JPH04506299A - インタロイキン―４の精製法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 インタロイキン−４による好中球数の増加、骨髄細胞成熟誘発、およびインタロ イキン−４精製のための方法 兜匝辺ｉ景　一 本発明は、哺乳類における好中球数の増加および骨髄細胞細胞成熟誘発のための 方法で、本目的のための有効量のインタロイキン−４をこのような処置を必要と している哺乳類に対して投与することによる方法、およびこのような処理に使用 するためのインタロイキン−４の精製方法に関する。

インタロイキン−４（ＩＬ−４）は、広い範囲の免疫細胞刺激活性を有するリン ホカイン（免疫系の刺激剤）であるＣＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｌｙｍｐｈ。

ｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、第６巻、１号；Ｕ１３５　（１９８７）；Ｙｏｋｏｔ、ｏら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、ｆ３ｊ：　５８９４−５ ８９８　（１９８６）ＨＬｅｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、　且：２０８１−２０６５　（１９８６）；Ｃｏｆｆｍａｎら、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、よ３Ｊｌ：９４９−９５４　（１９８６）；　５ａｎｄｅｒ、ｓｏ ｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１ユニ４３７−４４ ０　（１９８６）；Ｇｒａｂ８ｔｅｉｎら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、ユＪＬＬ：　 １７２６−１７３１　（１９８５）；およびＶｉｔｅｔｔａら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、よｕ：　１７２６−１７３１（１９８５）］。ＩＬ−４は、Ｂ細胞増殖因 子（ＢＣＧＦ）［Ｂｕｔｌｅｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、よ３３：２５１−２５ ５　（１９８４）　（ヒトＢＣＧＦ）；およびＦａｒｒａｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　Ｌｌｌ：１８２８−１８４２　（１９８３）（ＴウスＢＣＧＦ）１８よ びＢ細胞刺激因子１　（ＢＳＦ−１）ＣＯｈａｒａら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ 」Ｌｉ：　２５１８−２５２３　（１９８５）ゴと、さまざまな時点で呼ばれて いる。インタロイキン−４という名称は、１９８６年に最終的に提起されかつ採 択されたＣ３ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、Ｅｌ、旦：　４３７−４４０　（１９８６）］。

ＩＬ−４は、当初、活性化Ｂ細胞の刺激のためにのみ重要であると考えられて。

しかし、また、Ｔ細胞および肥満細胞の活性を改変することも示された［Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　且：　５６５４−５６５８　（ １９８６）］。同様に、Ｔ細胞増殖因子およびＢ細胞増殖因子としてのＩＬ−４ 活性が種々の感染に対する自然の防御を増強するために有用であると記載してい るＷＯ３７１０２９０を参照。

Ｔ細胞およびＢ細胞は、免疫応答の後期段階において作用する。感染の初期段階 において作用しそして感染に対する体の最初の防御系である好中球を増加させか つ活性化するような薬剤を有することは、極めて有益である。

細胞は、白血球造血の正常過程において、幹細胞として公知の始原未成熟細胞か ら骨髄において発生し、異なる系統（ｌｉｎｅａｇｅ）経路で漸次により成熟な 段階を経て分化し、単球、顆粒球またはリンパ球として分化の最軽状態に到達す る。

未成熟、未分化細胞の特性は、急速に増殖する能力である。前駆細胞がこれらの 増殖段階を経て成熟しかつ分化するときにのみ、それは、一般に、増殖する能力 を喪失しかつ特定された機能的成熟細胞の役割を担う。正常状態では、その最終 成熟形態に到達した細胞は、いかなる程度にも全く増殖しない。　。

一般に、腫瘍は、細胞分化の障害である。特に、骨髄性白血病は、単球および顆 粒球系統の細胞が成熟の初期段階で阻害され、したがって、その増殖能を喪失し た障害である。これらの成熟阻止細胞は増殖し続けるので、それらは、未成熟細 胞群を発生させ、その結果、白血病が診断される。

種々の骨髄性白血病細胞を正常マクロファージおよび顆粒球に分化させるように 誘導できること、および、これらの細胞は、分化するとその増殖能を喪失するこ との証拠がある。このことは、薬剤による最終的分化の誘導が骨髄性白血病の治 療として有用であることを示唆している。

良豆Ω！直− さて、我々は、驚くべきことに、ＩＬ−４の投与は哺乳類における好中球数を増 加させること、および好中球および単球の分化を刺激することを見いだした。

さらに驚くべきことに、我々は、好中球に対する効果はＩＬ−４投与を停止後も 礪めて短いことから極めて驚くべきことである。我々は、従って、ＩＬ〜４が哺 乳類に投与して好中球の数を増加させ、かつ、感染に対して宿主耐性を増強させ るかまたは感染を極めて早い段階に治療できることを発見した。この哺乳類は、 たとえば重度火傷または潰瘍を有する患者のように望ましくない細菌感染に感受 性のイムノコンブロマイズ宿主、免疫防御が腫瘍治療における放射線または化学 寮法のために低下している宿主、および遺伝的免疫不全宿主であることができる 。

これらのＩＬ−４特性は、また、創傷部位における好中球および単球活性化およ び繊維芽細胞増殖を刺激することによって、それが、傷口または火傷のような創 傷の治癒のために局所投与において有用であることを示唆している。

我々は、また、ＩＬ−４が骨髄性および単球様細胞の成熟を誘発することを発見 した。骨髄性白血病は未成熟骨髄細胞の増殖に関連しているので、骨髄性細胞を その成熟状態に進行させることによって、ＩＬ−４は、その増殖を低下させ、骨 髄性白血病を治療する方法を提供するはずである。

好適には、前記補元類は、ヒト由来のＩＬ−４によって、ずなわち太ｉｌｌ工以 ｎ１ｉ）またはＣＨ○細胞から組換え法によって産生されたヒトＩＬ−４のよう なヒトＩＬ−４によって、治療されるであろう。最も好適には、補元類に対する 投与は、皮下または静注によってまたは点滴によって投与され、そして、１日当 たり体重１ｋｇ当たり約０．１乃至約３０μｇの量であろう。好適には、１日当 たり体＠１ｋｇ当たり約１乃至約１５μｇの量であり、最も好適には、１日当た り体重１ｋｇ当たり約３乃至約１０μｇの量であろう。

高純度活性Ｉ　Ｌ−４は、３段階工程（１）ＩＬ−４発現大ＩＩｌ菌（Ｌｃｏｌ ｉ）の！ｅ＃培養液から得られ、この工程は、１、キレートセファロースファー ストフローおよびキレートセファロース６Ｂの名称でファルマシアファインケミ カルズ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｐｉｓｃａｔａ ｗａ、ｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能なキレートセファロースゲルの ような金属キレートアガロースゲルカラムによるアフィニティクロマトグラフィ に粗発酵培養液を供すること。キレートセファロースファーストフローは、セフ ァロース６フアーストフローに安定なエーテル結合で結合したスペー勺上のイミ ノ２酢酸からなる。セファロース６フアーストフローは、架橋アガロース６％で ある。好適にはリン酸緩衝液である緩衝液が使用される。使用したリン酸緩衝液 は、高塩化ナトリウム濃度の、すなわち約０．１乃至１．５Ｍで、好適には１． ０Ｍ、中性乃至わずかにアルカリ性ｐＨの、すなわち８．７−８の、好適には約 ７．２のものが使用される。高塩濃度および約７゜２の中性に近いｐＨは、カラ ムに対する活性インタロイキン−４の結合を最大としかつ他のタンパク質の結合 を最小とする。ｔＲ、コバルトまたはニッケルのような他の金属キレート類も使 用できるが、好適な金属キレートは亜鉛である。結合が完結した後、カラムを２ 回洗浄し、最初はｐＨ７，２の２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１．０Ｍ塩化ナ トリウム含有平衡緩衝液で行う。次に、約１０％のグリセロールおよび低濃度の すなわち約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に含 有するリン酸緩衝液で洗浄する。第２の洗浄は、極めて緊密に連関し分離が困難 な不純物を含めて不純物を除去する。最後に、活性ＩＬ−４を、０．５０Ｍ塩化 ナトリウム含有酢酸緩衝液でｐＨ５，０で溶出する。

２、段階１からの活性ＩＬ−４の溶液を、中性に近い約ｐＨ６，７５のｐＨでか つほとんどの不純物が結合しない１５ｍ５（伝導度）でＳ−セファローズファー ストフローカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに供する。さらに精製し たＩＬ−４緩衝溶液を、次に、カラムから溶出する；および３、この活性ＩＬ− ４溶液をｐＨ４，５で２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した後、１０ｍＭクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ４，５で平衡にしたサイズ排除カラムによるゲルろ過グロマトグラフィ に供する。次に、９５％−９９％純粋な精製した活性ＩＬ−４溶液を採取する。

同様に、高純度活性ＩＬ−４が、下記からなる工程でＩＬ−４発現ＣＨＯ細胞系 統の細胞培養培地から得ることができる：１、　Ｓ−セファロースファーストフ ローカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに約６．７乃至８、好適には７ ．２の中性に近いｐＨで、かつほとんどの不純物が結合していない１３−１５ｍ Ｓ（伝導度）で活性ＩＬ−４含有粗細胞培養培地を供すること。ファルマシアフ ァインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能なＳ−セファロースフ ァーストフローは、それにイオン交換基ＣＨ２−５０３−Ｎａ’を結合させた架 橋アガロースマトリックスである。このカラムは平衡緩衝液で洗浄し、次に、精 製したＩ　Ｌ−４緩衝溶液を、０．２６Ｎ　ＮａＣ１含有ｐ　）■７．２の緩衝 系によってカラムからイソクラティカリに溶出しプールする； ２、プールした段階］からの溶出物を、段階１のカラムの約１５％のベッドボリ ュームである実質的に小型のＳ−セファロ−スフアース）・フローカラムによる 陽イオン交換クロマトグラフィに供する。このカラムを平衡緩衝液で洗浄し、次 に、活性Ｉ　Ｌ　−４分子を、０．１２−０．５０Ｍの塩化ナトリウム勾配を有 するｐＨ７，２の緩衝系によって溶出する； ３　段階２からの活性ＩＬ−４溶液を、本溶液をｐＨ７，２にかつ伝導度を４５ ４５−５Ｏに調節した後金属キレートアガロースゲルカラムにおけるアフイニテ ィクロマトグラフイに供する。このキレ−・トセファロースゲルは、キレートセ ファロースファーストフローおよびキレートセファロース６Ｂの名称でファルマ シア７フインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能である。キレー トセファロースファーストフローは、セファロース６フアーストフローに安定な エーテル結合で結合したヌベーサ上のイミノ２酢酸からなる。セファロース６フ アーストフローは、架橋アガロース６％である。好適にはリン酸緩衝液である緩 衝液が使用される。使用したリン酸緩衝液は、中性かられずかにアルカリ性ｐＨ の、すなわち６．７−８の、好適には約７．２の約０．５Ｍ塩化ナトリウム濃度 を有するものが使用される。塩濃度および約７．２の中性に近いｐＨは、カラム に対する活性インタロイキン−４の結合を最大としか°フ他のタンパク質の結合 を最小とする。銅、コバルトまたはニツウルのような他の金属キレート蔑も使用 できるが、好適な金属キレートは亜鉛である。結合が完結した後、カラムを２回 洗浄し、最初はｐＨ７，２の２０　ｍ　Ｍリン酸ナトリウムおよび０．５Ｍ塩化 ナトリウム含有平Ｗｌ緩衝液で行う。次に、この活性ＩＬ−４を０．５Ｍの塩化 ナトリウムを含有するリン酸緩衝液でイソクラティカリに溶出する；４、　活１ ＩＬ−４ｉ液を、好適ニハ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）から入手可 能なアリルデキストランおよびＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミドの架橋 共重合体であるセファクリルＳ−２００ＨＲまたはＳ−１００であるサイズ排除 カラムチ、ｐＨ４，５において２０ｍｇ／ｍｌまで？ｌＩｌ接縮後Ｈ４，５，１ ０ｍＭクエン酸ナトリウムで平衡にしたこのサイズ排除カラムによるゲルろ過ク ロマトグラフィに供する。次に、９５−９９％純度である精製した活性Ｉ　Ｌ− ４溶液を回収すること。

区ｌＬ旺胆ム五悪 図１は、本発明の用途のための好適な（ヒト）ＩＬ−４のアミノ酸配列を例示す る。

図２は、ＩＬ−４をサイノモロガス（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）サルに投与する ことによって見いだされた好中球細胞数の増加を示したグラフである。

図３は、ＩＬ−４によるＨＬ−６０細胞の処理によって達成された活性化および 分化を示した結果を示したグラフである。

１！Ｉ４は、ＩＬ−４によるＵ−９３７細胞の処理によって達成された活性化お よび分化を示した結果を示したグラフである。

楚皿辺脱悪 いかなる適切なＩＬ−４も、本！ｅ明で使用できる。ＩＬ−４に対する相補性Ｄ ＮＡＪＩＣＣＤＮＡ類）は、最近、いくつかの実験室でクローン化され、配列決 定された。例、Ｙｏｋｏｔｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ。

１旦：５８９４−５８９８（１９８６）　（ヒト）ＨＬｅｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｌ１：４３７−４４０　（１９８６（マウス ））；およびＮｏｍａら、Ｎ　ａ　ｔ　ｕ、　ｒ　ｅ　４より：６４０−８４６ 　（１９８６）（マウス）ａ　Ｌｅら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２旦ｕ’　１ ０８１７　（１９８８）は、ＣＨＯ細胞中における組換えヒトＩＬ−４産生を記 載している。ＩＬ−４は、また、たとえば、ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社、 ボストン、マサチューセッツ州から入手可能な商品（ヒトおよびマウス）でもあ る。さらに、弁組換えＩＬ−４は、種々ノ＠養上溝から精製された、例、５ａｎ ｄｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｌ１：４３７−４４０　（１９８６） （マウス）ＨＧｒａｂｓｔｅｉｎら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、上６３：１４０５− １４５１８−２５２３　（１９８５）（７ウスＢＳＦ−１）；Ｂｕｔｌｅｒら、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、、　１旦ユニ２５１−２５５　（１９８４）（ヒトＢＣＧＦ ）；およびＰ’ａｒｒａｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．＋１ｆｔ’　１８３８− １８４２　（１９８３）　（マウスＢＣＧＦ）。上記論文全てゐ開示は、ＤＮＡ およびアミノ酸配列および本発明で使用するための適切なＩＬ−４材料類を得る ための方法の教示のために本文で参考として引用している。

好適には、本発明で使用したＩＬ−４はヒトＩＬ−４であり、そして、最も好適 には、それは、Ｙｏｋｏｔｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、且：　５８９４−５８９８　（１９８８）および１９８７年５月２１日ｐｃ Ｔ特許出願第８７１０２９９０に記載の配列を有するヒトバージョンであろう。

上記記載論文およびＰＣＴ出願の開示は、本文で参考として引用している。

本発明によれば、哺乳類に対して有効量のＩＬ−４を投与し、単球および／また は顆粒球（これは下記：多形核細胞類、好酸球および／または好塩基球のすべて のいずれかである）の数を増加させる。このような有効量とは、有意と見なされ る少なくとも２５％の、好適には５０％の増加数で好中球数を有意に増加させる いかなる量のＩＬ−４としても定義される。１日当たり体重１キログラム当たり 約０．１乃至約３０μｇの好適にはヒトＩＬ−４（ｈＩＬ−４）であるＩＬ−４ が、好適には投与される。さらに好適には、哺乳類に対して、１日当たり体重１ キログラム当たり約１゜０乃至約１５．０μｇのｈＩＬ−４が投与され、そして 、最も好適には、哺乳類に対して、１日当たり体重１キログラム当たり約３゜０ 乃至約１０．０μｇのｈＩＬ−４が投与される。

投与量、頻度および期間は、好中球および単球数のレベルＣ例　単球減少症また は顆粒球減少症の重度）、患者の年齢、栄養状態等のような因子によって変動す るであろう。通常、投与は当初毎日とし、患者の生涯にわたり定期的に継続でき る。投与量および頻度は、好中球数の初期スクリーニング時においておよび工Ｌ −４の好中球数増加に及ぼす効果の大きさによって決定できる。投与は、約１０ ｏＯ総好中球および／または１００総単球の許容レベルにまで好中球数を増加さ せ、所望の生物学的効果をもたらすことを目的としており、このことは、臨床状 態に応じて核患者に付いて個別に決定する必要があるであろう。さらに、１種以 上のリンパ球小群の増強のような選択的操作を行うこともできる。

ＩＬ−４の好中球増加効果を補償するために、それを他の生物学的および／また は薬剤学的に許容できる化合物類と併用して投与することも有用であろう。たと えば、それは、他の白血球増加剤［例　顆粒球−マクロファージコロニー刺激因 子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ９Ｆ）］と併用す ることもできる。また、総白血球数および好中球数を増加させる目的で、ＩＬ− ４を他のインタロイキン類、例えばＩＬ−１および／またはＩＬ−３および／ま たはＩＬ−７と併用することも有用であろう。ＩＬ−４と併用したＩＬ−２は、 特異的かつ有用なＴ細胞機能の選択的増強をもたらし、そして、ＩＬ−５および ／またはＩＬ−６と併用したＩＬ−４は、正常および／または新形成性Ｂ細胞の 機能および／または数を特異的に増加させる点で有用であることができる。ＩＬ −４は、また、化学療法剤類の用途を増加させる点で有用であることができ、ア ルキル化剤、減数分裂紡錘体毒物または抗腫瘍抗生物質層を含むがそれらに限定 されない。白血球数または細胞特定小群の機能または分化状況を増強させること によって、上述の化学療法剤の効果が増強できる。たとえばガンマ−またはアル ファインクフェロンとのＩＬ−４の併用は、また、ある白血球、特にＴ細胞サブ セットの数および機能を増加させる点で有用であることができる。ある状況では 、必要な生物学的効果を達成するため、上述のインタロイキン類またはインクフ ェロンのいずれかに対する抗体類も、天然分子の代わりに投与できる。

前記投与量の投与は、静注、鼻腔、非経口、経口、皮下、筋注、局所または経皮 経路またはいかなる他の許容できる経路によることもできる。このＩＩ、−４は 、いかなる数の従来の投与形態でも投与できる。非経口調製物は、無菌溶液また は懸濁液を含む。吸入投与は、鼻腔また口腔スプレーの形態またはガス注入によ って、実施することができる。局所投与形態は、クリーム剤、軟膏類、ローショ ン剤、経皮装具類（例　従来のレザバーまたはマトリックスバッチタイプ）等で あることができる。

上記投与形態によって検討した処方および薬剤組成物は、従来法を用いて従来の 薬剤学的に許容できる賦形剤および添加剤によって調製できる。

現在、ｒＬ−４は、好適には静脈内経路によって投与される。投与すべき溶液は 、再構成凍結乾燥粉末類であり、それらは、さらに、保存剤、緩衝液、分散剤等 を含むことができる。

好適には、ＩＬ−４は、１０ミルモルのクエン酸緩衝液および保存剤を含まない 無菌水で１ミリリツトル当たり１００μｇを超えない最大濃度に再構成され、連 続点滴によってまたは静注によって投与される。連続点滴のために、１日投与量 は、正常生理食塩水５ｍｌに添加でき、そして、本溶液を機械的ポンプまたは重 力によって点滴できる。

哺乳類における好中球数増加に及ぼすＩＬ−４の効果は、下記の試着プロトコー ルによって決定できる。

図１に示したアミノ酸配列を有する　Ｅ、ｏｌｉ　由来ヒトＩＬ−４を、サイノ モロガスサルにおける１力月の研究で評価した。ＩＬ−４は、２．１０および２ ５μｇ／ｋｇ／日の投与量で、１日１回、静注投与した。サルの血液試料の血清 学的および臨床検査を投与前、投与時および投与終了１力月後の選択した時点で 行った。データは、クールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）Ｓ＋４血清分析機器［１ｍｍ 白球数］３よび手動による差分計測に由来した。図２に示した結果は、本発明に よってもたらされた好中球数の増加を示している。

ＩＬ−４による好中球の活性化は、下記の試験プロトコールによって示すことが できる。

立法 人、綴息Ω！腫：　ＩＬ−４（２５μｇ／ｋｇ）または賦形剤投与終了４週後の サイノモロガスサルから採取した全血または賦形剤を、６％デキストランによる 重力沈降に供し、低張生理食塩水またはＴｒｉｓ塩化アンモニウムによって交互 に溶解し、白血球を口取した。

、　ψ　：食作用アッセイは、ヒト血清３００μｍ、熱死滅酵母粒子（１０８Ｉ Ｉ／ｍｌ）を、約５Ｘ１０５個の単離白血球細胞を含有する１２ｘ７５ｍｍのポ リプロピレン試験管に添加することによって行った。インキュベーションは、３ ７”　Ｃ（７）ジャロロータリ（ｇｙｒｏｒｏｔａｒｙ）水浴中で９０分間行っ た。遠心分離後、細ｉ１１！懸濁物を０．４％トリパンブルーおよび０．２％エ オシンＹ生理食塩水溶液によって染色した。消化された酵母は無色のままであっ たが、未消化の酵母は紫色に染色され、食細胞の百分率とともに結合力（消化さ れた酵母の数）を正確に決定できた。これらのパラメータについて得られた平均 値をかけ算して、各サルの食作用インデックスを計算した。データは、５ｔｕｄ ｅｎｔ’ｓ’ｒテストによって解析し、ｒＬ−４処理サルの値を賦形剤のみを投 与された対照群サルのそれと比較した。結果を、表１に示した。

表１．１Ｌ−４停止４週後のサルから採取した末梢血白血球の食作用！Ｉ能ａ、 ＩＬ−４または賦形剤４週投与後４週の洗い出し期間をおいたサルから得られた 細胞。

ｂ、細胞１個当たりの平均酵母＝＃消化された酵母／各すルの細胞６ｏｌ′Ｉｌ ；計数細胞に基づいた平均上平均の標準偏差（ＳＥＭ）。

Ｃ０食作用百分率＝酵母消化細胞／総細胞の％ｄ１食作用インデックス＝平均酵 母／細胞ｘ％食細胞ｅ、サルの多値の平均上ＳＥＭ ｆ、Ｐ＜０．００２，５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ、対照群対ＩＬ−４ ｇ、Ｐ＜０．０１４，５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ、対照群対ＩＬ−４ ｑ工ＮＢエヱエ立工；上記のように単離後、サイノモロガスサルからの白血球を 、２％熱不活化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４００，２ｍｌ中に再懸 濁し、モして１２Ｘ７５ｍｍのポリプロピレン試験管に分配した。各試験管に対 して、ニトロブルーテト？ゾリウム（ＮＥＴ）の２％ＲＰＭＩ溶液２ｍｇ／ｍｌ 、２％ＲＰＭＩ中０，２５μＭストックの新鮮調製ホルボール１２−ミリスチン 醗１３−酢酸（ＰＭＡ）のＯ，１ｍｌを細胞に添加した。細胞懸濁物を３０分間 、３７″Ｃの水浴中でインキュベートした。インキュベーション後試験管を遠心 分離し、上清を細胞ベレットから除去した。細胞ベレットを３７″ｃで１時間乾 燥させ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で抽出した。ＤＭＦｌｍｌを 細胞ベレットに添加しポルテックス後、すぐに８５＠ｃで２０分間インキュベー トした。この試験管を遠心分離し、着色ＤＭＦを採取し、ＤＭＦブランクに対し て５６０ｎｍで分光光度計で分析した。全ての測定は、インキュベーション停止 後３０分以内に行った。

還元ＮＢＴ　（ＮＢＦ；μｇ／ｍｌ）の計算は、ＭＢＴストック溶液２ｍｇ／ｍ １の順次希釈液をワットマン濾紙にスポットし乾燥させ、これを用いて作製した 標準曲線から行った。標準曲線について、ＮＥＴは、１ｍＭアスコルビン酸の０ ゜２ＮａＯＨ溶液に暗所で２０分間室温で暴露することによって還元した。濾紙 層はＤＭＦで抽出し、５８０ｎｍで読みとった。ＮＢＦ／細胞の計算は、μｇ／ ｍ１のＮＢＦを試料１ｍｌ当たりの細胞数で割ることによって得、結果を表２に 示した。

表２　１．−４中止４週後のサルから採取した末梢血白血球のＮＢＴ還元によっ て測定した食作用機能 胆　Ｉ　Ｌ−４または賦形剤４週投与復４週の洗い出し期間をおいたサルから得 られた細胞。

ｂ４試料中ＮＢＦｔ１ｇ／ｍｌ／総細胞から計算した細胞１個当たりのＮＢＦｐ ｇ／細胞。アッセイ前にタークス（Ｔｕｒｋｓ）溶液を用いるヘマサイトメータ によって得られた細胞数。

Ｃ，サルの多値の平均±ＳＥＭ ｄ、Ｐ＜０．０２，５ｔｕｄｅｎｔ’　ａ　Ｔ　ｔｅｓｔ、対照群対Ｉ　Ｌ−４ 上記結果は、投与４週後にＩＬ−４処置サルから得られた白血球食作用インデッ クスが対照群動物から得られた白血球に対して有意に増加したことを示している 。この食作用インデックスの増加は、酵母消化細胞の百分率の増加によった。

ＩＬ−４投与後群からの細胞（細胞１ｍ当たりの感染酵母の数）の結合活性がわ ずかに増加した。細胞１個当たりのＮＢＦｐｇ／細胞として測定したＮＢＴ色素 還元応答は、賦形剤対照群群のサルからの細胞と比較して、ＩＬ〜４処理サルか ら採取した細胞で増加した。

これら２つのアッセイ、酵母細胞消化およびＮＢＴ色素還元は、食作用、および 感染剤の破壊をもたらす１連の事象に３いて重要な段階である代謝的変化（レス ビラトリバースト）の測定値である。両方のパラメータで得られた増加は、工Ｌ 　−４が食作用応答を増加させるかまたは増幅させることができることを示して Ｕ９３７は、Ｗ慢性組織球性白血病患者の悪性腫瘍細胞から確立された細胞系統 （ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）である［Ｓｕｎｓｔｏｒｍら、Ｉｎｔ、　ｊ、ｃａ ｎＣｅｒよユニ　５６５−５７７　（１９７６）１゜この細胞系統は、それが未 成熟単球であることを示唆する特性を示している。

ＨＬ−６０は、急性前骨ｆ１球臼血病の患者から得られた細胞系統（ＡＴＣＣＣ ＣＬ２４０）である。これらの細胞は、それが未成熟好中球であることを示唆す る特性を示す。

ＩＬ−４は、これらの２ｐ１の未成熟細胞の分化を誘発することができ、これは 、食作用機能の増加、食作用にとって代謝必須であるヘキソース（ｈｅｘａｓｅ ）１リン酸シヤント（ＮＢＴ還元）の活性化上昇、成熟好中球（ナフトールグロ 口アセテートエステラーゼ）または成熟単球（アルファナフチルアセテートエス テラーゼ）に特異的な色素を取り込むことができる細胞の百分率の増加および成 熟単球または成熟好中球のＦＡＣ３解析によって示される表面マーカー類が陽性 のｍ胞増加によって明らかとされる。

ＩＬ−４の骨髄性細胞の成熟に及ぼす効果は、下記の試験操作によって示すこと ができる。

ハマ゛へＮＢＴ　二　−−−１１°− レスビラトリバースト関連ヘキソース１リン酸シャント活性化の測定Ｍｕｌｌｅ ｒら、Ａｇｅｎｔｓ＆Ａｃｔｉｏｎｓ上上：　３８４　（１９８１）Ｂａｅｈｎ ｅｒら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、２ヱ旦：９７１　（１９６Ｂ）Ｓａｌｉ ｎおよびＭｃＣｏｒｄ、Ｊ、Ｃ１ｔｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｌｉ：　１００Ｕ−９３ ７およびＨＬ−６０細胞系統とともに使用するための標準化１．１Ｅ８細Ｉｌ！ ／ウエルアツセイに十分な橿的細胞の釣菌。ツルバール（Ｓｏｒｖａｌｌ）上で の１２００ｒｐｍ、５分間の遠心沈澱。

２、十分なＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ　（２％）中で細胞を増殖させ、０．２ｍｌ／ ウェルアッセイに一定量分割する。

３、細胞を、２４ウエル平底プレート中に０．２ｍｌ／ウェルで一定量分割する 。

４．２％の２０ｕＭ　ＰＭＡ　Ｏ，１ｍｌを（各ウェルに）添加する。

５．２％のＮＥＴ２ｍｇ／ｍｌ　Ｏ，１ｍｌを（各ウェルに）添加する。

６、プレートを３７”Ｃで３０分間インキュベートする７、細胞０．１ｍｌをす ぐに除去し、シャントンサイトスピン（ＳｈａｎｄｏｎＣｙｔｏｓｐｉｎ）を用 いて５分間、２００ｒｐｍで（低加速）遠心分離する。

８、シフ・クイック（Ｄｉｆ−Ｑｕｉｃｋ）システムで逆染色し、計数のために カバーをのせる。

上記に述べた酵母食作用アッセイは、また、同一方法論を用いて両方の細胞系統 に付いて行った。

ＰＭＮ　た　−ＡＳ−Ｄ　Ｃｌ０ｈ　−’：　＝　−ｆｌＹａｍら、Ａｍ、Ｊ、 Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈ、５５：　２８３　（１９７１）Ｌｌら、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃ ｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２１　：　ｌ　（１９７３）ＨＬ−６０細胞系統染 色のための標準化１、シャントンサイトスピンを用いて、２０Ｏｒｐｍ（低加速 ）で５分間、顕微鏡スライド上に１−５Ｅ５細胞を遠心分離する。

２、クエン酸−酢酸−ＭｅＯＨ固定液中でスライドを室温（Ｒ，Ｔ、　）で固定 する。

３、脱イオン（ｄ、ｉ、　）水で洗浄しそして２０分間乾燥する。

４、ＡＳ−Ｄ染色液中で３７°Ｃで３０分間、暗所でスライドを染色する。

５．３Ｘを脱イオン水で洗浄する。

６、酸ヘマトキシリン染色で５分間逆染色する。

７．３Ｘを脱イオン水で洗浄し、風乾し、カバーをのせる。

クエン酸−アセトン−ＭｅＯＨ固定； クエン酸濃縮物を脱衣温水で１：９に希釈する。

クエン酸溶液１８ｍ１、アセトン２７ｍ１．および無水ＭｅＣ）Ｈ（メタノール ）５ｍｌを添加する。

室温に保存する。

毎日調製。

ＡＳ−Ｄ染色 トリズマル（Ｔｒｉｚｍａｌ）６．３を脱イオン水で１−〇に希釈する。

希釈トリズマル６．３　５０ｍ１を３７＠Ｃまで温め、そして、ファーストコリ ンス（Ｆａｓｔ　Ｃｏｒｉｎｔｈ）Ｖ塩１カプセルの内容物を絶えず撹拌して添 加する。

塩が完全に溶解したとき、２＋ｎｌのナフトールＡＳ−Ｄクロロ酢酸溶液を添加 する。この溶液は、極めて濁フて見えるであろう。１−５−３０分撹拌を継続し 、コブリン瓶に添加する。ろ過はしない。

ＡＳ−Ｄ溶液： ナフトールＡＳ−Ｄクロロ酢酸エカプセル（２０ｍｇ＋を２ｍｌジメチルホルム アミド中に溶解する。使用直前に調製する。

シグマキット９Ｏ−ＡＳ−Ｄクロロ酢酸を使用する。

ヌークエＬ）　−パた　ア　−−、工　−ｍ−Ｙａｍら、Ａｍ、Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｐａｔｈ、５５：　２８３　（１９７１）Ｌｉら、Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃ ｙｔｏｃｈｅｍ、２上：　１　（１９７３）Ｕ　−９’３７細胞系絞染色のため の標準化１、シャントンサイトスピンを用いて、２００ｒｐｍ　（低加速）で５ 分間、顕微鏡スライド上に１−５Ｅ５細胞を遠心分離する。

２、クエン酸−アセトン−ＭｅＯＨ固定液中でスライドを室温（Ｒ，Ｔ、　）で 固定する。

３、精ｍｌ／脱イオン（ｄ、ｉ、　）水で洗浄し、２０分間風乾する。

４、ＮＥ染色液中で３７’Ｃで３０分間、暗所でスライドを染色する。

５．３ｘを精製／脱イオン水で洗浄する。

６、マイヤーズ（ＭａＶｅｒ’　Ｓ）ヘマトキシリンで５分間、室温で逆染色す る。

７、精製／脱イオン水で洗浄し、風乾し、カバーをのせる。

クエン酸−アセトン−ＭｅＯＨ固定： クエン酸濃縮物を精製／脱イオン水で１−〇に希釈する。

クエン酸溶液１８ｍ１、アセトン２７ｍ　ｌ、および無水Ｍｅｎ）（（メタノー ル）５ｍｌを添加する。

室温に保存する。

毎日Ｅｌｌ製する。

ＮＥ染色： トリズマル７．６（モノ［トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンコマレイ ン酸；７．６）を精製／脱イオン水で１＝９に希釈する。希釈トルズマル７゜６ を３７°Ｃに温め、そして、ファーストブルー（Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ）ＲＲ塩（ ４−ベンゾイルアミン−２，５−ジメトキシベンゼン−ジアゾニウムクロリドヘ ミ［塩化亜鉛〕塩）１カプセルの内容物を絶えず撹拌して添加する。塩が完全に 溶解したとき、２ｍｌのＮＥ温溶液添加する。この溶液は黄色で、わずかに濁っ ているであろう。１５．−２０分撹拌を継続し、そして、コブリン瓶に添加する 。

ろ過はしない。

ＮＥ温溶液 １カプセル（２０ｍｇ）のアルファナフチルアセテートを２ｍｌのエチレングリ コールモノメチルエーテルに溶解する。使用直前に調製する。

シグマキット９０−アルファナフチルアセテートを使用する。

Ｉ（Ｌ　−６０細胞およびＵ−９３７細胞を眉いる上記の操作の結果は、表３お よび４に記載する。

表３　Ｅ、ｃｏｌｉ　由来ＩＬ−４のＨＬ−８０細胞の機能および分化に及ぼす 影響 治療°　酵母／細胞１　食作用　食作用　ＢＦ　ＡＥＩ細胞・　インデックス１ Ｍ　２−１　４　１　２ 培地　、４１０．３　９＝５　２九１２　７九２　１−５Ｌ・４ ５０Ｕ／ｍｌ　、５１１．４Ｑ　２４５９　２５１４５９　３１３　２１３９５ Ｕ／ｍ！　、１１１．１ｈ１１４９　０７１３７１２　９１４９　６１６Ｑ．５ Ｕ／ｍｌ　、４１１５Ｇ　６１３９　Ｂ４１３８９　５１４９　３４３９２５Ｌ Ｉ７ｍｌ　、７４１．０　７１５　６ｚ２４”　６１４Ｑ　０１２９０２５　ｕ ／ｍｌ　、１ｊｏ、ｓ　５＋、６　５１１８　３１２　２１７ａ、ＨＬ−６０細 胞は、指定濃度のＩＬ−４またはＤＭＳＯ含有培地中で６日間インキュベートし た。

ｂ、　４つの別々の実験の平均±ＳＥＭ；平均酵母／数＝＃消化された酵母／細 胞３０個 Ｃ０食作用細胞の百分率；酵母消化細胞／総細胞の％Ｘｌ００　４つの異なる実 験の平均上ＳＥＭ ｄ０食作用・インデックス−平均酵母／数Ｘ％食作用細胞ｅ、ＮＢＴ陽性細胞／ 細胞１００個の％；４つの別々の実験の平均±ＳＥＭｆ、クロロアセテートエス テラーゼ酵素活性陽性細胞／細胞１００個の％；４つの別々の実験の平均±ＳＥ Ｍ ｇ、Ｐ＜＝０．０５；５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ；培地対ＩＬ−４処 理またはＤＭＳ○処理群 り、Ｐ＜＝１０；５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ；培地対ＩＬ−４処理ま たはＤＭＳＯ処理群 表４　Ｅ、ｃｏｌｉ　由来ＩＬ−４のＵ−９３７細胞の機能および分化に及ぼす 影響 丁　Ｙ　％　Ｐ　Ｎ　。

治療“　酵母／細胞“　食作用　食作用　ＢＦ　ＮＥＩ細胞１　インデックス− Ｍ　５０よ２　１５ｊ＋３　５　１ 培地　、３土、０４　土・５６土４ ２　２５±５ｇ５７土１５ｇ３　６ ５０Ｕ／ｍｌ　、５．２９　８ｉ７９　６ｊ７Ｇ２　２５±５ｇ６３土１７９　 ４　ｓ ５Ｕ／ｍｌ　、４出、２’ａ　１１１Ｇｌ　４１６Ｑ２　２０±３ｇ５１４１０ ９　３　５ ．５ＬＪ／ｒｎ１．５１２９　３１２Ｑ　４ｊ７ＧＩ零１土５ｈ４３±１４”　 ２　４ ２５Ｌｊ／ｍｌ　、９１．３９　６　６４１６±４　２８±８　２　２ ０２５Ｕ／ｍｌ　、７土、１９　７．２９　９４３ａ、Ｕ−９３７細胞は、指定 濃度のＩＬ−４またはＤＭＳＯ含有培地中で６日間インキュベートした。培養物 は第３日に供給した。

ｂ、平均酵母／数＝＃消化された酵母／細胞３０ｆｌ；４つの興なる実験の平均 上ＥＭ Ｃ１食作用細胞の％＝酵母消化細胞／ｌａ細胞の＃Ｘ１００；　４つの実験の平 均上ＥＭ ｄ１食作用インデックス−平均酵母／数ｘ％食作用細胞；４つの実験の平均±Ｓ ｅ、ＮＢＴ陽性細胞／ｍ胞１００個の％；４つの実験の平均±ＳＥＭｆ、ＮＥ酵 素活性陽性細胞／細胞１００個の％；４つの別々の実験の平均±ＳＥｇ、Ｐ＜＝ ０．０５；５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ；培地対ＩＬ−４処理またはＤ ＭＳＯ処理群 り、Ｐ＜＝、１０；５ｔｕｄｅｎｔ’　ｓ　Ｔ　ｔｅｓｔ、；培地対ＩＬ−４処 理またはＤＭＳＯ処理群 ４ΩはＨ狙ｆｉ立づに１へ肚１丞ぶ關は且１」］旦揖Ｊ工ＨＬ−６０およびＵ− ９３７細胞は、Ｔ−７５フラスコ中で３７６０でかつ５Ｌ−４（ｒｈｕＩＬ−４ ）、８−ＩＬＥ−１００２）または対照群とともにインキュベートした。細胞は 分裂し、第３日に供給した。第１．３および６日に、細胞を取り出し、ＲＰＭＩ １６４０で洗浄し、かつヒト加熱凝集ＩｇＧでプロ・ツクし潜在的Ｆｃ干渉を低 下させた。再度ＲＰＭ１１６４０で洗浄後、細胞を５０μｍの希釈抗体（下記の モノクローナル抗体一覧の表を参照）に再！！濁しそして水上で３０分インキュ ベートした。細胞を次にＰＢＳで洗浄し、１００μｍの希釈ＦＩＴＣ結合ヤギ抗 マウスＩｇＧまたはＩｇＧ２ｂに再懸濁し、そして、氷上で３０分インキュベー トシた。第２抗体とインキ、Ｚベーション後、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し２次に １．　ｍ　１のＰＢＳ中に再懸濁し、ベクトンデイキンソン（Ｂｅａｋｉｒｏｎ 　Ｄｉ、ｃｋｓｏｎ）ＦＡＣＳｃａｎで操作し、細胞蛍光解析を行った。マウス ＩｇＧｚｈおよびＩｇＧ１のためのアイソタイプ対照群および第２抗体対照群に ついでも行い、本質的（ｃｏｎｓｔｊｔｕａｔｉｖｅ）発現レベルを上回る陽性 細胞の増加を調べた（すなオ〕ち、発現増強のＨ，、−４！１導）。

モノクローナル抗体一覧 特異性 ＷＥＭＧｌ　１　ｍｕｌｇＧＩ　ＵＮＫ、　ｇｐ　１１０：顆粒球 ＦＭＣ３２ｍｕｌｇＧＩ　ＵＮＫ。

骨髄単球 ＯＫＭ・１　ｍＬＩＩ（ｌＧ２ｂＣＤ　１１　ｂ　ＣＲ−３抗−Ｌｅｕ　Ｍ５　 ｍｕ１ｇＧ２ｂ　ＣＤＩ　ＩＣａ　ｃｈａｉｎ（ｇｐ　１５０− 抗−ＣＲ−１ｍｕｌｇＧＩ　ＣＤ３５　Ｃ３ｂ、　ＣＲ−抗−Ｌｅｕ　Ｍ３　ｍ ｕ１ｇＧ２ｂＣＤ１４単球 上記ＦＡＣＳ解析の結果は、図３および図４に示した。

ｈ五エシニ土呈現ブース主上且菫１工り二旦玉１上２上旦又１ユ辺璽東プラスミ ドｐＳＲα−ＣＡＴ１９６．ｐｃＤ１３７、ｐｃＤ−８Ｒα２０５、ｐｅＤｈＩ Ｌ−４クローン１２５およびｐｃＤ−５Ｒα２２４の構築は記載されている（Ｔ ａｋａｂｅら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ、旦：４６６−４７７　（１９８Ｂ）；およびＹＯｋＯｔＯら、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：５８９４−５８９８　（１９８６ン 。図１に示したように、プラスミドｐｃＤ−５Ｒα２０５は、ｐＳＲα−〇ＡＴ １９６由来３７３ｂｐのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ　ＳＲαプロモータ、ｐｃＴ１３７ 由来４３４ｂｐのＸｈｏｌ−５ｓｔｌスプライス部位（ＳＪ）および５゛マウヌ ＩＬ−４（ｍＩＬ−４）断片、および同様にｐｃＤ１３７由来４３４ｂｐＸｈｏ 　Ｉ　−３ｓ　ｔ　Ｉ　ＳＲａスプライス部位（ＳＪ）および５７マウスＩＬ− ４（ｍＩＬ−４）断片、および、３゛マウスＩＬ−４ｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリア デニル化領域および複製開始部およびアンピシリン耐性遺伝子含有ｐＢＲ３２２ 由来プラスミド骨格を含有する同様にｐＣＤ１３７由来３２１ｂｐ　５ｓｔＩ− Ｎｃａｌ断片の３分子連結によって構築された。Ｇ−Ｃティルは、下記のように ｐＣＤ−ｈＩＬ−４クローン４６から欠失していた（Ｙｏｋｏｔｏら、Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：５８９４−５８９８）。オカヤマ ーバーグブラスミドｐＬ１　（ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａ。

ｒ　ａｎｃｌ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、旦：　２８０−２８９　（ １９８３）はＰｓｔＩによって制限切断され、そして、４個のヌクレオチドオー バハングは、Ｔ４ポリメラーゼの３’−５’エクソヌクレアーゼ活性によって除 去された。ＢｇＩＩｌリンカ−は平滑ＤＮＡ末端に連結後、Ｂｇｌｌ＋およびＨ ｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌによる制限切断を行った。ｐＬｌのＳＶ４０配列含有Ｈｉ　 ｎ　ｄ　ＩＩＩ　Ｂ　ｇ　Ｉ［Ｉ断片を単離し、ＢｇＩＩＩ／Ｈｉｎｄｌｌ制限 切断ｐｃＤ−ＭＣＧＦ　（Ｙｏｋｏｔｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ、旦旦：１０７０−１０７４　（１９８４））に挿入し、中間体プ ラスミド１０１を得た。プラスミドｐｃＤ−ｈＩＬ−４クローン４６由来精製し た３１１ｂｐのＰｓｔ断片は、５ａｕ３Ａ−Ｉで制限切断され、これは、Ｂｇ■ と共存するオーバーハングを有するｔａ３ｂｐ断片を放出する。１６２ｂｐ断片 は、８ｇ１１Ｔ制限ｐ１０１に連結され、中間体１１２を得た。

このＳＶ４０およびヒトＩＬ−４ｃＤＮＡ配列類を含有するｐ１１２のＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片をＨＬｎｄｌｌｌ／Ｎｈｅｒ制限りｌ：Ｉ−ン４６ＤＮＡ に連結し、ＳＶ４０初期プロモータ、ＳＶ４０スプライス部位およびＧ−Ｃティ ルを欠失した完全ヒトＩ　Ｌ　−４ｃ　Ｄ　ＮＡを含有するｐｃＤ−ｈＩＬ−４ クローン１２５を生成した。プラスミドＩ）ＣＤ−８ｒａ２２４は、（ＳＪおよ びｍＩＫ−４ｃＤＮＡを含有する）　ｐｃＤ−５Ｒα２０５の小さいＸｈｏＩ断 片を、上記のようにＳＪおよびＧ−Ｃテイル欠失ＨＩＬ−４ｃＤＮＡ含有ｐｃＤ ｈＩＬ−４クロ＝ン１２５の小さいＸｈｏＩ断片で置換することによって、構築 した。

５ｉ１１に示したように、Ｓａｌ　ｒ部位は、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限切断 、前特表十、１−５ｏ６２９ａ　（ｓ″） リンカ−への結合によって、ｌ）ＭＴＶｄｈ、ｆｒに導入した（Ｌｅｅら、Ｎａ ｔｕｒｅ、２９４＋２２８−２３２　（１９８１））。プラスミドｐＭＴＶｄｈ ｆｒ２５９は、したがって、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を欠失し、 前記２つの間の領域を５ａｌＩリンカ−によって置換する。Ｓｒαプロモータ、 ５Ｖ４０ＳＪ、ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル類 を含有するｐｃＤ−３Ｒａ２２４の小さい５ａｌｌ断片をｐＭＴＶｄｈｆｒ２５ ９の唯一のＳａｌ１部位に挿入した。最終的ヒトＩＬ−４発現プラスミド、ｐｄ ｈｆｒ−Ｓ　Ｒａ　１　ｐ　ｈ　ａ　２６３は、下記の要素をＳａｌ　１部位か ら時計と逆回りに含有している二 １、ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子および複製開始点２．１）ＭＴＶ ｄｈｆｒ由来ＭＭＴＶ　ＬＴＲ駆動ｄｈｆｒ発現単位３、ＳＲアルファプロモー タ ４．５Ｖ４０由来スプライス部位 ５、ヒトＩＬ−４ｃＤＮＡ ６、ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル。

ベクター中に存在するヒトＩＬ−４ｃＤＮＡ配列は、Ｙｏ　ｋｏ　ｔ　ｏら、Ｐ ｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　旦ｌ：　５８９４−５８９８　（ Ｌ９８６））に記載のｐｃＤ−ＨＩＬ−４クローン４６中のものと同一である。

ＤＨＦＲ’　”　ＩＬ−４１ ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞変異 株（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ”）は、種々の組換えタンパク質類の過剰産生のために広 く用いられている。（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ］ 。

１ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５−：１７５０−１７５９　（１９８５））ｏ　 ＣＨＯ−ｄ　ｈｆ　ｒ−変異細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン に対する栄養要求性を有している。ｄｈｆｒマーカーを組み込んだ発現ベクター 類は、この変異を補償するために使用できる。選択は、上述の必要培地補因子不 在下において細胞を増殖させることによって達成する。遺伝子増幅（１００ＯＸ までのコピー数増加〕は、増加濃度の葉酸アナログメソトレキセート（Ｍｒｘ＞ 中で細胞を増殖させることによって、達成できる。組み込まれた組換えｄｈｆｒ 座のゲノム中における増幅は、問題の遺伝子の発現単位のコピー数を同時に増加 させる結果となる（Ｒｉｎｇｈｏｌｄら、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ、ｄｈｆｒおよびヒトＩＬ−４のコード配列（ｐｄｈｆｒ−３Ｒα２ ６３）含有プラスミドＤ’ＮＡは、上記のようにして構築した。ｐｄｈｆｒ−３ Ｒα２６３のＤＸＢ−ＩＩ　ＣＨＯ−ｄｈｇｒ−細胞系への移入は、リン酸カル シウム沈澱法によって行った。（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ。

且：５４６　（１９７Ｂ））ｏ形質転換体は、ヒボキサンチンおよびチミジンを 欠失している選択培地（ＤＨＥＭ、ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ”Ｓ）改良イ ーグル（Ｅａｇｌｅ’　Ｓ）培地）中で選択した。３Ｂ１２と指定されたクロー ンを、増幅の第１サイクルで選択した。この３Ｂ１２クローンは、４０ｎＭのＭ ＴＸ含有α−ＭＥＭ培地（イーグル最小必須培地）中で、耐性クローンを選択す るまで培養した。３Ｂ１２−Ａ２６と指定されたクローンは、さらにＭＴＸ　１ ／１Ｍで増幅するために使用した。薬剤選択の第２サイクル後、３Ｂ１２−Ａ２ ６−１９と指定されたクローンを、さらに展開させるために選択した。このクロ ーンは、１０％ＮＵ血清Ｖによる懸濁様式による増殖に適応させ、ＩＬ−４ＳＩ と指定されたサブクローンを大量繁殖のために選択した。

瓜ｌ惣訓ｌ マスターセルバンクＣＭＣＢ）調製のため、ＩＬ−４３１細胞を含有する２個の オリジナルスピナーフラスコを使用した。細胞を、さらに、２回、増殖培地交換 して継代し、１０．０ｍｌのスピナーフラスコ中で増殖させた（増殖培地は、基 本培地プラス０ないし１０％血清、例　ＮＵ血清Ｖ）。各フラスコの細胞を回収 し、洗浄し、１０ｍ１の凍結培地に再懸濁し、プールし、そして、約２．０ｍｌ の無菌細胞保存バイアルに無菌的に入れた（凍結培地は、基本培地プラス２０％ 血清であり、例　ＮＵ血清Ｖプラス１０％ジメチルスルホキシド）。このバイア ルを、−７０”Ｃでゆっくりと凍結させ、そして、液体窒素中に保存した。

３つの凍結バイアルからの細胞類を融解し、４乃至６世代にわたって１００ｍ１ から３リツトルまでの容量が増大するスピナーフラスコ中の増殖培地に懸濁させ 繁殖させた。細胞は遠心分離によって採取し、洗浄、そして、凍結培地に再懸濁 させた。細胞懸濁物を約２．０ｍｌの無菌細胞保存バイアル中に無菌的に入れた 。バイアルを一７０’Ｃでゆっくりを凍結させ、液体窒素中に保存し、マスター セルバンク（ＭＣＢ）を構成した。

マスターワーキングセルバンク（ＭＷＣＢ）は、１乃至３個のＭＣＢバイアルを 融解し、Ｔフラスコ中でかつ懸濁物として４乃至６世代にわたって３リツトルま で増加性容量で細胞を繁殖させることによって、Ｍ’ＣＢから調製した。細胞を 回収し、洗浄し、凍結培地中に再懸濁し、そして、一定分量に分割しＭＣＢにつ いて記載のように凍結した。ＭＷＣＢも同様に液体窒素中に保存した。

ＩＬ−４産生は、容量５０乃至２００リツトルのバイオリアクター中で行った。

産生開始のため、ＭＷＣＢからの１凍結バイアルを融解し、Ｔ−７５フラスコに 接種した。細胞１度が１００％コンフルエンシー（集密）に到達するまでインキ ュベーションし、細胞をトリプシン処理し、そして、２個のＴ−７５フラスコ中 に接種した（Ｔ−６０フラスコも適宜使用できる）。これらのフラスコは、１０ ０％コンフルエンシーになるまで再度インキュベートし、そして、トリプシン処 理細胞を用いて１００ｍ１スピナーフラスコに接種した。

この１００ｍ１スピナーフラスコを適当な細胞増殖が得られるまでインキユベー トシて、２５０ｍ１スピナフラスコのための接種物として使用した。同様の段階 を〕リットルおよび３リツトルフラスコ中で、かつ、１０乃至２０リツトルのバ イオリアクター中で繰り返した。１０乃至２０リツトルリアクターからの細胞を 接種物として５０乃至１００リツトルのりアクタ−のために使用した。このリア クターは当初バッチ処理で増殖させ、適当な細胞濃度に到達後、連続培地潅流を 開始した。

増殖および連続潅流のために使用した培地は改良イソコープ（工５ｃｏｖｅ’Ｓ ）培地であり、それには１０％まで（例　ＮＵ血清■）添加できる。メソトレキ セートは、産生工程を通して全く使用しなかった。

発酵段階は、無菌条件でかつ閉鎮系で行った。温度、　ｐＨ＋撹拌および通気の ような重要発酵パラメータ類を、増殖および連続漏流段階を通してモニターし適 当に制御した。無菌試料を定期的に取り出し、ｐＨ，細胞密度を測定し、かつ、 無菌性を検査した（細菌および真菌の不在）。

適当な容量の調製培地（潅ｆｆ１）を採取後、培養液をろ過し存在する全ての細 胞を取り出し、限外ろ過によって濃縮した。濃縮物は粗ＣＨＯＩＬ−４を含有し ており、最終精製段階に供した。

ＩＬ〜４の粗ＣＨＯＩＬ−４濃縮物からの精製は、スルホン酸カラム（Ｓ−セフ ァロース）による陽イオン交換クロマトグラフィによって行った。この段階は通 常繰り返した。スルホン酸カラムから選択したプール分画を次にキレートクロマ トグラフィ段階（例　コバルトキレートセファロース）に供した。この選択した プールキレート分画を次に２回ろ過し、メンブレンろ過によって濃縮した。

この濃縮をゲルろ過カラム（例　ＨＲＳ−２００）でクロマトグラフィにがけた 。精製バルクＩＬ−４を構成するプール分画を次にろ過し、−２０６Ｃ以下で保 存した。

このような活性組換えヒトＩＬ−４の粗ＣＨＯ〜ＩＬｉ縮物を精製する工程は、 （ａ）ａｃＨｏ細胞培地からの活性ＩＬ−４の緩衝粗溶液を中性近辺かられずか にアルカリ性のｐＨで陽イオン交換クロマトグラフィに供し、選択的にｒ　Ｌ− ４を結合させ、そして、イソクラティカリにＩＬ−４を溶出する。

（ｂ）段階（ａ）からの溶出物を、さらに、実質的に小さなカラム（段階（ａ） のベッドボリュームの１５％）による陽イオン交換クロマトグラフィに中性近辺 かられずかにアルカリ性のｐＨで供し、ＩＬ−４を勾配溶出する；（Ｃ）段階（ ｂ）からの溶出物をキレートアガロースゲルカラム系によるアフィニティクロマ トグラフィに中性近辺かられずかにアルカリ性のｐＨで供し、酸性緩衝液でＩＬ −４を溶出する； （ｄ）段階（Ｃ）からの溶出物を限外ろ過膜（１０，０００分子量をカットオフ とする）によって濃縮する；および （ｅ）段階（ｄ）からの活性ＩＬ−４の濃縮溶液をサイズ排除カラムによるゲル ろ過クロマトグラフィに酸性ｐＨで供し、精製ＩＬ−４溶液を採取する。

陽イオン交換クロマトグラフィは、ＣＨ○細胞培地をろ過して、外来性の大細胞 残渣を除去後、透析ろ過膜により１００ｍｇ／ｍｌタンパク質まで濃縮した後、 ２段階で行い、ｐＨはｐＨ７，１−７，３に、好適には７．２にそれぞれ調節す る。この膜は、好適には、１０．０００分子量未満の全ての材１４順を保持する たとえば米国、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社、ＹＭ−Ｎｏ膜またはマサチューセ ッツ州、ブラッドフォード、ミリポア（Ｍｉ　１１１ｐｏｒｅ）社、ベリコン（ Ｐｅ１１１ｃｏｎ）フィルターＰＴＧＣカセットのような膜を付属した撹拌セル である。第１段階において、粗培地を、先に中性近辺かられずかにアルカリ性ｐ Ｈの、すなわちりＨｅ、７−８で好適には７．２で、０．１２Ｍ　塩化ナトリウ ム含有リン酸緩衝液で平衡にしたＳ−セファロースファーストフローのような陽 イオン交換クロマトグラフィカラムにのせた（レジン１ｍｌ当たり１００ｍｇの タンパク質まで゛）。これによって、活性ＩＬ−４がカラムに残存し、はとんど の望ましくないタンパク質類および他の不純物が洗い出されることになる。この 活性ＩＬ−４をイソクラティカリにカラムから、好適にはｐＨ７，１−７，３の 、特にｐＨ７，２でかつ２０ｍＭ　リン酸ナトリウムおよび約０．２６Ｍ塩化ナ トリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で溶出する。活性ＩＬ−４を含有す る分画は、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定し、プール し、かつ、このプールをｐＨ７，２および１４ｍ５に調整する。

第２段階において、この第１段階からの１ｌｌＷプールを実質的に小型の（段階 ｌのベッドボリュームの１５％）リン酸緩衝液で平衡にした陽イオン交換クロマ トグラフィカラムにのせ、不純物を洗い出し、活性ＩＬ−４をカラムに残す。こ の活性ＩＬ−４は、ベッドボリューム当たり１．７５ｍ５の塩化ナトリウム勾配 で溶出する。溶出緩衝液は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２，０，１２ Ｍ塩化ナトリウムの低塩緩衝液および２０ｍＭ　リン酸ナトリウム、０．５０Ｍ 塩化ナトリウムの高塩！ｌａ液からなる。活性ＩＬ−４を含有する勾配分画を５ ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定し、プールし、このプー ルをｐＨ７，２および４５４５−５Ｏに調整する。

陽イオン交換グロマトグラフィ由来約８０−７０％純度の活性ＩＬ−４分画プー ルを、次に、キレートセファロースファーストフローまたはキレートセファロー ス６Ｂのような金属処理キレートセファロースゲルによってｗ／４１１シた金属 キレートアガロースゲルカラムによるアフィニティクロマトグラフィに供する。

このキレートカラムは、１本のカラム内で２つの部分からなる。カラム先端部分 は、カラム先端にのせ、そして、溶液フロースルーがカラム下端に流出するに至 り、リウム含有２０ｍＭ　ｐＨ６，０のＮａリン酸緩衝液、および第２の緩衝液 は、材料類は、架橋デキストランゲルであるセファデックス類（ファルマシア（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））である。好適には、活性ＩＬ−４溶液を先に１０ｍＭク エン酸緩衝液ｐＨ４，５で平衡にしたＳ−２００ＨＲカラムにのせる。

より好適な態様は、 （ａ）ＣＨＯＨ１胞培地からの活性組換えヒトＩＬ−４の緩衝粗溶液を、１３− １５ｍＳの０．１２Ｍ　塩化ナトリウム２０ｍＭリン酸緩衝液、ｌ（８，７乃至 ８、好適にはｐＨ７，２中で架橋アガロースゲルカラム（好適にはＳ−セファロ ースファーストフロー）による陽イオン交換クロマトグラフィに供し、次に、イ ソクラティカリにＩＬ−４を本カラムから０．２６Ｍ塩化ナトリウム含有好適に はｐＨ７，２（１）ｐＨ７，１乃至ｐＨ７，３の２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出し 、活性工Ｌ−４分画を採取する。

（ｂ）段階（ａ）からのＩＬ−４溶液を、さらに、段階（ａ）で使用した架橋ア ガロースゲルカラムと同一タイプであるがしかし段階（ａ）で使用したカラムの １５％のベッドボリュームを有する陽イオンクロマトグラフィにｐＨ７，２−７ ゜５で好適には７．２で０．１２Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液にもう一度供し、 次に、０．１２Ｍ乃至０．５０Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ７，２の２０ｍＭリン 酸緩衝液で勾配溶出し、そして、活性ＩＬ−４分画をプールする；（ｃ）段階（ ｂ）からのプールした活性ＩＬ−４を、ｐＨ７，２で、好適には上端がコバルト キレートセファロースファーストフロまたは６Ｂゲルからなり下端が未処理キレ ートセファロースファーストフローゲルからなる金属キレートアガ容量の未処理 キレートセファロースに対するコバルト処理キレートセファロースで約２．３− ３．０容量であり、平衡緩衝液で洗浄し、次に活性ＩＬ−４を０゜５Ｍ塩化ナト リウム含有ｐＨ６，０のリン酸！ｌ衝液で溶出し、そして４分画を採取すること ；および （ｄ）段階（ｃ）からのＩＬ−４分画（プールした）を、１０，０００分子量以 上の全ての物質を保持し好適にはＹＭ−１０のようなメンブレンを付属した撹拌 セル上である限外ろ過膜上でｐＨ４，５の２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮透析ろ過し、 次にこの活性ＩＬ−４濃縮物をアリルデキストランおよびＮ、　Ｎ”−メチレン ビスアクリルアミド架橋共重合体、好適にはｐＨ４，５の１０ｍＭクエン酸すｌ ・リウム中セファクリルＳ−２００ＨＲであるカラムで、分子量に従ってタンパ ク質溶液を分画するカラムによるサイズ排除クロマトグラフィに供し、そして、 活性４分画を回収すること。

段階（ａ）および段階（ｂ）において、分画のｐＨをｐＨ７，２に、そして伝導 度を４Ｍ　ＮａＣ１で１３−１５ｍＳに調節する。２種の陽イオン交換カラムの ベッドボリューム比は、段階（ａ）のＳ−セファロースカラムの約６．３容Ｉと 段階（ｂ）の陽イオン交換カラムの１容量である。クロマトグラフィカラム中の この陽イオン交換ゲル材料は、０．１２Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ７，２の２０ ｍＭリン酸緩衝液で平衡にする。好適な陽イオン交換体は、ファルマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）から入手可能なＳ−セファロースファーストフローのような− ＣＨ２−３ｏ、−Ｎａ÷基で置換された架橋アガロースである。この活性ＩＬ− ４をイソクラティカリに段階（ａ）で０．２６Ｍ　ＮａＣ１を含有するｐＨ７， ２の２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出する。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッ セイで最高濃度の活性４を有する分画をプールする。このプール分画溶液をｐＨ ７゜２に調節し、伝導度をｐＨ７，２のリン酸ナトリウム２０ｍＭで１ベツドボ リユーム当たり１．３−１５ｍ５に調節する。このカラムに次にＩＬ−４溶液を のせ、０．１２−０．５０Ｍ　ＮａＣ１含有ｐＨ７，２の２０ｍＭ　リン酸ナト リウム緩衝液で１．７５ｍ５勾配を用いて溶出する。５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタ ンパク質アッセイで決定した採取したＩＬ−４含有分画をプールする。陽イオン 交換クロマトグラフィの条件を選択し、活性ＩＬ−４分画が陽イオン交換マトリ ックスに付着するように確保する。陽イオン交換クロマトグラフィにと７ては実 質的に高い中性に近いｐＨ７，２および陰イオン交換クロマトグラフィにとって は実質的に高い１３−１５ｍＳの伝導度によって、はとんどの不純物がカラムに 結合しない緩和な結合条件が生じ、溶出は実質的に容易で、かつ高純度のＩＬ− ４溶液が、すなわち、約６０％−７０％の溶液が得られる。

段階（Ｃ）で使用した好適な金属キレートアガロースはキレートセファロース特 表平４−・５０６２９９　（１０） ７０−ス１ｌｌｉ；ｔ、　＝ニーシャーシー、Ｐｉ　ｓｃａｔａｗａｙ、ファル マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の製品である。本発明の用途のための好適なコバ ルトキレートセファロースカラムを調整するための好適な方法は、セファロース ゲルを０．０２Ｍコバルトアセテート溶液に懸濁し、脱イオン水で洗浄し、次に 、ｐｉ−１７，２の２０Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ　ＮａＣ１溶液のような 平衡緩衝液でカラムを溶出することによる。コバルトアセテートの代わりに、た とえばコバルトクロリドまたはコバルトサルフェートのような他のコバルト塩も 使用できる。

このクロマトグラフィカラムは２層を含有する１本のカラムからなり、第１また は上層は金属キレートセファロースゲルからなり、第２または下端は金属塩によ って処理されていないキレートセファロースゲルからなる。２重カラム内の容量 比は、未処理キレートセファロースゲル１容量に対して金属処理キレートセファ ロースゲル約２．３ないし３．０容量である。

カラム平衡のために使用した好適な緩衝液は、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ ７゜２−７．５の０．０２Ｍリン酸緩衝液である。

段階（Ｃ）において、コバルトキレートセファロースゲルおよび未処理キレート セファロースゲルを０．５Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ７，２のリン酸緩衝液で平 衡にし、次に、吸着した活性ＩＬ−４をイソクラティカリにコバルトキレートセ ファロースから未処理キレートセファロースゲルに０．５Ｍ塩化ナトリウム含有 ｐＨ８，０（Ｄｏ、０２Ｍリン酸緩衝液または０．５Ｍ　ＮａＣ１含有中性ｐＨ の緩衝液で溶出し、および（ｉ）５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン４酢 酸）、または（Ｌｉ）５０ｍＭイミダゾールのようなヒスチジンアナログ、また は（ｉｉｉ）５０ｍＭヒスチジンのようなアミノ酸で。好適であるのは、０．５ ＭＮａｃ１含有ｐＨ６，０のリン酸緩衝液である。活性ＩＬ−４含有溶出物を採 取する。従来の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイに基づき最大濃度の 活性ＩＬ−４の分画をプールした。

段階（ｄ）において、段１ｌ１１（ｃ）からのプールした溶出分画を濃縮透析ろ 過し、ゲルろ過クロマトグラフィに供した。溶出分画を、１０．０００分子量以 上の全ての物質を保持する撹拌セルで濃縮し、Ｏ，、ｏ５１ｄ　ＥＤＴＡ（エチ レンジアミＨ６，０に対して最初に透析ろ過し、次にｐＨ４４，５の０．０１Ｍ クエン酸ナトリウムに対して透析ろ過する。本工程のこの段階では活性ＩＬ−４ ｉｇ液が約９０−９５％純粋であるので、それは濃縮溶液として膜上部に保持さ れる。好適な膜は、米国アミコン社製造ＹＭ−１０である。得られた濃度は、活 性ＩＬ−４約２０ｍｇ／ｍｌである。活性ＩＬ−４の濡ｌｌＩ溶出物を、分子量 によってタンパク質溶液を分画するサイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィに のせる。適切な典型的カラムは、セファクリルＳ−２００ＨＲまたはＳ−１００ ＨＲ（ファルマシア）ゲルろ過カラムである。セファクリルＳ−２００ＨＲ（高 分解能）およびＳ−１００ＨＲは、アリルデキストランおよびＮ、　Ｎ’−メチ レンビスアクリルアミド架橋共重合体である。それらの分画範囲は、それぞれ、 ５，０００−２５０，０００および１，０００−１００．’　０００である。他 の適切な物質は、架橋デキストランゲルであるセファデックスＩｔ（ファルマシ ア）である。好適には１、活性ＩＬ−４の溶液を、先に１０ｍＭクエン酸ナトリ ウム緩衝液ｐＨ４，５で平衡にしたＳ−２００ＨＲカラムにのせる。段階（ｄ） の条件下で、安定なＩＬ−４濃縮物は、２０ｍｇ／ｍＬに達することができる。

これによって、ゲルろ過クロマトグラフィの能力および特性が向上する。５ＤＳ −ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定した最大濃度の活性ＩＬ−４ 含有溶出物分画を採取し、プール後、９５−９９％純粋な活性ＩＬ−４溶液を得 る。

上記の参考文献は、本文で、ｈ　Ｉ　Ｌ−４のためのＣＨＯ発現系の構築に使用 した物質および方法のそれらの対応する教示のために本文で引用した。

人１１１１１ヱーユＡユＩＬ虫米　ＩＬ−４’　五Ｍ近Ａ２旦上ユ↓−４−”Ｒ ｑ工１玉１ニュユ辺１】ヒトＩＬ−４発現プラスミドｐＡＨ３，ｐＫ、ＧＴ２６ ９−２およびＰＵＣ１９の構築については、これまで記載されている。Ｌｕｎｄ ｅｌ　１ら、Ｊ、Ｉｎ、ｄ、　。

Ｍｉｅｒｏｂｊ、ｏｌｏｇｙ、１９８９およびＹａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、 Ｇｅｎｅ、１３’　１０３−１１９．１９８５゜ｐＲＧＴ８５７−１１を構築す るために、ｐＡＨ３を制限エンドヌグレアーゼＡｖａｒによって消化した。本酵 素によって作製された５°オーバハングば、Ｅ、ｃｏｌｉＰｏｌＴのフレノウ断 片にｉ領域を有する５、８キロベース（ＫＢ）の断片を、複製のｐ　Ｕ　Ｃ開始 点を有するＩＩ）ＵＣｌ３の１．４ＫＢ　Ｐｖｕｌｌ−ＰｖｕＩ断片に連結した 。Ｅ、ｃｏｌｉ２９４の形質転換後、複製の１）ＵＣ開始点を有するアンピシリ ン耐性ＩＬ−４発現プラスミドのひとつは、図２に示したようにｐＲＧＴ８３９ −２であった。

ｐＲＧＴ８３９−２およびｐＫＧＴ２６９−２は、次に、Ａ　ａ　ｔ　ＴＩおよ びＰｖｕＩの両方によって消化した。ＩＬ−４および１ａｃｉ領域を有するｐＲ ＧＴ８３９−２の６．７ＫＢ断片を、クロラムフェニコール耐性をコードするｐ ＫＧＴ２６９−２の小さなＩＫ、Ｂ断片に連結した。この連結反応は、Ｅ、ｃｏ ｌｉ２９４を形質転換するために用いた。結果として生成した形質転換体のひと つは、ｐＲＧＴ８５７−１１であった。図２に示したように、このＩＬ−４発現 プラスミドは、複製のｐＵＣ開始点とクロラムフェニコール耐性を有している。

このブラヒトＩＬ−４産生のために使用したプラスミドｐＲＧＴ８５７−１１を 有する宿主生体は、１２立旦上１Ｋ−１２である。この株は、１２旦立よｉ　Ｒ Ｌ　７３２１であり、先にＢｏｌｉｖａｒらによって、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２４５−２６７　（Ｒａｙ　Ｗｕ著）、Ａｃａ ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓｌ　１９７９に記載の１２旦旦１１ＭＭ２９４の誘導体で ある。この株は、ＥＫＩ宿主に対して確立されたガイドラインに適合している。

ｌ工１立上工ＲＬ７３２１を１２立立よ１ＭＭ２９４から下記のようにして単離 した。

Ｅ、ｃｏｌｉＭＭ２９４のストレプトマイシン耐性形態は、１２立立１ユ２９４ Ｓと指定されており、これは、最初に先の株を、ミニ」トユユｊＰＡＭｉ８３［ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂ、Ｆ、１９７７、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　１）Ｋ−１２および ３株微細構造のマツピングおよびその中でのイオン変異を抑制する変異の特性。

Ｇｅｎｅ、Ｒｅｓ、、３０：２７３−８６１で増殖させたバクレイオフ７一ジＰ １ｃｍ１．ｃｉｒｌｏｏ中に形質導入することによって単離した［Ｍｉｌｌｅｒ 。

Ｊ、Ｈ，，１９７２，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｌ工立立土ユ２９４ｓは紫外線で突然変異を誘起し、外膜構造に欠損がある株を 単離した。細胞をＵＶ灯で４０秒間照射した。この処理によって９９．９％の細 胞が死減し、これは、高含量培地に接種することによって決定した。突然変異Ｍ 発細胞懸濁物を希釈し、暗所でしんとぅしながら３時間、３７°Ｃでインキュベ ートした。

この時点で、Ｔ７野生型バクレリオファージを１ｍｌ当たり１０８プラーク形成 単位になるまで添加した。バクテリオファージＴ７は、その外膜内に変異を誘発 するｌ！Ｅ′ｒＩＭを高含量とするための選択として使用した。Ｔ７レセブター は外膜タンパク質であるリポポリサッカライド上にあるので、一部の外膜変異は 、Ｔ７感染に対する耐性となって現れるであろう。野生型外膜を有する細胞は、 ＠染に対して感受性であろうし、したがって、′殺細胞されなければならない。

下記に述べる漏出性の表現形は、外１１［Ｑ透過性上昇による。バクテリオファ ージエフ耐性の外膜損傷の指標としての使用は、これまでに示されている［Ｂｒ ａｎｅｓら、Ｊ。

ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、よ旦４：１４６２−１４６６．１９８３］。

Ｔ７感染後、細胞溶解が観察されるまでフラスコを３７’Ｃでしんとぅした（約 ３０分）。Ｔ７耐性細胞は遠心分離によって採取し、１ｍｌの新鮮培地に再懸濁 した。これらの細胞を、ＴＹＥ（）リブトン：酵母抽出物：塩化ナトリウム＠２ ０：　１０　：　５）寒天プレート上に接種し、３７°Ｃで一晩インキユベート した。２４時間後、各プレートは３０−５０のコロニーを含有していた。これら のコロニーは、外膜損傷のためであった。ひとつの方法は、培地へのＲＮａｓｅ 漏出増加を観察することであった。Ｔ７バクレリオフアージ耐性クローンの単一 コロニー類に対して、ｐＨ７の１％酵母ＲＮＡ　（シグマ社）含有ＴＹＥ寒天４ ｍｌに重層した新鮮ＴＹＥ寒天寒天プレート面線した。−晩３７°Ｃでインキュ ベーション後、プレートにＩＮ　ＨＣＩをオーバフローさせた。ハロの大きさは 、ＲＮａｓｅ活性を培地中に漏出する株を決定するために使用した［Ｗｅｉｇａ ｎｄ。

Ｒ，Ａ、およびＲｏｔｈｆｉｅｌｄ、Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、よ ２旦：３４０−３４５．１９７６］、Ｅ、ｃｏｌｉ中における外膜損傷の第２の 指標は、ＭａＣｏｎｋｅｙ寒天上における増殖不可である［Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｒ 。

８４］。特にＭａＣＣＯｎｋｅｙ寒天に感受性でかつ実質量のペリプラズムＲｎ ａｓｅｒを放出可畦なＴ７耐性コロニー３０個のひとつを、ＲＬ７と命名した。

Ｅ、ｃｏｌｉＲＬ７は、ｈｕＩＬ−４発現ベクターｐＡＨ３（図１）によって形 質転換した。このベクターは、リンホカインを内部細胞膜を横断してペリプラズ ム中に導入する。形質転換体によって使用された培地は、その漏出をウェスタン プロット解析によって下記に記載のｈｕＩＬ−４ポリクロ一ナル抗体を用いて検 索した。暗所で少なくとも２時間増殖させた後、照射細胞を、アンピシリン（１ ００ｔ１ｇ／ｍｌ）ｍ加ＴＹＥ寒天プレート上に接種し、３０°Ｃで一晩インキ ユベートした。このコロニーを、′ダブルディスクアッセイ”によってそのｈτ ｘＩＬ−４放出増加を検索し、これは、変異コロニー下のより強烈な色の出現と して示された。このダブルディスクアッセイは、下記のようにして行う；変異細 胞を希釈し、１１００Ａｔ／ｍｌアンピシリン含有ＴＹＥ寒天プレート（直径１ ４２ｍｍＪ上に接種した（０．１ｍｌ／プレート）、、３０’　Ｃで一晩インキ ュベーション後、このプレートは、約１ｍｍ直径の５００−２０００コロニーを 含有していた。次に、このプレートに０．４５μ孔径の１３７ｍｍのニトロセル ロースディスク（シュライヒャー・エンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ））でカバーをした。このディスクをゆっくりと１端か らのせ、ゆっくりとかつ均等な湿潤を可能とした。このディスクをすぐに一気に はがし、そして、コロニーを寒天プレートからニトロセルロースディスクに持ち 上げた。このディスクは、先に無菌寒天プレート表面に８いたニトロセルロース ディスク（またはディスク類）であった。プレートを、次に３０’Ｃで一晩イン キユベーションした。インキュベーション後、底のディスク（またはディスク類 ）をコロニー保持ディスクから分離させた。フィルター類は、１％ＢＳＡ（ウシ 血清アルブミン）含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，１５０ｍＭ　ＮａＣ１およ び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０　（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）、エ ンザイムイムノアッセイピュリティ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｎｏ　Ａｓ５ａｙ Ｐｕｒｉｔｙ））（ＴＢＳＴ）中で室温で６０分間インキュベートした。次にフ ィルター類を、ウサギポリクローナル抗血清（ＴＢＳＴ／ＢＳＡによる１：１５ ００希釈；自然の構造のタンパク質決定のために使用）のモノクローナル抗血清 （１１Ｂ４）のいずれかと室温で３０分間インキュベートした。このフィルター 類をＴＢＳＴ中で３回洗浄して、次に、３０分間、適当なアルカリ性ホスファタ ーゼ結合第２抗体とインキュベートした。フィルター類は３回洗浄し、アルカリ ホスファターゼ基質（ピロメガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ） によるプロトプロットシステム（ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ　Ｓｙｓｔｅｍ））で染色 した。プロットを次にストックプレートと並列させ、ｈｕＩＬ４特異的染色増加 を示したコロニーを遺灰した。

疑わしいコロニーについて、非選択的培地中での形態移行によってプラスミドを 救い、次に、非選択的ＴＹＥプレート上で画線した。アンピシリンプレート上で の増殖不可と判定されたコロニーについてプラスミド不在を検査し、ヒトＩＬ− ４発現プラスミドｐＲＧＴ８５７−１１によって形質転換した。これらのクロー ンは、ｈｕＩＬ−４の放出増加を１０ｍ１の試験管発酵によって得られたドツト イムノブロッティング全培地によって検索した。検出は、ヒトＩＬ−４（１１Ｂ ４）に対するモノクローナル抗体によって、次にアルカリホスファターゼ結合ヤ ギ抗ラットＩｇＧで行った。高度生株として選択された１株を、ＲＬ７３１とし て命名した。

Ｅ、ｃｏ１ｉＲＬ７３１／ｐＲＧＴ８５７／１１は、ＵＶ灯によって先と同じよ うに突然変異を誘発した。暗所で必須培地で増Ｎ後、細胞を抗生物質でかつ１ｍ Ｍ　ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオガづクトシド）添加ＴＹＥ寒天プレート に接種した。ＲＬ７３１／ｐＲＧ８５７−１１は、誘発物質工ＰＴＧ存在下にお いて増殖しない。細胞は、１ｍｌ当たり１０４コロニー形成単位の密度で接種し た。１プレート当たり約５−１０コロニーが一晩インキュベーション後に発生し た。７５個以上のコロニーを画線によって生成し、ｈｕｌＬ−４産生を調べた。

産生レベルは、ウェスタンプロット解析によって決定した。最も強いバンドを示 したクローンは、前と同じようにそれらのプラスミドを救い、ｐＲＧＴ８５７− １１によって再形質転換し、そして、ｈｕｌＬ−４抗産生の保持を調べた。生物 活性ｒＬ−４の産生および漏出を含めて最も望ましい特性を示しかつｈｕＩＬ− ４発現を誘発後細胞増殖を示した株は、ＲＬ７３２１であった。

ヒトインタロイキン−４（ＩＬ−４）の発酵時において、生成物は直接発酵培地 に分泌される。初期下流段階は、培地を細胞から分離しかつ次にｒｈｒＬ−４を 培地中に濃縮するために行う。２つの異なる工程がこの作業を達成するためにあ る。膜プロセスとトリクロロ酢酸ナトリウム（ＴＣ，Ａ）プロセスである。ＴＣ Ａナトリウムプロセスにおいて、細胞はＴＣＡ塩の添加によって不活化される。

細胞を除去後、培地のｐＨを低下させ金属キレートセファロースゲル、ｒｈＩＬ −４を沈澱させ、そして、培地を遠心分離してｒｈＩＬ−４をベレットまたはス ラッジの形態で採取する。この膜プロセスは、ミクロフィルトレージョンおよび 限外ろ過の両方を使用し液体濃縮物の形態でｒｈＩＬ−４を採取する。このプロ セスは、緩衝液で何回か洗浄することを要し、下流回収を増加させる。

ｒｈＩＬ−４の発酵培地粗濃縮物からの生成は、金属キレートカラム（例　Ｚｎ −セファロース）による固定金属アフィニティクロマトグラフィを行うことによ って行われる。選択した分画をプールして、スルホン酸塩カラム（例　Ｓ−セフ ァロース）による陽イオン交換クロマトグラフィに供する。

選択した分画をプールし、濃縮し、適当な公称分子量の膜を含有する限外ろ過装 置で透析ろ過し、その結果生成物は濃縮物中に残存する（例　ミリボア（Ｍｉｌ ｌｉｐｏｒｅ）ＰＴＧＣ限外ろ過膜による）。透析ろ過した濃縮物をさらにゲル ろ過カラム（例　Ｓ−２００ＨＲによって）によるクロマトグラフィによって生 成する。生成したバルクｒｈＩＬ−４を構成するプール分画を次にろ過して一２ ０１′Ｃ以下で保存する。

Ｅ、ｃｏｌｉからの活性組換えヒトＩＬ−４の粗溶液を生成する工程は、従って 下記からなる： （ａ）中性かられずかにアルカリ性ｐＨでかつ約０．５乃至１．５モルの塩化ナ トリウムを含有する前記ｒＬ−４のＪｉｌ衝粗溶液を金属キレートアガロースゲ ルによるアフィニテイクロマトグラフィに供し、選択的にこのＩＬ−４を結合す ること： （ｂ）このカラムを最初に、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ　リン酸ナト リウム平衡緩衝液、ｐＨ７，２で洗浄し、次に、１０容量％のグリセロールおよ び約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有するｉ！衝液で洗浄すること；（Ｃ）結 合したｒＬ−４を、キレート剤、ヒスチジンアナログまたはアミノ酸含有酸性ｐ Ｈの溶出緩衝液または中性ｐＨＡｌ衝液で溶出すること；（ｄ）段階（Ｃ）から の活性ＩＬ−４を、Ｓ−セファロース（ファルマシアから入手可能）のような陽 イオン交換クロマトグラフィで中性に近いかまたはわずかに酸性のｐＨでかつ１ ５ｍ５の伝導度で処理し、このＳ−セファロースは、それにイオン交換基−ＣＨ ２−５０３−Ｎａ＋を結合させた架橋アガロースマトリックスである； （ｅ）段階（ｄ）からの溶出物を限外ろ過膜（１０，０００分子量カットオフ） によって濃縮すること； （ｆ）サイズ排除カラムによるゲルろ過クロマトグラフィによって濃縮保持物（ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を処理すること；および（ｇ）生成した活性ＩＬ−４を回 収すること。

最も好適なａ様は下記段階からなる。

（ａ）Ｏ，１Ｍ塩化ナトリウム含有中性かられずかにアルカリ性ｐＨのリン酸緩 衝液中で金属キレートアガロースゲル、好適にはキレートセファロースファース トフローのアフイニテイグロマトグラフイ力ラムに活性組換えヒトＩＬ−４の粗 溶液をのせること； （ｂ）二〇カラムを最初に、１．ＯＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ　リン酸ナト リウム平衡緩衝液、ｐＨ７，２−７，５で洗浄し、次に、１０容量％のグリセロ ールおよび約１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で洗浄すること；（ ｃ）ＩＬ−４を、０．５塩化ナトリウム含有ｐＨ５，０の溶出酢酸緩衝液でカラ ムからイソクラティカリに溶出すること；（ｄ）段階（Ｃ）からの活性ＩＬ−４ 溶出物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５で平衡にしたＳ−セフ ァロースのようなカラムによる陽イオン交換クロマトグラフィに供し、そして、 ０．１２−０．８Ｍ　ＮａＣ１含有ｐＨ６゜７５のリン酸緩衝液で勾配溶出する こと；（ｅ）段階（ｄ）からの溶出物を限外ろ過膜によって濃縮すること；（ｆ ）ｐＨ４，５の１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡にしたサイズ排除カラ ムによるゲルろ過クロマトグラフィによって濃縮溶出物を処理すること；（ｇ） 生成した活性ＩＬ−４溶液を採取すること。

活性４を精製調整するために本発明によって使用した好適なＥ、ｃｏｌｉ株は、 ＲＬ２１１７／ｐＲＧＴ８５７−１１およびＲＬ７３２１／ｐＲＧＴ８５７−１ １である。

段階（ａ）で使用した好適な金属キレートアガロースはキレートセファロース６ Ｂでも十分であるが、キレートセファロースファーストフローである。セファロ ース類は、ニューシャーシー、ＰｉｓｃａｔａｗａＹ、ファルマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）の製品である。本発明の用途のための好適な亜鉛キレートセファロ −ヌカラムを調整するための好適な方法は、セファロースゲルをクロマトグラフ ィカラムに入れ、脱イオン水で洗浄し、次に好適には酢酸亜鉛である塩溶液およ び脱イオン水をポンプで入れ、次にｐ）（’７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム 、このクロマトグラフィカラムは、連続して結合した２本のカラムである。第１ または上のカラムは、金属キレートセファロースゲルからなり、第２または下は 亜鉛塩または金属塩によって処理されていないキレートセファロースゲルからな る。２重カラム内の容量比は、未処理キレートセファロースゲル１容量に対して 亜鉛処理キレートセファロースゲル約３容量である。

カラム平衡のために使用した好適な緩衝液は、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ ７，２−７，５のリン酸緩衝液である。

段階（ｂ）において、最初、１．０Ｍ　塩化ナトリウム含有ｐＨ７，２のリン酸 緩衝液を平衡緩衝液として次に１０％グリセロールおよび低濃度の塩化ナトリウ ム（１５０ｍＭ）含有ｐＨ７，２−７，５のリン酸ナトリウム緩衝液で２部分に 特に分けて洗浄したものをカラムにのせる。この洗浄によって、極めて密接に関 連しており分離が困難なものを含めて不純物が除去される。活性ＩＬ−４はカラ ムに残る。

活性ＩＬ−４溶液のｐＨを保持するための好適な緩衝液は、１．０Ｍ塩化ナトリ ウム含有ｐＨ７，２のリン酸Ｍ衝液である。緩衝化した粗酒性Ｉ’　Ｌ　−４溶 液をカラムに流し、このＩＬ−４を選択的にゲルに吸着させる。

段＃（Ｃ）に３いて、亜鉛キレートセファロースおよび次に未処理キレートセフ ァロ−スゲルーは、１，０Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ６，７５のリン酸緩衝液で 平衡とし、そして、吸着された活性ＩＬ−４を、亜鉛キレートかセファロースか ら未処理キレートセファロースも０．５Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ５，０の酢酸 緩衝液、またはこれとは別に５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミンＩＬ−４酢 酸）または５０ｍＭイミダゾールのようなヒスチジンアナログまたは５０ｍＭヒ スチジンのようなアミノ酸のようなキレート剤を含有する中性ｐＨでイソクラテ ィカリに溶出する。酢酸緩衝液は好適である。活性ＩＬ−４を含む溶出物を採取 する。従来の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイに基づき活性Ｉ　Ｌ− ４最大槽度の分画をプールする。

段階（（１）において、段階（Ｃ）からのプール分画をｐＨ８，７５に調節しそ して、２０ｍＭ緩衝液、ｐ）ｉ６．７５によって希釈して、伝導度を１５ｍ５に する。クロマトグラフィカラム中の陽イオン交換ゲル物質は、０．１２Ｍ塩化ナ トリウムを有するｐＨ６，７５の２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡とする。好適な陽 イオン交換体は、ファルマシアから入手可能なＳ−セファロースファーストフａ −のような−ＣＨ２−３ｏ３−Ｎａ十基によって置換された架橋アガロースであ る。活性ＩＬ−４は、０．１２−０．６Ｍ　ＮａＣ１を含有する２０ｍＭリン酸 緩衝液で勾配溶出する。従来の５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイに基 づき活性ＩＬ−４最大潰最大分度をプールする。陽イオン交換クロマトグラフィ の条件ｊよ、活性ＩＬ−４分画を陽イオン交換マトリックスに付着させることを 確実するように選択される。中性に近いｐＨ６゜７５は実質的に陽イオン交換ク ロマトグラフィには高く、陰イオン交換クロマトグラフィには実質的に高い１５ ｍ５の伝導度によって、はとんどの不純物がカラムに結合しない緩和な結合条件 が生じ、溶出は実質的に容易でかつ高純度のＩＬ−４溶液が、すなわち、約９０ ％−９５％の溶液が得られる。

段階（ｅ）に３いて、段階（ｄ）からプールした溶出分画を、１０．０００分子 量以上の全ての物質を保持する撹拌セルで濃縮する。これには、活性ＩＬ−４が 含まれる。本工程のこの段階では、活性ＩＬ−４溶液が約９０−９５％純粋であ るので、活性ＩＬ−４以外の極めてわずかの部分しか、膜上力に保持された１縮 溶液中にない。好適な膜は、米国アミコン社製造ＹＭ−１０である。得られた濃 度は、活性ＩＬ−４の約２０ｍｇ／ｍｌである。

段Ｎ　（ｆ）において、プールし濃縮した活性ｒ　Ｌ−４の濃縮溶出物を、分子 量によってタンパク質溶液を分画するサイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィ にのせる。活性ＩＬ−４の濃縮溶出物を、分子量によってタンパク質溶液を分画 するサイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィにのせる。適切な典型的カラムは 。

セファクリルＳ−２００ＨＲまたはＳ−１００ＨＲ（ファルマシア）ゲルろ過カ ラムである。セファクリルＳ−２００ＨＲ（高分解能）およびＳ−１００ＨＲは 、アリルデキストランおよびＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミド架橋共重 合体である。それらの分画範囲は、それぞれ、５，０００−２５０，０００およ びｌ。

０００−１００，０００である。他の適切な物質は、架橋デキストランゲルであ るセファデックス類（ファルマシア）である。好適には活性Ｉ　Ｌ　＝　４の溶 液を、先にｌｏ’ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５で平衡にしたＳ−２ ００ＨＲカラムにのせる。段階（ｇ）の条件下で、安定なＩＬ＝４濃縮物は、２ ０ｍｇ／ｍ１に達することができる。これによって、ゲルろ過クロマトグラフィ の能力および特性が向上する。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定した最大濃度の活性Ｉ Ｌ−４含有溶出物分画を採取しプール後、９５−９９％純粋な活性ＩＬ−４溶液 を得る。

このプロセスにおいて使用した緩衝液は、それらが結合、洗浄および溶出の適切 な条件を提供し活性ＩＬ−４をクロマトグラフィに吸着させるかまたは選択的に それを溶出させるかのいずれかであるので、使用できる。好適な緩衝液は、濃度 ２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液類または実施例に示した濃度およびｐＨの酢 酸ナトリウム緩衝液、および特定量の示した塩化ナトリウムであるｏＰＨは、水 酸化ナトリウムまたは酸で調節した。段階（ｂ）の２部分洗浄において、最初の 洗浄は、１．ＯＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭリン酸ナトリウム平衡緩衝液であ り、第２の洗浄は約１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび第２洗浄緩衝液で必要亜 鉛キレートセファロースカラムで使用するａ？Ｅ液中塩化ナトリウムの１度は本 発明で重大であり、その理由として、高塩、好適にはＬＭの塩化ナトリウムがト リクロロ酢酸（ＴＣＡ）ベレットからの可溶化した活性ＩＬ−４の回収を向上さ せ、かつ、活性ＩＬ−４の金属キレートセファロースへの結合を増加させる。

この濃度によって、ＩＬ−４は、より選択的に亜鉛キレートセファロースカラム に発酵培地中の不純物よりも吸着される。

バルクＩＬ＝４を次に融解によって注入用に調整し、そして、無菌水および／ま たは１０ｍｍのクエン酸緩衝液によって希釈した。

実施例Ｉ Ｓ−セファロースファーストフローカラムの調整２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐ ）（’７．２および０．１２Ｍ　ＮａＣ１の緩衝液中Ｓ−セファロースファース トフロー陽イオン交換樹脂によって２本の陽イオン交換カラムを調整する。Ｉ！ １のカラムは、１．５リツトル、直径１００ｍｍ、高さ４５ｃｍ０カラムで、第 ２のカラムは、０．２５リツトル、直径５０ｍｍ、高さ３００ｍｍ０カラムであ る。それぞれのカラムを陽イオン交換ゲルで完全に充填したときに、小さい方の カラムは、大きい方のカラムのベットボリュームの１５％である。本カラムには 、下記のように充填する；２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，２および０．１２ Ｍ　ＮａＣ１から構成された緩衝液中のスラリＳ−セファロースファーストフロ ー陽イオン交換樹脂。このゲルを適当なりロマトグラフィカラムに入れ、液体を 流出させるかまたはそれをカラム底部からポンプで組み入れる。

トップフローアダプターをカラムに付け、この緩衝液を約１ｃｍ／ｍｌの直線速 度でカラムポンプで入れることによって、このゲルを５ベツドボリユームの２０ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２，０，１２Ｍ　ＮａＣ１から構成された緩衝 液で平衡とする。トップフローアダプターを調蔀して、樹脂ベッドの先端を硬く 押しつける。次に、少なくとも５ベツドボリユームの２０ｍＭリン酸ナトリウム 、ｐＨ７，２，０，１２Ｍ　ＮａＣ１から構成された緩衝液を約１ｃｍ／分の直 線速度でカラムにポンプで入れ、そして、もし必要であれば、同一フロー速度で 溶出液のｐＨが７．１および７．３の間となるまでカラムに緩衝液をポンプで組 み入れることをａ！続する。カラムのベッドボリュームを調節して、小さい方の カラムが大きい方のカラムのベッドボリュームの１５％となるようにする。

実施例２ コバルトキレートセファロースファーストフローの調整０．０２Ｍコバルト酢酸 ５容量にキレートセファロースファーストフローゲルを懸濁し、ときどき撹拌し ながら一晩放置する。このゲルをブッヒエナーろうと上で脱イオン水で洗浄して 、次に、このゲルを、０．０５Ｍ　ＮａＣ１含有０゜０２Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，２の緩衝液で洗浄する。次に、このゲルをｐＨ７，２の２０Ｍリン酸ナ トリウム、ｐＨ７，２および０．１２Ｍ　ＮａＣ１の緩衝液０．５ゲル容量にス ラリーとする。コバルト付加ゲル１９０ｍ１を直径５０ｍｍおよび高さ３００ｍ ｍのカラムに入れ、液体をカラムにポンプで流す。先端フローアダプターをカラ ムに付け、約１０ｍ７分の直線速度でカラムにポンプで０．５Ｍ　ＮａＣ１含有 ０．０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２緩衝液を入れることによって、このゲ ルを平衡とする。フローアダプターをカラム先端にのせる。

実施例３ キレートセファロースファーストフロー（金属塩で未処理）の調整キレートセフ ァロースファーストフローゲルを、０．０５Ｍ　ＮａＣ１含有２０ｍＭリン酸ナ トリウム、ｐＨ７，２の緩衝液で洗浄する。次に、このゲル７５ｍ１を実施例２ からのクロマトグラフィカラムに注ぎ、その結果、金属塩で未処理のゲルをコバ ルト付加ゲルの先端に均一層としてのせる。上端フローアダプターをカラムに付 け、このゲルを、この緩衝液を０．５Ｍ　ＮａＣ１含有ｐＨ７゜２の０．０２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液で平衡とする。

実施例４ コバルトキレートセファロースカラムの平衡化コバルトキレートセファロースフ ァーストフローおよびキレートセファロースカラムを実施例２および３のように して調製した後、このカラムを反転させ、コバルト処理樹脂が未処理樹脂の上に する。溶出物のｐａｌが７．１および７．３の間となるまで、０−０２Ｍリン酸 ナトリウムｐＨ７，２，０１５Ｍ　ＮａＣ１の緩衝液のカラムへのポンプ組入れ を継続する。

実施例５ セファクリルＳ−２００ＨＲカラムの調製１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４ ，５で構成された少なくとも１ベツドボリユームの緩衝液を、１．８リツトルの クロマトグラフィカラム、５０ｍｍ直径、１００ｃｍ高さのＳ−２００ＨＲゲル に約０．２ｃｍ／分の直線速度でカラムを平衡とするためにポンプで組み入れる 。

実施例６ 緩衝液の調製 ａ　０．０２ＭＭ　Ｉ　Ｈ７，２０，１２Ｍ　＋脱イオン水中で、２．７８ｇ／ ｌのリン酸水素１ナトリウム１水和物、７．０３ｇ／ｌの塩化ナトリウムおよび 十分量の８．３Ｎ＊酸化ナトリウムを混合して、ｐＨを７．２（±０６１）に調 節する。

０．０２ＭＩゝ　ｌ　Ｈ７，２０，２６Ｍ　＋脱イオン水中で、２．７８ｇ／ｌ のリン酸水素１ナトリウム１水和物、１５゜１９ｇ／ｌの塩化ナトリウムを混合 する。６．３Ｎの水酸化ナトリウムによってｐＨを７．２（±０．１）に調節す る。

、０２ＭＩ”　ｌ　８７．２　０．５　Ｍ　−１脱イオン水中で、２．７８ｇ／ ｌリン酸水素１ナトリウム１水和物、２９．２２ｇ／ｌ塩化ナトリウムおよび十 分量の５０％ＮａＯＨを混合して、ｐＨを７゜２（±０．１）に調節する。

ｄ　０．０２Ｍ”　＋　Ｈ６，００，５Ｍ　ＥＤＴＡ　０．５動ム 脱イオン水中で、２．７８ｇ／ｌのリン酸水素１ナトリウム１水和物および１９ ｇ／ｌのＥＤＴＡ４ナトリウム塩および２９．２２ｇ／ｌの塩化ナトリウムを混 合する。６．３Ｎの水酸化ナトリウム／４Ｎ　ＨＣＩによってｐＨを６．０（± ０．１）に調節する。

ｅ　１０ｍＭ　工ゝ　Ｉ　Ｈ４，５ ２１０グラム（２，１ｇ／ｌ）のクエン酸１水和物を脱イオン水１００リツトル と、クエン酸１水和物が溶解するまで混合する。緩衝液のｐＨを、もし必要であ れば、４Ｎ塩酸および６．３Ｎ水酸化ナトリウムによって４．５に調節する。

この緩衝液は、透析ろ過および限外ろ過のために、さらにゲルろ過クロマトグラ フィのために使用する。

ｆ　２０ｍＭＭ　ｌ　、　Ｈ７，２ ２７８グラムのリン酸水素１ナトリウム１水和物を１００リツトルの脱イオン水 と混合して溶解するまで撹拌する。緩衝液のｐＨを５０％ＮａＯＨでｐＨ７゜２ および２−４ｍ５の伝導度にｖＲ節する。

実施例７ 粗ＩＬ−４溶液の陽イオン交換クロマトグラフィ処理細胞培地含有粗ＩＬ−４（ １！！タンパク質約１４．ＯＯＯｇ）をｐＨ７，２（±０．１）に調節しそして その伝導度を１４ｍ５（±１）に調節する。この溶液をＳ−セファロース陽イオ ン交換に約１．０ｃｍ／分以下の直線速度でポンプで流す。カラムを実施例６（ ａ）で調製した緩衝液で洗浄する。このカラムを実施例６（ｂ）で調製した緩衝 液でＱ、２ｃｍ／分の直線速度でイソクラティカリに溶出する。ＳＤＳ／ＰＡＧ Ｅおよびタンパク質アッセイによって決定された活性工Ｌ−４含有分画を採取し 、それらをプールする。プールした活性ＩＬ−４の純度は、約５０％である。

実施例８ 部分精製活性ＩＬ−４溶液の陽イオン交換クロマトグラフィによる勾配溶出実施 例７にしたがって作製したプールした活性ＩＬ−４溶液のｐＨを、必要に応じ４ Ｎ　ＨＣＩまたは６．３ＮＮａＯＨで７．２（±０．１）ｉ、：調節スル。溶液 の伝導度を″＊ｍ例６（ｆ）で調製した緩衝液で１４ｍ５’（±１）に調節する 。

この溶液を実施例１で調製したＳ−セファロース陽イオン交換に約１．０ｃｍ／ 分以下の直線速度でポンプで流す。溶出溶液を１分画に集める。

約１．７５ｍ５／ベツドボリユームの勾配および約０．２ｃｍ／分の直線フロー 速度で溶出する。

勾配で使用した低塩緩衝液は実施例６（ａ）で作製したものであり、そして、こ の勾配で使用した高塩緩衝液は実施例６（Ｃ）で作製したものである。

５つの大分画を、各分画に付いて容量を約０．５ベツドボリユームとして採取す る。残りの分画く約４Ｏ−５０）を、容量を約０．　１ベツドボリユームとして 採取する。

活性ＩＬ−４分画をＳＤＳ−ｐＡＧＥｇよびタンパク質アッセイによって分析す る。活性ＩＬ−４分画をプールする。プールした活性ＩＬ−４の純度は、約６０ ％乃至７０％である。

実施例９ 活性組換えヒトインタロイキン−４のコバルトキレートセファロースクロマトグ ラフィ精製 実施例８から（７）ＩＬ−４溶液のｐＨを、４Ｎ　ＭＣＩまたは、３ＮＮａＯＨ で７．２（±０．１）に調節する。溶液の伝導度を４５４５−５Ｏに調節する。

この溶液をもし必要であれば遠心分離またはミクロフィルトレージョンによって 透明にする。実施例４で調製したコバルトキレートセファロースファーストフロ ーおよび未処理キレートセファロースファーストフローカラムに約０．　５ｃｍ ／分の直線速度でポンプで流す。フローヌル−（溶出溶液）を１分画に集める。

実施例６（Ｃ）で調製した緩衝液約１０ベツドボリユームで約０．５ｃｍ／分の 直線フロー速度でカラムを洗浄し、洗浄物を５分画未満に採取する。次に、この 方ラムを実施例６（ｄ）で調製した緩衝液約１０ベツドボリユームで約０．５ｃ ｍ／分の直線フロー速度でカラムを溶出する。約０．　２ベツドボリユームの容 量で分画を採取する。各分画活性ＩＬ−４分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパ ク質アッセイによって分析し、活性ＩＬ−４分画をプールする。

この実施例９によって処理した活性ＩＬ−４の純度は、約９０−９５％である。

実施例１０ 限外ろ過および濃縮 実施例９からのプール分画を、ＹＭ−１０膜付きアミコン撹拌チェンバーを用い て、実施例９からの活性ヒトＩＬ−４を含有するプール分画を容器に入れ、約０ ．２５容量の実施例６（ｄ）で調製した緩衝液を添加することによって濃縮する 。ＹＭ−１０膜による限外ろ過によって当初の容量の約０．２になるまでこのし 、それを約０．２容量までＹＭ−１０膜による限外ろ過によって濃縮する。

濃縮段階を繰り返して、当初のプール分画容量の約０．１を達成する。この濃縮 物を適当な容器に入れ、すぐに使用できるように冷室温におくかまたは−２゜０ Ｃで凍結して保存する。

実施例１１ ゲルろ過グロマトグラフィ（サイズ排除）セファクリルＳ−２００ＨＲカラムを 実施例６（ｅ）で調製した緩衝液で、少なくとも１ベツドボリユームの緩衝液を 直線速度的０．２ｃｍ／分でポンプで組み入れることによって平衡にする。

実施例１０で作製した溶液を、２９Ｃ−６０Ｃで３０分間、４５００ｒｐｍで実 験室遠心分離器で遠心分離することによって、透明にする。このＡ２ｇｏを測定 し、本溶液を実施例８（ｅ）７調製した緩衝液で希釈し、その結果、１ｍｌ当た り２８０ｎｍにおいて５光字濃度単位がある。

生成した溶液をセファクリルＳ−２００ＨＲカラムに直線速度的０．１ｃｍ／分 でポンプで組み入れる。実施例６（ｅ）の緩衝液のカラムへの組入れを約０゜１ ｃｍ／分のフロー速度で継続する。総容量０．４乃至０．５５ベツドボリユーム を有する大きい１分画を採取する。

活性ＩＬ−４分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって選択す る。活性ＩＬ−４分画をプールし、０．２ミクロンの無菌フィルターでろ過する 。５ＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによって調べた９５％乃至９９％純粋な活性ＩＬ〜 ４溶液のる液を口取する。細胞培地中の活性ＫＬ−４総取率は、７０％である。

インタロイキン−４活性分画を決定するために用いた全てのアッセイは、従来の ものである。精製ＩＬ−４２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度測定値について、１　 、　ＯＡ　２！ＩＱ光学濃光学値（ＯＤ）は、アミノＭ組成分析による１、６ｍ ｇおよびローリ法（Ｌｏｗｒｙ’　ｓ　Ｍｅｔｈｏｄ）による２、０ｍｇに等し い。

実施例１２ 亜鉛キレートセファロースファーストフローの調整キレートセファロースファー ストフローゲルを、脱イオン水でスラリー化する。

ｍ長さのクロマトグラフィカラムに注ぐ。この液体をカラムに流すかまたはそれ をカラム底部からポンプで入れる。

トップフローアダプターをカラムにおき、そして、ゲルを脱イオン水で充填／洗 浄する。水をカラムに約１ｃｍ／分の直線速度で流す。トップフローアダプター を調節して樹脂ベッドの先端に硬く押しつける。少なくとも５ベツドボリユーム の脱イオン水をカラムに約１ａｍ／分の直線速度でポンプで組み入れる。

直線速度１ｃｍ／分でカラムに０．０２３Ｍの亜鉛酢酸溶液５ベツドボリユーム をポンプで入れる。約１０ベツドボリユームの脱イオン水をカラムに直線速度約 １ｃｍ分でカラムにポンプで入れる。

！［線速度ｉ、Ｏｃｍ／分でカラムにリン酸緩衝溶液をポンプで入れることを継 続し、溶出液のＩ）Ｈが７．　１−７．３になるまで継続する。

実施例１３ キレートセファロースファーストフローの調整（金属塩非処理）キレートセファ ロースファーストフローゲルを、１．０Ｍ　ＮａＣ１含有ｐＨ７，２の２０ｍＭ リン酸ナトリウムの緩衝液中にスラリー化する。１リツトルのカラムを調製する ため、このスラリーを直径１４０ｍｍで５００ｍｍ長さのグロマトグラフイ力ラ ムに注ぎ、カラム底部から溶出する。Ｌ　ＯＭ　ＮａＣ１含有ｐＨ７，２の２０ ｍＭリン酸ナトリウムの緩衝液約５ベツドボリユームでゲルを平衡にする。この 緩衝液を約１ｃｍ／分の直線速度でカラムにポンプで入れる。

同一フロー速度でカラムにリン酸緩衝溶液をポンプで入れることをｍｌ！Ｌ、溶 出液のｐＨが７，１と７．３の間になるまで継続する。

実施例１４ 連続カラムの調製 亜鉛キレートセファロースファーストフローおよび未処理キレートセファロース カラムを実施例１２およ′ｒｊ１３に従って調製した棲、このカラムを順番に連 結して、フローが最初に亜鉛キレートセファロースファーストフローに、次に、 非亜鉛（未処理）キレートセファロースカラムに入るようにする。カラムの間に 泡トラツプは挿入すべきでない。

実施例１５ Ｓ−セファロースカラムの調整 Ｓ−セファロースゲル陽イオン交換樹脂を、１．０Ｍ　ＮａＣ１含有ｐＨ８゜７ ５の２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１２Ｍ　Ｎａ１ｌおよびＯ，００１Ｍエチ レンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）からなる緩衝液中にスラリー化する。このゲル を直径１００ｍｍで４５ｃｍ高さのクロマトグラフィカラムに注ぎ、この液体を カラムに流すかまたはそれをカラム底部からポンプで入れる。

トップフローアダプターをカラムにおき、そして、緩衝液をカラムに約１ｃｍ／ 分の直線速度で流すことによって、このゲルをｐＨ８，’７５の２０ｍＭリン酸 ナトリウム、０．１２Ｍ　ＮａＣ１および０．００１Ｍエチレンジアミン４酢酸 からなる緩衝液と平衡にする。トップフローアダプターを調節して樹脂ベッドの 先端に硬く押しつける。次に、少なくとも５ベツドボリユームのｐＨ８，７５の ２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１２Ｍ　ＮａＣ１およびＯ，ＯＯＩＭｚチレン ジアミン４酢酸からなる緩衝液をカラムに約１０ｍ／分の直線速度でポンプで組 み入れ、そして、もし必要であれば、同一速度でカラムに緩衝液をポンプで入れ ることを継続し、溶出液のｐＨが６．６と６゜９０間になるまで継続する。

実施例１６ セファクリルＳ−２００ＨＲカラムの調製１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４ ，５で構成された少なくとも１ベツドボリユームの緩衝液を１．８リツトルのク ロマトグラフィカラム、５０ｍｍｇ径、１００ｃｍ高さのＳ−２００ＨＲゲルを 介して約０．２ｃｍ／分の直線速度でカラムを平衡とするためにポンプで組み入 れる。

実施例１７ 緩衝液の調製 ａ　、２ＭＩ゛　ｌ　）！７．２　．１２Ｍ　ｌ脱イオン水中で、２．７８ｇ／ ｌのリン酸水素１ナトリウム１水和物、７．０３ｇ／ｌの塩化ナトリウムおよび 十分量の６゜３Ｎ　水酸化ナトリウムを混合して、ｐＨを７．２（±０．１）に 調節する。このバッチは、金属キレートセファロースカラム内にゲル１リツトル 当たり少なくとも３０リツトルの付与するほど十分に大きくなければならない。

１立１旦ユ追λ及去Ｚ１九上〃シリムーＰ且ニユー２よ一す＝１５刀−１止力五 旦立ム、１旦Ｘグツよ」仁ニル 脱イオン水中で、２．”、’８ｇ／ｌのリン酸水ｙ１ナトリウム１水和物および ８７６ｇ／ｌの塩化ナトリウムを混合する。６．３Ｎの水酸化ナトリウムによっ てｐＨを７．２（±０，１）に調節する。十分量のグリセロールを添加して０１ １／１を付与する。十分量のｋｌＪ？Ｅａを調製し、それがともに使用されるゲ ル１リツトル当たり少なくとも６リツトルを付与するようにする。

−（−玉ン−１０−，０；−さ１１ｖｒ儀ブニートーＬξこンニノ諷−ｚ！ｉ− う工ζし□−０ニー−う一一ロゴ、ヒーえ二」ユーソニ九脱イオン水中で、９９ ．７％の酌量１．１５ｍ１／ｌおよび２９．２ｇ、／］の塩化ナトリウムを混合 する１、このｐ　Ｈを、６．３Ｎ水酸化すトリウムで５．０（±○、］暑に調節 する。十分量の緩衝液を調製し、それがともに使用されるゲ脱イオン水中で、４ ．１．７ｇｍ／１のリン酸水素１ナトリウム１水和物および１．１４ｇ／ｌのＥ ＤＴＡ４ナトリウム塩を混合する。このｐＨを６．３Ｎの水酸化ナトリウムよっ て７．０（±０．１．）に調節する。十分量の緩衝液を調製し、ゲル１リツトル 当たり少なくとも２リツトルを付与するようにする。

１旦九ユニ１Ｎ欠工之鼓力上臥ワＡ、Ｊ？−且乞一旦２１０グラム（２，１ｇ／ ｌ）のクエン酸１水和物を脱イオン水１００リツトルと、クエン酸１水和物が溶 解するまで混合する。緩衝液のｐＨを、もし必要であれば、４Ｎ塩酸および６． ３Ｎ水酸化ナトリウムによって４．５に調節する。

この緩衝液は、透析ろ過および限外ろ過のために、さらにゲルろ過クロマトグラ フィのために使用する。

実施例１８ 活性組換えヒトインタロイキン−４の精製（亜鉛キレートセファロースクロマト グラフィ）活性ヒト組換えＩＬ−４を２０リツトルに溶解した７００リツトルの 発酵培地を濃縮し、次に、この溶液を実施例］、、　７　（ａ　）の緩ＷＥ液に 対して２５倍透析ろ過に曝す。この溶液のｐＨを、４Ｎ　ＭＣＩまたは６．３Ｎ 　ＮａＯＨで７．２（±０．１）に調節する。溶液の伝導度を７０７０−９Ｏに 調節する。

ろ過によってこの溶液を透明にし濃縮する。このフィルターを実施例１７（ａ） の緩衝液で洗浄し、本溶液の容量を２０リツトルに戻す。

溶液を亜鉛キレ−）・セファロースファーストフローおよび未処理セファロース ファーストフローカラムに直線速度的０−　５ｃｍ／分でポンプで流す。この溶 出を１分画にまとめる。

このカラムを２度洗浄し、最初は、約１０ベツドボリユームの実施例Ｌ７　（ａ ）で調製した緩衝液で直線速度約ｏ、５ｃｍ／分で洗浄し、５以下の分画に洗浄 物を集め、次に、約５ベツドボリユームの実施例１７（ｂ）で調製した緩衝液で 直線速度的０．５ｃｍ／分で洗浄し、１分画に洗浄物を集める。

活性ＩＬ−４をカラムから約８ベツドボリユームの実施例１７　（ｃ）で調製し た緩衝液で直線速度的０．２５ｃｍ／分で溶出する。約０．２ベツドボリユーム の容量で分画を１ｍｌ当たり０．５ｍｌの希釈液を入れた別々の容器にいれ、実 施例１７　（ｄ）で１ｌｌｌｌＬ、た緩衝液に集める。

活性ＩＬ−４の各試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイで試験する 。

この実施例１８にしたがって処理した活性ＩＬ−４溶液の純度は、約２０％−４ ０％である。粗発酵培地中における量に基づいた活性ＩＬ−４の収率は、９０％ である。

実施例１９ Ｓ−セファロースクロマトグラフィのための緩衝液の調製２．７８ｇ／ｌのリン 酸水１ｇ１ナトリウム１水和物、７．０３ｇ／ｌの塩化ナトリウム、０．３８ｇ ／ｌのＥＤＴＡ４ナトリウムおよび１１／１の脱イオン水を適当な容器に入れ、 溶解するまで撹拌する。

６．３Ｎ　水酸化ナトリウムによつ“Ｃ１この緩衝溶液のｐＨを６．７５（±０ ゜１）に調節する。

ＩＷ　２０ｍＭ’　゛　’　−１旦６．７ｉ一旦−互１ｙ−１止丈上ＪＪＪａ、 ０、ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ ２．７８ｇ／ｌのリン酸水素１ナトリウム１水和物、３２．ｉ４ｇ／ｌの塩化す ｌ、リウム、０．３８ｇ／ｌのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　４ナトリウムおよび脱イオン 水を適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。６．３Ｎ　水酸化ナトリウムに よって、この緩衝溶液のｐｉ（を６．７５（±０．１）に調節する。

Ａ幻ユ旦叫ｙ丑ン鼠丈上男−力Ｌ」とＨ６，７５−二工追孟ユＭＥＤＴＡ２、’ ７８ｇ／］のリン酸水素１ナトリウム］水和物、０．３８ｇ／ｌのＥＤＴＡ４す １．リウムおよび脱イオン水を保持するほど十分に大きな容器に入れる。溶解す るまで撹拌し、必要に応じ６．３Ｎ水酸化ナトリウムによって、この＆！衝液の ｐＨを６．７５（±０．１）に調節する。

実施例２０ 陽イオン交換カラムによって精製した活性インタロイキン−４溶液の勾配溶出実 施例７に従って作製した活性Ｉ　Ｌ−４溶液のｐＨを、必要に応じ４Ｎ　ＨＣｌ または６．３Ｎ　ＮａＯＨで６．’７５（±０．１）に調節する。

生成した溶液の伝導度を実施例１９（ｃ）で調製した緩衝溶液で１５（±０゜５ ｍ５）に調節する。

溶液を実施例４で精製したＳ−セファロースカラムに直線速度約１ｃｍ／分以下 でポンプで流１５このフロースルー（溶出溶液）を１分画にまとめ；、このカラ ムを約５ベツドボリユームの実施例１９　（ａ）で調製した緩衝液で直線速度的 １．０ｃｍ／分で洗浄する。

洗浄物を１分両に集める。〕、ベッドボリフーム当たり約４．５ｍＳおよび約０ ゜２ｃｍ／分のｌｆｔ線フロー速！を用いて、カラムを溶出する。

勾配に用いた低塩緩衝液は、５ヘツドポリニア、−ムで実施例１９（ａ）で作製 したものであり、そしＣ１高塩緩衝液は、５ベツ）Ｃボリュームで実施例１９（ ｂ）で作製したものである。

５個の大分画を集め、各分画は、約０４８ベツドボリユームの容量である。

残りの分画（約４０−５０　）を０，１ベツドボリユームの容量で集める。

上記分画の活性Ｈ−−−４を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイで試験 する。

活性ＩＬ−４分画をプールする。亜鉛キレートブールした溶出物中の活性４の量 に基づく活性ｒＬ−４収率は９０％である。

この活性ＩＬ−４溶液の純度は約９０％乃至９５％である。

実施例２１ 限外ろ過および濃縮 実施例２０からのプール分画を、ＹＭ−１０膜付きアミコン撹拌チェンバーを用 いて、実施例２０からの活性ヒトＩＬ−４を含有するプール分画を容器に入れ、 約０．２５容量の実施例６（ｄ）でＡ１１Ｗ１シた緩衝液を添加することによっ て濃縮する。ＹＭ−１０膜による限外ろ過によって、当初の容量の約０．１にな るまでこの容量を濃縮する。Ｉｔ！保持物を４容量の実施例１７　（ｅ）で調製 した緩衝液で希釈し、それを約０．２容量までＹＭ−１０膜による限外ろ過によ って濃縮する。

濃縮段階を繰り返して、当初のプール分画容量の約０．１を達成する。この濃縮 物を適当な容器に入れ、そして、すぐに使用できるように冷室温におくかまたは −２０９０で凍結して保存する。

実施例２２ ゲルろ過（サイズ排除） 実施例２１で作製した溶液を、２０Ｃ−６°Ｃで３０分間、４５００ｒｐｍで実 験室遠心分離器で遠心分離することによつで、透明にする。このＡ２８０を測定 し、本溶液を実施例１７（ｅ）でｖＲ製した緩衝液で希釈し、その結果、１５Ａ ２．。／ｍｌがでる。

生成した溶液をセファクリルＳ　２００ＨＲカラムに直線速度的０．１ｃｍ／分 でポンプで組み入れる。実施例１．７（ｅ）の緩衝液のカラムへの組入れを約０ ．１ｃｍ／分のフロー速度で継続する。総容量０．４乃至０．５５ベツドボリユ ームを有する１大分画を採取し、次に、釣０．０１ベッドボリュ・−ムの分画５ ０を採取する。

活性ＩＩ、−４分両を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって選沢 する。活性ＩＬ−４分画をプールし、０．２ミクｌフンの無菌フィルターでろ過 する。Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅア・シャイによって調べた活性ＩＬ、−４ ，９５％乃至９９％純粋なＩＬ−４溶液であるろ液を回収する。細胞培地中の活 性ＩＬ−４総収率は、７０−８０％である。

回収した活性ＩＬ−４の純度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたように、 ９５−９９％である。

インタロイキン−４活性分画を決定するために用いた全てのアッセイは、従来の ものである。Ｍ製ＩＬ−４２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度測定値について、１、 　ＯＡ２ｇｏ光学濃度単位（ＯＤ）は、アミノ酸組成分析による１、６ｍｇおよ びローリ法による２、０ｍｇに等しい。

５ＤＳ−ＰＡＧＥアッセイは、また、活性分画を選択するために必要である。

この方法は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ、２２ユニ６８０　（１ ９７０）に記載されている。

ローり法は、Ｌｏｗｒｙら、Ｊ、１３ｉ（＋１．Ｃｈｅｍ、　に記載されている 。

本発明はある特定の！！様と関連されて記載してきたが、多くの改変、修飾およ び変形ができることが当業者に明らかであろう。このような改変、修飾および変 形が本発明の精神および範囲に含められることが意図されている。

ＦｒＧＬＩＮＥ、　１ １　ＨＫＣＤＩＴＬＱＥ！ＩＫＴＬＮＳＬＴＥＱＫＴＬＣ置ＴＶＴ３１　０ｒＦ ＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＦＹＳＨＨＥ６１　に口ＴＲＣＬ ＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫｑＬ　！ＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬ９１　ＷＧＬＡＧＬＮＳ ＣＰＶＫＥＡＮ（ＩｓＴＬＥＮＦＬＥＩＩＬＫＴＩＭ１２１ＲＥＫ　マ５ｘｃｓ ｓ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＦＩＧＵＲＥ　３ 基準を上回る陽性バーセント ＦｒＧＬＩＲＥ　４ 基準を上回る陽性パーセント 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　１月２８日囚

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類において好中球の数を増加させるための方法で、前記哺乳類に有効量 のＩＬ−４をこのような目的のために投与することからなる方法。 ２．前記哺乳類はイムノコンプロマイズしているかまたは放射線治療または化学 療法に供されたことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ４，前記ＩＬ−４がヒトＩＬ−４であることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。 ５．前記ＩＬ−４が少なくとも１種の他の白血球増加剤と併用して投与されるこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ６．前記他の白血球増加剤が顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球 コロニー刺激因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６または インタフエロンアルファから選択されるをことを特徴とする請求の範囲第５項記 載の方法。 ７．前記ＩＬ−４が少なくとも１種の化学療法剤と併用して投与されることを特 徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の方法。 ８．前記化学療法剤がアルキル化剤、減数分裂紡錘体毒物または抗腫瘍抗生物質 から選択されることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。 ９．哺乳類における骨髄性または単球白血病を治療する方法で、前記哺乳類に対 して有効量のＩＬ−４をこのような目的のために投与することからなる方法。 １０．哺乳類における未成熟骨髄性または単球細胞の成熟を誘発する方法で、前 記哺乳類に対して有効量のＩＬ−４をこのような目的のために投与することから なる方法。 １１．哺乳類における好中球数の増加のための薬剤組成物の製造におけるＩＬ− ４の使用。 １２．哺乳類における骨髄性または単球白血病の治療のための薬剤組成物の製造 におけるＩＬ−４の使用。 １３．哺乳類における未成熱骨髄性または単球細胞の成熟を誘発するための薬剤 組成物の製造におけるＩＬ−４の使用。 １４．活性組換えヒトＩＬ−４の粗溶液を精製するための工程で、（ａ）中性か らわずかにアルカリ性ｐＨでかつ約０．５−１．５Ｍの塩化ナトリウムを含有す る前記ＩＬ−４の緩衝粗溶液を金属キレートアガロースゲルクロマトグラフィに 供し、選択的にこの活性組換えヒトインタロイキン−４をカラムに結合させるこ と； （ｂ）このカラムを最初に、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有平衡緩衝液で洗浄し、 次に、１０容量％のグリセロールおよび０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含有する 緩衝液で洗浄すること； （ｃ）結合した活性組換えヒトインタロイキン−４を、ｐＨ約４．５乃至５．５ の溶出緩衝液でカラムから溶出すること；（ｄ）段階（ｃ）からの活性ヒトＩＬ −４の緩衝液溶液を、陽イオン交換体によるクロマトグラフィにかけ、そして、 活性ヒトＩＬ−４の緩衝溶液をカラムから勾配溶出すること； （ｅ）段階（ｄ）からの溶出物を１０，０００分子量未満の物質を通過させる撹 拌セル膜上で濃縮すること； （ｆ）サイズ排除カラムに（ｅ）からの濃縮物を供すること；および（ｇ）活住 ヒトＩＬ−４の精製溶液を回収すること、からなる工程。 １５．段階（ａ）において、前記緩衝液がｐＨ７．５のリン酸緩衝液であり、前 記塩化ナトリウム一度が１Ｍであり、かつ、金属キレートゲルカラムが亜鉛キレ ートアガロースゲルであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の工程。 １６．段階（ｂ）において、前記置石液が０．０２ｍＭのｐＨ７．２のリン酸ナ トリウム緩衝液であり、その中に１５０ｍＭの塩化ナトリウムを有する請求の範 囲第１４項または第１５項のいずれかに記載の工程。 １７．段階（ｃ）において、前記溶出緩衝液が０．５Ｍ塩化ナトリウムを有しか つｐＨ５．０の０．０２ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請求 の範囲第１４項、第１５項または第１６項のいずれかに記載の工程。 １８．段階（ｄ）において、前記充填緩衝液が０．１２Ｍ塩化ナトリウムを有す るｐＨ６．７５の２０ｍＭリン酸緩衝液であり、前記溶出緩衝液が約０．１２− ０．５５Ｍ塩化ナトリウムを有するｐＨ６．７５の２０ｍＭリン酸緩衝液である ことを特徴とする請求の範囲第１４項、第１５項、第１６項または第１７項のい ずれかに記載の工程。 １９．段階（ｅ）の濃縮が、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に対 して２０ｍｇ／ｍｌの濃度まで透析ろ過することによって達成されることを特徴 とする請求の範囲第１４項、第１５項、第１６項、第１７項または第１８項のい ずれかに記載の工程。 ２０．ＣＨＯ細胞系統から発現された活性組換えヒトインタロイキン−４の粗溶 液を精製するための工程で、 （ａ）中性からわずかにアルカリ性ｐＨでかつ１３乃至１５ｍＳの前記ＩＬ−４ の緩衝組溶液を架橋アガロースゲルマトリックスカラムによる陽イオン交換クロ マトグラフィにのせ、この活性組換えヒトインタロイキン−４を選択的にカラム に結合させ、平衝緩衝液で洗浄し、かつイソクラテイカリにこの活性ＩＬ−４を カラムから溶出すること；（ｂ）段階（ａ）からの緩衝液中活性ヒトＩＬ−４溶 液を、（ａ）の陽イオン交換カラムのベッドボリユームの約１５％を有する小さ い陽イオン交換カラムによるクロマトグラフィにかけ、平衝緩衝液で洗浄し、結 合した活性ＩＬ−４をカラムから０．１２−０．５０Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ ７．２の緩衝液系で勾配溶出し、活性溶出物をプールすること； （ｃ）溶出物プールのｐＨをｐＨ７．２および伝導度４５−５０ｍＳに調節し、 次に、このプール溶出物を約ｐＨ６．７乃至８でかつ約０．５Ｍ塩化ナトリウム 含有緩衝液中の金属キレートアガロースゲルカラムにかけ、次にこのカラムを中 性に近いｐＨで０．５Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液で洗浄し、次に、この活性Ｉ Ｌ−４を０．５０Ｍ塩化ナトリウム含有ｐＨ６．０の緩衝液で溶出すること；（ ｄ）段階（ｃ）からの溶出物をｐＨ４．５で、１０，０００分子量未満の物質を 通過させる撹拌セル膜上で濃縮しかつ透析ろ過すること；（ｅ）段階（ｄ）から の濃縮物を、ｐＨ４．５の緩衝系で平衝にしたアリルデキストランおよびＮ，Ｎ ′−メチレンビスアクリルアミド架橋共重合体ゲルによるサイズ排除クロマトケ ラフイカラムに供すること；および（ｆ）活性組換えヒトインタロイキン−４の 精製溶液を回収すること、からなる工程。 ２１．段階（ａ）において、前記平衡緩衝液が０．１２Ｍ塩化ナトリウム濃度を 含有しｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液であることを特徴とする請 求の範囲第２０項に記載の工程。 ２２．段階（ｂ）において、前記溶出緩衝液が、その中に０．１２−０．５０Ｍ の塩化ナトリウム勾配を有する２０ｍＭのｐＨ７．２のリン酸ナトリウムであり 、金属キレートゲルカラムがコバルトキレートアガロースゲルであることを特徴 とする請求の範囲第２０項または第２１項に記載の工程。 ２３．段階（ｃ）において、前記溶出緩衝液が０．５０Ｍ塩化ナトリウムを含有 するｐＨ６．０の２０ｍＭリン酸緩衝液であることを特徴とする請求の範囲第２ ０項、第２１項または第２２項のいずれかに記載の工程。 ２４．段階（ｄ）の濃度が、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に対 して２０ｍｇ／ｍｌの濃度まで透析ろ過することによって達成されることを特徴 とする請求の範囲第２０項、第２１項、第２２項、または第２３項のいずれかに 記載の工程。 ２５．段階（ｅ）において、カラムが１０ｍＭクエン酸ナトリウムで平衝とされ ていることを特徴とする請求の範囲第２０項、第２１項、第２２項、第２３項ま たは第２４項のいずれかに記載の工程。