JPH0940575A - インタロイキン−４による好中球数の増加および骨髄細胞成熟誘発 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＩＬ−４を用いる好中球数の増加、骨髄細胞
成熟誘発の提供。 【解決手段】 ＩＬ−４を有効成分とする好中球数増
加、骨髄性または単球白血球治療用および未成熟骨髄性
または単球白血球の成熟誘発用医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、哺乳類における好
中球数の増加および骨髄細胞成熟誘発のための医薬組成
物に関する。

【０００２】

【従来の技術】インタロイキン−４(ＩＬ−４)は、広い
範囲の免疫細胞刺激活性を有するリンホカイン(免疫系
の刺激剤)である[Ｂanchereauら、Ｌymphokine Ｒes．
第６巻、１号; Ｕ１３５(１９８７); Ｙokotoら、Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ５８９４−５
８９８(１９８６); Ｌeeら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓc
i．ＵＳＡ, ８３: ２０６１−２０６５(１９８６); Ｃo
ffmanら、Ｊ．Ｉmmunol．１３６: ９４９−９５４(１９
８６); Ｓandersonら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ, ８３: ４３７−４４０(１９８６); Ｇrabstein
ら、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６２: １７２６−１７３１(１
９８５); およびＶitettaら、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６２:
１７２６−１７３１(１９８５)]。ＩＬ−４は、Ｂ細胞
増殖因子(ＢＣＧＦ)[Ｂutlerら、Ｊ．Ｉmmunol．１３
３: ２５１−２５５(１９８４)(ヒトＢＣＧＦ); および
Ｆarrarら、Ｊ．Ｉmmunol．１３１: １８２８−１８４
２(１９８３)(マウスＢＣＧＦ)]およびＢ細胞刺激因子
１(ＢＳＦ−１)[Ｏharaら、Ｊ．Ｉmmunol．１３５: ２
５１８−２５２３(１９８５)]と、さまざまな時点で呼
ばれている。インタロイキン−４という名称は、１９８
６年に最終的に提起されかつ採択された[Ｓanderson
ら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ４３
７−４４０(１９８６)]。

【０００３】ＩＬ−４は、当初、活性化Ｂ細胞の刺激の
ためにのみ重要であると考えられていた[Ｒoehmら、
Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６０: ６７９−６９４(１９８
４)]。しかし、また、Ｔ細胞および肥満細胞の活性を改
変することも示された[Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ, ８３: ５６５４−５６５８(１９８６)]。同様
に、Ｔ細胞増殖因子およびＢ細胞増殖因子としてのＩＬ
−４活性が種々の感染に対する自然の防御を増強するた
めに有用であると記載しているＷＯ８７／０２９０を参
照。Ｔ細胞およびＢ細胞は、免疫応答の後期段階におい
て作用する。感染の初期段階において作用し、そして感
染に対する体の最初の防御系である好中球を増加させ、
かつ活性化するような薬剤を有することは、極めて有益
である。細胞は、白血球造血の正常過程において、幹細
胞として公知の始原未成熟細胞から骨髄において発生
し、異なる系統(lineage)経路で漸次により成熟な段階
を経て分化し、単球、顆粒球またはリンパ球として分化
の最終状態に到達する。未成熟、未分化細胞の特性は、
急速に増殖する能力である。前駆細胞がこれらの増殖段
階を経て成熟しかつ分化するときにのみ、それは、一般
に、増殖する能力を喪失しかつ特定された機能的成熟細
胞の役割を担う。正常状態では、その最終成熟形態に到
達した細胞は、いかなる程度にも全く増殖しない。

【０００４】一般に、腫瘍は、細胞分化の障害である。
特に、骨髄性白血病は、単球および顆粒球系統の細胞が
成熟の初期段階で阻害され、したがって、その増殖能を
喪失した障害である。これらの成熟阻止細胞は増殖し続
けるので、それらは未成熟細胞群を発生させ、その結
果、白血病が診断される。種々の骨髄性白血病細胞を正
常マクロファージおよび顆粒球に分化させるように誘導
できること、および、これらの細胞は、分化するとその
増殖能を喪失することの証拠がある。このことは、薬剤
による最終的分化の誘導が骨髄性白血病の治療として有
用であることを示唆している。

【０００５】

【発明の解決すべき課題および課題を解決する手段】さ
て、我々は、驚くべきことに、ＩＬ−４の投与は哺乳類
における好中球数を増加させること、および好中球およ
び単球の分化を刺激することを見いだした。さらに驚く
べきことに、我々は、好中球に対する効果はＩＬ−４投
与を停止後も長く持続することを見いだした。このこと
は、ＩＬ−４の体内における半減期が極めて短いことか
ら極めて驚くべきことである。我々は、従って、ＩＬ−
４が哺乳類に投与して好中球の数を増加させ、かつ、感
染に対して宿主耐性を増強させるかまたは感染を極めて
早い段階に治療できることを発見した。この哺乳類は、
たとえば重度火傷または潰瘍を有する患者のように望ま
しくない細菌感染に感受性のイムノコンプロマイズ宿
主、免疫防御が腫瘍治療における放射線または化学療法
のために低下している宿主、および遺伝的免疫不全宿主
であることができる。これらのＩＬ−４特性は、また、
創傷部位における好中球および単球活性化および繊維芽
細胞増殖を刺激することによって、それが、傷口または
火傷のような創傷の治癒のために局所投与において有用
であることを示唆している。

【０００６】我々は、また、ＩＬ−４が骨髄性および単
球様細胞の成熟を誘発することを発見した。骨髄性白血
病は未成熟骨髄細胞の増殖に関連しているので、骨髄性
細胞をその成熟状態に進行させることによって、ＩＬ−
４は、その増殖を低下させ、骨髄性白血病を治療する手
段を提供するはずである。好適には、前記哺乳類は、ヒ
ト由来のＩＬ−４によって、すなわち、大腸菌(Ｅ．col
i)またはＣＨＯ細胞から組換え法によって産生されたヒ
トＩＬ−４のようなヒトＩＬ−４によって、治療される
であろう。最も好適には、哺乳類に対する投与は、皮下
または静注によってまたは点滴によって投与され、そし
て、１日当たり体重１kg当たり約０．１〜約３０μgの
量であろう。好適には、１日当たり体重１kg体重当たり
約１〜約１５μgの量であり、最も好適には、１日当た
り体重１kg当たり約３〜約１０μgの量であろう。

【０００７】高純度活性ＩＬ−４は、３段階工程のＩＬ
−４発現大腸菌(Ｅ．coli)の発酵培養液から得られ、こ
の工程は、 １．キレートセファロースファーストフローおよびキレ
ートセファロース６Ｂの名称でファルマシアファインケ
ミカルズ(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals; Ｐiscatawa
y, Ｎew Ｊarsey)から入手可能なキレートセファロー
スゲルのような金属キレートアガロースゲルカラムによ
るアフィニティクロマトグラフィに粗発酵培養液を供す
ること。キレートセファロースファーストフローは、セ
ファロース６ファーストフローに安定なエーテル結合で
結合したスペーサ上のイミノ２酢酸からなる。セファロ
ース６ファーストフローは、架橋アガロース６％であ
る。好適にはリン酸緩衝液である緩衝液が使用される。
使用したリン酸緩衝液は、高塩化ナトリウム濃度の、す
なわち約０．１〜１．５Ｍで、好適には１．０Ｍ、中性
〜わずかにアルカリ性pＨの、すなわち、６．７〜８
の、好適には約７．２のものが使用される。高塩濃度お
よび約７．２の中性に近いpＨは、カラムに対する活性
インタロイキン−４の結合を最大とし、かつ他のタンパ
ク質の結合を最小とする。銅、コバルトまたはニッケル
のような他の金属キレート類も使用できるが、好適な金
属キレートは亜鉛である。結合が完結した後、カラムを
２回洗浄し、最初はpＨ７．２の２０mＭリン酸ナトリウ
ムおよび１．０Ｍ塩化ナトリウム含有平衡緩衝液で行
う。次に、約１０％のグリセロールおよび低濃度のすな
わち約１５０mＭの塩化ナトリウムを２０mＭリン酸ナト
リウム緩衝液に含有するリン酸緩衝液で洗浄する。第２
の洗浄は、極めて緊密に連関し、分離が困難な不純物を
含めて不純物を除去する。最後に、活性ＩＬ−４を、
０．５０Ｍ塩化ナトリウム含有酢酸緩衝液でpＨ５．０
で溶出する。

【０００８】２．段階１からの活性ＩＬ−４の溶液を、
中性に近い約pＨ６．７５のpＨでかつほとんどの不純物
が結合しない１５mＳ(伝導度)でＳ−セファロースファ
ーストフローカラムによる陽イオン交換クロマトグラフ
ィに供する。さらに精製したＩＬ−４緩衝溶液を、次
に、カラムから溶出する; および ３．この活性ＩＬ−４溶液をpＨ４．５で２０mg／mlに
濃縮した後、１０mＭクエン酸ナトリウム、pＨ４．５で
平衡にしたサイズ排除カラムによるゲル濾過クロマトグ
ラフィに供する。次に、９５〜９９％純度な精製した活
性ＩＬ−４溶液を採取する。同様に、高純度活性ＩＬ−
４が、下記からなる工程でＩＬ−４発現ＣＨＯ細胞系統
の細胞培養培地から得ることができる: １．Ｓ−セファロースファーストフローカラムによる陽
イオン交換クロマトグラフィに約６．７〜８、好適には
７．２の中性に近いpＨで、かつほとんど不純物が結合
していない１３〜１５mＳ(伝導度)で活性ＩＬ−４含有
粗細胞培養培地を供すること。ファルマシアファインケ
ミカルズ(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals; Ｐiscatawa
y, Ｎew Ｊersey)から入手可能なＳ−セファロースフ
ァーストフローは、それにイオン交換基ＣＨ₂−ＳＯ₃ ^-
Ｎa⁺を結合させた架橋アガロースマトリックスである。
このカラムは平衡緩衝液で洗浄し、次に、精製したＩＬ
−４緩衝溶液を、０．２６Ｎ ＮaＣl含有pＨ７．２の
緩衝系によってカラムからイソクラティカリに溶出しプ
ールする:

【０００９】２．プールした段階１からの溶出物を、段
階１のカラムの約１５％のベッドボリュームである実質
的に小型のＳ−セファロースファーストフローカラムに
よる陽イオン交換クロマトグラフィに供する。このカラ
ムを平衡緩衝液で洗浄し、次に、活性ＩＬ−４分子を、
０．１２〜０．５Ｍの塩化ナトリウム勾配を有するpＨ
７．２の緩衝系によって溶出する; ３．段階２からの活性ＩＬ−４溶液を、本溶液をpＨ
７．２にかつ伝導度を４５〜５０mＳに調節した後、金
属キレートアガロースゲルカラムにおけるアフィニティ
クロマトグラフィに供する。キレートセファロースゲル
は、キレートセファロースファーストフローおよびキレ
ートセファロース６Ｂの名称でファルマシアファインケ
ミカルズ(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals; Ｐiscatawa
y, ＮewＪersey)から入手可能である。キレートセファ
ロースファーストフローは、セファロース６ファースト
フローに安定なエーテル結合で結合したスペーサ上のイ
ミノ２酢酸からなる。セファロース６ファーストフロー
は、架橋アガロース６％である。好適にはリン酸緩衝液
である緩衝液が使用される。使用したリン酸緩衝液は、
中性からわずかにアルカリ性pＨの、すなわち６．７〜
８の、好適には約７．２の約０．５Ｍ塩化ナトリウム濃
度を有するものが使用される。塩濃度および約７．２の
中性に近いpＨは、カラムに対する活性インタロイキン
−４の結合を最大とし、かつ他のタンパク質の結合を最
小とする。銅、コバルトまたはニッケルのような他の金
属キレート類も使用できるが、好適な金属キレートは亜
鉛である。結合が完結した後、カラムを２回洗浄し、最
初はpＨ７．２の２０mＭリン酸ナトリウムおよび０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有平衡緩衝液で行う。次に、この活
性ＩＬ−４を０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有するリン
酸緩衝液でイソクラティカリに溶出する;

【００１０】４．活性ＩＬ−４溶液を、好適には、ファ
ルマシア(Ｐharmacia)から入手可能なアリルデキストラ
ンおよびＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドの架橋共
重合体であるセファクリルＳ−２００ＨＲまたはＳ−１
００であるサイズ排除カラムで、pＨ４．５において２
０mg／mlまで濃縮後、pＨ４．５、１０mＭクエン酸ナト
リウムで平衡にしたこのサイズ排除カラムによるゲル濾
過クロマトグラフィに供する。次に、９５〜９９％純度
である精製した活性ＩＬ−４溶液を回収する。

【００１１】

【発明の実施の形態】いかなる適切なＩＬ−４も、本発
明で使用できる。ＩＬ−４に対する相補性ＤＮＡ類(cＤ
ＮＡ類)は、最近、いくつかの実験室でクローン化さ
れ、配列決定された。例、Ｙokotoら、Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ５８９４−５８９８(１９
８６)(ヒト); Ｌeeら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ, ８３: ４３７−４４０(１９８６(マウス)); およ
びＮomaら、Ｎature３１９: ６４０−６４６(１９８６)
(マウス)。Ｌeeら、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６３: １０８
１７(１９８８)は、ＣＨＯ細胞中における組換えヒトＩ
Ｌ−４産生を記載している。ＩＬ−４は、また、たとえ
ば、ゲンザイム(Ｇenzyme)社、ボストン、マサチューセ
ッツ州から入手可能な商品(ヒトおよびマウス)でもあ
る。さらに、非組換えＩＬ−４は、種々の培養上清から
精製された。例、Ｓandersonら、Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ４３７−４４０(１９８６)(マ
ウス); Ｇrabsteinら、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６３: １４
０５−１４１３(１９８５)(マウス); Ｏharaら、Ｊ．Ｉ
mmunol．１３５: ２５１８−２５２３(１９８５)(マウ
スＢＳＦ−１); Ｂutlerら、Ｊ．Ｉmmunol．, １３３:
２５１−２５５(１９８４)(ヒトＢＣＧＦ); およびＦar
rarら、Ｊ．Ｉmmunol．, １３１: １８３８−１８４２
(１９８３)(マウスＢＣＧＦ)。上記論文全ての開示は、
ＤＮＡおよびアミノ酸配列および本発明で使用するため
の適切なＩＬ−４材料類を得るための方法の教示のため
に本文で参考として引用している。好適には、本発明で
使用したＩＬ−４はヒトＩＬ−４であり、そして、最も
好適には、それは、Ｙokotoら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．
Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ５８９４−５８９８(１９８６)お
よび１９８７年５月２１日ＰＣＴ特許出願第８７／０２
９９０号に記載の配列を有するヒトバージョンであろ
う。上記記載論文およびＰＣＴ出願の開示は、本文で参
考として引用している。

【００１２】本発明によれば、哺乳類に対して有効量の
ＩＬ−４を投与し、単球および／または顆粒球(これは
下記: 多形核細胞類、好酸球および／または好塩基球の
すべてのいずれかである)の数を増加させる。このよう
な有効量とは、有意と見なされる少なくとも２５％の、
好適には５０％の増加数で好中球数を有意に増加させる
いかなる量のＩＬ−４としても定義される。１日当たり
体重１kg当たり約０．１〜約３０μgの好適にはヒトＩ
Ｌ−４(hＩＬ−４)であるＩＬ−４が、好適には投与さ
れる。さらに好適には、哺乳類に対して、１日当たり体
重１kg当たり約１．０〜約１５．０μgのhＩＬ−４が投
与され、そして、最も好適には、哺乳類に対して、１日
当たり体重１kg当たり約３．０〜約１０．０μgのhＩＬ
−４が投与される。投与量、頻度および期間は、好中球
および単球数のレベル(例、単球減少症または顆粒球減
少症の重度)、患者の年齢、栄養状態等のような因子に
よって変動するであろう。通常、投与は当初毎日とし、
患者の生涯にわたり定期的に継続できる。投与量および
頻度は、好中球数の初期スクリーニング時においておよ
びＩＬ−４の好中球数増加に及ぼす効果の大きさによっ
て決定できる。投与は、約１０００総好中球および／ま
たは１００総単球の許容レベルにまで好中球数を増加さ
せ、所望の生物学的効果をもたらすことを目的としてお
り、このことは、臨床状態に応じて核患者に付いて個別
に決定する必要があるであろう。さらに、１種以上のリ
ンパ球小群の増強のような選択的操作を行うこともでき
る。

【００１３】ＩＬ−４の好中球増加効果を補償するため
に、それを他の生物学的および／または薬剤学的に許容
できる化合物類と併用して投与することも有用であろ
う。例えば、それは、他の白血球増加剤[例、顆粒球−
マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)および
顆粒球−コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)]と併用するこ
ともできる。また、総白血球数および好中球数を増加さ
せる目的で、ＩＬ−４を他のインタロイキン類、例えば
ＩＬ−１および／またはＩＬ−３および／またはＩＬ−
７と併用することも有用であろう。ＩＬ−４と併用した
ＩＬ−２は、特異的かつ有用なＴ細胞機能の選択的増強
をもたらし、そして、ＩＬ−５および／またはＩＬ−６
と併用したＩＬ−４は、正常および／または新形成性Ｂ
細胞の機能および／または数を特異的に増加させる点で
有用であることができる。ＩＬ−４は、また、化学療法
剤類の用途を増加させる点で有用であることができ、ア
ルキル化剤、減数分裂紡錘体毒物または抗腫瘍抗生物質
類を含むが、それらに限定されない。白血球数または細
胞特定小群の機能または分化状況を増強させることによ
って、上述の化学療法剤の効果が増強できる。例えば、
ガンマーまたはアルファインタフェロンとのＩＬ−４の
併用は、また、ある白血球、特にＴ細胞サブセットの数
および機能を増加させる点で有用であることができる。
ある状況では、必要な生物学的効果を達成するため、上
述のインタロイキン類またはインタフェロンのいずれか
に対する抗体類も、天然分子の代わりに投与できる。

【００１４】前記投与量の投与は、静注、鼻腔、非経
口、経口、皮下、筋注、局所または経皮経路またはいか
なる他の許容できる経路によることもできる。このＩＬ
−４は、いかなる数の従来の投与形態でも投与できる。
非経口調製物は、無菌溶液または懸濁液を含む。吸入投
与は、鼻腔また口腔スプレーの形態またはガス注入によ
って、実施することができる。局所投与形態は、クリー
ム剤、軟膏、ローション剤、経皮装具類(例、従来のレ
ザバーまたはマトリックスパッチタイプ)等であること
ができる。上記投与形態によって検討した処方および薬
剤組成物は、従来法を用いて従来の薬剤学的に許容でき
る賦形剤および添加剤によって調製できる。現在、ＩＬ
−４は、好適には静脈内経路によって投与される。投与
すべき溶液は、再構成凍結乾燥粉末類であり、それら
は、さらに、保存剤、緩衝液、分散剤等を含むことがで
きる。好適には、ＩＬ−４は、１０ミルモルのクエン酸
緩衝液および保存剤を含まない無菌水で１ml当たり１０
０μgを超えない最大濃度に再構成され、連続点滴によ
ってまたは静注によって投与される。連続点滴のため
に、１日投与量は、正常生理食塩水５mlに添加でき、そ
して、本溶液を機械的ポンプまたは重力によって点滴で
きる。哺乳類における好中球数増加に及ぼすＩＬ−４の
効果は、下記の試験プロトコールによって決定できる。

【００１５】図１に示したアミノ酸配列を有する大腸菌
(Ｅ．coli)由来ヒトＩＬ−４を、サイノモロガスサルに
おける１カ月の研究で評価した。ＩＬ−４は、２、１０
および２５μg／kg／日の投与量で、１日１回、静注投
与した。サルの血液試料の血清学的および臨床検査を投
与前、投与時および投与終了１カ月後の選択した時点で
行った。データは、クールター(Ｃoulter)Ｓ＋４血清分
析機器[総白血球数]および手動による差分計測に由来し
た。図２に示した結果は、本発明によってもたらされる
好中球数の増加を示している。ＩＬ−４による好中球の
活性化は、下記の試験プロトコールによって示すことが
できる。

【００１６】方法Ａ．細胞の単離 ＩＬ−４(２５μg／kg)または賦形剤投与終了４週後の
サイノモロガスサルから採取した全血または賦形剤を、
６％デキストランによる重力沈降に供し、低張生理食塩
水またはＴris塩化アンモニウムによって交互に溶解
し、白血球を回収した。Ｂ．酵母食細胞アッセイ 食作用アッセイは、ヒト血清３００μl、熱死滅酵母粒
子(１０⁸菌／ml)を、約５×１０⁵個の単離白血球細胞を
含有する１２×７５mmのポリプロピレン試験管に添加す
ることによって行った。インキュベーションは、３７℃
のジャロロータリ(gyrorotary)水浴中で９０分間行っ
た。遠心分離後、細胞懸濁物を０．４％トリパンブルー
および０．２％エオシンＹ生理食塩水溶液によって染色
した。消化された酵母は無色のままであったが、未消化
の酵母は紫色に染色され、食細胞の百分率とともに結合
力(消化された酵母の数)を正確に決定できた。これらの
パラメータについて得られた平均値をかけ算して、各サ
ルの食作用インデックスを計算した。データは、Ｓtude
nt's Ｔテストによって解析し、ＩＬ−４処理サルの値
を賦形剤のみを投与された対照群サルのそれと比較し
た。結果を、表１に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】Ｃ．ＮＢＴアッセイ 上記のように単離後、サイノモロガスサルからの白血球
を、２％熱不活化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１
６４０ ０．２ml中に再懸濁し、そして１２×７５mmの
ポリプロピレン試験管に分配した。各試験管に対して、
ニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)の２％ＲＰＭＩ溶
液２mg／ml、２％ＲＰＭＩ中０．２５μＭストックの新
鮮調製ホルボール１２−ミリステン酸１３−酢酸(ＰＭ
Ａ)の０．１mlを細胞に添加した。細胞懸濁物を３０分
間、３７℃の水浴中でインキュベートした。インキュベ
ーション後試験管を遠心分離し、上清を細胞ペレットか
ら除去した。細胞ペレットを３７℃で１時間乾燥させ、
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)で抽出した。Ｄ
ＭＦ１mlを細胞ペレットに添加し、ボルテックス後、す
ぐに８５℃で２０分間インキュベートした。この試験管
を遠心分離し、着色ＤＭＦを採取し、ＤＭＦブランクに
対して５６０nmで分光光度計で分析した。全ての測定
は、インキュベーション停止後３０分以内に行った。還
元ＮＢＴ(ＮＢＦ; μg／ml)の計算は、ＭＢＴストック
溶液２mg／mlの順次希釈液をワットマン濾紙にスポット
し乾燥させ、これを用いて作製した標準曲線から行っ
た。標準曲線について、ＮＢＴは、１nＭアスコルビン
酸の０．２ＮaＯＨ溶液に暗所で２０分間室温で暴露す
ることによって還元した。濾紙類はＤＭＦで抽出し、５
６０nmで読み取った。ＮＢＦ／細胞の計算は、μg／ml
のＮＢＦを試料１ml当たりの細胞数で割ることによって
得、結果を表２に示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】上記結果は、投与４週後にＩＬ−４処置サ
ルから得られた白血球食作用インデックスが対照群動物
から得られた白血球に対して有意に増加したことを示し
ている。この食作用インデックスの増加は、酵母消化細
胞の百分率の増加によった。ＩＬ−４投与後群からの細
胞(細胞１個当たりの感染酵母の数)の結合活性がわずか
に増加した。細胞１個当たりのＮＢＦpg／細胞として測
定したＮＢＴ色素還元応答は、賦形剤対照群のサルから
の細胞と比較して、ＩＬ−４処理サルから採取した細胞
で増加した。これらの２つのアッセイ、酵母細胞消化お
よびＮＢＴ色素還元は、食作用、および感染剤の破壊を
もたらす一連の事象において重要な段階である代謝的変
化(レスピラトリバースト)の測定値である。両方のパラ
メータで得られた増加は、ＩＬ−４が食作用応答を増加
させるかまたは増幅させることができることを示してい
る。Ｕ９３７は、彌慢性組織球性白血病患者の悪性腫瘍
細胞から確立された細胞系統(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９
３)である[Ｓunstormら、Ｉnt．j．Ｃancer１７: ５６
５−５７７(１９７６)]。この細胞系統は、それが未成
熟単球であることを示唆する特性を示している。

【００２１】ＨＬ−６０は、急性前骨髄球性白血病の患
者から得られた細胞系統(ＡＴＣＣＣＣＬ２４０)であ
る。これらの細胞は、それが未成熟好中球であることを
示唆する特性を示す。ＩＬ−４は、これらの２種の未成
熟細胞の分化を誘発することができ、これは、食作用機
能の増加、食作用にとって代謝必須であるヘキソース(h
exase)１リン酸シャント(ＮＢＴ還元)の活性化上昇、成
熟好中球(ナフトールクロロアセテートエステラーゼ)ま
たは成熟単球(アルファナフチルアセテートエステラー
ゼ)に特異的な色素を取り込むことができる細胞の百分
率の増加および成熟単球または成熟好中球のＦＡＣＳ解
析によって示される表面マーカー類が陽性の細胞増加に
よって明らかとされる。ＩＬ−４の骨髄性細胞の成熟に
及ぼす効果は、下記の試験操作によって示すことができ
る。

【００２２】ホルマザンへのＮＢＩ(ニトロブルーテト
ラゾリウム)還元 レスビラトリバースト関連ヘキソース１リン酸シャント
活性化の測定 Ｍullerら、Ａgents ＆ Ａctions １１: ３８４(１９
８１) Ｂaehnerら、Ｎew Ｅng．Ｊ．Ｍed．２７８: ９７１
(１９６８) ＳalinおよびＭcＣord、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．５４: １
００５(１９７４) Ｕ−９３７およびＨＬ−６０細胞系統とともに使用する
ための標準化 １．１Ｅ６細胞／ウェルアッセイに十分な標的細胞の釣
菌。ソルバール(Ｓorvall)上での１２００rpm、５分間
の遠心沈澱。 ２．十分なＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ(２％)中で細胞を増殖
させ、０．２ml／ウェルアッセイに一定量分割する。 ３．細胞を、２４ウェル平底プレート中に０．２ml／ウ
ェルで一定量分割する。 ４．２％の２０μＭ ＰＭＡ ０．１mlを(各ウェルに)
添加する。 ５．２％のＮＢＴ２mg／ml ０．１mlを(各ウェルに)添
加する。 ６．プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。 ７．細胞０．１mlをすぐに除去し、シャンドンサイトス
ピン(Ｓhandon Ｃytospin)を用いて５分間、２００rpm
で(低加速)遠心分離する。 ８．ジフ・クイック(Ｄif−Ｑueck)システムで逆染色
し、計数のためにカバーをのせる。

【００２３】上記に述べた酵母食作用アッセイは、ま
た、同一方法論を用いて両方の細胞系統に付いて行っ
た。ＰＭＮＳのためのナフトールＡＳ−Ｄクロロアエテート
エステラーゼ染色 Ｙamら、Ａm．Ｊ．Ｃlin．Ｐath．５５: ２８３(１９７
１) Ｌiら、Ｊ．Ｈistochem．Ｃytochem．２１: １(１９７
３)ＨＬ−６０細胞系統染色のための標準化 １．シャンドンサイトスピンを用いて、２００rpm(低加
速)で５分間、顕微鏡スライド上に１−５Ｅ５細胞を遠
心分離する。 ２．クエン酸−酢酸−ＭeＯＨ固定液中でスライドを室
温(Ｒ．Ｔ．)で固定する。 ３．脱イオン(d．i．)水で洗浄しそして２０分間乾燥す
る。 ４．ＡＳ−Ｄ染色液中で３７℃で３０分間、暗所でスラ
イドを染色する。 ５．３Ｘを脱イオン水で洗浄する。 ６．酸ヘマトキシリン染色で５分間逆染色する。 ７．３Ｘを脱イオン水で洗浄し、風乾し、カバーをのせ
る。クエン酸−アセトン−ＭeＯＨ固定 ;クエン酸濃縮物を脱
衣温水で１:９に希釈する。クエン酸溶液１８ml、アセ
トン２７ml、および無水ＭeＯＨ(メタノール)５mlを添
加する。室温に保存する。毎日調製。

【００２４】ＡＳ−Ｄ染色 トリズマル(Ｔrizmal)６．３を脱イオン水で１:９に希
釈する。希釈トリズマル６．３ ５０mlを３７℃まで温
め、そして、ファーストコリンス(Ｆast Ｃorinth)Ｖ
塩１カプセルの内容物を絶えず撹拌して添加する。塩が
完全に溶解したとき、２mlのナフトールＡＳ−Ｄクロロ
酢酸溶液を添加する。この溶液は、極めて濁って見える
であろう。１５〜３０分撹拌を継続し、コプリン瓶に添
加する。濾過はしない。ＡＳ−Ｄ溶液 ナフトールＡＳ−Ｄクロロ酢酸１カプセル(２０mg)を２
mlジメチルホルムアミド中に溶解する。使用直前に調製
する。シグマキット９０−ＡＳ−Ｄクロロ酢酸を使用す
る。マクロファージのためのアルファナフチルアセテートエ
ステラーゼ染色 Ｙamら、Ａm．Ｊ．Ｃlin．Ｐath．５５: ２８３(１９７
１) Ｌiら、Ｊ．Ｈistochem．Ｃytochem．２１: １(１９７
３)

【００２５】Ｕ−９３７細胞系統染色のための標準化 １．シャンドンサイトスピンを用いて、２００rpm(低加
速)で５分間、顕微鏡スライド上に１−５Ｅ５細胞を遠
心分離する。 ２．クエン酸−アセトン−ＭeＯＨ固定液中でスライド
を室温(Ｒ．Ｔ．)で固定する。 ３．精製／脱イオン(d．i．)水で洗浄し、２０分間風乾
する。 ４．ＮＥ染色液中で３７℃で３０分間、暗所でスライド
を染色する。 ５．３Ｘを精製／脱イオン水で洗浄する。 ６．マイヤーズ(Ｍayer's)ヘマトキシリンで５分間、室
温で逆染色する。 ７．精製／脱イオン水で洗浄し、風乾し、カバーをのせ
る。クエン酸−アセトン−ＭeＯＨ固定 ;クエン酸濃縮物を精
製／脱イオン水で１:９に希釈する。クエン酸溶液１８m
l、アセトン２７ml、および無水ＭeＯＨ(メタノール)５
mlを添加する。室温に保存する。毎日調製する。

【００２６】ＮＥ染色:トリズマル７．６(モノ[トリス
(ヒドロキシメチル)−アミノメタン]マレイン酸; ７．
６)を精製／脱イオン水で１:９に希釈する。希釈トリズ
マル７．６を３７℃に温め、そして、ファーストブルー
(Ｆast Ｂlue)ＲＲ塩(４−ベンゾイルアミン−２,５−
ジメトキシベンゼン−ジアゾニウムクロリドヘミ[塩化
亜鉛]塩)１カプセルの内容物を絶えず撹拌して添加す
る。塩が完全に溶解したとき、２mlのＮＥ溶液を添加す
る。この溶液は黄色で、わずかに濁っているであろう。
１５〜２０分撹拌を継続し、そして、コプリン瓶に添加
する。濾過はしない。

【００２７】ＮＥ溶液:１カプセル(２０mg)のアルファ
ナフチルアセテートを２mlのエチレングリコールモノメ
チルエーテルに溶解する。使用直前に調製する。シグマ
キット９０−アルファナフチルアセテートを使用する。
ＨＬ−６０細胞およびＵ−９３７細胞を用いる上記の操
作の結果は、表３および４に記載する。

【００２８】

【表３】

【００２９】

【表４】

【００３０】単球および好中球表面マーカー類の蛍光標
示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)解析 ＨＬ−６０およびＵ−９３７細胞は、Ｔ−７５フラスコ
中で３７℃でかつ５％ＣＯ₂でレベルが上昇するＩＬ−
４(大腸菌(Ｅ．coli)由来ヒト組換えＩＬ−４(rhuＩＬ
−４)、(８−ＩＬＥ−１００２)または対照群とともに
インキュベートした。細胞は分裂し、第３日に供給し
た。第１、３および６日に、細胞を取り出し、ＲＰＭＩ
１６４０で洗浄し、かつヒト加熱凝集ＩgＧでブロック
し、潜在的Ｆc干渉を低下させた。再度ＲＰＭＩ１６４
０で洗浄後、細胞を５０μlの希釈抗体(下記のモノクロ
ーナル抗体一覧の表を参照)に再懸濁し、そして氷上で
３０分インキュベートした。細胞を次にＰＢＳで洗浄
し、１００μlの希釈ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩgＧま
たはＩgＧ_2bに再懸濁し、そして、氷上で３０分インキ
ュベートした。第２抗体とインキュベーション後、細胞
を再度ＰＢＳで洗浄し、次に１mlのＰＢＳ中に再懸濁
し、ベクトンディキンソン(Ｂeckton Ｄickson)ＦＡＣ
Ｓcanで操作し、細胞蛍光解析を行った。マウスＩgＧ_2b
およびＩgＧ₁のためのアイソタイプ対照群および第２抗
体対照群についても行い、本質的(constituative)発現
レベルを上回る陽性細胞の増加を調べた(すなわち、発
現増強のＩＬ−４誘導)。

【００３１】 モノクローナル抗体一覧 Ｍab Ｉgアイソタイプ 分化のクラスター 特異性 ＷＥＭＧ11 muＩgＧ₁ ＵＮＫ. gp110: 顆粒球 ＦＭＣ32 muＩgＧ₁ ＵＮＫ. 骨髄単球 ＯＫＭ−１ muＩgＧ_2b ＣＤ11b ＣＲ−３ 抗−ＬeuＭ５ muＩgＧ_2b ＣＤ11c 一本鎖 (gp150−95) 抗−ＣＲ−１ muＩgＧ₁ ＣＤ35 Ｃ３b,ＣＲ−１ 抗−ＬeuＭ３ muＩgＧ_2b ＣＤ14 単 球 上記ＦＡＣＳ解析の結果は、図３および図４に示した。

【００３２】ヒトＩＬ−４発現プラスミドpdhfr−ＳＲ
α２６３の構築 プラスミドpＳＲα−ＣＡＴ１９６, pcＤ１３７、pcＤ
−ＳＲα２０５、pcＤhＩＬ−４クローン１２５およびp
cＤ−ＳＲα２２４の構築は記載されている(Ｔakabe
ら、Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology, ８: ４６
６−４７７(１９８８); およびＹokotoら、Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ５８９４−５８９８
(１９８６)。図１に示したように、プラスミドpcＤ−Ｓ
Ｒα２０５は、pＳＲα−ＣＡＴ１９６由来３７３bpの
ＮcoＩ−ＸhoＩ ＳＲαプロモータ、pＣＴ１３７由来
４３４bpのＸhoＩ−ＳstＩスプライス部位(ＳＪ)および
５'マウスＩＬ−４(mＩＬ−４)断片、および同様にpＣ
Ｄ１３７由来４３４bp ＸhoＩ−ＳstＩＳＲαスプライ
ス部位(ＳＪ)および５７マウスＩＬ−４(mＩＬ−４)断
片、および、３'マウスＩＬ−４cＤＮＡ、ＳＶ４０ポリ
アデニル化領域および複製開始部およびアンピシリン耐
性遺伝子含有pＢＲ３２２由来プラスミド骨格を含有す
る同様にpＣＤ１３７由来３２１bp ＳstＩ−ＮcoＩ断
片の３分子連結によって構築された。

【００３３】Ｇ−Ｃテイルは、下記のようにpＣＤ−hＩ
Ｌ−４クローン４６から欠失していた(Ｙokotoら、Ｐro
c．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: ５８９４−５
８９８)。オカヤマ−バーグプラスミドpＬ１(Ｏkayama
およびＢerg、Ｍolecular and Ｃellular Ｂiology,
３: ２８０−２８９(１９８３)はＰstＩによって制限
切断され、そして、４個のヌクレオチドオーバハング
は、Ｔ４ポリメラーゼの３'−５'エクソヌクレアーゼ活
性によって除去された。ＢgｌＩＩリンカーは平滑ＤＮ
Ａ末端に連結後、ＢgｌＩＩおよびＨindＩＩＩによる制
限切断を行った。pＬ１のＳＶ４５配列含有ＨindＩＩＩ
ＢgｌＩＩ断片を単離し、ＢgｌＩＩ／ＨindＩＩＩ制
限切断pcＤ−ＭＣＧＦ(Ｙokotoら、Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．ＵＳＡ, ８３: １０７０−１０７４(１９８
４))に挿入し、中間体プラスミド１０１を得た。プラス
ミドpcＤ−hＩＬ−４クローン４６由来精製した３１１b
pのＰst断片は、Ｓau３Ａ−Ｉで制限切断され、これ
は、ＢgｌＩＩと共存するオーバハングを有する１６３b
p断片を放出する。

【００３４】１６２bp断片は、ＢgｌＩＩ制限p１０１に
連結され、中間体１１２を得た。このＳＶ４０およびヒ
トＩＬ−４cＤＮＡ配列類を含有するp１１２のＨindＩ
ＩＩ／ＮheＩ断片をＨindＩＩＩ／ＮheＩ制限クローン
４６ＤＮＡに連結し、ＳＶ４０初期モータ、ＳＶ４０ス
プライス部位およびＧ−Ｃテイルを欠失した完全ヒトＩ
Ｌ−４cＤＮＡを含有するpcＤ−hＩＬ−４クローン１２
５を生成した。プラスミドpcＤ−Ｓrα２２４は、(ＳＪ
およびmＩＫ−４cＤＮＡを含有する)pcＤ−ＳＲα２０
５の小さいＸhoＩ断片を、上記のようにＳＪおよびＧ−
Ｃテイル欠失ＨＩＬ−４cＤＮＡ含有pcＤhＩＬ−４クロ
ーン１２５の小さいＸhoＩ断片で置換することによって
構築した。

【００３５】図１に示したように、ＳalＩ部位は、Ｅco
ＲＩ−ＢamＨＩ制限切断、前記オーバハングのクレノウ
ポリメラーゼ充填およびオクタヌクレオチドＳalＩリン
カーへの結合によって、pＭＴＶdhfrに導入した(Ｌee
ら、Ｎature、２９４: ２２８−２３２(１９８１))。プ
ラスミドpＭＴＶdhfr２５９は、従って、ＥcoＲＩおよ
びＢamＨＩの制限部位を欠失し、前記２つの間の領域を
ＳalＩリンカーによって置換する。Ｓrαプロモータ、
ＳＶ４０ＳＪ、ヒトＩＬ−４cＤＮＡおよびＳＶ４０ポ
リアデニル化シグナル類を含有するpcＤ−ＳＲα２２４
の小さいＳalＩ断片をpＭＴＶdhfr２５９の唯一のＳal
Ｉ部位に挿入した。最終的ヒトＩＬ−４発現プラスミ
ド、pdhfr−ＳＲα２６３は、下記の要素をＳalＩ部位
から時計と逆回りに含有している: １．pＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子および複
製開始点 ２．pＭＴＶdhfr由来ＭＭＴＶ ＬＴＲ駆動dhfr発現単
位 ３．ＳＲαプロモータ ４．ＳＶ４０由来スプライス部位 ５．ヒトＩＬ−４cＤＮＡ ６．ＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル ベクター中に存在するヒトＩＬ−４cＤＮＡ配列は、Ｙo
kotoら、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ, ８３:
５８９４−５８９８(１９８６)に記載のpcＤ−ＨＩＬ−
４クローン４６中のものと同一である。

【００３６】ＤＨＦＲ遺伝子増幅およびＩＬ−４ Ｓ１
系統の選択 ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を欠失したチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞変異株(ＣＨＯ−dhfr^-)は、種々の
組換えタンパク質類の過剰産生のために広く用いられて
いる。(Ｋaufmanら、Ｍolecular and Ｃellular Ｂi
ology, ５: １７５０−１７５９(１９８５))。ＣＨＯ−
dhfr−変異細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグ
リシンに対する栄養要求性を有している。dhfrマーカー
を組み込んだ発現ベクター類は、この変異を補償するた
めに使用できる。選択は、上述の必要培地補因子不在下
において細胞を増殖させることによって達成する。遺伝
子増幅(１０００Ｘまでのコピー数増加)は、増加濃度の
破産アナログメソトレキセート(ＭＴＸ)中で細胞を増殖
させることによって、達成できる。組み込まれた組換え
dhfr座のゲノム中における増幅は、問題の遺伝子の発現
単位のコピー数を同時に増加させる結果となる(Ｒingho
ldら、Ｊ．Ｍol．Ａpplied Ｇenetics、１:１６５−１
７５(１９８１); およびＫaufmanら、ＥＭＢＯ Ｊ．、
６: １８７−１９３(１９８７))。dhfrおよびヒトＩＬ
−４のコード配列(pdhfr−ＳＲα２６３)含有プラスミ
ドＤＮＡは、上記のようにして構築した。pdhfr−ＳＲ
α２６３のＤＸＢ−ＩＩＣＨＯ−dhfr^-細胞系への移入
は、リン酸カルシウム沈澱法によって行った。(Ｇraham
およびＶan der Ｅb, Ｖirology, ５２: ５４６(１９
７８))。形質転換体は、ヒポキサンチンおよびチミジン
を欠失している選択培地(ＤＨＥＭ, ダルベッコ(Ｄulbe
cco's)改良イーグル(Ｅagle's)培地)中で選択した。３
Ｂ１２と指定されたクローンを、増幅の第１サイクルで
選択した。この３Ｂ１２クローンは、４０nＭのＭＴＸ
含有α−ＭＥＭ培地(イーグル最小必須培地)中で、耐性
クローンを選択するまで培養した。３Ｂ１２−Ａ２６と
指定されたクローンは、さらにＭＴＸ １μＭで増幅す
るために使用した。薬剤選択の第２サイクル後、３Ｂ１
２−Ａ２６−１９と指定されたクローンを、さらに展開
させるために選択した。このクローンは、１０％ＮＵ血
清Ｖによる懸濁様式による増殖に適応させ、ＩＬ−４
ＳＩと指定されたサブクローンを大量繁殖のために選択
した。

【００３７】培養物調製 マスターセルバンク(ＭＣＢ)調製のため、ＩＬ−４Ｓl
細胞を含有する２個のオリジナルスピナーフラスコを使
用した。細胞を、さらに、２回、増殖培地交換して継代
し、１００mlのスピナーフラスコ中で増殖させた(増殖
培地は、基本培地プラス０ないし１０％血清、例 ＮＵ
血清Ｖ)。各フラスコの細胞を回収し、洗浄し、１０ml
の凍結培地に再懸濁し、プールし、そして、約２．０ml
の無菌細胞保存バイアルに無菌的に入れた(凍結培地
は、基本培地プラス２０％血清であり、例 ＮＵ血清Ｖ
プラス１０％ジメチルスルホキシド)。このバイアル
を、−７０℃でゆっくりと凍結させ、そして、液体窒素
中に保存した。

【００３８】３つの凍結バイアルからの細胞類を融解
し、４〜６世代にわたって１００mlから３リットルまで
の容量が増大するスピナーフラスコ中の増殖培地に懸濁
させ繁殖させた。細胞は遠心分離によって採取し、洗
浄、そして、凍結培地に再懸濁させた。細胞懸濁物を約
２．０mlの無菌細胞保存バイアル中に無菌的に入れた。
バイアルを−７０℃でゆっくりと凍結させ、液体窒素中
に保存し、マスターセルバンク(ＭＣＢ)を構成した。マ
スターワーキングセルバンク(ＭＷＣＢ)は、１〜３個の
ＭＣＢバイアルを融解し、Ｔフラスコ中でかつ懸濁物と
して４〜６世代にわたって３リットルまで増加性容量で
細胞を繁殖させることによって、ＭＣＢから調製した。
細胞を回収し、洗浄し、凍結培地中に再懸濁し、そし
て、一定分量に分割しＭＣＢについて記載のように凍結
した。ＭＷＣＢも同様に液体窒素中に保存した。

【００３９】ＩＬ−４産生は、容量５０〜２００リット
ルのバイオリアクター中で行った。産生開始のため、Ｍ
ＷＣＢからの１凍結バイアルを融解し、Ｔ−７５フラス
コに接種した。細胞濃度が１００％コンフルエンシー
(集密)に到達するまでインキュベーションし、細胞をト
リプシン処理し、そして、２個のＴ−７５フラスコ中に
接種した(Ｔ−６０フラスコも適宜使用できる)。これら
のフラスコは、１００％コンフルエンシーになるまで再
度インキュベートし、そして、トリプシン処理細胞を用
いて１００mlスピナーフラスコに接種した。この１００
mlスピナーフラスコを適当な細胞増殖が得られるまでイ
ンキュベートして、２５０mlスピナーフラスコのための
接種物として使用した。同様の段階を１リットルおよび
３リットルフラスコ中で、かつ、１０〜２０リットルの
バイオリアクター中で繰り返した。１０〜２０リットル
リアクターからの細胞を接種物として５０〜１００リッ
トルのリアクターのために使用した。このリアクターは
当初バッチ処理で増殖させ、適当な細胞濃度に到達後、
連続培地潅流を開始した。

【００４０】増殖および連続潅流のために使用した培地
は改良イソコーブ(Ｉscove's)培地であり、それには１
０％まで(例 ＮＵ血清Ｖ)添加できる。メソトレキセー
トは、産生工程を通して全く使用しなかった。発酵段階
は、無菌条件でかつ閉鎖系で行った。温度、pＨ、撹拌
および通気のような重要発酵パラメータ類を、増殖およ
び連続潅流段階を通してモニターし適当に制御した。無
菌試料を定期的に取り出し、pＨ、細胞密度を測定し、
かつ、無菌性を検査した(細菌および真菌の不在)。適当
な容量の調製培地(潅流)を採取後、培養液をろ過し、存
在する全ての細胞を取り出し、限外ろ過によって濃縮し
た。濃縮物は粗ＣＨＯ ＩＬ−４を含有しており、最終
精製段階に供した。ＩＬ−４の粗ＣＨＯ ＩＬ−４濃縮
物からの精製は、スルホン酸カラム(Ｓ−セファロース)
による陽イオン交換クロマトグラフィによって行った。
この段階は通常繰り返した。スルホン酸カラムから選択
したプール分画を次にキレートクロマトグラフィ段階
(例 コバルトキレートセファロース)に供した。この選
択したプールキレート分画を、次に２回ろ過し、メンブ
レンろ過によって濃縮した。この濃縮をゲルろ過カラム
(例 ＨＲ Ｓ−２００)でクロマトグラフィにかけた。
精製バルクＩＬ−４を構成するプール分画を次にろ過
し、−２０℃以下で保存した。

【００４１】このような活性組換えヒトＩＬ−４の粗Ｃ
ＨＯ−ＩＬ濃縮物を精製する工程は、 (a)ＣＨＯ細胞培地からの活性ＩＬ−４の緩衝粗溶液を
中性近辺からわずかにアルカリ性のpＨで陽イオン交換
クロマトグラフィに供し、選択的にＩＬ−４を結合さ
せ、そして、イソクラティカリにＩＬ−４を溶出する。 (b)段階(a)からの溶出物を、さらに、実質的に小さなカ
ラム(段階(a)のベッドボリュームの１５％)による陽イ
オン交換クロマトグラフィに中性近辺からわずかにアル
カリ性のpＨで供し、ＩＬ−４を勾配溶出する; (c)段階(b)からの溶出物をキレートアガロースゲルカラ
ム系によるアフィニティクロマトグラフィに中性近辺か
らわずかにアルカリ性のpＨで供し、酸性緩衝液でＩＬ
−４を溶出する; (d)段階(c)からの溶出物を限外ろ過膜(１０,０００分子
量をカットオフとする)によって濃縮する;および (e)段階(d)からの活性ＩＬ−４の濃縮溶液をサイズ排除
カラムによるゲルろ過クロマトグラフィに酸性pＨで供
し、精製ＩＬ−４溶液を採取する。

【００４２】陽イオン交換クロマトグラフィは、ＣＨＯ
細胞培地をろ過して、外来性の大細胞残渣を除去後、透
析ろ過膜により１００mg／mlタンパク質まで濃縮した
後、２段階で行い、pＨはpＨ７．１〜７．３に、好適に
は７．２にそれぞれ調節する。この膜は、好適には、１
０,０００分子量未満の全ての材料類を保持する、例え
ば、米国、アミコン(Ａmicon)社、ＹＭ−１０膜または
マサチューセッツ州、ブラッドフォード、ミリポア(Ｍi
llipore)社、ペリコン(Ｐellicon)フィルターＰＴＧＣ
カセットのような膜を付属した撹拌セルである。第１段
階において、粗培地を、先に中性近辺からわずかにアル
カリ性pＨの、すなわち、pＨ６．７〜８で好適には７．
２で、０．１２Ｍ 塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液で
平衡にしたＳ−セファロースファーストフローのような
陽イオン交換クロマトグラフィカラムにのせた(レジン
１ml当たり１００mgのタンパク質まで)。これによっ
て、活性ＩＬ−４がカラムに残存し、ほとんどの望まし
くないタンパク質類および他の不純物が洗い出されるこ
とになる。この活性ＩＬ−４をイソクラティカリにカラ
ムから、好適にはpＨ７．１〜７．３の、特にpＨ７．２
でかつ２０mＭ リン酸ナトリウムおよび約０．２６Ｍ
塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で溶
出する。活性ＩＬ−４を含有する分画は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定し、プール
し、かつ、このプールをpＨ７．２および１４mＳに調整
する。

【００４３】第２段階において、この第１段階からの調
整プールを実質的に小型の(段階１のベッドボリューム
の１５％)リン酸緩衝液で平衡にした陽イオン交換クロ
マトグラフィカラムにのせ、不純物を洗い出し、活性Ｉ
Ｌ−４をカラムに残す。この活性ＩＬ−４は、ベッドボ
リューム当たり１．７５mＳの塩化ナトリウム勾配で溶
出する。溶出緩衝液は、２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ
７．２,０．１２Ｍ塩化ナトリウムの低塩緩衝液および
２０mＭ リン酸ナトリウム、０．５０Ｍ塩化ナトリウ
ムの高塩緩衝液からなる。活性ＩＬ−４を含有する勾配
分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによ
って決定し、プールし、このプールをpＨ７．２および
４５〜５０mＳに調整する。陽イオン交換クロマトグラ
フィ由来約６０〜７０％純度の活性ＩＬ−４分画プール
を、次に、キレートセファロースファーストフローまた
はキレートセファロース６Ｂのような金属処理キレート
セファロースゲルによって調製した金属キレートアガロ
ースゲルカラムによるアフィニティクロマトグラフィに
供する。このキレートカラムは、１本のカラム内で２つ
の部分からなる。カラム先端部分は、金属処理キレート
アガロースゲル、好適にはコバルト処理キレートセファ
ロースファーストフローゲルを含有し、カラムの下端
は、未処理キレートセファロースファーストフローゲル
を含有する。この２層の容量比は、１容量の未処理キレ
ートセファロースに対するコバルト処理キレートセファ
ロースで約２．３−３．０容量である。陽イオン交換ク
ロマトグラフィ処理による精製ＩＬ−４のプールをカラ
ム先端にのせ、そして、溶液フロースルーがカラム下端
に流出するに至り、ここで、いかなる残留不純物も含有
するフロースルーも出される。

【００４４】好適にはpＨ７．２の中性近辺の緩衝液お
よび好適には約０．５Ｍの塩化ナトリウムを用いること
によって、アフィニティクロマトグラフィによって金属
キレートアガロースゲルカラム好適にはキレートセファ
ロースファーストフローまたはセファロース６Ｂに活性
ＩＬ−４分子を選択的に結合させて、実質的に溶液中に
存在する夾雑タンパク質を除外するまで結合させた。こ
の活性ＩＬ−４は、カラムに残り、わずかに酸性pＨ
の、好適にはpＨ６．０の０．５ＭＮaＣl含有緩衝液で
イソクラティカリに溶出する。アフィニティクロマトグ
ラフィからの活性ＩＬ−４の精製溶液を、限外ろ過膜
(カットオフ１０,０００分子量)、好適にはＩＬ−４を
含む範囲の１０,０００分子量以上の全ての材料を保持
する膜を付けた撹拌セルによって濃縮する。好適な膜
は、米国アミコン社製造ＹＭ−１０である。得られた濃
度は、２０mg／mlまでである。２種の透析ろ過緩衝液を
使用し、最初は、０．５Ｍ 塩化ナトリウム含有２０m
Ｍ pＨ６．０のＮaリン酸緩衝液、および第２の緩衝液
は、好適には、pＨ４．５の１０mＭ クエン酸ナトリウ
ムである。

【００４５】活性ＩＬ−４の濃縮溶出物は、分子量によ
って溶液中タンパク質を分画するサイズ排除ゲルろ過カ
ラムにのせる。適切な典型的カラムは、セファクリルＳ
−２００ＨＲまたはＳ−１００ＨＲ(ファルマシア(Ｐha
rmacia))ゲルろ過カラムである。このセファクリルＳ−
２００ＨＲ(高分解能)およびＳ−１００ＨＲは、アリル
デキストランおよびＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミ
ドの架橋共重合体である。それらの分画範囲は、ダルト
ンで、それぞれ、５,０００〜２５０,０００および１,
０００〜１００,０００の範囲である。他の適切な材料
類は、架橋デキストランゲルであるセファデックス類
(ファルマシア(Ｐharmacia))である。好適には、活性Ｉ
Ｌ−４溶液を先に１０mＭクエン酸緩衝液pＨ４．５で平
衡にしたＳ−２００ＨＲカラムにのせる。より好適な態
様は、 (a) ＣＨＯ細胞培地からの活性組換えヒトＩＬ−４の
緩衝粗溶液を、１３〜１５mＳの０．１２Ｍ 塩化ナト
リウム２０mＭリン酸緩衝液、pＨ６．７〜８、好適には
pＨ７．２中で架橋アガロースゲルカラム(好適にはＳ−
セファロースファーストフロー)による陽イオン交換ク
ロマトグラフィに供し、次に、イソクラティカリにＩＬ
−４を本カラムから０．２６Ｍ塩化ナトリウム含有好適
にはpＨ７．２のpＨ７．１〜pＨ７．３の２０mＭリン酸
緩衝液で溶出し、活性ＩＬ−４分画を採取する。

【００４６】(b) 段階(a)からのＩＬ−４溶液を、さら
に、段階(a)で使用した架橋アガロースゲルカラムと同
一タイプであるが、しかし、段階(a)で使用したカラム
の１５％のベッドボリュームを有する陽イオンクロマト
グラフィにpＨ７．２〜７．５で好適には７．２で０．
１２Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液にもう一度供し、次
に、０．１２〜０．５０Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ７．
２の２０mＭリン酸緩衝液で勾配溶出し、そして、活性
ＩＬ−４分画をプールする。 (c) 段階(b)からのプールした活性ＩＬ−４を、pＨ
７．２で、好適には上端がコバルトキレートセファロー
スファーストフローまたは６Ｂゲルからなり下端が未処
理キレートセファロースファーストフローゲルからなる
金属キレートアガロースゲルカラムによるアフィニティ
クロマトグラフィに０．５Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ
７．２の２０mＭリン酸緩衝液で供し、前記２種のタン
パク質の容量比は、１容量の未処理キレートセファロー
スに対するコバルト処理キレートセファロースで約２．
３〜３．０容量であり、平衡緩衝液で洗浄し、次に活性
ＩＬ−４を０．５Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ６．０のリ
ン酸緩衝液で溶出し、そして４分画を採取する。および (d) 段階(c)からのＩＬ−４分画(プールした)を、１
０,０００分子量以上の全ての物質を保持し好適にはＹ
Ｍ−１０のようなメンブレンを付属した撹拌セル上であ
る限外ろ過膜上でpＨ４．５の２０mg／mlまで濃縮透析
ろ過し、次にこの活性ＩＬ−４濃縮物をアリルデキスト
ランおよびＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド架橋共
重合体、好適にはpＨ４．５の１０mＭクエン酸ナトリウ
ム中セファクリルＳ−２００ＨＲであるカラムで、分子
量に従ってタンパク質溶液を分画するカラムによるサイ
ズ排除クロマトグラフィに供し、そして、活性４分画を
回収する。

【００４７】段階(a)および段階(b)において、分画のp
ＨをpＨ７．２に、そして伝導度を４Ｍ ＮaＣlで１３
〜１５mＳに調節する。２種の陽イオン交換カラムのベ
ッドボリューム比は、段階(a)のＳ−セファロースカラ
ムの約６．３容量と段階(b)の陽イオン交換カラムの１
容量である。クロマトグラフィカラム中のこの陽イオン
交換ゲル材料は、０．１２Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ
７．２の２０mＭリン酸緩衝液で平衡にする。好適な陽
イオン交換体は、ファルマシア(Ｐharmacia)から入手可
能なＳ−セファロースファーストフローのような−ＣＨ
₂−ＳＯ₃ ^-Ｎa⁺基で置換された架橋アガロースである。
この活性ＩＬ−４をイソクラティカリに段階(a)で０．
２６Ｍ ＮaＣlを含有するpＨ７．２の２０mＭリン酸緩
衝液で溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質ア
ッセイで最高濃度の活性４を有する分画をプールする。
このプール分画溶液をpＨ７．２に調節し、伝導度をpＨ
７．２のリン酸ナトリウム２０mＭで１ベッドボリュー
ム当たり１３〜１５mＳに調節する。このカラムに次に
ＩＬ−４溶液をのせ、０．１２〜０．５０Ｍ ＮaＣl含
有pＨ７．２の２０mＭ リン酸ナトリウム緩衝液で１．
７５mＳ勾配を用いて溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びタンパク質アッセイで決定した採取したＩＬ−４含有
分画をプールする。陽イオン交換クロマトグラフィの条
件を選択し、活性ＩＬ−４分画が陽イオン交換マトリッ
クスに付着するように確保する。陽イオン交換クロマト
グラフィにとっては実質的に高い中性に近いpＨ７．２
および陰イオン交換クロマトグラフィにとっては実質的
に高い１３〜１５mＳの伝導度によって、ほとんどの不
純物がカラムに結合しない緩和な結合条件が生じ、溶出
は実質的に容易で、かつ高純度のＩＬ−４溶液が、すな
わち、約６０％〜７０％の溶液が得られる。

【００４８】段階(c)で使用した好適な金属キレートア
ガロースはキレートセファロース６Ｂでも十分ではある
が、キレートセファロースファーストフローである。セ
ファロース類は、ニュージャージー、Ｐiscataway,ファ
ルマシア(Ｐharmacia)の製品である。本発明の用途のた
めの好適なコバルトキレートセファロースカラムを調整
するための好適な方法は、セファロースゲルを０．０２
Ｍコバルトアセテート溶液に懸濁し、脱イオン水で洗浄
し、次に、pＨ７．２の２０Ｍリン酸ナトリウム、０．
５Ｍ ＮaＣl溶液のような平衡緩衝液でカラムを溶出す
ることによる。コバルトアセテートの代わりに、たとえ
ばコバルトクロリドまたはコバルトサルフェートのよう
な他のコバルト塩も使用できる。このクロマトグラフィ
カラムは２層を含有する１本のカラムからなり、第１ま
たは上層は金属キレートセファロースゲルからなり、第
２または下端は金属塩によって処理されていないキレー
トセファロースゲルからなる。２重カラム内の容量比
は、未処理キレートセファロースゲル１容量に対して金
属処理キレートセファロースゲル約２．３〜３．０容量
である。

【００４９】カラム平衡のために使用した好適な緩衝液
は、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ７．２〜７．５の
０．０２Ｍリン酸緩衝液である。段階(c)において、コ
バルトキレートセファロースゲルおよび未処理キレート
セファロースゲルを０．５Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ
７．２のリン酸緩衝液で平衡にし、次に、吸着した活性
ＩＬ−４を、イソクラティカリにコバルトキレートセフ
ァロースから未処理キレートセファロースゲルに０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ６．０の０．０２Ｍリン酸緩
衝液または０．５Ｍ ＮaＣl含有中性pＨの緩衝液で溶
出し、および(i)５０mＭ ＥＤＴＡ(エチレンジアミン
４酢酸)、または(ii)５０mＭイミダゾールのようなヒス
チジンアナログ、または(iii)５０mＭヒスチジンのよう
なアミノ酸で、好適であるのは、０．５Ｍ ＮaＣl含有
pＨ６．０のリン酸緩衝液である。活性ＩＬ−４含有溶
出物を採取する。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパ
ク質アッセイに基づき最大濃度の活性ＩＬ−４の分画を
プールした。

【００５０】段階(d)において、段階(c)からのプールし
た溶出分画を濃縮透析ろ過し、ゲルろ過クロマトグラフ
ィに供した。溶出分画を、１０,０００分子量以上の全
ての物質を保持する撹拌セルで濃縮し、０．０５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ(エチレンジアミン４酢酸)および０．５Ｍ Ｎa
Ｃl含有０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pＨ６．０に
対して最初に透析ろ過し、次にpＨ４４．５の０．０１
Ｍクエン酸ナトリウムに対して透析ろ過する。本工程の
この段階では活性ＩＬ−４溶液が約９０−９５％純粋で
あるので、それは濃縮溶液として膜上部に保持される。
好適な膜は、米国アミコン社製造ＹＭ−１０である。得
られた濃度は、活性ＩＬ−４約２０mg／mlである。活性
ＩＬ−４の濃度溶出物を、分子量によってタンパク質溶
液を分画するサイズ排除(ゲルろ過)クロマトグラフィに
のせる。適切な典型的カラムは、セファクリルＳ−２０
０ＨＲまたはＳ−１００ＨＲ(ファルマシア)ゲルろ過カ
ラムである。セファクリルＳ−２００ＨＲ(高分解能)お
よびＳ−１００ＨＲは、アリルデキストランおよびＮ,
Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド架橋共重合体であ
る。それらの分画範囲は、それぞれ、５,０００〜２５
０,０００および１,０００〜１００,０００である。他
の適切な物質は、架橋デキストランゲルであるセファデ
ックス類(ファルマシア)である。好適には、活性ＩＬ−
４の溶液を、先に１０mＭクエン酸ナトリウム緩衝液pＨ
４．５で平衡にしたＳ−２００ＨＲカラムにのせる。段
階(d)の条件下で、安定なＩＬ−４濃縮物は、２０mg／m
lに達することができる。これによって、ゲルろ過クロ
マトグラフィの能力および特性が向上する。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定した最大
濃度の活性ＩＬ−４含有溶出物分画を採取し、プール
後、９５〜９９％純粋な活性ＩＬ−４溶液を得る。

【００５１】上記の参考文献は、本文で、hＩＬ−４の
ためのＣＨＯ発現系の構築に使用した物質および方法の
それらの対応する教示のために本文で引用した。大腸菌(Ｅ．coli)由来ヒトＩＬ−４の構築および特性解
析 Ａ．ヒトＩＬ−４発現プラスミドpＲＧＴ８５７−１１
の構築 ヒトＩＬ−４発現プラスミドpＡＨ３、pＫＧＴ２６９−
２およびpＵＣ１９の構築については、これまで記載さ
れている。Ｌundellら、Ｊ．Ｉnd．Ｍicrobiology,１９
８９およびＹanisch−Ｐerron、Ｇene,３３:１０３−１
１９,１９８５。pＲＧＴ８５７−１１を構築するため
に、pＡＨ３を制限エンドヌクレアーゼＡvaＩによって
消化した。本酵素によって作製された５'オーバハング
は、Ｅ．coliＰolＩのクレノウ断片によって充足し、こ
のＤＮＡをＰvuＩによって消化した。ＩＬ−４およびla
ci領域を有する５．８キロベース(ＫＢ)の断片を、複製
のpＵＣ開始点を有するpＵＣ１９の１．４ＫＢ ＰvuＩ
Ｉ−ＰvuＩ断片に連結した。Ｅ．coli２９４の形質転換
後、複製のpＵＣ開始点を有するアンピシリン耐性ＩＬ
−４発現プラスミドのひとつは、図２に示したようにp
ＲＧＴ８３９−２であった。

【００５２】pＲＧＴ８３９−２およびpＫＧＴ２６９−
２は、次に、ＡatＩＩおよびＰvuＩの両方によって消化
した。ＩＬ−４およびlaci領域を有するpＲＧＴ８３９
−２の６．７ＫＢ断片を、クロラムフェニコール耐性を
コードするpＫＧＴ２６９−２の小さな１ＫＢ断片に連
結した。この連結反応は、Ｅ．coli２９４を形質転換す
るために用いた。結果として生成した形質転換体のひと
つは、pＲＧＴ８５７−１１であった。図２に示したよ
うに、このＩＬ−４発現プラスミドは、複製のpＵＣ開
始点とクロラムフェニコール耐性を有している。このプ
ラスミドは、次に、Ｅ．coli ＲＬ７３２１の形質転換
に使用した。

【００５３】Ｂ．宿主細菌 ヒトＩＬ−４産生のために使用したプラスミドpＲＧＴ
８５７−１１を有する宿主生体は、Ｅ．coliＫ−１２で
ある。この株は、Ｅ．coliＲＬ７３２１であり、先にＢ
olivarらによって、Ｍethods in Ｅnzymology,６８
巻、２４５−２６７(Ｒay Ｗu著)、Ａcademic Ｐres
s、１９７９に記載のＥ．coliＭＭ２９４の誘導体であ
る。この株は、ＥＫ１宿主に対して確立されたガイドラ
インに適合している。Ｅ．coliＲＬ７３２１をＥ．coli
ＭＭ２９４から下記のようにして単離した。Ｅ．coliＭ
Ｍ２９４のストレプトマイシン耐性形態は、Ｅ．coli２
９４Ｓと指定されており、これは、最初に先の株を、
Ｅ．coliＰＡＭ１６３[Ｊohnson,Ｂ．Ｆ．１９７７．大
腸菌(Ｅ．coli)Ｋ−１２およびＢ株微細構造のマッピン
グおよびその中でのイオン変異を抑制する変異の特性。
Ｇene．Ｒes．,３０:２７３−８６]で増殖させたバクレ
オファージＰ１cmＩ、Ｃir１００中に形質導入すること
によって単離した[Ｍiller,Ｊ．Ｈ．,１９７２,Ｅxperi
ments in Ｍolecular Ｇenetics．Ｃold Ｓpring
Ｈarbor Ｌaboratory．Ｃold Ｓpring Ｈarbor、
Ｎ．Ｙ．]。

【００５４】Ｅ．coli２９４Ｓは紫外線で突然変異を誘
起し、外膜構造に欠損がある株を単離した。細胞をＵＶ
灯で４０秒間照射した。この処理によって９９．９％の
細胞が死滅し、これは、高含量培地に接種することによ
って決定した。突然変異誘発細胞懸濁物を希釈し、暗所
で振盪しながら３時間、３７℃でインキュベートした。
この時点で、Ｔ７野生型バクレリオファージを１ml当た
り１０⁸プラーク形成単位になるまで添加した。バクテ
リオファージＴ７は、その外膜内に変異を誘発する細菌
を高含量とするための選択として使用した。Ｔ７レセプ
ターは外膜タンパク質であるリポポリサッカライド上に
あるので、一部の外膜変異は、Ｔ７感染に対する耐性と
なって現れるであろう。野生型外膜を有する細胞は、感
染に対して感受性であろうし、したがって、殺細胞され
なければならない。下記に述べる漏出性の表現形は、外
膜の透過性上昇による。バクテリオファージＴ７耐性の
外膜損傷の指標としての使用は、これまでに示されてい
る[Ｂranesら、Ｊ．of Ｂacteriology,１５４:１４６
２−１４６６,１９８３]。

【００５５】Ｔ７感染後、細胞溶解が観察されるまでフ
ラスコを３７℃で振盪した(約３０分)。Ｔ７耐性細胞は
遠心分離によって採取し、１mlの新鮮培地に再懸濁し
た。これらの細胞を、ＴＹＥ(トリプトン:酵母抽出物:
塩化ナトリウム＝２０:１０:５)寒天プレート上に接種
し、３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、各
プレートは３０〜５０のコロニーを含有していた。これ
らのコロニーは、外膜損傷のためであった。ひとつの方
法は、培地へのＲＮase漏出増加を観察することであっ
た。Ｔ７バクレリオファージ耐性クローンの単一コロニ
ー類に対して、pＨ７の１％酵母ＲＮＡ(シグマ社)含有
ＴＹＥ寒天４mlに重層した新鮮ＴＹＥ寒天プレート上に
画線した。一晩３７℃でインキュベーション後、プレー
トに１ＮＨＣlをオーバフローさせた。ハロの大きさ
は、ＲＮase活性を培地中に漏出する株を決定するため
に使用した[Ｗeigand,Ｒ．Ａ．およびＲothfield,Ｊ．o
fＢacteriology,１２５:３４０−３４５,１９７６]。
Ｅ．coli中における外膜損傷の第２の指標は、ＭacＣon
key寒天上における増殖不可である[Ｈancock,Ｒ．Ｅ．
Ｗ．,Ａnn．Ｒev．Ｍicrobiol．,３８:２３７−６４,１
９８４]。特に、ＭacＣonkey寒天に感受性でかつ実質量
のペリプラズムＲnaseＩを放出可能なＴ７耐性コロニー
３０個のひとつを、ＲＬ７と命名した。

【００５６】Ｅ．coliＲＬ７は、huＩＬ−４発現ベクタ
ーpＡＨ３(図１)によって形質転換した。このベクター
は、リンホカインを内部細胞膜を横断してペリプラズム
中に導入する。形質転換体によって使用された培地は、
その漏出をウェスタンブロット解析によって下記に記載
のhuＩＬ−４ポリクローナル抗体を用いて検索した。暗
所で少なくとも２時間増殖させた後、照射細胞を、アン
ピシリン(１００μg／ml)添加ＴＹＥ寒天プレート上に
接種し、３０℃で一晩インキュベートした。このコロニ
ーを、「ダブルディスクアッセイ」によってそのhuＩＬ
−４放出増加を検索し、これは、変異コロニー下のより
強烈な色の出現として示された。このダブルディスクア
ッセイは、下記のようにして行う。変異細胞を希釈し、
１００μg／mlアンピシリン含有ＴＹＥ寒天プレート(直
径１４２mm)上に接種した(０．１ml／プレート)。３０
℃で一晩インキュベーション後、このプレートは、約１
mm直径の５００〜２０００コロニーを含有していた。次
に、このプレートに０．４５μ孔径の１３７mmのニトロ
セルロースディスク(シュライヒャー・エンド・シュエ
ル(Ｓchleicher and Ｓchuell))でカバーをした。こ
のディスクをゆっくりと１端からのせ、ゆっくりとかつ
均等な湿潤を可能とした。このディスクをすぐに一気に
はがし、そして、コロニーを寒天プレートからニトロセ
ルロースディスクに持ち上げた。このディスクは、先に
無菌寒天プレート表面においたニトロセルロースディス
ク(またはディスク類)であった。プレートを、次に３０
℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション
後、底のディスク(またはディスク類)をコロニー保持デ
ィスクから分離させた。

【００５７】フィルター類は、１％ＢＳＡ(ウシ血清ア
ルブミン)含有１０mＭ Ｔris pＨ８、１５０mＭ Ｎa
Ｃlおよび０．０５％(v／v)Ｔween−２０(バイオラド
(ＢioＲad)、エンザイムイムノアッセイピュリティ(Ｅn
zyme Ｉmmno Ａssay Ｐurity))(ＴＢＳＴ)中で室温
で６０分間インキュベートした。次にフィルター類を、
ウサギポリクローナル抗血清(ＴＢＳＴ／ＢＳＡによる
１:１５００希釈；総huＩＬ−４決定のために使用)また
はＴＢＳＴ／ＢＳＡ１:１５００希釈；自然の構造のタ
ンパク質決定のために使用)のモノクローナル抗血清(１
１Ｂ４)のいずれかと室温で３０分間インキュベートし
た。このフィルター類をＴＢＳＴ中で３回洗浄して、次
に、３０分間、適当なアルカリ性ホスファターゼ結合第
２抗体とインキュベートした。フィルター類は３回洗浄
し、アルカリホスファターゼ基質(ピロメガバイオテッ
ク(Ｐromega Ｂiotec)によるプロトブロットシステム
(ＰrotoＢlot Ｓystem))で染色した。ブロットを次に
ストックプレートと並列させ、huＩＬ４特異的染色増加
を示したコロニーを選択した。

【００５８】疑わしいコロニーについて、非選択的培地
中での形態移行によってプラスミドを救い、次に、非選
択的ＴＹＥプレート上で画線した。アンピシリンプレー
ト上での増殖不可と判定されたコロニーについてプラス
ミド不在を検査し、ヒトＩＬ−４発現プラスミドpＲＧ
Ｔ８５７−１１によって形質転換した。これらのクロー
ンは、huＩＬ−４の放出増加を１０mlの試験管発酵によ
って得られたドットイムノブロッティング全培地によっ
て検索した。検出は、ヒトＩＬ−４(１１Ｂ４)に対する
モノクローナル抗体によって、次にアルカリホスファタ
ーゼ結合ヤギ抗ラットＩgＧで行った。高産生株として
選択された１株を、ＲＬ７３１として命名した。Ｅ．co
liＲＬ７３１／pＲＧＴ８５７／１１は、ＵＶ灯によっ
て先と同じように突然変異を誘発した。暗所で必須培地
で増殖後、細胞を抗生物質でかつ１mＭＩＰＴＧ(イソプ
ロピルβ−Ｄチオガラクトシド)添加ＴＹＥ寒天プレー
トに接種した。ＲＬ７３１／pＲＧ８５７−１１は、誘
発物質ＩＰＴＧ存在下において増殖しない。細胞は、１
ml当たり１０⁴コロニー形成単位の密度で接種した。１
プレート当たり約５〜１０コロニーが一晩インキュベー
ション後に発生した。７５個以上のコロニーを画線によ
って生成し、huＩＬ−４産生を調べた。産生レベルは、
ウェスタンブロット解析によって決定した。最も強いバ
ンドを示したクローンは、前と同じようにそれらのプラ
スミドを救い、pＲＧＴ８５７−１１によって再形質転
換し、そして、huＩＬ−４抗産生の保持を調べた。生物
活性ＩＬ−４の産生および漏出を含めて最も望ましい特
性を示しかつhuＩＬ−４発現を誘発後細胞増殖を示した
株は、ＲＬ７３２１であった。

【００５９】ヒトインタロイキン−４(ＩＬ−４)の発酵
時において、生成物は直接発酵培地に分泌される。初期
下流段階は、培地を細胞から分離しかつ次にrhＩＬ−４
を培地中に濃縮するために行う。２つの異なる工程がこ
の作業を達成するためにある。膜プロセスとトリクロロ
酢酸ナトリウム(ＴＣＡ)プロセスである。ＴＣＡナトリ
ウムプロセスにおいて、細胞はＴＣＡ塩の添加によって
不活化される。細胞を除去後、培地のpＨを低下させ金
属キレートセファロースゲル、rhＩＬ−４を沈澱させ、
そして、培地を遠心分離してrhＩＬ−４をペレットまた
はスラッジの形態で採取する。この膜プロセスは、ミク
ロフィルトレーションおよび限外ろ過の両方を使用し、
液体濃縮物の形態でrhＩＬ−４を採取する。このプロセ
スは、緩衝液で何回か洗浄することを要し、下流回収を
増加させる。rhＩＬ−４の発酵培地粗濃縮物からの生成
は、金属キレートカラム(例 Ｚn−セファロース)によ
る固定金属アフィニティクロマトグラフィを行うことに
よって行われる。選択した分画をプールして、スルホン
酸塩カラム(例 Ｓ−セファロース)による陽イオン交換
クロマトグラフィに供する。

【００６０】選択した分画をプールし、濃縮し、適当な
公称分子量の膜を含有する限外ろ過装置で透析ろ過し、
その結果生成物は濃縮物中に残存する(例 ミリポア(Ｍ
illipore)ＰＴＧＣ限外ろ過膜による)。透析ろ過した濃
縮物をさらにゲルろ過カラム(例 Ｓ−２００ＨＲによ
って)によるクロマトグラフィによって生成する。生成
したバルクrhＩＬ−４を構成するプール分画を次にろ過
して、−２０℃以下で保存する。Ｅ．coliからの活性組
換えヒトＩＬ−４の粗溶液を生成する工程は、従って、
下記からなる: (a)中性からわずかにアルカリ性pＨでかつ約０．５〜
１．５モルの塩化ナトリウムを含有する前記ＩＬ−４の
緩衝粗溶液を金属キレートアガロースゲルによるアフィ
ニティクロマトグラフィに供し、選択的にこのＩＬ−４
を結合する; (b)このカラムを最初に、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有
２０mＭ リン酸ナトリウム平衡緩衝液,pＨ７．２で洗
浄し、次に、１０容量％のグリセロールおよび約１５０
mＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で洗浄する; (c)結合したＩＬ−４を、キレート剤、ヒスチジンアナ
ログまたはアミノ酸含有酸性pＨの溶出緩衝液または中
性pＨ緩衝液で溶出する; (d)段階(c)からの活性ＩＬ−４を、Ｓ−セファロース
(ファルマシアから入手可能)のような陽イオン交換クロ
マトグラフィで中性に近いかまたはわずかに酸性のpＨ
でかつ１５mＳの伝導度で処理し、このＳ−セファロー
スは、それにイオン交換基−ＣＨ₂−ＳＯ₃ ^-Ｎa⁺を結合
させた架橋アガロースマトリックスである; (e)段階(d)からの溶出物を限外ろ過膜(１０,０００分子
量カットオフ)によって濃縮する; (f)サイズ排除カラムによるゲルろ過クロマトグラフィ
によって濃縮保持物(retentate)を処理する;および (g)生成した活性ＩＬ−４を回収する。

【００６１】最も好適な態様は下記段階からなる。 (a)０．１Ｍ塩化ナトリウム含有中性からわずかにアル
カリ性pＨのリン酸緩衝液中で金属キレートアガロース
ゲル、好適にはキレートセファロースファーストフロー
のアフィニティクロマトグラフィカラムに活性組換えヒ
トＩＬ−４の粗溶液をのせる; (b)このカラムを最初に、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有
２０mＭ リン酸ナトリウム平衡緩衝液,pＨ７．２−
７．５で洗浄し、次に、１０容量％のグリセロールおよ
び約１５０mＭの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で洗
浄する; (c)ＩＬ−４を、０．５塩化ナトリウム含有pＨ５．０の
溶出酢酸緩衝液でカラムからイソクラティカリに溶出す
る; (d)段階(c)からの活性ＩＬ−４溶出物を、２０mＭリン
酸ナトリウム緩衝液、pＨ６．５で平衡にしたＳ−セフ
ァロースのようなカラムによる陽イオン交換クロマトグ
ラフィに供し、そして、０．１２−０．６Ｍ ＮaＣl含
有pＨ６．７５のリン酸緩衝液で勾配溶出する; (e)段階(d)からの溶出物を限外ろ過膜によって濃縮す
る; (f)pＨ４．５の１０mＭクエン酸ナトリウム緩衝液で平
衡にしたサイズ排除カラムによるゲルろ過クロマトグラ
フィによって濃縮溶出物を処理する; (g)生成した活性ＩＬ−４溶液を採取する。

【００６２】活性４を精製調整するために本発明によっ
て使用した好適なＥ．coli株は、ＲＬ２１１７／pＲＧ
Ｔ８５７−１１およびＲＬ７３２１／pＲＧＴ８５７−
１１である。段階(a)で使用した好適な金属キレートア
ガロースはキレートセファロース６Ｂでも十分である
が、キレートセファロースファーストフローである。セ
ファロース類は、ニュージャージー、Ｐiscataway,ファ
ルマシア(Ｐharmacia)の製品である。本発明の用途のた
めの好適な亜鉛キレートセファロースカラムを調整する
ための好適な方法は、セファロースゲルをクロマトグラ
フィカラムに入れ、脱イオン水で洗浄し、次に好適には
酢酸亜鉛である塩溶液および脱イオン水をポンプで入
れ、次にpＨ７．２の２０mＭリン酸ナトリウム、１．０
Ｍ ＮaＣl溶液のような平衡緩衝液でカラムを溶出する
ことによる。酢酸亜鉛の代わりに、例えば、塩化亜鉛ま
たは硫酸亜鉛のような他の亜鉛塩も使用できる。

【００６３】このクロマトグラフィカラムは、連続して
結合した２本のカラムである。第１または上のカラム
は、金属キレートセファロースゲルからなり、第２また
は下は亜鉛塩または金属塩によって処理されていないキ
レートセファロースゲルからなる。２重カラム内の容量
比は、未処理キレートセファロースゲル１容量に対して
亜鉛処理キレートセファロースゲル約３容量である。カ
ラム平衡のために使用した好適な緩衝液は、１．０Ｍ塩
化ナトリウム含有pＨ７．２〜７．５のリン酸緩衝液で
ある。段階(b)において、最初、１．０Ｍ 塩化ナトリ
ウム含有pＨ７．２のリン酸緩衝液を平衡緩衝液として
次に１０％グリセロールおよび低濃度の塩化ナトリウム
(１５０mＭ)含有pＨ７．２〜７．５のリン酸ナトリウム
緩衝液で２部分に特に分けて洗浄したものをカラムにの
せる。この洗浄によって、極めて密接に関連しており分
離が困難なものを含めて不純物が除去される。活性ＩＬ
−４はカラムに残る。活性ＩＬ−４溶液のpＨを保持す
るための好適な緩衝液は、１．０Ｍ塩化ナトリウム含有
pＨ７．２のリン酸緩衝液である。緩衝化した粗活性Ｉ
Ｌ−４溶液をカラムに流し、このＩＬ−４を選択的にゲ
ルに吸着させる。

【００６４】段階(c)において、亜鉛キレートセファロ
ースおよび次に未処理キレートセファロースゲルは、
１．０Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ６．７５のリン酸緩衝
液で平衡とし、そして、吸着された活性ＩＬ−４を、亜
鉛キレートかセファロースから未処理キレートセファロ
ースも０．５Ｍ塩化ナトリウム含有pＨ５．０の酢酸緩
衝液、またはこれとは別に５０mＭ ＥＤＴＡ(エチレン
ジアミンＩＬ−４酢酸)または５０mＭイミダゾールのよ
うなヒスチジンアナログまたは５０mＭヒスチジンのよ
うなアミノ酸のようなキレート剤を含有する中性pＨで
イソクラティカリに溶出する。酢酸緩衝液は好適であ
る。活性ＩＬ−４を含む溶出物を採取する。従来のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイに基づき活性Ｉ
Ｌ−４最大濃度の分画をプールする。

【００６５】段階(d)において、段階(c)からのプール分
画をpＨ６．７５に調節しそして、２０mＭ緩衝液、pＨ
６．７５によって希釈して、伝導度を１５mＳにする。
クロマトグラフィカラム中の陽イオン交換ゲル物質は、
０．１２Ｍ塩化ナトリウムを有するpＨ６．７５の２０m
Ｍリン酸緩衝液で平衡とする。好適な陽イオン交換体
は、ファルマシアから入手可能なＳ−セファロースファ
ーストフローのような−ＣＨ₂−ＳＯ₃ ^-Ｎa⁺基によって
置換された架橋アガロースである。活性ＩＬ−４は、
０．１２〜０．６Ｍ ＮaＣlを含有する２０mＭリン酸
緩衝液で勾配溶出する。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
タンパク質アッセイに基づき活性ＩＬ−４最大濃度の分
画をプールする。陽イオン交換クロマトグラフィの条件
は、活性ＩＬ−４分画を陽イオン交換マトリックスに付
着させることを確実するように選択される。中性に近い
pＨ６．７５は実質的に陽イオン交換クロマトグラフィ
には高く、陰イオン交換クロマトグラフィには実質的に
高い１５mＳの伝導度によって、ほとんどの不純物がカ
ラムに結合しない緩和な結合条件が生じ、溶出は実質的
に容易でかつ高純度のＩＬ−４溶液が、すなわち、約９
０％〜９５％の溶液が得られる。

【００６６】段階(e)において、段階(d)からプールした
溶出分画を、１０,０００分子量以上の全ての物質を保
持する撹拌セルで濃縮する。これには、活性ＩＬ−４が
含まれる。本工程のこの段階では、活性ＩＬ−４溶液が
約９０〜９５％純粋であるので、活性ＩＬ−４以外の極
めてわずかの部分しか、膜上方に保持された濃縮溶液中
にない。好適な膜は、米国アミコン社製造ＹＭ−１０で
ある。得られた濃度は、活性ＩＬ−４の約２０mg／mlで
ある。段階(f)において、プールし濃縮した活性ＩＬ−
４の濃縮溶出物を、分子量によってタンパク質溶液を分
画するサイズ排除(ゲルろ過)クロマトグラフィにのせ
る。活性ＩＬ−４の濃縮溶出物を、分子量によってタン
パク質溶液を分画するサイズ排除(ゲルろ過)クロマトグ
ラフィにのせる。適切な典型的カラムは、セファクリル
Ｓ−２００ＨＲまたはＳ−１００ＨＲ(ファルマシア)ゲ
ルろ過カラムである。セファクリルＳ−２００ＨＲ(高
分解能)およびＳ−１００ＨＲは、アリルデキストラン
およびＮ,Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド架橋共重合
体である。それらの分画範囲は、それぞれ、５,０００
〜２５０,０００および１,０００〜１００,０００であ
る。他の適切な物質は、架橋デキストランゲルであるセ
ファデックス類(ファルマシア)である。好適には活性Ｉ
Ｌ−４の溶液を、先に１０mＭクエン酸ナトリウム緩衝
液pＨ４．５で平衡にしたＳ−２００ＨＲカラムにのせ
る。段階(g)の条件下で、安定なＩＬ−４濃縮物は、２
０mg／mlに達することができる。これによって、ゲルろ
過クロマトグラフィの能力および特性が向上する。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって決定し
た最大濃度の活性ＩＬ−４含有溶出物分画を採取しプー
ル後、９５〜９９％純粋な活性ＩＬ−４溶液を得る。

【００６７】このプロセスにおいて使用した緩衝液は、
それらが結合、洗浄および溶出の適切な条件を提供し活
性ＩＬ−４をクロマトグラフィに吸着させるかまたは選
択的にそれを溶出させるかのいずれかであるので、使用
できる。好適な緩衝液は、濃度２０mＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液類または実施例に示した濃度およびpＨの酢
酸ナトリウム緩衝液、および特定量の示した塩化ナトリ
ウムである。pＨは、水酸化ナトリウムまたは酸で調節
した。段階(b)の２部分洗浄において、最初の洗浄は、
１．０Ｍ塩化ナトリウム含有２０mＭリン酸ナトリウム
平衡緩衝液であり、第２の洗浄は約１５０mＭの塩化ナ
トリウムおよび第２洗浄緩衝液で必要な１０％グリセロ
ール含有リン酸緩衝液で行う。亜鉛キレートセファロー
スカラムで使用する緩衝液中塩化ナトリウムの濃度は本
発明で重大であり、その理由として、高温、好適には１
Ｍの塩化ナトリウムがトリクロロ酢酸(ＴＣＡ)ペレット
からの可溶化した活性ＩＬ−４の回収を向上させ、か
つ、活性ＩＬ−４の金属キレートセファロースへの結合
を増加させる。この濃度によって、ＩＬ−４は、より選
択的に亜鉛キレートセファロースカラムに発酵培地中の
不純物よりも吸着される。バルクＩＬ−４を次に融解に
よって注入用に調整し、そして、無菌水および／または
１０mmのクエン酸緩衝液によって希釈した。

【００６８】

【実施例】

実施例１ Ｓ−セファロースファーストフローカラムの調整 ２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ７．２および０．１２Ｍ
ＮaＣlの緩衝液中Ｓ−セファロースファーストフロー
陽イオン交換樹脂によって２本の陽イオン交換カラムを
調整する。第１のカラムは、１．５リットル、直径１０
０mm、高さ４５cmのカラムで、第２のカラムは、０．２
５リットル、直径５０mm、高さ３００mmのカラムであ
る。それぞれのカラムを陽イオン交換ゲルで完全に充填
したときに、小さい方のカラムは、大きい方のカラムの
ベットボリュームの１５％である。本カラムには、下記
のように充填する。２０mＭリン酸ナトリウムpＨ７．２
および０．１２Ｍ ＮaＣlから構成された緩衝液中のス
ラリＳ−セファロースファーストフロー陽イオン交換樹
脂。このゲルを適当なクロマトグラフィカラムに入れ、
液体を流出させるかまたはそれをカラム底部からポンプ
で組み入れる。

【００６９】トップフローアダプターをカラムに付け、
この緩衝液を約１cm／mlの直線速度でカラムポンプで入
れることによって、このゲルの５ベッドボリュームの２
０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．１２Ｍ Ｎ
aＣlから構成された緩衝液で平衡とする。トップフロー
アダプターを調節して、樹脂ベッドの先端を硬く押しつ
ける。次に、少なくとも５ベッドボリュームの２０mＭ
リン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．１２Ｍ ＮaＣlか
ら構成された緩衝液を約１cm／分の直線速度でカラムに
ポンプで入れ、そして、もし必要であれば、同一フロー
速度で溶出液のpＨが７．１および７．３の間となるま
でカラムに緩衝液をポンプで組み入れることを継続す
る。カラムのベッドボリュームを調節して、小さい方の
カラムが大きい方のカラムのベッドボリュームの１５％
となるようにする。

【００７０】実施例２ コバルトキレートセファロースファーストフローの調整 ０．０２Ｍコバルト酢酸５容量にキレートセファロース
ファーストフローゲルを懸濁し、ときどき撹拌しながら
一晩放置する。このゲルをブッヒェナーろう斗上で脱イ
オン水で洗浄して、次に、このゲルを、０．０５Ｍ Ｎ
aＣl含有０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２の緩
衝液で洗浄する。次に、このゲルをpＨ７．２の２０Ｍ
リン酸ナトリウム、pＨ７．２および０．１２Ｍ ＮaＣ
lの緩衝液０．５ゲル容量にスラリーとする。コバルト
付加ゲル１９０mlを直径５０mmおよび高さ３００mmのカ
ラムに入れ、液体をカラムにポンプで流す。先端フロー
アダプターをカラムに付け、約１cm／分の直線速度でカ
ラムにポンプで０．５Ｍ ＮaＣl含有０．０２Ｍリン酸
ナトリウム、pＨ７．２緩衝液を入れることによって、
このゲルを平衡とする。フローアダプターをカラム先端
にのせる。

【００７１】実施例３ キレートセファロースファーストフロー(金属塩で未処
理)の調整 キレートセファロースファーストフローゲルを、０．０
５Ｍ ＮaＣl含有２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ７．２
の緩衝液で洗浄する。次に、このゲル７５mlを実施例２
からのクロマトグラフィカラムに注ぎ、その結果、金属
塩で未処理のゲルをコバルト付加ゲルの先端に均一層と
してのせる。上端フローアダプターをカラムに付け、こ
のゲルを、この緩衝液を０．５Ｍ ＮaＣl含有pＨ７．
２の０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡とする。

【００７２】実施例４ コバルトキレートセファロースカラムの平衡化 コバルトキレートセファロースファーストフローおよび
キレートセファロースカラムを実施例２および３のよう
にして調製した後、このカラムを反転させ、コバルト処
理樹脂が未処理樹脂の上にする。溶出物のpＨが７．１
および７．３の間となるまで、０．０２リン酸ナトリウ
ムpＨ７．２,０．５Ｍ ＮaＣlの緩衝液のカラムへのポ
ンプ組入れを継続する。

【００７３】実施例５ セファクリルＳ−２００ＨＲカラムの調製 １０mＭクエン酸ナトリウム、pＨ４．５で構成された少
なくとも１ベッドボリュームの緩衝液を、１．８リット
ルのクロマトグラフィカラム、５０mm直径、１００cm高
さのＳ−２００ＨＲゲルに約０．２cm／分の直線速度で
カラムを平衡とするためにポンプで組み入れる。

【００７４】実施例６ 緩衝液の調製(a)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．１２
Ｍ 塩化ナトリウム 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物、７．０３g／リットルの塩化ナト
リウムおよび十分量の６．３Ｎ 水酸化ナトリウムを混
合して、pＨを７．２(±０．１)に調節する。(b)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．２６
Ｍ 塩化ナトリウム 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物、１５．１９g／リットルの塩化ナ
トリウムを混合する。６．３Ｎの水酸化ナトリウムによ
ってpＨを７．２(±０．１)に調節する。(c)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．５０
Ｍ 塩化ナトリウム 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素ナ
トリウム１水和物、２９．２２g／リットルの塩化ナト
リウムおよび十分量の５０％ＮaＯＨを混合して、pＨを
７．２(±０．１)に調節する。(d)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ６．０、０．０５
Ｍ ＥＤＴＡ,０．５Ｍ塩化ナトリウム 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物および１９g／リットルのＥＤＴＡ
４ナトリウム塩および２９．２２g／リットルの塩化ナ
トリウムを混合する。６．３Ｎの水酸化ナトリウム／４
Ｎ ＨＣlによってpＨを６．０(±０．１)に調節する。(e)１０mＭクエン酸ナトリウム、pＨ４．５ ２１０グラム(２．１g／リットル)のクエン酸１水和物
を脱イオン水１００リットルと、クエン酸１水和物が溶
解するまで混合する。緩衝液のpＨを、もし必要であれ
ば、４Ｎ塩酸および６．３Ｎ水酸化ナトリウムによって
４．５に調節する。この緩衝液は、透析ろ過および限外
ろ過のために、さらにゲルろ過クロマトグラフィのため
に使用する。(f)２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ７．２ ２７８グラムのリン酸１水素ナトリウム１水和物を１０
０リットルの脱イオン水と混合して溶解するまで撹拌す
る。緩衝液のpＨを５０％ＮaＯＨでpＨ７．２および２
−４mＳの伝導度に調節する。

【００７５】実施例７ 粗ＩＬ−４溶液の陽イオン交換クロマトグラフィ処理 細胞培地含有粗ＩＬ−４(総タンパク質約１４,０００g)
をpＨ７．２(±０．１)に調節しそしてその伝導度を１
４mＳ(±１)に調節する。この溶液をＳ−セファロース
陽イオン交換に約１．０cm／分以下の直線速度でポンプ
で流す。カラムを実施例６(a)で調製した緩衝液で洗浄
する。このカラムを実施例６(b)で調製した緩衝液で
０．２cm／分の直線速度でイソクラティカリに溶出す
る。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによっ
て決定された活性ＩＬ−４含有分画を採取し、それらを
プールする。プールした活性ＩＬ−４の純度は、約５０
％である。

【００７６】実施例８ 部分精製活性ＩＬ−４溶液の陽イオン交換クロマトグラ
フィによる勾配溶出 実施例７にしたがって作製したプールした活性ＩＬ−４
溶液のpＨを、必要に応じ４Ｎ ＨＣlまたは６．３ＮＮ
aＯＨで７．２(±０．１)に調節する。溶液の伝導度を
実施例６(f)で調製した緩衝液で１４mＳ(±１)に調節す
る。この溶液を実施例１で調製したＳ−セファロース陽
イオン交換に約１．０cm／分以下の直線速度でポンプで
流す。溶出溶液を１分画に集める。約１．７５mＳ／ベ
ッドボリュームの勾配および約０．２cm／分の直線フロ
ー速度で溶出する。勾配で使用した低塩緩衝液は実施例
６(a)で作製したものであり、そして、この勾配で使用
した高塩緩衝液は実施例６(c)で作製したものである。
５つの大分画を、各分画に付いて容量を約０．５ベッド
ボリュームとして採取する。残りの分画(約４０−５０)
を、容量を約０．１ベッドボリュームとして採取する。
活性ＩＬ−４分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパク質
アッセイによって分析する。活性ＩＬ−４分画をプール
する。プールした活性ＩＬ−４の純度は、約６０％〜７
０％である。

【００７７】実施例９ 活性組換えヒトインタロイキン−４のコバルトキレート
セファロースクロマトグラフィ精製 実施例８からのＩＬ−４溶液のpＨを４Ｎ ＨＣlまた
は、３Ｎ ＮaＯＨで７．２(±０．１)に調節する。溶
液の伝導度を４５−５０mＳに調節する。この溶液をも
し必要であれば遠心分離またはミクロフィルトレーショ
ンによって透明にする。実施例４で調製したコバルトキ
レートセファロースファーストフローおよび未処理キレ
ートセファロースファーストフローカラムに約０．５cm
／分の直線速度でポンプで流す。フロースルー(溶出溶
液)を１分画に集める。実施例６(c)で調製した緩衝液約
１０ベッドボリュームで約０．５cm／分の直線フロー速
度でカラムを洗浄し、洗浄物を５分画未満に採取する。
次に、このカラムを実施例６(d)で調製した緩衝液約１
０ベッドボリュームで約０．５cm／分の直線フロー速度
でカラムを溶出する。約０．２ベッドボリュームの容量
で分画を採取する。各分画活性ＩＬ−４分画をＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびタンパク質アッセイによって分析し、活
性ＩＬ−４分画をプールする。この実施例９によって処
理した活性ＩＬ−４の純度は、約９０−９５％である。

【００７８】実施例１０ 限外ろ過および濃縮 実施例９からのプール分画を、ＹＭ−１０膜付きアミコ
ン撹拌チェンバーを用いて、実施例９からの活性ヒトＩ
Ｌ−４を含有するプール分画を容器に入れ、約０．２５
容量の実施例６(d)で調製した緩衝液を添加することに
よって濃縮する。ＹＭ−１０膜による限外ろ過によって
当初の容量の約０．２になるまでこの容量を濃縮する。
濃縮保持物を４容量の実施例６(e)で調製した緩衝液で
希釈し、それを約０．２容量までＹＭ−１０膜による限
外ろ過によって濃縮する。濃縮段階を繰り返して、当初
のプール分画容量の約０．１を達成する。この濃縮物を
適当な容器に入れ、すぐに使用できるように冷室温にお
くかまたは−２０℃で凍結して保存する。

【００７９】実施例１１ ゲルろ過クロマトグラフィ(サイズ排除) セファクリルＳ−２００ＨＲカラムを実施例６(e)で調
製した緩衝液で、少なくとも１ベッドボリュームの緩衝
液を直線速度約０．２cm／分でポンプで組み入れること
によって平衡にする。実施例１０で作製した溶液を、２
℃〜６℃で３０分間、４５００rpmで実験室遠心分離器
で遠心分離することによって、透明にする。このＡ₂₈₀
を測定し、本溶液を実施例６(e)で調製した緩衝液で希
釈し、その結果、１ml当たり２８０nmにおいて５光学濃
度単位がある。生成した溶液をセファクリルＳ−２００
ＨＲカラムに直線速度約０．１cm／分でポンプで組み入
れる。実施例６(e)の緩衝液のカラムへの組入れを約
０．１cm／分のフロー速度で継続する。総容量０．４〜
０．５５ベッドボリュームを有する大きい１分画を採取
する。活性ＩＬ−４分画ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびタンパ
ク質アッセイによって選択する。活性ＩＬ−４分画をプ
ールし、０．２ミクロンの無菌フィルターでろ過する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによって調べた９５％〜９９
％純粋な活性ＩＬ−４溶液のろ液を回収する。細胞培地
中の活性ＩＬ−４総収率は、７０％である。インタロイ
キン−４活性分画を決定するために用いた全てのアッセ
イは、従来のものである。精製ＩＬ−４ ２８０nmにお
けるＵＶ吸光度測定値について、１．０Ａ₂₈₀光学濃度
単位(ＯＤ)は、アミノ酸組成分析による１．６mgおよび
ローリ法(Ｌowry's Ｍethod)による２．０mgに等し
い。

【００８０】実施例１２ 亜鉛キレートセファロースファーストフローの調整 キレートセファロースファーストフローゲルを、脱イオ
ン水でスラリー化する。３リットルのカラムを調製する
ため、このスラリーを直径１８０mmで５００mm長さのク
ロマトグラフィカラムに注ぐ。この液体をカラムに流す
かまたはそれをカラム底部からポンプで入れる。トップ
フローアダプターをカラムにおき、そして、ゲルを脱イ
オン水で充填／洗浄する。水をカラムに約１cm／分の直
線速度で流す。トップフローアダプターを調節して樹脂
ベッドの先端に硬く押しつける。少なくとも５ベッドボ
リュームの脱イオン水をカラムに約１cm／分の直線速度
でポンプで組み入れる。直線速度１cm／分でカラムに
０．０２３Ｍの亜鉛酢酸溶液５ベッドボリュームをポン
プで入れる。約１０ベッドボリュームの脱イオン水をカ
ラムに直線速度約１cm分でカラムにポンプで入れる。直
線速度１．０cm／分でカラムにリン酸緩衝溶液をポンプ
で入れることを継続し、溶出液のpＨが７．１〜７．３
になるまで継続する。

【００８１】実施例１３ キレートセファロースファーストフローの調整(金属塩
非処理) キレートセファロースファーストフローゲルを、１．０
Ｍ ＮaＣl含有pＨ７．２の２０mＭリン酸ナトリウムの
緩衝液中にスラリー化する。１リットルのカラムを調製
するため、このスラリーを直径１４０mmで５００mm長さ
のクロマトグラフィカラムに注ぎ、カラム底部から溶出
する。１．０Ｍ ＮaＣl含有pＨ７．２の２０mＭリン酸
ナトリウムの緩衝液約５ベッドボリュームでゲルを平衡
にする。この緩衝液を約１cm／分の直線速度でカラムに
ポンプで入れる。同一フロー速度でカラムにリン酸緩衝
溶液をポンプで入れることを継続し、溶出液のpＨが
７．１と７．３の間になるまで継続する。

【００８２】実施例１４ 連続カラムの調製 亜鉛キレートセファロースファーストフローおよび未処
理キレートセファロースカラムを実施例１２および１３
に従って調製した後、このカラムを順番に連結して、フ
ローが最初に亜鉛キレートセファロースファーストフロ
ーに、次に、非亜鉛(未処理)キレートセファロースカラ
ムに入るようにする。カラムの間に泡トラップは挿入す
べきでない。

【００８３】実施例１５ Ｓ−セファロースカラムの調整 Ｓ−セファロースゲル陽イオン交換樹脂を、１．０Ｍ
ＮaＣl含有pＨ６．７５の２０mＭリン酸ナトリウム、
０．１２Ｍ ＮaＣlおよび０．００１Ｍエチレンジアミ
ン４酢酸(ＥＤＴＡ)からなる緩衝液中にスラリー化す
る。このゲルを直径１００mmで４５cm高さのクロマトグ
ラフィカラムに注ぎ、この液体をカラムに流すかまたは
それをカラム底部からポンプで入れる。トップフローア
ダプターをカラムにおき、そして、緩衝液をカラムに約
１cm／分の直線速度で流すことによって、このゲルをp
Ｈ６．７５の２０mmリン酸ナトリウム、０．１２Ｍ Ｎ
aＣlおよび０．００１Ｍエチレンジアミン４酢酸からな
る緩衝液と平衡にする。トップフローアダプターを調節
して樹脂ベッドの先端に硬く押しつける。次に、少なく
とも５ベッドボリュームのpＨ６．７５の２０mＭリン酸
ナトリウム、０．１２Ｍ ＮaＣlおよび０．００１Ｍエ
チレンジアミン４酢酸からなる緩衝液をカラムに約１cm
／分の直線速度でポンプで組み入れ、そして、もし必要
であれば、同一速度でカラムに緩衝液をポンプで入れる
ことを継続し、溶出液のpＨが６．６と６．９の間にな
るまで継続する。

【００８４】実施例１６ セファクリルＳ−２００ＨＲカラムの調製 １０mＭクエン酸ナトリウム、pＨ４．５で構成された少
なくとも１ベッドボリュームの緩衝液を１．８リットル
のクロマトグラフィカラム、５０mm直径、１００cm高さ
のＳ−２００ＨＲゲルを介して約０．２cm／分の直線速
度でカラムを平衡とするためにポンプで組み入れる。

【００８５】実施例１７ 緩衝液の調製(a)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．１２
Ｍ 塩化ナトリウム 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物、７．０３g／リットルの塩化ナト
リウムおよび十分量の６．３Ｎ 水酸化ナトリウムを混
合して、pＨを７．２(±０．１)に調節する。このバッ
チは、金属キレートセファロースカラム内にゲル１リッ
トル当たり少なくとも３０リットルの付与するほど十分
に大きくなければならない。(b)０．０２Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．２、０．１５
Ｍ 塩化ナトリウム、１０％グリセロール 脱イオン水中で、２．７８g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物および８．７６g／lの塩化ナトリウ
ムを混合する。６．３Ｎの水酸化ナトリウムによってp
Ｈを７．２(±０．１)に調節する。十分量のグリセロー
ルを添加して０．１リットル／リットルを付与する。十
分量の緩衝液を調製し、それがともに使用されるゲル１
リットル当たり少なくとも６リットルを付与するように
する。(c)０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、pＨ５．０、０．５Ｍ
塩化ナトリウム 脱イオン水中で、９９．７％の酢酸１．１５ml／リット
ルおよび２９．２g／リットルの塩化ナトリウムを混合
する。このpＨを、６．３Ｎ水酸化ナトリウムで５．０
(±０．１)に調節する。十分量の緩衝液を調製し、それ
がともに使用されるゲル１リットル当たり少なくとも１
０リットルを付与するようにする。

【００８６】(d)０．０３Ｍリン酸ナトリウム、pＨ７．
０、０．００３Ｍ ＥＤＴＡ 脱イオン水中で、４．１７g／リットルのリン酸水素１
ナトリウム１水和物および１．１４g／リットルのＥＤ
ＴＡ４ナトリウム塩を混合する。このpＨを６．３Ｎの
水酸化ナトリウムによって７．０(±０．１)に調節す
る。十分量の緩衝液を調製し、ゲル１リットル当たり少
なくとも２リットルを付与するようにする。(e)１０mＭクエン酸ナトリウム、pＨ４．５ ２１０グラム(２．１g／リットル)のクエン酸１水和物
を脱イオン水１００リットルと、クエン酸１水和物が溶
解するまで混合する。緩衝液のpＨを、もし必要であれ
ば、４Ｎ塩酸および６．３Ｎ水酸化ナトリウムによって
４．５に調節する。この緩衝液は、透析ろ過および限外
ろ過のために、さらにゲルろ過クロマトグラフィのため
に使用する。

【００８７】実施例１８ 活性組換えヒトインタロイキン−４の精製 (亜鉛キレートセファロースクロマトグラフィ)活性ヒト
組換えＩＬ−４を２０リットルに溶解した７００リット
ルの発酵培地を濃縮し、次に、この溶液を実施例１７
(a)の緩衝液に対して２５倍透析ろ過に曝する。この溶
液のpＨを、４Ｎ ＨＣlまたは６．３Ｎ ＮaＯＨで
７．２(±０．１)に調節する。溶液の伝導度を７０−９
０mＳに調節する。ろ過によってこの溶液を透明にし濃
縮する。このフィルターを実施例１７(a)の緩衝液で洗
浄し、本溶液の容量を２０リットルに戻す。溶液を亜鉛
キレートセファロースファーストフローおよび未処理セ
ファロースファーストフローカラムに直線速度約０．５
cm／分でポンプで流す。この溶出を１分画にまとめる。
このカラムを２度洗浄し、最初は、約１０ベッドボリュ
ームの実施例１７(a)で調製した緩衝液で直線速度約
０．５cm／分で洗浄し、５以下の分画に洗浄物を集め、
次に、約５ベッドボリュームの実施例１７(b)で調製し
た緩衝液で直線速度約０．５cm／分で洗浄し、１分画に
洗浄物を集める。活性ＩＬ−４をカラムから約８ベッド
ボリュームの実施例１７(c)で調製した緩衝液で直線速
度約０．２５cm／分で溶出する。約０．２ベッドボリュ
ームの容量で分画を１ml当たり０．５mlの希釈液を入れ
た別々の容器にいれ、実施例１７(d)で調製した緩衝液
に集める。活性ＩＬ−４の各試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびタンパク質アッセイで試験する。この実施例１８に
したがって処理した活性ＩＬ−４溶液の純度は、約２０
％〜４０％である。粗発酵培地中における量に基づいた
活性ＩＬ−４の収率は、９０％である。

【００８８】実施例１９ Ｓ−セファロースクロマトグラフィのための緩衝液の調
製(a)２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ６．７５、０．１２
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ２．７８g／リットルのリン酸水素１ナトリウム１水和
物、７．０３g／リットルの塩化ナトリウム、０．３８g
／リットルのＥＤＴＡ４ナトリウムおよび１リットル／
リットルの脱イオン水を適当な容器に入れ、溶解するま
で撹拌する。６．３Ｎ水酸化ナトリウムによって、この
緩衝溶液のpＨを６．７５(±０．１)に調節する。(b)２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ６．７５、０．５５
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ ２．７８g／リットルのリン酸水素１ナトリウム１水和
物、３２．１４g／リットルの塩化ナトリウム、０．３
８g／リットルのＥＤＴＡ４ナトリウムおよび脱イオン
水を適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。６．３
Ｎ水酸化ナトリウムによって、この緩衝溶液のpＨを
６．７５(±０．１)に調節する。(c)２０mＭリン酸ナトリウム、pＨ６．７５,０．００１
Ｍ ＥＤＴＡ ２．７８g／リットルのリン酸水素１ナトリウム１水和
物、０．３８g／リットルのＥＤＴＡ４ナトリウムおよ
び脱イオン水を保持するほど十分に大きな容器に入れ
る。溶解するまで撹拌し、必要に応じ６．３Ｎ水酸化ナ
トリウムによって、この緩衝液のpＨを６．７５(±０．
１)に調節する。

【００８９】実施例２０ 陽イオン交換カラムによって精製した活性インタロイキ
ン−４溶液の勾配溶出 実施例７に従って作製した活性ＩＬ−４溶液のpＨを、
必要に応じ４Ｎ ＨＣlまたは６．３Ｎ ＮaＯＨで６．
７５(±０．１)に調節する。生成した溶液の伝導度を実
施例１９(c)で調製した緩衝溶液で１５(±０．５mＳ)に
調節する。溶液を実施例４で調製したＳ−セファロース
カラムに直線速度約１cm／分以下でポンプで流す。この
フロースルー(溶出溶液)を１分画にまとめる。このカラ
ムを約５ベッドボリュームの実施例１９(a)で調製した
緩衝液で直線速度約１．０cm／分で洗浄する。洗浄物を
１分画に集める。１ベッドボリューム当たり約４．５m
Ｓおよび約０．２cm／分の直線フロー速度を用いて、カ
ラムを溶出する。勾配に用いた低塩緩衝液は、５ベッド
ボリュームで実施例１９(a)で作製したものであり、そ
して、高塩緩衝液は、５ベッドボリュームで実施例１９
(b)で作製したものである。５個の大分画を集め、各分
画は、約０．８ベッドボリュームの容量である。残りの
分画(約４０−５０)を０．１ベッドボリュームの容量で
集める。上記分画の活性ＩＬ−４をＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびタンパク質アッセイで試験する。活性ＩＬ−４分画
をプールする。亜鉛キレートプールした溶出物中の活性
４の量に基づく活性ＩＬ−４収率は９０％である。この
活性ＩＬ−４溶液の純度は約９０％〜９５％である。

【００９０】実施例２１ 限外ろ過および濃縮 実施例２０からのプール分画を、ＹＭ−１０膜付きアミ
コン撹拌チェンバーを用いて、実施例２０からの活性ヒ
トＩＬ−４を含有するプール分画を容器に入れ、約０．
２５容量の実施例６(d)で調製した緩衝液を添加するこ
とによって濃縮する。ＹＭ−１０膜による限外ろ過によ
って、当初の容量の約０．１になるまでこの容量を濃縮
する。濃縮保持物を４容量の実施例１７(e)で調製した
緩衝液で希釈し、それを約０．２容量までＹＭ−１０膜
による限外ろ過によって濃縮する。濃縮段階を繰り返し
て、当初のプール分画容量の約０．１を達成する。この
濃縮物を適当な容器に入れ、そして、すぐに使用できる
ように冷室温におくかまたは−２０℃で凍結して保存す
る。

【００９１】実施例２２ ゲルろ過(サイズ排除) 実施例２１で作製した溶液を、２℃〜６℃で３０分間、
４５００rpmで実験室遠心分離器で遠心分離することに
よって、透明にする。このＡ₂₈₀を測定し、本溶液を実
施例１７(e)で調製した緩衝液で希釈し、その結果、１
５Ａ₂₈₀／mlがでる。生成した溶液をセファクリルＳ−
２００ＨＲカラムに直線速度約０．１cm／分でポンプで
組み入れる。実施例１７(e)の緩衝液のカラムへの組入
れを約０．１cm／分のフロー速度で継続する。総容量
０．４〜０．５５ベッドボリュームを有する１大分画を
採取し、次に、約０．０１ベッドボリュームの分画５０
を採取する。活性ＩＬ−４分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びタンパク質アッセイによって選択する。活性ＩＬ−４
分画をプールし、０．２ミクロンの無菌フィルターでろ
過する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイによって調べた活性
ＩＬ−４ ９５％〜９９％純粋なＩＬ−４溶液であるろ
液を回収する。細胞培地中の活性ＩＬ−４総収率は、７
０〜８０％である。

【００９２】回収した活性ＩＬ−４の純度は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって確認されたように、９５〜９９％であ
る。インタロイキン−４活性分画を決定するために用い
た全てのアッセイは、従来のものである。精製ＩＬ−４
２８０nmにおけるＵＶ吸光度測定値について、１．０
Ａ₂₈₀光学濃度単位(ＯＤ)は、アミノ酸組成分析による
１．６mgおよびローリ法による２．０mgに等しい。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥアッセイは、また、活性分画を選択するた
めに必要である。この方法は、Ｌaemmli,Ｕ．Ｋ．、Ｎa
ture、２２７:６８０(１９７０)に記載されている。ロ
ーリ法は、Ｌowryら,Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．に記載されて
いる。本発明はある特定の態様と関連されて記載してき
たが、多くの改変、修飾および変形ができることが当業
者に明らかであろう。このような改変、修飾および変形
が本発明の精神および範囲に含められることが意図され
ている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の用途のための好適な（ヒト）ＩＬ−
４のアミノ酸配列を例示する。

【図２】 ＩＬ−４をサイノモロガス（cynomologus）
サルに投与することによって見いだされた好中球細胞数
の増加を示すグラフである。

【図３】 ＩＬ−４によるＨＬ−６０細胞の処理によっ
て達成された活性化および分化の結果を示すグラフであ
る。

【図４】 ＩＬ−４によるＵ−９３７細胞の処理によっ
て達成された活性化および分化の結果を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リー・サリヴァン アメリカ合衆国ニュージャージー州08837, エディソン，ルーズベルト・ブールヴァー ド120 (72)発明者 マイケル・グレース アメリカ合衆国ニュージャージー州08620, ハミルトン・タウンシップ，ボニー・レ イ・ドライヴ22 (72)発明者 ロレッタ・ボバー アメリカ合衆国ニュージャージー州07036, リンデン，ラリタン・ロード301 (72)発明者 ジョン・チュ−テイ・タン アメリカ合衆国ニュージャージー州07039, リヴィングストーン，キャメロット・ドラ イヴ19 (72)発明者 デーヴィッド・ナヴー オランダ王国エヌエル−2300 エイジー ライデン，ピー・オー・ボックス251 (72)発明者 ティー・エル・ナガブシャン アメリカ合衆国ニュージャージー州07054, パーシッパニー，サンセット・レーン３ (72)発明者 ジァイ・ラマン アメリカ合衆国ニュージャージー州08691, ウエスト・ウィンザー，ハイモント・ドラ イヴ25

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＩＬ−４を含有してなる哺乳類の好中球
   数増加用医薬組成物。
2. 【請求項２】 ＩＬ−４を含有してなる哺乳類の骨髄性
   または単球白血球治療用医薬組成物。
3. 【請求項３】 ＩＬ−４を含有してなる哺乳類における
   未成熟骨髄性または単球細胞の成熟誘発用医薬組成物。