FI102039B - Menetelmä aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n raakaliu oksen puhdistamiseksi - Google Patents

Description

102039

Menetelmä aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n raakaliuoksen puhdistamiseksi - Förfarande för rening av en rälösning av aktiv rekombinant-human-interleukin-4 5 Tämä keksintö koskee menetelmiä interleukiini-4:n puhdistamiseksi tällaista hoitoa varten.

lnterleukiini-4 (IL-4) on lymfokiini (immuunijärjestelmän stimuloija), jolla on laaja immuunisolua stimuloivien aktiivisuuksien alue [Banchereau et ai., Lymphokine 10 Res. voi. 6, no. 1: U137 (1987); Yokoto et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5894-5898; Lee et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2061-2065; Coffman et ai., J. Immunol. 136 (1986) 949-954; Sanderson et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 437-440; Grabstein et ai., J. Exp. Med. 163 (1985) 1405-1413; ja Vitetta et ai., J. Exp. Med. 162 (1985) 1726-1731]. Eri aikoina IL-4:ää on myös kutsuttu B-solun 15 kasvutekijäksi (BCGF) [Butler et ai., J. Immunol. 133 (1984) 251-255 (humaani-BCGF); ja Farrar et ai., J. Immunol. 131 (1983) 1838-1842 (hiiri-BCGF)] ja B-solua stimuloiva tekijäksi (BSF-1) [Ohara et ai.; J. Immunol. 135 (1985) 2518-2523]. Lopulta nimi interleukiini-4 ehdotettiin ja otettiin käyttöön vuonna 1986 [Sanderson et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 437-440].

20 IL-4:n ajateltiin alunperin olevan tärkeä vain aktivoitujen B-solujen ko-stimuloinnissa [Roehm et ai.; J. Exp. Med 160 (1984) 679-694]. Sen on kuitenkin osoitettu moduloivan T-solujen ja syöttösolujen aktiivisuuksia [Mosmann et ai.; Proc. Natl. Acad. Sei USA 83 (1986) 5654-5658]. Katso myös PCT-patenttijulkaisua WO 87/0290, jossa 25 IL-4:n aktiivisuus T-solun kasvutekijänä kuvataan hyödyllisenä lisäämään luonnollisia puolustuksia erilaisia infektioita vastaan.

T-solut ja B-solut vaikuttavat immuunivasteen myöhemmissä vaiheissa. Olisi erittäin edullista, jos olisi reagenssi, joka lisäisi ja aktivoisi neutrofiilejä, jotka vaikuttavat 30 infektion varhaisissa vaiheissa ja ovat kehon infektionvastaisen puolustuksen ensimmäinen linja.

Valkosten verisolujen muodostumisen normaalissa prosessissa solut saavat alkunsa luuytimessä alkukantaisesta kypsymättömästä solusta, joka tunnetaan kantasoluna, 2 102039 ja erilaistuvat vaiheittaisesti kypsempien vaiheiden kautta erilaisia solulinjareittejä saavuttamaan erilaistumisen viimeisen tilan monosyyttinä, jyvässoluna tai imusoluna.

Kypsymättömien, erilaistumattomien solujen ominaisuus on kyky lisääntyä nopeasti.

5 Vain kun prekursorisolu kypsyy ja erilaistuu näiden monien vaiheiden kautta, se yleensä menettää kykynsä lisääntyä, ja ottaa vastaan roolinsa erikoistuneena, funktionaalisena kypsänä soluna. Normaalitilassa solut, jotka saavuttavat lopullisen kypsän muotonsa, eivät lisäänny suuressa määrin, jos lainkaan.

10 Yleensä syöpä on solun erilaistumisen häiriö. Erityisesti myeloiset leukemiat ovat häiriöitä, joissa monosyyttiset - ja jyvässolulinjat ovat pysähtyneet varhaiselle kypsy-misasteelle, eivätkä siten ole menettäneet lisääntymiskapasiteettiansa. Koska nämä kypsymisestä estetyt solut jatkavat lisääntymistä, ne aiheuttavat kypsymättömien syöpäsolujen populaation, josta on tuloksena leukemian diagnoosi.

15

On todisteita siitä, että erilaiset myeloiset leukemiasolut voidaan indusoida erilaistumaan normaaleiksi makrofageiksi ja jyvässoluiksi, ja että nämä solut menettävät erilaistumisen jälkeen kapasiteettinsa lisääntyä. Tämä viittaa siihen, että terminaalisen erilaistumisen indusointi reagenssilla olisi käyttökelpoista myeloisen leukemian 20 hoidossa.

Olemme havainneet, että IL-4:n antaminen lisää neutrofiilien lukumäärää nisäkkäissä ja stimuloi neutrofiilien ja monosyyttien erilaistumista. Yllättävää on, että vaikutukset neutrofiileihin jatkuvat kauan sen jälkeen kun IL-4:n annostelu on lopetettu. Tämä on 25 hyvin hämmästyttävää, koska IL-4:n puoliintumisaika kehossa on hyvin lyhyt. IL-4:tä voidaan näin antaa nisäkkäälle neutrofiilien lukumäärän lisäämiseksi ja aikaansaamaan isännän lisääntyneen resistenssin infektiota vastaan, tai infektion hoitamiseksi hyvin varhaisessa vaiheessa. Nisäkäs voi olla immunokompromisoitu isäntä, esimerkiksi mikä hyvänsä isäntä, joka on altis ei-toivotulle bakteeri-infektiolle, kuten potilas, 30 jolla on vaikeita palovammoja tai haavaumia, ja isäntä, jonka immuunipuolustukset ovat alentuneet johtuen säteilystä tai kemoterapiasta syövän hoidossa, ja isäntä, jolla on geneettistä immuunivajetta. Nämä IL-4:n ominaisuudet viittaavat myös siihen, että se olisi käyttökelpoista paikallisessa annossa parantamaan haavoja, kuten avoimia 3 102039 leikkaushaavoja tai palovammoja, stimuloimalla neutrofiili- ja monosyyttiaktivaatiota ja fibroblastiproliferaatiota haavakohdassa.

Olemme myös havainneet, että IL-4 indusoi valko- ja monosytoidisten solujen kypsy-5 mistä. Koska myeloinen leukemia liittyy kypsymättömien valkosolujen lisääntymiseen, pitäisi IL-4:n edistämällä valkosoluja kypsään tilaansa vähentää niiden lisääntymistä ja aikaansaada menetelmän myeloisen leukemian hoitamiseksi.

Hyvin puhdasta aktiivista IL-4:ää voidaan saada patenttivaatimuksessa 1 kuvatulla 10 keksinnön mukaisella menetelmällä IL-4:ää ekspressoivan E. colin fermentointilie-mestä 3-vaiheisella menetelmällä, joka käsittää: 1. Raa'an fermentointiliemen alistamisen affiniteettikromatografialle metallia kelatoi-valla agaroosigeelikolonnilla, kuten chelating-Sepharose®-geelillä, jota on saatavissa 15 yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, Nwe Jersey nimillä chelating-Sepharose® Fast Flow ja chelating-Sepharose® 6B. Chelating Sepharose® Fast flow koostuu iminodietikkahapporyhmistä välikkeillä, jotka on liitetty Sepharose 6 Fast Flow:hon pysyvillä eetterisidoksilla. Sepharose® 6 Fast Flow on ristiliitettyä agaroosia, 6 %. Käytetään puskuria, edullisesti fosfaattipuskuria. Käytetty fosfaatti-20 puskuri on sellaista, jossa on suuri natriumkloridikonsentraatio, ts., noin 0,5 -1,5 M, edullisesti 1,0 M, neutraalissa/lievästi alkalisessa pH-arvossa, ts., pH-arvo noin 6,7 - 8, edullisesti noin 7,2. Suuri suolakonsentraatio ja lähes neutraali pH-arvo noin 7,2 auttaa maksimoimaan aktiivisen interleukiini-4:n sitoutumisen ja minimoimaan muiden proteiinien sitoutumisen kolonniin. Edullinen metallikelaatti on sinkki, vaikka 25 voidaan käyttää muita metallikelaatteja, kuten kupari, koboltti tai nikkeli. Kun sitominen on suoritettu loppuun, kolonni pestään kahdesti, ensin tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, ja 1,0 M natriumkloridia. Sitten se pestään fosfaattipuskurilla, joka sisältää noin 10 % glyserolia ja alhaisen konsentraa-tion natriumkloridia, ts., noin 150 mM, 20 mM natriumfosfaattipuskurissa. Toinen 30 pesu poistaa epäpuhtaudet, mukaan lukien hyvin lähisukuiset vaikeasti erotettavat epäpuhtaudet. Lopulta aktiivinen IL-4 eluoidaan pH-arvossa 5,0 asetaattipuskurilla, joka sisältää 0,50 M natriumkloridia.

4 102039 2. Aktiivisen IL-4:n liuoksen vaiheesta 1 alistamisen kationinvaihtokromatografialle S-Sepharose® Fast Flow-kolonnilla lähes neutraalissa pH-arvossa noin 6,75 ja 15 mS:ssä (johtokyky), jossa useimmat epäpuhtaudet eivät sitoudu. Sitten edelleen puhdistunut IL-4 puskuroidussa liuoksessa eluoidaan kolonnista; ja 5 3. Aktiivisen IL-4-liuoksen alistamisen geelisuodatuskromatografialle "size exclusion"-kolonnilla, joka on tasapainotettu 10 mM natriumsitraatilla, pH 4,5 jopa tasolle 20 mg/ml konsentroitumisen jälkeen pH-arvossa 4,5. Sitten puhdistetun aktiivisen IL-4-liuoksen keräämisen, joka on 95 - 99-% puhdasta.

10

Hyvin puhdasta aktiivista IL-4:ää voidaan saada myös patenttivaatimuksen 7 mukaisella menetelmällä IL-4:ää ekspressoivien CHO-solulinjojen solukasvatusväliaineesta menetelmässä, joka käsittää: 15 1. Aktiivista IL-4:ää sisältävän raa'an soluviljelyväliaineen alistamisen kationinvaihto kromatografialle S-Sepharose® Fast Flow-kolonnilla lähes neutraalissa pH-arvossa noin 6,7 - 8, edullisesti 7,2, ja 13 -15 mS:ssä (johtokyky), jossa useimmat epäpuhtaudet eivät sitoudu. S-Sepharose®, Fast Flow, joka on saatavissa yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, on ristiliitettyä agaroosimatrii-20 siä, johon on liitetty ioninvaihtoryhmä -CH2-S03' Na+. Kolonni pestään tasapainotus-puskurilla, sitten puhdistettu IL-4 puskuroidussa liuoksessa eluoidaan isokraattisesti kolonnista puskurijärjestelmällä pH-arvossa 7,2, sisältäen 0,26 M NaCI:ää, ja yhdistetään; 25 2. Yhdistetyn eluaatin vaiheesta 1 alistamisen edelleen kationinvaihtokromatografial le suhteellisen pienellä S-Sepharose® Fast Flow-kolonnilla, joka on noin 15 % vaiheen 1 kolonnin pakatusta tilavuudesta. Kolonni pestään tasapainotuspuskurilla, sitten aktiivinen IL-4-molekyyli eluoidaan pH-arvossa 7,2 puskurijärjestelmällä, joka sisältää natriumkloridi-gradienttia 0,12 - 0,50 M; 30 3. Aktiivisen IL-4:n vaiheesta 2 alistamisen affiniteettikromatografialle metallia kela-toivalla agaroosigeelikolonnilla sen jälkeen kun liuoksen pH on säädetty pH-arvoon 7,2 ja johtokyky 45 - 50 mS:ään. Chelating-Sepharose®-geeliä on saatavissa yhtiöstä Pharmacia Hine Chemicals, Piscataway, New Jersey nimillä chelating- 5 102039

Sepharose® Fast Flow ja chelating-Sepharose® 6B. Chelating Sepharose® Fast Flow koostuu iminodietikkahapporyhmistä välikkeillä, jotka on liitetty Sepharose 6 Fast Flow:hon pysyvillä eetterisidoksilla. Sepharose® 6 Fast Flow on ristiliitettyä agaroosia, 6 %. Käytetään puskuria, edullisesti fosfaattipuskuria. Käytetty fosfaatti-5 puskuri on sellaista, jossa on natriumkloridikonsentraatio noin 0,5 M neutraalissa/lie-västi alkalisessa pH-arvossa, ts., pH-arvo noin 6,7 - 8, edullisesti noin 7,2. Suolakon-sentraatio ja lähes neutraali pH-arvo noin 7,2 auttaa maksimoimaan aktiivisen inter-leukiini-4:n sitoutumisen ja minimoimaan muiden proteiinien sitoutumisen kolonniin. Edullinen metallikelaatti on koboltti, vaikka voidaan käyttää muita metallikelaatteja, 10 kuten sinkki, kupari tai nikkeli. Kun sitominen on suoritettu loppuun, kolonni pestään tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, ja 0,5 M nat-riumkloridia. Lopuksi aktiivinen IL-4 eluoidaan isokraattisesti pH-arvossa 6,0 fosfaatti-puskurilla, joka sisältää 0,5 M natriumkloridia; 15 4. Aktiivisen IL-4-liuoksen alistamisen geelisuodatuskromatografialle "size exclusion"- kolonnilla, edullisesti Sepacryl® S-200 HR tai S-100 HR, jotka ovat ristiliitettyjä kopo-lymeerejä allyylidekstraanista ja Ν,Ν'-metyleenibisakryyliamidista, jotka ovat saatavissa yhtiöstä Pharmacia, tasapainotettuna 10 mM natriumsitraatilla, pH 4,5 jopa 20 mg/ml:aan konsentroinnin jälkeen pH-arvossa 4,5. Sitten puhdistetun aktiivisen 20 IL-4:n keräämisen, joka on 95 - 99-% puhdasta.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvassa 1 esitetään edullisen (humaani) IL-4:n aminohapposekvenssi keksinnön 25 mukaisesti käytettäväksi.

Kuva 2 on graafinen esitys neutrofiilisolumäärän kasvusta, joka havaitaan annostelemalla cynomologus-apinoille IL-4:ää.

30 Kuva 3 on graafinen esitys tuloksista, jotka ilmaisevat aktivoitumisen ja erilaistumisen, joka saavutetaan käsittelemällä HL-60-soluja IL-4:llä.

Kuva 4 on graafinen esitys tuloksista, jotka ilmaisevat aktivoitumisen ja erilaistumisen, joka saavutetaan käsittelemällä U-937-soluja IL-4:llä.

e 102039

Keksinnön kuvaus

Keksinnön mukaisesti voidaan käyttää mitä hyvänsä sopivaa IL-4:ää. IL-4:lle on viime aikoina kloonattu ja sekvensoitu komplementaarisia DNA'ita (cDNA'ita) joukos-5 sa laboratorioita, esimerkiksi Yokoto et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5894-5898 (humaani); Lee et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 2061-2065 (hiiri); ja Noma et ai., Nature 319 (1986) 640-646 (hiiri). Le et ai.; J. Biol. Chem. 263 (1988) 10817, on kuvannut yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:n tuottamisen CHO-soluis-sa. IL-4 on myös kaupallinen tuote, joka on saatavissa esimerkiksi yhtiöstä Genzyme 10 Corporation, Boston, Massachusetts (humaani ja hiiri). Lisäksi ei-yhdistelmä-DNA-IL-4:ää on puhdistettu erilaisista kasvatussupernatanteista, esimerkiksi Sanderson et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 437-440 (hiiri); Grabstein et ai., J. Exp.

Med. 163 (1985) 1405-1413 (hiiri); Ohara et ai., J. Immunol. 135 (1985) 2518-2523 (hiiri-BSF-1); Butler et ai., J. Immunol. 133 (1984) 251-255 (humaani-BCGF); ja Farra 15 et ai., J. Immunol. 131 (1983) 1838-1842 (hiiri-BCGF). Edellä olevien julkaisujen selitykset liitetään täten tähän viitteeksi koskien niiden esityksiä DNA- ja aminohapposekvensseistä ja menetelmistä sopivien IL-4-materiaalien saamiseksi tämän keksinnön mukaisesti käytettäviksi.

20 Tämän keksinnön mukaisesti käytetty IL-4 on edullisesti humaani-IL-4:ää, ja edullisimmin se on humaaniversiota, jolla on sekvenssi, joka kuvataan julkaisussa Yokoto et ai.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5894-5898; ja PCT-patenttihakemukses-sa 87/02990, julkaistu 21. toukokuuta 1987. Edellä mainitun julkaisun ja PCT-patent-tihakemuksen selitykset liitetään täten tähän viitteeksi.

25

Keksinnön mukaisesti nisäkkäille annetaan tehokas määrä IL-4:ää lisäämään mono-syyttien ja/tai jyvässolujen (jotka voivat olla mitä hyvänsä seuraavista: polymorfonuk-leaariset solut, eosinofiilit ja/tai basofiilit) lukumäärää. Tällainen tehokas määrä määritellään miksi hyvänsä määräksi, joka lisää merkittävästi neutrofiilimäärää, jolloin 30 merkittävänä pidetään lisääntynyttä määrä ainakin 25 %, edullisesti 50 %. Edullisesti annetaan noin 0,1 - noin 30 pg IL-4/kg kehonpainoa/päivä, edullisesti humaani-IL-4:ää (hlL-4)/kg kehonpainoa/päivä. Edullisemmin nisäkkäille annetaan noin 1,0 - noin 15 pg hlL-4/kg kehonpainoa/päivä, ja edullisimmin nisäkkäille annetaan noin 3,0 - noin 10,0 pg hlL-4/kg kehonpainoa/päivä.

7 102039

Annon määrä, taajuus ja kesto vaihtelevat riippuen tekijöistä, kuten neutrofiili- ja monosyyttimäärän taso (esimerkiksi monosytopenian ja granulosytopenian vakavuudesta), potilaan iästä, ravitsemuksesta, ja vastaavista. Tavallisesti anto tapahtuu aluksi päivittäin ja se voi jatkua aika ajoin potilaan eliniän. Annosmäärä ja taajuus 5 määritetään neutrofiilimäärän ja IL-4:n vaikutuksen suuruuden alkuseulontojen aikana neutrofiilimäärän kasvun jälkeen. Annoksella tähdätään neutrofiilimäärän kasvattamiseen hyväksyttävälle tasolle yhteensä noin 1000 neutrofiiliä ja/tai yhteensä 100 monosyyttiä halutun biologisen vaikutuksen luomiseksi, joka on määritettävä yksilöllisesti kullekin potilaalle kliinisen tapauksen mukaan. Lisäksi voidaan suorittaa selektii-10 visiä manipulointeja, kuten valkosolujen 1 tai usean alipopulaation lisääminen.

IL-4: n neutrofiilejä lisäävän vaikutuksen täydentämiseksi voi olla käyttökelpoista antaa sitä muiden biologisesti ja/tai farmaseuttisesti aktiivisten yhdisteiden yhteydessä. Se voidaan esimerkiksi yhdistää muiden valkosoluja lisäävien aineiden kanssa 15 [esimerkiksi granulosyytti-makrofagi-koloniaa stimuloivan tekijän (GM-CSF) ja jyväs-solukoloniaa stimuloivan tekijän (G-CSF)]. Voi myös olla käyttökelpoista yhdistää IL-4 muiden interleukiinien kanssa, esimerkiksi IL-1:n ja/tai IL-3:n ja/tai IL-7:n valkoisten verisolujen - ja neutrofiilien kokonaismäärän lisäämiseksi. IL-2 yhdistelmänä IL-4:n kanssa voi tuottaa spesifisten ja käyttökelpoisten T-solutoimintojen selektiivi-20 sen parantumisen, ja IL-4 yhdistelmänä IL-5:n ja/tai IL-6:n kanssa voi olla käyttökelpoinen lisäämään selektiivisesti normaalien ja/tai neoplastisten B-solujen toimintaa ja/tai lukumääriä. IL-4 voi myös olla käyttökelpoinen lisäämään muiden kemotera-peuttisten aineiden hyödyllisyyttä, mukaan lukien muttei rajoittuen alkyloivien aineiden, mitoosinestäjien (mitotic spindle poisons) tai kasvaintenvastaisten antibioottien. 25 Lisäämällä valkosolujen lukumäärää tai solujen spesifisten alipopulaatioiden toiminnallista - tai erilaistumisstatusta voidaan lisätä edellä mainittujen kemoterapeuttisten aineiden tehokkuutta. Interferonin, esimerkiksi gamma- tai alfa-interferonin yhdistelmä IL-4:n kanssa voi myös olla käyttökelpoinen määrättyjen valkosolujen, erityisesti T-solujen alajoukon lukumäärien ja toimintojen parantamisessa. Määrätyissä tilan-30 teissä välttämättömän biologisen vaikutuksen saavuttamiseksi voidaan natiivien molekyylien sijasta antaa vasta-aineita mille hyvänsä edellä mainituista interleukii-neista tai interferoneista.

g 102039

Annoksen voidaan antaa laskimonsisäistä, nasaalista, parenteraalista, oraalista, ihonalaista, lihaksensisäistä, paikallista tai ihon läpäisevää reittiä, tai mitä hyvänsä muuta hyväksyttävää reittiä. IL-4 voidaan antaa missä hyvänsä joukosta tavanomaisia annosmuotoja. Parenteraalisia valmisteita ovat mm. steriilit liuokset tai suspen-5 siot. Inhalaatioanto voidaan suorittaa nasaalisen tai oraalisen suihkeen muodossa, tai insufflaatiolla. Paikalliset annosmuodot voivat olla käsivoiteita, voiteita, pesuliuok-sia, ihon läpi vapauttavia laitteita (esimerkiksi tavallista säiliö- tai matriisilaastarityyp-piä) ja vastaavia.

10 Edellä olevilla annosmuodoilla ajatellut formulaatiot ja farmaseuttiset koostumukset voidaan valmistaa tavanomaisilla farmaseuttisesti hyväksyttävillä täyte- ja lisäaineilla tavanomaisia tekniikkoja käyttäen.

Tällä hetkellä IL-4 annetaan edullisesti laskimonsisäistä reittiä. Annettavat liuokset 15 voivat olla uudelleenmuodostettuja lyofilisoituja jauheita, ja lisäksi ne voivat sisältää säilöntäaineita, puskurointiaineita, dispergoimisaineita ja vastaavia.

Edullisesti IL-4 muodostetaan uudelleen 10 mM sitraattipuskurilla ja säiiöntäaineetto-malla steriilillä vedellä, jolloin maksimikonsentraatio ei ole yli 100 pg/ml, ja annetaan 20 jatkuvalla laskimonsisäisellä infuusiolla tai laskimonsisäisellä injektiolla. Jatkuvaa infuusiota varten päivittäisannos voidaan lisätä 5 ml:aan normaalia suolaliuosta ja infusoida liuos mekaanisella pumpulla tai painovoimalla.

IL-4:n vaikutus neutrofiilimäärän kasvuun voidaan määrittää seuraavalla testiproto-25 koltalla.

E. colista peräisin olevaa humaani-IL-4:ää, jolla oli kuvassa 1 esitetty aminohappo-sekvenssi, arvioitiin 1-kuukautisessa tutkimuksessa cynomolgus-apinoissa. IL-4:ää annettiin laskimonsisäisesti kerran päivässä annoksina 2, 10 ja 25 pg/kg/päivä. Api-30 noista olevien verinäytteiden hematologiset ja kliinis-kemialliset arvioinnit suoritettiin valituilla ajanhetkillä ennen annostelua, sen aikana ja 1 kuukauden kuluttua annostelun päättymisestä. Arvot johdettiin Coulter S+4-hematologia-analysaattorista [valkosolujen kokonaismäärä] ja manuaalisesta differentiaalilaskusta. Tulokset, jotka esitetään kuvassa 2, osoittavat keksinnön mukaisesti tuotetun neutrofiilimäärän kasvun.

9 102039

Neutrofiitien aktivointi IL-4:llä voidaan osoittaa seuraavilla testiprotokollilla. Menetelmät 5 A. Solujen eristäminen: Kokoverta cynomolgus-apinoista 4 viikkoa IL:n (25 pg/kg) tai väliaineen annostelun lopettamisen jälkeen alistettiin painovoimasedimentoitumiselle 6-% dekstraanin läpi, jonka jälkeen seurasi vaihtoehtoinen sulatus hypotonisella suolaliuoksella tai Tris/ammoniumkloridilla valkosolujen talteen ottamiseksi.

10 B. Hiivan fagosytoosimääritys. Fagosyyttinen määritys suoritettiin lisäämällä 300 μΙ ihmisseerumia, 50 μΙ kuumassa tapettuja hiivahiukkasia (108 organismia/ml) 12 x 75 mm polypropyleeniputkiin, jotka sisälsivät suunnilleen 5 x 105 eristetyistä valkosoluista. Inkubointia suoritettiin 90 min ajan gyrorotaatiovesihauteessa 37 °C:ssa. Sentrifugoinnin jälkeen solususpensio värjättiin 0,4-% trypaanisinisellä ja 15 0,2-% eosiini Y:llä suolaliuoksessa. Syöty hiiva pysyi värittömänä, ja syömätön hiiva värjäytyi purppuranpunaiseksi, sallien vetovoiman (syötyjen hiivasolujen lukumäärän) samoin kuin fagosyyttisten solujen tarkan määrittämisen. Näille parametreille saadut keskiarvot kerrottiin fagosyyttisen indeksin laskemiseksi kullekin apinalle. Arvot analysoitiin Studentin T-testillä, verraten arvoja IL-4-käsitellyistä apinoista arvoihin kont-20 rolliapinoista, jotka saivat yksistään väliainetta. Tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1. 4 viikkoa IL-4:stä luopumisen jälkeen apinoista otettujen perifeeristen valkosolujen fagosyyttinen toiminta

Apina # IL-4a(ua/ka/ hiiva/solub % faaosvtoottisiac faaosvvttinen indeksi13 25 1 0 3,8 ±0,2 35,0 130,6 2 0 3,8 ±0,2 50,0 186,5 3 0 5,3 ±0,2 45,6 242,1 4 0 2.6 ±0.2 33.8 87.5 keskiarvo® 3,9 ±0,6 41,1 ±4 161,6 ±33,6 30 5 25 4,84± 0,2 82,5 399,3 6 25 4,8 ±0,2 70,0 333,3 7 25 4,7 ±0,2 71,4 336,4 8 25 3.8 ±0.2 61.9 232,6 keskiarvo® 4,5 ±0,2 71,5 ±4f 325,4 ± 34,59 ίο 102039 a Soluja, jotka saatiin apinoista, joille annosteltiin 4 viikon ajan IL-4:ää tai väliainetta, minkä jälkeen seurasi 4 viikon uloshuuhtoutumisajanjakso.

b Keskiarvo hiiva/solu = syödyn hiivan lukumäärä/60 solua kustakin apinasta; keskiar-5 vo ± keskiarvon keskivirhe (SEM) laskettujen solujen pohjalta.

c % fagosytoottisia soluja = % hiivan syömiä soluja/solujen kokonaismäärä x 100.

d Fagosytoottinen indeksi = keskiarvo hiiva/solu x % fagosytoottisia soluja.

10 e Keskiarvo ± SEM yksittäisistä arvoista apinoille. f P<0,002, Studentin T-testi, kontrolli versus IL-4.

15 9 P<0.014, Studentin T-testi, kontrolli versus IL-4.

C. NBT-määritys:

Edellä kuvatun eristyksen jälkeen valkosoluja cynomolgus-apinoista suspendoitiin 20 uudelleen 0,2 ml:aan RPMI-1640:tä, joka sisälsi 2 % kuumassa inaktivoitua naudan sikiön seerumia, ja jaettiin 12 x 75 mm polypropyleenikoeputkiin. Jokaiseen putkeen soluihin lisättiin 0,1 ml 2-mg/ml liuosta, jossa oli nitrosinitetratsoliumia (NBT) 2-% ; RPMLssä, ja 0,1 ml 0,25 μΜ kantaliuosta juuri valmistetusta forboli-12-myristaatti-13- asetaatista (PMA) 2-% RPMLssä. Solususpensiota inkuboitiin 37°C:ssa vesihautees-25 sa 30 min ajan. Inkuboinnin jälkeen putket sentrifugoitiin, ja supernatantit poistettiin solupelletistä. Solupellettejä kuivattiin 1 tunnin ajan 37°C:ssa ennen uuttoa N,N-di-metyyliformamidilla (DMF). 1 ml DMF:ää lisättiin solupellettiin, sekoitettiin, ja inkuboitiin välittömästo 85°C:ssa 20 min ajan. Putket sentrifugoitiin, ja värillinen DMF kerättiin spektrofotometristä analyysiä varten 560 nrrdlä DMF-nollakoetta vasten. Kaikki 30 mittaukset suoritettiin 30 min sisällä inkuboinnin päättämisestä.

Pelkistyneen NBT:n (NBF; gg/ml) laskeminen suoritettiin standardikäyrästä käyttämällä sarjalaimennoksia 2 mg/ml NBT-kantaliuoksesta lisättyinä täpliksi Whatman-suodatinsuikaleille ja kuivattuina. Standardikäyrää varten NBT pelkistettiin alistamalla 11 102039 1 mM askorbaattiliuokselle 0,2 N NaOH.ssa 20 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Suodattimet uutettiin DMF:llä ja luettiin 560 nnrllä. NBF/solun laskelma saatiin jakamalla NBF, pg/ml, solujen lukumäärällä ml:ssa näytettä. Tulokset esitetään taulukossa 2.

5

Taulukko 2. 4 viikkoa IL-4:stä luopumisen jälkeen apinoista otettujen perifeeristen valkosolujen fagosyyttinen toiminta NBT:n pelkistymisellä mitattuna.

Apina IL-4-anno$a absorbanssi NBF/ml NBFb 10 # (pg/kg) (560 nm) (pg/ml) pg/solu 1 0 0,095 3,9 0,3 2 0 0,075 3,1 0,3 3 0 0,113 4,5 0,7 4 0 0,033 1,5 0J3 15 keskiarvo 0,4±0,1c 5 25 0,213 8,3 1,1 6 25 0,316 12,1 0,7 7 25 0,483 18,5 1,0

8 25 0,163 6,5 0J

20 keskiarvo Q,9±0,1cd a Soluja, jotka saatiin apinoista, joille annosteltiin 4 viikon ajan IL-4:ää tai väliainetta, minkä jälkeen seurasi 4 viikon uloshuuhtoutumisajanjakso.

25 b NBF, pg/solu, laskettuna NBF pg/ml/solujen kokonaismäärä näytteessä. Solujen lukumäärä on saatu hemasytometrilaskulla käyttämällä Turkin liuosta ennen määritystä.

c keskiarvo ± SEM apinoiden yksittäisistä arvoista.

d P<0,02, Studentin T-testi, kontrolli versus IL-4.

30 12 102039

Edellä olevat tulokset osoittavat, että 4 viikkoa annostelun jälkeen IL-4-käsitellyistä apinoista saatujen valkosolujen fagosyyttinen indeksi kasvoi merkittävästi verrattuna kontrollieläimistä saatuihin valkosoluihin. Tämä fagosyyttisen indeksin kohoaminen johtui hiivaa syövien solujen %-osuuden kasvusta. Solujen vetovoimassa (solua 5 kohden syödyn hiivan lukumäärässä) on hienoista kasvua IL-4:llä annostelun jälkeisessä ryhmässä. NBT-väein pelkistysvaste mitattuna yksikössä pg/solu NBF:ää kasvoi soluissa, jotka otettiin IL-4:l!ä käsitellyistä soluista verrattuna soluihin apinoista, jotka olivat väliainekontrolliryhmässä.

10 Nämä 2 määritystä, hiivasolunsyöminen ja NBT-värinpelkistys, ovat mittoja fagosy-toosista ja metabolisista muutoksista (respiratorinen purskahdus), jotka ovat tärkeitä vaiheita tapahtumajaksossa, joka johtaa infektoivien aineiden tuhoutumiseen. Molemmissa parametreissä saadut kasvut ilmaisevat, että IL-4 voi lisätä tai vahvistaa fagosyyttistä vastetta.

15 U937 on soluiinja (ATCC CRL 1593), joka on perustettu pahanlaatuisista soluista potilaasta, jolla on levittäytynyt histiosyyttinen leukemia [Sunstrom et ai; Int. J. Cancer 17 (1976) 565-577]. Tällä solulinjalla on ominaispiirteitä, jotka viittaavat siihen, että se on kypsymätön monosyytti.

20 HL-60 on soluiinja (ATCC CCL 240), joka on perustettu potilaasta, jolla on akuutti promyelosyyttinen leukemia. Näillä soluilla on ominaispiirteitä, jotka viittaavat siihen, ; että se on kypsymätön neutrofiili.

25 IL-4 voi indusoida näiden 2 kypsymättömän solun erilaistumisen määritettynä fagosyyttisen toiminnan lisääntymisenä, heksaasimonofosfaattisivuvirtauksen (NBT:n pelkistys) aktivoinnin kasvuna, joka heksaasimonofosfaattisivuvirtaus on fagosytoo-sin metabolinen välttämättömyys, solujen %-osuuden kasvun, jotka solut voivat ottaa vastaan kypsille neutrofiileille spesifistä väriä (nahtoliklooriasetaattiesteraasi) tai kyp- 30 sille monosyyteille spesifistä väriä (a-naftyyliasetaattiesteraasi), ja solujen lisääntymisen, jotka ovat positiivisia pintamerkkiaineille osoitettuna kypsien monosyyttien tai kypsien neutrofiilien FACS-analyysillä.

13 102039 IL-4:n vaikutus valkosolujen kypsymiseen voidaan osoittaa seuraavilla testimenettely-tavoilla.

NBI.n (nitrosinitetratsolium) pelkistys fomriatsaaniksi 5

Respiratoriseen purskahdukseen liittyvän heksoosimonofosfaattisivuvirtausaktivoin-nin mittaaminen.

Muller et ai.; Agents & Actions 11 (1981)384.

10 Baehner et ai.; New Eng. J. Med. 278 (1968) 971.

Salin ja McCord; J. Clin. Invest. 54 (1974) 1005.

Standardisoitu käytettäväksi U-937-ja HL-60-solulinjoilla 15 1. Kerää kohdesoluja riittävästi 106 solua/kaivo-määritykseen. Sentrifugoi Sorvall- sentrifugilla nopeudella 1200 r/min 5 min ajan. Pese PBSillä ja sentrifugoi uudelleen.

2. Lisää soluja riittävässä määrässä RPMLtä + 2% FBS (2 %) muodostamaan tasaeriä 0,2 ml/kaivo-määritykseen.

20 3. Muodosta tasaeriä 0,2 ml/kaivo 24-kaivoisella tasapohjaisella levyllä.

4. Lisää 0,1 ml 20 μΜ PMA:ta 2 %:ssa (jokaiseen kaivoon).

25 5. Lisää 0,1 ml 2 mg/ml NBT.tä 2 %:ssa (jokaiseen kaivoon).

6. Inkuboi levyä 30 min ajan 37 °C:ssa.

7. Poista välittömästi 0,1 ml soluja ja sentrifugoi alas nopeudella 200 r/min (hidas 30 kiihdytys) 5 min ajan käyttämällä Shandon Cytospin-laitetta.

8. Vastavärjää Doif-Quick-järjestelmällä ja asenna peitelevy laskemista varten.

14 102039

Edellä kuvattu hiivafagosytoosimääritys suoritettiin myös molemmilla solulinjoilla samaa metodologiaa käyttämällä.

Naftoli AS-D-klooriasetaattiesteraasivärjäys PMNS:lle 5

Yarn et ai.; Am. J. Clin. Path. 55 (1971) 283.

Li et ai.; J. Histiochem. Cytochem. 21 (1973) 1.

Standardisoitu HL-60-solulinjan värjäykseen.

10 1. Sentrifugoi 1 - 5 x 105 solua mikroskooppialuslevylle nopeudella 200 r/min (hidas kiihdytys) 5 min ajan Shandon Cytospin-laitetta käyttämällä.

2. Kiinnitä aluslevyä 2 min ajan sitraatti/asetoni/MeOH-kiinnitysliuoksessa huoneen-15 lämpötilassa (R.T.).

3. Pese deionisoidussa (d.i.) vedessä ja kuivaa ilmassa 20 min ajan.

4. Värjää levyjä AS-D-värissä 30 min ajan 37 °C:ssa pimeässä.

20 5. Pese 3x d.i.-vedessä.

6. Vastavärjää happo/hematoksyliini-värissä 5 min.

25 7. Pese 3x d.i.-vedessä, kuivaa ilmassa, asenna peitelevy.

Sitraatti/asetoni/MeOH-kiinnitysliuos:

Laimenna sitraattikonsentraattia 1:9 d.i.-vedellä.

30 Lisää 18 ml sitraattiliuosta, 27 ml asetonia ja 5 ml abs. MeOH:ta (metanoli).

Säilytä huoneenlämpötilassa.

Valmista päivittäin.

AS-D-väri:

Laimenna Trizmal 6.3:a 1:9 d.i.-vedellä.

1C 102039 15 Lämmitä 50 ml laimeaa Trizmal 6.3:a 37 °C:seen ja lisää vakiosekoituksella yhden Fast Corinth V-suolakapselin sisältö.

Kun suola on liuennut täysin, lisää 2 ml naftoli-AS-D-klooriasetaattiliuosta. Liuos näyttää melko samealta. Jatka sekoitusta 15-30 min ajan, ja lisää "coplin'-astiaan. 5 Älä suodata.

AS-D-liuos:

Liuota 1 kapseli naftoli-AS-D-klooriasetaattia (20 mg) 2 ml:aan dimetyyliformamidia. Valmista välittömästä ennen käyttöä.

10 Käytä yhtiön Sigma testipakkausta 90 - Naphthol AS-D Chloroacetate.

α-naftyyliasetaattiesteraasivärjäys makrofageilie 15 Yarn et ai.; Am. J. Clin. Path. 55 (1971) 283.

Li et ai.; J. Histiochem. Cytochem. 21 (1973) 1.

Standardisoitu U-937-solulinjan värjäykseen.

20 1. Sentrifugoi 1 - 5 x 105 solua mikroskooppilevylle nopeudella 200 r/min (hidas kiih dytys) 5 min ajan Shandon Cytospin-laitetta käyttämällä.

2. Kiinnitä levyä sitraatti/asetoni/MeOH-kiinnitysliuoksessa 30 min ajan R.T.:ssä.

25 3. Pese tislatussa/deionisoidussa vedessä ja kuivaa ilmassa 20 min ajan.

4. Värjää levyjä NE-värissä 37 °C:ssa 30 min ajan pimeässä.

5. Pese 3x tislatussa/deionisoidussa vedessä.

30 6. Vastavärjää Mayer'in hematoksyliinissä 5 min ajan R.T.:ssä.

7. Pese tislatussa/deionisoidussa vedessä, kuivaa ilmassa, asenna peitelevy.

16 102039

Sitraatti/asetoni/MeOH-kiinnitysliuos:

Laimenna sitraattikonsentraattia 1:9 tislatulla/deionisoidulla vedellä.

Lisää 18 ml sitraattiIiuosta, 27 ml asetonia, ja 5 ml abs. MeOH:ta.

Säilytä huoneenlämpötilassa.

5 Valmista päivittäin.

NE-väri:

Laimenna Trizmal 7.6:ta (mono[tris(hydroksimetyyli)aminometaani]maleaatti; pH 7,6) 10 1:9 tislattuun/deionisoituun veteen.

Lämmitä laimeaa Trizmal 7,6:ta 37 °C:een ja lisää vakiosekoituksella sisältö 1 kapselista Fast Blue RR-suolaa (4-bentsoyyliamiini-2,5-dimetoksibentseeni-diatsonium-kloridi hemi[sinkkikloridi]suola). Kun suola on täysin liuennut, lisää 2 ml NE-liuosta.

15 Liuos on keltainen ja hieman samea. Jatka sekoittamista 15-20 min ajan ja lisää "coplin'-astiaan. Älä suodata.

NE-liuos: 20 Liuota 1 kapseli (20 mg) a-naftyyliasetaattia 2 ml:aan etyleeniglykolimonometyylieet-teriin. Valmista välittömästi ennen käyttöä.

Käytä yhtiön Sigma testipakkausta 90 a-naftyyliasetaatti.

25 Tulokset edellä olevista menettelytavoista HL-60-soluja ja U-937-soluja käyttämällä esitetään taulukoissa 3 ja 4 alla.

Taulukko 3. E. coli'sta peräisin olevan IL-4:n vaikutus HL-60-solujen toimintaan ja erilaistumiseen.

30 „ 102039 % fagosyyttisiä fagosyyttinen käsittely3 hiiva/solub soluja0 indeksid NBT® CAEf väliaineet 2,4 ±0,3 18 ± 5 42 ±12 17 ±2 21 ±5 IL-4 5 250 U/m 5,5 ± 1,49 42 ± 59 225 ±459 33 ±3 62 ± 39 25 U/ml 5,1 ± 1,1h 41 ± 49 207 ± 379 39 ± 49 56 ± 69 2,5 U/ml 5,4 ± 1,59 36 ± 39 184 ± 389 38 ± 49 53 ± 39 0,025U/ml 3,1 ±0,6 25 ± 0,6 75 ± 18 23 ±2 32 ± 7 DMSO 3,6 ± 0,49 71 ±109 259 ± 549 92 ± 29 56 ± 29 10 3 HL-60-soluja, joita inkuboitiin 6 päivän ajan väliaineissa, jotka sisälsivät merkityt konsentraatiot lL-4:ää tai DMSO:ta. Viljelmille syötettiin IL-4:ää tai DMSO.ta 3. päivänä.

15 b Keskiarvo ± SEM 4 erillisestä kokeesta; keskimääräinen hiiva/solu = syötyjen hiivojen lukumäärä/30 solua.

c % fagosyyttisiä soluja = % hiivaa syöviä soluja/solujen kokonaismäärä x 100 keskiarvo ± SEM 4 erillisestä kokeesta.

20 d fagosyyttinen indeksi - keskiarvo hiiva/solu x % fagosyyttisiä soluja.

3 % NBT:lle positiivisia soluja/100 solua; keskiarvo ± SEM 4 kokeesta.

25 1 % klooriasetaattiesteraasientsyymiaktiivisuudelle positiivisia soluja/100 solua; keski arvo 4 kokeesta.

9 P < 0,05; Studentin T-testi, väliaineet versus IL-4-käsitellyt tai DMSO:lla käsitellyt ryhmät.

h P < 0,10; Studentin T-testi, väliaineet versus IL-4-käsitellyt tai DMSO:lla käsitellyt ryhmät.

30 18 102039

Taulukko 4. E. coli'sta peräisin olevan IL-4:n vaikutus U937-solujen toimintaan ja erilaistumiseen.

% fagosyyttisiä fagosyyttinen 5 käsittely3 hiiva/solub soluja® indeksid NBTe a NEf väliaineet 1,3 ±0,04 10 ±2 15 ±3 5 ±0,5 16 ±4 IL-4 250 U/ml 2,5 ±29 25 ±59 57± 159 38 ±79 66 ±79 25 U/ml 2,4 ± 0,29 25 ± 59 63± 179 41 ± 19 64 ±69 10 2,5 U/ml 2,5 ± 0,29 20 ± 39 51 ± 109 33 ± 29 54 ± 79 0,25 U/ml 1,9 ± 0,39 21 ±5h 43±14h 28 44 ±49 0,025U/ml 1,7 ± 0,19 16 ±4 28 ±8 27 ± 29 29 ± 3 3 U937-soluja, joita inkuboitiin 6 päivän ajan väliaineissa, jotka sisälsivät merkityt 15 konsentraatiot IL-4:ää. Viljelmät syötettiin 3. päivänä.

b Keskimääräinen hiiva/solu = syötyjen hiivojen lukumäärä/30 solua; keskiarvo ± SEM 4 erillisestä kokeesta.

20 c % fagosyyttisiä soluja = % hiivaa syöviä soluja/solujen kokonaismäärä x 100 keskiarvo ± SEM 4 erillisestä kokeesta.

• d fagosyyttinen indeksi - keskiarvo hiiva/solu x % fagosyyttisiä soluja; keskiarvo ± SEM 4 erillisestä kokeesta.

25 3 % NBT:lle positiivisia soluja/100 solua; keskiarvo ± SEM 4 kokeesta.

f % NE-aktiivisuudelle positiivisia soluja/100 solua; keskiarvo ± SEM 4 kokeesta.

30 9 P < 0,05; Studentin T-testi, väliaineet versus IL-4-käsitellyt tai DMSOilla käsitellyt ryhmät.

19 102039 h P s 0,10; Studentin T-testi, väliaineet versus IL-4-käsitellyttai DMSO:lla käsitellyt ryhmät.

Monosyytti- ja neutrofiilipintamerkkiaineiden FACS (Fluorescence-Activated Cell 5 Sorter)-analyysi HL-60-ja U-937-soluja inkuboitiin T-75-pulloissa 37°C:ssa ja 5-% C02:ssa kasvavien IL-4-tasojen (E. coli'sta peräisin olevaa yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:ää (rhulL-4), 8-ILE-1002) tai kontrollien kanssa; solut jaettiin ja syötettiin 3. päivänä. Päivinä 1, 10 3 ja 6 soluja poistettiin, pestiin RPMI 1640:llä ja salvattiin humaanilla kuumassa aggregoidulla lgG:llä mahdollisen Fc-vuorovaikutuksen vähentämiseksi. Kun oli jälleen pesty RPMI.IIä, solut suspendoitiin uudelleen 50 pl.aan laimennettua vasta-ainetta (katso seuraavaa taulukkoa monoklonaalisen vasta-aineen panelia varten) ja inkuboitiin 30 min jäässä. Sitten solut pestiin PBS:llä, suspendoitiin uudelleen 15 100 pl.aan laimennettua FITC-konjugoitua vuohi-anti-hiiri-lgG:tä, tai lgG2b, ja inku boitiin 30 min ajan jäässä. Toisen vasta-aineen inkuboinnin jälkeen solut pestiin yhä uudelleen PBS:ssä, sitten suspendoitiin uudelleen PBS:ään ja ajettiin Becton-Dickinson FACScan-laitteella sytofluorometristä analyysiä varten. Isotyyppikontrollit hiiri-igG2b:lle ja -lgG1:lle ja toisen vasta-aineen kontrolleille ajettiin positiivisten solujen 20 lisääntyessä yli konstitutiivisen ekspressiotason (ts., lisääntyneen ekspression IL-4-induktio).

. Monoklonaalinen vasta-ainepaneli: 25 CD (Cluster of

Mab lg-isotyyppi Differentiation) spesifisyys WEMG11 hiiri-lgG, tuntematon gp 110: jyvässolut FMC 32 hiiri-lgG, tuntematon myelomonosyytit OKM-1 hiiri-lgG2b CD11b CR-3 30 anti-Leu M5 hiiri-lgG^ CD11c ketju (gp 150-95) anti-CR-1 hiiri-lgG, CD35 C3b, CR-1 anti-Leu M3 hiiri-lgG2b CD14 monosyytit ,n 102039 20

Tulokset yllä olevasta FACS-analyysistä esitetään kuvissa 3 ja 4. Humaani-IL-4-ekspressioplasmidi pdhfr-SRa263:n muodostaminen 5 Plasmidien pSRa-CAT196, pcD137, pcD-SRa205, pcDhlL4 klooni 125 ja pcD-SRa224 muodostaminen on kuvattu (Takebe et ai., Molecular and Cellular Biology 8 (1988) 466-477; ja Yokoto et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 5894-5898). Kuten kuvassa 1 esitetään, plasmidi pcD-SRa-205 muodostettiin kolmimolekyylisel-lä ligaatiolla 373 emäsparin Ncol-Xhol SRa-promoottorifragmentista pSRa-10 CAT 196:sta, 434 emäsparin Xhol-Sstl-liitoskohdasta (SJ) ja 5'-hiiri-IL-4 (mll_-4)-frag-mentista pcD137:stä, ja 32321 emäaparin Sstl-Ncol-fragmentista, myös pcD137:stä, sisältäen 3'-hiiri-IL-4-cDNA:n, SV40-polyadenylointialueen ja pBR322:sta peräisin olevan plasmidirungon, joka sisältää replikaation aloituskohdan ja ampisilliiniresis-tenssigeenin. G-C-häntä hävitettiin pcD-hlL-4-kloonista 46 (Yokoto et ai.; Proc. Natl. 15 Acad. Sei. USA 83: 5894-5898) seuraavalla tavalla. Okayama-Berg-plasmidi pL1 (Okayama ja Berg; Molecular and Cellular Biology 3 (1983) 280-289) katkaistiin Pstl:llä, ja 4 nukleotidin 1-säikeinen uloke poistettiin T4-polymeraasin 3'-5'-eksonuk-leaasiaktiivisuudella. Bglll-linkkerit liitettiin tylppiin DNA-päihin, minkä jälkeen seurasi katkaisu BgllUlaja Hindllklla. Hindlll/Bglll-fragmentti, joka sisälsi pL1:n SV40-sek-20 venssin, eristettiin ja insertoitiin Bglll/Hindlll:llä katkaistuon pcD-MCGF:ään (Yokoto et ai.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 1070-1074). jolloin saatiin välituoteplas-midi 101. Puhdistettu 311 emäsparin Pst-fragmentti plasmidista pcD-hlL-4-kloonista 46 katkaistiin Sau3A-l:llä, joka vapauttaa 163 emäsparin fragmentin, jossa on Bglll.n kanssa yhteensopivat 1-säikeiset ulokkeet. 162 emäsparin fragmentti liitettiin Bgllklla 25 katkaistuun p101:een, jolloin saatiin välituoteplasmidi 112. p112:n Hindlll/Nhel-frag-mentti, joka sisälsi SV40-ja humaani-IL-4-cDNA-sekvenssit, liitettiin Hindlll/Nhel:llä katkaistuun klooni 46-DNA:han, jolloin saatiin pcD-hlL-4-klooni 125, joka sisälsi SV40-varhaisen promoottorin, SV40-liitoskohdan ja täydellisen humaani-IL-4-cDNA:n, josta on hävitetty G-C-häntä. Plasmidi pcD-Sra224 muodostettiin korvaa-30 maila pcD-SRa205:n pieni Xhol-fragmentti (sisältäen SJ:n ja mlL4-cDNA:n) pcDhlL- 4-kloonin 125 pienellä Xhol-fragmentilla, joka sisältää SJ:n ja HIL-4-cDNA:n, josta on hävitetty G-C-häntä edellä kuvatulla tavalla.

21 102039

Sali-kohta lisättiin pMTVdhfnään (Lee et ai.; Nature 294 (1981) 228-232) EcoRI/BamHI-restriktiolla, 1-säikeisen ulokkeen Klenow-polymeraasitäytöllä ja liittämisellä oktanukleotidi-Sall-linkkeriin kuvassa 1 esitetyllä tavalla. Silloin plasmidista pMTVdhfr259 puuttuu restriktiokohdat EciPLtä ja BamHl.tä varten, ja alue näiden 5 kahden välillä korvataan Sall-linkkerillä. pcD-SRa224:n Sali-fragmentti, joka sisältää Sra-promoottorin, SV40-SJ:n, humaani-IL-4-cDNA:n ja SV40-polyadenylointisignaa-lit, insertoitiin pMVTdhfr259:n ainutlaatuiseen Sali-kohtaan. Lopullinen humaani-IL-4-ekspressioplasmidi, pdhfr-SRa263 sisältää seuraavat elementit, vastapäivään Sali-kohdasta: 10 1. Ampisilliinirersistenssigeenin ja replikaation aloituskohdan pBR322:sta.

2. MMTV LTR:n ohjaama dhfr-ekspressioyksikkö pMTVdhfr:stä.

15 3. SRa-promoottorin.

4. SV40:stä peräisin oleva liitoskohta.

5. Humaani-IL-4-cDNA.

20 6. SV40:stä peräisin oleva polyadenylointisignaali.

Vektorissa läsnä oleva humaani-IL-4-cDNA-sekvenssi on sama kuin pcD-HIL-4-kloonissa 46, joka esitetään julkaisussa: Yokoto et ai.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 25 (1986) 5894-5898.

DHFR-geeniamplifionti ja IL-4-SI-linjan valinta

Kiinalaisen hamsterin munasolumutantit, joilta puuttuu dihydrofolaattireduktaasiaktii-30 visuus (CHO-dhrf'), ovat laajalti käytettyjä erilaisten yhdistelmä-DNA-proteiinien ylituotantoon. (Kaufman et ai.; Molecular and Cellular Biology 5 (1985) 1750-1759). CHO-dhfr^utanttisoluilla on auksotrooppinen hypoksantiini- tymidiini- ja glysiinivaati-mus. Ekspressiovektoreita, jotka sisältävät dhfr-markkerin, voidaan käyttää tämän mutaation täydentämiseen; valinta toteutetaan kasvattamalla sotuja edellä kuvattujen 22 102039 vaadittujen väliainekofaktoreiden puutteessa. Geeniamplifiointi (kopioluvun kasvu tasolle 1000X) voidaan toteuttaa kasvattamalla soluja folaattianalogi metotreksaatin (MTX) kasvavissa konsentraatioissa. Integroidun yhdistelmä-DNA-dhfr-paikan ampli-fiointi genomissa antaa tulokseksi ekspressioyksikön kopioluvun samanaikaisen 5 kasvun kiinnostuksen kohteena olevalle geenille (Ringhold et ai., J. Mol. Applied Genetics 1 (1981) 165-175; ja Kaufman et ai.; EMBO J. 6 (1987) 187-193).

Plasmidi-DNA, jossa on koodisekvenssi dhfrää ja humaani-IL-4:ää varten (pdhfr-SRa263) muodostettiin edellä kuvatulla tavalla. pdhfr-SRa263:n transfektio DXB-IΙ-ΙΟ CHO-dhfrsolulinjaan suoritettiin kalsiumfosfaattisaostusmenetelmällä. (Graham ja Van der Eb; Virology 52 (1978) 546). Transformantit valittiin valintaväliaineessa (DMEM, Dulbecco'n modifioitu Eagle'n väliaine), josta puuttuu hypoksantiini ja tymi-diini. Klooni, jota merkitään 3B12, valittiin amplifioinntin ensimmäistä sylkiä varten. 3B12-kloonia kasvatettiin α-ΜΕΜ-väliaineessa (Eagle'n minimaalinen välttämätön 15 väliaine), joka sisältää 40 nM MTX:ää kunnes valittiin resistentit kloonit. Klooni, joka merkittiin 3B12-A26, käytettiin edelleen amplifioimiseen 1 pM:lla MTX:ää. Toisen lääkevalintasyklin jälkeen edelleen kehittämistä varten valittiin klooni, joka merkittiin 3B12-A26-19. Tämä klooni sopeutettiin kasvamaan suspensiotavalla 10 %:n kanssa NU Serum™ V:tä, ja ahkiooni, jota merkittiin IL-4 SI, valittiin suurimittakaavaiseen 20 lisäämiseen.

Viljelmän valmistus Pääsolupankin (MCB) valmistamiseksi käytettiin kahta alkuperäistä 100-ml pyöritys-25 pulloa, jotka sisälsivät IL-4 Sl-soluja. Solut saatettiin vielä kasvatusväliaineen kahden vaihdon läpi, ja kasvatettiin 100-ml pyörityspulloissa (kasvatusväliaine on perusväli-ainetta ynnä 0 -10 % seerumia, esimerkiksi NU Serum™ V:tä). Solut kerättiin kaikista pulloista, pestiin, suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan pakastusväliainetta, yhdistettiin ja jaettiin noin 2,0-ml steriileihin solunvarastointipulloihin (pakastusväliaine on 30 perusväliainetta ynnä 20 % seerumia, esimerkiksi NU Serum™ V ynnä 10 % dime-tyylisulfoksidia). Pullot pakastettiin hitaasti -70°C:ssa ja varastoitiin nestetypessä.

Solut 3 pakastetusta pullosta sulatettiin ja lisättiin suspendoimalla kasvatusväliainee-seen 4 - 6 sukupolven ajan pyörityspulloissa, joiden koko kasvoi 100 ml:sta 3 litraan.

23 102039

Solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin ja suspendoitiin uudelleen pakastusväliainee-seen. Solususpensio jaettiin aseptisesti noin 2,0-ml steriileihin solunvarastointipulloi-hin. Pullot pakastettiin hitaasti -70°C:ssa ja varastoitiin nestetypessä pääsolupankin (MCB) perustamiseksi.

5 Päätyöskentelysolupankki (MWCB) valmistettiin MCB:stä sulattamalla 1-3 MCB-putkea ja lisäämällä soluja T-pulloissa, ja suspensiossa 4-6 sukupolven ajan kasvavissa tilavuuksissa 3 litraan asti. Solut kerättiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen pakastusväliaineeseen ja jaettiin tasaeriin ja pakastettiin tavalla, joka kuvattiin 10 MCB:lle. Myös MWCB:tä säilytettiin nestetypessä.

IL-4:n tuotanto suoritettiin bioreaktoreissa, jotka olivat tilavuudeltaan 50 - 200 I. Tuotannon aloittamiseksi 1 pakastettu pullo MWCB:stä sulatettiin ja siirrostettiin T-75-pulloon. Inkuboinnista kunnes solukonsentraatio saavuttaa 100-% yhteenkasvun, 15 solut trypsinoitiin ja siirrostettiin 2 T-75-pulloon (mahdollisesti voidaan käyttää T-160-pulloa). Näitä pulloja inkuboitiin jälleen 100-% yhteenkasvuun, ja trypsinisoituja soluja käytettiin 100-ml pyörityspullon siirrostamiseen.

100-ml pyörityspulloa inkuboitiin kunnes saavutettiin adekvaatti solukasvu, ja käytet-20 tiin 250-ml pyörityspullon siirrostukseen. Samanlainen vaihe toistettiin 1-1 ja 3-1 pullossa, ja 10 - 20-I bioreaktorissa. Soluja 10 - 20-I reaktorista käytettiin siirrosteena 50 -100-1 reaktoria varten. Tätä reaktoria kasvatettiin aluksi panostyyppisesti, ja riittävän solukonsentraation saavuttamisen jälkeen aloitettiin jatkuvatoiminen väli-aineperfuusio.

25

Kasvatukseen ja jatkuvatoimiseen perfuusioon käytettu väliaine oli modifioitua Iscove'n väliainetta, joka oli täydennetty jopa 10 %:lla (esimerkiksi NU Serum™ V). Koko tuotantoprosessin aikana ei käytetty metotreksaattia.

30 Fermentointivaiheet suoritettiin steriileissä olosuhteissa ja suljetussa järjestelmässä. Avainfermentointiparametrejä, kuten lämpötilaa, pH-arvoa, sekoitusta ja ilmastusta tarkkailtiin ja kontrolloitiin tarkoituksenmukaisuuden mukaan koko kasvatus- ja jatkuvan perfuusiovaiheen ajan. Aikaajoin otettiin aseptisia näytteitä pH-arvon, solutihey- 24 102039 den mittaamiseksi, ja steriilisyyden tarkistamiseksi (bakteerien ja sienten puuttuminen).

Kun oli kerätty riittävä tilavuus konditioitua väliainetta (perfusaattia), kasvatusliemi 5 suodatettiin kaikkien läsnä olevien solujen poistamiseksi, ja konsentroitiin ultrasuoda-tuksella. Raakaa CHO-IL-4:ää sisältävällä konsentraatilla edettiin lopullisiin puhdis-tusvaiheisiin.

IL-4:n puhdistus raa'asta CHO-IL-4-konsentraatista suoritettiin suorittamalla kationin-10 vaihtokromatografia sulfonaattikolonnilla (esimerkiksi S-Sepharose). Tämä vaihe toistettiin tyypillisesti. Sitten valitut yhdistetyt jakeet sulfonaattikolonnista vietiin edelleen kelaattikromatografiavaiheeseen (esimerkiksi koboltti-kelaatti-Sepharose).

Sitten valitut yhdisteyt kelaattijakeet kalvosuodatettiin ja konsentroitiin membraa-nisuodatuksella. Konsentrointi kromatografoitiin geelisuodatuskolonnissa (esimerkiksi 15 HR S-200). Yhdistetyt jakeet, jotka muodostavat puhdistetun irto-IL-4:n, suodatettiin sitten ja varastoitiin -20°C:ssa tai alle.

Menetelmä aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:n tällaisen raaka-CHO-IL-kon-sentraatin puhdistamiseksi käsittää: 20 (a) CHO-solukasvatusväliaineesta olevan aktiivisen IL-4:n puskuroidun raakaliuoksen alistamisen kationinvaihtokromatografialle lähes neutraalissa/lievästi alkalisessa pH-arvossa IL-4:n sitomiseksi selektiivisesti, ja IL-4:n eluoinnin isokraattisesti; 25 (b) eluaatin vaiheesta (a) alistamisen edelleen kationinvaihtokromatografialle suh teellisen pienessä kolonnissa (15 % vaiheen (a) pakkaustilavuudesta) tähes neutraalissa/lievästi alkalisessa pH-arvossa, ja IL-4:n gradienttieluoimisen; (c) eluaatin vaiheesta (b) alistamisen affiniteettikromatografialle kelatoivalla agaroo-30 sigeelikolonnijärjestelmällä lähes neutraalissa/lievästi alkalisessa pH-arvossa, sitten IL-4:n eluoimisen happamalla puskurilla; (d) eluaatin vaiheesta (c) konsentroimisen ultrasuodatusmembraanilla (molekyylipai-norajoitus 10000); ja ,κ 102039 ZÖ (e) aktiivisen IL-4:n konsentroidun liuoksen vaiheesta (d) alistamisen geelisuodatus-kromatografialle "size exclusion'-kolonnilla happamassa pH-arvossa, ja puhdistetun IL-4-liuoksen keräämisen.

5 Kationinvaihtokromatografia suoritetaan 2 vaiheessa sen jälkeen kun CHO-solukas-vatusväliaine on suodatettu ulkoisten suurten solujäänteiden poistamiseksi, konsentroidaan sitten jopa tasolle 100 ml/ml proteiinia siasuodatusmembraanilla, ja pH säädetään pH-arvoon 7,1 - 7,3, edullisesti 7,2. Membraani on edullisesti pyöritetty solu, johon on sovitettu membraani, joka pidättää kaiken materiaalin, joka on kooltaan yli 10 10000 MW, esimerkiksi YM-10-membraani, Amicon Co., USA, tai Pellicon-suodatin PTGC Cassettes, Millipore Corp., Bradford, Mass. Ensimmäisessä vaiheessa raaka kasvatusväliaine lisätään kationinvaihtokromatografiakolonnille, kuten S-Sepharose® Fast Flow Gopa 100 mg proteiinia/ml hartsia), joka on aikaisemmin tasapainotettu fosfaattipuskurilla, jonka pH on lähes neutraali/lievästi alkalinen, ts., pH 6,7 - 7,8, 15 edullisesti 7,2, sisältäen 0,12 M natriumkloridia. Tämä antaa tulokseksi aktiivisen IL-4:n jäämisen kolonniin ja suurimman osan ei-toivotuista proteiineista ja muista epäpuhtauksista huuhtoutuessa läpi. Sitten aktiivinen IL-4 eluoidaan kolonnista isokraat-tisesti natriumfosfaattipuskurilla, edullisesti pH-arvon 7,1 - 7,3, erityisemmin pH 7,2, 20 mM natriumfosfaattia ja noin 0,26 M natriumkloridia. Jakeet, jotka sisältävät aktii-20 visen IL-4:n SDS-PAGE:lla ja proteiinimäärityksillä määritettynä, yhdistetään, ja pooli säädetään pH-arvoon 7,2 ja 14 mS.

Toisessa vaiheessa säädetty pooli ensimmäisestä vaiheesta lisätään suhteellisen pieneen kationinvaihtokromatografiakolonniin, noin 15 % vaiheessa 1 käytetyn kat-25 ioninvaihtokolonnin pakkaustilavuudesta, joka on tasapainotettu fosfaattipuskurilla, epäpuhtaudet huuhtoutuvat läpi, ja aktiivinen IL-4 jää kolonniin. Aktiivinen IL-4 eluoidaan natriumkloridigradientilla 1,75 mS/pakkaustilavuus. Eluointipuskurit koostuvat vähäsuolaisesta puskurista, ts., 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, 0,12 M natriumkloridia, ja suolarikkaasta puskurista, ts., 20 mM natriumfosfaattia, pH 0,50 M natrium-30 kloridia. Gradienttijakeet, jotka sisältävät aktiivisen IL-4:n SDS-PAGE:lla ja proteiini-määrityksillä määritettynä yhdistetään ja säädetään pH-arvoon 7,2 ja 45 - 50 mS.

Aktiivisen IL:n fraktioiden pooli kationinvaihtokromatografiasta, joka on noin 60 - 70-% puhdasta, alistetaan sitten affiniteettikromatografialle metallia kelatoivalla ,c 102039 26 agaroosigeelikromatografialla, joka on valmistettu metallikäsitellyllä chelating-Sepharose®-geelillä, ts., chelating-Sepharose® Fast Flow tai chelating-Sepharose® 6B. Kelatoivat kolonnit käsittävät 2 osaa yhdessä ainoassa kolonnissa. Kolonnin huippuosa sisältää metallilla käsiteltyä kelatoivaa agaroosigeeliä, edullisesti koboltilla 5 käsiteltyä chelating-Sepharose® Fast Flow-geeliä, ja kolonnin pohjaosa on käsittelemätöntä chelating-Sepharose® Fast Flow-geeliä. Näiden 2 kerroksen tilavuussuhde on noin 2,3 - 3,0 tilavuutta koboltilla käsiteltyä chelating-Sepharose®:ää yhteen tilavuuteen käsittelemätöntä chelatin Sepharose®:ää. Kun puhdisteun IL-4:n pooli kationinvaihtokäsittelystä lisätään kolonnin huipulle, läpi virtaava liuos kulkee kolon-10 nin pohjaosaan, josta kaiken jäännösepäpuhtauden sisältävä läpivirtaus poistuu.

Käyttämällä puskuria lähes neutraalissa pH-arvossa 7,2 ja edullisesti noin 0,5 M natriumkloridia aktiiviset IL-4-molekyylit sitoutuvat affiniteettikromatografialla selektiivisesti metallia kelatoivaan agaroosigeelikolonniin, edullisesti chelating 15 Sepharose® Fast Flow tai Sepharose® 6B, liuoksessa läsnä olevien kontaminoivien proteiinien oleelliseen poistamiseen. Aktiivinen IL-4 pysyy kolonneissa ja eluoidaan isokraattisesti puskurilla, jonka pH-arvo on hieman hapan, edullisesti pH-arvossa 6,0, sisältäen 0,5 M NaCI:ää.

20 Aktiivisen IL-4:n puhdistettu liuos affiniteettikromatografiakolonnista konsentroidaan ultrasuodatusmembraanilla (molekyylipainorajoitus 10000), edullisesti liikkuvalla solulla, johon on sovitettu membraani, joka pidättää kaiken materiaalin, jonka mole-kyylipaino on yli 10000, johon alueeseen IL-4 kuuluu. Edullinen membraani on YM-10, jota valmistaa yhtiö Amicon Co., USA. Saatu konsentraatio on jopa 20 mg/ml.

25 Käytetään kahta kalvosuodatuspuskuria, ensimmäistä 20 mM Na-fosfaattipuskuria pH-arvossa 6,0, 0,5 M natriumkloridia, ja toista puskuria, joka on edullisesti 10 mM natriumsitraattia pH-arvossa 4,5.

Aktiivisen IL-4:n konsentroidut eluaatit lisätään "size exclusion'-geelisuodatuskolon-30 niin, joka fraktioi liuoksessa olevat proteiinit molekyylipainon mukaan. Tyypillinen kolonni, joka on sopiva, on Sephacryl® S-200 HR tai S-100 HR (Pharmacia)-geeli-suodatuskolonni. Sephacryl® S-200 HR (suuri erotuskyky) ja S-100 HR ovat ristiliitet-tyjä kopolymeerejä allyylidekstraanista ja Ν,Ν'-metyleenibisakryyliamidista. Niiden fraktiointialue yksikössä Dalton on 5000 - 250000 ja 1000 - 100000, vastaavasti.

27 102039

Muita sopivia materiaaleja ovat Sephadex®'it (Pharmacia), jotka ovat ristiliitettyjä dekstraanigeelejä. Edullisesti aktiivisen IL-4:n liuos lisätään S-200 HR-kolonniin, joka on aikaisemmin tasapainotettu 10 mM sitraattipuskurilla pH-arvossa 4,5.

5 Edullisempi suoritusmuoto käsittää: (a) aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:n CHO-solukasvatusväliaineesta alistamisen kationinvaihtokromatografialle ristiliitetyllä agaroosikolonnilla (edullisesti S-Sepharose® Fast Flow) 20 mM fosfaattipuskurissa, pH 6,7 - 8, edullisesti pH 7,2, 10 0,12 M natriumkloridin kanssa tasolla 13-15 mS, edullisesti 14 mS, sitten aktiivisen IL-4:n eluoimisen kolonnista isokraattisesti 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,1 - 7,3, edullisesti pH 7,2, 0,26 M natriumkloridin kanssa, ja aktiivisen IL-4:n fraktioiden keräämisen; 15 (b) IL-4-liuoksen vaiheesta (a) alistamisen edelleen kationinvaihtokromatografialle samantyyppisellä ristiliitetyllä agaroosikolonnilla jota käytettiin vaiheessa (a), mutta jonka pakkaustilavuus on noin 15 % vaiheessa (a) käytetyn kolonnin pakkaustilavuu-desta, puskurissa pH-arvossa 7,2 - 7,5, edullisesti pH 7,2, sisältäen 0,12 M natrium-kloridia, sitten gradienttieluoimisen 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,2, sisältä-20 en 0,12 - 0,50 M natriumkloridia, ja aktiivista IL-4:ää sisältävien jakeiden yhdistämisen; (c) aktiivisen IL-4:n yhdistettyjen jakeiden vaiheesta (b) pH-arvossa alistamisen affiniteetti kromatografiaIle metallia kelatoivalla agaroosigeelikolonnilla, joka koostuu edul- 25 lisesti kobolttia kelatoivan chelating Sepharose® Fast Flow- tai 6B-geelin huippuosasta ja käsittelemättömän chelating Sepharose® Fast Flow-geelin alaosasta 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,2 sisältäen 0,5 M natriumkloridia, näiden 2 osan tilavuussuhde on noin 2,3 - 3,0 tilavuutta koboltilla käsiteltyä chelating Sepharose®:ää yhteen tilavuuteen käsittelemätöntä chelating Sepharose®:ää, pesemisen tasapaino-30 tuspuskurilla, sitten aktiivisen IL-4:n eluoimisen fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,0 sisältäen 0,5 M natriumkloridia, ja IL-4-jakeiden keräämisen; ja (d) IL-4-jakeiden vaiheesta (c) (yhdistettyjen) konsentroimisen ja kalvosuodattami-sen tasolle jopa 20 mg/ml pH-arvossa 4,5 ultrasuodatusmembraanilla, joka pidättää 28 102039 kaiken materiaalin, jonka molekyylipaino on yli 10000, edullisesti liikkuvalla solulla, johon on sovitettu membraani, kuten YM-10, sitten aktiivisen IL-4-konsentraatin alistamisen "size exclusion"- (geelisuodatus) kromatografialle kolonnilla, joka fraktioi liuoksessa olevat proteiinit molekyylipainon mukaan ristiliitetyllä kopolymeerillä allyyli-5 dekstraanista ja N.N-metyleenibisakryyliamidista, edullisesti Sephacryl® S-200:lla 10 mM natriumsitraattipuskurissa pH-arvossa 4,5, ja aktiivisten IL-4-jakeiden keräämisen.

Vaiheessa (a) ja vaiheessa (b) jakeiden pH säädetään pH-arvoon 7,2 ja sänhönjoh-10 tokyky 13-15 mS 4M NaCUIä. Näiden 2 kationinvaihtokolonnin pakkaustilavuussuh-de on noin 6,3 tilavuutta S-Sepharose®-kolonnia vaiheessa (a) ja yksi tilavuus katio-ninvaihtokolonnia vaiheessa (b). Kationinvaihtogeelimateriaali kromatografiakolonnis-sa tasapainotetaan 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,2, jossa on 0,12 M nat-riumkloridia. Edullinen kationinvaihdin on ristiliitettyä agaroosia, joka on substituoitu -15 CH2-S03' Na+-ryhmillä, kuten S-Sepharose® Fast Flow, jota on saatavissa yhtiöstä

Pharmacia. Aktiivinen IL-4 eluoidaan isokraattisesti vaiheessa (a) 20 mM fosfaatti-puskurilla pH-arvossa 0,26 M NaCI. Yhdistetään jakeet, joissa on suurimmat konsen-traatiot IL-4:ää SDS-PAGE:n ja proteiinimääritysten perusteella. Yhdistettyjen jakeiden liuos säädetään pH-arvoon 7,2, ja johtokyky säädetään tasolle 13-15 mS/pak-20 kaustilavuus 20 mM natriumfosfaattipuskurilla pH 7,2. Sitten kolonniin päälle lisätään IL-4-liuos, ja gradienttieluoidaan käyttämällä gradienttia 1,75 mS 20 mM natriumfos-faattipuskureilla pH 7,2, sisältäen 0,12 - 0,50 M NaCI. Yhdistetään kerätyt jakeet, jotka sisältävät IL-4:ää SDS-PAGE:lla ja proteiinimäärityksillä määritettynä. Kationin-vaihtokromatografian olosuhteen valitaan varmistamaan, että aktiivisen IL-4:n jae 25 kiinnittyy kationinvaihtomatriisiin. Lähes neutraali pH-arvo 7,2 , joka on suhteellisen korkea kationinvaihtokromatografialle, ja johtokyky 13-15 mS, joka on suhteellisen korkea kationinvaihtokromatografialle, antaa tulokseksi lievät sitoutumisolosuhteet, joissa useimmat epäpuhtaudet eivät sitoudu kolonniin, eluointi on suhteellisen helppoa, ja saadaan hyvin puhdasta aktiivisen IL-4:n liuosta, ts., noin 60 - 70-%.

30

Edullinen vaiheessa (c) käytetty metallia kelatoiva agaroosi on chelating Sepharose® Fast Flow, vaikka chelating Sepharose® 6B on myös tyydyttävä. Sepharose't ovat tuotteita yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey. Edullinen menetelmä edullisen kobolttia kelatoivan Sepharose®-kolonnin valmistamiseksi 29 102039 keksinnön mukaisesti käytettäväksi on suspendoimalla Sepharose®-geeli 0,02 M kobolttiasetaattiliuokseen ja pestä deionisoidulla vedellä, sitten tasapainotuspuskuril-la, ts., 20 mM natriumfosfaatilla, pH 7,2, 0,5 M NaCI kolonnin läpi. Kobolttiasetaatin sijasta voidaan käyttää muita kobolttisuoloja, esimerkiksi kobolttikloridia tai koboltti-5 sulfaattia.

Kromatografiakolonni käsittää yhden kolonnin, joka sisältää 2 kerrosta, ensimmäinen huippukerros sisältää metallia kelatoivaa chelating-Sepharose®-geeliä, ja toinen eli pohjakerros sisältää chelating Sepharose®-geeliä, jota ei ole käsitelty metallisuolalla. 10 Tilavuussuhde kaksoiskolonneissa on noin 2,3 - 3,0 tilavuutta metallia kelatoivaa Sepharose®:ää yhteen tilavuuteen käsittelemätöntä kelatoivaa Sepharosea®. Edullinen metalli on koboltti.

Kolonnien tasapainotukseen käytetty edullinen puskuri on 0,02 M fosfaattipuskuri 15 pH-arvossa 7,2 - 7,5, sisältäen 0,5 M natriumkloridia.

Vaiheessa (c) kobolttia kelatoiva chelating-Sepharose® ja käsittelemätön chelating Sepharose®-geelit tasapainotetaan fosfaattipuskurissa pH-arvossa 7,2, sisältäen 0,5 M natriumkloridia, sitten adsorboitu aktiivinen IL-4 eluoidaan isokraattisesti ko-20 bolttia kelatoivasta Sepharose®:stä käsittelemättömän kelatoivan Sepharose®:n läpi 0,02 M fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,0, jossa on 0,5 M natriumkloridia, tai vaihtoehtoisesti neutraalin pH-arvon omaavalla puskurilla, joka sisältää 0,5 M NaCI:ää ja (i) kelatoivaa ainetta, kuten 50 mM EDTA:ta (etyleenidiamiinitetraetikkahappo), tai (ii) histidiinianalogia, kuten 50 mM imidatsolia, tai (iii) aminohappoa, kuten 50 mM histi-25 diiniä. Edullinen on fosfaattipuskuri pH-arvossa 6,0, jossa on 0,5 M NaCI:ää. Aktiivisen IL-4:n sisältävä eluaatti kerätään. Tavanomaisten SDS-PAGE-ja proteiinimääri-tysten mukaan korkeimmat aktiivisen IL-4:n konsentraatiot sisältävät yhdistetään.

Vaiheessa (d) yhdistetyt eluoidut jakeet vaiheesta (c) konsentroidaan ja kalvosuoda-30 tetaan, alistetaan sitten geelisuodatuskromatografialle. Eluoidut jakeet konsentroidaan liikkuvalla solulla, joka on varustettu membraanilla, joka pidättää kaiken materiaalin, jonka molekyylipaino on yli 10000, ja kalvosuodatetaan ensin 0,02 M natrium-fosfaattipuskuria vastaan, pH 6,0, joka sisältää 0,05 M EDTA:ta (etyleenidiamiini-tetraetikkahappo) ja 0,5 M NaCl.ää, sitten 0,01 M natriumsitraatilla pH-arvossa 4,5.

30 102039

Koska aktiivinen IL-4:n liuos on prosessin tässä vaiheessa noin 90 - 95-% puhdasta, tämä on konsentroidussa liuoksessa, joka pysyy membraanin päällä. Edullinen mem-braani on Y-10, jota valmistaa yhtiö Amicon Co., USA. Saavutettu konsentraatio on noin 20 mg/ml aktiivista IL-4:ää. Aktiivisen IL-4:n konsentroidut eluaatit lisätään "size 5 exclusion" (geelisuodatus)-kolonniin, joka fraktioi liuoksessa olevia proteiineja mooli-painonsa mukaan. Tyypillinen kolonni, joka on sopiva, on Sephacryl® S-200- tai S-100 HR (Pharmacia) geelisuodatuskolonni. Sephacryl® S-200HR (suuri erotuskyky) ja S-100 HR ovat ristiliitettyjä kopolymeerejä allyylidekstraanista ja Ν,Ν'-metyleeni-bisakryyliamidista. Niiden fraktiointialueet ovat 5000 - 250000 ja 1000 -100000, 10 vastaavasti. Muita sopivia materiaaleja ovat Sephadex®:t (Pharmacia), jotka ovat ristiliitettyjä dekstraanigeelejä. Edullisesti aktiivisen IL-4:n liuos lisätään S-200 HR-kolonniin, joka on aikaisemmin tasapainotettu 10 mM natriumsitraattipuskurilla pH-arvossa 4,5. Vaiheen (d) olosuhteissa stabiili IL-4-konsentraatti voi saavuttaa jopa 20 mg/ml. Tämä lisää geelisuodatuskromatografian kapasiteettia ja suorituskykyä.

15 Eluaatin jakeet, jotka sisältävät aktiivisen IL-4:n suurimmat konsentraatiot SDS- PAGE- ja proteiinimäärityksellä määritettynä, kerätään ja yhdistetään, jolloin saadaan aktiivisen !L-4:n 95 - 99-% puhdasta liuosta.

Edellä olevat viitteet liitetään täten tähän viitteeksi koskien niiden asiaankuuluvia 20 esityksiä materiaaleista ja menetelmistä, joita käytetään CHO-ekspressiojärjestelmän muodostamiseen hlL-4:ää varten.

! E. colista peräisin olevan humaani-IL-4:n muodostaminen ja karakterisointi 25 A. Humaani-IL-4-ekspressioplasmidin pRGT857-11 muodostaminen

Humaani-IL-4-ekspressioplasmidien PAH3, pKGT269-2 ja pUC19 muodostaminen on kuvattu aikaisemmin. Lundell et ai., J. Ind. Microbiology, 1989; ja Yanisch-Perron et ai., Fene 33 (1985) 103-119. pRGT857-11:n muodostamiseksi pAH3 sulatettiin 30 restriktioendonukleaasilla Aval. Tämän entsyymin muodostama 1-säikeinen 5'-uloke täytettiin E. coli Pol l:n Klenow-fragmentilla, ja DNA sulatettiin PvuLllä. 5,8 kiloemäksen (ke) fragmentti, joka sisälsi IL-4:n ja lacl-alueet, liitettiin pUC19:n 1,4 ke Pvull/-Pvul-fragmentti, joka sisälsi pUC:n replikaation aloituskohdan. E. coli 294:n transfor- 31 102039 moinnin jälkeen yksi ampisilliiniresistenteistä IL-4-ekspressioplasmideista, joka sisälsi pUC:n replikaation aloituskohdan, oli pRGT839-2, kuten kuvassa 2 esitetään.

Sitten pRGT839-2 ja pKGT269-2 sulatettiin molemmat Aatll:Ha ja Pvukllä. 6,7 ke 5 fragmentti pRGT839-2:sta, joka sisälsi IL-4:n, ja laci-alueet, liitettiin pieneen 1 ke fragmenttiin pKGT269-2:sta, joka koodittaa kloramfenikoliresistenssiä. Liittämisreak-tiota käytettiin transformoimaan E. coli 294:ää. Yksi tulokseksi saaduista transfor-manteista oli pRGT857-11. Kuten kuvassa 2 esitetään, tämä IL-4-ekspressioplasmidi sisältää kloramfenikoliresistenssin samoin kuin pUC.n replikaation aloituskohdan.

10 Seuraavaksi tätä plasmidia käytettiin E. coli RL7321:n transformoimiseen.

B. Isäntäbakteeri

Isäntäorganismi, joka sisältää plasmidin pRGT857-11, jota käytetään humaani-IL-4:n 15 tuotantoon, on E. coli K-12. Kanta on E. coli RL7321, E. coli MM294:n johdannainen, joka on kuvattu aikaisemmin teoksessa: Bolivar et ai.; Methods of Enzymology, voi. 68, 245-267, (toimittaja Ray Wu), Academic Press, 1979. Tämä kanta on yhdenmukainen EK1-isännälle vahvistettujen suuntaviivojen kanssa. E. coli RL7321 eristettiin E. coli MM294:stä seuraavalla tavalla: 20 E. coli MM294:n streptomysiiniresistentti muoto, jota merkitään E. coli 294S, eristettiin ensin transdusoimalla ensin mainittu kanta bakteriofagilla P1 cmi,clr100 [Miller, J.

H., 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.], jota on kasvatettu E. coli PAM163:ssa [Johnson, B.F. 1977.

25 Fine structure mapping and properties of mutations suppressing the ion mutation in Escherichia coli K-12 and B strains. Genet. Res., 30:273-86].

E. coli 294S mutagenisoitiin ultraviolettivalolla kannan eristämiseksi, jolta puuttuu ulkomembraanirakenne. Soluja säteilytettiin 40 s ajan UV-lampulla. Käsittely aiheutti 30 99,9-% solukuoleman, määritettynä siirrostamalla levyille rikkaalle väliaineelle. Muta- genisoitu solususpensio laimennettiin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 3 tunnin ajan pimeässä ravistaen.

32 102039 Tässä vaiheessa lisättiin T7-villityyppibakteriofagia 108 täplää muodostavaan yksik-köön/ml. Bakteriofagia T7 käytetään valintana rikastamaan bakteereilla, joiden ulko-membraaneilla on mutaatioita. Koska T7-reseptori sijaitsee lipopolysakkaridilla, ulkomembraaniproteiinilla, jotkin ulkomembraanimutaatiot antavat tulokseksi resis-5 tenssin T7-infektiota vastaan. Solut, joilla on villityypin ulkomembraanit, ovat herkkiä infektiolle ja kuolevat siten. Alla kuvattu vuotava fenotyyppi johtuu ulkomembraanin lisääntyneestä läpäisevyydestä. Bakteriofagin T7-resistenssin käyttö ulkomembraa-nivaurion merkkinä on esitetty aikaisemmin [Branes et ai., J. of Bacteriology 154 (1983) 1462-1466].

10 T7-infektion jälkeen pulloa ravistetaan 37 °C:ssa kunnes havaitaan solujen liukenemista (noin 30 min). T7-resistenssit solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan tuoretta lientä. Nämä solut levitettiin TYE (tryptoni:hiivauute:nat-riumkloridi @ 20:10:5)-agarlevyille ja inkuboitiin 37 °C:ssa yön yli. 24 tunnin kuluttua 15 kukin levy sisälsi 30 - 50 koloniaa. Nämä koloniat olivat ulkomembraanivauriota varten. Eräs menetelmä oli huomioida mikä hyvänsä RNaasi l:n vuotaminen väliaineeseen. Yksittäisiä T7-bakteriofagiresistenttejä klooneja siveltiin poikki tuoreiden TYE-agarlevyjen, jotka oli päällystetty 4 ml:lla TYE-agaria, joka sisälsi 1 % hiiva-RNA:ta (Sigma Corp.) pH-7:ssä. 37 °C:ssa yön yli inkuboimisen jälkeen levyt kastel-20 tiin 1N HC1 :llä. Ympäröivän kehän kokoa käytettiin määrittämään kantoja, joista vuoti RNAasiaktiivisuutta väliaineeseen [Weigand, R.A. ja Rothfield, J. of Bacteriology 125 (1976) 340-345]. Ulkomembraanivaurion toinen merkki E. colissa on kasvun puuttuminen MacConcey-agarilla [Hancock, R.E.W, Ann Rev. Microbiol. 38 (1984) 237-64], Eräs 30 T7-resistentistä kannasta, joka osoittautui erityisen herkäksi McConcey-25 agarille ja kykeneväksi vapauttamaan oleellisia periplasmisen RNaasi l-määriä, merkittiin RL7.

·. E. coli RL7 transformoitiin hulL4-ekspressiovektorilla pAH3 (kuva 1). Tämä vektori ohjaa lymfokiiniä sisämembraanin läpi periplasmaan. Käytetystä väliaineesta trans-30 formanteista selontatutkittiin vuotaminen "Western blot"-analyysillä käyttämällä alla kuvattua polyklonaalista hulL-4-vasta-ainetta. RL7/pAH3 mutagenisoitiin kuten edellä UV-valolla. Kun oli kasvatettu pimeässä ainakin 2 tunnin ajan, säteilytetyt solut siveltiin TYE-agarlevyille, jotka oli täydennetty ampisilliinilla (100 pg/ml) ja inkuboitiin yön yli 30 °C:ssa. Koloniat seulontatutkittiin "kaksoislevy"-määrityksellä hulL4:n lisään- 33 102039 tynyttä vapautumista varten intensiivisemmän värin kehittymisellä mutanttikolonioi-den alla. Kaksoislevymääritys suoritettiin seuraavasti:

Mutagenisoidut solut laimennettiin ja siveltiin (0,1 ml/levy) TYE-agarlevyille (halkaisija 5 142 mm) sisältäen 100 pg/ml ampisilliinia. Yön yli 30°C:ssa inkuboimisen jälkeen levyt sisälsivät 500 - 2000 koloniaa, joiden halkaisijat olivat noin 1 mm. Sitten levyt peitettiin 137-mm nitroselluloosakiekolla (Schleicher and Schuell), jonka huokoskoko oli 0,46 pm. Kiekko lisättiin varovasti yhdestä reunasta vaiheittaisen ja tasaisen kos-tumisen sallimiseksi Kiekko kuorittiin välittömästi takaisin yhdellä liikkeellä niin, että 10 koloniat nousivat agarlevystä nitriselluloosakiekkoon. Tämä kiekko oli nitroselluloosa-kiekko (tai kiekkoja), joka oli etukäteen sijoitettu steriilin agarlevyn pinnalle. Sitten levyjä inkuboitiin yön yli 30°C:ssa. Inkuboinnin jälkeen pohjakiekko (tai -kiekot) erotettiin kolonian kantavasta kiekosta. Suodattimia inkuboitiin 10 mM Trikissä pH 8, 150 mM NaCI ja 0,05 % (tilavuus/tilavuus) Tween-20 (Bio Rad, entsyymi-immuno-15 määrityspuhtaus (TBST), joka sisälsi 1 % BSA:ta (naudanseerumialbumiini) huoneenlämpötilassa 60 min ajan. Sitten suodattimia inkuboitiin joko kanin polyklonaali-sen antiseerumin kanssa (laimennos 1:1500 TBST/BSA:ssa; käytetään kokonais-hulL-4:n määritykseen) tai monoklonaalisen antiseerumin (11B4) kanssa (hybridoo-maviljelmäsupernatantin 1:10-laimennos TBST/BSA:ssa; käytetään natiivissa konfor-20 maatiossa olevan proteiinin määritykseen) huoneenlämpötilassa 30 min ajan. Suodattimet pestiin kolmesti TBST:ssä, sitten inkuboitiin sopivan alkalinen fosfataasi-liiteyn sekundäärisen vasta-aineen kanssa 30 min ajan. Suodattimet pestiin kolmesti ja värjättiin alkalinen fosfataasi-substraatilla (ProtoBlot System yhtiöstä Progmega Biotec.). Sitten täplät asetettiin vierekkäin standardilevyjen kanssa, ja valittiin koloni-25 at, joilla nähtiin lisääntynyt hulL4-spesifinen värjäytyminen.

Mahdollisena pidetyt koloniat parannettiin plasmidista siirtämällä jatkuvasti ei-selektii-viselle väliaineelle, minkä jälkeen siveltiin ei-selektiivisille TYE-levyille. Koloniat, jotka arvosteltiin negatiivisiksi kasvulle ampisilliinilevyillä, tarkastettiin plasmidin puuttumi-30 sen suhteen, ja transformoitiin sitten uudelleen humaani-IL-4-ekspressioplasmidilla pRGT857-11. Nämä kloonit seulottiin lisääntyneen hulL-4:n vapautumisen suhteen "dot immuno-blot"-menetelmällä koko kasvatusliuoksista, jotka saatiin 10-ml putki-fermentoinneista. Havaitseminen oli humaani-IL-4:n vastaisella monoklonaalisella 34 102039 vasta-aineella (11B4), minkä jälkeen alkalinen fosfataasi-konjugoidulla vuohi-anti-rotta-lgG:llä. Yhtä kantaa, joka valittiin paljon tuottavana kantana, merkittiin RL731.

E. coli RL731/pRGT857-11 mutatoitiin UV-valolla kuten edellä. Tarpeellisen pimeäs-5 sä kasvun jälkeen solut siirrostettiin TYE-agarille, joka oli täydennetty antibiootilla ja 1 mM IPTG:llä (isopropyyli-B-D-tiogalaktosidi). RL731/pRGT857-11 ei kasva indusoivan aineen IPTG:n läsnä ollessa. Soluja siirrostettiin levyille tiheydessä 104 koloniaa muodostavaa yksikköä/ml. Noin 5-10 koloniaa levyä kohden kehittyi yön yli inkuboinnin jälkeen. Yli 75 koloniaa puhdistettiin sivelemällä ja tarkistettiin hulL-4-10 tuotannon suhteen. Tuotantotaso määritettiin "Western blot"-analyysillä. Kloonit, joilla havaittiin voimakkaimmat vyöhykkeet, parannettiin plasmideistaan kuten edellä, transformoitiin uudelleen plasmidilla pRGT857-11, ja tarkastettiin hulL-4:n suuren tuotannon säilyminen. Kanta, joka poimittiin tyydyttävimpien ominaispiirteiden vuoksi, mukaan lukien biologisesti aktiivisen hulL-4:n tuotantoja vuotaminen, ja solujen 15 jatkuva kasvu hulL-4-ekspression indusoinnin jälkeen, oli RL7321.

Humiaani-interleukiini-4:n (rhIL-) fermentoinnin aikana tuote erittyy suoraan fermen-tointiliemeen. Alkumyötävirtavaiheet suoritetaan liemen erottamiseksi soluista ja sitten liemessä olevan rhlL-4:n konsentroimiseksi. Tämän tehtävän suorittamiseksi 20 on olemassa 2 selväpiirteistä menetelmää: membraanimenetelmä ja natriumtrikloori-etikkahappo (TCA)-menetelmä. Natrium-TCA-menetelmässä solut inaktivoidaan TCA-suolaa lisäämällä. Solujen poistamisen jälkeen liemen pH-arvo säädetään alhaiseen arvoon rhlL-4:n saostamiseksi, ja liemi sentrifugoidaan rhlL-4:n poistamiseksi pelletin tai lietteen muodossa. Membraanimenetelmässä käytetään sekä mik-25 rosuodatusta että ultrasuodatusta rhlL-4:n talteensaamiseksi nestemäisen konsentraatin muodossa. Tässä menetelmässä voidaan käyttää useita pesuja puskurilla lisäämään myötävirtatalteensaantia.

« rhlL-4:n puhdistus fermentointiliemen raakakonsentraatista suoritetaan suorittamalla 30 immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia melattlikelaattikolonnilla (esimerkiksi Zn-Sepharosella). Valitut jakeet yhdistetään, konsentroidaan ja kalvosuodatetaan ultra-suodatuslaitteella, joka sisältää sopivan nimellismolekyylipainon membraanin niin, että tuote pysyy konsentraatissa (esimerkiksi Millipore PTGC-ultrasuodatusmem-braaneilla). Kalvosuodatettu konsentraatti puhdistetaan edelleen kromatografialla 35 102039 geelisuodatuskolonnilla (esimerkiksi 2-200 HR:llä). Yhdistetyt jakeet, jotka muodostavat puhdistetun irto-rhlL-4:n, suodatetaan sitten ja säilytetään -20 °C:ssa tai alle.

Siten menetelmä aktiivin yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:n raakaliuoksen puhdistami-5 seksi E. colista käsittää: (a) mainitun IL-:n puskuroidun raakaliuoksen neutraalissa/lievästi aikalisessa pH-arvossa ja sisältäen noin 0,5 -1,5 M natriumkloridia, alistamisen affiniteettikromato-grafialle metallia kelatoivalla agaroosigeelillä IL-4:n sitomiseksi selektiivisesti; 10 (b) kolonnin pesemisen ensin 20 mM natriumfosfaattitasapainotuspuskurilla pH-arvossa 7,2 sisältäen 1,0 M natriumkloridia, sitten puskurilla, joka sisältää 10 tila-vuus-% glyserolia ja noin 150 mM natriumkloridia; 15 (c) sitoutuneen IL-4:n eluoimisen eluointipuskurilla happamassa pH- tai neutraalissa pH-puskurissa, joka sisältää kelatoivaa ainetta, histidiinianalogia tai aminohappoa; (d) aktiivisen IL-4-eluaatin vaiheesta (c) käsittelemisen kationinvaihtokromatogra-fiakolonnilla, kuten S-Sepharose® (saatavissa yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals) 20 lähes neutraalissa/lievästi happamassa pH-arvossa ja johtokyvyssä 15 mS, S-Sepharose® on ristiliitettyä agaroosimatriisia, johon on liitetty ioninvaihtoryhmä -CH2-S03' Na+; (e) eluaatin vaiheesta (d) konsentroinnin ultrasuodatusmembraanilla (molekyylipaino-25 rajoitus 10000); (f) konsentroidun retentaatin käsittelyn geelisuodatuskromatografialla "size exclusion'-kolonnilla; ja 30 (g) puhdistetun aktiivisen IL-4:n keräämisen.

Edullisin suoritusmuoto käsittää seuraavat vaiheet: 36 102039 (a) aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-IL-4:n raakaliuoksen lisääminen metallia kelatoivan agaroosigeelin, edullisesti kelatoivan Sepharose® Fast Flow'n affiniteetti-kromatografiakolonniin neutraalissa/lievästi alkalisen pH-arvon omaavassa fosfaatti-puskurissa, joka sisältää 1,0 M natriumkloridia; 5 (b) kolonnin pesemisen kahdesti, ensin fosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,2 - 7,5 sisältäen 1,0 M natriumkloridia, sitten fosfaattipuskurilla, joka sisältää 10 tilavuus-% glyserolia ja 150 mM natriumkloridia; 10 (c) aktiivisen IL-4:n eluoimisen kolonnista isokraattisesti asetaattipuskurilla pH-arvos- sa 5,0 sisältäen 0,5 M natriumkloridia; (d) aktiivisen IL-4-eluaatin fosfaattipuskurissa pH-arvossa 6,75, johtokyvyssä 15 mS vaiheesta (c) alistamisen kationinvaihtokromatografialle kolonnilla, kuten 15 S-Sepharose®, joka on tasapainotettu 20 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 6,75 ja 0,12 M natriumkloridilla; ja gradienttieluoinnin fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,75 sisältäen 0,12 - 0,6 N NaCI:ää; (e) eluaatin vaiheesta (d) eluoimisen ultrasuodatusmembraanilla; 20 (f) konsentroidun eluaatin käsittelyn geelisuodatuskromatografialla "size exclusion"-kolonnilla, joka on tasapainotettu 10 mM natriumsitraattipuskurilla pH-arvossa 4,5; ja (g) puhdistetun aktiivisen IL-4-liuoksen keräämisen.

25

Edulliset E. coli-kannat, joita käytetään keksinnön mukaisesti puhdistetun aktiivisen IL-4:n valmistamiseen, ovat RL 2117/pRGT857-11 ja RL7321/pRGT857-11.

Edullinen metallia kelatoiva agaroosi, jota käytetään vaiheessa (a), on chelating 30 Sepharose® Fast Flow, vaikka chelating Sepharose® 6B on myös tyydyttävä.

Sepharose't ovat tuotteita yhtiöstä Pharmacia Fine Chemicals, Piscaway, New Jersey. Edullinen menetelmä edullisen sinkki-chelating Sepharose®-kolonnin valmistamiseksi keksinnön mukaisesti käytettäväksi on Sepharose®-geelin kaataminen kro-matografiakolonniin, peseminen deionisoidulla vedellä, sitten suola-, edullisesti sink- 37 102039 kiasetaattiliuoksen ja deionisoidun veden pumppaaminen, sitten tasapainotuspusku-rin, ts., 20 mM natriumfosfaatin, pH 7,2,1,0 M NaCI-liuoksen pumppaaminen kolonnin läpi. Sinkkiasetaatin sijasta voidaan käyttää muita sinkkisuoloja, esimerkiksi sinkkikloridia tai sinkkisulfaattia.

5

Kromatografiakolonni on 2 sarjaan kytkettyä kolonnia. Ensimmäinen eli huippukolon-ni sisältää sinkki-chelating-Sepharose®-geelin, ja toinen eli pohjakolonni sisältää chelating Sepharose®-geeliä, jota ei ole käsitelty sinkkisuolalla tai muilla metal-lisuoloilla. Tilavuussuhde kaksoiskolonneissa on noin 3 tilavuutta sinkkikäsiteltyä 10 Sepharose®:ää yhteen tilavuuteen käsittelemätöntä chelating Sepharose®:ää.

Edullinen puskuri, jota käytetään kolonnien tasapainottamiseen, on fosfaattipuskuri pH-arvossa 7,2 - 7,5 sisältäen 1,0 M natriumkloridia.

15 Vaiheessa (b) kolonniin lisätään erityinen 2-osainen pesu, ensin tasapainotuspusku-rina fosfaattipuskuri pH-arvossa 7,2 sisältäen 1,0 M natriumkloridia, sitten fosfaatti-puskurilla pH-arvossa 7,2 - 7,5 sisältäen 10 % glyserolia ja alhaisen konsentraation natriumkloridia (150 mM). Pesut poistavat epäpuhtauksia, mukaan lukien erästä, joka on hyvin lähisukuista ja vaikeasti erotettavaa. Aktiivinen IL-4 jää kolonniin.

20

Edullinen puskuri aktiivisen IL-4:n liuoksen pH-arvon pysyttämiseen on fosfaattipuskuri pH-arvossa 7,2 sisältäen 1,0 M natriumkloridia. Kun puskuroitu raaka aktiivinen IL-4-liuos ajetaan kolonnien läpi, absorboituu IL-4 sekektiivisesti geeleihin.

25 Vaiheessa (c) sinkki-chelating-Sepharose® ja käsittelemätön chelating Sepharose-geelit tasapainotetaan fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,75 sisältäen 1,0 M natriumkloridia, sitten absorboitu aktiivinen IL-4 eluoidaan isokraattisesti sinkki-chelating-Sepharose®:stä käsittelemättömän chelating-Sepharose®:n läpi asetaattipuskurilla pH-arvossa 5,0 sisältäen 0,5 M natriumkloridia, tai vaihtoehtoisesti neutraalilla pH- 30 puskurilla, joka sisältää kelatoivaa ainetta, kuten 50 mM EDTA (etyleenidiamiinitetra-etikkahappo), tai histidiinin analogia, kuten 50 mM imidatsolia, tai aminohappoa, kuten 50 mM histidiiniä. Edullinen on asetaattipuskuri. Aktiivisen IL-4:n sisältävä elu-aatti kerätään. Yhdistetään jakeet, jotka sisältävät suurimmat konsentraatiot aktiivista IL-4:ää tavanomaisten SDS-PAGE-ja proteiinimääritysten mukaan.

38 102039

Vaiheessa (d) vaiheesta (c) olevien yhdistettyjen jakeiden pH-arvot säädetään pH-arvoon 6,75, ja laimennetaan 20 mM puskurilla pH-arvossa 6,75 niin, että johtokyvyksi tulee 15 mS. Kationinvaihtogeelimateriaali kromatografiakolonnissa tasapainotetaan 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,75 sisältäen 0,12 M natriumkloridia.

5 Edullinen kationinvaihtaja on ristiliitettyä agaroosia, joka on substituoitu -CH2-S03 Na+-ryhmillä, kuten S-Sepharose® Fast Flow, jota on saatavissa yhtiöstä Pharmacia. Aktiivinen IL-4 gradienttieluoidaan 20 mM fosfaattipuskurilla pH-arvossa 6,75 sisältäen 0,12 - 0,6 M NaCI. Yhdistetään jakeet, joissa on korkeimmat konsentraatiot aktiivista IL-4:ää SDS-PAGE- ja proteiinimääristysten mukaan. Kationinvaihtokromato-10 grafian olosuhteet valitaan varmistamaan, että aktiivinen IL-4-jae kiinnittyy kationin-vaihtomatriisiin. Lähes neutraali pH-arvo 6,75, joka on suhteellisen korkea kationin-vaihtokromatografiaan, ja johotyky 15 mS, joka on suhteellisen korkea ioninvaihto-kromatofrafiaan, antaa tulokseksi lievät kiinnittymisolosuhteet, joissa useimmat epäpuhtaudet eivät sitoudu kolonniin, eluointi on suhteellisen helppoa, ja saadaan aktiivi-15 sen IL-liuoksen suuri puhtaus, ts., noin 90 - 95-%.

Vaiheessa (e) yhdistetyt eluoidut jakeet vaiheesta (d) konsentroidaan liikkuvalla solulla, johon on sovitettu membraani, joka pidättää kaiken pateriaalin, jonka mole-kyylipaino on yli 10000. Tähän luetaan mukaan aktiivinen IL-4. Koska aktiivinen IL-4-20 liuos prosessin tässä vaiheessa on noin 90 - 95-% puhdasta, hyvin vähän aktiivista IL-4:ää lukuunottamatta on membrtaanin päällä pysyvässä konsentroidussa liuoksessa. Edullinen membraani on YM-10, jota valmistaa yhtiö Amicon Co., USA. Saavutettu konsentraatio on jopa noin 20 mg/ml aktiivista IL-4:ää.

25 Vaiheessa (f) aktiivisen IL-4:n yhdistetyt, konsentroidut eluaatit vaiheesta (e) lisätään "size exclusion'-geelisuodatuskolonniin, joka fraktioi liuoksessa olevia proteiineja molekyylipainon mukaan. Tyypillinen kolonni, joka on sopiva, on Sephacryl® 200 HR- tai S-100 HR- (Pharmacia) geelisuodatuskolonni. Sephacryl®S-200HR (suuri erotuskyky) ja S-100HR ovat ristiliitettyjä kopolymeerejä allyylidekstraanista ja N,N'-30 metyleenibisakryyliamidista. Niiden fraktiointialueet ovat 5000 - 250000 ja 1000 -00000, vastaavasti. Muita sopivia materiaaleja ovat Sephadex®:t (Pharmacia), jotka ovat ristiliitettyjä dekstraanigeelejä. Edullisesti aktiivisen IL-4:n liuos lisätään S-200 HR-kolonniin, joka on aikaisemmin tasapainotettu 10 mM natriumsitraattipuskurilla pH-arvossa 4,5. Vaiheen (g) olosuhteissa stabiili IL-4-konsentraatti voi saavuttaa 39 102039 jopa 20 mg/ml. Tämä lisää geelisuodatuskromatografian kapasiteettia ja suorituskykyä.

Eluaatin jakeet, jotka sisältävät aktiivisen IL-4:n suurimmat konsentraatiot SDS-5 PAGE- ja proteiinimäärityksellä määritettynä, kerätään ja yhdistetään, jolloin saadaan aktiivisen IL-4:n 95 - 99-% puhdasta liuosta.

Tässä prosessissa käytetyt puskurit valitaan, koska ne aikaansaavat oikeat sitoutu-mis-, pesu-ja eluointiolosuhteet sallimaan aktiivisen IL-4:n joko adsorboitua kromato-10 grafiageeleihin tai eluoitua selektiivisesti niiden läpi. Edulliset puskurit ovat natrium-fosfaattipuskurit konsentraatiossa 20 mM, tai natriumsitraatti- tai natriumasetaattipus-kurit esimerkeissä esitetyissä konsentraatioissa ja pH-arvoissa, samoin kuin ilmaistut natriumkloridin erityiset määrät. pH-arvo säädetään natriumhydroksidilla tai hapolla. Vaiheen (b) 2-osaisessa pesussa ensimmäinen pesu tapahtuu 20 mM natriumfos-15 faattitasapainotuspuskurilla pH-arvossa 7,2 sisältäen 1,0 M natriumkloridia, ja toinen pesu tapahtuu fosfaattipuskurilla, joka sisältää noin 150 mM natriumkloridia ja 10 % glyserolia, jota vaaditaan toisessa pesupuskurissa.

Puskureissa sinkki-chelating-Sepharose-kolonnien kanssa käytetty natriumkloridin 20 konsentraatio on keksinnölle kriittinen, koska korkea suolapitoisuus, edullisesti 1M natriumkloridi, parantaa liuotetun aktiivisen IL-4:n talteensaantia trikloorietikkahappo (TCA)-pelletistä, samoin kuin lisää aktiivisen IL-4:n sitoutumista metalli-chelating ; Sepharose'en. Konsentraatio sallii IL-4:n olevan selektiivisemmin adsorboitunutta sinkki-chelating Sepharose-kolonniin kuin fermentointiliemessä olevien epäpuhtauk-25 sien.

Sitten IL-4-irtotuote valmistetaan injektiota varten sulattamalla ja laimentamalla steriloidulla vedellä ja/tai 10 mm sitraattipuskurilla.

30 Esimerkki 1 S-Sepharose® Fast Flow-kolonnin valmistus

Valmistetaan 2 kationinvaihtokolonnia S-Sepharose® Fast Flow-kationinvaihtohartsil-la puskurissa, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, ja 0,12 M NaCI. Ensimmäi- 40 102039 nen kolonni on 1,5-1 kolonni, jonka halkaisija on 100 mm ja korkeus on 45 cm, ja toinen kolonni on 0,25-1 kolonni, jonka halkaisija on 50 mm ja korkeus 300 mm. Pienemmän kolonnin pakkaustilavuus on 15 % suuremman kolonnin pakkaustilavuudes-ta kummankin kolonnin ollessa täysin pakattu kationinvaihtogeelillä. Kolonnit paka-5 taan seuraavasti: Suspendoidaan S-Sepharose® Fast Flow-geelikationinvaihtohart-sia puskuriin, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2 ja 0,12 M NaCI. Geeli kaadetaan sopivaan kromatografiakolonniin, annetaan nesteen virrata tai se pumpataan kolonnin pohjan kautta.

10 Kolonnin päälle sijoitetaan huippuvirtaussovitin, ja geeli tasapainotetaan 5 pakkausti-lavuudella puskuria, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, 0,12 M NaCI, pumppaamalla puskuria kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 1 cm/min. Huippuvirtaussovitin säädetään painamaan lujasti hartsikerroksen huipulle. Sitten kolonnin läpi pumpataan tasaisella nopeudella noin 1 cm/min ainakin 5 pakkaustilavuutta pusku-15 ria, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2, 0,12 M NaCI, ja mikäli välttämätöntä, jatketaan puskurin pumppausta kolonnin läpi samalla virtausnopeudella kunnes effluentin pH-arvo on välillä 7,1 ja 7,3. Kolonnien pakkaustilavuudet säädetään niin, että pienemmän kolonnin pakkaustilavuus on 15 % suuremman kolonnin pakkausti-lavuudesta.

20

Esimerkki 2

Koboltti-chelating Sepharose® Fast Flow:n valmistus

Chelating Sepharose® Fast Flow-geeliä suspendoidaan 5 tilavuuteen 0,02 M kobolt-25 tiasetaattia ja annetaan seistä sekoittaen toisinaan. Geeli pestään Buchner-suppilos-sa deionisoidulla vedellä, sitten geeli pestään puskurilla, jossa on 0,02 M natriumfosfaattia, pH 7,2, sisältäen 0,5 M NaCI. Sitten geeli suspendoidaan 0,5 geelitilavuuteen 0,02 M natriumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,2 sisältäen 0,5 M NaCI. Kaadetaan 190 ml koboltilla ladatusta geelistä kolonniin, jonka halkaisija on 50 mm ja korkeus 30 300 mm, ja pumpataan neste kolonnin läpi. Sijoitetaan kolonnin päälle huippuvir- taussäädin ja tasapainotetaan geeli pumppaamalla kolonnin läpi nopeudella noin 1 cm/min 0,02 M natriumfosfaattipuskuria pH-arvossa 7,2 sisältäen 0,5 M NaCI. Sijoita kolonnin huipulle virtaussovitin.

Esimerkki 3

Chelating Sepharose® Fast Flow:n valmistus (metallisuolalla käsittelemättömän) 41 102039

Chelating Sepharose® Fast Flovv-geeliä suspendoidaan puskuriin, joka koostuu 5 20 mM natriumfosfaatista pH-arvossa 7,2 sisältäen 0,5 M NaCI. 75 ml geelistä kaadetaan kromatografiakolonniin esimerkistä 2 niin, että metallisuolalla käsittelemätön geeli asettuu tasaiseksi kerrokseksi koboltilla ladatun geelin päälle. Kolonnin päälle sijoitetaan virtaussovitin, ja tasapainotetaan geeli 0,02 M natriumfosfaattipuskurilla pH-arvossa 7,2 sisältäen 0,5 M NaCI:ää.

10

Esimerkki 4

Koboltti-chelating-Sepharose®-kolonnin tasapainotus

Sen jälkeen kun koboltti-chelating Sepharose® Fast Flow- ja käsittelemätön chela-15 ting Sepharose®-kolonni valmistetaan esimerkkien 2 ja 3 mukaisesti, kolonni käännetään niin, että kobolttikäsitelty hartsi on käsittelemättömän hartsin päällä. Jatketaan puskurin, ts., 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2, 0,5 M NaCI, pumppaamista kolonnin läpi, kunnes effluentin pH-arvo on välillä 7,1 ja 7,3.

20 Esimerkki 5

Sephacryl® S-200 HR-kolonnin valmistus ; S-200 HR-geelin läpi pumpataan ainakin 1 pakkaustilavuus puskuria, jossa on 10 mM natriumsitraattia, pH 4,5, 1,8-1 kromatografiakolonnissa, halkaisija 50 mm, 25 korkeus 100 cm, lineaarisella nopeudella noin 0,2 cm/min kolonnin tasapainottamiseksi.

Esimerkki 6 ' Puskureiden valmistus 30 (a) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2,0,12 M natriumkloridi „ 102039 42

Sekoitetaan yhteen deionisoidussa vedessä 2,78 g/l natriumfosfaattimonoemäksistä monohydraattia, 7,03 g/l natriumkloridia ja riittävä määrä 6,3 N natriumhydroksidia pH:n säätämiseksi pH-arvoon 7,2(±0,1).

5 (b) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2, 0,12 M natriumkloridi

Sekoitetaan yhteen deionisoidussa vedessä 2,78 g/l natriumfosfaattimonoemäksistä monohydraattia ja 15,19 g/l natriumkloridia. Säädetään pH 6,3 N natriumhydroksidilla pH-arvoon 7,2(±0,1).

10 (c) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2, 0,50 M natriumkloridi

Sekoitetaan yhteen deionisoidussa vedessä 2,78 g/l natriumfosfaattimonoemäksistä monohydraattia, 29,22 g/l natriumkloridia ja riittävä määrä 50-% NaOH:ta pH:n säätä-15 miseksi pH-arvoon 7,2(±0,1).

(d) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 6,0, 0,05 M EDTA, 0,5 M natriumkloridi

Sekoitetaan yhteen deionisoidussa vedessä 2,78 g/l natriumfosfaattimonoemäksistä 20 monohydraattia ja 19 g/l tetranatrium-EDTA:ta ja 29,22 g/l natriumkloridia. Säädetään pH arvoon pH 6,0(±0,1) 6,3 N Natriumhydroksidilla/4 N HCI:llä.

;· (e) 10 mM natriumsitraatti, pH 4,5 25 Sekoitetaan 210 g (2,1 g/l) sitruunahappomonohydraattia 100 l:n kanssa deionisoitua vettä, kunnes sitruunahappomonohydraatti on liuennut. Puskurin pH-arvo säädetään 4,5:een 4 N suolahapolla ja 6,3 N natriumhydroksidilla, mikäli tarpeen. Tätä puskuria käytetään kalvosuodatukseen ja ultrasuodatukseen, samoin kuin geelisuodatuskro-matografiaan.

(f) 20 mM natriumfosfaatti, pH 7,2 30 43 102039

Sekoitetaan 278 g monoemäksistä natriumfosfaattimonohydraattia 100 l:n kanssa deionisoitua vettä ja sekoitetaan liukenemiseen asti. Puskurin pH-arvo säädetään pH-arvoon 7,2 50-% NaOH:lla ja johtokykyyn 2-4 mS.

5 Esimerkki 7

Raa'an IL-4-liuoksen kationinvaihtokromatografiakäsittely

Raakaa IL-4:ää sisältävän solukasvatusväliaineen (kokonaisproteiini noin 14000 g) pH säädetään pH-arvoon 7,2(-1,0), ja sen johtokyky säädetään arvoon 14 mS(±1). 10 Liuosta pumpataan S-Sepharose®-kationinvaihtokolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 1,0 cm/min tai alle. Kolonni pestään esimerkissä 6(a) valmistetulla puskurilla. Kolonni eluoidaan isokraattisesti esimerkissä 6(b) valmistetulla puskurilla tasaisella nopeudella noin 0,2 cm/min. Kerätään jakeet, jotka sisältävät aktiivista IL-4:ää SDS-PAGE- ja proteiinimäärityksillä määritettynä, ja ne yhdistetään. Yhdistetyn aktiivisen 15 IL-4:n puhtaus on noin 50 %.

Esimerkki 8

Osaksi puhdistetun aktiivisen IL-4-liuoksen gradienttieluointi kationinvaihtokolonnilla.

20 Esimerkin 7 mukaisesti valmistetun yhdistetyn aktiivisen IL-4-liuoksen pH-arvo säädetään pH-arvoon 7,2(-0,1) joko 4N HCIillä tai 6,3 N NaOHMIa mikäli tarpeen. Liuoksen johtokyky säädetään esimerkissä 6(f) valmistetulla puskurilla arvoon 14 mS(-1).

Liuosta pumpataan esimerkissä 1 valmistetun S-Sepharose®-kolonnin läpi tasaisella 25 nopeudella 1 cm/min tai alle. Kerätään läpivirtausliuos 1 jakeena.

Eluoidaan kolonnia käyttämällä gradienttia noin 1,75 mS/pakkaustilavuus ja lineaarisella virtausnopeudella noin 0,2 cm/min.

30 Gradientissa käytetty vähäsuolainen puskuri on esimerkissä 6(a) valmistettua, ja gradientissa käytetty suolarikas puskuri on esimerkissä 6(c) valmistettua.

Kerätään 5 suurta jaetta, kukin tilavuudeltaan noin 0,5 pakkaustilavuutta. Kerätään loput jakeet (noin 40 - 50) noin 0,1 pakkaustilavuuden tilavuuksissa.

Analysoidaan jakeet aktiivisen IL-4:n suhteen SDS-PAGE- ja proteiinimäärityksillä.

Aktiiviset IL-jakeet yhdistetään. Yhdistetyn aktiivisen IL-4-liuoksen puhtaus on noin 60 - 70 %.

44 102039 5 Esimerkki 9

Aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n koboltti-chelating Sepharose®-kromatografiapuhdistus

Esimerkistä 8 olevan IL-4-liuoksen pH säädetään pH-arvoon 7,2(±0,1) 4N HCI:llä 10 ja/tai 6,3 N natriumkloridilla. Liuoksen johtokyky säädetään arvoon 45 - 50 mS.

Liuos kirkastetaan tarvittaessa sentrifugoimalla tai mikrosuodatuksella. Liuos (noin 3,3 mg proteiinia/ml geeliä) pumpataan esimerkissä 4 valmistettujen koboltti-chelating Sepharose® Fast Flow- ja käsittelemättömän chelating Sepharose® Fast Flow-15 kolonnien läpi tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min. Kerää läpivirtaus yhtenä jakee- na.

Kolonnit pestään noin 10 pakkaustilavuudella esimerkissä 6(c) valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min ja kerätään pesiu ei useammassa kuin 5 ja-20 keessa, sitten kolonni eluoidaan noin 10 pakkaustilavuudella esimerkissä 6(d) valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min. Jakeet kerätään tilavuudessa noin 0,2 pakkaustilavuutta. Kustakin näytteestä analysoidaan aktiivinen IL-4 DSD-PAGE- ja proteiinimäärityksillä, ja aktiiviset IL-4-jakeet yhdistetään.

25 Tämän esimerkin 9 mukaisesti käsitellyn aktiivisen IL-4:n puhtaus on noin 90 - 95 %.

Esimerkki 10

Ultrasuodatus ja konsentrointi 30 Yhdistetyt jakeet esimerkistä 9 konsentroidaan käyttämällä Amicon-liikkuvaa kammiota, johon on sovitettu YM-10-membraani lisäämällä aktiivista humaani-IL-4:ää sisältävät yhdistetyt jakeet esimerkistä 9 säiliöön ja lisäämällä noin 0,25 tilavuutta esimerkissä 6(d) valmistettua puskuria. Tilavuus konsentroidaan noin 0,2:een alkuperäisestä tilavuudesta ultrasuodattamalla YM-10-membraanilla. Konsentroitu reten- 45 102039 taatti laimennetaan 4 tilavuudella esimerkissä 6(e) valmistettua puskuria, ja se konsentroidaan noin 0,2 tilavuuteen ultrasuodattamalla YM-10-membraanilla.

Konsentrointivaihe voidaan toistaa suunnilleen 0,1-tilavuuden saavuttamiseksi alku-5 peräisistä yhdistetyistä jakeista. Konsentraatti siirretään sopivaan säiliöön ja pidetään kylmän huoneen lämpötilassa välittömästi käytettäväksi, tai säilytetään jäädytettynä -20 °C:ssa.

Esimerkki 11 10 Geelisuodatuskromatografia ("size exclusion"-)

Sephacryl®S-200 HR-kolonni tasapainotetaan esimerkissä 6(e) valmistetulla pus-ku-rilla pumppaamalla ainakin 1 pakkaustilavuuden puskuria kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 0,2 cm/min.

15

Esimerkissä 10 valmistettu liuos kirkastetaan sentrifugoimalla laboratoriosentrifugilla nopeudella 4500 r/min 30 min ajan 2 - 6°C. Mitataan A280, ja liuos laimennetaan esimerkissä 6(e) valmistetulla puskurilla niin, että saadaan 5 optisen tiheyden yksikköä aallonpituudella 280 nm/ml.

20

Tulokseksi saatu liuos pumpataan SephacryKEDS-200 HR-kolonnilla tasaisella nopeudella noin 0,1 cm/min. Esimerkin 6(e) puskuroidun pumppaamista jatketaan virtausnopeudella noin 0,1 cl/min. Kerätään 1 suuri jae, jonka kokonaistilavuus on 0,4 - 0,55 pakkaustilavuutta. Kerätään suuri fraktio, jonka kokonaistilavuus on 0,4 - 0,55 pak-25 kaustilavuutta, sitten kerätään 50 noin 0,1 pakkaustilavuuden jaetta.

Valitaan jakeet, joissa on aktiivista IL-4:ää SDS-PAGE- ja proteiinimäärityksillä määritettynä. Aktiiviset IL-4-jakeet yhdistetään ja steriilisuodatetaan 0,2-pm suodattimen läpi. Otetaan talteen suodokset, jotka ovat 95 - 99-% puhtaita aktiivisen IL-4:n liuok-30 siä SDS-PAGE-analyysillä osoitettuna. Kokonaissaanto soluviljelmäväliaineen aktiivisen IL-4:n perusteella on 70 %.

Kaikki interleukiini-4:n aktiivisten jakeiden määritykseen käytetyt määritykset ovat tavanomaisia. Puhdistetun IL-4:n UV-absorbanssimittausta varten 280 nnrllä, 1,0 46 102039 A280-optjsen tiheyden yksikköä (OD) vastaa 1,6 mg aminohappokoostumusanalyysillä ja 2,0 mg Lowry'n menetelmällä.

Esimerkki 12 5 Sinkki-chelating-Sepharose® Fast Flow'n valmistus

Chelating Sepharose® Fast Flow-geeliä suspendoidaan deionisoituun veteen. 3-I kolonnin valmistamiseksi liete kaadetaan kromatografiakolonniin, joka on 500 mm korkea, ja jonka halkaisija on 180 mm. Kolonnissa olevan nesteen annetaan virrata 10 tai se pumpataan kolonnin pohjan läpi.

Kolonnin päälle sijoitetaan huippuvirtaussovitin, ja geeliä pakataan/pestään deioni-soidulla vedellä. Vettä pumpataan kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 1 cm/min. Huippuvirtaussovitin säädetään painamaan lujasti hartsikerroksen huipulle. Kolonni-15 en läpi pumpataan tasaisella nopeudella noin 1 cm/min ainakin 5 pakkaustilavuutta deionisoitua vettä.

Kitten kolonnin läpi pumpataan tasaisella nopeudella noin 1 cm/min noin 5 pakkaustilavuutta 0,023 M sinkkiasetaattiliuosta. Kolonnin läpi pumpataan tasaisella nopeudel-20 la noin 1 cm/min noin 10 pakkaustilavuutta deionisoitua vettä.

Fosfaattipuskurin pumppausta kolonnin läpi jatketaan tasaisella nopeudella noin 1,0 cm/min kunnes effluentin pH-arvo on välillä 7,1 - 7,3.

25 Esimerkki 13

Chelating Sepharose® Fast Flow'n valmistus (ei käsitelty metallilla)

Chelating Sepharose® Fast Flow-geeliä suspendoidaan puskuriin, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 7,2 sisältäen 1,0 M NaCI:ää. 1-1 kolonnin valmistamiseksi geeli 30 kaadetaan kolonniin, jonka halkaisija on 140 mm ja korkeus 500 mm, ja eluoidaan kolonnin pohjalta. Geeli tasapainotetaan noin 5 pakkaustilavuudelia puskuria, jossa on 20 mM natriumfosfaattia pH 7,2, sisältäen 1,0 M NaCI. Pumpataan puskuria kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 1 cm/min. Puskurin pumppausta kolonnin 47 102039 läpi jatketaan samalla virtausnopeudella kunnes effluentin pH-arvo on välillä 7,1 ja 7,3.

Esimerkki 14 5 Kolonnien valmistus Saijaan

Kun sinkki-chelating-Sepharose® Fast Flow- ja käsittelemätön chelating Sepharose® Fast Flow-kolonnit on valmistettu esimerkkien 12 ja 13 mukaisesti, kolonnit yhdistetään sarjaan niin, että virtaus on ensin sinkki-kelatoivaan kolonniin ja sitten ei-sinkki 10 (käsittelemättömään) -kelatoivaan kolonniin. Kolonnien väliin ei saisi sijoittaa kuplan-sieppaajaa.

Esimerkki 15 S-Sepharose®-kolonnin valmistus 15

Suspendoidaan S-Sepharose®-geelikationinvaihtohartsia puskuriin, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 6,75, 0,12 M NaCI ja 0,001 M etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Kaadetaan geeli kromatografiakolonniin, jonka halkaisija on 100 mm, korkeus 45 cm, ja annetaan nesteen virrata tai se pumpataan kolonnin pohjan kautta.

20

Kolonnin päälle sijoitetaan huippuvirtaussovitin, ja geeli tasapainotetaan 5 pakkaus-tilavuudella puskuria, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 6,75, 0,12 M NaCI, 0,001 M EDTA, pumppaamalla puskuria kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 1 cm/min. Huippuvirtaussovitin säädetään painamaan lujasti hartsikerroksen huipulle. 25 Sitten kolonnin läpi pumpataan tasaisella nopeudella noin 1 cm/min ainakin 5 pak-kaustilavuutta puskuria, jossa on 20 mM natriumfosfaattia, pH 6,75, 0,12 M NaCI, 0,001 M EDTA, ja mikäli välttämätöntä, jatketaan puskurin pumppausta kolonnin läpi samalla virtausnopeudella kunnes effluentin pH-arvo on välillä 6,6 ja 6,9.

30 Esimerkki 16

Sephacryl®S-200HR-kolonnin valmistus 48 102039

Ainakin 1 pakkaustilavuus puskuria, jossa on 10 mM natriumsitraattia, pH 4,5, pumpataan kolonnin tasapainottamiseksi tasaisella nopeudella noin 0,2 cm/min S200 HR-geelin läpi kromatografiakolonnissa, jonka halkaisija on 50 mm, korkeus 100 cm.

5 Esimerkki 17

Puskurien valmistus (a) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2, 1,0 M natriumkloridia 10 Sekoitetaan deionisoidussa vedessä yhteen 2,78 g/l monoemäksistä natriumfosfaat-timonohydraattia, 58,44 g/l natriumkloridia ja riittävä määrä 6,3 N natriumhydroksidia pH:n säätämiseksi pH-arvoon 7,2(±0,1). Erän pitäisi olla riittävän suuri aikaansaamaan ainakin 30 l/l geeliä metalli-chelating Sepharose®-kolonneissa.

15 (b) 0,02 M natriumfosfaatti, pH 7,2, 0,15 M natriumkloridia, 10 % glyserolia

Sekoitetaan deionisoidussa vedessä yhteen 2,78 g/l monoemäksistä natriumfosfaat-timonohydraattia, 8,76 g/l natriumkloridia. pH säädetään pH-arvoon 7,2(±0,1) 6,3 N natriumhydroksidilla. Lisätään riittävä määrä aikaansaamaan 0,1 l/l. Valmistetaan 20 riittävä määrä puskuria aikaansaamaan ainakin 6 l/l geeliä, jonka kanssa se käytetään.

(c) 0,02 M natriumasetaatti, pH 5,0, 0,5 M natriumkloridia 25 Sekoitetaan deionisoidussa vedessä yhteen 1,15 g/l 99,7-% etikkahappoa ja 29,2 g/l natriumkloridia. Säädetään pH-arvoon 5,0(±0,1) 6,3 N natriumhydroksidilla. Valmistetaan riittävä määrä puskuria aikaansaamaan ainakin 10 l/l geeliä, jonka kanssa sitä käytetään.

30 (d) 0,03 M natriumfosfaatti, pH 7,0, 0,003 M EDTA

Sekoitetaan deionisoidussa vedessä yhteen 4,17 g/l monoemäksistä natriumfosfaat- timonohydraattia ja 1,14 g/l tetranatrium-EDTA:ta. Säädetään pH-arvoon 7,0(±0,1) 6,3 N natriumhydroksidilla. Valmistetaan riittävä määrä puskuria aikaansaamaan ainakin 2 l/l geeliä.

49 102039 (e) 10 mM natriumsitraatti, pH 4,5 5

Sekoitetaan 210 g (2,1 g/l) sitruunahappomonohydraattia 100 l:n kanssa deionisoitua vettä, kunnes sitruunahappomonohydraatti on liuennut. Puskurin pH säädetään tarvittaessa 4 N suolahapolla ja 5,3 N natriumhydroksidilla pH-arvoon 4,5. Tänä puskuria käytetään kalvosuodatukseen ja ultrasuodatukseen, samoin kuin geelisuodatus-10 kromatografointiin.

Esimerkki 18

Aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n puhdistus (Sinkki-chelating Sepharose®-kromatografia) 15

Konsentroidaan 700 I femnentointilientä, jossa aktiivinen humaani-yhdistelmä-DNA-IL-4 on liuotettu 20 litraan, sitten liuos alistetaan 25-kertaiselle diasuodatukselle esimerkin 17(a) puskuria vastaan. Liuoksen pH säädetään 4 N HCI:llä ja/tai 6,3 N natriumhydroksidilla pH-arvoon 7,2(±0,1). Liuoksen johtokyky säädetään arvoon 20 70 - 90 mS.

Liuos kirkastetaan ja konsentroidaan suodattamalla. Suodatin pestään esimerkin 17(a) puskurilla liuoksen tilavuuden palauttamiseksi 20 litraan.

25 Liuos pumpataan sinkki-chelating Sepharose® Fast Flow- ja käsittelemättömän Sepharose® Fast Flow-kolonnin läpi tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min. Läpivirtaus kerätään 1 jakeena.

Kolonnit on pestävä kahdesti, ensin noin 10 pakkaustilavuudella esimerkissä 17(a) 30 valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min, ja kerätään ei useammassa kuin 5 jakeessa, sitten suunnilleen 5 pakkaustilavuudella esimerkissä 17(b) valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 0,5 cm/min, ja kerätään pesu 1 jakeessa.

102039 so

Eluoidaan aktiivinen IL-4 kolonnista noin 8 pakkaustilavuudella esimerkissä 17(c) valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 0,25 cm/min. Kerätään jakeita tilavuudella noin 0,2 pakkaustilavuutta erillisiin astioihin, jotka sisältävät laimennusai-neena 0,5 ml/ml esimerkissä 17(d) valmistettua kerättävää puskuria.

5 Tämän esimerkin 18 mukaisesti käsitellyn aktiivisen IL-4-liuoksen puhtaus on noin 20 - 40 %. Aktiivisen IL-4:n saanto raa'assa fermentointiliemessä olevan määrän perusteella on 90 %.

10 Esimerkki 19

Puskurien valmistus S-Sepharose®-kromatografiaa varten

(a) 20 mM natriumfosfaatti, pH 6,75, 0,12 M natriumkloridi, 0,001 M EDTA

15 Lisätään 2,78 g/l monoemäksistä natriumfosfaattimonohydraattia, 7,03 g/l natrium-kloridia, 0,38 g/l tetranatrium-EDTA:ta ja 1 l/l deionisoitua vettä sopivaan astiaan, ja sekoitetaan liukenemiseen asti. Puskurin pH säädetään 6,3 N natriumhydroksidilla pH-arvoon 6,75(±0,1).

20 (b) 20 mM natriumfosfaatti, pH 6,75, 0,55 M natriumkloridi, 0,001 M EDTA

Lisätään 2,78 g/l monoemäksistä natriumfosfaattimonohydraattia, 32,14 g/l natrium-kloridia, 0,38 g/l tetranatrium-EDTA:ta ja deionisoitua vettä sopivaan astiaan, ja sekoitetaan liukenemiseen asti. Puskurin pH säädetään 6,3 N natriumhydroksidilla 25 pH-arvoon 6,75(±0,1).

(c) 20 mM natriumfosfaatti, pH 6,75, 0,001 M EDTA

Lisätään riittävän suureen astiaan sisältämään 2,78 g/l monoemäksistä natriumfos-30 faattimonohydraattia, 0,38 g/l tetranatrium-EDTA:ta ja deionisoitua vettä. Sekoitetaan liukenemiseen asti, ja puskurin pH säädetään tarvittaessa 6,3 N natriumhydroksidilla pH-arvoon 6,75(±0,1).

81 102039

Esimerkki 20

Puhdistetun aktiivisen interleukiini-4-liuoksen gradienttieluointi kationinvaihtokolonnil-la 5 Esimerkin 7 mukaisesti valmistetun aktiivisen IL-4-liuoksen pH säädetään vaadittaessa joko 4 N HCI:llä tai 6,3 N NaOH:lla pH-arvoon 6,75(±0,1).

Suodatetaan 0,45-μηι suodattimen läpi. Suodatin pestään noin 1 litralla esimerkissä 19(c) valmistettua puskuria.

10

Tulokseksi saadun liuoksen johtokyky säädetään esimerkissä 19(c) valmistetulla puskuriliuoksella arvoon 15(±0,5 mS).

Pumpataan liuos esimerkissä 4 valmistetun S-Sepharose®-kolonnin läpi tasaisella 15 noppeudella noin 1 cm/min tai alle. Effluenttiliuos kerätään 1 jakeena.

Kolonni pestään noin 5 pakkaustilavuudella esimerkissä 19(a) valmistettua puskuria tasaisella nopeudella noin 1,0 cm/min tai alle.

20 Pesu kerätään 1 jakeena. Kolonnia eluoidaan käyttämällä gradienttia noin 4,5 mS/pakkaustilavuus, ja tasaisella virtausnopeudella noin 0,2 cm/min.

Gradientissa käytetty vähäsuolainen puskuri on esimerkissä 19(a) valmistettua, määrä 5 pakkaustilavuutta, ja gradientissa käytetty runsassuolainen puskuri on esi-25 merkissä 19(b) valmistettua, määrä 5 pakkaustilavuutta.

Kerätään 5 suurta jaetta, joista kukin on tilavuudeltaan 0,8 pakkaustilavuutta.

Loput jakeet (noin 40 - 50) kerätään tilavuuksina 0,1 pakkaustilavuutta.

30

Jakeiden testi aktiivisen IL-4:n suhteen SDS-PAGE- ja proteiinimäärityksillä.

Aktiiviset IL-4-jakeet yhdistetään. Aktiivisen IL-4:n saanto sinkkiä kelatoivissa yhdistetyissä eluaateissa olevan aktiivisen IL-4-määrän perusteella on 90 %.

52 102039

Aktiivisen IL-4-liuoksen puhtaus on noin 90 - 95 -%.

Esimerkki 21

Ultrasuodatus ja konsentrointi 5

Yhdistetyt jakeet esimerkistä 20 konsentroidaan käyttämällä liikkuvaa Amicon-kam-miota, johon on sovitettu YM 10-membraani lisäämällä aktiivista humaani-IL-4:ää sisältävät yhdistetyt jakeet esimerkistä 20 säiliöön ja konsentroimalla tilavuuden noin 0,1:een alkuperäisestä tilavuudesta YM-10-membraanilla. Konsentroitu retentaatti 10 laimennetaan 4 tilavuudella esimerkissä 17(e) valmistettua puskuria, ja se konsentroidaan noin 0,2 tilavuuteen ultrasuodattamalla YM-10-membraanilla.

Konsentrointivaihe voidaan toistaa, jotta saavutettaisiin tilavuus noin 0,1 alun yhdistetyistä jakeista. Konsentraatti siirretään sopivaan astiaan ja pidetään kylmän huo-15 neen lämpötilassa tai säilytetään jäädytettynä -20°C:ssa.

Esimerkki 22

Geelisuodatus ("sixe exclusion") 20 Esimerkissä 21 valmistettu liuos kirkastetaan sentrifugoimalla laboratoriosentrifugilla nopeudella 4500 r/min 30 min ajan 2 - 6°C:ssa. Mitataan Ä2B0, ja liuos laimennetaan esimerkissä 17(e) valmistetulla puskurilla, jolloin on 15A280/ml.

Tulokseksi saatu liuos pumpataan Sephacryl® S-200 HR-kolonniin tasaisella no-25 peudella noin 0,1 cm/min. Jatketaan esimerkin 17(e) puskurin pumppausta kolonnin läpi virtausnopeudella noin 0,1 cm/min. Kerätään 5 jaetta, joiden kokonaistilavuus on 0,4 - 0,55 pakkaustilavuutta, sitten kerätään 50 noin 0,01 pakkaustilavuuden jaetta.

Valitaan jakeet, joissa on aktiivista IL-4:ää DSD-PAGE-ja proteiinimäärityksellä 30 määritettynä. Aktiiviset IL-4-jakeet yhdistetään ja steriilisuodatetaan 0,2-pm suodattimen läpi. Otetaan talteen suodokset, jotka ovat 95 - 99-% puhtaita aktiivisia IL-4-liuoksia. Kokonaissaanto fermentointiliemessä olevan aktiivisen IL-4:n perusteella on 70 - 80 %.

53 102039

Talteen saadun aktiivisen IL-4:n puhtaus on 95 - 99-% SDS-PAGE-määrityksellä osoitettuna.

Kaikki interleukini-4:n aktiivisten jakeiden määritykseen käytetyt määritykset ovat 5 tavanomaisia. Puhdistetun IL-4:n UV-absorbanssimittausta varten 280 nm:llä, 1,0 A280-optisen tiheyden yksikköä (OD) vastaa 1,6 mg aminohappokoostumusana-lyysillä ja 2,0 mg Lowry'n menetelmällä.

Myös SDS-PAGE-määritystä vaaditaan aktiivisten jakeiden valintaan. Tätä menetel-10 mää kuvataan julkaisussa: Laemmli, U. K.; Nature 227 (1970) 680.

Lowry'n menetelmä kuvataan julkaisussa: Lowry et ai.; J. Biol. Chem.

Vaikka keksintö on kuvattu määrättyjen erityisten suoritusmuotojen yhteydessä, on 15 ammattimiehelle selvää, että voidaan tehdä useita vaihtoehtoja, modifikaatioita tai muunnelmia. Kaikki tällaiset vaihtoehdot, modifikaatiot ja muunnelmat on tarkoitettu luettavaksi mukaan keksinnön henkeen ja suoja-alaan.

Claims (12)

102039

1. Menetelmä aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n raakaliuoksen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 (a) lisätään mainittu IL-4:n raakaliuos puskuroituna neutraalissa/hieman alkalisessa pH-arvossa ja sisältäen noin 0,5 -1,5 M natriumkloridia metallia kelatoivaan agaroo-sigeelikromatografiakolonniin aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n sitomiseksi selektiivisesti; 10 (b) mainittu kolonni pestään kahdesti, ensin tasapainotuspuskurilla, joka sisältää 1,0 M natriumkloridia, ja sitten puskurilla, joka sisältää 10 % glyserolia ja 0,15 M natriumkloridia; 15 (c) sitoutunut aktiivinen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4 eluoidaan kolonnista eluointipuskurilla pH-arvossa noin pH 4,5 - 5,5; (d) lisätään aktiivinen humaani-IL-4-liuos vaiheesta (c) puskuriin kromatografoimisek-si kationinvaihtajalla ja gradienttieluoidaan aktiivisen humaani-IL-4:n puskuroitu liuos 20 kolonnista; (e) konsentroidaan eluaatti vaiheesta (d) liikkuvalla solumembraanilla, joka sallii materiaalin kulkeä läpi, jonka molekyylipaino on alle 10000; 25 (f) alistetaan konsentraatti vaiheesta (e) kokoon perustuvaan (size exclusion)-kroma- tografiaan; ja ·' (g) otetaan talteen aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n puhdistettu liuos. 30

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa (a) puskuri on fosfaattipuskuria, jonka pH-arvo on 7,5, ja natriumkloridikonsentraatio on 1 M, ja metallia kelatoiva geelikolonni on sinkkiä kelatoivaa agaroosigeeliä. 102039

3. Kumman hyvänsä patenttivaatimuksista 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri vaiheessa (b) on 0,02 mM natriumfosfaattia pH-arvossa 7,2, ja jossa on myös 150 mM natriumkloridia.

4. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointipuskuri vaiheessa (c) on 0,02 mM natriumasetaattipuskuria, jossa on 0,5 M natriumkloridia ja jonka pH-arvo on 5,0.

5. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 1, 2, 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että lisäyspuskuri vaiheessa (d) on 20 mM fosfaattipuskuria pH-arvossa 6,75 sisältäen 0,12 M natriumkloridia, ja eluointipuskuri on 20 mM fosfaattipuskuria pH-arvossa 6,75 sisältäen noin 0,12 - 0,55 M natriumkloridia.

6. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 1, 2, 3, 4 tai 5 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että konsentrointi vaiheessa (e) toteutetaan kalvosuodattamalla 10 mM natriumsitraattipuskuria vastaan pH-arvossa 4,5 konsentraatioon jopa 20 mM/ml.

7. Menetelmä CHO-solulinjoista ekspressöidyn aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n raa'an liuoksen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 20 (a) mainittu aktiivisen IL-4:n raakaliuos lisätään neutraaliin/hieman alkaliseen pH-arvoon puskuroituna ja johtokyvyssä 13 -15 mS kationinvaihtokromatografiaan risti-liitetyllä agaroosigeelimatriisikolonnilla aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleu-kiini-4:n sitomiseksi selektiivisesti kolonniin, pestään tasapainotuspuskurilla ja eluoi- 25 daan aktiivinen IL-4 isokraattisesti kolonnista; (b) lisätään aktiivinen humaani-IL-4-liuos vaiheesta (a) puskuriin kromatografoitavak- ’ si pienemmällä kationinvaihtokolonnilla, jonka pakkaustilavuus on noin 15 % vaiheen (a) kationinvaihtokolonnin pakkaustilavuudesta, pestään tasapainotuspuskurilla, 30 gradienttieluoidaan sitoutunut aktiivinen IL-4 kolonnista puskurijärjestelmällä pH-arvossa 7,2, sisältäen 0,12 - 0,50 M natriumkloridia, ja yhdistetään aktiiviset eluaatit; (c) säädetään eluaattipoolin pH-arvo 7,2:een, ja johtokyky arvoon 45 - 50 mS, sitten yhdistetyt eluaatit lisätään metallia kelatoivaan agaroosigeelikolonniin puskurissa pH- 102039 arvossa noin 6,7 - 8, ja sisältäen noin 0,5 M natriumkloridia, sitten kolonni pestään puskurilla lähes neutraalissa pH-arvossa sisältäen 0,5 M natriumkloridia, sitten aktiivinen IL-4 eluoidaan isokraattisesti puskurilla pH-arvossa 6,0 sisältäen 0,50 M natriumkloridia; 5 (d) konsentroidaan ja kalvosuodatetaan eluaatti vaiheesta (c) pH-arvossa 4,5 liikkuvalla solumembraanilla, joka sallii materiaalin molekyylipainoltaan alle 10000 kulkea läpi; 10 (e) lisätään konsentraatti vaiheesta (d) kokoon perustuvan (size exclusion)-kromato- grafiakolonniin ristiliitetylle kopolymeerigeelille allyylidekstraanista ja Ν,Ν'-mety-leenibisakryyliamidista tasapainotettuna puskurijärjestelmällä pH-arvossa 4,5; ja (f) kerätään talteen aktiivisen yhdistelmä-DNA-humaani-interleukiini-4:n puhdistettu 15 liuos.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tasapainotus-puskuri vaiheessa (a) on 20 mM natriumfosfaattia pH-arvossa 7,2, sisältäen konsent-raation 0,12 M natriumkloridia. 20

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointi-puskuri vaiheessa (b) on 20 mM natriumfosfaattia pH-arvossa 7,2, jossa on gradientti 0,12 - 0,50 M natriumkloridia, ja metallia kelatoiva geelikolonni on kobolttia kelatoiva agaroosigeeli. 25

10. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 7, 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluointipuskuri vaiheessa (c) on 20 mM fosfaattipuskuria pH-arvossa 6,0, sisältäen 0,50 M natriumkloridia.

11. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 7, 8, 9 tai 10 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että konsentrointi vaiheessa (d) suoritetaan kalvosuodattamalla 0,02 M natriumfosfaattipuskuria vastaan pH-arvossa 6,0, sisältäen 0,05 M EDTA:ta ja 0,5 M natriumkloridia, ja sitten 10 mM natriumsitraattipuskuria vastaan pH-arvossa 4,5, konsentraatioon jopa 20 mg/ml. 102039

12. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 7, 8, 9, 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolonni vaiheessa (e) tasapainotetaan 10 mM natriumsitraatilla. 102039