KR100191223B1 - 인터루킨-4의 정제방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물에게 IL-4를 투여하여 골수세포의 성숙을 유도하고 호중구의 수를 증가시키는 방법 및 특정한 이.콜라이 발효육즙 또는 특정한 CHO-세포 배양 배지로부터 활성인 재조합 사람 인터루킨-4를 정제하는 방법에 관한 것이다.
Description
[발명의 명칭]
인터루킨-4의 정제 방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물
[발명의 배경]
본 발명은 포유동물에게 유효량의 인터루킨-4(IL-4)를 투여하여 상기 동물에서 호중구의 수를 증가시키고 골수 세포의 성숙을 유도하는 방법 및 상기 치료에 사용하기 위해 인터루킨-4를 정제하는 방법에 관한 것이다.
인터루킨-4(IL-4)는 광범위한 면역-세포 자극 활성을 갖는 림포카인(면역계의 자극제)이다[참조: Banchereau et al., Lymphokine Res. Vol. 6, No. 1:U135(1987); Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898(1986); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2061-2065(1986); Coffman et al., J. Immunol. 136:949-954(1986); Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:437-440(1986); Grabstein et al., J. Exp. Med., 163:1405-1413(1985); and Vitetta et al., J. Exp. Med. 162:1726-1731(1985)]. 오랫동안, IL-4는 B-세포 성장 인자(BCGF)[참조: Butler et al., J. Immunol. 133:251-255(1984)(사람 BCGF); and Farrar et al., J. Immunol. 131:1838-1842(1983) (마우스 BCGF)] 및 B-세포 자극 인자-1 (BSF-1) [Ohara et al., J. Immunol. 135:2518-2523(1985)]로도 언급되었다. 최종적으로 인터루킨-4라는 명칭이 제안되어 1986년에 채택되었다[참조: Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:437-440(1986)].
IL-4는 처음에는 단지 활성화된 B-세포의 공동-자극을 위해서만 중요한 것으로 생각되었다[참조: Roehm, et al., J. Exp. Med. 160:679-694(1984)]. 그러나, IL-4는 또한 T-세포 및 비만 세포(mast cell)의 활성을 조절하는 것으로도 밝혀졌다[참조: Mosmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:5654-5658(1986)]. 또한 WO 87/0290에는 T-세포 성장 인자 및 B-세포 성장 인자로서, IL-4의 활성이 다양한 감염에 대한 천연 방어력을 증진시키는데 유용한 것으로 기술되어 왔다.
T-세포 및 B-세포는 면역 반응의 후기 단계에 작용한다. 감염의 초기 단계에 작용하는 감염에 대한 신체의 제1방어선인, 호중구를 증가시키고 활성화시키는 인자를 갖는 것이 매우 유리할 수 있다.
백혈구의 정상적인 조혈 과정에서, 세포는 간 세포로서 공지된 원시의 미성숙 세포로부터 골수중에서 기원하여, 상이한 계보 경로에 따라 점진적으로 보다 성숙한 단계로 분화되어, 단구, 과립구 또는 림프구와 같은 분화의 말기 상태에 도달한다.
미성숙한, 분화되지 않은 세포의 특성을 빠른 증식력을 갖는다는 것이다. 전구체 세포가 일반적으로 이의 증식력을 상실하고 특수화된 작용성 성숙 세포의 역할을 갖는 것은 이들 전구체 세포가 이의 다수 단계를 통해 성숙하고 분화하는 경우에 한한다. 정상적인 상태에서, 이의 최종의 성숙한 형태에 이른 세포는 더 이상 크게 증식하지 않는다.
일반적으로, 암은 세포 분화의 장애이다. 특히, 골수성 백혈병은 단구 및 과립구 계보의 세포가 성숙의 초기 단계에서 차단되어 이들의 증식력을 상실하지 않는 장애이다. 이러한 성숙이-저지된 세포는 계속적으로 증식하여 미성숙한 암세포군을 이루어, 그 결과 백혈병의 특성을 나타낸다.
많은 골수성 백혈벙 세포는, 정상적인 대식구 및 과립구로의 분화를 유도할 수 있으며, 분화시 이들 세포는 자체의 증식력을 상실한다는 것이 입증되었다. 이러한 사실은 인자에 의한 말기 분화의 유도가 골수성 백혈병의 치료요법에 유용하다는 것을 시사한다.
[발명의 요지]
본 발명에 이르러, 본 발명자는 놀랍게도 IL-4의 투여로 포유동물에서 호중구의 수가 증가되고, 호중구 및 단구의 분화가 자극된다는 것을 발견하였다. 보다 놀랍게도, 본 발명자는 IL-4의 투여를 중단한 후 오랫동안 호중구에 대한 이의 효과가 지속된다는 것을 발견하였다. 신체중에서 IL-4의 반감기는 매우 짧으므로 이는 매우 놀라운 일이다. 따라서, 본 발명자는 호중구의 수를 증가시키고 감염에 대한 숙주의 내성을 증가 시키거나 매우 초기 단계에서 감염을 치료하기 위하여 포유 동물에 IL-4를 투여할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 이러한 포유동물은 면역손상된(immunocompromised) 숙주, 예를 들어 중증의 화상 또는 궤양을 갖는 환자와 같이 바람직하지 못한 세균에 감염되기 쉬운 숙주, 암의 치료시 방사선 또는 화학요법에 의해 면역 방어능이 저하된 숙주, 및 유전적 면역결핍증을 지닌 숙주일 수 있다. IL-4의 이러한 특성은 상처 부위에서 호중구 및 단구의 활성화 및 섬유 아세포의 증식을 자극하여 개방 절상(open cut) 또는 화상과 같은 상처 치유용으로 국소 투여하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
본 발명자는 또한 IL-4가 골수 세포 및 단구 세포의 성숙을 유도한다는 것을 밝혀내었다. 골수성 백혈병은 미성숙한 골수 세포의 증식과 관련이 있으므로, IL-4는 골수 세포를 이의 성숙한 상태로 발달시킴으로써 이의 증식을 감소시키고 골수성 백혈병을 치료하는 방법을 제공함이 분명하다.
포유 동물은 사람 공급원으로부터 유도된 IL-4, 즉 이.콜라이 또는 CHO 세포로부터 재조합적으로 생산된 사람 IL-4와 같은 사람 IL-4로 치료하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 포유 동물에 대한 복용량을, 피하내 또는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입으로써, 약0.1 내지 약30㎍의 IL-4/kg 체중/일의 양으로 투여한다. 바람직하게는, IL-4의 약1 내지 약15㎍의 IL-4/kg 체중/일의 양으로 투여하며, 가장 바람직 하게는 약3 내지 약10㎍의 IL-4/kg 체중/일의 양으로 투여한다.
고순도의 활성 IL-4는 하기 3-단계 과정으로 IL-4 발현-이.콜라이의 발효 육즙으로부터 수득할 수 있다:
1. 조 발효 육즙을 금속 킬레이트화-아가로즈 겔 컬럼, 예를 들어 킬레이트화-Sepharose겔(킬레이트화-SepharoseFast Flow 및 킬레이트화-Sepharose6B라는 상품명으로 Pharmacia Fine Chemicals에서 시판, Piscataway, New Jersey) 상에서 친화성 크로마토그래피한다. 킬레이트화 SepharoseFast Flow는 안정한 에테르 결합에 의해 Sepharose 6 Fast Flow에 결합된 스페이서상의 이미노디아세트산 그룹으로 이루어 진다. Sepharose6 Fast Flow는 가교결합된 아가로즈 6%이다. 완충액은 인산염 완충액이 바람직하게 사용된다. 사용되는 인산염 완충액은 중성 내지 약 알칼리성 pH, 즉 약6.7 내지 8, 바람직하게는 약7.2에서, 고농도의 염화나트륨, 즉 약0.5 내지 1.5M, 바람직하게는 1.0M을 함유하는 완충액이다. 고 농도의 염 및 약 pH7.2의 중성에 가까운 pH는 활성 인터루킨-4의 결합을 최대화하고, 다른 단백질이 컬럼에 결합 하는 것을 최소화한다. 바람직한 금속 킬레이트는 아연이며, 기타 금속 킬레이트, 예를 들어 구리, 코발트 또는 니켈도 사용할 수 있다. 결합이 완결된 후, 컬럼을 먼저 20mM 인산나트륨(pH7.2) 및 1.0M 염화나트륨을 함유하는 평형화 완충액으로 세척하고, 이어서 약10% 글리세롤 및 저 농도의 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액, 즉 20mM 인산 나트륨 완충액중 150mM의 염화나트륨으로 세척한다. 2번째 세척에서, 불순물, 예를 들어 매우 밀접히 연관 되어 분리시키기 어려운 불순물이 제거된다. 마지막으로, 활성 IL-4를 0.50M 염화나트륨을 함유하는 아세트산염 완충액으로 pH5.0에서 용출시킨다;
2. 단계1로부터의 활성 IL-4의 용액을 약 pH6.75의 중성에 가까운 pH 및 15mS(전도율)(여기에서는 대부분의 불순물이 결합하지 않는다)의 S-SepharoseFast Flow 컬럼상에서 양이온 교환 크로마토그래피한다. 이어서 완충 용액중의 보다 더 정제된 IL-4를 컬럼으로부터 용출시킨다;
3. 활성 IL-4 용액을 pH4.5에서 29mg/ml 이하로 농축시킨후, 10mM 시트르산나트륨(pH4.5)으로 평형화시킨 크기 배제 컬럼상에서 겔 여과 크로마토그래피한다. 이어서 95% 내지 99% 순도의 정제된 활성 IL-4 용액을 수집한다:
또한, 고순도 활성 IL-4는 하기 4-단계 과정으로 IL-4 발현-CHO-세포주의 세포 배양 배지로부터 수득될 수 있다:
1. 활성 IL-4를 함유하는 조 세포 배양 배지를 약 pH6.7 내지 8의 중성에 가까운 pH, 바람직하게는 pH7.2 및 13내지 15mS(전도율)(여기에서는 대부분의 불순물이 결합하지 않는다)의 S-SepharoseFast Flow 컬럼상에서 양이온 교환 크로마토그래피한다. S-SepharoseFast Flow(Pharmacia Fine Chemicals)에서 시판, Piscataway, New Jersey)는 이온 교환 그룹-CH2-SO3 -Na+이 결합되어 있는 가교 결합된 아가로즈 매트릭스이다. 컬럼을 평형화 완충액으로 세척한후, 완충 용액중의 정제된 IL-4를 0.26M NaCl을 함유하는 완충 시스템(pH7.2)으로 컬럼으로부터 등용매적(isocratical)으로 용출시켜 수집한다;
2. 단계1로부터의 수집된 용출물을 비교적 작은 S-SepharoseFast Flow 컬럼(이의 베드 용적은 단계1의 컬럼의 베드 용적의 약15%이다)상에서 추가로 양이온 교환 크로마토그래피한다. 컬럼을 평형화 완충액으로 세착한후, 활성 IL-4분자를 0.12 내지 0.50M의 염화나트륨 구배를 함유하는 완충 시스템(pH7.2)으로 용출시킨다;
3. 단계2로부터의 활성 IL-4의 용액을 pH7.2 및 45 내지 50mS의 전도율로 조절한 후 금속 킬레이트화-아가로즈 겔 컬럼상에서 친화성 크로마토그래피한다. 킬레이트화-Sepharose겔은 킬레이트화-SepharoseFast Flow 및 킬레이트화-Sepharose6B라는 상품명으로 Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway, New Jersey)에서 시판한다. 킬레이트화 SepharoseFast Flow는 안정한 에테르 결합에 의해 Sepharose 6 Fast Flow에 결합된 스페이서상에서의 이미노 디아세트산 그룹으로 이루어져 있다. Sepharose6 Fast Flow는 가교결합된 아가로즈 6%이다. 사용되는 완충액은 인산염 완충액이 바람직하다. 사용되는 인산염 완충액은 pH가 중성 내지 약 알칼리성, 즉 pH6.7 내지 8, 바람직하게는 약7.2인, 약0.5M 농도의 염화나트륨을 함유하는 완충액이다. 염의 농도 및 약 pH7.2의 중성에 가까운 pH가 활성 인터루킨-4의 결합을 최대화 시키고 다른 단백질의 컬럼에 대한 결합을 최소화한다. 바람직한 금속 킬레이트는 코발트이며, 기타의 금속 킬레이트, 예를 들어 아연, 구리 또는 니켈도 사용할 수 있다. 결합이 완료된 후, 컬럼을 20mM 인산나트륨(pH7.2) 및 0.5M 염화나트륨을 함유하는 평형화 완충액으로 세척한다. 마지막으로, 활성 IL-4를 0.5M 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액으로 pH6.0에서 등용매적으로 용출시킨다;
4. 활성 IL-4 용액을 pH4.5에서 20mg/ml 이하의 농도를 농축시킨 후 10mM 시트르산나트륨(pH4.5)으로 평형화시킨, 크기 배제 컬럼, 바람직하게는 Pharmacia에서 시판되는 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드와의 가교 결합된 공중합체인 SephacrylS-200 HR 또는 S-100 HR 상에서 겔 여과 크로마토그래피한다. 이어서 95 내지 99% 순도의 정제된 활성 IL-4 용액을 수집한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명에 사용하기 위한 바람직한(사람) IL-4의 아미노산 서열도이고,
제2도는 시노몰로거스(cynomologus) 원숭이에게 IL-4를 투여하여 밝혀진 호중구 수의 증가를 나타내는 그래프이며,
제3도는 HL-60 세포를 IL-4로 처리하여 달성된 활성화 및 분화 결과를 나타내는 그래프이고,
제4도는 U-937 세포를 IL-4로 처리하여 달성된 활성화 및 분화 결과를 나타내는 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
어떠한 적합한 IL-4도 본 발명에 사용될 수 있다. 최근에 IL-4에 대한 상보적 DM(cDNA)가 클로닝되었으며 많은 실험가에 의해 서열분석되었다[참조: Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898(1986) (사람); Lee at al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2061-2065(1986)(마우스); and Noma et al., Nature 319:640-646(1986) (마우스)]. 문헌 [참조: Le et al., J. Biol. Chem. 263:10817(1988)]에는 CHO 세포내에서 재조합 사람 IL-4의 생성이 기술되어 있다. IL-4는 또한, 예를 들어 Genzyme Corporation(Boston, Massachusetts: 사람 및 마우스)에서 시판되는 품목이다. 또한, 비-재조합 IL-4가 다양한 배양 상등액으로부터 정제되었다[참조: Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:437-440(1986) (마우스); Grabstein et al., J. Exp. Med., 163:1405-1413(1985) (마우스); Ohara et al., J. Immunol., 135:2518-2523(1985) (마우스 BSF-1); Butler et al., J. Immunol., 133:251-255(1984) (사람 BCGF); 및 Farrar et al., J. Immunol., 131:1838-1842(1983) (마우스 BCGF)]. 본 명세서에 상술된 잡지의 기술 내용은 본 발명에 사용하기 위한 적합한 IL-4 물질을 수득하는 방법, 및 DNA 및 아미노산 서열에 대한 교시를 위하여 참조로 인용되었다.
본 발명에 사용되는 IL-4는 바람직하게는 사람 IL-4이며, 보다 바람직하게는 문헌[참조: Yokoto et al., Natl. Proc. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898(1986) 및 PCT 특허원 제87/02990호, 1987년 5월 21일 공개]에 기술된 서열을 갖는 사람 IL-4이다. 상술된 잡지의 기술 내용 및 PCT 특허원의 기술 내용은 본 명세서에 참조로 인용되었다.
본 발명에 따라, 포유 동물에게 IL-4의 유효량을 투여하여 단구 및/또는 과립구(다형핵구, 호산구 및/또는 호염구 중의 어떠한 것일 수 있다)의 수를 증가시킨다. 유효량은 호중구의 수를 25% 이상, 바람직하게는 50% 증가시키는 IL-4의 양으로 정의된다. 약0.1 내지 30㎍의 IL-4, 바람직하게는, 사람 IL-4(hIL-4)/kg 체중/일이 투여된다. 보다 바람직하게는, 포유 동물에게 약1.0 내지 약15.0㎍의 hIL-4/kg 체중/일, 및 가장 바람직하게는 약3.0 내지 약10.0㎍의 hIL-4/kg 체중/일이 투여된다.
투여랑, 횟수 및 기간을 호중구 및 단구 수의 수준(예: 단구 감소증 또는 과립구 감소증의 중증도), 환자의 연령, 영양 상태 등에 따라 달라진다. 통상적으로, 초기에는 매일 투여 하고, 환자의 일생 동안 주기적으로 지속할 수 있다. 투여 용량 및 횟수는 호중구 수의 초기 스크리닝 동안 결정될 수 있으며, IL-4의 효과의 크기는 호중구 수의 증가시에 측정할 수 있다. 복용량은 총 약 1000개의 호중구 및/또는 총 100개의 단구의 허용되는 수준으로 호중구의 수를 증가시켜 목적하는 생물학적 효과(이는 임상적 상태에 따라 개개의 환자에 대해 개별적으로 측정해야 한다)를 얻는 것을 목적으로 한다. 추가로, 예를 들면 림프구의 하나 이상의 아군의 증진과 같은 선별적인 조작을 수행할 수 있다.
IL-4의 호중구 수의 증가 효과를 보완하기 위하여, IL-4를 기타의 생물학적 및/또는 약제학적 활성 화합물과 함께 투여하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 기타의 백혈구 증가제[예: 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)]와 혼합할 수 있다. 또한 IL-4를 전체 백혈구 및 호중구 수를 증가시킬 목적으로, 기타의 인터루킨, 예를 들면 IL-1 및/또는 IL-3 및/또는 IL-7과 혼합하는 것도 유용할 수 있다. IL-4와 혼합한 IL-2는 특이적이고 유용한 T-세포 작용을 선택적으로 증진시킬 수 있으며, 또한 IL-5 및/또는 IL-6와 혼합한 IL-4도 정상적이고/이거나 신생물적인 B-세포의 작용 및/또는 수를 특이적으로 증진시키는데 유용할 수 있다. IL-4는 또한 이에 한정되는 것은 아니나 알킬화제, 유사 분열 방추체 독물 또는 종양 치료 항생제를 포함한, 화학 치료 요법제의 이용을 증가시키는데도 유용할 수 있다. 백혈구의 수 또는 특이적 아군의 세포의 작용적 또는 분화적 상태를 증진시켜, 상술한 화학 치료요법제의 효능을 증진시킬 수 있다. IL-4와 인터페론(예: 인터페론 감마 또는 알파)와의 배합물은 또한 특정 백혈구, 특히 T-세포, 아세트의 수 및 작용을 증가시키는데 유용할 수도 있다. 특정한 상황에서, 필요한 생물학적 효과를 얻기 위하여, 상술한 인터루킨 또는 인터페론중 특정한 것에 대한 항체를 천연 분자 대신에 투여할 수 있다.
복용량의 투여는 정맥내, 비내, 비경구, 경구, 피하, 근육 내, 국소 또는 경피 경로 또는 기타 어떠한 적합한 경로로도 수행할 수 있다. IL-4는 수많은 통상의 복용량 형태로 투여될 수 있다. 비경구 제제에는 멸균 액제 또는 현탁제가 포함된다. 흡입 투여는 비내 또는 경구 스프레이의 형태, 또는 취입(insuffulation)으로 수행될 수 있다. 국소 복용량 형태는 크림, 연고, 로션, 경피 장치(예: 통상의 저장기 또는 매트릭스 패치 타입)등 일 수 있다.
상기 복용량 형태에 의해 고려될 수 있다는 제형 및 약제학적 조성물은 통상의 기술을 이용하여, 통상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 부가제로 제조될 수 있다.
현재, IL-4는 정맥내 경로로 투여하는 것이 바람직하다. 투여되는 액제는 재구성되는 동결 건조된 산제일 수 있으며, 이들은 방부제, 완충제, 분산제 등을 추가로 함유할 수 있다.
바람직하게는, IL-4는 ml당 100㎍을 초과하지 않는 최대 농도로 10mM 시트르산염 완충액 및 방부제-부재 멸균 수로 재구성되고 연속적인 정맥내 주입 또는 정맥내 주사로 투여한다. 연속적 주입을 위해서, 1일 복용량을 5ml의 통상의 염수에 가하고 이 용액을 기계적 펌프 또는 중력에 의해 주입할 수 있다.
포유 동물에서 호중구 수의 증가에 대한 IL-4의 효과를 하기 시험 프로토콜에 의해 측정할 수 있다.
제1도에 나타낸 아미노산 서열 세트를 갖는 이.콜라이-유래된 사람 IL-4를 시노몰거스 원숭이에서 1개월 동안 연구하여 평가한다., IL-4를 2, 10 및 25㎍/kg/일의 복용량으로 1일 1회씩 정맥내 투여한다. 원숭이로부터 채취한 혈액 샘플의 혈액학적 및 임상화학적 평가를, 복용량을 투여하기 전 특정 시점, 투여하는 동안 및 투여를 종료한지 1개월후에 수행한다. 데이터는 Coulter S+4 혈액학 분석기[총 백혈구수] 및 수동적 미분 측정으로부터 유도 한다. 제2도에 나타낸 결과는 본 발명에 의해 생성되는 호중구 수의 증가를 입증한다.
IL-4에 의한 호중구의 활성화는 하기 시험 프로토콜에 의해 입증될 수 있다.
[방법]
A. 세포의 분리: IL-4 용량(25㎍/kg) 및 비이클 투여를 멈춘지 4주후 시노몰거스 원숭이로부터 채취한 전체 혈액을 6% 덱스트란을 통해 중력에 의해 침전시킨 후, 저장성 염수 또는 트리스-염화암모늄으로 번갈아 가며 용해시켜 백혈구를 회수한다.
B. 효모 식작용 검정: 식작용 검정은 약5x105의 분리된 백혈구를 함유하는 12x75mm의 폴리프로필렌 시험관에 사람 혈청 300㎕, 가열-사멸시킨 효모 입자(108유기체/ml) 50㎕를 가하여 수행한다. 37℃에서 90분동안 자이로회전식(gyrorotary) 수욕중에서 배양한다. 원심분리시킨 후, 세포 현탁액을 염수중의 0.4% 트리판 블루 및 0.2% 에오신 Y로 염색한다. 섭취된 효모는 무색이며, 섭취되지 않은 효모는 자줏빛이어서, 결합성(섭취된 효모 세포의 수) 및 식세포 %를 정확히 측정할 수 있다. 이들 변수에 대해 수득된 평균 값을 배가하여 원숭이 각각에 대한 식작용 지수를 계산한다. 데이터를 스튜던트 T 시험으로 분석하고, 비이클만을 투여한 대조군 원숭이의 값과 IL-4 처리된 원숭이의 값을 비교한다. 그 결과가 표 1에 나타나 있다.
a: IL-4 또는 비이클을 4주 동안 투여한 후 4주동안 세척한 원숭이로부터 수득된 세포
b: 효모 평균치/세포=섭취된 효모수/60개 세포(원숭이 각각으로부터 기원); 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)(측정된 세포에 기초함).
c: 식세포 %=효모 섭취 세포/전체 세포 x 100
d: 식작용 지수= 효모 평균치/세포 x 식세포 %.
e: 평균 ± SEM(원숭이에 대한 개개의 값)
f: P 0.002, 스튜던트 T 시험, 대조군대 IL-4
g: P 0.014, 스튜던트 T 시험, 대조군대 IL-4
C. NBT 검정: 상기와 같이 분리시킨 후, 시노몰거스 원숭이로부터의 백혈구를 2% 가열-불활성화시킨 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI-1640 0.2ml 중에 재현탁시키고, 12 x 75mm 폴리프로필렌 시험관에 분배한다. 각각의 시험관에, 2% RPMI 중의 니트로불루 테트라졸륨(NBT)의 2mg/ml 용액 0.1ml 및 2% RPMI 중의 새로이 제조된 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)의 0.25μM 저장액 0.1ml을 세포에 가한다. 세포 현탁액을 30분 동안 37℃ 수욕중에서 배양한다. 배양후, 시험관을 원심 분리시키고, 상등액을 세포 펠렛으로부터 제거한다. 세포 펠렛을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)로 추출하기 전에 37℃에서 1시간동안 건조시킨다. DMF 1ml을 세포펠렛에 가하고, 와동 시킨후, 즉시 20분동안 85℃에서 배양한다. 시험관을 원심분리시키고, 착색된 DMF를 DMF 블랭크에 대한 560nm에서 분광 광도계적 분석을 위해 수집한다. 모든 측정은 배양이 종료된지 30분내에 수행한다.
환원된 NBT(NBF; ㎍/ml)의 계산을, Whatman 필터 스트립 상에 스폿팅하여 건조된 2mg/ml NBT 원액의 연속 희석물을 사용하여 준비된 표준 곡선으로부터 수행한다. 표준 곡선에 대해, NBT를 암실의 실온에서 20분동안 0.2N NaOH 중의 1mM 아스코르베이트 용액에 노출시켜 환원시킨다. 필터를 DMF로 추출하고 560nm에서 판독한다. NBF/세포의 계산은 NBF(㎍/ml)를 샘플 ml당 세포수로 나누어 구한다. 이 결과가 표 2에 나타나 있다.
a: IL-4 또는 비이클을 4주 동안 투여한 후 4주동안 세척한 원숭이로부터 수득된 세포
b: NBF ㎍/ml 전체 세포(샘플중)로부터 계산된 NBF(pg/세포). 세포수는 검정하기전에 Turks 용액을 사용하여 혈구계로 계산함으로써 수득된다.
c: 평균 ± SEM(원숭이에 대한 개개의 값)
d: P 0.02, 스튜던트 T 시험, 대조군 대 IL-4
상기 결과는 4주동안 투여한 후 IL-4 처리된 원숭이로부터 수득된 백혈구의 식작용 지수가 대조군 동물로부터 수득된 백혈구의 식작용 지수보다 현저히 증가함을 입증한다. 식작용 지수의 상승은 효모를 섭취하는 세포 %가 증가하기 때문이다. IL-4 투여후 그룹으로부터 세포의 결합성(세포당 섭취된 효모의 수)은 약간 증가한다. NBF의 pg/세포로 측정된 NBT염료 환원 반응은 비이클-대조군 그룹의 원숭이로부터의 세포와 비교시 IL-4 처리된 원숭이로부터의 세포에서 증가되었다.
상기 두 검정(효모 세포 섭취 및 NBT 염료 환원)은, 감염원을 파괴시키는 연속적인 현상에서 중요한 단계인 식작용의 측정 및 대사적 변화(호흡 버스트: respiratory burst)의 측정이다. 변수 모두에서의 증가는 IL-4가 식작용 반응을 증가시키거나 증폭시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
U937은 조직구성 백혈병을 확산시키는 환자로부터의 악성종양 세포로부터 확립된 세포주(ATCC CRL 1593)이다[참조: Sunstrom et al., Int. J. Cancer 17:565-577(1976)]. 이러한 세포주는 자체가 미성숙한 단구임을 나타내는 특성을 보인다.
HL-60은 급성 전골수구성 백혈벙 환자로부터 확립된 세포주(ATCC CCL 240)이다. 이들 세포는 자체가 미성숙한 호중구임을 나타내는 특성을 보인다.
IL-4는 식작용의 증가, 식작용에 대한 대사적 필요소인 헥소즈 모노포스페이트 측로(NBT 환원)의 활성화의 증가, 성숙한 호중구(나프톨 클로로아세테이트 에스테라제) 또는 성숙한 단구(알파 나프틸 아세테이트 에스테라제)에 대해 특이적인 색소를 취할 수 있는 세포 %의 증가 및 성숙한 단구 또는 성숙한 호중구에 대한 FACS 분석으로 입증되는 바와 같이 표면 마커에 대해 양성인 세포의 증가에 의해 정의한 바와 같이 이러한 2개의 미성숙한 세포의 분화를 유도할 수 있다.
골수 세포의 성숙에 대한 IL-4의 효과는 하기 시험 공정에 의해 입증될 수 있다.
[NBI(니트로블루 테트라졸륨)의 포마잔으로의 환원]
호흡 버스트와 관련된 헥소즈 모노포스페이트 측로 활성화의 측정[참조: Muller, et al., Agents Actions 11:384(1981), Baehner, et al., New Eng. J. Med. 278:971(1968), and Salin and McCord, J. Clin. Invest. 54:1005(1974)]
U937 및 HL-60 세포주를 사용하기 위한 표준화
1. 1E6 세포/웰 검정을 수행하기에 충분한 표적 세포를 수거하고, 5분동안 1200rpm로 Sorvall상에서 회전 침전 시킨후, PBS로 세척하고, 재회전시킨다.
2. 세포를 충분히 RPM1 + 2% FBS(2%)중에 0.2ml 분취량/웰 검정으로 취한다.
3. 세포를 24-웰 평저 플레이트내에 0.2ml/웰로 분배한다.
4. 2%중의 2oμM PMA 0.1ml을 (각각의 웰에) 가한다.
5. 2%중의 2mg/ml NBT 0.1ml를(각각의 웰에) 가한다.
6. 30분동안 37℃에서 플레이트 배양한다.
7. 세포 0.1ml을 즉시 제거하여 Shandon Cytospin을 사용하여 5분 동안 200rpm(저가속화)으로 회전 침전시킨다.
8. Dif-Quick 시스템으로 대비염색시키고, 계수를 위해 커버 슬립을 올려놓는다.
또한 상술한 바와 같이 효모 식작용 검정을 동일한 방법을 이용하여 두 세포 주 모두에 대해 수행한다.
[PMNS에 대한 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 에스터라제 염색]
[참조: Yam, et al., Am J. Clin. Path. 55:283(1971) 및 Li, et al., J. Histiochem. Cytochem. 21:1(1973)]
HL-60세포주를 염색하기 위한 표준화
1. Shandon Cytospin을 사용하여 5분동안 200rpm(저가속화)으로 현미경 슬라이드상에 1-5E5 세포를 회전 침전시킨다.
2. 실온(R.T.)에서 2분동안 시트레이트-아세톤-MeOH 고정물로 슬라이드를 고정시킨다.
3. 탈이온수로 세척하고, 20분동안 공기-건조시킨다.
4. 37℃의 암실에서 30분동안 AS-D 염색물로 슬라이드를 염색시킨다.
5. 탈이온수로 3회 세척한다.
6. 5분동안 산-헤마톡실린 염색으로 대비염색시킨다.
7. 탈이온수로 3회 세척하고, 공기 건조시킨후, 커버 슬립을 올려놓는다.
시트레이트-아세톤-MeOH 고정물:
시트레이트 농축액을 탈이온수로써 1:9로 희석시킨다. 시트레이트 용액 18ml, 아세톤 27ml, 및 무수 MeOH(메탄올) 5ml을 가한다. 실온에서 저장한다. 매일 제조한다.
AS-D 염색물:
트리즈말(Trizmal) 6.3을 탈이온수로 1:9로 희석시킨다. 희석된 트리즈말 6.3 50ml을 37℃로 가온시키고, Fast Corinth V염의 1 캡슐 함량을 일정하게 교반시키면서 가한다. 염이 완전히 용해된후, 나프톨 AS-D 클로로아세테이트 용액 2ml을 가한다. 이 용액은 즉시 혼탁해질 것이다. 15분 내지 30분동안 계속 교반시키고, 코플린 병(coplin jar)에 가한다. 여과시키지 않는다.
AS-D 용액:
디메틸 포름아미드 2ml 중에 나프톨 AS-D 클로로아세테이트(20mg)의 1캡슐을 용해시킨다. 사용전에 즉시 제조한다.
Sigma 키트 90-나프톨 AS-D 클로로아세테이트를 사용한다.
[대식구에 대한 알파 나프틸 아세테이트 에스터라제 염색]
[참조: Yam, et al., Am. J. Clin. Path. 55:283(1971) 및 Li, et al., J. Histiochem. Cytochem. 21:1(1973)]
U-937 세포주를 염색하기 위한 표준화
1. Shandon Cytospin을 사용하여 5분 동안 200rpm(저가속화)으로 현미경 슬라이드상에 1-5E5 세포를 회전 침전시킨다.
2. 실온에서 시트레이트-아세톤-MeOH 고정물로 30분간 슬라이드를 고정시킨다.
3. 증류수/탈이온수로 세척하고 20분동안 공기-건조 시킨다.
4. 암실에서 30분동안 37℃에서 NE 염색물로 슬라이드를 염색한다.
5. 증류수/탈이온수로 3회 세척한다.
6. 실온에서 5분동안 Mayer의 헤마톡실린으로 대비 염색시킨다.
7. 증류수/탈이온수로 세척하고, 공기 건조시킨후, 커버 슬립을 올려놓는다.
시트레이트-아세톤-MeOH 고정물:
증류수/탈이온수로 시트 레이트 농축물을 1:9로 희석시킨다. 시트레이트 용액 18ml, 아세톤 27ml 및 무수 MeOH 5ml을 가한다. 실온에서 저장한다. 매일 제조한다.
NE 염색물:
증류수/탈이온수중에 트리즈말 7.6(모노[트리스 (하이드록시메틸)아미노메탄]말레에이트; pH7.6)을 1:9로 희석 시킨다. 희석된 트리즈말 7.6을 37℃로 가온시키고, 일정하게 교반시키면서 Fast Blue RR 염(4-벤조일아민-2.5-디메톡시벤젠-디아조늄 클로라이드 헤미[염화아연]염)의 1캡슐 함량을 가한다. 염이 완전히 용해되면, NE 용액 2ml을 가한다. 이 용액은 황색이며 약간 혼탁해질 것이다. 15분 내지 20분동안 계속 교반시키고, 코플린병에 가한다. 여과시키지 않는다.
NE용액:
알파 나프틸 아세테이트 1캡슐(20mg)을 에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 2ml에 용해시킨다. 사용전에 즉시 제조한다.
Sigma 키트 90-알파 나프틸 아세테이트를 사용한다.
HL-60 세포 및 U-937 세포를 사용한 상기 공정으로부터의 결과가 하기 표 3 및 4에 나타나 있다.
a: 지정 농도의 IL-4 또는 DSMO를 함유하는 배지중에서 6일 동안 배양한 HL-60 세포, 3일째에 IL-4 또는 DMSO가 공급된 배양물.
b: 4개의 분리된 실험의 평균 ± SEM; 효모 평균치/세포=섭취된 효모 수/30개 세포
c: 식세포 % = 효모 섭취 세포수/전체 세포 x 100; 4개의 분리된 실험의 평균 ± SEM
d: 식작용 지수=효모 평균치/세포 x 식세포%
e: 100 세포당 NBT에 대해 양성인 세포의 %; 4개의 분리된 실험의 평균 ± SEM.
f: 100개의 세포당 클로로아세테이트 에스테라제 효소 활성에 대해 양성인 세포의 %; 4개의 실험의 평균
g: P0.05; 스튜던트 T 시험, 배지대 IL-4 처리되거나 DMSO 처리된 그룹
h: P≤d0.10; 스튜던트 T 시험, 배지대 IL-4 처리되거나 DMSO 처리된 그룹
a: 지정된 농도를 IL-4를 함유하는 배지중에서 6일동안 배양한 U937 세포. 3일째에 영양 공급된 배양물
b: 효모 평균치/세포=섭취된 효모수/30개 세포; 4개의 실험의 평균±SEM
c: 식세포%=효모섭취 세포수/전체 세포수 x 100; 4개의 실험의 평균±SEM
d: 식작용 지수=효모 평균치/세포 x 식세포%; 4개의 실험의 평균±SEM
e: 100개의 세포당 NBT에 대해 양성인 세포의 %; 4개의 실험의 평균±SEM
f: 100개의 세포당 NE 활성에 대해 양성인 세포의 %; 4개의 실험의 평균±SEM
g: P≤d0.05, 스튜던트 T 시험; 배지 대 IL-4 처리된 그룹.
h: P≤e0.10, 스튜던트 T 시험; 배지 대 IL-4 처리된 그룹.
[단구 및 호중구 표면 마커의 형광-활성화된 세포 선별기(FACS) 분석]
HL-60 및 U-937 세포를 T-75 플라스틱중 37℃에서 5% CO하에 IL-4(이.콜라이-유래된 재조합 사람 IL-4(rhuIL-4), 8-ILE-1002)를 증가시키면서 또는 대조군으로 배양한다: 세포를 나누고, 3일째에 영양을 보충한다. 1,3 및 6일만에 세포를 제거하여 RPM1 1640으로 세척한후, 사람의 열-응집된 IgG로 차단시켜 잠재적인 Fc 인터페론을 감소시킨다. RPM1 1640으로 재세척한후, 희석된 항체(하기표에서 모노클로날 항체 패널을 참조) 50㎕중에 재현탁시키고 얼음상에서 30분동안 배양한다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 희석된 FITC-접합된 염소-항-마우스 IgG 또는 IgG100㎕중에 재현탁시킨후, 얼음상에서 30분동안 배양한다. 제2항체의 배양후, 세포를 PBS 중에서 반복적으로 세척한 후, PBS ml 중에 재현탁시킨 다음, 세포 형광 계수 분석을 위해 Becton-Dickinson FACScan 상에서 작동시킨다. 쥐의 IgG및 IgG에 대한 동형 대조군 및 제2항체 대조군에 대해서도 상기 양성 세포에서 구성적 발현 수준 이상으로 증가(즉, 발현의 증진으로 인한 IL-4 유도)하는지에 대해 수행한다.
상기 FACS 분석에 의한 결과가 제3도 및 제도에 나타나 있다.
[사람 IL-4 발현 플라스미드 phdfrSRα263의 작제]
플라스미드 pSRα-CAT196, pcD137, pcDSRα205, pcDhIL-4 클론 125 및 pcD-SRα224의 작제 방법이 문헌[참조: Takebe et al., Moecular and Cellular Biology, 8:466-477(1988); and Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898(1986)]에 기술되어 있다. 제1도에 나타나있는 바와 같이, 플라스미드 pcD-SRα-205를 pSRα-CAT196으로부터의 373bp NcoI-XhoI SR 프로모터 단편; pcD137로부터의 434bp XhoI-SstI 스플라이스 연결부(splice junction: SJ) 및 쥐의 5' IL-L(mIL-4) 단편; 및 pcD137(쥐의 3' IL-4 cDNA, SV40 폴리아데닐화 영역, 및 복제원 및 암피실린 내성 유전자를 함유하는 pBR322 유도된 플라스미드 골격을 함유)로 부터의 3221 bp SstI-NcoI 단편의 삼분자 결합에 의해 작제한다. G-C 테일(tail)은 하기와 같이 pcD-hIL-4 클론 46으로부터 결실되어 있다[참조: Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898]. 오카야마-베르그 플라스미드 pL1[참조: Okayama and Berg, Molecular and Cellular Biology, 3:280-289(1983)]를 PstI으로 제한분해하고, 4개의 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)를 T4 폴리머라제의 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성으로 제거한다. Bg1II링커를 평활 DNA 말단에 결합시키고, Bg1II 및 HindIII로 제한분해한다. pL1의 SV40 서열을 함유하는 HindIII/Bg1II 단편을 분리하고, Bg1II/Hind III 제한 pcD-MCGF[참조: Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1070-1074(1984)]내에 삽입시켜 중간체 플라스미드 101을 수득한다. 플라스미드 pcD-hIL-4 클론 46으로부터 정제된 311bp Pst 단편을 Sau3A-1으로 제한분해하여 Bg1II와 상응하는 돌출부를 갖는 163bp 단편을 방출시킨다. 162bp 단편을 Bg1II 제한분해된 p101에 결합시켜 중간체 112을 수득한다. SV40 및 제한 IL cDNA를 함유하는 p112의 HindIII/NheI 단편을 HindIII/NheI 제한분해된 클론 46 DNA에 연결시켜 SV40 초기 프로모터, SV40 스플라이스 연결부, 및 G-C 테일이 결실되어 있는 완전한 사람 IL-4 cDNA를 함유하는 pcD-hIL-4 클론 125를 생성한다. 플라스미드 pcD-Srα224는 pcDSRα205(SJ 및 mIL4 cDNA 함유)의 XhoI 소단편을 상술된 바와 같이 G-C 테일이 결실 되어 있는 SJ 및 HIL-4 cDNA를 함유하는 pcDhIL-4 클론 125의 XhoI 소단편으로 대체시켜 작제한다.
SalI부위를 제1도에 나타난 바와 같이 EcoRI/BamHI 제한분해, 돌출부의 클레노우 폴리머라제 충진 및 옥타뉴클레오타이드 SalI 링커에의 연결로 pMTVdhfr[참조: Lee et al., Nature, 294:228-232(1981)]내에 도입한다. 이때, 플라스미드 pMTVdhfr259는 EcoRI 및 BamHI에 대한 제한 부위가 결여되어 있으며, 둘 사이의 영역은 SalI 링커로 대체된다. Sr α 프로모터, SV40 SJ, 사람 IL-4 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 pcD-SRα 224의 SalI 단편을 pMTVdhfr259의 유일한 SalI 부위내에 삽입시킨다. 최종의 사람 IL-4 발현 플라스미드, pdhfr-SRα 263은 SalI 부위로부터 반시계 방향으로 하기 성분을 함유한다:
1. pBR322의 암피실린 내성 유전자 및 복제원
2. pMTVdhfr로부터의 MMTV LTR 유도된 dhfr 발현 단위
3. SRα 프로모터
4. SV40 유도된 스플라이스 연결부
5. 사람 IL-4 cDNA
6. SV40 유도된 폴리아데닐화 시그날
이 벡터중에 존재하는 사람 IL-4 cDNA 서열은 문헌[참조: Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894-5898(1986)]에 나타난 pcD-HIL-4 클론 46에서와 동일하다.
[DHFR 유전자 증폭 및 IL-4 SI 주의 선별]
디하이드로폴레이트 환원 효소 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 세포 돌연변이체(CHO-dhfr )는 다양한 재조합 단백질의 과다 생성에 널리 사용된다[참조: Kaufman et al., Molecular and Cellular Biology, 5:1750-1759(1985)]. CHO-dhfr 돌연변이체 세포는 하이코프산틴, 티미딘 및 글리신에 대한 영양 요구성이다. dhfr 마커를 삽입시킨 발현 벡터는 이러한 돌연변이를 보완하는데 사용될 수 있다; 선별은 상술된 요구 배지 보조인자의 부재하에서 세포를 성장시켜 달성한다. 유전자 증폭(1000배 이하로 복제수를 증가시킴)은 세포를 폴레이트 동족체 메토트렉세이트(MTX)의 증가된 농도에서 성장시켜 달성할 수 있다. 게놈중에 통합된 재조합 dhfr 위치의 증폭으로 관심의 대상인 유전자에 대한 발현 단위의 복제수가 동시에 증가된다[참조: Ringhold et al., J. Mol. Applied Genetics, 1:165-175(1981); and Kaufman et al., EMBO J., 6:187-193(1987)].
dhfr 및 사람 IL-4의 암호화 서열을 갖는 플라스미드 DNA(pdhfr-SRα 263)은 상술한 바와 같이 작제한다. DXB-II CHO-dhgr 세포주에 pdhfr-SRα 263의 형질감염은 인산칼슘 침전법[참조: Graham and Van der Eb, Virology, 52:546 (1978)]으로 수행한다. 형질 전환체는 하이포크산틴 및 티미딘이 결여된 선택 배지(DMEM, Dulbecco 변형된 Eagle 배지)중에서 선별한다. 지정된 클론 3B12는 증폭의 제1사이클을 위해 선택된다. 3B12 클론을 내성 클론이 선별될 때까지 40nM MTX를 함유하는 α-MEM 배지(Eagle의 최소 필수 배지)중에서 배양한다. 지정된 클론 3B12-A26은 1㎛ MTX로 더욱 증폭시키기 위해 사용한다. 약물 선별의 제2주기후, 지정된 클론 3B12-A26-19를 더욱 전개시키기 위해 선택한다. 이 클론은 10% NU Serum V를 사용하여 현탁 방식으로의 성장에 적용하고, 지정된 아클론 IL-4-SI은 대규모적 증식을 위해 선택한다.
[배양물 제조]
Master Cell Bank(MCB)를 제조하기 위하여, IL-4 SI 세포를 함유하는 2개의 원래의 100ml 짜리 스피너(spinner) 플라스크를 사용한다. 세포는 성장 배지를 추가로 2회 교환 시킨 다음, 100ml 짜리 스피너 플라스크중에서 성장시킨다[성장 배지는 기본 배지와 0 내지 10% 혈청이 혼합된 것이다(예: NU Serum V)]. 각각의 플라스크로부터의 세포를 수집하고, 세척한 후, 동결 배지 10ml중에 재현탁시키고, 혼합시킨후, 약 2.0ml 멸균 세포 저장 바이알에 무균적으로 분배시킨다[동결 배지는 기본 배지와 20% 혈청이 혼합된 것이다(예: NU Serum V +10% 디메틸설폭사이드)]. 바이알을 -70℃에서 서서히 동결시키고, 액체 질소중에 저장한다.
3개의 동결된 바이알로부터의 세포를 해동시키고, 100ml에서 3ℓ까지 증가되는 용적의 스피너 플라스크중에서 4 내지 6세대 동안 성장 배지중에서 현탁식으로 증식시킨다. 세포를 원심 분리시켜 수집하고, 세척한후, 동결 배지중에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 약 2.0ml 멸균 세포 저장 바이알 중에 무균적으로 분배시킨다. 이 바이알을 -70℃에서 서서히 동결시키고, 액체 질소중에 저장하여 Master Cell Bank(MCB)를 구성한다.
Master Working Cell Bank(MWCB)을, 1 내지 3 바이알의 MCB를 해동시키고 3ℓ까지 증가되는 용적으로 4 내지 6세대 동안 T-플라스크중에서 현탁식으로 세포 증식시켜 MCB로부터 제조한다. 세포를 수집하고, 세척한후, 동결 배지중에 재현탁시키고, MCB에 대해 상술한 바와 같이 분취량으로 취하고 동결시킨다. MWCB를 또한 액체 질소중에서 저장한다.
IL-4를 50 내지 200ℓ 용적의 생물학적 반응기중에서 생성한다. 생성을 개시하기 위하여, MWCB 로부터의 1개의 동결된 바이알을 해동시키고, T-75 플라스크내에 접종시킨다. 세포 농도가 100% 유착 될 때까지 배양한후, 세포에 트립신 처리하고, 2개의 T-75 플라스크내에 접종시킨다(임의로, T-160 플라스크를 사용할 수 있다). 이들 플라스크를 100% 유착이 될 때까지 재배양하고, 트립신 처리된 세포를 사용하여 100ml 스피너 플라스크에 접종한다.
100ml짜리 스피너 플라스크를 세포 성장이 적절히 이루어질 때까지 배양하고, 이를 250ml짜리 스피너 플라스크용 접종물로서 사용한다. 유사한 단계를 1ℓ 및 3ℓ 플라스크 및 10 내지 20ℓ 생물학적 반응기내에서 반복한다. 10 내지 20ℓ짜리 생물학적 반응기로부터의 세포를 50 내지 100ℓ짜리 반응기용 접종물로서 사용한다. 이 반응기는 처음에는 배치식으로 배양하고, 세포 농도가 적절하게 달성될 때, 연속 배지 환류(perfusion)를 개시한다.
배양 및 연속 환류에 사용되는 배지는 10% 까지 보충될 수 있는 변형된 Iscove 배지(예: NU Serum V)이다. 생산 과정 전체 동안 메토트렉세이트는 사용되지 않는다.
발효 단계는 밀폐된 시스템내에서 멸균 조건하에 수행한다. 주요 발효 변수(예: 온도, pH, 교반, 및 통기)는 성장 단계 및 연속적 환류 단계 동안 모니터링하면서 적절히 조절한다. 무균 샘플을 주기적으로 취하여 pH 및 세포 밀도를 측정하고, 멸균(세균 및 진균의 부재) 상태를 점검한다.
조건이 조절된 배지(환류액) 적절한 용량을 수거한 후, 브로쓰를 여과하여 존재할 수도 있는 어떠한 세포도 제거시키고, 한외 여과로 농축시킨다. 조 CHO IL-4를 함유하는 농축물을 최종 정제 단계로 진행시킨다.
조 CHO IL-4 농축물로부터 IL-4의 정제는 설포네이트컬럼(예: S-Sepharose)상에서 양이온 교환 크로마토그래피로 수행한다. 이 단계를 통상 반복한다. 이어서 설포네이트 컬럼으로부터의 선별된 혼합 분획을 킬레이트 크로마토그래피(예: 코발트-킬레이트 세파로즈)한다. 선별된 혼합 킬레이트 분획을 막 여과로 투석 여과하여 농축시킨다. 농축물은 겔 여과 컬럼(예: HR S-200)상에서 크로마토그래피한다. 정제된 다량의 IL-4를 구성하는 혼합 분획을 여과시키고, -20℃ 이하에서 저장한다.
이러한 활성인 재조합 사람 IL-4의 조 CHO-IL 농축물을 정제하는 방법은 하기단계를 포함한다:
(a) CHO-세포 배양 배지로부터 활성 IL-4의 완충된 조 용액을 약 중성 내지 약 알카리성 pH에서 양이온 교환 크로마토그래피하여 IL-4를 선별적으로 결합시키고, IL-4를 등용매적으로 용출시키는 단계;
(b) 단계(a)로부터의 용출물을 대략 중성 내지 약 알카리성 pH의 비교적 작은 컬럼[단계(a)의 베드 용적의 15%]상에서 추가로 양이온 교환 크로마토그래피하고, IL-4를 구배 용출시키는 단계;
(c) 단계(b)로부터의 용출물을 약 중성 내지 약 알카리성 pH의 킬레이트화 아가로즈 겔 컬럼 시스템상에서 친화성 크로마토그래피한 다음, IL-4를 산성 완충액으로 용출시키는 단계;
(d) 단계(c)로부터의 용출물을 한외여과막(10,000 분자량 차단)으로 농축시키는 단계;
(e) 단계(d)로부터의 활성 IL-4의 농축된 용액을 산성 pH의 크기 배제 컬럼상에서 겔 여과 크로마토그래피하여 정제된 IL-4용액을 수거하는 단계.
CHO-세포 배양 배지를 여과시켜 외인성 거대 세포 파편을 제거시킨후, 양이온 교환 크로마토그래피를 2단계로 수행한 다음, 투석 여과막상에서 100mg/mL이하의 농도로 단백질을 농축시킨 후, pH를 7.1 내지 7.3, 바람직하게는 7.2로 조절한다. 막은 바람직하게는 교반된 세포가 고정된 10,000MW 이상의 모든 물질을 보유하는 막[예: YM-10 막(Amicon Co., U.S.A.), 또는 Pellicon 필터 PTGC Cassettes(Millipore Corp., Bradford, Mass.)]이다. 제1단계에서는, 조 배양 배지를, 약 중성 내지 약 알카리성 pH, 즉, pH 6.7 내지 8, 바람직하게는 7.2의 0.12M 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액으로 미리 평형화시킨 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼[예: S-SepharoseFast Flow(100mg 이하 단백질/ml 수지)]상에 충전시킨다. 이 결과 컬럼상에는 활성 IL-4가 남고 대부분의 목적하지 않는 단백질 및 기타 불순물은 완전히 세척된다. 이어서 활성 IL-4를 20mM 인산나트륨 및 약 0.26M 염화나트륨을 함유하는 인산나트륨 완충액, 바람직하게는 pH가 7.1 내지 7.3, 더욱 바람직하게는 pH가 7.2인 완충액으로 컬럼으로부터 등용매적으로 용출시킨다. SDS-PAGE 및 단백질 검정으로 측정하여 활성 IL-4를 함유하는 분획을 혼합시키고, 이를 pH 7.2 및 14mS로 조절한다.
제2단계에서는, 제1단계로부터의 조절된 혼합물을 베드 용적이 제1단계에서 사용된 양이온 교환 컬럼의 약 15%이고 인산염 완충액으로 평형화시킨 비교적 작은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼상에 충전시켜 불순물을 완전히 세척하여, 활성 IL-4가 컬럼상에 남도록한다. 활성 IL-4를 베드 용적당 1.75mS로 구배된 염화나트륨으로 용출시킨다. 용출 완충액은 저염 완충액, 즉 0.12mM 염화나트륨을 함유하는 pH7.2의 20mM 인산나트륨 및 고염 완충액, 즉 0.50M 염화나트륨을 함유하는 pH7.2의 20mM 인산나트륨으로 구성된다. SDS-PAGE 및 단백질 검정으로 측정한 것으로서 활성 IL-4를 함유하는 구배 분획을 수집하여 pH7.2 및 45내지 50mS로 조절한다.
이어서 순도가 약 60 내지 70%인 양이온 교환 크로마토그래피로부터의 활성IL-4 분획의 수집물을 금속 처리된 킬레이트화-Sepharose겔로 제조된 금속 킬레이트화 아가로즈 겔 컬럼(예: Chelating-SepharoseFast Flow 또는 Chelating-Sepharose6B)상에서 친화성 크로마토그래피한다. 킬레이트화 컬럼은 단일 컬럼내에 2개의 부분을 포함한다. 컬럼의 상단부는 금속 처리된-킬레이트화 아가로즈 겔, 바람직하게는 코발트 처리된-킬레이트화 SepharoseFast Flow 겔을 포함하고, 컬럼의 하부는 처리되지 않은 킬레이트화-SepharoseFast Flow 겔이다. 상기 2개 층의 용적비는 약 2.3 내지 3.0 용적의 코발트 처리된-킬레이트화 Sepharose대 1용적의 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose이다. 양이온 교환 처리로부터의 정제된 IL-4의 수집물을 컬럼의 상단에 충전시키는 경우, 유동 용액은 컬럼의 하부(여기에서는 잔류하는 불순물을 함유하는 유동물이 존재한다)로 통과한다.
바람직하게는 약 0.5M의 염화나트륨을 함유하는 거의 중성, 바람직하게는 pH7.2의 완충액을 사용하여, 활성 IL-4 분자를 금속 킬레이트화-아가로즈 겔 컬럼, 바람직하게는 킬레이트화 SepharoseFast Flow 또는 Sepharose6B에 친화성 크로마토그래피로써 선별적으로 결합시켜 용액중에 존재하는 오염 단백질을 실질적으로 배제시킨다. 활성 IL-4는 컬럼 상에 잔류하며, 이를 0.5M NaCl을 함유하는 약산 pH, 바람직하게는 pH 6.0의 완충액으로 등용매적으로 용출시킨다.
친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터의 활성 IL-4의 정제된 용액을 한외여과막(10,000MW 차단), 바람직하게는 분자량이 10,000 이상인 IL-4를 포함하는 범위의 모든 물질을 보유하는 막에 고정된 교반된 세포상에서 농축시킨다. 바람직한 막은 YM-10(Amicon Co., USA제조원)이다. 수득된 농도는 20mg/ml 이하이다. 2개의 투석여과 완충액, 먼저 0.5M 염화 나트륨을 함유한 20mM 인산나트륨 완충액(pH6.0) 및 바람직하게는 10mM 시트르산나트륨을 함유하는 제2완충액(pH4.5)을 사용한다.
활성 IL-4의 농축된 용출물을 용액중의 단백질을 분자량에 따라 분획화시키는 크기 배제 겔 여과 컬럼에 충전시킨다. 적합한 대표적인 컬럼은 SephacrylS-200 HR 또는 S-100 HR(Pharmacil 제조원 겔 여과 컬럼이다. SephacryS-200 HR(고분해) 및 S-100 HR은 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌 비스 아크릴아미드의 가교 결합된 공중합체이다. 이들의 분획화 범위는 각각 5,000 내지 250,000달톤 및 1,000 내지 100,000달톤 이다. 기타의 적합한 물질은 가교결합된 덱스트란 겔인 Sephadexes(Pharmacia 제조원)이다. 바람직하게는, 활성 IL-4의 용액을 미리 10mM 시트레이트 완충액(pH4.5)으로 평형화시킨 S-200 HR 컬럼에 충전시킨다.
보다 바람직한 배양은 하기 단계를 포함한다: (a) CHO-세포 배양 배지로부터의 활성 재조합 사람 IL-4의 조 완충 용액을 0.12M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH6.7 내지 8, 바람직하게는 pH7.2, 13 내지 15mS, 바람직하게는 45mS)중에서 가교결합된 아가로즈 컬럼(바람직하게는 S-SepharoseRFast Flow)상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시킨 다음 컬럼으로부터 활성 IL-4를 0.26M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH7.1 내지 7.3, 바람직하게는 pH7.2)으로 등용매적으로 용출시켜 활성 IL-4 분획을 수거하는 단계;
(b) 단계(a)로부터 IL-4 용액을 0.12M 염화나트륨을 함유하는 완충액(pH7.2 내지 7.5, 바람직하게는 7.2)중 단계(a)에서 사용된 동일한 유형의 가교결합된 아가로즈 컬럼[단, 이것은 단계(a)에서 사용된 컬럼에 대해 15%의 베드 용적을 갖는다]상에서 추가의 양이온 교환 크로마토그래피에 적용시킨 후, 0.12M 내지 0.50M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH7.2)으로 구배 용출시켜 활성 IL-4를 함유하는 분획을 수집하는 단계,
(c) 단계(b)로부터의 활성 IL-4의 수집된 분획(pH7.2)을 0.5M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH7.2)을 사용하여, 금속 킬레이트화 아가로즈겔 컬럼(바람직하게는 코발트-킬레이트화 SepharoseFast Flow 또는 6B 겔의 상부 및 처리되지 않은 길레이트화 SepharoseFast Flow 겔의 하부로 구성되며, 코발트-처리된 킬레이트화 Sepharose대 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose의 용적비는 약2.3 내지 3.0 용적 대 1용적이다)상에서 친화성 크로마토그래피에 적용시킨 다음, 평형화 완충액으로 세척한 후, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH6.0)으로 활성 IL-4를 용출시키며, 이어서 IL-4 분획을 수거하는 단계; 및
(d) 단계(c)로부터의 IL-4 분획(수집된 분획)을 한외여과막(분자량이 10,000이상인 모든 물질을 보유하는, 바람직하게는 교반된 세포가 고정된 YM-10과 같은 막)상에서 20mg/ml(pH4.5)이하로 농축 및 투석여과시킨 다음, 활성 IL-4 농축물을 10mM 시트르산나트륨 완충액(pH4.5)중에서 알릴덱스트란 및 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드와의 가교결합 공중합체상에서 분자량에 따라 용액중의 단백질을 분획화시키는 컬럼, 바람직하게는 SephacryS-200 HR 상에서 크기 배제(겔 여과) 크로마토그래피에 적용시킨 후, 활성 IL-4 분획을 수거하는 단계.
단계(a) 및 (b)에서, 분획물의 pH를 7.2로 조절하고 4M NaCl로 13 내지 15mS의 전도율을 갖도록 조절한다. 2개의 양이온 교환 컬럼의 베드 용적비는 단계(a)의 S-Sepharose컬럼의 경우 약 6.3용적이고 단계(b)의 양이온 교환 컬럼의 경우 약1용적이다. 크로마토그래피 컬럼중의 양이온 교환 겔 물질은 0.12M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH7.2)으로 평형화시킨다. 바람직한 양이온 교환기는 -CH2-SO3 -Na+그룹으로 치환된 가교결합된 아가로즈[예: S-SepharoseFast Flow(Pharmacia 제조원)]이다. 단계(a)에서 활성 IL-4를 0.26M NaCl을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH7.2)로 등용매적으로 용출시킨다. SDS-PAGE 및 단백질 검정에 기초하여 농도가 가장 높은 활성 IL-4를 갖는 분획을 수집한다. 수집된 분획용액의 pH를 7.2로 조절하고, 전도율을 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.2)으로써 베드 용적당 13 내지 15mS로 조절한다. 이어서 컬럼에 IL-4 용액을 충전시키고, 0.12 내지 0.50M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH7.2)으로 1.75mS 구배를 사용하여 구배 용출시킨다. SDS-PAGE 및 단백질 검정에 의해 측정하여 수거된 IL-4 함유 분획을 수집한다. 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위한 조건을 선택하여 활성 IL-4 분획이 양이온 교환 매트릭스에 부착되도록 한다. 양이온 교환 크로마토그래피에 대해서 비교적 높은 약 중성의 pH7.2 및 양이온 교환 크로마토그래피에 대해서 비교적 높은 13 내지 15mS에 의해 대부분의 불순물이 컬럼에 결합하지 않는 온화한 결합조건이 생성되며, 용출이 비교적 용이하게 되고, 고순도의 활성 IL-4 용액(즉, 약 60% 내지 70%)이 수득된다.
킬레이트화 Sepharose6B 또한 만족스럽다해도 단계(c)에 사용되는 바람직한 금속 킬레이트화-아가로즈는 킬레이트화 SepharoseFast Flow이다. Sepha rose는 Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey 소재)사의 제품이다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 코발트 킬레이트화 Sepharose컬럼을 제조하는 바람직한 방법은 Sepharose겔을 0.02M 코발트 아세테이트 용액 중에 현탁시키고, 탈이온수, 이어서 평형화 완충액, 즉 0.5M NaCl 용액을 함유하는 20mM 인산나트륨(pH7.2)을 컬럼에 통과시켜 세척하는 것이다. 코발트 아세테이트 대신, 다른 코발트염(예: 염화코발트 또는 황산 코발트)을 사용할 수 있다.
크로마토그래피 컬럼은 2개의 층을 포함하는 하나의 컬럼(제1또는 상부층은 금속 킬레이트화 Sepharose겔을 함유하고 제2또는 하부층은 금속염으로 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose겔을 함유한다)을 포함한다. 이중 컬럼에서의 용적비는 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose1용적에 대해 금속 처리된 킬레이트화 Sepha rose이 약2.3 내지 3.0 용적이다. 바람직한 금속은 코발트이다.
컬럼을 평형화시키는데 사용되는 바람직한 완충액은 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH7.2 내지 7.5)이다.
단계(c)에서 코발트 킬레이트화-Sepharose및 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose 겔은 0.5M 염화 나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH7.2)으로 평형화시킨 다음, 흡수된 활성 IL-4를 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산염 완충액(pH6.0) 또는 달리는 0.5M NaCl 및 (i) 킬레이트화제[예: 50mM EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산)], 또는 (ii) 히스티딘의 동족체(예: 50mM 이미다졸), 또는 (iii) 아미노산(예: 50mM 히스티딘)을 함유하는 중성 pH의 완충액으로 처리되지 않은 킬레이트화-Sepharose을 통해 코발트 킬레이트화-Sepharose로부터 등용매적으로 용출시킨다. 0.5M NaCl을 함유하는 인산염 완충액(pH6.0)이 바람직하다. 활성 IL-4를 함유하는 용출물을 수거한다. 통상의 SDS-PAGE 및 단백질 검정에 기초하여 활성 IL-4의 농도가 최고인 분획물을 수집한다.
단계(d)에서는, 단계(c)로부터 혼합된 용출 분획을 농축 및 투석 여과시킨 다음, 겔 여과 크로마토그래피에 적용시킨다. 용출된 분획을 분자량이 10,000 이상인 물질을 보유하는 막이 결합되어 있는 교반된 세포상에서 농축시키고, 먼저 0.05M EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산) 및 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 인산나트륨 완충액(pH6.0)에 이어서 0.01M 시트르산나트륨(pH4.5)에 대해 투석여과시킨다. 이 공정 단계에서 활성 IL-4 용액의 순도는 약 90 내지 95%가 되며, 이는 막의 상부에 보유된 농축 용액중에 존재한다. 바람직한 막은 YM-10(Amicon Co., U.S.A. 제조원)이다. 수득된 활성 IL-4의 농도는 약 20mg/ml 이하이다. 활성 IL-4의 농축된 용출물을 분자량에 따라 용액중의 단백질을 분획회시키는 크기 배제(겔 여과)컬럼에 충전시킨다. 적합한 대표적인 컬럼은 SephacrylS-200 HR 또는 S-100 HR(Pharmacia)겔 여과 컬럼이다. SephacrylS-200 HR (고분해) 및 S-100 HR은 알릴덱스트란 및 N,N'-메틸렌 비스 아크릴아미드의 가교결합된 공중합체 이다. 이들의 분획화 범위는 각각 5,000 내지 250,000 및 1,000 내지 100,000이다. 기타의 적합한 물질은 덱스트란 겔이 가교 결합된 Sephadexes(Pharmacia 제조원)이다. 바람직하게는 활성 IL-4의 용액을 미리 10mM 시트르산나트륨 완충액(pH4.5)로 평형화시킨 S-200 HR 컬럼에 충전시킨다. 단계(d)의 조건하에서, 안정한 IL-4 농축물은 20mg/ml 이하로 될 수 있다. 이는 겔 여과 크로마토그래피의 용량과 수행능을 증가시킨다. SDS-PAGE 및 단백질을 검정으로 측정시 농도가 최고인 활성 IL-4를 함유하는 용출물의 분획을 수거하여 수집함으로써 순도가 95 내지 99%인 활성 IL-4용액이 수득된다.
상기 참조문은 hIL-4에 대한 CHO 발현 시스템의 작제에 사용되는 물질 및 방법에 관한 관련 교시를 위해 본원에서 참조로 인용되었다.
[이.콜라이-유래된 사람 IL-4의 작제 및 특징화]
A. 사람 IL-4 발현 플라스미드 pRGT857-11의 작제
사람 IL-4 발현 플라스미드, pAH3, pKGT269-2 및 pUC19의 작제방법은 이미 기술되어왔다[참조: Lundell et al., J. Ind. Microbiology, 1989 and Yanisch-Perron et al., Gene, 33: 103-119, 1985]. pRGT857-11을 작제하기 위해서, pAH3을 제한 엔도뉴클레아제 Aval으로 분해한다. 이 효소에 의해 생성된 5' 돌출부를 이.콜라이 Pol I의 클레노우 단편으로 충진시키고, 이 DNA를 PvuI으로 분해한다. IL-4 및 laci 영역을 갖는 5.8 KB 단편을 pUC 복제원을 갖는 pUC 19의 1.4 KB PvuII-PVuI단편에 연결시킨다. 이.콜라이 294를 형질전환시킨 후, pUC 복제원을 갖는 암피실린 내성 IL-4 발현 플라스미드 중의 하나가 제2도에 나타난 pRGT839-2이다.
pRGT839-2 및 pKGT269-2 모두를 AtaII 및 PvuI으로 분해시킨다. IL-4 및 laci 영역을 갖는 pRGT839-2의 6.7KB 단편을 클로람페니콜 내성 유전자를 암호화하는, pKGT269-2로 부터의 1KB 소단편에 연결시킨다. 연결 반응물을 사용하여, 이.콜라이 294를 형질전환시킨다. 생성되는 형질전환체 중의 하나가 pRGT857-11 이다. 제2도에 나타난 바와 같이, 이 IL-4 발현 플라스미드는 클로람페니콜 내성 유전자 및 pUC의 복제원을 지닌다. 이어서 플라스미드를 이.콜라이 RL7321을 형질 전환시키는데 사용한다.
B. 숙주 세균
사람 IL-4의 생성에 사용되는, 플라스미드 pRGT857-11을 지니는 숙주 균주는 이.콜라이 K-12이다. 이 균주는 이미 기술된 이.콜라이 MM294의 유도체인 이.콜라이 RL7321이다[참조: Bolivar et al., Methods in Enzymology, Vol. 68, 245-267(Ray Wu, ed.), Academic Press, 1979]. 이 균주는 EK1 숙주에 대해 확립된 지침과 일치한다. 이.콜라이 RL7321은 하기와 같이 이.콜라이 MM294로부터 분리한다:
먼저, 이.콜라이 MM294 균주를 이.콜라이 PAM163 [참조: Johnson, B.F. 1977. Fine Structure mapping and properties of mutations suppressing the ion mutation in Escherichia coli K-12 and B strains. Genet. Res., 30: 273-86]상에서 생장시킨 박테리오파지 P1 cml, clr100[참조: Miller, J.H., 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y]으로 형질도입시켜 이.콜라이 294S로 지칭되는 이.콜라이 MM294의 스트렙토 마이신 내성 형태를 분리한다.
이.콜라이 294S를 자외선으로 돌연변이유발시켜 외막 구조에 결함이 있는 균주를 분리한다. 세포에 UV 램프를 사용하여 40초 동안 조사한다. 이 처리에 의해 99.9%의 세포가 사멸되고 강화 배지 상에 도말시켜 측정한다. 돌연변이 유발된 세포 현탁액을 희석시키고, 암실에서 진탕시키면서 3시간 동안 37℃로 배양한다.
이때, T7 야생형 박테리오파지를 108개의 플라크 형성단위/ml로 가한다. 박테리오파지 T7는 외막이 돌연변이된 세균을 풍부하게 하기 위한 선별물로서 사용된다. T7 수용체는 지다당류, 외막 단백질상에 위치하므로, 얼마간의 외막 돌연변이체는 T7 감염에 내성을 나타내게 된다. 야생형 외막을 갖는 세포는 감염에 민감하므로 죽는다. 후술되는 리키(leaky)표현형은 외막의 증가된 투과성에 기인한다. 외막 손상의 신호로서 박테리오파지 T7 내성 균주의 사용은 이미 알려져 있다[참조: Branes et al., J. of Bacteriology, 154; 1462-1466, 1983].
T7 감염후, 세포가 용해될 때까지 진탕시킨 플라스크를 관측한다(대략 30분). T7 내성 세포를 원심분리로 수집하고 1ml의 신선한 육즙중에 재현탁시킨다. 이들 세포를 TYE (트립톤 : 효모 추출물 : 염화나트륨 ⓐ 20:10:5) 한천 평판상에 도말 하고 밤새 37℃에서 배양한다. 24시간 후, 각각의 평판은 30 내지 50개의 콜로니를 포함한다. 이들 콜로니들은 외막이 손상되어 있다. 하나의 방법은 배지로의 RNase I 누출이 증가하는 것을 관측하는 것이다. T7 박테리오파지 내성 클론의 단일 콜로니를 1% 효모 RNA(Sigma Corp. 제조원)를 함유하는 TYE 한천(pH 7) 4ml로 덮인 신선한 TYE 한천평판상에 스트레킹한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 평판을 1N HCI로 잠기게 한다. 할로 사이즈(Halo size)를 사용하여 배지로 RNase 활성을 누출시키는 균주를 측정한다[참조: Weigand, R.A. and Rothfield. J. of Bacteriology, 125: 340-345, 1976]. 이.콜라이에서 외막 손상의 두 번째 신호는 MacConkey 한천상에서 성장할 수 없다는 것이다[참조: Hancock, R.E.W., Ann. Rev. Microbiol. 38: 237-94, 1984]. MacConkey 한천상에서 특히 민감한 것으로 나타나고 상당량의 주변세포질성 RNase I을 방출시킬 수 있는 30개의 T7-내성 콜리니중 하나를 RL7로 지정하였다.
이.콜라이 RL7을 huIL4 발현 벡터 pAH3(제1도)으로 형질전환시킨다. 이 벡터는 내부 세포 막을 통해 세포질내로 림포카인을 방출시킨다. 형질전환체로부터의 소모된 배지를 후술하는 huIL-4 폴리클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석으로 누출에 대해 스크리닝한다. RL7/pHA3을 상기와 같이 UV 광으로 돌연변이유발 시킨다. 암실에서 2시간 이상 동안 생장시킨 후, 조사된 세포를 암피실린(100㎍/ml)이 보충된 TYE 한천 평판 상에 도말시키고, 30℃에서 밤새 배양한다. 콜로니를 돌연변이체 콜로니하에 보다 짙은 색을 전개시키는 것에 의해 제시되는 것으로서 huIL4의 증가된 방출에 대한 이중 디스크 검정으로 스크리닝한다. 이중 디스크 검정은 하기와 같이 수행한다:
돌연변이유발된 세포를 희석시키고 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 TYE 한천 평판(142mm 직경)상에 확산시킨다. 30℃에서 밤새 배양한 후, 평판에는 직경이 약 1mm인 500 내지 2000개의 콜로니가 존재한다. 이어서 평판에 공극 크기가 0.45μ인 137mm의 니트로셀룰로즈 디스크(Scheleicher and Schuell 제조원)를 덮는다. 디스크를 한쪽 가장자리부터 완만히 작용시켜 단계적이고 균일하게 습윤시킨다. 디스크를 즉시 한번의 동작으로 뒤집어 콜로니를 한천 평판으로부터 니트로셀룰로즈 디스크로 옮긴다. 이 디스크는 미리 멸균된 한천 평판의 표면상에 놓인 니트로 셀룰로즈 디스크(디스크들)이다. 이어서 평판을 30℃에서 밤새 배양한다. 배양한 후, 디스크(디스크들) 바닥을 콜로니 함유 디스크로부터 분리시킨다. 필터를 60분동안 실온에서 1% BSA(소 혈청 알부민)를 함유하는 10mM 트리스(pH 8), 150mM NaCl 및 0.05% (v/v) Tween-20(Bio Rad, Enzyme Immuno Assay Purity 제조원) (TBST)중에서 배양한다. 이어서 필터를 30분 동안 실온에서 래빗 폴리클로날 항혈청(TBST/BSA 중의 1:1500 희석물; 전체 huIL-4의 측정에 사용됨) 또는 모노클로날 항혈청(11B4)(TBST/BSA 중의 하이브리도마 배양 상등액의 1:10 희석물; 천연 구조의 단백질을 측정하는데 사용 됨)과 함께 배양한다. 필터를 TBST로 3회 세척한 후, 30분 동안 적절한 알칼린 포스파타제-연결된 제2항체와 배양한다. 필터를 3회 세척하고 알칼린 포스파타제 기질(Progmega Biotec에 의한 ProtoBlot System)로 염색한다. 이어서 블롯을 스톡(stock) 평판과 정렬시키고, huIL4 특이적 염색이 증가된 콜로니를 선별한다.
의심되는 콜로니는 비-선택적 배지중에 연속해서 이전시킨 후 비-선택적 TYE 평판상에 스트리킹시켜 플라스미드를 구제한다. 암피실린 평판상에서의 생장에 있어 음성인 것으로 기록된 콜로니의 플라스미드 부재에 대해 검사한 후, 사람 IL-4 발현 플라스미드, pRGT857-11로 재형질전환시킨다. 이들 클론은 10ml 짜라 튜브 발효기로부터의 모든 브로쓰를 도트 면역-블로팅(dot immuno-blotting)함으로써 huIL-4 방출의 증가에 대해 스크리닝한다. 사람 IL-4(11B4)에 대한 모노클로날에 이어서 알칼린 포스파타제 결합된 염소 항-래트 IgG에 의해 검측한다. 고생성 균주로 선별된 균주 하나를 RL731로 지칭한다.
이.콜라이 RL731/pRGT857-11을 상기와 같이 UV 광으로 돌연변이시킨다. 암실에서 적절히 생장시킨 후, 세포를 항생제 및 1mM IPTG(이소프로필 β-D 티오갈락토사이드)가 보충된 TYE 한천상에 도말한다. RL731/pRGT857-11은 유도물질인 1PTG의 존재하에서 생장하지 않는다. 세포를 ml당 104콜로니 형성 단위의 밀도로 도말한다. 밤새 배양시 평판당 약 5 내지 10개의 콜로니가 생성된다. 75개 이상의 콜로니를 스트리킹에 의해 정제하고 huIL-4 생성에 대해 검사한다. 생성 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정한다. 가장 두꺼운 밴드를 나타내는 클론은, 상기와 같이 이들의 플라스미드를 구제하고, pRGT857-11로 재형질전환시킨 후, huIL-4의 고생성의 유지에 대해 검사한다. 생물학적으로 활성인 huIL-4의 생성 및 누출을 포함하는 가장 만족스러운 특성으로 균주를 선별하고 huIL-4 발현 유도후에도 세포 생장을 지속하는 균주를 RL7321로 지칭한다.
사람 인터루킨-4(rhIL-4)의 발효과정 동안, 생성물은 발효 브로쓰내에 직접 분비된다. 초기의 다운스트림(doun-stream) 단계를 수행하여 세포로부터 브로쓰를 분리시킨 다음 브로쓰 중의 rhIL-4를 농축시킨다. 이 과정을 수행하는데는 2개의 뚜렷한 공정이 있다: 즉, 막 공정 및 나트륨 트리클로로 아세트산(TCA) 공정. 나트륨 TCA 공정에서, TCA 염을 가하여 세포를 불활성화시킨다. 세포를 제거한 후, 브로쓰의 pH를 낮추어 rhIL-4를 침전시키고, 브로쓰를 원심분리시켜 펠렛 또는 슬러지의 형태의 rhIL-4를 회수한다. 막 공정은 미세여과 및 한외여과법 모두를 사용하여 rhIL-4를 액체 농축물의 형태로 회수한다. 이 공정은 완충액으로 수회 세척하는 것을 통해 다운스트림 회수율을 증진시킨다.
금속 킬레이트 컬럼(예: Zn-Sepharose)상에서 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피하여 발효 브로쓰의 조 농축물로부터 rhIL-4를 정제한다. 선별된 분획을 수집한 후, 설포네이트 컬럼(예: S-Sepharose)상에서 양이온 교환 크로마토그래피한다.
선별된 분획을 수집하여, 농축시킨 후, 적합한 분자량의 막(예: Millipore PTGC 한외 여과막)을 갖는 한외여과 장치로 투석여과시켜 생성물을 농축시킨다. 투석여과 농축물을 겔 여과 컬럼(예: S-200 HR)상에서 크로마토그래피하여 더욱 정제한다. 이어서 정제된 다량의 rhIL-4를 구성하는 수집된 분획을 여과시키고, -20℃ 이하로 저장한다.
따라서 이.콜라이로부터 활성 재조합 사람 IL-4의 조용액을 정제하는 공정은 하기 단계를 포함한다:
(a) pH가 중성 내지 약 알칼리성이고 약 0.5 내지 1.5몰의 염화나트륨을 함유하는 IL-4의 완충된 조 용액을 금속 킬레이트화-아가로즈 겔상에서 친화성 크로마토그래피하여 IL-4를 선별적으로 결합시키는 단계;
(b) 컬럼을 우선 1.0M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산나트륨 평형화 완충액(pH 7.2)으로 세척한 후, 10용적% 글리세롤 및 약 150mM 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 세척하는 단계;
(c) 결합된 IL-4를 킬레이트화, 히스티딘 동족체 또는 아미노산을 함유하는 산성 pH 또는 중성 pH의 용출 완충액으로 용출시키는 단계;
(d) 단계(c)로부터의 활성 IL-4 용출물을 약 중성 내지 약 산성 pH 및 15mS 전도율에서 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼[예: 이온교환 그룹 -CH2-SO3 -Na+에 커플링된 가교결합 아가로즈 매트릭스인 S-Sepharose(Pharmacia Fine Chemi cals 제조원)]으로 처리하는 단계;
(e) 단계(d)로부터의 용출물을 한외여과막(10,000 분자량 차단)으로 농축시키는 단계;
(f) 농축된 보유물을 크기 배제 컬럼상에서 겔 여과 크로마토그래피하는 단계;
(g) 정제된 활성 IL-4를 수거하는 단계.
보다 바람직한 태양은 하기 단계를 포함한다:
(a) 활성 재조합 시합 IL-4의 조 용액을 1.0M 염화나트륨을 함유하는 중성 내지 약 알카리성 pH의 인산염 완충액중의 금속 킬레이트화-아가로즈 겔, 바람직하게는 킬레이트화 SepharoseFast Flow의 친화성 크로마토그래피 컬럼에 충전시키는 단계;
(b) 컬럼을 우선 1.0M 염화나트륨을 함유하는 pH 7.2 내지 7.5의 인산염 완충액으로 세척한 후, 10용적% 글리세롤 및 150mM 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액으로 세척하는 단계;
(c) 컬럼으로부터의 활성 IL-4를 0.5M 염화나트륨을 함유하는 아세트산염 완충액(pH 5.0)으로 등용매적으로 용출시키는 단계;
(d) 단계(c)로부터, pH가 6.75이고, 전도율이 15mS인 인산염 완충액중의 활성 IL-4 용출물을 0.12M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.75)으로 평형화시킨 컬럼(예: S-Sepharose)상에서 양이온 교환 크로마토그래피하고, 0.12 내지 0.6M NaCl을 함유하는 인산염 완충액(pH 6.75)으로 구배 용출시키는 단계;
(e) 단계(d)로부터의 용출물을 한외여과막으로 농축시키는 단계;
(f) 농축된 용출물을 10mM 시트르산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 평형화시킨 크기 배제 컬럼상에서 겔 여과 크로마토그래피하는 단계;
(g) 정제된 활성 IL-4 용액을 수거하는 단계.
본 발명에 따라 정제된 활성 IL-4를 제조하기 위하여 사용되는 바람직한 이.콜라이 균주는 RL 2117/pRGT857-11 및 RL7321/pRGT857-11이다.
단계(a)에서 사용되는 바람직한 금속 킬레이트화-아가로즈는 킬레이트화 SepharoseFast Flow이며, 킬레이트화 Sepharose6B도 만족스럽다. Sepharose는 Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway. New Jersey 소재)사의 제품이다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 아연 킬레이트화 Sepharose컬럼을 제조하는 바람직한 방법은 Sepharose겔을 크로마토그래피 컬럼에 부은 후, 탈이온수로 세척하며, 이어서 염 용액, 바람직하게는 아연 아세테이트 용액 및 탈이온수를 컬럼에 통과시켜 세척한후, 평형화 완충액(즉, pH 7.2의 1.0M NaCl 용액을 함유하는 20mM 인산나트륨)을 컬럼을 통해 펌프질하는 것이다. 아연 아세테이트 대신, 다른 아연 염, 예를 들어 황산아연 또는 염화아연도 사용할 수 있다.
크로마토그래피 컬럼은 연속 연결된 2개의 컬럼이다. 제1 또는 상부 컬럼은 아연 킬레이트화-Sepharose 겔을 함유하고, 제2 또는 하부 컬럼은 아연염 또는 기타 금속염으로 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose 겔을 함유한다. 이중 컬럼의 용적비는 아연 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose 1용적에 대해 아연 처리된 킬레이트화 Sepharose가 약 3용적이다.
컬럼을 평형화시키는데 사용되는 바람직한 완충액은 1.0M 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.2 내지 7.5)이다.
단계(b)에서는, 먼저 평형화 완충액으로서 1.0M 염화 나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.2) 및 이어서 10% 글리세롤 및 저농도의 염화나트륨(150mM)을 함유하는 인산나트륨 완충액(pH 7.2 내지 7.5)으로 세척한 특정한 2개의 세척물 일부를 컬럼에 충전시킨다. 컬럼을 세척하여 매우 밀접히 관련되고 분리가 어려운 것을 포함하는 불순물을 제거한다. 활성 IL-4는 컬럼상에 잔류한다.
활성 IL-4의 용액의 pH를 유지시키기 위한 바람직한 완충액은 1.0M 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH 7.2)이다. 완충된 조 활성 IL-4 용액을 컬럼에 통과시키는 경우, IL-4는 겔상에 선별적으로 흡착된다.
단계(c)에서는, 아연 킬레이트화-Sepharose및 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose겔을 1.0M 염화 나트륨을 함유하는 인산염 완충액(pH 6.75)으로 평형화 시킨 다음, 이어서 흡착된 활성 IL-4는 0.5M 염화나트륨을 함유하는 아세트산염 완충액(pH 5.0) 또는 달리는 착화제[예: 50mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)] 또는 히스티딘 동족체(예: 50mM 이미다졸), 또는 아미노산(예: 50mM 히스티딘)을 함유하는 완충액(pH; 중성)을 처리되지 않은 킬레이트화-Sepharose에 통과시켜 아연 킬레이트화 Sepharose로부터 등용매적으로 용출시킨다. 아세트산염 완충액이 바람직하다. 활성 IL-4를 함유하는 용출물을 수거한다. 통상의 SDS-PAGE 및 단백질 검정에 기초하여 최고농도의 활성 IL-4를 갖는 분획을 수집한다.
단계(d)에서는, 단계(c)로부터 수집된 분획의 pH를 pH 6.75로 조절하고, pH가 6.75인 20mM 완충액으로 희석시켜 전도율이 15mS가 되도록 한다. 크로마토그래피 컬럼 중의 양이온 교환 겔 물질을 0.12M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH 6.75)으로 평형화시킨다. 바람직한 양이온 교환기는 -CH2-SO3 -Na+그룹으로 치환된 가교결합된 아가로즈[예: S-SepharoseFast Flow (Pharmacia 제조원)]이다. 활성 IL-4를 0.12 내지 0.6M NaCl을 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH 6.75)으로 구배 용출시킨다. SDS-PAGE 및 단백질 검정에 기초하여 활성 IL-4의 농도가 최고인 분획을 수집한다. 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 조건은 활성 IL-4 분획이 양이온 교환기 매트릭스에 확실히 결합되도록 선택한다. 양이온 교환 크로마토그래피에 대해서 비교적 높은 약중성인 pH 6.75 및 이온교환 크로마토그래피에 대해서 비교적 높은 15mS 전도율에 의해서 대부분의 불순물이 컬럼에 결합하지 않는 온화한 결합조건이 생성되며, 용출이 비교적 용이하고, 활성 IL-4 용액이 고순도(즉, 약 90% 내지 95%)로 수득된다.
단계(e)에서, 단계(d)로부터의 수집된 용출 분획을 분자량이 10,000 이상인 모든 물질을 보유하는 막과 결합된 교반된 세포상에서 농축시킨다. 이는 활성 IL-4를 함유한다. 이 공정의 단계에서, 활성 IL-4 용액의 순도는 약 90 내지 95%이며, 막의 상부에 보유된 농축 용액중에는 활성 IL-4 이외의 것의 농도는 매우 적다. 바람직한 막은 YM-10(Amicon Co., 제조원 U.S.A.)이다. 수득된 활성 IL-4의 농도는 약 20mg/ml 이하이다.
단계(f)에서는, 단계(e)로부터 수집되고, 농축된 활성 IL-4 농축물을 분자량에 따라 용액 중의 단백질을 분획화시키는 크기 배제 겔 여과 크로마토그래피에 충전시킨다. 적합한 대표적인 컬럼은 SephacrylS-200 HR 또는 S-100 HR (Pharmacia제조원) 겔 여과 컬럼이다. SephacrylS-200 HR (고분해) 및 S-100 HR은 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌비스 아크릴아미드와의 가교결합된 공중합체이다. 분획화 범위는 각각 5,000 내지 250,000달톤 및 1,000 내지 100,000달톤이다. 기타의 적합한 물질은 가교결합된 덱스트란 겔인 Sephadexes(Pharmacia 제조원)이다. 바람직하게는 활성 IL-4의 용액을 pH가 4.5인 10mM 시트르산염 완충액으로 미리 평형화시킨 S-200HR 컬럼에 충전시킨다. 단계(g)의 조건하에서, 안정한 IL-4 농축물은 20mg/ml 농도까지 될 수 있다. 이는 겔 여과 크로마토 그래피의 용량과 기능을 증가시킨다.
SDS-PAGE 및 단백질 검정으로 측정한 것으로서 최고 농도의 활성 IL-4를 함유하는 용출물의 분획을 수거하여 수집하면 순도가 95 내지 99%인 활성 IL-4 용액이 수득된다.
이 공정에서 사용되는 완충액은 활성 IL-4를 크로마토그래피 겔에 흡착시키거나 이를 통해 선별적으로 용출시킬 수 있는 결합, 세척 및 용출에 적절한 조건을 제공하도록 선택된다. 바람직한 완충액은 20mM 농도의 인산나트륨 완충액 또는 농도 및 pH가 실시예에 나타난 바와 같고 또한 지시된 특정량의 염화나트륨을 함유하는 아세트산나트륨 완충액이다. pH는 수산화나트륨 또는 산으로 조절한다. 단계(b)의 2부분의 세척시, 첫 번째 세척은 1.0M 염화나트륨을 함유하는 20mM 인산나트륨 평형화 완충액(pH 7.2)으로 수행하고, 두 번째 세척은 약 150mM 염화나트륨 및 제2세척 완충액에 필수적인 10% 글리세롤을 함유하는 인산염 완충액으로 수행한다.
높은 염 농도, 바람직하게는 1M 염화나트륨이 트리클로로 아세트산(TCA) 펠렛으로부터 용해된 활성 IL-4의 회수를 증가 시키고 금속 킬레이트화 Sepharose에 대한 활성 IL-4 결합을 증진시키므로 아연 킬레이트화-Sepharose 컬럼과 함께 사용되는 완충액중의 일정 농도의 염화나트륨이 중요하다. 상기 농도는 IL-4가 아연 킬레이트화 Sepharose 컬럼에 발효 브로쓰중의 불순물보다도 더욱 선별적으로 흡착되게 한다.
이어서, 다량의 IL-4를 해동시키고 멸균수 및/또는 10mm 시트르산 염 완충액으로 희석시켜 주사용 제제를 제조한다.
[실시예 1]
[S-SepharoseFast Flow 컬럼의 제조]
0.12M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)중의 S-SepharoseFast Flow 양이온 교환 수지로 2개의 양이온 교환 컬럼을 제조한다. 제1컬럼은 1.5ℓ 짜리 컬럼으로서, 직경이 100㎜이며, 높이는 45㎝이고, 제2컬럼은 0.25ℓ 짜리 컬럼으로서 직경은 50㎜이고 높이는 300㎜이다. 각각의 컬럼을 양이온 교환겔로 완전히 충전시키는 경우 작은 컬럼은 큰 컬럼의 베드 용적의 15%이다. 컬럼은 하기와 같이 충전시킨다: 0.12M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.2)중의 Slurry S-SepharoseFast Flow 겔 양이온 교환 수지. 겔을 적절한 크로마토그래피 컬럼에 붓고, 액체를 흘려보낸 후, 컬럼의 바닥을 통과하도록 펌프질한다.
상부 유동 적용기를 컬럼상에 놓고, 0.12M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.2) 5 베드 용적을 대략 1㎝/분의 선속도로 컬럼을 통해 펌프질하여 겔을 평형화시킨다. 상단 유동 적용기를 수지 베드의 상단에서 견고히 누른다. 이어서 0.12M NaCl을 함유하는 20mM 인산 나트륨으로 구성된 완충액 (pH 7.2) 5 베드 용적 이상을 대략 1㎝/분의 선속도로서 컬럼을 통해 펌프질하고, 필요한 경우, 용출물의 pH가 7.1 내지 7.3이 될 때까지 완충액을 동일한 유동속도로 컬럼을 통해 펌프질한다. 소컬럼의 베드 용적이 대컬럼의 베드 용적의 15%가 되도록 컬럼의 베드 용적을 조절한다.
[실시예 2]
[코발트 킬레이트화-SepharoseFast Flow의 제조]
0.02M 코발트 아세테이트 5 용적중에 킬레이트화 Sepharose Fast Flow 겔을 현탁시키고 이따금 교반하면서 밤새 정치한다. Buchner 깔대기상의 겔을 탈이온수로 세척한 후, 겔을 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 세척한다. 이어서 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.2) 0.5 겔 용적중에 겔을 슬러리화한다. 코발트 부가된 겔 190ml을 직경이 50㎜이고 높이가 300㎜인 컬럼에 붓고, 액체를 컬럼을 통해 펌프질한다. 상부 유동 적용기를 컬럼상에 설치하고, 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 약 1㎝/분의 유속으로 컬럼을 통해 펌프질하여 겔을 평형화시킨다. 컬럼의 상부에 유동 적용기를 설치한다.
[실시예 3]
[킬레이트화 SepharoseFast Flow(금속염으로 처리되지 않음)의 제조]
NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.2)중에 킬레이트화 SepharoseFast Flow 겔을 슬러리화한다. 겔 75ml을 실시예2로부터의 크로마토그래피 컬럼에 부어 금속염으로 처리되지 않은 겔을 코발트 부가된 겔의 상부에 균일층으로 가라앉힌다. 유동 적용기를 컬럼상에 설치하고 겔을 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 평형화시킨다.
[실시예 4]
[코발트 킬레이트화-Sepharose컬럼의 평형화]
코발트 킬레이트화 SepharoseFast Flow 및 처리 되지 않은 킬레이트화 Sepharose컬럼을 실시예 2 및 3에 따라 제조한 후, 코발트 처리된 수지가 코발트 처리되지 않은 수지의 상부에 놓이도록 컬럼을 뒤집는다. 용출물의 pH가 7.1 내지 7.3이 될 때까지 완충액(즉, pH 7.2, 0.5M NaCl을 함유하는 0.02N 인산나트륨)을 컬럼을 통해 계속 펌프질한다.
[실시예 5]
[Sephacryl
제조 pH 4.5의 10mM 시트르산나트륨으로 구성된 완충액 1베드 용적 이상을 직경이 50㎜이고, 높이가 100㎝인 1.8ℓ 짜리 크로마토그래피 컬럼중의 S-200 HR 겔을 통해 약 0.2㎝/분의 선속도로 펌프질하여 컬럼을 평형화시킨다.
[실시예 6]
[완충액의 제조]
(a) 0.12M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)
탈이온수중에 2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 7.03g/ℓ 염화나트륨 및 pH를 7.2(±.01)로 조절하기에 충분한 양의 6.3N 수산화나트륨을 함께 혼합한다.
(b) 0.26M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)
탈이온수중에 2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 15.19g/ℓ 염화나트륨을 함께 혼합한다. 6.3N 수산화나트륨으로 pH를 7.2(±.01)로 조절한다.
(c) 0.50M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)
탈이온수중에 2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 29.22g/ℓ 염화나트륨 및 pH를 7.2(±.01)로 조절하기에 충분한 양의 50% NaOH를 함께 혼합한다.
(d) 0.05M EDTA, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 6.0)
탈이온수중에 2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 19g/ℓ 사나트륨 EDTA 및 29.22g/ℓ 염화나트륨을 함께 혼합한다. 6.3N 수산화나트륨/4N HCI로 pH를 6.0(±.01)으로 조절한다.
(e) pH 4.5의 10mM 시트르산나트륨
시트르산 일수화물이 용해될 때까지 시트르산 일수화물 210g(2.1g/ℓ)을 탈이온수 100ℓ와 혼합한다. 필요한 경우, 완충액의 pH를 4N 염산 및 6.3N 수산화나트륨을 사용하여 4.5로 조절한다. 이 완충액은 투석여과 및 한외여과 뿐만 아니라 겔 여과 크로마토그래피에도 사용한다.
(f) pH7.2의 20mM 인산나트륨
인산나트륨 일염기성 일수화물 278g 탈이온수 100ℓ와 혼합하고, 용해될 때가지 교반한다. 완충액의 pH를 50% NaOH로서 7.2로 조절하고, 전도율도 2 내지 4mS로 조절한다.
[실시예 7]
[조 IL-4 용액의 양이온 교환 크로마토그래피 처리]
조 IL-4 함유 세포 배양 배지(전체 단백질 약 14,000g)를 pH 7.2(±0.1)로 조절하고, 이의 전도율도 14mS(±1)로 조절한다. S-Sepharose양이온 교환 컬럼을 통해 약 1.0㎝/분 이하의 선속도로 용액을 펌프질한다. 컬럼을 실시예 6(a)에서 제조된 완충액으로 세척한 후, 컬럼을 실시예 6(b)에서 제조된 완충액으로써 약 0.2㎝/분의 선형속도로 등용매적으로 용출시킨다. SDS-PAGE 및 단백질 검정으로 측정된 것으로서 활성 IL-4를 함유하는 분획을 수거하여 이들을 수집한다. 수집된 활성 IL-4의 순도는 약 50%이다.
[실시예8]
[양이온 교환 컬럼상에서 부분적으로 정제된 활성 IL-4 용액의 구배 용출]
실시예 7에 따라 제조된 수집된 활성 IL-4 용액의 pH를 4N HCI 또는 6.3N NaOH로서 7.2(±0.1)로 조절한다. 용액의 전도율을 실시예 6(f)에서 제조된 완충액으로써 14mS(±1)로 조절한다.
용액을 실시예 1에서 제조한 S-Sepharose컬럼을 통해 약 1㎝/분 이하의 선속도로 펌프질 한다. 유동 용액을 1분획으로 수거한다.
컬럼을 베드 용적당 약 1.75mS의 구배 및 약 0.2㎝/분의 선형 유속으로 용출 시킨다.
구배에 사용되는 저 염 완충액은 실시예 6(a)에서 제조된 것이고, 구배에 사용되는 고 염 완충액은 실시예 6(c)에서 제조된 것이다.
5개의 대 분획(각각은 약 0.5 베드 용적을 갖는다)을 수거하고, 0.1 베드 용적의 나머지 분획(약 40 내지 50)을 수거한다.
활성 IL-4에 대한 분획을 SDS-PAGE 및 단백질 검정으로 분석하고, 활성 IL-4 분획을 수집한다. 수집된 활성 IL-4 용액의 순도는 약 60% 내지 70%이다.
[실시예 9]
[활성 재조합 사람 인터루킨-4의 코발트 킬레이트화 Sepharose 크로마토그래피 정제]
실시예 8에서의 IL-4용액의 pH를 4N HCI 및/또는 6.3N 염화나트륨을 사용하여 7.2(±0.1)로 조절한다. 용액의 전도율을 45 내지 50mS로 조절한다.
경우에 따라 원심분리 또는 미소여과로 용액을 청결하게 한다. 실시예 4에서 제조한 코발트 킬레이트화 SepharoseFast Flow 및 처리되지 않는 킬레이트화 Sepharose Fast Flow 컬럼을 통하여 용액을 약 0.5㎝/분의 선속도로 펌프질한다. 유동물을 1분획으로 수거한다.
실시예 6(c)에서 제조한 완충액 약 10 베드 용적을 사용하여 컬럼을 약 0.5㎝/분의 선속도로 세척하여 세척물을 5개 이하의 분획으로 수거한 다음 실시예 6(d)에서 제조한 완충액 약 10 베드 용적을 사용하여 컬럼을 약 0.5㎝/분의 선속도로 용출시킨다. 용적이 약 0.2 베드 용적인 분획을 수거한다. 각 샘플을 SDS-PAGE 및 단백질 검정법으로 활성 IL-4에 대하여 분석하고 활성 IL-4 분획을 수집한다.
본 실시예 9에 따라 처리한 활성 IL-4 용액의 순도는 약 90 내지 95%이다.
[실시예 10]
[한외여과 및 농축]
실시예 9로부터의 수집된 분획은 YM-10 막이 장착된 Amicon 교반 챔버를 이용하여, 활성 사람 IL-4를 함유하는 상기의 수집된 분획을 용기에 두고 실시예 6(d)에서 제조한 완충액 약 0.25용적을 첨가함으로써 농축시킨다. YM-10 막 상에서 한외여과하여 본래 용적의 약 0.2배가 되도록 농축시킨다. 농축된 보유물을 실시예 6(e)에서 제조한 완충액 4용적으로 희석시킨 다음 YM-10 막 상에서 한외여과하여 약 0.2용적이 되게 농축시킨다.
초기의 수집된 분획 용적의 약 0.1배의 용적을 달성하기 위해 농축단계를 반복할 수 있다. 농축물을 적절한 용기에 옮기고 즉시 사용할 경우 냉장실 온도에서 유지시키고 그렇지 않을 경우 -20℃에서 동결 보관한다.
[실시예 11]
[겔 여과 크로마토그래피(크기 배제)]
SephacrylS-200 HR 컬럼을 실시예 6(e)에서 제조한 완충액을 사용하며, 완충액은 적어도 1 베드 용적을 컬럼을 통해 약 0.2㎝/분의 선속도로 펌프질시켜 평형화한다.
실시예 10에서 제조한 용액을 2 내지 6℃에서 30분간 실험실용 원심분리기상에서 4500rpm으로 원심분리하여 정화한다. A280을 측정하고 용액을 실시예 6(e)에서 제조한 완충액으로 희석시켜 280㎜/ml에서 5흡광도 단위가 되게한다.
생성된 용액을 약 0.1㎝/분의 선속도로 Sephacryl S-200 HR 컬럼상에 펌프질한다. 실시예 6(e)의 완충액을 컬럼을 통하여 약 0.1㎝/분의 유속으로 연속하여 펌프질한다. 총 용적이 0.4 내지 0.55 베드 용적인 하나의 큰 분획을 수집한 다음, 약 0.01 베드 용적의 50개 분획을 수집한다.
SDS-PAGE 및 단백질 검정법으로 측정하여 활성인 IL-4를 함유하는 분획을 선별한다. 활성 IL-4 분획을 수집하여 0.2μ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. SDS-PAGE 검정으로 입증된 것으로서 순도가 95 내지 99%인 활성 IL-4 용액으로서의 여액을 회수한다. 세포배양배지중 활성 IL-4를 기준으로 한 전체 수율은 70%이다.
IL-4의 활성 분획을 측정하는데 사용한 모든 검정은 통상적인 것이다. 정제된 IL-4의 280㎚에서의 UV 흡광도 측정에서, 1.0 Å280광학 밀도 단위(OD)는 아미노산 조성 분석에 의해서는 1.6㎎이고 로우리 방법에 의해서는 2.0㎎에 상당한다.
[실시예 12]
[아연 킬레이트화 Sepharose Fast Flow의 제조]
킬레이트화 Sepharose Fast Flow 겔을 탈이온수에서 슬러리화한다. 3ℓ 용량의 컬럼을 제조하기 위하여, 슬러리를 높이가 500㎜이고 직경이 180㎜인 크로마토그래피 컬럼내로 붓는다. 컬럼내의 액체가 유동되도록 하거나 이것이 컬럼 하부를 통과하도록 펌프질한다.
상충 유동 적용기를 컬럼상에 놓고 겔을 탈이온수로 충진/세척한다. 물을 컬럼을 통하여 약 1㎝/분의 선속도로 펌프질한다. 상층 유동 적용기를 조절하여 수지 베드의 상부를 견고하게 가압한다. 컬럼을 통하여 적어도 5 베드 용적의 탈이온수를 약 1㎝/분의 선속도로 펌프질한다.
약 5 베드 용적의 0.023M 아연 아세테이트 용액을 컬럼을 통하여 약 1㎝/분의 선속도로 펌프질한다. 약 10 베드 용적의 탈이온수를 컬럼을 통해 약 1㎝/분의 선속도로 펌프질한다.
인산염 완충 용액을 컬럼을 통해 약 1.0㎝/분의 선속도로, 용출물의 pH가 7.1 내지 7.3이 될 때까지 계속 펌프질한다.
[실시예13]
[킬레이트화 Sepharose Fast Flow의 제조(금속염으로 처리하지 않음)]
킬레이트화 SepharoseFast Flow 겔을 1.0M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 이루어진 완충액(pH 7.2)중에서 슬러리화 한다. 1ℓ 용량의 컬럼을 제조하기 위하여, 겔을 직경이 140㎜이고 높이가 550㎜인 크로마토그래피 컬럼에 붓고 컬럼 하부로부터 용출시킨다. 겔을 1.0M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 이루어진 완충액(pH 7.2) 약 5 베드 용적으로 평형화한다. 완충액을 컬럼을 통해 약 1㎝/분의 선속도로 펌프질한다. 완충액을 컬럼을 통해 동일한 유속으로, 용출물의 pH가 7.1 내지 7.3이 될 때까지 연속해서 펌프질한다.
[실시예 14]
[컬럼 시리즈의 제조]
아연 킬레이트화 Sepharose Fast Flow 및 아연으로 처리되지 않은 킬레이트화 Sepharose 컬럼을 실시예 12 및 13에 따라 제조한 후에, 컬럼을 연속 연결하여 유동물이 처음에는 아연 킬레이트화 컬럼으로 유동하고 이어서 비-아연(비처리) 킬레이팅 컬럼으로 유동되게 한다. 컬럼간에 버블트랩이 삽입되지 않아야 한다.
[실시예 15]
[S-Sepharose컬럼의 제조]
S-Sepharose 겔 양이온 교환수지를 0.12M NaCl 및 0.001M 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 20mM 인산나트륨으로 이루어진 완충액(pH 6.75)중에 슬러리화한다. 겔을 직경이 100㎜이고, 높이가 445㎝인 크로마토그래피 컬럼에 붓고 액체가 유동하도록 두거나 펌프질하여 컬럼 하부를 통과하도록한다.
상층 유동 적용기를 컬럼상에 놓고 겔을 20mM 인산 나트륨(pH 6.75), 0.12M NaCl, 0.001M EDTA로 이루어진 완충액 5 베드 용적을 사용하여, 완충액이 약 1㎝/분의 선속도로 통과 하도록 펌프질함으로써 평형화시킨다. 상부 유동 적용기를 조정하여 수지 베드 상단에 견고히 가압되도록 한다. 이어서, 20mM 인산나트륨(pH 6.78), 0.12M NaCl, 0.001M EDTA로 이루어진 완충액 적어도 5 베드 용적을 컬럼을 통하여 약 1㎝/분의 선 속도로 펌프질하고 필요할 경우 완충액을 컬럼을 통하여 동일한 유속으로, 용출물의 pH가 6.6 내지 6.9가 될 때까지 연속해서 펌프질한다.
[실시예 16]
[SephacrylS-200 HR 컬럼의 제조]
10mM 시트르산나트륨(pH 4.5)로 이루어진 완충액 적어도 1 베드 용적을 직경이 50㎜이고 높이가 100㎝인 크로마토그래피 컬럼내의 S 200 HR 겔을 통하여 약 0.2㎝/분의 선속도로 펌프질하여 컬럼을 평형화한다.
[실시예 17]
[완충액의 제조]
(a) 1.0M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)
2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 58.44g/ℓ 염화나트륨 및 충분량의 6.3N 수산화나트륨을 탈이온수중에서 함께 혼합하여 pH 7.2(±0.1)가 되게 조절한다. 뱃치는 금속 킬레이트화 Sepharose 컬럼내 겔 ℓ당 적어도 30ℓ를 제공할 정도로 충분히 커야 한다.
(b) 0.15M 염화나트륨 및 10% 글리세롤을 함유하는 0.02M 인산나트륨(pH 7.2)
2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 8.76g/ℓ 염화나트륨을 탈이온수중에서 함께 혼합한다. 6.3N 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 7.2(±0.1)로 조절한다. 충분량의 글리세롤을 가하여 0.1ℓ/ℓ가 되게 한다. 사용될 겔 ℓ당 적어도 6ℓ를 제공할 충분량의 완충액을 제조한다.
(c) 0.5M 염화나트륨을 함유하는 0.02M 아세트산나트륨(pH 5.0)
1.15ml/ℓ의 99.7% 아세트산 및 29.2g/ℓ의 염화나트륨을 탈이온수중에서 함께 혼합한다. 6.3N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.0(±0.1)으로 조절한다. 사용될 겔ℓ당 10ℓ를 제공할 충분량의 완충액을 제조한다.
(d) 0.003M EDTD를 함유하는 0.03M 인산나트륨(pH 7.0)
4.17g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물 및 1.14g/ℓ 사나트륨 EDTA를 탈이온수중에서 함께 혼합한다. 6.3N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.0(±0.1)으로 조절한다. 겔ℓ당 적어도 2ℓ를 제공할 충분량의 완충액을 제조한다.
(e) 10mM 시트르산나트륨(pH 4.5)
210g(2.1g/ℓ)의 시트르산 일수화물을 100ℓ의 탈이온수와 시트르산 일수화물이 용해될 때까지 혼합한다. 경우에 따라, 4N 염산 및 6.3N 수산화나트륨을 사용하여 완충액의 pH를 4.5로 조절한다. 당해 완충액을 투석여과, 한외여과 및 겔여과 크로마토그래피에 사용한다.
[실시예 18]
[활성인 재조합 사람 인터루킨-4의 정제(아연 킬레이트화 Sepharose 크로마토그래피)]
활성인 사람 재조합 IL-4가 용해된 700ℓ의 발효 브로쓰를 20ℓ로 농축시킨 다음, 이 용액을 실시예 17(a)의 완충액에 대해 25회 투석여과시킨다. 4N HCI 및/또는 6.3N 염화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.2(±0.1)로 조절한다. 용액의 전도율을 70 내지 90mS로 조절한다.
용액을 여과에 의해 정화 및 농축시킨다. 필터를 용액 용적이 20ℓ가 되도록 실시예 17(a)의 완충액으로 세척한다.
용액을 아연 킬레이트화 Sepharose Fast Flow 컬럼을 통해 약 0.5㎝/분의 선속도로 펌프질한다.
컬럼을 2회 세척하여야 하며, 처음에는 실시예 17(a)에서 재조한 완충액 약 10 베드 용적을 사용하여 약 0.5㎝/분의 선속도로 수행하고 세척물을 5개 이하의 분획으로 수집한 다음, 실시예 17(b)에서 제조한 완충액 약 5 베드 용적을 사용하여 약 0.5㎝/분의 선형속도로 수행한 다음 세척물을 하나의 분획으로 수거한다.
실시예 17(c)에서 제조한 완충액 약 8 베드 용적을 사용하여 활성 IL-4를 컬럼으로부터 약 0.25㎝/분의 선속도로 용출시킨다. 희석제로서 실시예 17(d)에서 제조한 수거될 완충액 ml당 희석물 0.5ml를 함유하는 별개의 용기에서 용적이 약 0.2 베드 용적인 분획을 수거한다.
각 샘플을 SDS-PAGE 및 단백질 검정법을 이용하여 활성 IL-4에 대하여 시험한다.
본 실시예 18에 따라 처리한 활성 IL-4 용액의 순도는 약 20 내지 40%이다. 조 발효 브로쓰에 존재하는 양을 기준으로 한 활성 IL-4의 수율은 90%이다.
[실시예 19]
[S-Sepharose크로마토그래피용 완충액의 제조]
(a) 0.12M 염화나트륨 및 0.001M EDTA를 함유하는 20mM 인산 나트륨(pH 6.75)
2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 7.03g/ℓ 염화나트륨, 0.38g/ℓ 사나트륨 EDTA 및 1ℓ/ℓ의 탈이온수를 적절한 용기중에 채워넣고 용해될 때까지 교반한다.
6.3N 수산화나트륨으로 완충용액의 pH를 6.75(±0.1)로 조절한다.
(b) 0.55M 염화나트륨 및 0.001M EDTA를 함유하는 20mM 인산 나트륨(pH 6.75)
2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 32.14g/ℓ 염화나트륨, 0.38g/ℓ 사나트륨 EDTA 및 탈이온수를 적절한 용기중에 채워넣고 용해될 때까지 교반한다. 6.3N 수산화나트륨으로 완충용액의 pH를 6.75(±0.1)로 조절한다.
(c) 0.001M EDTA를 함유하는 20mM 인산 나트륨(pH 6.75)
2.78g/ℓ 인산나트륨 일염기성 일수화물, 0.38g/ℓ 사나트륨 EDTA 및 탈이온수를 이들을 수용하기에 충분히 큰 용기에 채워넣는다. 용해될 때까지 교반하고 필요에 따라 6.3N NaOH를 사용하여 완충액의 pH를 6.75(±0.1)로 조절한다.
[실시예 20]
[양이온 교환 컬럼상에서의 정제된 활성 인터루킨-4 용액의 구배 용출]
필요에 따라 4N HCI 또는 6.3N NaOH를 사용하여 실시예 7에 따라 제조한 활성 IL-4 용액의 pH를 6.75(±0.1)로 조절한다.
0.45μ 필터를 통해 여과한다. 필터를 실시예 19(c)에서 제조한 완충액 약 1ℓ로 세척한다.
실시예 19(c)에서 제조한 완충용액을 사용하여 생성 용액의 전도율을 15(±0.5mS)로 조절한다.
용액을 실시예 4에서 제조한 S-Sepharose컬럼을 통하여 약1㎝/분 이하의 선속도로 펌프질한다. 용출용액을 하나의 분획으로 수거한다.
컬럼을 실시예 19(a)에서 제조한 완충용액 약 5 베드 용적을 사용하여 약 1.0㎝/분의 선속도로 세척한다.
세척물을 하나의 분획으로 수거한다. 약 4.5mS/베드 용적의 구배 및 약 0.2㎝/분의 선유속을 사용하여 컬럼을 용출시킨다.
구배에 사용된 저염 완충액은 실시예 19(a)에서 제조한 것이며(5 베드 용적), 구배에 사용된 고 염 완충액은 실시예 19(b)에서 제조한 것이다(5 베드 용적).
각각 용적이 약 0.8 베드 용적인 5개의 큰분획을 수거한다.
0.1 베드 용적의 잔류 분획(약 40 내지 50개)을 수거한다.
분획을 SDS-PAGE 및 단백질 검증법에 의해 활성 IL-4에 대하여 시험한다.
활성 IL-4 분획을 수집한다. 아연 킬레이트화 수집된 용출물내 활성 IL-4의 양을 기준으로 한 활성 IL-4의 수율은 90%이다.
활성 IL-4 용액의 순도는 약 90 내지 95%이다.
[실시예 21]
[한외여과 및 농축]
실시예 20으로부터의 수집된 분획을 YM 10 막이 장착된 Amicon 교반챔버를 사용하여, 활성 사람 IL-4를 함유하는 실시예 20으로부터의 수집된 분획을 용기에 넣고 용적을 YM-10 막 상에서 한외여과로 원 용적의 약 0.1배가 되도록 농축시킴으로써 농축한다. 농축된 보유물을 실시예 17(e)에서 제조한 완충액 4 용적으로 희석시키고 이를 YM-10 막 상에서의 한외여과로 약 0.2 용적이 되게 농축한다.
초기 수집된 분획의 용적이 약 0.1배가 되도록 하기위하여 농축단계를 반복할 수 있다. 농축물을 적절한 용기에 옮기고 냉장실 온도로 유지시키거나 -20℃에서 동결보관한다.
[실시예 22]
[겔 여과(크기 배제)]
실시예 21에서 제조한 용액을 2 내지 6℃에서 30분간 실험실용 원심분리기상에서 4500rpm으로 원심분리하여 정화한다. Å280을 측정하고 용액을 실시예 17(e)에서 제조한 완충액으로 희석함으로써 15A280/ml가 되게 한다.
생성 용액을 SephacrylS-200 HR 컬럼상에 약 0.1㎝/분의 선속도로 펌프질한다. 실시예 17(e)의 완충액을 컬럼을 통하여 약 0.1㎝/분의 유속으로 연속해서 펌프질한다. 총 용적이 0.4 내지 0.55 베드 용적인 5개의 분획을 수거한 다음 약 0.01베드 용적의 50개의 분획을 수거한다.
SDS-PAGE 및 단백질 검정법에 의해 측정한 것으로서 활성 IL-4를 함유하는 분획을 선별한다. 활성 IL-4 분획을 수집하여 0.2μ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 순도가 95 내지 99%인 활성 IL-4 용액으로서의 여액을 회수한다. 발효 브로쓰중에 존재하는 활성 IL-4를 기준으로 한 전체 수율은 70 내지 80%이다.
회수한 활성 IL-4의 순도는 SDS-PAGE 검정에 의해 입증되는 바와 같이 95 내지 99%이다.
인터루킨-4의 활성 분획을 측정하는데 사용된 모든 검정법은 통상적인 것이다. 용출물로부터 활성 분획을 선별하는데 필요한 검정법은 280㎚에서의 UV 흡광도 측정이다. 정제된 IL-4의 경우, 1.0A280흡광도 단위(OD)는 아미노산 조성 분석에 있어서는 1.6㎎ 및 로우리 방법에 의해서는 2.0㎎에 상당한다.
활성분획을 선별하는데 있어서는 SDS-PAGE 검정법도 또한 요구된다. 이 방법은 문헌[참조: Laemmli, U.K., Nature, 227: 680 (1970)]에 기술되어 있다.
로우리 방법은 문헌[참조: Lowry et al., J. Biol. Chem.]에 기술되어 있다.
본 발명을 특정의 특이양태와 관련하여 기술하였지만, 당해 분야의 전문가는 다수의 대체방법, 변화 및 변형이 가능함을 명백히 알 수 있을 것이다. 이와 같은 모든 대체방법, 변화 및 변형은 본 발명의 취지 및 범주에 포함된다.
Claims (20)
- (a) 약 0.5 내지 1.5M 염화나트륨을 함유하고 중성 내지 약알칼리성 pH에서 완충된 활성인 재조합 사람 인터루킨-4(IL-4)의 조 용액을 금속 킬레이트화 아가로즈 겔 크로마토그래피 컬럼에 충전시켜, 활성인 재조합 사람 인터루킨-4를 당해 컬럼에 선별적으로 결합시키는 단계; (b) 상기 컬럼을, 먼저 1.0M 염화나트륨을 함유하는 평형화 완충액으로 세척한 후 10% 글리세롤 및 0.15M 염화나트륨을 함유하는 완충액으로 2회 세척하는 단계; (c) 결합된 활성인 재조합 사람 인터루킨-4를 컬럼으로부터 pH가 약 4.5 내지 5.5인 용출 완충액으로 용출시키는 단계; (d) 완충액 중의 단계(c)로부터의 활성인 사람 IL-4용액을 양이온 교환기상에 충전시키고, 컬럼으로부터 활성인 사람 IL-4의 완충용액을 구배용출시키는 단계; (e) 단계(d)로부터 용출물을 분자량이 10,000 미만인 물질을 통과시키는 교반된 세포막상에서 농축시키는 단계; (f) 단계(e)로부터의 농축물을 크기 배제 크로마토그래피에 적용시키는 단계; 및 (g) 활성인 재조합 사람 인터루킨-4의 정제된 용액을 회수하는 단계를 포함하여, 활성인 재조합 사람 인터루킨-4의 조 용액을 정제하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(a)에서 완충액의 pH가 7.5인 인산염 완충액이고, 염화나트륨 농도가 1M이며, 금속 킬레이트화 겔 컬럼이 아연 킬레이트화 아가로즈 겔인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계(b)에서 완충액이 150mM 염화나트륨을 함유하고 pH가 7.2인 0.02mM 인산나트륨인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(c)에서 용출 완충액이 0.5M 염화나트륨을 함유하고 pH가 5.0인 0.02mM 아세트산나트륨 완충액인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(d)에서 충전 완충액이 0.12M 염화나트륨을 함유하고 pH가 6.75인 20mM 인산염 완충액이고, 용출 완충액이 약 0.12 내지 0.55M 염화나트륨을 함유하며 pH가 6.75인 20mM 인산염 완충액인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계(e)의 농축을 20㎎/ml 이하의 농도가 되도록 pH가 4.5인 10mM 시트르산나트륨 완충액에 대해 투석여과시켜 수행하는 방법.
- (a) 중성 내지 약 알칼리성 pH 및 13 내지 15mS에서 완충된 활성인 재조합 사람 인터루킨-4(IL-4)의 조 용액을 양이온 교환 크로마토그래피의 가교 결합된 아가로즈 겔 매트릭스 컬럼상에 충전시켜, 활성인 재조합 사람 인터루킨-4를 당해 컬럼에 선별적으로 결합시키고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 활성인 IL-4를 컬럼으로부터 등용매(isocratically)용출시키는 단계; (b) 완충액중의 단계(a)로부터의 활성인 사람 IL-4 용액을 베드 용적이 단계(a)의 양이온 교환 컬럼의 베드 용적의 약 15%인, 크로마토그래피의 양이온 교환 소컬럼상에 충전시키고, 평형화 완충액으로 세척한 후, 0.12 내지 0.50M 염화나트륨을 함유하고 pH가 7.2인 완충 시스템을 사용하여 결합된 활성인 IL-4를 컬럼으로부터 구배 용출시키며, 활성 용출물을 수집하는 단계; (c) 수집된 용출물의 pH 및 전도율을 각각 pH 7.2 및 전도율 45 내지 50mS로 조절한 다음, 수집된 용출물을 약 0.5M 염화나트륨을 함유하며 pH가 약 6.7 내지 8인 완충액중의 금속 킬레이트화 아가로즈 겔 컬럼에 충전시킨 후, 당해 컬럼을 0.5M 염화나트륨을 함유하고 pH가 약 중성인 완충액으로 세척한 다음, 활성인 IL-4를 0.5M 염화나트륨을 함유하고 pH가 6.0인 완충액으로 등용매 용출시키는 단계; (d) pH 4.5에서 단계(c)로부터의 용출물을 분자량이 10,000 미만인 물질을 통과시키는 교반된 세포막상에서 농축 및 투석여과시키는 단계; (e) 단계(d)로부터의 농축물을 pH가 4.5인 완충시스템으로 평형화시킨 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드와의 가교결합된 공중합체 겔상의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 충전시키는 단계; 및 (f) 활성인 재조합 사람 인터루킨-4의 정제된 용액을 회수하는 단계를 포함하여, CHO-세포주로부터 발현된 활성인 재조합 사람 인터루킨-4의 조 용액을 정제하는 방법.
- 제7항에 있어서, 단계(a)에서 평형화 완충액이 0.12M염화나트륨을 함유하고 pH가 7.2인 20mM 인산나트륨인 방법.
- 제7항 또는 8항에 있어서, 단계(b)에서 용출 완충액이 0.12 내지 0.50M 염화나트륨 구배를 함유하며 pH가 7.2인 20mM 인산나트륨이고, 금속 킬레이트화 겔컬럼이 코발트 킬레이트화 아가로즈 겔인 방법.
- 제7항에 있어서, 단계(c)에서 용출 완충액이 0.50M 염화나트륨을 함유하고 pH가 6.0인 20mM 인산염 완충액인 방법.
- 제7항에 있어서, 단계(d)의 농축을 20㎎/ml 이하의 농도가 되도록 0.05M EDTA 및 0.5M 염화나트륨을 함유하고 pH가 6.0인 0.02M 인산나트륨 완충액에 대해 투석여과한 후, pH가 4.5인 10mM 시트르산나트륨 완충액에 대해 투석여과하여 수행하는 방법.
- 제7항에 있어서, 단계(e)에서 컬럼을 10mM 시트르산나트륨으로 평형화시키는 방법.
- 유효량의 인터루킨-4(IL-4) 및 약제학적으로 허용되는 부형제 및 부가제를 포함하는, 호중구의 수를 증가시키기 위한 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, IL-4가 사람 IL-4인 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, IL-4가 하나 이상의 다른 백혈구 증가제와 배합되어 있는 약제학적 조성물.
- 제15항에 있어서, 다른 백혈구 증가제가 과립구-대식구 콜로니 자극 인자, 과립구-콜로니 자극 인자, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, 또는 인터페론 알파인 약제학적 조성물.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, IL-4가 하나 이상의 화학요법제와 배합되어 있는 약제학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제, 유사 분열 방추체 독물 또는 종양 치료 항생제 중에서 선택된 약제학적 조성물.
- 유효량의 인터루킨-4(IL-4) 및 약제학적으로 허용되는 부형제 및 부가제를 포함하는, 골수성 백혈병 또는 단구성 백혈병을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
- 유효량의 IL-4 및 약제학적으로 허용되는 부형제 및 부가제를 포함하는, 미성숙한 골수 세포 또는 단구 세포의 성숙을 유도하기 위한 약제학적 조성물.
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