する。
0.45ミクロンのフィルターを介して濾過する。そのフ
ィルターを、実施例8(c)で製造した緩衝液約1リッ
トルで洗浄する。
ィルターを、実施例8(c)で製造した緩衝液約1リッ
トルで洗浄する。
得られた溶液の導電率を、実施例8(c)で製造した
緩衝液を用いて15(±0.5mS)に調整する。
緩衝液を用いて15(±0.5mS)に調整する。
溶液を、実施例4で製造のS−セファロースカラムを
介して約1cm/分またはそれ未満の線速度でポンプ輸送す
る。流出液を一つの画分に集める。
介して約1cm/分またはそれ未満の線速度でポンプ輸送す
る。流出液を一つの画分に集める。
カラムを約5床容量の実施例8(a)で製造した緩衝
液を用いて約1.0cm/分またはそれ未満の線速度で洗浄す
る。
液を用いて約1.0cm/分またはそれ未満の線速度で洗浄す
る。
洗浄液を1個の画分に集める。カラムを、約4.5mS/床
容量の勾配および約0.2cm/分の線流量を用いて溶離す
る。
容量の勾配および約0.2cm/分の線流量を用いて溶離す
る。
勾配で用いられた低塩緩衝液は、5床容量の実施例8
(a)で製造されたものであり、勾配で用いられた高塩
緩衝液は、5床容量の実施例8(b)で製造されたもの
である。
(a)で製造されたものであり、勾配で用いられた高塩
緩衝液は、5床容量の実施例8(b)で製造されたもの
である。
5個の大きい画分を集め、それぞれの容量は約0.8床
容量である。
容量である。
残りの画分(約40〜50個)を0.1床容量の容量で集め
る。
る。
画分の活性IL-4についてSDS-PAGEおよびタンパク質検
定法によって試験する。
定法によって試験する。
活性IL-4画分をプールする。亜鉛キレー用のプールさ
れた溶離液中の活性IL-4の量に基づく苛性IL-4の収率は
90%である。
れた溶離液中の活性IL-4の量に基づく苛性IL-4の収率は
90%である。
活性IL-4溶液の純度は約90%〜95%である。
実施例10 限外濾過および濃縮 実施例9からのプール画分を、YM10膜を備えたアミコ
ン撹拌室を用いて、活性ヒトIL-4を含む実施例9からの
プール画分を容器中に入れ且つその容量をYM-10膜上の
限外濾過によって元の容量の約0.1まで濃縮することに
よって濃縮する。濃縮された保持物質を実施例6(e)
で製造した緩衝液4容量で稀釈し、そしてそれをYM-10
膜上の限外濾過によって約0.2容量まで濃縮する。
ン撹拌室を用いて、活性ヒトIL-4を含む実施例9からの
プール画分を容器中に入れ且つその容量をYM-10膜上の
限外濾過によって元の容量の約0.1まで濃縮することに
よって濃縮する。濃縮された保持物質を実施例6(e)
で製造した緩衝液4容量で稀釈し、そしてそれをYM-10
膜上の限外濾過によって約0.2容量まで濃縮する。
濃縮工程は、最初のプール画分の容量の約0.1になる
まで繰り返すことができる。濃縮物を適当な容器に移し
且つ冷蔵室温度で保持するかまたは−20℃で冷凍貯蔵す
る。
まで繰り返すことができる。濃縮物を適当な容器に移し
且つ冷蔵室温度で保持するかまたは−20℃で冷凍貯蔵す
る。
実施例11 ゲル濾過(サイズ排除) 実施例10で製造された溶液を、実験室遠心機で2℃〜
6℃において4500rpmで30分間遠心分離することによっ
て透明にする。Å280を測定し、そして15Å280/mlであ
るように溶液を実施例6(e)で製造した緩衝液で稀釈
する。
6℃において4500rpmで30分間遠心分離することによっ
て透明にする。Å280を測定し、そして15Å280/mlであ
るように溶液を実施例6(e)で製造した緩衝液で稀釈
する。
得られた溶液をセファクリルS-200HRカラムに約0.1cm
/分の線速度でポンプ輸送する。実施例6(e)の緩衝
液をカラムを介して約0.1cm/分の流量でポンプ輸送する
ことを続ける。全容量が0.4〜0.55床容量である5個の
画分を集めた後、約0.01床容量の50個の画分を集める。
/分の線速度でポンプ輸送する。実施例6(e)の緩衝
液をカラムを介して約0.1cm/分の流量でポンプ輸送する
ことを続ける。全容量が0.4〜0.55床容量である5個の
画分を集めた後、約0.01床容量の50個の画分を集める。
SDS-PAGEおよびタンパク質検定法によって決定される
活性IL-4を含む画分を選択する。活性IL-4画分をプール
し、そして0.2ミクロンの滅菌フィルターを介して濾過
する。95%〜99%純度の活性IL-4溶液である濾液を回収
する。発酵ブイヨン中の活性IL-4に基づく全体の収率は
70〜80%である。
活性IL-4を含む画分を選択する。活性IL-4画分をプール
し、そして0.2ミクロンの滅菌フィルターを介して濾過
する。95%〜99%純度の活性IL-4溶液である濾液を回収
する。発酵ブイヨン中の活性IL-4に基づく全体の収率は
70〜80%である。
回収された活性IL-4の純度は、SDS-PAGE検定法によっ
て実証される95%〜99%である。
て実証される95%〜99%である。
インターロイキン−4の活性画分を決定するのに用い
られた検定法はいずれも慣用的である。溶離液から活性
画分を選択するのに必要な検定法は、280nmでの紫外線
吸収測定法である。精製IL-4に対して、1.0Å280の光学
濃度単位(OD)は、アミノ酸組成分析による1.6mgおよ
びローリー法による2.0mgに相当する。
られた検定法はいずれも慣用的である。溶離液から活性
画分を選択するのに必要な検定法は、280nmでの紫外線
吸収測定法である。精製IL-4に対して、1.0Å280の光学
濃度単位(OD)は、アミノ酸組成分析による1.6mgおよ
びローリー法による2.0mgに相当する。
SDS-PAGE検定法は、更に、活性画分を選択するのに必
要である。この方法は、レームリ(Laemmli),U.K.,Nat
ure,227:680(1970)に論及されている。
要である。この方法は、レームリ(Laemmli),U.K.,Nat
ure,227:680(1970)に論及されている。
ローリー法は、ローリー(Lowry)ら、J.Biol.Chem.,
193,265〜275(1951)に記載されている。
193,265〜275(1951)に記載されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナガビュシャン,ティー・エル アメリカ合衆国ニュージャージー州 07054,パーシッパニー,サンセット・ レーン 3 (56)参考文献 特開 昭63−501401(JP,A) 特開 平4−506299(JP,A) European Journal of Lmmunology,Vol. 18(1988)P.577−584
Claims (3)
- 【請求項1】大腸菌により生産される活性組換え体ヒト
インターロイキン−4の溶液を精製する方法であって、 (a)約pH6.7〜8、好ましくは約7.2で緩衝され且つ約
0.5〜1.5M塩化ナトリウムを含む活性組み換え体ヒトイ
ンターロイキン−4の溶液を、亜鉛キレートアガロース
ゲルクロマトグラフィーカラム上に充填して、活性組み
換え体ヒトインターロイキン−4をカラムに選択的に結
合させ;そして (b)結合した活性組み換え体ヒトインターロイキン−
4を、約pH4.5〜5.5で溶離用緩衝液を用いてカラムから
溶離すること を含む上記の方法。 - 【請求項2】大腸菌により生産される活性組み換え体ヒ
トインターロイキン−4の粗製溶液を精製する方法であ
って、 (a)約pH6.7〜8、好ましくは約7.2で緩衝され且つ約
0.5〜1.5M塩化ナトリウムを含むインターロイキン−4
の粗製溶液を、亜鉛キレートアガロースゲルクロマトグ
ラフィーカラム上に充填して、活性組み換え体ヒトイン
ターロイキン−4をカラムに選択的に結合させ; (b)カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含む平
衡緩衝液で、次に、10%グリセロールおよび0.15M塩化
ナトリウムを含む緩衝液で2回洗浄し; (c)結合した活性ヒトインターロイキン−4を、約pH
4.5〜5.5で溶離用緩衝液を用いてカラムから溶離し; (d)工程(c)からの活性ヒトインターロイキン−4
に、陽イオン交換器でのクロマトグラフィーに続いてカ
ラムからの活性ヒトインターロイキン−4の緩衝液の勾
配溶離を施し; (e)工程(d)からの溶離液を、分子量が10,000ダル
トン未満の物質を通過させる撹拌されたセルの膜上で濃
縮し; (f)工程(e)からの濃縮物にサイズ排除クロマトグ
ラフィーを施し;そして (g)精製活性組み換え体ヒトインターロイキン−4を
回収すること を含む上記の方法。 - 【請求項3】活性ヒトインターロイキン−4を分泌大腸
菌突然変異体の粗製発酵ブイヨンから精製する方法であ
って、 (a)粗製溶液を遠心分離して大型粒子不純物を除去
し; (b)遠心分離した粗製溶液に、ダイアフィルトレーシ
ョンを施して粗製溶液を濃縮し;そして (c)濃縮した粗製溶液を請求項1または2に記載の方
法によって処理すること を含む上記の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/531,270 US5077388A (en) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | Purification of human interleukin-4 from a secreted escherichia coli mutant |
US531,270 | 1990-05-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05505934A JPH05505934A (ja) | 1993-09-02 |
JP2573767B2 true JP2573767B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=24116964
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3503528A Expired - Lifetime JP2573767B2 (ja) | 1990-05-31 | 1991-01-04 | 分泌大腸菌突然変異体からのヒトインターロイキン―4の精製 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5077388A (ja) |
EP (1) | EP0537148B1 (ja) |
JP (1) | JP2573767B2 (ja) |
AT (1) | ATE136552T1 (ja) |
AU (1) | AU659993B2 (ja) |
CA (1) | CA2084186C (ja) |
DE (1) | DE69118696T2 (ja) |
DK (1) | DK0537148T3 (ja) |
ES (1) | ES2085986T3 (ja) |
GR (1) | GR3019705T3 (ja) |
IE (1) | IE73668B1 (ja) |
IL (1) | IL96880A0 (ja) |
MY (1) | MY130013A (ja) |
NZ (1) | NZ236699A (ja) |
WO (1) | WO1991018919A1 (ja) |
ZA (1) | ZA9193B (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100191223B1 (ko) * | 1989-07-28 | 1999-06-15 | 둘락 노먼 씨. | 인터루킨-4의 정제방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 |
US5840851A (en) * | 1993-07-23 | 1998-11-24 | Plomer; J. Jeffrey | Purification of hemoglobin |
KR0141651B1 (ko) * | 1994-09-07 | 1998-06-15 | 강재헌 | 금속이온 친화성 크로마토그라피를 이용한 히루딘의 정제방법 |
US6171856B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-01-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity |
WO1999006059A2 (en) * | 1997-07-30 | 1999-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to no-mediated cytotoxicity |
WO2002072615A1 (fr) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de purification de proteines |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL80678A (en) * | 1985-11-19 | 1999-05-09 | Schering Biotech Corp | Human interleukin-4 |
EP0374791A1 (en) * | 1988-12-21 | 1990-06-27 | Schering Corporation | The use of Interleukin-4 for the manufacture of a medicament for lowering blood cholesterol levels. |
KR100191223B1 (ko) * | 1989-07-28 | 1999-06-15 | 둘락 노먼 씨. | 인터루킨-4의 정제방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 |
-
1990
- 1990-05-31 US US07/531,270 patent/US5077388A/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-04 MY MYPI91000007A patent/MY130013A/en unknown
- 1991-01-04 NZ NZ236699A patent/NZ236699A/en unknown
- 1991-01-04 EP EP91903451A patent/EP0537148B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-04 IE IE2791A patent/IE73668B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-01-04 WO PCT/US1991/000006 patent/WO1991018919A1/en active IP Right Grant
- 1991-01-04 AT AT91903451T patent/ATE136552T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-04 ES ES91903451T patent/ES2085986T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-04 DK DK91903451.2T patent/DK0537148T3/da active
- 1991-01-04 CA CA002084186A patent/CA2084186C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-04 IL IL96880A patent/IL96880A0/xx unknown
- 1991-01-04 DE DE69118696T patent/DE69118696T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-01-04 ZA ZA9193A patent/ZA9193B/xx unknown
- 1991-01-04 AU AU72220/91A patent/AU659993B2/en not_active Ceased
- 1991-01-04 JP JP3503528A patent/JP2573767B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-22 GR GR960401088T patent/GR3019705T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
European Journal of Lmmunology,Vol.18(1988)P.577−584 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL96880A0 (en) | 1992-03-29 |
US5077388A (en) | 1991-12-31 |
ES2085986T3 (es) | 1996-06-16 |
IE910027A1 (en) | 1991-12-04 |
JPH05505934A (ja) | 1993-09-02 |
MY130013A (en) | 2007-05-31 |
CA2084186C (en) | 1999-12-14 |
ATE136552T1 (de) | 1996-04-15 |
EP0537148B1 (en) | 1996-04-10 |
IE73668B1 (en) | 1997-07-02 |
DE69118696D1 (de) | 1996-05-15 |
ZA9193B (en) | 1991-09-25 |
WO1991018919A1 (en) | 1991-12-12 |
NZ236699A (en) | 1992-08-26 |
EP0537148A1 (en) | 1993-04-21 |
DE69118696T2 (de) | 1996-08-29 |
DK0537148T3 (da) | 1996-05-06 |
AU659993B2 (en) | 1995-06-08 |
CA2084186A1 (en) | 1991-12-01 |
GR3019705T3 (en) | 1996-07-31 |
AU7222091A (en) | 1991-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU584032B2 (en) | Method for the purification of erythroppietin and erythropoietin compositions | |
JP2562192B2 (ja) | 血清アルブミンの純化方法 | |
KR101831300B1 (ko) | 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 | |
JP2005225889A (ja) | 精製血清アルブミン | |
CN102850450B (zh) | 聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法 | |
JP2005525304A (ja) | 生物学的に活性な顆粒球コロニー刺激因子の精製および/または単離方法 | |
JP2573767B2 (ja) | 分泌大腸菌突然変異体からのヒトインターロイキン―4の精製 | |
JP3360315B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 | |
EP0618220B1 (en) | Method for purifying interleukin-4 | |
CN113416722A (zh) | 一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺 | |
EP0446582B1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
US5034133A (en) | Purification of human interleukin-4 from a CHO-cell line culture medium | |
CA2257294C (en) | Process for the purification of human interleukin-1 receptor antagonist from recombinant e. coli | |
JPH02115196A (ja) | エリスロポエチンの精製法 | |
JPS62259596A (ja) | ハイブリツドタンパク質の精製方法 | |
KR100531670B1 (ko) | 인체 인터페론 알파의 제조방법 | |
EP0337243A1 (en) | Process for purifying recombinant human interleukin-2 | |
CN116410295A (zh) | 一种大肠杆菌表达物的纯化方法 | |
KR100493338B1 (ko) | 재조합이.콜라이로부터사람인터루킨-1수용체길항제의정제방법 | |
JPH022390A (ja) | 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 | |
JPH1042892A (ja) | タンパク質の回収精製法 | |
JPS59225195A (ja) | インタ−ロイキン2の精製法 | |
JPH0675513B2 (ja) | ヒト血清アルブミンの脱色方法 | |
IE75354B1 (en) | Method for purifying interleukin-4 | |
JPH013198A (ja) | インターリューキン−2の精製方法 |