HU215257B - Eljárás interleukin-4 tisztítására, és a tisztított interleukin-4-et tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát E. cőli fermentlevekből és CHO-sejttenyészlevekbőlszármazó aktív rekőmbináns hűmán interleűkin–4 tisztítására szőlgálóeljárásők képezik. A találmány tővábbá az ily módőn tisztítőttinterleűkin–4–et tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására isvőnatkőzik, amelyek emlősökben a neűtrőfilek számának növelésére, amielőid vagy mőnőcit id leűkémia kezelésére, valamint az éretlenmielőid vagy mőnőcitőid sejtek érésének indűkálására szőlgálnak. ŕ

Description

A találmány tárgyát E. coli fermentlevekből és CHOsejttenyészlevekből származó aktív rekombináns humán interleukin-4 tisztítására szolgáló eljárások képezik.

A találmány továbbá az ily módon tisztított interleukin—4-et tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is vonatkozik, amelyek emlősökben a neutrofilek számának növelésére, a mieloid vagy monocitoid leukémia kezelésére, valamint az éretlen mieloid vagy monocitoid sejtek érésének indukálására szolgálnak.

A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 4 lap ábra)

HU 215 257 B

HU 215 257 Β

A találmány tárgya eljárás neutrofil sejtek számának növelésére és mieloid sejtek érésének megindítására emlősökben. Ennek érdekében interleukin-4 hatékony mennyiségét adják be olyan emlősnek, melynek ilyen kezelésre szüksége van. A találmány az ilyen kezeléshez használt interleukin-4 tisztítási módszereire is vonatkozik.

Az interleukin-4 (IL—4) egy limfokin (immunrendszer-stimulátor), mely széles tartományban fejti ki immunsejt-stimuláló hatását [Banchereau et al., Lymphokine Rés., 6. kötet No. 1: U135 (1987); Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894-5898 (1986); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2061-2065 (1986); Coffman et al., J. Immunoi., 136, 949-954 (1986); Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 437-440 (1986); Grabstein et al., J. Exp. Med., 163, 1404-1413 (1985); Vitetta et al., J. Exp. Med., 162, 1726-1731 (1985], Az IL—4-et időnként B-sejt növekedési faktornak (BCGF) [Butler et al., J. Immunoi., 133, 251-255 (1984) (humán BCGF); és Farrar et al., J. Immunoi., 131, 1838-1842 (1983) (egér-BCGF)] és sejtstimuláló faktor 1-nek (BSF-1) [Ohara et al., J. Immunoi., 135, 2518-2523 (1985)] nevezték. Végül az interleukin-4 nevet javasolták, és 1986-ban ez fogadták el [Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 437-440 (1986)].

Eredetileg úgy gondolták, hogy az IL—4 csak az aktivált B-sejtek kostimulálása szempontjából fontos [Roehm et al., J. Esp. Med., 160, 679-694 (1984)], azonban kimutatták, hogy a T-sejtek és a hízósejtek hatását is szabályozzák [Mosmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5654-5658 (1986)]. Lásd még a WO 87/0290 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentést, melyben az IL-4 aktivitás, mint T-sejt növekedési faktorhatás és B-sejt növekedési faktorhatás szerepel, és ezért a különböző fertőzésekkel szembeni természetes védekezés fokozására használható.

A T-sejtek és a B-sejtek az immunválasz késői szakaszában fejtik ki hatásukat. Igen előnyös lenne egy olyan szer, amely növelné és aktiválná a neutrofil sejteket, amelyek a fertőzés korai szakaszaiban fejtik ki hatásukat, és a szervezetben a védelem első vonalát képezik a fertőzések ellen.

A fehérvérsejt-hematopoézis normál folyamatában a sejtek csontvelőben képződnek éretlen alapsejtből, amelyet őssejtnek neveznek. Az őssejt fokozatosan, különböző fejlődési vonalak mentén, több érési lépésen keresztül differenciálódik, míg eléri a differenciáltság végső állomását, mint egy monocita, granulocita vagy limfocita.

Az éretlen, nem differenciálódott sejteknek az a tulajdonsága, hogy gyorsan képesek szaporodni. Ha a prekurzorsejt e sok szakaszból álló pályán keresztül érik és differenciálódik, végül elveszti proliferációs képességét, és felveszi egy specializált, funkcionális szempontból érett sejt szerepét. Normál esetben azok a sejtek, amelyek elérik végső érettségi formájukat, nemigen sokszorozódnak, ha egyáltalán sokszorozódnak.

Általánosságban a rák a sejtdifferenciálódás egy rendellenessége. Részletesebben kifejtve a mieloid leukémiák olyan zavarok, amelyekben a monocita és granulocita sejtvonalak az érés egy korai szakaszában blokkoltak, és így nem vesztették el proliferatív képességüket. Minthogy az érésükben megállított sejtek tovább szaporodnak, ezekből éretlen rákos sejtpopuláció keletkezik, melynek eredménye a leukémia diagnózisa.

Bizonyítást nyert, hogy a különböző mieloid leukémiás sejtek makrofágokká és granulocitákká való differenciálódásra késztethetők és hogy a differenciálódás következtében ezek a sejtek elvesztik proliferációs képességüket. Ebből az következtethető, hogy egy szer, amely a végső differenciáltságot indukálja, használható lehetne a mieloid leukémia terápiájában.

Legutóbb meglepődve tapasztaltuk, hogy az IL-4 alkalmazása növeli emlősökben a neutrofílek számát és stimulálja a neutrofílek és monociták differenciálódását. Ugyancsak meglepő módon azt találtuk, hogy a neutrofilekre kifejtett hatás hosszú ideig fennmarad az IL-4 adásának beszüntetése után. Ez igen meglepő, ugyanis a szervezetben az IL—4 félélete nagyon rövid. Megállapítottuk, hogy ha egy emlősnek IL-4-et adunk, azzal növeljük a neutrofil sejtek számát, elősegítjük, hogy a gazdaszervezet nagyobb ellenállást fejtsen ki fertőzésekkel szemben, és eléijük, hogy egy nagyon korai szakaszban kezeljük a fertőzéseket. Az emlős lehet egy immunológiailag veszélyeztetett gazdaszervezet, azaz olyan gazda, amely a nem kívánt bakteriális fertőzésre érzékeny, ilyenek a súlyosan égett és fekélyes betegek vagy olyan gazda, akinél az immunológiai védekezés lecsökkent a rák kezelésében alkalmazott besugárzás vagy kemoterápia következtében, vagy egy genetikai okból immunhiányos gazda. Az IL-4 ezen tulajdonságaiból az is következik, hogy fel lehetne használni helyi alkalmazásra sebek - ilyenek a nyílt törések vagy égések - gyógyításában azáltal, hogy stimulálja a neutrofil- és monocitaaktiválódást, és a sebhelynél a fibroblaszt proliferizációt.

Előnyös, ha az emlősöket humán eredetű IL-4-gyel kezeljük, azaz olyan humán IL-4-gyel, mint az E. coli vagy CHO-sejtekből rekombináns technikával előállított humán IL-4. Nagyon előnyös, ha az emlősnek szánt adagot szubkután adjuk be, vagy intravénás injekció vagy intravénás infúzió formájában, napi körülbelül 0,1-30 pg/kg testtömegmennyiségben. Előnyös az IL-4 alkalmazása, ha napi körülbelül 1-15 pg/kg testtömeg IL-4-et adunk, és legelőnyösebb, ha napi körülbelül 3-10 pg IL-4-et adunk testtömeg kg-onként.

Nagy tisztaságú aktív IL-4-et a találmány értelmében IL—4-et kifejező E. coli fermentlevéből egy alább ismertetett, háromlépéses eljárással állíthatunk elő:

1. A nyers fermentlevet affinitás-kromatografáló oszlopra visszük, melynek töltete fém-kelát-agaróz. Ilyen például a Pharmacia Fine Chemicals cégtől (Piscataway, New Jersey, USA) beszerezhető kelátSepharose gél. A készítmények neve a következő: Chelating-Sepharose Fást Flow és chelating-Sepharose 6B. A chelating-Sepharose Fást Flow-ban az iminodiecetsav csoportokat áthidaló karok (spacerek) kötik stabil éterkötéssel a Sepharose 6 Fást Flow-hoz. A Sepharose 6 Fást Flow térhálósított, 6%-os agaróz. Elő2

HU 215 257 Β nyös a foszfátpufferek használata. A használt foszfátpuffer nátrium-klorid koncentrációja magas, körülbelül 0,5-1,5 M, előnyösen 1,0 M. A puffer pH-ja semleges vagy enyhén lúgos, azaz pH=6,7-8, előnyösen körülbelül 7,2. A magas sókoncentráció és a közel semleges pH - körülbelül 7,2 - elősegíti, hogy az aktív interleukin—4 maximálisan kötődjék, és hogy más proteinek minimális mértékben kötődjenek az oszlophoz. Az előnyös fém-kelát a cink, bár más fém-kelátok - így a réz, kobalt és nikkel - is használhatók. Amikor a kötődés megtörtént, az oszlopot kétszer mossuk, először egy kiegyensúlyozópufferrel, mely 20 mM nátrium-foszfátot (pH=7,2) és 1,0 M nátrium-kloridot tartalmaz. Az oszlopot ezután foszfátpufferrel mossuk, mely körülbelül 10% glicerint és alacsony nátrium-klorid koncentrációtkörülbelül 150 mM - tartalmazó 20 mmol-os közeli rokonságú szennyezőanyagokat. Végül az aktív IL-4-et pH=5,0 mellett, 0,50 M nátrium-klorid-tartalmú acetátpufferrel oldjuk le.

2. Az 1. lépésben kapott aktív IL-4 oldalát kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk, S-Sepharose Fást Flow oszlopon, közel semleges, körülbelül pH=6,75 és 15 mS vezetőképesség mellett, ahol a szennyeződések legnagyobb része nem kötődik. A tovább tisztított IL-4 pufferolt oldatát ezután leoldjuk az oszlopról.

3. Az aktív IL-4 oldatát - miután 20 mg/ml-re bekoncentráltuk pH=4,5 mellett - gélszűréssel tisztítjuk, méretkizáró kromatografáló oszlopon, amelyet 10 mM nátrium-citráttal, pH=4,5, hoztunk egyensúlyba. Az összegyűjtött tisztított aktív IL—4 oldatban az IL-4 tisztasága 95-99%.

Ugyancsak nagy tisztaságú aktív IL-4-et kaphatunk IL-4-et kifejező CHO-sejtvonal sejttenyészetének tenyészlevélből egy másik találmány szerinti eljárással:

1. Az aktív IL—4-et tartalmazó sejttenyészet nyers tenyészlevét S-Sepharose Fást Flow kationcserélő kromatografáló oszlopra visszük közel semleges, körülbelül pH=6,7-8, előnyösen pH=7,2 és 13-15 mS (vezetőképesség) mellett, ahol a szennyeződések nagy része nem kötődik. Az S-Sepharose Fást Flow - beszerezhető a Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) cégtől egy térhálósított agaróz mátrix, amelyhez -CH2-SO® NtP ioncserélő csoportok kapcsolódnak. Az oszlopot a kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd a tisztított IL-4 pufferolt oldatát izokratikusan oldjuk le az oszlopról pH=7,2 mellett, 0,26 M nátrium-klorid-tartalmú pufferrendszerrel. A leoldott anyagot egyesítjük.

2. Az 1. lépésben kapott eluátumot ezután kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk. Az oszlop egy viszonylag kicsi S-Sepharose Fást Flow oszlop, amely az 1. lépésben használt oszlop ágytérfogatának körülbelül 15%-át teszi ki. Az oszlopot kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd az aktív IL-4 molekulát 0,12-0,50 M nátrium-klorid grádienst tartalmazó pufferrendszerrel eluáljuk pH=7,2 mellett.

3. A 2. lépésben kapott aktív IL-4 oldatát, miután pH-ját 7,2-re és vezetőképességét 45-50 mS-re állítottuk be, affinitás-kromatográfiával, kelát agaróz géloszlopon tisztítjuk. A kelát-Sepharose gél a Pharmacia Fine Chemicals cégtől (Piscataway, NJ) szerezhető be, nevük: chelating-Sepharose Fást Flow és chelatingSepharose 6B. A chelating-Sepharose Fást Flow-ban az imino-diecetsav csoportokat spacerek kötik stabil éterkötéssel a Sepharose 6 Fást Flow-hoz. A Sepharose 6 Fást Flow térhálósított 6%-os agaróz. Előnyös a foszfátpufferek alkalmazása. A használt foszfátpuffer nátrium-klorid koncentrációja körülbelül 0,5 M, pH-ja semleges vagy enyhén lúgos, azaz pH=6,7-8, előnyösen körülbelül 7,2. A sókoncentráció és a közel semleges, körülbelül 7,2-es pH elősegíti, hogy az aktív interleukin-4 kötődése az oszlophoz maximális legyen, és hogy más proteinek kötődése minimális legyen. Az előnyös fém-kelát a kobalt, bár más fém-kelátok, mint a cink, réz és nikkel, szintén használhatók. Mihelyt a kötődés megtörtént, az oszlopot 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú, 20 mM nátrium-foszfát (pH=7,2) kiegyensúlyozó pufferrel mossuk. Végül az aktív IL—4-et izokratikusan eluáljuk 0,50 M nátrium-kloridot tartalmazó foszfátpufferrel, pH=6,0 mellett.

4. Az aktív IL-4 tartalmú oldatot, miután 20 mg/mlre bekoncentráltuk pH=4,5 mellett, méretkizáró gélszűrő oszlopon kromatografáljuk. Előnyös oszloptöltet a Sephacryl S-200 HR vagy S-100 HR, melyek allildextrán és Ν,Ν’-metilén-bisz-akrilamid kopolimerek. (Beszerezhetők a Pharmacia cégtől.) Az oszlopot 10 mM nátrium-citrát oldattal (pH=4,5) hozzuk egyensúlyba. Az összegyűjtött, tisztított aktív IL-4 oldat tisztasága 95-99%-os.

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek a találmány szerinti eljárásokkal tisztított IL-4-et tartalmazzák.

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetése következik.

Az 1. ábrán a jelen találmány szerinti használathoz előnyös (humán) IL-4 aminosav-szekvenciája látható.

A 2. ábra grafikusan ábrázolja a neutrofil sejtszám növekedését, amely cynomolgus majmoknál következett be IL-4 adását követően.

A 3. ábra grafikusan ábrázolja az IL-4-gyel kezelt HL-60 sejteknél kapott aktiválódásra és differenciálódásra vonatkozó adatokat.

A 4. ábra grafikusan ábrázolja az IL-4-gyel kezelt U-937 sejteknél kapott aktiválódásra és differenciálódásra vonatkozó adatokat.

A jelen találmány szerint bármilyen alkalmas IL-4 felhasználható. Legutóbb számos laboratóriumban klónoztak és szekventáltak IL—4-et meghatározó komplementer DNS-eket (cDNS-eket). [Például: Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894-5898 (1986) (humán); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 2061-2065 (1986) (egér); és Noma et al., Natúré, 319, 640-646 (1986) (egér)]. Lee és munkatársai [J. Bioi. Chem., 263, 10817 (1988)] rekombináns IL-4 CHOsejtekben való előállítását írták le. Az IL-4 kereskedelmi árucikk is, beszerezhető például a Genzyme Corporationtől (Boston, Massachusetts, USA; humán és egér). Ezenkívül különböző tenyészet-felülúszókból nem rekombináns IL-4-et tisztítottak [például: Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 437-440 (1986) (egér); Grabstein et al., J. Exp. Med.,

HU 215 257 Β

763,1405-1413 (1985) (egér); Oharaet al., J. Immunoi., 135, 2518-2523 (1985) (egér BSF-1); Butler et al., J. Immunoi, 133, 251—255 (1984) (humán BCGF); és Farrar et al., J. Immunoi., 131, 1838-1842 (1983) (egér BCGF)].

A fent említett közleményeket ez a leírás referenciaként tartalmazza a DNS- és aminosav-szekvenciákra vonatkozó és a jelen találmányban használható megfelelő IL-4 anyag előállításának módszereire vonatkozó közléseik miatt.

A jelen találmányban használt IL-4 előnyösen humán IL-4, és legelőnyösebben egy olyan humán változat, amelynek a szekvenciáját Yokoto és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894-5898 (1986)] és a 87/02990 számú PCT szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra hozva 1987. május 21-én) írták le. Az említett közleményt és PCT bejelentést ez a leírás referenciaként tartalmazza.

Ha a találmány szerint előállított gyógyszerkészítményekkel emlősöknek az IL—4 hatásos mennyiségét adjuk be, növekedni fog a monociták és/vagy a granulociták száma (ezek vagy polimorfonukleáris sejtek, vagy eozinofilek és/vagy bazofilek lehetnek). Hatásos mennyiség alatt az IL-4 bármilyen olyan mennyiségét értjük, amely jelentősen növeli a neutrofd számot. A legalább 25%kal, előnyösen 50%-kal nagyobb számot tekintjük jelentősnek. Az IL-4 - előnyösen a humán IL-4 (hIL—4) — előnyös napi adagja testtömeg kg-onként körülbelül 0,1-30 μg. Még előnyösebb, ha naponta testtömeg kgonként körülbelül 1,0-15,0 mg hIL-4-et adunk be az emlősöknek, és emlősöknél a legelőnyösebb a napi testtömeg kg-onkénti körülbelül 3,0-10,1 pg hl L-A alkalmazása.

A beadott mennyiség, az alkalmazás gyakorisága és időtartama különböző faktoroktól függően változik, így a neutrofd- és monocitaszámtól (például a monocitopénia vagy a granulocitopénia súlyosságától), a beteg korától, tápláltságától stb. A beadás kezdetben rendszerint naponta történik, majd időszakosan folytatódik a beteg élete folyamán. Az adagolt mennyiséget és az adás gyakoriságát úgy határozzuk meg, hogy méljük a kiindulási neutrofdszámot és az IL-4 hatásának befolyását a neutrofilszám növekedésére. Az adagolás célja az, hogy a neutrofilszámot elfogadható szintre - ez körülbelül 1000 össz-neutrofdsejtnek és/vagy 100 összmonocitának felel meg - növeljük, hogy elérjük a kívánt biológiai hatást. Ezt a hatást minden betegnél egyedileg kell meghatározni a klinikai körülményektől függően. Ezenkívül szelektív manipulációkat végezhetünk, például fokozhatjuk a limfociták egy vagy több szubpopulációját.

Az IL—4 neutrofilszám növelő hatásának kiegészítése szempontjából hasznos lehet, ha más, biológiailag és/vagy gyógyászatilag aktív vegyületekkel együtt adagoljuk. Például kombinálhatjuk az IL-4-et más fehérvérsejtszám-növelő szerekkel [ilyen például a granulocitamakrofágtelep-stimuláló faktor (GM-CSF) és a granulocitatelep-stimuláló faktor (G-CSF)]. Ugyancsak hasznos lehet, ha az IL-4-et más ínterleukinokkal, például IL-l-gyel és/vagy IL-3-mal és/vagy IL-7-tel kombináljuk abból a célból, hogy megnöveljük az összfehérvérsejt- és neutrofilszámot. Az IL-2 IL-4-gyel kombinálva szelektíven fokozhatja a specifikus és hasznos T-sejt-funkciókat, és az IL—4 kombinációja IL-5-tel és/vagy IL-6-tal hasznos lehet a normál és/vagy daganatos B-sejtek íúnkciójának és/vagy számának specifikus fokozásában. Az IL-4 a kemoterápiás szerek felhasználhatóságát szintén javíthatja, ilyenek az alkilezőszerek, a mitózisos (oszlási) orsóra ható mérgek vagy tumorellenes antibiotikumok (e felsorolásnak nincs korlátozó jellege). A fehérvérsejtek számának növelése révén, vagy a sejtek specifikus szubpopulációinak funkcionális és differenciáltsági állapotának javítása révén a fent említett kemoterápeutikumok hatékonysága fokozható. Egy interferonnal való kombináció, például a gamma- vagy alfainterferonnak a kombinációja IL-4-gyel szintén használható bizonyos fehérvérsejtek - főként T-sejt-alcsoportokban - számának növelésére és funkcióik fokozására. Bizonyos esetekben a szükséges biológiai hatás elérése érdekében bármelyik előbb említett interleukin vagy interferon elleni antitest is beadható a natív molekulák helyett.

A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket intravénás, nazális, parenterális, orális, szubkután és intramuszkuláris úton, valamint helyileg vagy transzdermálisan alkalmazhatjuk, vagy bármilyen más elfogadott módon. Az IL-4 bármelyik szokásos gyógyszerformában adagolható. A parenterális készítmények közé tartoznak a steril oldatok vagy szuszpenziók. Az inhalálással való alkalmazást nazális vagy orális permettel vagy befúvással végezhetjük. A helyi alkalmazásra szánt gyógyszerformák a következők: krémek, kenőcsök, borogatóvizek, bőr alatti eszközök (például hagyományos depó vagy mátrix patch típusok) és hasonlók.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállítását a szokásos, gyógyszerészetileg elfogadott kötőanyagokkal és adalékanyagokkal, hagyományos technikák használatával végezhetjük.

Az IL-4 alkalmazása jelenleg előnyösen intravénásán történik. A beadandó oldatok liofilizált porok feloldásával készíthetők el, és ezek az oldatok még konzerválószereket, puffereket, diszpergálószereket stb. is tartalmazhatnak.

Előnyös, ha az IL—4-et 10 mmol-os cítrátpufferben és konzerválószer nélküli steril vízben oldjuk fel, s a maximális koncentráció nem haladja meg a 100 pg/ml-t. Az oldatot folyamatos intravénás infúzió vagy intravénás injekció formájában adjuk be. Folyamatos infúzióhoz a napi adagot 5 ml normál konyhasóoldathoz adhatjuk, és az oldatot mechanikus szivattyú vagy gravitáció segítségével infundáljuk.

Emlősökben az IL—4 hatását a neutrofilszám növelésére a következő vizsgálómódszerrel határozhatjuk meg:

Az 1. ábra szerinti aminosav-szekvenciájú E. coli eredetű humán IL-4-et cynomolgusmajmokon végzett 1 hónapos vizsgálatban értékeltük ki. Az IL—4-et naponta egyszer intravénásán adtuk, 2, 10 és 25 pg/kg/nap

HU 215 257 Β dózisokban. A majmok vérmintáinak hematológiai és klinikai kémiai értékelését kiválasztott időpontokban végeztük el, az adagolás előtt, annak folyamán és egy hónappal az adagolás befejezése után. Az adatokat egy Coulter S+4 hematológiai analizátor (teljes fehérvérsejtszám) és egy manuális vérkép szolgáltatta. A 4. ábrán látható eredmények mutatják, hogy a megnövekedett neutrofilszám a jelen találmány szerinti gyógyszerkészítményeknek tudható be.

A neutrofilek IL—4-gyel való aktiválását a következő vizsgáló módszerek mutatják be.

Módszerek A) Sejtizolálás

Cynomolgusmajmokból négy héttel az IL-5 (25 μg/kg) vagy a vivőanyag adása után teljes vért veszünk le. A vért 6%-os dextránban gravitációs úton ülepítjük, majd a leukociták kinyerése céljából vagy hipotóniás konyhasóoldattal vagy trisz-ammónium-klorid oldattal lizáljuk.

B) Élesztőfagocitózis vizsgálat

A vizsgálatot a következőképpen végezzük: körülbelül 5T0⁵ izolált leukocitasejtet tartalmazó 12x75 mm-es polipropilén csövekhez hozzáadunk 300 μΐ humán szé5 rumot és 50 μΐ hővel elölt élesztőrészecskéket (10⁸ mikroorganizmus/ml) tartalmazó szuszpenziót. A csöveket forgó-rotációs (gyrorotary) vízfürdőben 37 °C-on inkubáljuk. Centrifugálás után a sejtszuszpenziót 0,4% tripán-kéket és 0,2% eozin Y-t tartalmazó konyhasóol10 dattal festjük meg. A bekebelezett élesztő színtelen marad, és a bekebelezetlen élesztő vörösre festődik. Ez a módszer lehetővé teszi az aviditás (a bekebelezett élesztősejtszám), valamint a fagocitálósejtek százalékos arányának pontos meghatározását. E paraméterekre ka15 pott középértéket megszorozva, minden majomra kiszámítunk egy fagocitózisindexet. Az adatokat a Student T-teszt segítségével analizáltuk, összehasonlítván az IL-4-gyel kezelt majmokat a csak vivőanyagot kapott majmokkal. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be.

1. táblázat

Majmokból IL-4-kezelés beszüntetése után négy héttel vett perifériásvér-leukociták fagocitálóképessége

Majom	IL-4a(pg/kg)	Élesztő/sejtb	Fagocitálósejtek (%)c	Fagocitózisindexd
1	0	3,8+0,2	35,0	130,6
2	0	3,8+0,2	50,0	186,5
3	0	5,3+0,2	45,6	242,1
4	0	2,6+0,2	33,8	87,5
	középértéke	3,9+0,6	41,1+4	161,6+33,6
5	25	4,84+0,2	82,5	399,3
6	25	4,8+0,2	70,0	333,2
7	25	4,7+0,2	71,4	336,4
8	25	3,8+0,2	61,9	232,6
	középértéke	4,5+0,3	71,5±4f	325,4+34,5®

^aNégy hétig IL-4-gyel vagy vivőanyaggal kezelt majmokból 4 hetes időszak után kapott sejtek.

^bÉlesztő/sejtközépérték=bekebelezett élesztő/minden majomból 60 sejt; középérték± a középérték standard hibája (SEM=standard error of mean) a számolt sejtek alapján.

^cFagoeitálósejt%=élesztő-bekebelező sejtek/össz sejt-100% ^dFagocitózisindex= élesztő/sejtközépértékfagocitáló sejt% ^eA majmok individuális értékeinek középértéke ± SEM ^fp< 002 Student T-teszt, kontroll versus IL-4

8p<, 014 Student T-teszt, kontroll versus IL-4

C) NBT-vizsgálat

Cynomolgusmajmokból a fentiek szerint izolált leukocitákat 2% hővel inaktivált fetális boíjúszérum-tartalmú 0,2 ml RPMI 1640 tápoldatban reszuszpendálunk. A szuszpenziót 12^75 mm-es polipropilén csövekbe osztjuk szét. A csövekben lévő sejtekhez hozzáadunk 0,1 ml nitrokék-tetrazolium (NBT=nitroblue tetrazolium) oldatot (2 mg NBT/ml 2%-os RPMI) és 0,1 ml fórból-12-mirisztát-13-acetát (PMA) oldatot (2%-os PRMI-vel frissen készített 0,25 μπιοΐ-os oldat). A sejtszuszpenziót 37 °C-os vízfürdőben 30 percig inkubáljuk. Inkubálás után a csöveket lecentrifugáljuk, és az üledékről eltávolítjuk a felülúszót. A sejtüledéket 1 órán át 37 °C-on szárítjuk, majd Ν,Ν-dimetil-formamiddal (DMF) extraháljuk: 1 ml DMF-et adunk az üledékhez, vortexeljük, majd rögtön ezután 85 °C-on 20 percig inkubáljuk. A csöveket centrifugáljuk, és a színes DMFet összegyűjtjük spektrofotometriás analízishez, melyet 560 nm-en DMF vakkal szemben végzünk. Minden mérést az inkubálás befejezése után 30 percen belül vég55 zünk el.

A redukált NBT-t (NBF; μg/ml) standard görbe alapján számítjuk ki, amelyet úgy készítünk, hogy egy 2 mg/ml-es NBT törzsoldat sorozathígításait Whatman szűrőpapírcsíkokra cseppentjük, és megszárítjuk.

A standard görbéhez az NBT-t úgy redukáljuk, hogy

HU 215 257 Β

0,2 n NaOH-ban készített 1 mM aszkorbinátoldattal kezeljük 20 percig szobahőmérsékleten, sötét helyen. A szűrőpapírt DMF-fel extraháljuk és 560 nm-en olvassuk le. Az NBF/sejt-érték kiszámításánál az NBF-et (pg/ml) elosztjuk a minta 1 ml-ében lévő sejtszámmal. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja be.

2. táblázat

Négy héttel az IL—4 megvonása után a majmokból vett perifériás vérleukociták fagocitálótulajdonságának mérése NBT-redukcióval

Majom	IL—4-adása (BgAg)	Abszorpció (560 nm)	NBF/ml (gg/ml)	NBFb (pg/sejt)
1	0	0,095	3,9	0,3
2	0	0,075	3,1	0,3
3	0	0,113	4,5	0,7
4	0	0,033	1,5	03
	középérték 0,4±0,lc
5	25	0,213	8,3	1,1
6	25	0,316	12,1	0,7
7	25	0,483	18,5	1,0
8	25	0,163	6,5	0J
	középérték 0,9±0,lcd

“Négy hétig IL-4-gyel vagy vivőanyaggal kezelt majmokból 4 hetes kiürülési időszak után kapott sejtek.

^bNBF pg/sejt a minta NBF pg/ml összsejtadatából számított érték. A sejtszámot hemacitométerrel határoztuk meg; a vizsgálat előtt Türk-féle oldatot használunk.

^CA majmoknál az egyedi értékek középértéke ± SEM^dp< 0,02, Student T-teszt, kontroll versus IL-4.

A fenti eredmények szerint az IL-4-gyel kezelt majmokból az adagolás befejezése után 4 héttel vett leukociták fagocitózisindexe jelentősen nagyobb volt, mint a kontrollállatokból kapott leukocitáké. A megnövekedett fagocitózisindex az élesztőt bekebelező sejtek 35 százalékos növekedésének tudható be. Az IL-4-gyel kezelt csoportban (az adagolás után) a sejtek aviditása gyengén nőtt (a sejtenként befalt élesztőszám). Az NBT festék-redukciós válasz, amelyet az NBF pg/sejt értéke mér, az IL-4-gyel kezelt majmokból vett sejtekben megnőtt, összehasonlítva a vivőanyagkontroll majomcsoportból származó sejtekkel.

Ez a két vizsgálat - az élesztősejt-bekebelezés és az NBT-festékredukció - méri a fagocitózist és az anyagcsere-változásokat (respirációs robbanás=respiratory burst), amelyek fontos állomásai a fertőzőanyagok elpusztításához vezető történések láncolatának. A két paraméternél kapott növekedés arra mutat, hogy az IL-4 meg tudja növelni és ki tudja szélesíteni a fagocitózisválaszt.

Az U-937 sejtvonal egy olyan sejtvonal (ATCC CRL 1593), amelyet diffúz hisztiocitás leukémiás beteg rosszindulatú (malignus) sejtjeiből állítottak elő [Sunstrom et al., Int. J. Cancer, 17, 565-577 (1976)].

A sejtvonal jellemző tulajdonságai arra mutatnak, hogy ez egy éretlen monocitavonal.

A HL-60 sejtvonal (ATCC CCL 240) akut premielocitás leukémiás betegből származik. A sejtek jellemző tulajdonságai arra mutatnak, hogy ezek éretlen neutrofilek.

Az IL—4 képes arra, hogy e két éretlen sejt differenciálódását megindítsa, mely a fagocitafunkció növekedésében, továbbá a hexóz-monofoszfát sönt (NBT-redukció) aktivitás növekedésében nyilvánul meg, mely fagocitózis számára metabolikus szükségszerűséget jelent, megnyilvánul abban is, hogy megnő azoknak a sejteknek a százalékos aránya, amelyek az érett neutrofilekre (naftolkloroacetát-észteráz) vagy az érett monocitákra (alfanaftil-acetát-észteráz) specifikus festéket képesek felven40 ni, és növekszik a felületi markerek szempontjából pozitív sejtek száma, melyet az érett monocitákra és érett neutrofilekre vonatkozó FACS-analízis igazol.

Az IL-4 hatását a mieloid sejtek érésére az alábbi vizsgálati eljárással mutatjuk ki:

NBT (nitroblue-tetrazolium) redukciója formazánná:

A hexóz-monofoszfát sönt aktiválással társult respirációs robbanás meghatározása.

Müller et al., Agents and Actions, 11, 384 (1981).

Baehler et al., New Engl. J. Med., 278, 971 (1968). 50 Salin és McCord, J. Clin. Invest., 54, 1005 (1974).

U-937 és HL-60 sejtvonalra standardizált eljárás.

1. Annyi célsejtet izolálunk, hogy az elégséges legyen 1E6 sejt/tartály meghatározásához. A sejteket Sorvall centrifugán 5 percig 1200 fordulat/perc mellett lecentrifugáljuk. Mosás PBS-ben, majd újból centrifugálás következik.

2. A sejteket megfelelő mennyiségű 2% FBS (fetal bovin serum=fetális marhaszérum) tartalmú RPMI tápoldatban vesszük fel, hogy tartályonként 0,2 ml-t oszt60 hassunk el.

HU 215 257 Β

3. A sejteket 24 tartályos (lapos fenekű) lemezre mérjük be 0,2 ml/tartály elosztásban.

4. Hozzáadunk 0,1 ml 20 μΜ PMA-t 2%-os FBSben (minden tartályhoz).

5. Hozzáadunk 0,1 ml 2 μ§/ιηΙ NBT-t 2%-os FBS- 5 ben (minden tartályhoz).

6. A lemezeket 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

7. Ezután rögtön kiveszünk 0,1 ml sejtet, 5 percig centrifügáljuk 200 fordulat/perc mellett (alacsony gyorsulás), Shandon Cytospin készüléket használva.

8. A sejteket Dif-Quick rendszer segítségével festjük, majd fedőlemezre visszük számláláshoz.

Az élesztőfagocitózis vizsgálatot a fent leírtak szerint mindkét sejtvonalnál elvégeztük, azonos metodológiát használva.

Naftol AS-D-klór-acetát észteráz festés PMNS-re

Yam, et al., Am. J. Clin. Path., 55, 283 (1971).

Li, et al., J. Histochem. Cytochem., 21, 1 (1973).

HL-60 sejtvonalra standardizált eljárás.

1. Tárgylemezre centrifugálunk 1-5E5 sejtet 5 per- 20 cig 200 fordulat/perc mellett (alacsony gyorsulás) Shandon Cytospin készülékkel.

2. A tárgylemezeket 2 percig citrát-aceton-metanol fixálóoldatban szobahőmérsékleten fixáljuk.

3. A lemezeket ionmentesített vízben mossuk, leve- 25 gőn szárítjuk 20 percig.

4. A lemezeket AS-D oldatban 30 percig 37°C-on festjük sötét helyen.

5. Mosás háromszor ionmentesített vízben.

6. Festés savanyú hematoxilinnel 5 percig.

7. A tárgylemezt háromszor mossuk ionmentesített vízben, levegőn szárítjuk, fedőlemezzel fedjük. Citrát-aceton-metanol fixálóoldat

A koncentrált citrátot 1:9 arányban hígítjuk ionmentesített vízzel.

ml citrátoldatot, 27 ml acetont és 5 ml vízmentes metanolt elegyítünk.

Az oldatot szobahőmérsékleten tároljuk, és naponta készítjük.

AS-D festék

Trizmal 6,3 puffért 1:9 arányban hígítunk ionmentesített vízzel.

A hígított Trizmal 6,3 oldat 50 ml-ét 37 °C-ra melegítjük, és állandó keverés mellett hozzáadunk 1 kapszulányi Fást Corinth V sót. Ha a só teljesen feloldódott, 45 hozzáadunk 2 ml naftol AS-D kloroacetát-oldatot. Az oldat meglehetősen zavarosnak tűnik. Folytatjuk a keverést 15-30 percig, és Coplin festőkádba öntjük az oldatot. Nem szűrjük.

AS-D oldat kapszula naftol AS-D kloroacetátot feloldunk ml dimetil-formamidban. Közvetlenül használat előtt készítjük el.

A Sigma cég naftol AS-D kloroacetát-készletét (katalógusszám: 90) használjuk.

Alfa-naftil-acetát észeráz festés makrofágokra

Yam, et al., Am. J. Clin. Path., 55, 283 (1971).

Li, et al., Histochem. Cytochem., 21, 1 (1973).

U-937 sejtvonalra standardizált eljárás.

1. Tárgylemezre centrifugálunk 1-5E5 sejtet 5 percig 200 fordulat/perc mellett (alacsony gyorsulás) Shandon Cytospin készülékkel.

2. A tárgylemezeket 30 percig citrát-aceton-metanol 15 fixálóoldatban szobahőmérsékleten fixáljuk.

3. A lemezeket desztillált/ionmentesített vízben mossuk, levegőn 20 percig szárítjuk.

4. A lemezeket NE-oldatban 30 percig 37 °C-on, sötét helyen festjük.

5. Mosás háromszor desztillált/ionmentesített vízben.

6. Festés Mayer-féle hematoxilinnel 5 percig szobahőmérsékleten.

7. A tárgylemezt desztillált/ionmentesített vízzel mossuk, levegőn szárítjuk, fedőlemezzel fedjük.

Citrát-aceton-metanol fixálóoldat

A koncentrált citrátot 1:9-re hígítjuk desztillált/ionmentesített vízzel. 18 ml citrátoldatot, 27 ml acetont és 5 ml vízmentes metanolt elegyítünk. Szobahőmérsékleten tároljuk. Az oldatot naponta készítjük.

NE-festék

Trizmal 7,6 [(mono/trisz(hidroximetil)-aminometán/-maleát; pH=7,6] puffért 1:9 arányban hígítunk desztillált/ionmentesített vízzel. A hígított Trizmal 7,6 puffért 37 °C-ra melegítjük, és állandó keverés mel35 lett hozzáadunk 1 kapszulányi Fást Blue RR sót [4-benzoilamin-2,5 -dimetoxi-benzol-diazónium-klorid hemi(cink-klorid)só]. Ha a só teljesen feloldódott, hozzáadunk 2 ml NE-oldatot. Az oldat sárga és enyhén zavaros lesz. Folytatjuk a keverést 15-20 percig, majd 40 Coplin festőkádba öntjük az oldatot. Nem szüljük. NE-oldat kapszula (20 mg) alfa-naftil-acetátot feloldunk 2 ml etilén-glikol-monometil-éterben. Közvetlenül használat előtt készítjük.

A Sigma cég alfa-naftil-acetát készletét (katalógusszám: 90) használjuk.

A HL-60 és U-937 sejtekkel végzett vizsgálatok eredményét a 3. és 4. táblázatban ismertetjük.

3. táblázat

E. coli eredetű IL-4 hatása a HL-60 sejtek funkciójára és differenciálódására

Kezelés3	Élesztő/sejtb	Fagocitálósejtek (5)c	Fagocitózisindexd	NBTe	CAEf(x)
Tápoldat IL-4	2,4+0,3	18+5	42+12	17+2	21+5
250 E/ml	5,5+1,48	42+5«	225+458	33+3	62+3«
25E/ml	5,l±l,lh	41+4«	207+37»	39+4«	56+6«
2,5 E/ml	5,4+1,58	36+38	184+38«	35+4«	53+38

HU 215 257 Β

3. táblázat (folytatás)

Kezelés3	Élesztő/sejtb	Fagocitálósejtek (5)c	Fagocitózisindexd	NBTe	CAEf(x)
0,25 E/ml	3,7±l,0	27±5	96±24b	36±48	40±28
0,025 E/ml	3,l±0,6	25±6	75±18	23±2	32±7
DMSO	3,6±0,48	71±108	259±54g	92±2«	56±28

Mklór-acetát-észteráz ^aA HL-60 sejteket 6 napig inkubáltuk az IL—4 megadott koncentrációit vagy DMSO-t tartalmazó tápoldatban (DMSO=dimetil-szulfoxid). A tenyészetekhez a 3. napon adtunk IL—4-et vagy DMSO-t.

^bNégy független kísérlet középértéke ± SEM; Élesztő/sejt középérték=bekebelezett élesztő/30 sejt.

^cFagoeitálósejt (%)=élesztőbekebelező sejt/összsejt. 100; Négy független kísérlet középértéke ± SEM.

^dFagocitózisindex = élesztő/sejt középérték x fagocitálósejt (%).

^eNBT-pozitiv sejt (%)/100 sejt; Négy kísérlet középértéke ± SEM.

Oíloroaeetát-észteráz (CAE) -enzimaktivitásra pozitív sejt (%)/100 sejt; Négy kísérlet középértéke± SEM.

8p<, 0,5; Student T-teszt, tápoldat versus IL—t-gyel vagy DMSO-val kezelt csoport.

^bp< 10, Student T-teszt, tápoldat versus IL—1-gyel vagy DMSO-val kezelt csoport.

4. táblázat

E. coli eredetű IL—4 hatása az U-937 sejtek funkciójára és differenciálódására

Kezelés3	Élesztő/sejtb	Fagocitálósejtek (%)c	Fagocitózisindexd	NBTe	Nef
Tápoldat IL—4	l,3±0,4	10±2	15±3	5±5	16,4±4
250 E/ml	2,5±2g	25±5g	57±158	38±78	66±78
25 E/ml	2,4±28	25±5g	63±178	41±18	64±68
2,5 E/ml	2,5±2g	20±38	51±10g	33±2g	54±78
0,25 E/ml	1,9±38	21±5h	43±14h	28	44±48
0,025 E/ml	1,7±18	16±4	28±8	27±28	29±3

³ Az U-937 sejteket 6 napig inkubáltuk az IL—l feltüntetett koncentrációit tartalmazó tápoldatban. A tenyészeteket a 3 napon egészítettük ki. ^bÉlesztő/sejt-középérték=bekebelezett élesztő/30 sejt; Négy kísérlet középértéke ± SEM. ^cFagoeitálósejt (%)=élesztőbekebelező sejt/összsejt* 100; Négy kísérlet középértéke ± SEM. ^dFagocitózisindex=élesztő/sejt-középérték x fagocitálósejt (%).

^eNBT-pozitív sejt (%)/l 00 sejt; Négy kísérlet középértéke ± SEM. NE-aktivitásra pozitív sejt (%)/l 00 sejt; Négy kísérlet középértéke ± SEM: 8p<, 0,5, Student T-teszt, tápoldat versus IL-4-gyel kezelt csoportok. ^fp<, 10, Student T-teszt, tápoldat versus IL—t-gyel kezelt csoportok.

Monocita és neutrofil felületi markerek FACS (fluorescence-activated cell sorter) T-analízise

HL-60 és U-937 sejteket T-75 palackokban inkubálunk növekvő mennyiségű IL-4-gyel [E. coli eredetű rekombináns humán IL-4 (rhuIL-4), 8-ILE-1002] vagy kontroliokkal; a 3. napon a sejteket szétosztjuk, és ekkor végezzük az adagolást. Az 1., 3. és 6. napon kivett sejteket RPMI 1640 tápoldattal mossuk. A sejteket hővel aggregáltatott humán IgG-vel blokkoljuk a potenciális Fc-zavaró hatás csökkentése céljából. Újból mosás következik RPMI 1640 használatával, a sejteket 50 μί hígított antitestben (a monoklonális antitestpanelt az alábbi táblázat tartalmazza) reszuszpendáljuk. A sejteket ezután PBS-ben mossuk, 100 μί hígított FITC-vel konjugált kecske anti-egér IgGl- vagy IgG2b-oldatban reszuszpendáljuk és

30 percig jégen inkubáljuk. A második antitesttel való inkubálás után a sejteket ismételten PBS-ben mossuk, majd 1 ml PBS-ben reszuszpendáljuk. A sejtszuszpenzió citofluorometriás analízisét Becton-Dickinson FACScan készüléken végezzük. A készüléken lefuttat50 juk az egér-IgG2b izotípuskontrollokat és a második antitestkontrollokat, hogy a pozitív sejtekben a természetes expressziós szint felett jelentkező növekedést (azaz az IL-4 által indukált fokozott kifejeződést) bemutassuk.

HU 215 257 Β

Monoklonális antitest (mAt) panel

mAt	lg izotipus	Differenciálódási csoport (CD)	Specificitás
WEMG11	egér-IgGl	ismeretlen	gp 110:granulociták, mielomonociták
FNC 32	egér-IgGl	ismeretlen	mielomonociták
OKM-1	egér-IgG2b	CDllb	CR-3
anti-Leu M5	egér-IgG2b	CDI le	gp 150 (95) lánc
anti-CR-1	egér-IgGl	CD35	C3b, CR-1
anti-Leu M3	egér-IgG2b	CD14	monociták

(gp=glükoprotein; CR=komplementreceptor)

A FACS-analízis során kapott eredményeket a 3. és

4. ábra mutatja be.

IL-4 expressziós plazmid — pdhfr—SRalpha263 - szerkesztése

Takebe és munkatársai [Molecular and Cellular Biology, 8, 466-477 (1988)] és Yokoto és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894-5898 (1986)] írták le a következő plazmidok szerkesztését:

pSRcc-CAT196, pcD137, pcD-SRa205, pcDhIL—4 klón 125 és pcD-SRa224.

A pcD-SRa205 plazmidot a következő fragmentumok trimolekuláris ligálásával szerkesztettük: a pSRa-CAT 196-ból származó 373 bp Ncol-Xhol SRapromoter-fragmentumból, a pcD137-ből származó 434 bp hosszú XhoI-SstI csatlakozódarabot (splice junction=SJ) és 5’ egér IL—4-et (mIL-4) tartalmazó fragmentumból, valamint a pcD137-ből származó 3221 bp Sstl-NcoI-fragmentumból, mely a 3’ egér IL—4 cDNS-t, az SV40 poliadenilációs szakaszt és a pBR322 plazmid gerincét tartalmazza, s ez utóbbi replikációs origót és ampicillinrezisztencia-gént tartalmaz. A G-C farkat a 35 pcD-hIL—4 klón 46-ból deléció útján kapjuk [Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894-5898 (1986)] a következőképpen: a pLl Okayama-Berg-plazmidot [Okayama és Berg, Molecular and Cellular Biology, 3, 280-289 (1983)] Pstl-gyel hasítjuk, és a túlnyúló 40 4 nukleotidot a T4 polimeráz 3’-5’ exonukleáz aktivitása segítségével távolítjuk el. Az egysíkú DNS-végekhez Bglll linkereket ligálunk, majd BglII-vel és HINDIIImal hasítunk. A pLl SV40 szekvenciát tartalmazó HindlII-BglII fragmentumát izoláljuk, és beépítjük a 45 BglII/HindlII-mal hasított pcD-MCGF plazmidba [Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 1070-1074 (1984)]. így kapjuk a 101-es intermedier plazmidot. A pcD-hIL—4 plazmid klón 46-ból származó tisztított 311 bp Pstl-fragmentumot Sau3A-val hasítjuk, amikor is egy olyan, 163 bp fragmentum szabadul fel, mely BglII-vel kompatíbilis kinyúlószakaszokat visel.

A 162 bp fragmentumot a BglII-vel hasított plO 1-gyel ligáljuk, és megkapjuk a 102-es intermedier plazmidot.

Az SV40 és humán IL-4 cDNS-szekvenciát tartalmazó pl 12 HindlII/Nhel-fragmentumot a HindlII/Nhel-gyel hasított klón 46 DNS-éhez ligáljuk, így kapjuk a 125-ös pcD-hIL-4 kiónt, amely egy SV40 korai promotert, SV40 csatlakozódarabot (SJ) és a teljes humán IL-4 cDNS-t tartalmazza a deletált G-C farokkal.

A pcD-SR 224 plazmidot úgy szerkesztettük, hogy a pcD-SR 205 kis Xhol-fragmentumát (az SJ-t és a mIL-4 cDNS-t tartalmazza) a pcD-hIL—4 klón 125 kis Xhol-fragmentumával - mely mint fent leírtuk, az SJ-t és a hIL-4 cDNS-t tartalmazza a deletált G-C farokkal 20 helyettesítjük.

A pMTVdhfr plazmidba [Lee et al., Natúré, 294, 228-232 (1981)] egy Sáli helyet vezetünk be: EcoRI/BamHI-gyel hasítunk, a kinyúló részt Klenowpolimerázzal betöltjük, majd egy oktanukleotid Sáli 25 linkerhez ligálunk. A pMTVdhfr259 plazmid ezután nem tartalmaz EcoRI és BamHI restrikciós helyet, és a két hely közötti szakaszt egy Sáli linker helyettesíti. Az SRa promotert, SV40 SJ-t, a humán IL-4 cDNS-t és SV40 poliadenilációs szignálokat tartalmazó 30 pcD-SRct224 Sáli fragmentumát beépítjük az egyetlen Sáli helyet tartalmazó pMTVdhfr259-be. A végső humán IL-4 expressziós plazmid, a pdhfr-SRalpha263 a következő elemeket tartalmazza az óramutató járásával ellenkező irányban:

1. Ampicillin rezisztenciagén és replikációs origó a pBR322-ből.

2. MMTV LTR által irányított dhfr-expressziós egység a pMTVdhfr-ből.

3. SRalpha-promoter.

4. Csatlakozódarab az SV40-ből.

5. Humán IL-4 cDNS.

6. Poliadenilációs szignál az SV40-ből.

A vektorban lévő humán IL-4 cDNS-szekvencia azonos a Yokoto és munkatársai által [Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 5894—5898 (1986)] ismertetett pcD-hIL-4 klón 46-ban lévő szekvenciával.

DHFR gén sokszorozás és az IL—4 Sí vonal szelekciója

A dihidrofolát-reduktáz aktivitás hiányos kínaihörcsög-petefészeksejteket (CHO-dhf) széles körben hasz50 nálják a különböző rekombináns proteinek nagybani termelésére [Kaufman et al., Molecular and Cellular Biology, 5, 1750-1759 (1985)]. A CHO-dhfr mutáns sejteknek auxotróf szükséglete van hipoxantin, timidin és glicin iránt. A dhfr-markert tartalmazó expressziós 55 vektorokat fel lehet használni mutáció kiegészítésére; a szelekció úgy érhető el, hogy a sejteket a szükséges kofaktorokat nem tartalmazó táptalajban tenyésztjük. A génsokszorozást (a másolatszám ezerszeresig való növelését) úgy érhetjük el, hogy a sejteket a folát analóg 60 metotrexát (MTX) megnövelt koncentrációja mellett te9

HU 215 257 Β nyésztjük. A genomba integrálódott rekombináns dhfrlokusz sokszorozódása a szóban forgó fontos génre vonatkozó expressziós egység másolatszámának a megnövekedésével jár együtt [Ringhold et al., J. Mól. Applied Genetics, I, 165-175 (1981); és Kaufman et al., EMBO J., 6, 187-193 (1987)].

A dhfr és a humán IL-4 kódolószekvenciát tartalmazó plazmid DNS-t (pdhfr-SRa263) a fentiek szerint szerkesztjük. A pdhfr-SRa263 transzfekcióját a DXB-II CHO-dhfr sejtvonalba kalciumfoszfát-precipitációs módszerrel végezzük el [Graham és Van dér Eb, Virology, 52, 546 (1978)]. A transzformált sejteket olyan szelektív táptalajon (DMEM=Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium=Dulbecco-féle módosított Eagle táptalaj) szelektáljuk, amely nem tartalmaz hipoxantint és timidint. Az első sokszorozóciklushoz egy 3B12 jelű kiónt választottunk. A 3B12 kiónt 40 mM MTX-et tartalmazó α-MEM táptalajon (Eagle’s Minimum Essential Medium=Eagle-féle minimál esszenciális táptalaj) tenyésztettük, amíg a rezisztens kiónokat nem szelektáltuk. Egy 3B12-A26 jelű kiónt használtunk 1 μΜ MTX-szel való további sokszorozáshoz. A második szelekciós ciklus után a 3B12-A26-19 jelű kiónt választottuk ki a további feldolgozáshoz. Ezt a kiónt 10% NU Serum™ V-vel módosított szuszpenzióban való tenyésztéshez adaptáltuk, és egy IL-4 Sl-vel jelölt kiónt szelektáltunk a nagybani szaporításhoz.

Tenyészet előállítása

Az „Alap Sejtbank” (Master Cell Bank=MCB) létesítéséhez két kezdő, 100 ml-es hengeres (spinner) palackot használtunk, ezek tartalmazták az IL-4 SI sejteket. A sejteket két további tápoldatcserével 100 ml-es hengeres palackokban tenyésztettünk [tápoldat=alaptápoldat plusz 0-10% szérum (NU Serum™ V)]. A palackokból a sejteket összegyűjtjük, mossuk, 10 ml fagyasztóoldatban reszuszpendáljuk, egyesítjük, és aszeptikusán szétosztjuk körülbelül 2,0 ml-es steril sejttároló fiolákba [fagyasztóoldat=alaptápoldat plusz 20% szérum (NU Serum™ V) plusz 10% dimetilszulfoxid]. A fiolákat lassan -70 °C-ra fagyasztjuk le, és folyékony nitrogénben tároljuk.

Három fagyasztott fiolányi sejtet felolvasztunk, majd a szuszpenziót 4—6 generáción keresztül tápoldatban, 100 ml-től 3 literig növekvő térfogatú hengeres palackokban elszaporítjuk. A sejteket centrifügálással gyűjtjük össze, mossuk, és fagyasztóoldatban reszuszpendáljuk. A sejteket aszeptikusán osztjuk szét, körülbelül 2,0 ml-es, steril, sejttárolásra alkalmas fiolákba. A fiolákat lassan -70 °C-ra fagyasztjuk le, és folyékony nitrogénben tároljuk. Ezzel létrehoztuk az Alap Sejtbankot (MCB).

„Üzemi Alap Sejtbank” (MWCB=Master Working Cell Bank) létesítéséhez 1-3 MCB fiolát olvasztunk fel, és a sejteket 4—6 generáción keresztül 3 literig növekvő térfogatú T-palackokban szaporítjuk. A sejteket összegyűjtjük, mossuk, fagyasztóoldatban reszuszpendáljuk, szétosztjuk, és úgy fagyasztjuk, mint az MCB-t. Az MWCB-t szintén folyékony nitrogénben tároljuk.

Az IL-4 termelését 50-200 literes bioreaktorokban végezzük. A termelést úgy kezdjük, hogy egy fagyasztott MWCB fiolát felolvasztunk, és ezzel beoltunk egy

T-75 palackot. Addig inkubálunk, amíg a sejtkoncentráció el nem éri a 100%-os összefolyást, akkor a sejteket tripszinnel kezeljük, és beoltjuk két T-75 palackba (adott esetben T-160 palack is használható. Ezeket a palackokat megint 100% összefolyásig inkubáljuk, majd a tripszinnel kezelt sejtekkel egy 100 ml-es hengeres palackot oltunk be. A 100 ml-es hengeres palackot addig inkubáljuk, amíg megfelelő sejtnövekedést nem kapunk. Ezek a sejtek szolgálnak inokulumként egy 250 ml-es hengeres palack beoltásához. Hasonlóan járunk el 1 literes és 3 literes palack esetén és 10, illetve 20 literes bioreaktor esetén. A reaktorban a tenyésztés kezdetben tételenként történik, majd a megfelelő sejtkoncentráció elérésekor elkezdjük a folyamatos tápoldatperfuziót.

A tenyésztéshez és a folyamatos perfuzióhoz módosított Iscove táptalajt használunk, amelyet legfeljebb 10% szérummal (például NU Serum™ V) egészíthetünk ki. A termelés folyamán nem használunk metotrexátot.

A fermentációs lépéseket steril körülmények között, zárt rendszerekben végezzük. A lényeges permentációs paramétereket - ilyen a hőmérséklet, pH, keverés és levegőztetés - megfelelő módon figyeljük, és szabályozzuk a tenyésztés és a folyamatos perfúziós lépések folyamán. Időközönként aszeptikusán mintákat veszünk a pH és a sejtsűrűség mérése, és a sterilitás (baktérium- és gombamentesség) ellenőrzése céljára.

Ha megfelelő mennyiségű kondicionált tápoldat (perfuzátum) gyűlik össze, a fermentlevet leszűijük, hogy a még jelen levő sejteket eltávolítsuk és ultraszűréssel koncentráljuk. A nyers CHO IL—4-et tartalmazó koncentrátumot a végső tisztítási lépésekhez továbbítjuk.

A nyers CHO IL—4-koncentrátumból az IL—4 tisztítását kationcserélő kromatográfiával, szulfonátoszlopon (például S-Sepharose) végezzük. Jellemző az eljárásra, hogy ezt a lépést ismételjük. A szulfonátoszlopról kapott kiválasztott, egyesített frakciókat kelátkromatográfiával (például: kobalt-kelát-Sepharose) tovább tisztítjuk. A kiválasztott, egyesített frakciókat ezután diaszűréssel és membránszűréssel koncentráljuk. A koncentrátumot gélszűrő oszlopon (például: HR S-200) kromatografáljuk. Az egyesített frakciókból álló tisztított IL-4-tételt ezután megszűrjük, és -20 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk.

Az aktív rekombináns humán IL—4-et tartalmazó nyers CHO-IL-4 koncentrátum tisztítási eljárása az alábbi lépéseket tartalmazza:

(i) a CHO-sejttenyészléből származó aktív IL-4 pufferolt nyers oldatát kationcserélő oszlopon kromatografáljuk, közel semlegestől enyhén lúgos pH-tartományban; az oszlop szelektíven köti az IL—4-et, majd az IL-4 izokratikus elúciója következik;

(ii) az (i) lépésben kapott eluátumot egy viszonylag kis kationcserélő oszlopon [az (i) lépésnél használt ágytérfogat 15%-a) kromatografáljuk közel semlegestől enyhén lúgos pH-tartományban; az IL-4 leoldását prádiens elúcióval végezzük;

(iii) az (ii) lépésben kapott eluátumot affinitásoszlopon kromatografáljuk, kelát-agaróz gél oszloprendszeren, közel semlegestől enyhén lúgos pH-tartományban, majd az IL—4-et savanyú pufferrel oldjuk le;

HU 215 257 Β (iv) az (iii) lépésben kapott eluátumot ultraszűrő membránon (kizárási molekulatömeg-határ: 10000) koncentráljuk; és (v) az aktív IL-4 (iv) lépésben kapott koncentrált oldatát méretkizáró oszlopon, gélszűréssel kromatografáljuk, savanyú pH mellett, majd a tisztított IL-4 oldatot összegyűjtjük.

A kationcserélő kromatografálást két lépésben végezzük. Először a CHO-sejttenyészlevet megszűrjük, hogy a szennyező nagy sejttörmelékeket eltávolítsuk, majd diaszűrő membránon 100 mg/ml proteintartalomra koncentráljuk, és a pH-t 7,1-7,3-ra, előnyösen 7,2-re állítjuk be. [A membránszűrő előnyösen egy keverővei felszerelt cella, olyan membránnal ellátva, amely minden 10000-nél nagyobb molekulatömegű anyagot visszatart; ilyen például az Amicon Co. (USA) YM-10 membránja, vagy a Millipore Corp. (USA) Pellicon szűrője PTGC kazettákkal]. Az első lépésben a nyers tenyészlevet kationcserélő oszlopra visszük fel, például S-Sepharose Fást Flow oszlopra (legfeljebb 100 mg protein/ml gyanta), amelyet foszfátpufferrel hoztunk egyensúlyba. A puffer pH-ja közel semleges vagy enyhén lúgos, azaz pH=6,7-8,0, előnyösen 7,2 és 0,12 M nátriumkloridot tartalmaz. Ennek eredményeként az aktív IL—4 visszamarad az oszlopon, és a nem kívánt proteinek és más szennyeződések legnagyobb része kimosódik. Az oszlopról az aktív IL-4 izokratikus leoldását ezután nátrium-foszfát pufferrel végezzük, előnyösen egy pH=7,l-7,3, leginkább pH=7,2 pufferrel, mely 20 mM nátrium-foszfátot és körülbelül 0,26 M nátrium-kloridot tartalmaz. Az aktív IL-4-et tartalmazó frakciókat - a meghatározást SDS-PAGE- és proteinanalízissel végezzük - egyesítjük, és az oldatot pH=7,2-re és 14 mS-re állítjuk be.

A második lépésben az első lépésben beállított oldatot egy viszonylag kis kationcserélő oszlopra visszük fel - ennek az ágytérfogata az első lépésben használt kationcserélő oszlop 15%-át teszi ki -, amelyet foszfátpufferrel hoztunk egyensúlyba. A szennyeződések kimosódnak, és az aktív IL-4 az oszlopon marad. Az aktív IL-4 kioldása nátrium-klorid grádienssel - 1,75 mS per ágytérfogat - történik. A kioldópufferek egy alacsony sótartalmú pufferből - 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,12 M nátrium-klorid - és egy magas sótartalmú pufferből - 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,50 mM nátrium-klorid - állnak. Az aktív IL-4 tartalmú gradiensfrakciókat - SDS-PAGE- és proteinvizsgálattal meghatározva - egyesítjük, és az oldatot pH=7,2-re és 45-50 mS-re állítjuk be.

A kationcserélő kromatográfiával kapott aktív IL-4 frakciók elegyét, melynek tisztasága 60-70%-os, ezután affinitáskromatografiának vetjük alá fém-kelátagaróz oszlopon, amelyet fémsóval kezelt kelátSepharose gél, azaz kelát-Sepharose Fást Flow vagy kelát-Sepharose 6B felhasználásával készítünk. A kelátoszlopok két részből állnak egyetlen oszlopon belül. Az oszlop felső része fémsóval kezelt kelát-agaróz gélt tartalmaz, előnyösen kobalttal kezelt kelát-Sepharose Fást Flow gélt, és az oszlop alsó része kezeletlen kelátSepharose Fást Flow gélt. A két réteg térfogataranya a következő: 2,3-3,0 térfogat kobaltsóval kezelt kelátSepharose Fást Flow, 1 térfogat kezeletlen kelátSepharose. Ha a kationcserélő kezelés után kapott tisztított IL—4-elegyet felvisszük az oszlop tetejére, az átfolyó oldat átmegy az oszlop alsó részén, ahonnan az átfolyó folyadékban maradt minden szennyezés eltávozik.

Egy közel semleges, előnyösen pH=7,2 és előnyösen körülbelül 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó puffer használata következtében az affinitáskromatografia alkalmazása esetén az IL-4 molekulák szelektíven kötődnek a fém-kelát-agaróz gél oszlophoz, előnyösen a kelátSepharose Fást Flow vagy a Sepharose 6B oszlophoz, az oldatban jelen lévő szennyező proteinek lényegében teljes kizárása mellett. Az aktív IL—4 az oszlopokon marad, izokratikus kioldását gyengén savanyú, előnyösen pH=6,0 pufferrel végezzük, mely 0,5 M nátrium-kloridot tartalmaz.

Az affinitáskromatografáló oszlopról kapott aktív IL-4 tisztított oldatát ultraszűrő membránon (kizárási molekulatömeg: 10000) koncentráljuk, előnyösen olyan membránnal ellátott keverős cellán, amely visszatart minden olyan anyagot, melynek 10000-nél nagyobb a molekulatömege, s ez a nagyságrend foglalja magába az IL-4-et. Előnyös membrán az Amicon Co. (USA) által gyártott YM-10 membrán. A kapott koncentráció legalább 20 mg/ml. Két diaszűrő puffért használunk, az első egy 20 mM nátrium-foszfát puffer, pH=6,0,0,5 M nátrium-kloriddal és a második puffer előnyösen egy 10 mM nátrium-citrát puffer, pH=4,5.

Az aktív IL-4-tartalmú koncentrált eluátumokat méretkizáró gélszűrő oszlopra visszük fel, amely az oldatban lévő proteineket molekulatömegük szerint frakcionálja. Alkalmas tipikus oszlop például a Sephacryl S-200 HR vagy S-100 HR (Pharmacia) gélszűrő oszlop. A Sephacryl S-200 HR (high resolution) és az S-100 HR az allil-dextrán és az N,N’-metilén-bisz-akrilamid térhálósított kopolimerje. Frakcionálási tartományuk 5000-250000 D, illetve 1000-100000 D. További alkalmas anyagok például a Pharmacia-féle Sephadexek, amelyek térhálós dextrán gélek. Előnyös, ha az aktív IL-4 oldatát egy előzőleg 10 mM citrát pufferrel (pH=4,5) egyensúlyba hozott S-200 HR oszlopra visszük fel.

A találmány kivitelezésére szolgáló egy előnyösebb eljárás a következő lépésekből áll:

(i) a CHO-sejttenyészléből származó aktív rekombináns humán IL-4 nyers pufferolt oldatát kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk térhálósított agaróz oszlopon (előnyösen S-Sepharose Fást Flow) 0,12 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM foszfát pufferben (pH=6,7-8, előnyösen pH=7,2), 13-15 mS (előnyösen 14 mS) mellett; ezután az oszlopról izokratikus elúcióval, 0,26 mM nátrium-klorid-tartalmú 20 mM foszfát pufferrel (pH=7,1-7,3, előnyösen pH=7,2) leoldjuk az aktív IL-4et, majd az aktív IL-4 tartalmú frakciókat összegyűjtjük;

(ii) az (i) lépésben kapott ILN oldatot további kationcserélő kromatografálásnak vetjük alá, ugyanolyan térhálós agaróz oszlopon, mint amit az (i) lépésben használtunk, de ennek az ágytérfogata körülbelül 15%kal kisebb, mint az (i) lépésben használt oszlopé, a hasz11

HU 215 257 Β nált puffer 0,112 M nátrium-kloridot tartalmaz és pH-ja 7,2-7,5, előnyösen pH=7,2; a gradiens elúciót egy 0,12-0,50 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM foszfát pufferrel (pH=7,2) végezzük és az aktív IL-4 tartalmú frakciókat egyesítjük;

(iii) az (ii) lépésben pH=7,2 mellett kapott aktív IL-A frakciók elegyét affinitáskromatográfiával, fémkelát-agaróz gél oszlopon tisztítjuk; az oszlop felső része előnyösen kobalt-kelát-Sepharose Fást Flow vagy 6B gélt tartalmaz és az alsó része kezeletlen kelátSepharose Fást Flow gélből áll, 0,5 M nátrium-kloridtartalmú 20 mM foszfát pufferben (pH=7,2); a két rész térfogataránya a következő: 2,3-3,0 térfogat kobalttal kezelt kelát-Sepharose és 1 térfogat kezeletlen kelátSepharose; az oszlopot kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, ezután az aktív IL—4-et 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó foszfát pufferrel (pH=6,0) eluáljuk, majd a frakciókat összegyűjtjük; és (iv) az (iii) lépésben kapott IL-4 frakciók elegyét koncentráljuk és diaszűrjük 20 mg/ml koncentrációig, pH 4,5 mellett; a használt ultraszűrő membrán a 10 000nél nagyobb molekulatömegű anyagot visszatartja; a készülék előnyösen egy membránnal - ilyen például az YM-10 - felszerelt keverés cella; a koncentrált aktív IL^4-et azután méretkizáró (gélszűrő) kromatografáló oszlopra visszük, amely az oldatban lévő proteineket molekulatömegük szerint frakcionálja; a töltet allildextránból és Ν,Ν’-metilén-bisz-akrilamidból térhálósított kopolimer, mely előnyösen Sephacryl S-200 HR 10 mM nátrium-citrát pufferben (pH=4,5); ezután az aktív IL-4 frakciókat összegyűjtjük.

Az (i) és (ii) lépésben a frakciók pH-ját 7,2-re állítjuk be, a vezetőképességet 13-15 mS-re állítjuk be 4 M nátrium-kloriddal. A két kationcserélő oszlop ágytérfogatának aránya a következő: 2,3-3,0 térfogat S-Sepharose oszlop az (a) lépésben és 1 térfogat kationcserélő oszlop a (b) lépésben. A kromatografáló oszlopban lévő kationcserélő gélt 0,12 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM foszfát pufferrel (pH=7,2) hozzuk egyensúlyba. Előnyös kationcserélő a -CH₂So₃ ^_ Na⁺ csoportokkal szubsztituált térhálós agaróz, ilyen például a Pharmacia cégtől beszerezhető S-Sepharose Fást Flow. Az (a) lépésben az aktív IL-4 izokratikus kioldása 0,26 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM foszfát pufferrel történik pH=7,2 mellett. Azokat a frakciókat, amelyekben SDS-PAGE analízis és protein meghatározás alapján a legmagasabb az aktív IL-4 koncentrációja, egyesítjük. Az egyesített frakciók oldatának a pH-ját 7,2-re és vezetőképességét 13-15 mS/ágytérfogat értékre állítjuk be 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2). Az IL-4 tartalmú frakciókat - SDS-PAGE analízis és protein meghatározás alapján - egyesítjük. A kationcserélő kromatográfia feltételeit úgy választjuk meg, hogy az aktív IL-4 frakció kötődjön a kationcserélő mátrixhoz. A közel semleges 7,2-es pH - mely viszonylag magas kationcserélő kromatográfiához - és a 13-15 mS vezetőképesség - mely szintén viszonylag magas a kationcserélő kromatográfiához - enyhe kötési feltételeket eredményez, így a szennyeződések nagy része nem kötődik az oszlophoz, a kioldás viszonylag könnyen megy és nagy tisztaságú aktív IL-4-et kapunk. A tisztasági fok körülbelül 60-70%-os.

Az (iii) lépésben használt előnyös fém-kelát-agaróz a kelát-Sepharose Fást Flow, bár a kelát-Sepharose 6B szintén megfelel. A Sepharose-ok gyártója a Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey, USA). A találmány szerinti felhasználáshoz alkalmas kobalt-kelátSepharose oszlopot előnyösen a következőképpen készítjük el: a Sepharose gélt 0,02 M kobalt-acetát oldatban szuszpendáljuk és ionmentesített vízzel mossuk, majd kiegyensúlyozó puffért - 0,5 M nátrium-kloridtartalmú 20 mM nátrium-foszfát puffért (pH=7,2) - engedünk át az oszlopon; kobalt-acetát helyett más kobalt sók is használhatók, például a kobalt-klorid vagy a kobalt-szulfát.

A kromatografáló oszlop két réteget tartalmaz, az első vagy felső réteg fém-kelát-Sepharose gélből áll és a második vagy alsó réteg olyan kelát-Sepharose gélt tartalmaz, amelyet nem kezeltünk fémsóval. A kettős oszlop térfogataránya a következő: 2,3-3,0 térfogat fémmel kezelt kelát-Sepharose és 1 térfogat kezeletlen kelát-Sepharose. Előnyös fém a kobalt.

Az oszlopok kiegyensúlyozásához a 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M foszfát puffer (pH=7,2-7,5) előnyös.

Az (iii) lépésben a kobalt-kelát-Sepharose és a kezeletlen Sepharose géleket egy 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó, pH=7,2, foszfát pufferrel hozzuk egyensúlyba, majd az adszorbeált aktív IL-4 izokratikus kioldását a kobalt-kelát-Sepharose-ról a kezeletlen kelátSepharose-on keresztül 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú, 0,02 M foszfát pufferrel (pH=6,0) végezzük, vagy semleges pufferrel, mely 0,5 M nátrium-kloridot és/vagy (i) egy kelátképző szert - például 50 mM EDTA-t (etiléndiamin-tetra-ecetsav) - vagy (ii) egy hisztidin analógot - például 50 mM imidazolt, vagy (iii) a 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó, pH=6,0, foszfát puffért. Az aktív IL-4-et tartalmazó eiuátumot összegyűjtjük. Azokat a frakciókat, amelyek hagyományos SDS-PAGE és protein meghatározás szerint a legmagasabb koncentrációban tartalmazzák az aktív IL—4-et, egyesítjük.

Az (iv) lépésben az (üi) lépésben leoldott frakciók elegyét koncentráljuk és diaszűrjük, majd gélszűrő kromatografálásnak vetjük alá. A leoldott frakciókat olyan membránnal felszerelt keverős cellában koncentráljuk, amely visszatart minden olyan anyagot, amelynek 10 000-nél nagyobb a molekulatömege. Ezután diaszűrést végzünk, először egy 0,05 M EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) és 0,5 M NaCl tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=6,0) szemben, majd ezután 0,01 M nátrium-citráttal (pH =4,5) szemben. Minthogy az eljárásnak ebben a szakaszában az aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 90-95%-os, a koncentrált oldat a membránon marad. Előnybe helyezzük az Amicon Co. (USA) által gyártott YM-10 membránt. A kapott aktív IL-^1 koncentrációja körülbelül 20 mg/ml. Az aktív IL—4 koncentrált eluátumait méretkizáró (gélszűrő) oszlopra visszük, amely az oldatban lévő proteineket molekulatömegük alapján frakcionálja. Tipikusan alkalmas oszlop a Sephacryl S-200 HR vagy S-100 HR (Pharmacia)

HU 215 257 Β gélszűrő oszlop. A Sephacryl S-200 HR (high resolution) és az S-100 HR az allil-dextrán és az N,N’-metilén-bisz akrilamid térhálós kopolimeqe. Frakcionáló tartományuk 5000-250 000, illetve 1000-100000. Alkalmas anyagok még a Sephadex-ek (Pharmacia), melyek térhálós dextrán gélek. Előnyös, ha az aktív IL-4 oldatot egy S-200 HR oszlopon kromatografáljuk, amelyet előzőleg 10 mM nátrium-citrát pufferrel (pH=4,5) hoztunk egyensúlyba. Az (iv) lépés feltételei mellett a stabil IL-4 elérheti a 20 mg/ml koncentrációt. Ez növeli a gélszűrő kromatográfia kapacitását és teljesítményét.

Az eluátum azon frakcióit, amelyek SDS-PAGE és proteinmeghatározás alapján az aktív IL-4 legmagasabb koncentrációit tartalmazzák, összegyűjtjük és egyesítjük, s így egy 95-99%-os tisztaságú aktív IL^4 oldatot kapunk.

A fent ismertetett adatokat a találmány referenciaként tartalmazza, ugyanis a hIL-4 előállítására alkalmazott CHO expressziós rendszer szerkesztésében használt anyagok és módszerek fontos ismeretanyagot szolgáltatnak.

E. coli eredetű humán IL-4 szerkezete és jellemzése

A) A pRGT857-l 1 humán IL—4 expressziós plazmid szerkesztése

A pAH3, pKGT269-2 és pUC19 humán expressziós plazmidok szerkesztését a következő közlemények ismertették: Lundell et al., J. Ind. Microbiology (1989) és Yanisch-Perron et al., Gene, 33, 103-119 (1985). A pEGT857-ll megszerkesztése érdekében Aval restrikciós endonukleázzal emésztjük a pAH3 plazmidot. Az enzimhatásra keletkezett 5’ túlnyúló részt az E. coli Poll Klenow fragmentje segítségével betöltjük és a DNS-t Pvul-gyel emésztjük. Az IL=4-et és a lati szakaszokat hordozó 5,8 kb hosszú fragmentumot a pUC replikációs origót tartalmazó pUC191,4 kb hosszú PvuII-PvuI fragmentumához ligáljuk. Az E. coli transzformálását követően egy olyan ampicillin rezisztens IL—4 expressziós plazmid, amely a pUC replikációs origót tartalmazza, adja a pRGT839-2 plazmidot.

A pRGT839-2 és pKGT269-2 plazmidot ezután AatlI-vel és Pvul-gyel emésztjük. A pRGT839-26,7 kb fragmentumát, amely az IL—4 és laci szakaszokat hordozza, a kloramfenikol-rezisztenciát kódoló pKGT2692-ből származó kis 1 kb fragmentumhoz ligáljuk. A ligáz reakcióelegyet használjuk az E. coli 294 transzformálására. A kapott transzformált sejtek közül egyet pRGT857-l 1 jelzéssel láttunk el. Ez az IL-4 expressziós plazmid kloramfenikol-rezisztenciát, valamint pUC replikációs origót tartalmaz. Ezt követően ezt a plazmidot használjuk az E. coli RL 7321 transzformálására.

B) Gazda baktérium

Az E. coli KI2 gazdaszervezet hordozza a humán IL-4 termeléséhez használt pRGT857-ll plazmidot. A E. coli RL 7321 törzs a Bolivár és munkatársai [Methods in Enzymology, 68. kötet, 245-267. oldalak, szerk.: Ray Wu, Academic Press (1979)] által leírt E. coli MM294 törzs egy származéka. Ez a törzs megfelel az EK 1 gazdákra megállapított irányelveknek. Az E. coli RL 7321-et a következőképpen izoláljuk E. coli MM294-ből:

Az E. coli MM294 sztreptomicin rezisztens formáját -jele: E. coli 294S - először úgy izolálták, hogy az előbbi törzsbe transzdukció révén bevitték a Pl cml clrlOO bakteriofágot [J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y.], melyet E. coli PAM 163ban [B. F. Johnson, Fine structure mapping and properties of mutations suppressing the ion mutation in Escherichia coli K12 and B strains, Génét. Rés., 30, 273-286 (1977)] tenyésztettek.

Az E. coli 294S törzset ultraibolya fénnyel mutagenizáljuk és így egy olyan törzset kapunk, amelynek hiányos a külső membránszerkezete. A sejteket 40 másodpercig UV lámpával sugározzuk be. Ez a kezelés 99,9%-ban okoz sejtpusztulást, ami teljes táptalajra való leoltással határozunk meg. A mutagenizált sejtszuszpenziót hígítjuk és rázás közben 37 °C-on, sötét helyen órán át inkubáljuk.

Ekkor T7 vad típusú bakteriofágot adunk a szuszpenzióhoz 10⁸ plakk képző egység/ml mennyiségben. A T7 bakteriofágot szelekciós célra használják a külső membránjukban mutációkat tartalmazó baktériumok feldúsítása céljára. Minthogy a T7 receptor - egy külső membrán protein - lipopoliszaccharidon helyezkedik el, bizonyos külső membrán mutációk T7 fertőzéssel szembeni rezisztenciát eredményeznek. Azok a sejtek, amelyeknek a külső membránja vadtípusú, érzékenyek lesznek a fertőzésre és így elpusztulnak. Az alább tárgyalt szivárgó fenotípust a külső membrán megnövekedett permeábilitása jellemzi. Branes és munkatársai [J. of Bacteriology, 154, 1462-1466 (1983)] kimutatták, hogy a T7 bakteriofágrezisztencia felhasználható a külső membránsérülés jelzésére.

A T7 fertőzés után a palackokat 37 °C-on rázzuk, amíg sejtlízis észlelhető (körülbelül 30 per). A T7 rezisztens sejteket centrifúgálással gyűjtjük össze és 1 ml friss levesben reszuszpendáljuk. Ezeket a sejteket ΊΎΕ (Trypton:élesztőkivonat:nátriumklorid=10:10:5) agar lemezekre szélesztjük és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A lemezek 24 óra múlva 30-50 telepet tartalmaznak. Ezekben a telepekben a baktériumok külső membránja sérült. Az alábbi módszerrel vizsgáljuk az RNázI táptalajba való szivárgásának növekedését. A T7 bakteriofágrezisztens kiónok egyedi telepeit olyan friss TYE agar lemezekre szélesztjük, amelyekre ml 1% élesztő RNS (Sigma Co.) tartalmú TYE agart (pH=7) rétegeztünk. Egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk a lemezeket, majd leöntjük 1 n sósavval. A táptalajba RNáz aktivitást áteresztő törzseket a gyűrű méretével határozzuk meg [R. A. Weigand és Rothfield, J. of Bacteriology, 125, 340-345 (1976)]. Az E. coli külső membránsérülésének egy második indikátora, hogy nem képes MacConkey agaron nőni [R. E. W: Hancock, An. Rév. Microbiol., 38, 237-264 (1984)]. A kapott 30 T7 rezisztens telep közül egy, amely különösen érzékenynek mutatkozott MacConkey agarra, és jelentős mennyiségű periplazmatikus RNázI-et bocsátott ki, RL7 jelzést kapott.

E. coli RL7 sejteket pAH3 huIL-4 expressziós vektorral transzformálunk. Ez a vektor vezeti be a limfokint

HU 215 257 Β a belső sejtmembránon keresztül a periplazmatikus térbe. A transzformált sejtek által használt tápoldatot a kibocsátás szempontjából Western biot analízissel szűrjük az alábbiakban ismertetett huIL-4 poliklonális antitest felhasználásával. Az RL7/pAH3 sejteket - mint fent - UV fénnyel mutagenizáljuk. Sötét helyen 2 órán át tartó tenyésztés után a besugárzott sejteket ampicillinnel (100 mg/ml) kiegészített TYE agar lemezekre oltjuk és 30 °C-on egy éjszakán át inkubáljuk. A lemezeket a „double disc assay”-vel (kettős korong meghatározással) szűrjük megnövekedett huIL-4 kibocsátásra, amelyet a mutáns telepek intenzívebb szintképződése jelez. A double disc assay-t a következőképpen végezzük:

A mutagenizált sejteket hígítjuk és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó TYE agar lemezekre (átmérő: 142 mm) szélesztjük (0,1 ml lemezenként). A lemezek egy éjszakán át tartó 30 °C-on való inkubálás után 500-2 000, körülbelül 1 mm átmérőjű telepet tartalmaznak. A lemezeket ezután 137 mm-es, 0,45 μ pórusú nitrocellulóz koronggal (Schleicher és Schuell) fedjük be. A korongot az egyik szélétől kezdve óvatosan helyezzük el, hogy fokozatosan és egyenletesen nedvesedjék át. A korongot egy mozdulattal hirtelen visszaemeljük úgy, hogy a telepeket az agarlemezről a nitrocellulóz korong felemelje. Ez a korong az a nitrocellulóz korong volt (vagy korongok), amelyet előzőleg egy steril agarlemez felületére helyeztünk. A lemezeket ezután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. Inkubálás után az alsó korongot (vagy korongokat) elválasztjuk a telepeket hordozó korongoktól. A szűrőkorongokat 1% BSA (bovin serum albumin) tartalmú TBST oldatban [10 mM trisz (pH=8), 150 mM NaCl és 0,05% (térf./térf.) Tween 20 (BioRad; Enzyme Immuno Assay Purity)] szobahőmérsékleten 60 percig inkubáljuk. Ezután a szűrőket vagy nyúl poliklonális antiszérummal (1:1 500 hígítást TBST/BSA-val; ossz huIL-4 meghatározására) vagy monoklonális antiszérummal [(11B4) hibridoma tenyészet felülúszó 1:10 hígítása TBST/BSA-val; a natív konformációjú protein meghatározására] szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A szűrőket háromszor mossuk TBST-ban, majd a megfelelő alkalikus foszfatázzal konjugált második antitesttel inkubáljuk 30 percig. A szűrőket háromszor mossuk és alkalikus foszfatáz szubsztrátummal (ProtoBlot System; Promega Biotec.) festjük. A biotokat ezután az alaplemezekhez igazítjuk és azokat a telepeket választjuk ki, amelyek erősebb huIL—4 specifikus festődést mutatnak.

A gyanús telepeket ezután úgy mentesítjük a plazmidtól, hogy folyamatosan nem szelektív táptalajra visszük át, majd nem szelektív TYE lemezekre szélesztjük. Az ampicillin lemezeken való növekedésük szempontjából negatívnak számító telepeket plazmidmentességre vizsgáljuk, majd ezután újból transzformáljuk pRGT857-ll humán IL-4 expressziós plazmiddal. Ezeket a kiónokat megnövekedett huIL-4 kibocsátásra szűrjük 10 ml-es kémcső fermentációkból kapott levesek dót immunobiot analízisével. A kimutatást humán IL-4 elleni monoklonális antitesttel (11B4) és alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-patkány IgG-vel végezzük. Egy törzs, amely erős termelő törzsnek bizonyult, RL737 jelzést kapott.

E. coli RL731/pRGT857-l 1 sejteket UV fénnyel mutagenizálunk, mint fent. Sötét helyen, megfelelő tenyésztés után a sejteket antibiotikummal és 1 mM IPTG-vel (izopropil-P-D-tiogalaktozid) kiegészített TYE agar lemezre szélesztjük. Az RL731/pRGT857-l 1 nem nő IPTG indukciós anyag jelenlétében. A sejteket 10⁴ telepképző egység/ml (cfu/ml) sűrűségben lemezre oltjuk. Egy éjszakán át tartó tenyésztés alatt lemezenként körülbelül 5-10 telep fejlődik. Szélesztéssel több mint 75 telepet tisztítottunk és vizsgáltunk huIL-4 termelésre. A termelés szintjét Western biot analízissel határoztuk meg. A legnehezebb sávot mutató kiónokat, mint előbb, plazmidmentesítettük, majd újra transzformáltuk pRGT857-l 1-gyel és vizsgáltuk, hogy megtartották-e magas szinten huIL—4 termelő képességüket. A legmegfelelőbb tulajdonságokat hordozó törzset, amely biológiailag aktív huIL—4-et termelt és bocsátott ki és a huIL—4 expressziós indukciója után is növekedett, RL7321 jelzéssel láttuk el.

A humán interleukin-4 (rhIL-4) fermentációja folyamán a termék közvetlenül a fermentlébe szekretálódik. A kezdeti lépésekben a fermentlevet elválasztjuk a sejtektől, ezután a leves rhIL-4 tartalmát koncentráljuk. Ennek a feladatnak a végrehajtására két külön eljárás alkalmazható: egy membrán eljárás és egy triklór-ecetsavas-nátrium (TCA-Na) eljárás. A TCA-Na eljárás szerint a sejteket a TCA-só hozzáadása inaktiválja. A sejtek eltávolítása után a leves pH-ját levisszük az rhIL—4 kicsapása céljából, majd a levest lecentrifugáljuk, hogy az rhIL—4-et üledék vagy csapadék formájában kapjuk meg. A membrán eljárásban mikroszűrést és ultraszűrést alkalmazunk, hogy az rhIL-4-et koncentrált folyadék formájában kapjuk meg. Ez az eljárás több pufferes mosást alkalmaz a kitermelés fokozására.

A fermentlé nyers koncentrátumából az rhIL—4 tisztítását immobilizált fém-affinitás kromatográfiával végezzük, fém-kelát oszlopon (például Zn-Sepharose alkalmazásával). A kiválasztott frakciókat egyesítjük és a továbbiakban kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk szulfonát oszlopon (például S-Sepharose alkalmazásával).

A kiválasztott frakciókat egyesítjük, koncentráljuk és diaszűijük olyan ultraszűrő készüléken, amely a névleges molekulatömegnek megfelelő membránnal van ellátva, s így a termék a koncentrátumban marad (ilyenek például a Millipore PTGC ultraszűrő membránok). A diaszűrt koncentrátumot ezután gélszűrő kromatografáló oszlopon (például S-200 HR oszloppal) tovább tisztítjuk. Ezután a tisztított rhIL—4 terméket tartalmazó frakciók elegyét megszűrjük és -20 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk.

Az E. coli eredetű aktív rekombináns humán IL—4 nyers oldatának tisztítására szolgáló eljárás tehát a következő lépésekből áll:

(i) az említett IL-4 semleges vagy enyhén lúgos pHra pufferolt nyers oldatát, mely körülbelül 0,5-1,5 mól nátrium-kloridot tartalmaz, affinitás kromatográfiával tisztítjuk fém-kelát-agaróz gélen, amely szelektíven köti az IL-4-et;

HU 215 257 Β (ii) az oszlopot először 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM nátrium-éfoszfát kiegyensúlyozó pufferrel (pH=7,2) mossuk, azután 10 térfogatszázalék glicerint és körülbelül 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel;

(iii) a megkötött IL—4-et eluáló pufferrel oldjuk el savanyú vagy semleges pH-jú pufferrel, mely kelátképző szert - hisztidin analógot vagy egy aminosavat tartalmaz;

(iv) az (iii) lépésben kapott aktív IL—4 eluátumot kationcserélő kromatografáló oszlopon, például S-Sepharose oszlopon (beszerezhető a Pharmacia Fine Chemicals cégtől) kezeljük közel semleges vagy enyhén savanyú pH-η és 15 mS vezetőképesség mellett; az S-Sepharose térhálós agaróz mátrix, amelyhez a -CH₂-SO₃~ Na⁺ ioncserélő csoport kapcsolódik;

(v) az (iv) lépésben kapott eluátumot ultraszűrő membránon (molekulatömeg kizárási határ: 10000) koncentráljuk;

(vi) a visszamaradt koncentrátumot gélszűrő kromatográfiával, méretkizáró oszlopon kezeljük; és (vii) a tisztított aktív IL-4-et összegyűjtjük.

A legelőnyösebb eljárás a következő lépéseket tartalmazza:

(i) az aktív rekombináns humán IL-A nyers oldatát affinitás kromatografáló oszlopra visszük, melynek töltete fém-kelát-agaróz gél, előnyösen kelát-Sepharose Fást Flow, 1,0 M nátrium-kloridot tartalmazó semleges vagy enyhén lúgos foszfát pufferben;

(ii) az oszlopot kétszer mossuk, először 1,0 M nátrium-kloridot tartalmazó, pH=7,2-7,5 foszfát pufferrel, azután 10 térfogat% glicerint és 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó foszfát pufferrel;

(iii) az aktív IL-4-et izokratikusan oldjuk le az oszlopról 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú kioldó acetát pufferrel, pH=5,0 mellett;

(iv) az (iii) lépésben kapott aktív IL-4 eluátumot foszfát pufferben, pH=6,75 és 15 mS vezetőképesség mellett kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk, például 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH=6,75) és 0,12 M nátrium-kloriddal egyensúlyba hozott S-Sepharose oszlopon; ezután gradiens elúciót végzünk 0,12-0,6 M nátrium-klorid-tartalmú foszfát pufferrel (pH=6,75);

(v) az (iv) lépésben kapott eluátumot ultraszűrő membránon koncentráljuk;

(vi) a koncentrált eluátumot gélszűrő kromatográfiával, 10 mM nátrium-citrát pufferrel (pH=4,5) kiegyensúlyozott méretkizáró oszlopon kezeljük; és (vii) a tisztított aktív IL-4 oldatot összegyűjtjük.

A találmány szerinti aktív IL-4 előállításához használt előnyös E. coli törzsek a következők:

RL2117/pRGT857-ll és

RL7321/pRGT857-ll.

Az (i) lépésben használt előnyös kelát-agaróz a kelát-Sepharose Fást Flow, bár a kelát-Sepharose 6B szintén megfelelő. A Sepharose-ok a Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ, USA) termékei. A találmányban alkalmazott előnyös cink-kelát-Sepharose oszlopot úgy készítjük el, hogy a Sepharose gélt betöltjük egy kromatografáló oszlopba, és ionmentesített vízzel mossuk. Ezt követően sóoldatot, előnyösen cinkacetát oldatot és ionmentesített vizet nyomunk át az oszlopon, majd egy kiegyensúlyozó puffért, például 1,0 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM nátrium-foszfát puffért (pH=7,2) szívatunk át az oszlopon. Cink-acetát helyett más cink sókat is használhatunk, például cinkkloridot vagy cink-szulfátot.

A kromatografáló oszlop két sorbakötött oszlopból áll. Az első vagy felső oszlop tartalmazza a cink-kelátSepharose gélt és a második vagy alsó oszlop olyan kelát-Sepharose gélt tartalmaz, amelyet nem kezeltünk cinksóval vagy más fémsókkal. A kettős oszlop térfogataránya a következő: körülbelül 3 térfogat cinksóval kezelt kelát-Sepharose és 1 térfogat kezeletlen kelátSepharose.

Az oszlopok kiegyensúlyozására használt előnyös puffer az 1,0 M nátrium-klorid-tartalmú foszfát puffer, pH=7,2-7,5.

Az (ii) lépésben speciális, kétrészes mosást alkalmazunk, először egy 1,0 M nátrium-kloridot tartalmazó kiegyensúlyozó foszfát puffért (pH=7,2), másodszor egy 10% glicerintartalmú és alacsony nátriumklorid koncentrációjú (150 mM) nátrium-foszfát puffért (pH=7,2-7,5) viszünk az oszlopra. A mosások eltávolítják a szennyezéseket, beleértve azokat is, amelyeket szoros rokonságuk miatt nehéz elválasztani. Az aktív IL-4 az oszlopon marad.

Az aktív IL-4 oldat pH stabilizálására előnyös puffer az 1,0 M nátrium-klorid-tartalmú foszfát puffer (pH=7,2). Ha a pufferolt nyers aktív IL—4 oldat átmegy az oszlopokon, az IL-4-et szelektíven abszorbeálják a gélek.

Az (iii) lépésben a cink-kelát-Sepharose és a kezeletlen kelát-Sepharose géleket 1,0 M nátrium-kloridot tartalmazó foszfát pufferrel (pH=6,75) hozzuk egyensúlyba, ezután az abszorbeált aktív IL-4-et izokratikusan eluáljuk - a kezeletlen kelát-Sepharose-on keresztül - a cink-kelát-Sepharose-ról 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó acetát pufferrel pH=5,0 mellett, vagy pedig semleges pH-jú pufferrel, amely kelátképző anyagot, például 50 mM EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsav) vagy egy hisztidin analógot, például 50 mM imidazolt vagy egy aminosavat, például 50 mM hisztidint tartalmaz. Előnybe helyezzük az acetát puffért. Az aktív IL—4 legmagasabb koncentrációit tartalmazó frakciókat - a meghatározás a hagyományos SDS-PAGE és protein analízisen alapul - egyesítjük.

Az (iv) lépésben az (iii) lépésben kapott frakciók elemek pH-ját 6,75-re állítjuk be és 20 mM pufferrel (pH=6,75) úgy hígítjuk, hogy az oldat vezetőképessége 15 mS legyen. A kromatografáló oszlopban lévő kationcserélő gélt 0,12 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM foszfát pufferrel (pH=6,75) hozzuk egyensúlyba. Előnyös kationcserélő a -CH₂-SO₃ ^_ Na⁺ csoportokkal szubsztituált térhálós agaróz, például az SSepharose Fást Flow, mely beszerezhető a Pharmaciatól. Az aktív IL—4-et gradiens elúcióval, 0,12-0,6 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM foszfát pufferrel (pH=6,75) oldjuk le. Az aktív IL-4 legmagasabb koncentrációit tartalmazó frakciókat - a meghatározás

HU 215 257 Β

SDS-PAGE és protein analízisen alapul - egyesítjük. A kationcserélő kromatográfia feltételeit úgy választjuk meg, hogy ezek biztosítsák az aktív IL-4 kapcsolódását a kationcserélő mátrixhoz. A közel semleges pH (pH=6,75), ami viszonylag magas a kationcserélő kromatográfia szempontjából és a 15 mS vezetőképesség, ami viszonylag szintén magas az ioncserélő kromatográfia szempontjából, enyhe kötési körülményeket eredményez, amikoris a szennyezések legnagyobb része nem kötődik az oszlophoz, a leoldás viszonylag könnyű, és ez nagytisztaságú, körülbelül 90-95%-os tisztaságú aktív IL-4 oldatot eredményez.

A (v) lépésben az (iv) lépésben leoldott frakciók elegyét koncentráljuk. A készülék egy keverős cella, amely olyan membránnal van ellátva, ami minden 10000-nél nagyobb molekulatömegű anyagot visszatart. Ez az anyag foglalja magába az aktív IL-4-et. Minthogy az eljárásnak ebben a szakaszában az aktív IL—4 oldat körülbelül 90-95%-os tisztaságú, az aktív IL-4-en kívül nagyon kevés olyan anyag van a koncentrált oldatban, ami a membránon fennmarad. Előnyös membrán az Amicon Co. (USA) által gyártott YM-10 membrán. A kapott koncentráció legalább körülbelül 20 mg aktív IL—4/ml.

A (vi) lépésben a (v) lépésből származó aktív IL—4 koncentrátumot méretkizáró gélszűrő oszlopra visszük fel, amely az oldatban lévő proteineket molekulatömegük szerint frakcionálja. Tipikusan alkalmas oszlop a Sephacryl S-200 HR vagy S-100 HR (Pharmacia) gélszűrő oszlop. A Sephacryl S-200 HR (high resolution) és S-100 HR allil-dextránból és Ν,Ν’-metilén-bisz-akrilamidból álló térhálósított kopolimer. Frakcionálási tartományuk 5000-250000, illetve 1000-100000 Dalton. Alkalmas anyagok még a Sephadex-ek (Pharmacia), melyek térhálós dextrán gélek. Előnyös, ha az aktív IL—4 oldatot S-200 HR oszlopra visszük fel, melyet előzőleg 10 mM citrát pufferrel (pH=4,5) hoztunk egyensúlyba. Az (vii) lépés feltételei mellett a stabil IL—4 koncentrátum elérheti a 20 mg/ml koncentrációt. Ez növeli a gélszűréses kromatográfia kapacitását és teljesítményét.

Az SDS-PAGE és protein analízissel való meghatározás szerinti legmagasabb aktív IL-4 koncentrációkat tartalmazó eluált frakciókat összegyűjtjük és egyesítjük. A kapott termék 95-99%-os tisztaságú aktív IL-4 oldat.

Az ebben az eljárásban használt pufferokat úgy választjuk meg, hogy azok megfelelő feltételeket biztosítsanak a kötéshez, mosáshoz és kioldáshoz, s hogy elősegítsék az aktív IL-4 adszorpcióját a kromatográfiás gélekhez, valamint az ezekről való szelektív leoldást. Előnyös pufferek a 20 mM nátrium-foszfát puffer vagy a nátrium-citrát, vagy nátrium-acetát puffer a példákban megadott koncentrációban és pH-val, valamint a speciális nátrium-klorid tartalommal. A pH beállítást nátriumhidroxiddal vagy savval végezzük. Az (ii) lépésben a két részből álló mosás első részét 1,0 M nátrium-kloridtartalmú 20 mM nátrium-foszfát kiegyensúlyozó pufferrel (pH=7,2) végezzük, a második mosáshoz a körülbelül 150 mM nátrium-kloridot és 10% glicerint tartalmazó foszfát puffer szükséges.

A cink-kelát-Sepharose oszlopokhoz használt pufferek nátrium-klorid koncentrációja a találmányban meghatározó jelentőségű, mivel a magas sótartalom - előnyösen az 1 M nátrium-klorid koncentráció - javítja a szolubilizált aktív IL-4 kinyerését a triklórecetsavas (TCA) üledékből, ugyanakkor fokozza az aktív IL—4 kötődését a fém-kelát-Sepharose-hoz. Ez a koncentráció elősegíti, hogy az IL-4 szelektívebben adszorbeálódjék a cink-kelát-Sepharose-oszlophoz, mint a fermentlé szennyeződései.

Injekció készítéséhez az IL-4 elegyet felolvasztjuk, és sterilizált vízzel és/vagy 10 mM citrát pufferrel hígítjuk.

1. példa

S-Sepharose Fást Flow oszlop készítése

Két kationcserélő oszlopot készítünk 0,12 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH=7,2), S-Sepharose Fást Flow kationcserélő gyantával. Az első oszlop 1,5 literes, átmérője 100 mm, magassága 45 cm, a második oszlop 0,25 literes, átmérője 50 mm, magassága 300 mm. A kisebb oszlop ágytérfogata a nagy oszlopénak 15%-a, ha mindegyik teljesen meg van töltve a kationcserélő géllel. Az oszlopokat a következőképpen töltjük be: az S-Sepharose Fást Flow kationcserélő gélt 20 mM nátrium-foszfát (pH=7,2) és 0,12 M nátrium-klorid összetételű pufferben felszuszpendáljuk. A gélt beöntjük a megfelelő kromatografáló oszlopba és vagy hagyjuk, hogy a folyadék átfolyjon az oszlop alján, vagy átnyomjuk a folyadékot az oszlopon.

Az oszlop tetejére folyadékadaptert helyezünk, majd a gélt 5 ágytérfogatnyi pufferrel - 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2,0,12 M nátrium-klorid - hozzuk egyensúlyba úgy, hogy a puffért átnyomjuk az oszlopon egyenletes, körülbelül 1 cm/perc sebességgel. A folyadékadaptert úgy állítjuk be, hogy szorosan illeszkedjék a gyantaágy tetejére. Ezután legalább 5 ágytérfogat puffért 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,12 M nátrium-klorid - nyomunk át az oszlopon körülbelül 1 cm/perc egyenletes sebességgel, és ha szükséges, addig nyomunk át puffért az oszlopon ugyanezen átfolyási sebesség mellett, amíg a kifolyó folyadék pH-ja 7,1-7,3 között nem lesz. Az oszlop ágytérfogatát úgy állítjuk be, hogy a kisebb oszlop ágytérfogata a nagy oszlopénak 15%-a legyen.

2. példa

Kobalt-kelát-Sepharose Fást Flow oszlop készítése

Kelát-Sepharose Fást Flow gélt szuszpendálunk 5 térfogat 0,02 M kobalt-acetátban, és egy éjszakán át állni hagyjuk, esetenként megkeverve. A gélt Büchner tölcséren, ionmentesített vízzel mossuk, majd 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) mossuk a gélt. Azután a gélt 0,5 géltérfogatnak megfelelő 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát pufferben (pH=7,2) felszuszpendáljuk. A kobalttal kezelt gél 190 ml-ét 50 mm átmérőjű, 300 mm magas oszlopba töltjük, és a folyadékot átnyomjuk az oszlopon. Az oszlopra folyadékadaptert helyezünk és a gél kiegyensúlyozása céljából 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát puffért

HU 215 257 Β (pH=7,2) nyomunk át az oszlopon, körülbelül 1 cm/perc sebességgel. A folyadékadaptert rászorítjuk az oszlop tetejére.

3. példa

Kelát-Sepharose Fást Flow oszlop készítése fémsóval való kezelés nélkül

Kelát-Sepharose Fást Flow gélt szuszpendálunk

0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM nátrium-foszfát pufferben pH=7,2 mellett. A gél 75 ml-ét a 2. példa szerinti kromatografáló oszlopba öntjük úgy, hogy a fémsó kezelés nélküli gél a kobalttal kezelt gél tetejére ülepedjen. Az oszlop tetejére folyadékadaptert helyezünk és a gélt 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=7,2) hozzuk egyensúlyba.

4. példa

A kobalt-kelát-Sepharose oszlop kiegyensúlyozása

Miután a 2. és 3. példa szerint elkészítettük a kobaltkelát-Sepharose Fást Flow és a kezeletlen kobaltSepharose oszlopot, megfordítjuk az oszlopot úgy, hogy a kobalttal kezelt gyanta kerüljön a kezeletlen gyanta tetejére, folytatjuk a puffer -0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát (pH=7,2) - átnyomását az oszlopon keresztül, amíg a kifolyó folyadék pH-ja el nem éri a 7,1-7,3 értéket.

5. példa

Sephacryl S-200 HR oszlop készítése

Legalább 1 ágytérfogat 10 mM nátrium-citrát puffért (pH=4,5) nyomunk át S-20Q HR gélt tartalmazó 1,8 literes, 50 mm átmérőjű, 100 cm magas kromatografáló oszlopon, körülbelül 0,2 cm/perc egyenletes sebességgel, az oszlop kiegyensúlyozása végett.

6. példa

Pufferek készítése (a) 0,02 M nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,12 M nátriumklorid

Ionmentesített vízben 2,78 g/1 nátrium-dihidrogénfoszfát monohidrátot, 7,03 g/1 nátrium-kloridot oldunk fel és megfelelő mennyiségű 6,3 n nátrium-hidroxiddal a pH-t 7,2 (±0,l)-re állítjuk be.

(b) 0,02 M nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,26 M nátriumklorid

Ionmentesített vízben 2,78 g/1 nátrium-dihidrogénfoszfát monohidrátot és 15,19 g/1 nátrium-kloridot oldunk fel, majd ph-ját 6,3 n nátrium-hidroxiddal

7,2 (±0,l)-re állítjuk be.

(c) 0,02 M nátrium-foszfát, pH77,2, 0,50 M nátriumklorid

Ionmentesített vízben 2,78 g/1 nátrium-dihidrogénfoszfát monohidrátot, 29,22 g/1 nátrium-kloridot oldunk fel és a pH-t megfelelő mennyiségű 50%-os NaOH-val

7,2 (±0,l)-re állítjuk be.

(d) 0,02 M nátrium-foszfát, pH=6,0, 0,05 M EDTA,

0,5 M nátrium-klorid

Ionmentesített vízben 2,78 g/1 nátrium-dihidrogénfoszfát monohidrátot és 19 g/1 etilén-diamin-tetraecetsavas nátriumot és 29,22 g/1 nátrium-kloridot oldunk fel. Az oldat pH-ját 6,3 n nátrium-hidroxid/4 n sósav hozzáadásával pH=6,0 (±0,l)-re állítjuk be.

(e) 10 mM nátrium-citrát, pH=4,5

100 liter ionmentesített vízhez hozzáadunk 210 g (2,1 g/1) citromsav monohidrátot. A citromsav oldódása után a puffer pH-ját - ha szükséges - 4 n sósav és 6,3 n nátrium-hidroxid hozzáadásával 4,5-re állítjuk be. Ezt a puffért használjuk diaszűréshez és ultraszűréshez, valamint a gélszűréses kromatografáláshoz.

(f) 20 mM nátrium-foszfát, pH=7,2

100 liter ionmentesített vízben rázás közben feloldunk 278 g nátrium-dihidrogén-foszfát monohidrátot. A puffer pH-ját 50%-os NaOH-val 7,2-re és vezetőképességét 2-4 mS-re állítjuk be.

7. példa

Nyers IL-4 oldat kezelése kationcserélő kromatográfiával

A nyers IL—4-et tartalmazó sejt tenyészlevet (összprotein körülbelül 14000g) pH=7,2 (±0,l)-re és vezetőképességét 14 (±0,1) mS-re állítjuk be. Az oldatot egyenletes, körülbelül 1,0 cm/perc vagy ennél kisebb sebességgel nyomjuk át az S-Sepharose kationcserélő oszlopon. Az oszlopot a 6. (a) példa szerint készített pufferrel mossuk. Az izokratikus elúciót a 6. (b) példa szerint készített pufferrel végezzük. Az aktív IL-4 tartalmú frakciókat - a meghatározást SDS-PAGE és protein analízissel végezzük - összegyűjtjük és egyesítjük. Az így kapott aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 50%-os.

8. példa

A részlegesen tisztított aktív IL-4 oldat gradiens elúciója kationcserélő oszlopról A 7. példa szerint előállított aktív IL—4 oldat pH-ját

7-7,2 (±0,l)-re állítjuk be szükség szerint vagy 4 n HCI vagy 6,3 n NaOH adagolásával. Az oldat vezetőképességét a 6. (f) példa szerint készített pufferrel 14 (±1) mS-re állítjuk be.

Az oldatot az 1. példa szerint készített oszlopon nyomjuk át egyenletes, körülbelül 1 cm/perc vagy ennél kisebb sebességgel. Az átfolyó oldatot 1 frakcióban fogjuk fel.

Az oszlopról való leoldást körülbelül 1,75 mS/ágytérfogat gradienssel és körülbelül 0,2 cm/perc egyenletes sebességgel végezzük.

A gradiensben használt alacsony sótartalmú puffért a 6. (a) példa szerint készítjük el. A gradiensben használt magas sótartalmú puffért a 6. (c) példa szerint készítjük el.

Leszedünk 5 nagy frakciót, mindegyik térfogata körülbelül 0,5 ágytérfogatnak felel meg. A többi frakciót (körülbelül 40-50) 0,1 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségekben szedjük.

A frakciókat SDS-PAGE és protein analízissel vizsgáljuk aktív IL-4-re. Az aktív IL-4 tartalmú frakciókat egyesítjük. A kapott aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 60-70%-os.

HU 215 257 Β

9. példa

Az aktív rekombináns humán interleukin-4 tisztítása kobalt-kelát-Sepharose kromatográfiával A 8. példa szerint kapott IL-4 oldat pH-ját

7,2 (±0,l)-re állítjuk be 4 n HCI és/vagy 6,3 n NaOH adagolásával.

Ha szükséges, az oldatot centrifugálással vagy mikroszűréssel derítjük. Az oldatot (körülbelül 3,3 mg protein/ml gél) a 4. példa szerint készített kobalt-kelátSepharose Fást Flow és kezeletlen kelát-Sepharose Fást Flow oszlopokon nyomjuk át körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel.

Az oszlopokat körülbelül 10 ágytérfogat 6. (c) példa szerint készített pufferrel mossuk, körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel és a mosófolyadékot legfeljebb 5 frakcióban gyűjtjük össze. Ezután az oszlopot körülbelül 10 ágytérfogat 6. (d) példa szerint készített pufferrel eluáljuk körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel. A leszedett frakciók térfogata körülbelül 0,2 ágytérfogatnak felel meg. Minden mintát SDS-PAGE és protein analízissel vizsgálunk aktív IL-4-re, majd az aktív IL-4 frakciókat egyesítjük.

A 9. példa szerint kezelt aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 90-95%-os.

10. példa

Ultraszűrés és koncentrálás

A 9. példa szerint kapott frakciók elegyét Amiconféle YM-10 membránnal felszerelt keverős cella alkalmazásával koncentráljuk úgy, hogy a 9. példa szerint kapott aktív humán IL-4-et tartalmazó frakciók elegyét egy tartályba öntjük és hozzáadunk körülbelül 0,25 térfogat 6. (d) példa szerint készített puffért. A térfogatot az eredeti térfogat körülbelül 0,2-ére koncentráljuk YM-10 membránon való ultraszűréssel. A visszamaradt koncentrátumot 4 térfogat 6. (e) példa szerint készített pufferrel hígítjuk és az oldatot ultraszűréssel körülbelül 0,2-ére koncentráljuk YM-10 membránon.

A koncentrálási lépést megismételhetjük a kezdeti egyesített frakciók térfogatának körülbelül 0,1-ének elérése céljából. Ezután a koncentrátumot megfelelő tartályba visszük át, és hidegszoba-hőmérsékleten tartjuk azonnali felhasználásra, vagy lefagyasztva, -20 °C-on tároljuk.

11. példa

Gélszűrő kromatográfia (méretkizárás)

A Sephacryl S-200 HR oszlopot a 6. (e) példa szerint készített pufferrel hozzuk egyensúlyba oly módon, hogy legalább 1 ágytérfogatnak megfelelő puffért nyomunk át az oszlopon körülbelül 0,2 cm/perc egyenletes sebességgel.

A 10. példa szerint kapott oldatot laboratóriumi centrifugán 30 percig tartó centrifugálással derítjük, 2-6 °C-on, 4500 fordulat/perc mellett. Az abszorpciót 280 nm-en (A₂₈₀) méijük és az oldatot a 6. (e) példa szerint készített pufferrel úgy hígítjuk, hogy 280 nm-en 5 optikai sűrűségi egységet (OD) kapjuk ml-enként.

A kapott oldatot Sephacryl S-200 HR oszlopra visszük körülbelül 0,1 cm/perc egyenletes sebességgel.

Folytatjuk a 6. (e) szerinti puffer átszívatását az oszlopon körülbelül 0,1 cm/perc átfolyási sebességgel. Egy nagy frakciót szedünk le, melynek össztérfogata 0,4-0,55 ágytérfogat, ezután 50 frakciót szedünk le. Egy frakció mennyisége körülbelül 0,01 ágytérfogatnak felel meg.

Az aktív IL—4 tartalmú frakciókat - a meghatározást SDS-PAGE és protein analízissel végezzük - kiválasztjuk. Az aktív IL-4 frakciókat egyesítjük és 0,2 μ-os steril szűrőn megszüljük. A kapott szűrletek SDS-PAGE analízis szerint 95-99%-os tisztaságú aktív IL—4 oldatok; a sejt tenyészlé aktív IL—4 tartalmára számítva a teljes kihozatal 70%-os.

Az interleukin-4 aktív frakciók meghatározásá-hoz hagyományos vizsgáló módszereket használunk. A tisztított IL-4280 nm-en mért UV abszorpciója alapján 1 ,θ A₂₈₀ optikai sűrűségi egység (OD) az aminosavösszetétel analízise szerint 1,6 mg-nak felel meg és a Lowry-féle módszer alapján 2,0 mg-nak felel meg.

12. példa

Cink-kelát-Sepharose Fást Flow oszlop készítése

A kelát-Sepharose Fást Flow gélt ionmentesített vízben szuszpendáljuk. Egy 3 literes oszlop készítéséhez a sűrű szuszpenziót 500 mm magas, 180 mm átmérőjű kromatografáló oszlopba töltjük. A folyadékot vagy hagyjuk kifolyni, vagy kinyomjuk az oszlop alján.

A folyadékadaptert ráhelyezzük az oszlopra és a gélt ionmentesített vízzel átnyomatva mossuk. A vizet 1 cm/perc egyenletes sebességgel nyomjuk át az oszlopon. A folyadékadaptert úgy állítjuk be, hogy erősen szoruljon a gyantaágy tetejére. Legalább 5 oszloptérfogat ionmentesített vizet nyomunk át az oszlopon körülbelül 1 cm/perc egyenletes sebességgel.

Foszfát pufferrel addig folytatjuk az oszlop átmosását körülbelül 1,0 cm/perc egyenletes sebességgel, amíg a kifolyó folyadék pH-ja a 7,1-7,3 közötti értéket el nem éri.

13. példa

Kelát-Sepharose Fást Flow oszlop készítése fémsóval való kezelés nélkül

Kelát-Sepharose Fást Flow gélt szuszpendálunk

1,0 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH=7,2). A gélt 1 literes oszlop készítéséhez 140 mm átmérőjű, 500 mm magas kromatografáló oszlopba töltjük, és az oszlop aljáról kifolyatjuk a folyadékot. A gélt körülbelül 5 ágytérfogat 1,0 M nátrium-klorid, 20 mM nátrium-foszfát összetételű, pH=7,2 pufferrel hozzuk egyensúlyba. A puffért körülbelül 1 cm/perc egyenletes sebességgel nyomjuk át az oszlopon. A puffer átnyomását az oszlopon ugyanezen átfolyási sebesség mellett folytatjuk, amíg a kifolyó folyadék pH-ja a 7,1-7,3 közötti értéket el nem éri.

14. példa

Sorbakötött oszlopok készítése

Miután a 12. és 13. példa szerint elkészítettük a cinkkelát-Sepharose Fást Flow és a kezeletlen kelátSepharose oszlopot, sorba kötjük az oszlopokat oly módon, hogy a folyadék először a cink-kelát oszlopba, azu18

HU 215 257 Β tán a cinkmentes (kezeletlen) oszlopba jusson. Az oszlopok közé nem szükséges buborékcsapdát beépíteni.

15. példa

S-Sepharose oszlop készítése

S-Sepharose gélt (kationcserélő gyanta) szuszpendálunk 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,12 nátrium-klorid és 0,001 etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) összetételű pufferben. A gélt 100 mm átmérőjű, 45 cm magas kromatografáló oszlopba töltjük, és vagy hagyjuk, hogy a folyadék kifolyjon az oszlop alján, vagy átnyomjuk a folyadékot az oszlopon.

Folyadékadaptert helyezünk az oszlop tetejére és a gélt 5 ágytérfogat 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,12 M nátrium-klorid, 0,001 M EDTA összetételű pufferei hozzuk egyensúlyba oly módon, hogy a puffért átnyomjuk az oszlopon körülbelül 1 cm/perc sebesség mellett. A folyadékadaptert úgy állítjuk be, hogy erősen szoruljon a gyantaágy tetejére. Ezután legalább 5 ágytérfogat 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,12 M nátrium-klorid, 0,001 M EDTA-tartalmú puffért nyomunk át az oszlopon körülbelül 1 cm/perc egyenletes sebességgel, amíg a kifolyó folyadék pH-ja a 6,6-6,9 közötti értéket el nem éri.

16. példa

Sephacryl S-200 HR oszlop készítése

Egy 50 mm átmérőjű, 100 cm magas kromatografáló oszlopba töltött S-200 HR gélen átnyomunk 1 ágytérfogat 10 mM nátrium-citrát puffért (pH=4,5) körülbelül 0,2 cm/perc egyenletes sebességgel, az oszlop kiegyensúlyozása céljából.

17. példa

Pufferek készítése (a) 0,02 M nátrium-foszfát, pH=7,2, 1,0 M nátriumklorid

Ionmentesített vízben feloldunk 2,78 g/1 nátriumdihidrogén-foszfát monohidrátot, 58,44 g/1 nátrium-kloridot, majd megfelelő mennyiségű 6,3 n nátrium-hidroxiddal az oldat pH-ját 7,2 (±0,l)-re állítjuk be. Nagy tételt kell készíteni, mivel a fém-kelát-Sepharose oszlopban lévő gél 1 literéhez legalább 30 liter puffer szükséges.

(b) 0,02 M nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,15 M nátriumklorid, 10% glicerin

Ionmentesített vízben feloldunk 2,78 g/1 nátrium dihidrogén-foszfát monohidrátot és 8,76 g/1 nátrium-kloridot. A pH-t 7,2 (±0,l)-re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxiddal. Az oldathoz annyi glicerint adunk, hogy koncentrációja 0,1 1/1 legyen. Ebből a pufferből 1 liter gélhez legalább 6 1-t kell használni, tehát annyi puffért kell készíteni, hogy elegendő legyen ahhoz a gélhez, amelyhez használni fogjuk.

(c) 0,02 M nátrium-acetát, pH=5,0,0,5 M nátrium-klorid

Ionmentesített vízben feloldunk 1,15 ml/1 99,7%-os ecetsavat és 29,2 g/1 nátrium-kloridot. A pH-t 5,0 (±0,1)re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxiddal. Ebből a pufferből 1 liter gélhez legalább 10 litert kell használni, tehát annyi puffért kell készíteni, hogy az elegendő legyen ahhoz a gélhez, amelyhez használni fogjuk.

(d) 0,03 M nátrium-foszfát, pH=7,0, 0,003 M EDTA

Ionmentesített vízben feloldunk 4,17 g/1 nátriumdihidrogén-foszfát monohidrátot és 1,14 g/1 tetra-nátrium-EDTA-t. A pH-t 7,0 (±0,l)-re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxiddal. A pufferből 1 liter gélhez legalább 2 litert kell használni, tehát annyi puffért kell készíteni, hogy az elegendő legyen ahhoz a gélhez, amelyhez használni fogjuk.

(e) 10 mM nátrium-citrát, pH=4,5

100 liter ionmentesített vízben feloldunk 210 g (2,1 g/1) citromsav monohidrátot. Ha szükséges, a puffer pH-ját 4,5-re állítjuk vagy 4 n sósavval, vagy 6,3 n nátrium-hidroxiddal. Ezt a puffért diaszűréshez, ultraszűréshez és gélszűrő kromatográfiához használjuk.

18. példa

Aktív rekombináns humán interleukin-4 tisztítása (Cink-kelát-Sepharose kromatográfia)

Az aktív humán rekombináns IL-4-et tartalmazó 700 liter fermentlevet 20 literre koncentráljuk, majd az oldat 25-szörös diaszűrését a 17. (a) példa szerinti pufferrel szemben végezzük. Az oldat pH-ját 7,2 (±0,l)-re állítjuk be 4 n sósavval és/vagy 6,3 n nátrium-hidroxiddal. Az oldat vezetőképességét 70-90 mS-re állítjuk be.

Az oldatot szűréssel derítjük és koncentráljuk. A szűrőt a 17. (a) példa szerint készített pufferrel mossuk és az oldat térfogatát újból 20 literre állítjuk be.

Az oldatot cink-kelát-Sepharose Fást Flow és a kezeletlen Sepharose Fást Flow oszlopon nyomjuk át körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel. Az átfolyó folyadékot 1 frakcióban fogjuk fel.

Az oszlopokat kétszer kell mosni, először körülbelül 10 ágytérfogat 17. (a) példa szerint készített pufferrel, körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel és a mosófolyadékot legfeljebb 5 frakcióban fogjuk fel, ezután körülbelül 5 agytérfogat 17. (b) példa szerinti pufferrel mossuk, körülbelül 0,5 cm/perc egyenletes sebességgel és a mosófolyadékot 1 frakcióban gyűjtjük össze.

Az oszlopról az aktív IL—4-et körülbelül 8 ágytérfogat 17. (c) példa szerint készített pufferrel eluáljuk körülbelül 0,25 cm/perc egyenletes sebességgel. A frakciókat körülbelül 0,2 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségű frakciókban, külön tartályokban gyűjtjük, amelyek a leszedett oldat 1 ml-ére számítva 0,5 ml 17. (d) példa szerint készített puffért tartalmaznak hígítószerként.

Minden mintát aktív IL-4-re vizsgálunk SDS-PAGE és protein analízissel.

A 18. példa szerint kezelt aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 20-40%-os. Nyers fermentlére számítva az aktív IL^t kitermelése 90%-os.

19. példa

Pufferek készítése S-Sepharose kromatográfiához (a) 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,12 M nátriumklorid, 0,001 M EDTA.

Megfelelő tartályba bemérünk 2,78 g/1 nátrium dihidrogén-foszfát monohidrátot, 7,03 g/1 nátrium-kloridot, 0,38 g tetra-nátrium EDTA-t és ionmentesített vizet. Az elegyet oldódásig rázzuk.

HU 215 257 Β

A pufferoldat pH-ját 6,75 (±0,l)-re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxiddal.

(b) 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,55 M nátriumklorid, 0,001 M EDTA

Megfelelő tartályba bemérünk 2,78 g/1 nátriumdihidrogén-foszfát monohidrátot, 32,14 g/1 nátrium-kloridot, 0,38 g/1 tetra-nátrium-EDTA-t és ionmentesített vizet. Az elegyet oldódásig rázzuk.

A pufferoldat pH-ját 6,75 (±0,l)-re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxiddal.

(c) 20 mM nátrium-foszfát, pH=6,75, 0,001 M EDTA

Megfelelően nagy tartályba bemérünk 2,78 g nátrium-dihidrogén-foszfát monohidrátot, 0,38 g/1 tetra-nátrium-EDTA-t és ionmentesített vizet. Az elegyet oldódásig rázzuk, majd a puffer pH-ját 6,75 (±0,l)-re állítjuk be 6,3 n nátrium-hidroxid oldattal.

20. példa

A tisztított aktív interleukin-4 oldat grádiens elúciója kationcserélő oszlopról A 7. példa szerint készített aktív IL-4 oldat pH-ját

6,75 (±0,l)-re állítjuk be, szükség szerint vagy 4 n sósavval, vagy 6,3 n nátrium-hidroxiddal.

Az oldatot 0,45 μ-os szűrőn átszűijük. A szűrőt körülbelül 1 liter 19. (c) példa szerint készített pufferoldattal mossuk át.

A kapott oldat vezetőképességét 15 (±0,5) mS-re állítjuk be a 19. (c) példa szerinti pufferoldattal.

Az oldatot a 4. példa szerint készített S-Sepharose oszlopon nyomjuk át körülbelül 1 cm/perc vagy ennél kisebb sebességgel. A kifolyó folyadékot 1 frakcióban gyűjtjük össze.

Az oszlopot körülbelül 5 ágytérfogat 19. (a) példa szerint készített pufferoldattal mossuk, körülbelül 1 cm/perc vagy ennél kisebb sebességgel.

A mosófolyadékot 1 frakcióban gyűjtjük össze. Az oszlop elúcióját körülbelül 4,5 mS per ágytérfogat grádienssel végezzük, körülbelül 0,2 cm/perc egyenletes átfolyási sebesség mellett.

A grádiensben használt alacsony sótartalmú puffért a 19. (a) példa szerint készítettük és 5 ágytérfogatnyit használunk fel belőle. A grádiens magas sótartalmú pufferét a 19. (b) példa szerint készítettük és 5 ágytérfogatnyi mennyiségét használjuk fel.

Öt nagy frakciót szedünk, mindegyik térfogata körülbelül 0,8 ágytérfogatnak felel meg.

A maradék frakciókat (körülbelül 40-50) 0,1 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségekben gyűjtjük.

A frakciókat aktív IL-4-re vizsgáljuk SDS-PAGE és protein analízissel.

Az aktív IL-4 frakciókat egyesítjük. A cink-kelát egyesített eluátumokban az aktív IL-4 mennyiségét véve alapul, az aktív IL—4 kitermelése 90%-os.

Az aktív IL-4 oldat tisztasága körülbelül 90-95%-os.

21. példa

Ultraszűrés és koncentrálás

A 20. példa szerint kapott egyesített frakciókat koncentráljuk. Amicon-féle YM-10 membránnal felszerelt keverős cellát használunk. A 20. példában kapott, aktív humán IL—4 tartalmú frakciók elegyét a tartályba öntjük és térfogatát eredeti térfogatának körülbelül 0,1-éré koncentráljuk YM-10 membránon való ultraszűréssel. A visszamaradt koncentrátumot 4 térfogat 17. (e) példa szerint készített pufferrel hígítjuk, majd térfogatának körülbelül 0,2-ére koncentráljuk ultraszűréssel YM-10 membránt használva.

A koncentrálási lépést megismételhetjük abból a célból, hogy az egyesített frakciók eredeti térfogatának körülbelül 0,1 -ét érjük el. A koncentrátumot megfelelő tartályba visszük át, és hideg szobában vagy -20 °C-ra lefagyasztva tároljuk.

22. példa

Gélszűrés

A 21. példa szerint készített oldatot centrifugálással derítjük, laboratóriumi centrifugán, 2-6 °C-on, 4500 fordulat/perc mellett, 30 percig tartó centrifugálással. Méljük az A₂₈₀ értékét, majd a 17. (e) példa szerint készített pufferrel úgy hígítjuk az oldatot, hogy 15 A₂₈₀/ml értéket érjen el.

A kapott oldatot Sephacryl S-200 HR oszlopon nyomjuk át körülbelül 0,1 cm/perc egyenletes sebességgel. Folytatjuk a 17. (e) példa szerinti puffer átnyomatását az oszlopon keresztül körülbelül 0,1 cm/perc átfolyási sebességgel. Öt frakciót gyűjtünk, melyek össztérfogata 0,4—0,55 ágytérfogatnak felel meg, majd 50 frakciót szedünk 0,01 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségekkel.

SDS-PAGE és protein analízissel való meghatározás alapján kiválasztjuk az aktív IL-4 frakciókat. Az aktív IL—4 frakciókat egyesítjük és 0,3 μ-os steril szűrőn átszűrjük. A szűrletet összegyűjtjük. A kapott aktív IL-4 oldat tisztasága 95-99%-os. A fermetlé aktív IL-4 tartalmára számítva a teljes kihozatal 70-80%-os.

Az izolált aktív IL-4 tisztasága SDS-PAGE analízis szerint 95-99%-os.

Az interleukin-4 aktív frakciók meghatározására minden esetben hagyományos módszereket használtunk. Az eluátumokból az aktív frakciók kiválasztása a 280 nm-en mért UV abszorpció alapján történt. A tisztított IL-4 esetén 1,0 A₂₈₀ optikai sűrűség egység (OD) aminosav összetétel analízis szerint 1,6 mg-nak és Lowry-módszer szerint 2,0 mg-nak felel meg.

Az SDS-PAGE analízis szintén szükséges az aktív frakciók kiválasztásához. A módszert U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970) ismertette.

A Lowry-módszer leírását lásd: Lowry et al., J. Bioi. Chem.

Jóllehet a találmányt bizonyos speciális megvalósításaival kapcsolatosan ismertettük, a szakterületen jártas szakemberek számára azonban magától értetődik, hogy számos más megoldásra, változtatásra és módosításra van lehetőség a találmány oltalmi körén belül.

Claims (15)

1. Eljárás aktív rekombináns humán interleukin-4 nyers oldatának tisztítására, azzal jellemezve, hogy

HU 215 257 Β (i) semleges vagy enyhén lúgos pH-ra pufferolt és 0,5-1,5 M nátrium-klorid-tartalmú nyers IL-4 oldatot fém-kelát-agaróz gél kromatografáló oszlopra visszük, amely szelektíven megköti az aktív rekombináns interleukin—4-et;

(ii) az említett oszlopot kétszer mossuk, először 0,1 M nátrium-klorid-tartalmú kiegyensúlyozó pufferrel és ezután 10% glicerint és 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel;

(iii) a megkötött aktív rekombináns humán interleukin-4-et eluáló pufferrel pH 4,5 és5,5 között oldjuk le az oszlopról;

(iv) az (iii) lépésben kapott aktív humán IL-4 pufferolt oldatát kationcserélő oszlopra visszük, és az aktív humán IL-4 pufferolt oldatát gradienssel eluáljuk az oszlopról;

(v) az (iv) lépésben kapott eluátumot keverős cellában, olyan membránon koncentráljuk, amely csak a 10000-nél kisebb molekulatömegű anyagokat engedi át;

(vi) a (v) lépésben kapott koncentrátumot méretkizáró oszlopon kromatografáljuk;

(vii) az aktív rekombináns humán interleukin—4 tisztított oldatát összegyűjtjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben használt puffer egy pH=7,5-ös foszfát-puffer, melynek nátrium-klorid koncentrációja 1 M és a fém-kelát gél oszlop egy cink-kelát-agaróz gél.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (ii) lépésben használt puffer egy, 150 mM nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 M nátriumfoszfát puffer (pH=7,2).

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iii) lépésben használt eluáló puffer egy, 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,02 mM nátrium-acetát puffer (pH=5,0).

5. Az 1^4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben 0,12 M nátriumkloridot tartalmazó 20 mM foszfát-pufferben (pH=6,75) visszük fel az anyagot, és 0,12-0,55 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM foszfát-pufferrel eluáljuk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (v) lépésben végzett koncentrálást 10 mM nátrium-citrát pufferrel (pH=4,5) szemben diaszűréssel végezzük 20 mg/ml koncentrációig.

7. Eljárás CHO-sejtvonal által kifejezett aktív rekombináns humán interleukin-4 nyers oldatának tisztítására, azzal jellemezve, hogy (i) az említett aktív IL-4 nyers oldatát semleges vagy enyhén lúgos pH és 13-15 mS vezetőképesség mellett térhálós agaróz gél mátrix töltetű kationcserélő kromatografáló oszlopra visszük, amely megköti az aktív rekombináns humán interleukin-4-et, és az oszlopot kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd az aktív IL-4et izokratikusan eluáljuk az oszlopról;

(ii) az (i) lépésben kapott aktív humán IL-4 pufferolt oldatát egy kisebb kationcserélő kromatografáló oszlopra visszük, amelynek ágytérfogata az (i) lépésben használt kationcserélő oszlopnak mintegy 15%-a; az oszlopot kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, majd a megkötött aktív IL-4-et pH=7,2-es, 0,12-0,50 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrendszerrel oldjuk le az oszlopról, s az eluátumokat egyesítjük;

(iii) az egyesített eluátum pH-ját 7,2-re és vezetőképességét 45-50 mS-re állítjuk be; ezután az egyesített eluátumot egy 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú pufferben (pH=6,7-8) fém-kelát-agaróz gél oszlopra visszük, majd az oszlopot közel semleges pH mellett, 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel mossuk; az aktív IL—4 izokratikus elúcióját 0,50 M nátrium-klorid-tartalmú pufferrel végezzük, pH=6,0 mellett;

(iv) az (iii) lépésben kapott eluátumot koncentráljuk és diaszűijük pH=4,5 mellett, keverős cellában olyan membránon, amely a 10000-nél kisebb molekulatömegű anyagokat átengedi;

(v) az (iv) lépésben kapott koncentrátumot méretkizáró oszlopra visszük, melynek töltete allil-dextrán és Ν,Ν’-metilén-bisz-akrilamid térhálósított kopolimer gél, amelyet egy pH=4,5-ös pufferrendszerrel hozunk egyensúlyba;

(vi) az aktív rekombináns humán interleukin—4 tisztított oldatát összegyűjtjük.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben használt kiegyensúlyozó puffer egy 0,12 M nátrium-klorid-tartalmú 20 mM nátriumfoszfát puffer (pH=7,2).

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (ii) lépésben használt eluáló puffer 0,12-0,50 M nátrium-klorid gradienst tartalmazó 20 mM nátrium-foszfát puffer (pH=7,2) és a fém-kelát gél oszlop egy kobalt-kelát-agaróz gél.

10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iii) lépésben használt eluáló puffer 0,50 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM foszfát-puffer (pH=6,0).

11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (iv) lépésben végzett koncentrálást diaszűréssel hajtjuk végre 0,05 M EDTA és 0,5 M nátrium-klorid-tartalmú 0,02 M nátrium-foszfát pufferrel (pH=6,0) szemben, majd 10 mM nátriumcitrát pufferrel (pH=4,5) szemben 20 mg/ml koncentrációig.

12. A 7-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (v) lépésben használt oszlopot 10 mM nátrium-citrát oldattal hozzuk egyensúlyba.

13. Eljárás egy emlősben a neutrofil-szám növelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárással tisztított rekombináns humán interleukin-4 hatásos mennyiségét a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és segédanyagokkal, és adott esetben egyéb, az IL-4-gyel szinergizmust nem mutató gyógyászatilag hatásos vegyülettel összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

14. Eljárás egy emlősben a mieloid vagy monocitoid leukémia kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárással tisztított rekombináns humán interleukin-4 hatásos mennyiségét a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és segédanyagokkal, és adott

HU 215 257 Β esetben egyéb, az IL-4-gyel szinergizmust nem mutató gyógyászatilag hatásos vegyülettel összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

15. Eljárás egy emlősben az éretlen mieloid vagy monocitoid sejtek érésének indukálására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 7. igénypont szerinti eljárással tisztított rekombináns humán interleukin—I hatásos mennyiségét a gyógyszerkészítésben szokásos vivő- és segédanyagokkal, és adott esetben egyéb, az IL-4-gyel sziner5 gizmust nem mutató gyógyászatilag hatásos vegyülettel összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

HU 215 257 Β

Int. Cl.⁶: A 61 K 38/20

1 . ábra

1 hkcditlqeiiktlhslteqktlcteltvt 31 0 IFAASKNTTEKETFCRAAT'/LRQFYSHHE

51 KD7RCLGATAQQFKRHKQLIRFLKRLDRNL 91 WGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKT Ifi

121 REKYSKCSS

HU 215 257 B

Int. Cl.⁶: A 61 K 38/20

44 Cn Cl Cl Ci rt N rt »0 X! •H H rt 'rt 4Í 44 44 44 rH s **». 0 Cn Cl On Oi θ' 3 3 3 3 rt 'x. X. -X. Ό o ru o KJ rt

[)

Neutrofil sejtszám IL-4-gyel kezelt majmokban vizsgálati hetek lg-Οΐ) urezs TTjojgnoN

HU 215 257 Β

Int. Cl.⁶: A 61 K 38/20