JPH06256397A - Ｔｎｆ阻害タンパク質 - Google Patents
Ｔｎｆ阻害タンパク質Info
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- JPH06256397A JPH06256397A JP3031043A JP3104391A JPH06256397A JP H06256397 A JPH06256397 A JP H06256397A JP 3031043 A JP3031043 A JP 3031043A JP 3104391 A JP3104391 A JP 3104391A JP H06256397 A JPH06256397 A JP H06256397A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ２８キロダルトンの分子量を有し、腫瘍壊死
因子の活性を直接阻害する活性を有さず、かつ腫瘍壊死
因子感受性細胞に腫瘍壊死因子耐性を付与することによ
り該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性または細胞増殖抑制活
性を阻害するタンパク質。 【効果】 この新規なタンパク質を抗原として産生した
抗体は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならず、この患
者の癌のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用であ
る。
因子の活性を直接阻害する活性を有さず、かつ腫瘍壊死
因子感受性細胞に腫瘍壊死因子耐性を付与することによ
り該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性または細胞増殖抑制活
性を阻害するタンパク質。 【効果】 この新規なタンパク質を抗原として産生した
抗体は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならず、この患
者の癌のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、腫瘍壊死因子感受性細
胞に対する腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称す）の細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害するタン
パク質性物質、および同物質を製造する方法に関する。
本発明のタンパク質性物質は、ここでは“ＴＮＦ阻害タ
ンパク質”（“ＴＩＰ”）と呼称し、有用な抗体、すな
わちＴＮＦの細胞溶解活性に対して耐性の癌患者を同定
するのに有用であるのみならずそのような患者の癌のＴ
ＮＦ耐性を除去するのにも有用である抗体を産生するた
めの抗原として有利に用いることができる。
胞に対する腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと称す）の細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害するタン
パク質性物質、および同物質を製造する方法に関する。
本発明のタンパク質性物質は、ここでは“ＴＮＦ阻害タ
ンパク質”（“ＴＩＰ”）と呼称し、有用な抗体、すな
わちＴＮＦの細胞溶解活性に対して耐性の癌患者を同定
するのに有用であるのみならずそのような患者の癌のＴ
ＮＦ耐性を除去するのにも有用である抗体を産生するた
めの抗原として有利に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】分化や増殖のような、細胞の成長に影響
する多岐にわたる生物活性を持つタンパク質であるＴＮ
Ｆは腫瘍壊死活性があることでよく知られている。数多
くのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で、ＴＮＦは多くの型の腫瘍
細胞系に対して強い細胞溶解活性および／または細胞増
殖抑制活性を有する因子であることが示されている。
する多岐にわたる生物活性を持つタンパク質であるＴＮ
Ｆは腫瘍壊死活性があることでよく知られている。数多
くのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で、ＴＮＦは多くの型の腫瘍
細胞系に対して強い細胞溶解活性および／または細胞増
殖抑制活性を有する因子であることが示されている。
【０００３】癌を治療するための治療薬剤として、多く
の癌床実験がＴＮＦに関して行なわれてきた。しかしな
がら、腫瘍がＴＮＦによる処理に反応しないことが度々
あり、あるいはＴＮＦ処理による部分的な腫瘍寛解後に
おいては患者はＴＮＦによるさらなる処置に耐性を示す
ようになることから、初期の臨床実験の結果は失望させ
るものであった。ＴＮＦの細胞致死活性に対するこの耐
性の発現は、腫瘍の治療にＴＮＦを使用することに制限
を与えるものである。
の癌床実験がＴＮＦに関して行なわれてきた。しかしな
がら、腫瘍がＴＮＦによる処理に反応しないことが度々
あり、あるいはＴＮＦ処理による部分的な腫瘍寛解後に
おいては患者はＴＮＦによるさらなる処置に耐性を示す
ようになることから、初期の臨床実験の結果は失望させ
るものであった。ＴＮＦの細胞致死活性に対するこの耐
性の発現は、腫瘍の治療にＴＮＦを使用することに制限
を与えるものである。
【０００４】最近、ＴＮＦの細胞致死活性に対して阻害
活性を持つタンパク質が報告されている〔ジャ−ナル・
オブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）、２６４，１１９７４−１１９８０、１９８
９；ジャ−ナル・オブ・バイオロジカルケミストリ−
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６４，１１９６６−
１１９７３、１９８９；ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オ
ブ・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４１，
４１４−４１９、１９８８；ヨ−ロピアン・ジャ−ナル
・オブ・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４
２，２７０−２７５、１９８９；およびジャ−ナル・オ
ブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）、２６５，１５３１−１５３６、１９９
０）〕。
活性を持つタンパク質が報告されている〔ジャ−ナル・
オブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．）、２６４，１１９７４−１１９８０、１９８
９；ジャ−ナル・オブ・バイオロジカルケミストリ−
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６４，１１９６６−
１１９７３、１９８９；ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オ
ブ・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４１，
４１４−４１９、１９８８；ヨ−ロピアン・ジャ−ナル
・オブ・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４
２，２７０−２７５、１９８９；およびジャ−ナル・オ
ブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）、２６５，１５３１−１５３６、１９９
０）〕。
【０００５】これらの報告されているタンパク質は、Ｔ
ＮＦ結合タンパク質、またはＴＮＦα阻害剤のようなＴ
ＮＦ阻害剤として記述されており、ＴＮＦに加えるとＴ
ＮＦの細胞致死活性を直接阻害する。他方、ある種の細
胞をＴＮＦで処理するとＴＮＦ類似タンパク質、インタ
−ロイキン−１（以下“ＩＬ−１”と称す）、またはイ
ンタ−ロイキン−６（以下“ＩＬ−６”と称す）の産生
を誘発することを示唆している報告もある。
ＮＦ結合タンパク質、またはＴＮＦα阻害剤のようなＴ
ＮＦ阻害剤として記述されており、ＴＮＦに加えるとＴ
ＮＦの細胞致死活性を直接阻害する。他方、ある種の細
胞をＴＮＦで処理するとＴＮＦ類似タンパク質、インタ
−ロイキン−１（以下“ＩＬ−１”と称す）、またはイ
ンタ−ロイキン−６（以下“ＩＬ−６”と称す）の産生
を誘発することを示唆している報告もある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならずこの患者の癌
のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用である特異
抗体を産生するために有用である、ＴＮＦ阻害活性を有
する新規なタンパク質性物質（ＴＮＦ阻害タンパク質）
を提供することにある。
は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならずこの患者の癌
のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用である特異
抗体を産生するために有用である、ＴＮＦ阻害活性を有
する新規なタンパク質性物質（ＴＮＦ阻害タンパク質）
を提供することにある。
【０００７】本発明のもう一つの目的は、この新規なＴ
ＮＦ阻害タンパク質の製造方法を提供することにある。
ＮＦ阻害タンパク質の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＴＮＦ耐性
のメカニズムに関して鋭意研究を行なった結果、意外に
も、ヒト線維芽ＭＬＤ１の細胞またはＢＧ−９またはＦ
Ｓ−４細胞系、末梢血液白血球または確立された腫瘍細
胞のような細胞を、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、リン
ホトキシン、インタ−フェロン−αおよびそれら類似物
質のような特定のインデュ−サ−で処理すると、これら
の細胞は新規なタンパク質性物質を著しく産生し、その
新規な物質はこれら細胞にＴＮＦの細胞溶解活性および
／または細胞増殖抑制活性に対する耐性を付与すること
を発見した。そして、本発明者らはこの物質の単離、精
製および同定に成功し、この物質を“ＴＮＦ阻害タンパ
ク質”と命名した。またこのＴＮＦ阻害タンパク質と同
じ物質が、ＴＮＦを投与された癌患者の血清中で形成さ
れるということも発見した。さらにこのＴＮＦ阻害タン
パク質は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならずこの患
者の癌のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用であ
る特異抗体を産生するための抗原として用いることがで
きることを見出した。本発明はこれらの新規な知見に基
づいて完成されたものである。
のメカニズムに関して鋭意研究を行なった結果、意外に
も、ヒト線維芽ＭＬＤ１の細胞またはＢＧ−９またはＦ
Ｓ−４細胞系、末梢血液白血球または確立された腫瘍細
胞のような細胞を、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、リン
ホトキシン、インタ−フェロン−αおよびそれら類似物
質のような特定のインデュ−サ−で処理すると、これら
の細胞は新規なタンパク質性物質を著しく産生し、その
新規な物質はこれら細胞にＴＮＦの細胞溶解活性および
／または細胞増殖抑制活性に対する耐性を付与すること
を発見した。そして、本発明者らはこの物質の単離、精
製および同定に成功し、この物質を“ＴＮＦ阻害タンパ
ク質”と命名した。またこのＴＮＦ阻害タンパク質と同
じ物質が、ＴＮＦを投与された癌患者の血清中で形成さ
れるということも発見した。さらにこのＴＮＦ阻害タン
パク質は、ＴＮＦ耐性の癌患者の検知のみならずこの患
者の癌のＴＮＦ耐性を除去するためにも極めて有用であ
る特異抗体を産生するための抗原として用いることがで
きることを見出した。本発明はこれらの新規な知見に基
づいて完成されたものである。
【０００９】すなわち、本発明によれば、（ａ）２８キ
ロダルトンの分子量を有し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性
を直接阻害する活性を有さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子
感受性細胞に腫瘍壊死因子耐性を付与し、それにより腫
瘍壊死因子感受性細胞に対する該腫瘍壊死因子の細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性
を有する、ことを特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質が提
供される。
ロダルトンの分子量を有し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性
を直接阻害する活性を有さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子
感受性細胞に腫瘍壊死因子耐性を付与し、それにより腫
瘍壊死因子感受性細胞に対する該腫瘍壊死因子の細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性
を有する、ことを特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質が提
供される。
【００１０】本発明のＴＮＦ阻害剤は、通常のドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（以下“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”と称す）で測定したときの
分子量が２８キロダルトン（以下“ｋＤａ”と称す）で
あり、ＴＮＦ耐性をＴＮＦ感受性細胞に付与し、それに
よりＴＮＦ感受性細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性お
よび／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する
タンパク質性物質である。
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（以下“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”と称す）で測定したときの
分子量が２８キロダルトン（以下“ｋＤａ”と称す）で
あり、ＴＮＦ耐性をＴＮＦ感受性細胞に付与し、それに
よりＴＮＦ感受性細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性お
よび／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する
タンパク質性物質である。
【００１１】すなわち、ＴＮＦ感受性細胞を本発明のＴ
ＮＦ阻害タンパク質で処理すると、この細胞はもはやＴ
ＮＦの細胞溶解活性および／または細胞増殖抑制活性に
よる影響を受けない。ＴＮＦ感受性細胞の例としては、
ヒト線維芽細胞系ＭＬＤ、ヒト膀胱移行型細胞乳頭腫系
ＲＴ４、ヒト卵巣癌細胞系Ａ２７８０などの細胞があげ
られる。
ＮＦ阻害タンパク質で処理すると、この細胞はもはやＴ
ＮＦの細胞溶解活性および／または細胞増殖抑制活性に
よる影響を受けない。ＴＮＦ感受性細胞の例としては、
ヒト線維芽細胞系ＭＬＤ、ヒト膀胱移行型細胞乳頭腫系
ＲＴ４、ヒト卵巣癌細胞系Ａ２７８０などの細胞があげ
られる。
【００１２】ＭＬＤ細胞の場合には、本発明のＴＮＦ阻
害タンパク質は、シクロヘキシミド（以下“ＣＨＩ”と
称す）の存在下で、ＭＬＤ細胞に対するＴＮＦの細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害する。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦの活性を直接に
は阻害しない。すなわち、ＴＮＦ阻害タンパク質をＴＮ
Ｆと一緒にインキュベ−トしてもＴＮＦの活性は低下し
ない。従って、そのインキュベ−トした混合物をＴＮＦ
感受性細胞に加えても、ＴＮＦはまだ細胞溶解活性およ
び／または細胞増殖抑制活性を示す。
害タンパク質は、シクロヘキシミド（以下“ＣＨＩ”と
称す）の存在下で、ＭＬＤ細胞に対するＴＮＦの細胞溶
解活性および／または細胞増殖抑制活性を阻害する。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦの活性を直接に
は阻害しない。すなわち、ＴＮＦ阻害タンパク質をＴＮ
Ｆと一緒にインキュベ−トしてもＴＮＦの活性は低下し
ない。従って、そのインキュベ−トした混合物をＴＮＦ
感受性細胞に加えても、ＴＮＦはまだ細胞溶解活性およ
び／または細胞増殖抑制活性を示す。
【００１３】本発明のＴＮＦ阻害タンパク質のＴＮＦ感
受性細胞に対する細胞溶解活性および／または細胞増殖
抑制活性を阻害する活性は、このＴＮＦ阻害タンパク質
を、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６に対するモノクロ
−ナル抗体またはポリクロ−ナル抗体と一緒にインキュ
ベ−トしても影響を受けない。本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質は、熱に不安定なタンパク質である。
受性細胞に対する細胞溶解活性および／または細胞増殖
抑制活性を阻害する活性は、このＴＮＦ阻害タンパク質
を、ＴＮＦ、ＩＬ−１およびＩＬ−６に対するモノクロ
−ナル抗体またはポリクロ−ナル抗体と一緒にインキュ
ベ−トしても影響を受けない。本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質は、熱に不安定なタンパク質である。
【００１４】ＴＮＦ阻害タンパク質は、一般のタンパク
質の場合と同様、ＴＮＦ阻害タンパク質を製造する方法
に従って修飾することができる。修飾タンパク質が上記
の活性を持つ限りにおいて、本発明のＴＮＦ阻害タンパ
ク質はこのような修飾タンパク質の全てを包含する。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質のＴＮＦ阻害活性は、下記
のように、ＴＮＦ阻害タンパク質で処理したヒト線維芽
細胞系ＭＬＤの細胞をシクロヘキシミドの存在下にＴＮ
Ｆと一緒にインキュベ−トしたのちの、該細胞の生存率
によって測定することができる。
質の場合と同様、ＴＮＦ阻害タンパク質を製造する方法
に従って修飾することができる。修飾タンパク質が上記
の活性を持つ限りにおいて、本発明のＴＮＦ阻害タンパ
ク質はこのような修飾タンパク質の全てを包含する。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質のＴＮＦ阻害活性は、下記
のように、ＴＮＦ阻害タンパク質で処理したヒト線維芽
細胞系ＭＬＤの細胞をシクロヘキシミドの存在下にＴＮ
Ｆと一緒にインキュベ−トしたのちの、該細胞の生存率
によって測定することができる。
【００１５】本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、上記し
た従来のＴＮＦ結合タンパク質やＴＮＦα阻害剤とは完
全に異なるものである。その理由は次の通りである。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質の作用機序は、ＴＮＦ結合
タンパク質やＴＮＦα阻害剤のそれとは異なる。ＴＮＦ
結合タンパク質およびＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦに結合
することによってＴＮＦの機能を遮断し、そのＴＮＦへ
の結合はＴＮＦ受容体と競合的であるという報告があ
る。
た従来のＴＮＦ結合タンパク質やＴＮＦα阻害剤とは完
全に異なるものである。その理由は次の通りである。本
発明のＴＮＦ阻害タンパク質の作用機序は、ＴＮＦ結合
タンパク質やＴＮＦα阻害剤のそれとは異なる。ＴＮＦ
結合タンパク質およびＴＮＦα阻害剤は、ＴＮＦに結合
することによってＴＮＦの機能を遮断し、そのＴＮＦへ
の結合はＴＮＦ受容体と競合的であるという報告があ
る。
【００１６】他方、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質（以
後、“ＴＮＦ阻害因子”とも称する）はＴＮＦに結合し
ないし、結合しても、ＴＮＦの活性に影響を与えない。
即ち、ＴＮＦを本発明のＴＮＦ阻害タンパク質と一緒に
試験管中で６時間インキュベ−トし、得られる混合物を
腫瘍細胞に加えると、この細胞の細胞溶解が起こる。よ
って、ＴＮＦ阻害因子はＴＮＦ活性を直接には阻害しな
い。
後、“ＴＮＦ阻害因子”とも称する）はＴＮＦに結合し
ないし、結合しても、ＴＮＦの活性に影響を与えない。
即ち、ＴＮＦを本発明のＴＮＦ阻害タンパク質と一緒に
試験管中で６時間インキュベ−トし、得られる混合物を
腫瘍細胞に加えると、この細胞の細胞溶解が起こる。よ
って、ＴＮＦ阻害因子はＴＮＦ活性を直接には阻害しな
い。
【００１７】しかしながら、本発明のＴＮＦ阻害タンパ
ク質をＴＮＦを添加する６時間前に腫瘍細胞に加えた場
合には、腫瘍細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性が阻害
される。この阻害は、ＴＮＦ阻害タンパク質を加えた腫
瘍細胞の培地を取り除き、ＴＮＦ添加の前に新しい培地
を加えた場合でも観察される。これらの事実から、本発
明のＴＮＦ阻害タンパク質は、尿から単離した従来のＴ
ＮＦ結合因子がＴＮＦに結合してＴＮＦの細胞溶解活性
を低下させるのとは異なり、ＴＮＦに結合することによ
ってＴＮＦ活性を低下させるのではないことが示唆され
る。
ク質をＴＮＦを添加する６時間前に腫瘍細胞に加えた場
合には、腫瘍細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性が阻害
される。この阻害は、ＴＮＦ阻害タンパク質を加えた腫
瘍細胞の培地を取り除き、ＴＮＦ添加の前に新しい培地
を加えた場合でも観察される。これらの事実から、本発
明のＴＮＦ阻害タンパク質は、尿から単離した従来のＴ
ＮＦ結合因子がＴＮＦに結合してＴＮＦの細胞溶解活性
を低下させるのとは異なり、ＴＮＦに結合することによ
ってＴＮＦ活性を低下させるのではないことが示唆され
る。
【００１８】他の研究者達によって報告されているＴＮ
Ｆ阻害剤は、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの細
胞溶解活性および／または細胞増殖抑制活性を減少させ
るのである。ＴＮＦ−ＴＮＦ阻害剤複合体は（阻害剤が
ない場合、ＴＮＦはＴＮＦ受容体に結合する。）ＴＮＦ
受容体に結合することができない。従って細胞はＴＮＦ
によって溶解されない（直接阻害）。
Ｆ阻害剤は、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの細
胞溶解活性および／または細胞増殖抑制活性を減少させ
るのである。ＴＮＦ−ＴＮＦ阻害剤複合体は（阻害剤が
ない場合、ＴＮＦはＴＮＦ受容体に結合する。）ＴＮＦ
受容体に結合することができない。従って細胞はＴＮＦ
によって溶解されない（直接阻害）。
【００１９】本発明のＴＩＰは、ＴＮＦとではなく、細
胞と相互作用をし、この相互作用の結果、細胞はＴＮＦ
の細胞溶解活性および／または細胞傷害活性に耐性とな
る。ＴＩＰがＴＮＦの細胞溶解活性および／または細胞
増殖抑制活性に対する耐性を誘発する作用機序はまだ正
確には分かっていない。理論的に、また必ずしも理論的
でないにしても、ＴＩＰが、ＴＮＦ受容体の数あるいは
親和力の変化を誘発することや、（ＴＩＰ未処理のＴＮ
Ｆ感受性細胞内において）ＴＮＦによって活性化された
細胞内生化学経路（代謝過程）を妨害することの可能性
はある。
胞と相互作用をし、この相互作用の結果、細胞はＴＮＦ
の細胞溶解活性および／または細胞傷害活性に耐性とな
る。ＴＩＰがＴＮＦの細胞溶解活性および／または細胞
増殖抑制活性に対する耐性を誘発する作用機序はまだ正
確には分かっていない。理論的に、また必ずしも理論的
でないにしても、ＴＩＰが、ＴＮＦ受容体の数あるいは
親和力の変化を誘発することや、（ＴＩＰ未処理のＴＮ
Ｆ感受性細胞内において）ＴＮＦによって活性化された
細胞内生化学経路（代謝過程）を妨害することの可能性
はある。
【００２０】更に、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質の諸
特性は、上記のＴＮＦ結合タンパク質およびＴＮＦα阻
害剤のそれらとは異なる。即ち、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅに対して、ＴＮＦ結合タンパク質はｐＨ５．０で結
合する〔ジャ−ナル・オブ・バイオロジカルケミストリ
−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１１９７４
−１１９８０，１９８９〕が、本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質は結合しない。
特性は、上記のＴＮＦ結合タンパク質およびＴＮＦα阻
害剤のそれらとは異なる。即ち、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅに対して、ＴＮＦ結合タンパク質はｐＨ５．０で結
合する〔ジャ−ナル・オブ・バイオロジカルケミストリ
−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１１９７４
−１１９８０，１９８９〕が、本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質は結合しない。
【００２１】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘに対して、Ｔ
ＮＦα阻害剤はｐＨ８．０で結合する〔ジャ−ナル・オ
ブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．），２６４，１１９６６−１１９７３，１９８
９〕が、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は結合しない。
ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オブ・ヘマトロジ−（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４１，４１４−４１９，１９８
８には、もう１つの別の阻害タンパク質が報告されてお
り、この文献では、この阻害タンパク質の分子量は５０
ｋＤａと報告されている。のちにこの分子量は３０ｋＤ
ａに訂正されている〔ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オブ
・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）９，４２，
２７０−２７５，１９８９〕。本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質の分子量は上記のとおり２８ｋＤａである。
ＮＦα阻害剤はｐＨ８．０で結合する〔ジャ−ナル・オ
ブ・バイオロジカルケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．），２６４，１１９６６−１１９７３，１９８
９〕が、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は結合しない。
ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オブ・ヘマトロジ−（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）、４１，４１４−４１９，１９８
８には、もう１つの別の阻害タンパク質が報告されてお
り、この文献では、この阻害タンパク質の分子量は５０
ｋＤａと報告されている。のちにこの分子量は３０ｋＤ
ａに訂正されている〔ヨ−ロピアン・ジャ−ナル・オブ
・ヘマトロジ−（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．）９，４２，
２７０−２７５，１９８９〕。本発明のＴＮＦ阻害タン
パク質の分子量は上記のとおり２８ｋＤａである。
【００２２】更に、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質の活
性は抗−ＴＮＦ抗体、抗−ＩＬ−１抗体または抗−ＩＬ
−６抗体によっては中和されない。本発明のＴＮＦ阻害
タンパク質は適切な条件下で細胞を培養することによっ
て製造することができる。すなわち、本発明によれば、 （１）腫瘍壊死因子を含まない栄養培地中にてヒト由来
の細胞を培養し； （２）上記細胞をＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−サ−
を含む培地中で培養して、（ａ）２８キロダルトンの分
子量を有し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性を直接阻害する
活性を有さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子感受性細胞に腫
瘍壊死因子耐性を付与し、それにより腫瘍壊死因子感受
性細胞に対する該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性および／
または細胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する、こと
を特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質を含む培養物を該細
胞に産生させ；そして （３）上記培養物から該ＴＮＦ阻害タンパク質を単離す
る、ことを含むことを特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質
の製造方法も提供される。
性は抗−ＴＮＦ抗体、抗−ＩＬ−１抗体または抗−ＩＬ
−６抗体によっては中和されない。本発明のＴＮＦ阻害
タンパク質は適切な条件下で細胞を培養することによっ
て製造することができる。すなわち、本発明によれば、 （１）腫瘍壊死因子を含まない栄養培地中にてヒト由来
の細胞を培養し； （２）上記細胞をＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−サ−
を含む培地中で培養して、（ａ）２８キロダルトンの分
子量を有し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性を直接阻害する
活性を有さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子感受性細胞に腫
瘍壊死因子耐性を付与し、それにより腫瘍壊死因子感受
性細胞に対する該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性および／
または細胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する、こと
を特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質を含む培養物を該細
胞に産生させ；そして （３）上記培養物から該ＴＮＦ阻害タンパク質を単離す
る、ことを含むことを特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質
の製造方法も提供される。
【００２３】上記ヒト由来の細胞の例としては、ヒト線
維芽ＭＬＤの細胞、ＢＧ−９またはＦＳ−４細胞系の細
胞、末梢血液白血球の細胞などの細胞を挙げることがで
きる。まず、これらヒト由来の細胞をＴＮＦを含まない
栄養培地中で培養する。栄養培地としては、ＲＰＭＩ
１６４０培地のような最小必須培地を用いることができ
る。培養は、一般に、例えば約３７℃で行なうことがで
きる。
維芽ＭＬＤの細胞、ＢＧ−９またはＦＳ−４細胞系の細
胞、末梢血液白血球の細胞などの細胞を挙げることがで
きる。まず、これらヒト由来の細胞をＴＮＦを含まない
栄養培地中で培養する。栄養培地としては、ＲＰＭＩ
１６４０培地のような最小必須培地を用いることができ
る。培養は、一般に、例えば約３７℃で行なうことがで
きる。
【００２４】ＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦの不存在
下で細胞を培養することによって製造することができ
る。しかしながら、１０単位／ｍｌ〜１０4 単位／ｍｌ
のＴＮＦの存在下に約２時間から２４時間細胞を培養す
ると、産生されるＴＮＦ阻害タンパク質の量は、ＴＮＦ
の不存在下で産生されるＴＮＦ阻害タンパク質の量の３
０倍以上に増える。
下で細胞を培養することによって製造することができ
る。しかしながら、１０単位／ｍｌ〜１０4 単位／ｍｌ
のＴＮＦの存在下に約２時間から２４時間細胞を培養す
ると、産生されるＴＮＦ阻害タンパク質の量は、ＴＮＦ
の不存在下で産生されるＴＮＦ阻害タンパク質の量の３
０倍以上に増える。
【００２５】ＴＮＦを含む培地としては、上記したＴＮ
Ｆ阻害タンパク質インデュ−サ−を加える以外は、集密
的細胞を得るために使用されるものと同じ培地を用いる
ことができる。ＴＮＦとしては、従来のＴＮＦを用いる
ことができる。例えば、ヨ−ロッパ特許出願公開第０１
５８２８６号記載の方法に従って製造されるヒトＴＮＦ
を用いることができる。
Ｆ阻害タンパク質インデュ−サ−を加える以外は、集密
的細胞を得るために使用されるものと同じ培地を用いる
ことができる。ＴＮＦとしては、従来のＴＮＦを用いる
ことができる。例えば、ヨ−ロッパ特許出願公開第０１
５８２８６号記載の方法に従って製造されるヒトＴＮＦ
を用いることができる。
【００２６】細胞によって産生されるＴＮＦ阻害タンパ
ク質は、細胞内に蓄積する場合と、細胞外すなわち培養
培地中に蓄積する場合があるが、いずれにしろＴＮＦ阻
害タンパク質を含む培養物が得られる。ＴＮＦ阻害タン
パク質が細胞内に蓄積するか細胞外に蓄積するかは使用
される細胞の種類による。培養終了後、ＴＮＦ阻害タン
パク質を培養物から単離する。ＴＮＦ阻害タンパク質が
細胞内に蓄積されている場合には、細胞を培養培地から
分離して破砕し、そして破砕された細胞の上清液を遠心
分離によって取得する。このようにして得られた上清液
は精製にかけられる。
ク質は、細胞内に蓄積する場合と、細胞外すなわち培養
培地中に蓄積する場合があるが、いずれにしろＴＮＦ阻
害タンパク質を含む培養物が得られる。ＴＮＦ阻害タン
パク質が細胞内に蓄積するか細胞外に蓄積するかは使用
される細胞の種類による。培養終了後、ＴＮＦ阻害タン
パク質を培養物から単離する。ＴＮＦ阻害タンパク質が
細胞内に蓄積されている場合には、細胞を培養培地から
分離して破砕し、そして破砕された細胞の上清液を遠心
分離によって取得する。このようにして得られた上清液
は精製にかけられる。
【００２７】ＴＮＦ阻害タンパク質が細胞外、すなわち
培養培地中に蓄積されている場合には、培養培地を細胞
から分離して、精製にかける。必要があれば、培養培地
を精製にかける前に遠心分離にかけ、培地中に残存して
いる細胞砕片を除去することもできる。精製は、タンパ
ク質精製の通常の方法を組み合せて行なうことができ
る。精製方法の例としては、ゲルろ過クロマトグラフィ
−、イオン交換クロマトグラフィ−、吸着クロマトグラ
フィ−および逆相クロマトグラフィ−のようなクロマト
グラフィ−；限外ろ過；電気泳動；などを挙げることが
できる。
培養培地中に蓄積されている場合には、培養培地を細胞
から分離して、精製にかける。必要があれば、培養培地
を精製にかける前に遠心分離にかけ、培地中に残存して
いる細胞砕片を除去することもできる。精製は、タンパ
ク質精製の通常の方法を組み合せて行なうことができ
る。精製方法の例としては、ゲルろ過クロマトグラフィ
−、イオン交換クロマトグラフィ−、吸着クロマトグラ
フィ−および逆相クロマトグラフィ−のようなクロマト
グラフィ−；限外ろ過；電気泳動；などを挙げることが
できる。
【００２８】本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦ
耐性の癌患者を検知するのに有用な特異的モノクロ−ナ
ルまたはポリクロ−ナル抗体産生のための抗原として効
果的に使用することができる。この抗体はまた患者の癌
のＴＮＦ耐性を取り除くためにも有用である。本発明の
ＴＮＦ阻害タンパク質をモノクロ−ナルまたはポリクロ
−ナル抗体の調製に使用することは、後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）の治療に新規な手段を提供するもので
ある。
耐性の癌患者を検知するのに有用な特異的モノクロ−ナ
ルまたはポリクロ−ナル抗体産生のための抗原として効
果的に使用することができる。この抗体はまた患者の癌
のＴＮＦ耐性を取り除くためにも有用である。本発明の
ＴＮＦ阻害タンパク質をモノクロ−ナルまたはポリクロ
−ナル抗体の調製に使用することは、後天性免疫不全症
候群（ＡＩＤＳ）の治療に新規な手段を提供するもので
ある。
【００２９】ヒト免疫欠損ウイルス（以下“ＨＩＶ”と
称す）に潜在的に感染した患者のＡＩＤＳの発現は、長
い遅延期間の後に現われ、またＨＩＶゲノムの発現の増
進に依存する。ＴＮＦはウイルス感染細胞中のＨＩＶ複
製を増幅することが他の研究者らによって知見されてい
る。従って、ＴＮＦ抗体またはＴＮＦ活性を低下させる
拮抗体はＨＩＶゲノムのＴＮＦ誘導増幅を防止すること
ができる。逆もまた可能である。
称す）に潜在的に感染した患者のＡＩＤＳの発現は、長
い遅延期間の後に現われ、またＨＩＶゲノムの発現の増
進に依存する。ＴＮＦはウイルス感染細胞中のＨＩＶ複
製を増幅することが他の研究者らによって知見されてい
る。従って、ＴＮＦ抗体またはＴＮＦ活性を低下させる
拮抗体はＨＩＶゲノムのＴＮＦ誘導増幅を防止すること
ができる。逆もまた可能である。
【００３０】ＨＩＶゲノムの発現は、（本発明者らが発
見したように）ＴＮＦ阻害タンパク質の刺激も含むもの
であった。ＴＮＦといくつかの生物活性を共有するリン
ホカインであるＩＬ−１によっても刺激され、ＴＮＦを
インタ−フェロン−ガンマ（以下“ＩＦＮ−ガンマ”と
称す）と共に細胞に加えると、細胞のＨＩＶ感受性を大
きく低下させ、またＨＩＶｍＲＮＡおよびコアタンパク
質ｐ２４の生産を抑制した。
見したように）ＴＮＦ阻害タンパク質の刺激も含むもの
であった。ＴＮＦといくつかの生物活性を共有するリン
ホカインであるＩＬ−１によっても刺激され、ＴＮＦを
インタ−フェロン−ガンマ（以下“ＩＦＮ−ガンマ”と
称す）と共に細胞に加えると、細胞のＨＩＶ感受性を大
きく低下させ、またＨＩＶｍＲＮＡおよびコアタンパク
質ｐ２４の生産を抑制した。
【００３１】本発明者らは、ＩＮＦ−ガンマが、ＴＮＦ
のヒト線維芽細胞および末梢血液白血球（以下“ＰＢ
Ｌ”と称す）の両者の中のＴＮＦ阻害タンパク質を増殖
する能力を低下させることを発見した。従って、ＴＮＦ
あるいはＩＬ−１ではなく、ＴＮＦおよび／またはＩＬ
−１により誘導されるＴＩＰがＨＩＶの発現を増幅し、
そして最近になってＴＮＦまたはＩＬ−１によるものと
考えられているいくつかのその他の作用を媒介するのか
もしれない。もしそうであるなら、次に、ＴＮＦ抗体
（ＴＩＰは他のリンホカインによって刺激されることが
ありうる）あるいはＴＩＰでなく、ＴＮＦ阻害タンパク
質の抗体が、ＡＩＤＳの治療のための新規な手段を提供
できるものである。
のヒト線維芽細胞および末梢血液白血球（以下“ＰＢ
Ｌ”と称す）の両者の中のＴＮＦ阻害タンパク質を増殖
する能力を低下させることを発見した。従って、ＴＮＦ
あるいはＩＬ−１ではなく、ＴＮＦおよび／またはＩＬ
−１により誘導されるＴＩＰがＨＩＶの発現を増幅し、
そして最近になってＴＮＦまたはＩＬ−１によるものと
考えられているいくつかのその他の作用を媒介するのか
もしれない。もしそうであるなら、次に、ＴＮＦ抗体
（ＴＩＰは他のリンホカインによって刺激されることが
ありうる）あるいはＴＩＰでなく、ＴＮＦ阻害タンパク
質の抗体が、ＡＩＤＳの治療のための新規な手段を提供
できるものである。
【００３２】また、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質はＴ
ＮＦの各種活性を適切に調節するためのモジュレ−タ−
としても有利に使用することができる。本発明者らは、
ヒト線維芽細胞、ＰＢＬおよびいくつかの確立された腫
瘍細胞系を刺激すると、ＴＮＦ阻害タンパク質の産生を
増進させることができ、該ＴＮＦ阻害タンパク質はＴＮ
Ｆで誘導される細胞溶解に感受性を有する腫瘍細胞系に
添加されると、それら細胞系に耐性を付与することを知
見した。
ＮＦの各種活性を適切に調節するためのモジュレ−タ−
としても有利に使用することができる。本発明者らは、
ヒト線維芽細胞、ＰＢＬおよびいくつかの確立された腫
瘍細胞系を刺激すると、ＴＮＦ阻害タンパク質の産生を
増進させることができ、該ＴＮＦ阻害タンパク質はＴＮ
Ｆで誘導される細胞溶解に感受性を有する腫瘍細胞系に
添加されると、それら細胞系に耐性を付与することを知
見した。
【００３３】ＴＮＦにより媒介される作用は、いくつか
の形質転換細胞の溶解に限定されるものでない。ＴＮＦ
は、宿主防御系、対宿主移植片（ＧＶＨ）疾患、Ｂ細胞
の分化、ＨＩＶの発現調節、およびその他多数の作用に
おいて重要な役割を演ずる。従って、ＴＩＰがこれらの
作用にも或る効果を有するかもしれないと期待すること
は理にかなっている。即ち、ＴＩＰおよび／またはその
抗体は、ＴＮＦで誘起される細胞溶解に対する腫瘍細胞
の耐性を低下させるため、またはＨＩＶゲノムのＴＮＦ
誘導増幅を阻害するため、または対宿主移植片（ＧＶ
Ｈ）疾患の強さを軽減するため、あるいはエンドトキシ
ンのＴＮＦ／ＩＬ−１媒介致死作用を防ぐため、などに
利用することができると考えられる。またそれらは、Ｔ
ＮＦ治療を受けるための患者の選別やサイトカイン網の
研究にも利用することができる。
の形質転換細胞の溶解に限定されるものでない。ＴＮＦ
は、宿主防御系、対宿主移植片（ＧＶＨ）疾患、Ｂ細胞
の分化、ＨＩＶの発現調節、およびその他多数の作用に
おいて重要な役割を演ずる。従って、ＴＩＰがこれらの
作用にも或る効果を有するかもしれないと期待すること
は理にかなっている。即ち、ＴＩＰおよび／またはその
抗体は、ＴＮＦで誘起される細胞溶解に対する腫瘍細胞
の耐性を低下させるため、またはＨＩＶゲノムのＴＮＦ
誘導増幅を阻害するため、または対宿主移植片（ＧＶ
Ｈ）疾患の強さを軽減するため、あるいはエンドトキシ
ンのＴＮＦ／ＩＬ−１媒介致死作用を防ぐため、などに
利用することができると考えられる。またそれらは、Ｔ
ＮＦ治療を受けるための患者の選別やサイトカイン網の
研究にも利用することができる。
【００３４】更に、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、
器官移植体または組織移植体の管理、特に器官移植体拒
絶の割合を減らすために利用することができる。骨髄移
植（以下“ＢＭＴ”と称す）に続いて起こる対宿主移植
片反応は、移植の失敗すなわち致命的合併症を起こすこ
とがあり、通例患者の死に至る。移植に成功しても、５
０％までの死亡率を伴うことがある合併症であるところ
の対宿主移植片疾患（以下“ＧＶＨＤ”と称す）を招く
危険がある。
器官移植体または組織移植体の管理、特に器官移植体拒
絶の割合を減らすために利用することができる。骨髄移
植（以下“ＢＭＴ”と称す）に続いて起こる対宿主移植
片反応は、移植の失敗すなわち致命的合併症を起こすこ
とがあり、通例患者の死に至る。移植に成功しても、５
０％までの死亡率を伴うことがある合併症であるところ
の対宿主移植片疾患（以下“ＧＶＨＤ”と称す）を招く
危険がある。
【００３５】骨髄からのＴ細胞の減耗を招くところの免
疫抑制薬剤を使用すると、ＧＶＨＤの発生率および強さ
を著しく低減させるが、しかしこれは移植の失敗、感
染、および再発性白血病の発生頻度の増大につながるこ
とがしばしばある。ＧＶＨＤ中にＴＮＦのレベル増加が
観察されており、これはＴＮＦがＧＶＨＤの誘発および
強さの原因となっている可能性があることを示唆してい
る。インタ−ロイキン２（以下“ＩＬ−２”と称す）
は、Ｔ細胞減耗を招くＢＭＴを行なった後の患者から得
たリンパ球によるＴＮＦの生産を著しく増大させる。Ｔ
ＮＦ抗体は、ＢＭＴ後の死亡率を大きく減少させ、ＧＶ
ＨＤの急性期における皮膚および腸管損傷、およびその
他の好ましくない作用を防ぐ。この理由から、ＴＮＦ抗
体または他のＴＮＦ拮抗体は器官または組織移植の管理
に潜在的な用途を有することが期待される。
疫抑制薬剤を使用すると、ＧＶＨＤの発生率および強さ
を著しく低減させるが、しかしこれは移植の失敗、感
染、および再発性白血病の発生頻度の増大につながるこ
とがしばしばある。ＧＶＨＤ中にＴＮＦのレベル増加が
観察されており、これはＴＮＦがＧＶＨＤの誘発および
強さの原因となっている可能性があることを示唆してい
る。インタ−ロイキン２（以下“ＩＬ−２”と称す）
は、Ｔ細胞減耗を招くＢＭＴを行なった後の患者から得
たリンパ球によるＴＮＦの生産を著しく増大させる。Ｔ
ＮＦ抗体は、ＢＭＴ後の死亡率を大きく減少させ、ＧＶ
ＨＤの急性期における皮膚および腸管損傷、およびその
他の好ましくない作用を防ぐ。この理由から、ＴＮＦ抗
体または他のＴＮＦ拮抗体は器官または組織移植の管理
に潜在的な用途を有することが期待される。
【００３６】
【実施例】本発明を以下の実施例および参考例によって
詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものと受け取るべきでない。以下の実施例におい
て、細胞の維持は、以下の培養培地を用いて、次のごと
く行なった。
詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものと受け取るべきでない。以下の実施例におい
て、細胞の維持は、以下の培養培地を用いて、次のごと
く行なった。
【００３７】ＭＬＤ細胞：この細胞は、２％ウシ胎児血
清（以下“ＦＢＳ”と称す）、８％子ウシ血清（以下
“ＢＣＳ”と称す）および０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイ
シンを補った最小必須培地（以下“ＭＥＭ”と称す）ま
たはＲＰＭＩ １６４０培地で通常の方法で維持した。 ＲＴ４細胞およびＡ２７８０細胞：この細胞は、１０％
ＦＢＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補った
ＲＰＭＩ １６４０培地で生長させた。
清（以下“ＦＢＳ”と称す）、８％子ウシ血清（以下
“ＢＣＳ”と称す）および０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイ
シンを補った最小必須培地（以下“ＭＥＭ”と称す）ま
たはＲＰＭＩ １６４０培地で通常の方法で維持した。 ＲＴ４細胞およびＡ２７８０細胞：この細胞は、１０％
ＦＢＳおよび０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補った
ＲＰＭＩ １６４０培地で生長させた。
【００３８】Ｌ９２９細胞：この細胞は、５％ＦＢＳお
よび０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったＲＰＭＩ
１６４０培地で維持した。 更に、以下の実施例では、ＴＮＦ阻害タンバク質の細胞
毒性およびＴＮＦ阻害活性の検定は以下の方法によって
行なった。 （１）細胞毒性の検定 Ｌ９２９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＣＬＩ）を９６ウェ
ルのマイクロタイタープレートの各ウェルの中に３×１
０4 個／ウェルの密度で接種する。これらのプレートを
２４時間インキュベートしたのち、順次希釈されたＴＮ
Ｆ阻害タンパク質を含むサンプルを各々のウェルにそれ
ぞれ加え、その後直ちにシクロヘキシミド（ＣＨＩ）を
最終濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌになるように加える。
よび０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補ったＲＰＭＩ
１６４０培地で維持した。 更に、以下の実施例では、ＴＮＦ阻害タンバク質の細胞
毒性およびＴＮＦ阻害活性の検定は以下の方法によって
行なった。 （１）細胞毒性の検定 Ｌ９２９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＣＣＬＩ）を９６ウェ
ルのマイクロタイタープレートの各ウェルの中に３×１
０4 個／ウェルの密度で接種する。これらのプレートを
２４時間インキュベートしたのち、順次希釈されたＴＮ
Ｆ阻害タンパク質を含むサンプルを各々のウェルにそれ
ぞれ加え、その後直ちにシクロヘキシミド（ＣＨＩ）を
最終濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌになるように加える。
【００３９】これらの細胞を３７℃で１６時間インキュ
ベートし、次いで１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定
し、０．０５％（ｗ／ｖ）メチレンブルーで染色する。
各ウェル中の細胞を水で洗浄したのち細胞中に残存する
染料（メチレンブルー）を５０％（ｖ／ｖ）エタノール
で溶出する。各ウェルの溶出液の吸光度をＢｉｏ−Ｔｅ
ｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ Ｅ
Ｌ３１１（米国、Ｖｅｒｍｏｎｔ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉの
Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で測定
する。この吸光度は生き残ったＬ９２９細胞の数に比例
する。このようにして、Ｌ９２９細胞について各サンプ
ルの細胞毒性活性を吸光度から評価する。
ベートし、次いで１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定
し、０．０５％（ｗ／ｖ）メチレンブルーで染色する。
各ウェル中の細胞を水で洗浄したのち細胞中に残存する
染料（メチレンブルー）を５０％（ｖ／ｖ）エタノール
で溶出する。各ウェルの溶出液の吸光度をＢｉｏ−Ｔｅ
ｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ Ｅ
Ｌ３１１（米国、Ｖｅｒｍｏｎｔ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉの
Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で測定
する。この吸光度は生き残ったＬ９２９細胞の数に比例
する。このようにして、Ｌ９２９細胞について各サンプ
ルの細胞毒性活性を吸光度から評価する。
【００４０】（２）ＴＮＦ阻害活性の検定 ＭＬＤ細胞を、生長培地を含有する９６ウェルのマイク
ロタイタープレートの各ウェル中に３×１０4 個／ウェ
ルの密度で接種する。これらのプレートを２４時間イン
キューベートしたのち、該細胞のための生長培地を吸引
して、２％ＢＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地と取り
代える。
ロタイタープレートの各ウェル中に３×１０4 個／ウェ
ルの密度で接種する。これらのプレートを２４時間イン
キューベートしたのち、該細胞のための生長培地を吸引
して、２％ＢＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地と取り
代える。
【００４１】順次希釈したＴＮＦ阻害タンパク質含有サ
ンプルを各々のウェルにそれぞれ加え、これらのプレー
トを１２時間インキュベートする。次いで、ウェル中に
細胞を残したまま培地をウェルから除去する。そしてこ
の細胞を、２％ＢＣＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に溶解
したＴＮＦ（１０００単位／ｍｌ）およびＣＨＩ（０．
１ｍｇ／ｍｌ）で処理する。
ンプルを各々のウェルにそれぞれ加え、これらのプレー
トを１２時間インキュベートする。次いで、ウェル中に
細胞を残したまま培地をウェルから除去する。そしてこ
の細胞を、２％ＢＣＳ含有のＲＰＭＩ １６４０に溶解
したＴＮＦ（１０００単位／ｍｌ）およびＣＨＩ（０．
１ｍｇ／ｍｌ）で処理する。
【００４２】使用したＴＮＦは、山崎ら〔ジャパニーズ
・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス・アンド
・バイオロジー（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂ
ｉｏｌ．），３９，１０５，１９８６〕の方法によって
測定したときの比活性は２．３×１０6 単位／ｍｇであ
る。細胞は３７℃で１６時間インキュベートし、１０％
ホルマリンで固定し、そして０．０５％（ｗ／ｖ）クリ
スタルバイオレットで染色する。細胞を染色している染
料（クリスタルバイオレット）を５０％エタノールで溶
出し、その吸光度を上記のＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｍｉｃｒｏ
ｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ ＥＬ３１１を使っ
て６００ｎｍで測定する。
・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンス・アンド
・バイオロジー（Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂ
ｉｏｌ．），３９，１０５，１９８６〕の方法によって
測定したときの比活性は２．３×１０6 単位／ｍｇであ
る。細胞は３７℃で１６時間インキュベートし、１０％
ホルマリンで固定し、そして０．０５％（ｗ／ｖ）クリ
スタルバイオレットで染色する。細胞を染色している染
料（クリスタルバイオレット）を５０％エタノールで溶
出し、その吸光度を上記のＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｍｉｃｒｏ
ｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ ＥＬ３１１を使っ
て６００ｎｍで測定する。
【００４３】ＴＮＦ阻害タンパク質の量は、次に定義す
る単位数によって表される。１単位は、ＭＬＤ細胞３×
１０4 個のうちの５０％を、１０００単位／ｍｌのＴＮ
Ｆおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＣＨＩの細胞溶解活性から
防御するＴＮＦ阻害タンパク質の量、すなわち３×１０
4 個の細胞のうちの５０％がそのような処理のあとに生
存することを許す量である。
る単位数によって表される。１単位は、ＭＬＤ細胞３×
１０4 個のうちの５０％を、１０００単位／ｍｌのＴＮ
Ｆおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＣＨＩの細胞溶解活性から
防御するＴＮＦ阻害タンパク質の量、すなわち３×１０
4 個の細胞のうちの５０％がそのような処理のあとに生
存することを許す量である。
【００４４】細胞生存度は、接種された細胞の数に対す
る生き残る細胞の数の比として計算され、吸光度に比例
する。計算において、ＣＨＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）のみ
を加えてインキュベートした細胞に関して得られた吸光
度を“１００％細胞生存度”とし、それに対して１００
０単位／ｍｌのＴＮＦと０．１ｍｇ／ｍｌのＣＨＩを加
えてインキュベートした細胞について得られた吸光度を
“０％細胞生存度”とする。
る生き残る細胞の数の比として計算され、吸光度に比例
する。計算において、ＣＨＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）のみ
を加えてインキュベートした細胞に関して得られた吸光
度を“１００％細胞生存度”とし、それに対して１００
０単位／ｍｌのＴＮＦと０．１ｍｇ／ｍｌのＣＨＩを加
えてインキュベートした細胞について得られた吸光度を
“０％細胞生存度”とする。
【００４５】
【実施例１】 工程１（細胞の調製） ヒト線維芽細胞系ＭＬＤの細胞（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｈｏ
ｒｏｓｚｅｗｉｃｚ博士から提供されたＭＬＤ細胞のよ
うな新生児の包皮からの細胞）を、組織培養皿（米国、
Ｌｉｎｋｏｌｎ ＰａｒｋのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ製の１００×２０ｍｍの型）
で１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で生長させ、集密的細胞
を得る。
ｒｏｓｚｅｗｉｃｚ博士から提供されたＭＬＤ細胞のよ
うな新生児の包皮からの細胞）を、組織培養皿（米国、
Ｌｉｎｋｏｌｎ ＰａｒｋのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ製の１００×２０ｍｍの型）
で１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ中で生長させ、集密的細胞
を得る。
【００４６】こうして得られた集密的細胞のうち３×１
０9 個の細胞を集め、ヨーロッパ特許出願公開第０１５
８２８６号記載の方法に従って調製しておいた比活性
２．３×１０6 単位／ｍｇのＴＮＦを１００単位／ｍｌ
含むＭＥＭ中で培養した。８時間培養を行なって細胞を
刺激し、細胞にＴＮＦ阻害タンパク質を産生させた。こ
の集密的細胞をリン酸塩緩衝食塩水溶液（以下“ＰＢ
Ｓ”と称す）で３回洗浄してから凍結し、組織培養皿か
らゴム製スクレーパーを用いて脱離させ、０．９ｌのＰ
ＢＳ中に懸濁させた。この懸濁液を音波処理し、１０
０，０００×ｇで１時間遠心分離にかけ、ＴＮＦ阻害タ
ンパク質を含む上清液を得た。この上清液０．９ｌか
ら、ＴＮＦ阻害タンパク質を下記の方法で精製した。
０9 個の細胞を集め、ヨーロッパ特許出願公開第０１５
８２８６号記載の方法に従って調製しておいた比活性
２．３×１０6 単位／ｍｇのＴＮＦを１００単位／ｍｌ
含むＭＥＭ中で培養した。８時間培養を行なって細胞を
刺激し、細胞にＴＮＦ阻害タンパク質を産生させた。こ
の集密的細胞をリン酸塩緩衝食塩水溶液（以下“ＰＢ
Ｓ”と称す）で３回洗浄してから凍結し、組織培養皿か
らゴム製スクレーパーを用いて脱離させ、０．９ｌのＰ
ＢＳ中に懸濁させた。この懸濁液を音波処理し、１０
０，０００×ｇで１時間遠心分離にかけ、ＴＮＦ阻害タ
ンパク質を含む上清液を得た。この上清液０．９ｌか
ら、ＴＮＦ阻害タンパク質を下記の方法で精製した。
【００４７】工程２（ＴＮＦ阻害タンパク質の精製） 上記０．９ｌの上清液を０．１ｌの１Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．９）と混合し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．０）で予め平衡化した制御された多孔ガラス（西
独、ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇのＳｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ製で１２０〜２００メッシュのＣＰ
Ｇ．１０）１００ｍｌを含むビーカーに注いで、１時間
ゆっくり攪拌した。
（ｐＨ４．９）と混合し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．０）で予め平衡化した制御された多孔ガラス（西
独、ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇのＳｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａ製で１２０〜２００メッシュのＣＰ
Ｇ．１０）１００ｍｌを含むビーカーに注いで、１時間
ゆっくり攪拌した。
【００４８】この混合物から液体を吸引除去した。残っ
た制御された多孔ガラスをＫ５０／３０カラム（米国Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に充填した。ＴＮＦ阻害
活性を有する画分を、０．５Ｍテトラメチルアンモニウ
ムクロライド（ｐＨ７．４）を含む３ベッド容量（３０
０ｍｌ）のＰＢＳを用い、流速１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時
（３００ｍｌ／時）でカラムから溶出させた。固体の塩
化ナトリウムをこの画分に加え、得られる溶液が５Ｍの
塩化ナトリウム濃度となるようにした。
た制御された多孔ガラスをＫ５０／３０カラム（米国Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙのＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に充填した。ＴＮＦ阻害
活性を有する画分を、０．５Ｍテトラメチルアンモニウ
ムクロライド（ｐＨ７．４）を含む３ベッド容量（３０
０ｍｌ）のＰＢＳを用い、流速１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時
（３００ｍｌ／時）でカラムから溶出させた。固体の塩
化ナトリウムをこの画分に加え、得られる溶液が５Ｍの
塩化ナトリウム濃度となるようにした。
【００４９】次いでこの画分を５Ｎ ＮａＯＨでｐＨ
７．４に調整して、０．５Ｍテトラメチルアンモニウム
クロライドおよび５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．４、平衡緩衝液）で予め平衡化し
ておいたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４
Ｂ ２０ｍｌを充填したＫ−２６／４０カラム（米国Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ製）に通した。
７．４に調整して、０．５Ｍテトラメチルアンモニウム
クロライドおよび５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン
酸塩緩衝液（ｐＨ７．４、平衡緩衝液）で予め平衡化し
ておいたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４
Ｂ ２０ｍｌを充填したＫ−２６／４０カラム（米国Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ製）に通した。
【００５０】この画分は、１０ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速
でカラムに流した。そして、カラムを３ベッド容量の上
記平衡緩衝液で洗浄した。次いで、このカラムを、予め
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化させておいたＣｕ 2+キレ
ートＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを充填したＫ１６／２０
カラム〔米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ製であって、トレンヅ・イン・バイオ
テクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）、３，１−７，１９８５にＳｕｌｋｏｗｓ
ｋｉによって記載されている方法で調製したもの〕に、
チューブを介して連結した。
でカラムに流した。そして、カラムを３ベッド容量の上
記平衡緩衝液で洗浄した。次いで、このカラムを、予め
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化させておいたＣｕ 2+キレ
ートＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを充填したＫ１６／２０
カラム〔米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ製であって、トレンヅ・イン・バイオ
テクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）、３，１−７，１９８５にＳｕｌｋｏｗｓ
ｋｉによって記載されている方法で調製したもの〕に、
チューブを介して連結した。
【００５１】ＴＮＦ阻害活性を持つ画分は、Ｐｈｅｎｙ
ｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム中の画分をＰＢＳ（ｐＨ
７．４）を用いて１０ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で溶出さ
せることにより、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４ＢカラムからＣｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムへ移送させた。移送を完了させるために、１０
０ｍｌのＰＢＳ（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムの５ベッド容量）が必要であった。
ｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム中の画分をＰＢＳ（ｐＨ
７．４）を用いて１０ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で溶出さ
せることにより、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４ＢカラムからＣｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラムへ移送させた。移送を完了させるために、１０
０ｍｌのＰＢＳ（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムの５ベッド容量）が必要であった。
【００５２】このＣｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムを３ベッド容量（１５ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．
４）で洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む溶液（ｐＨ４．０）で予め平衡にしておい
たＦｅ3+キレートＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ２ｍｌを充填したＫ９／１５カラム〔米国Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製
であって、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，
１−７，１９８５にＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載さ
れている方法で調製したもの〕にチューブを介して連結
した。
ラムを３ベッド容量（１５ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．
４）で洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む溶液（ｐＨ４．０）で予め平衡にしておい
たＦｅ3+キレートＦａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ２ｍｌを充填したＫ９／１５カラム〔米国Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製
であって、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，
１−７，１９８５にＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載さ
れている方法で調製したもの〕にチューブを介して連結
した。
【００５３】ＴＮＦ阻害活性を持つ画分は、０．１Ｍ酢
酸ナトリウムおよび１Ｍ ＮａＣｌを含む５ベッド容量
（２５ｍｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を
用い、Ｃｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムから取
り出し、Ｆｅ3+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに流
した。この画分のＦｅ3+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムへの流入は１０ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で行なっ
た。
酸ナトリウムおよび１Ｍ ＮａＣｌを含む５ベッド容量
（２５ｍｌ）の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を
用い、Ｃｕ2+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムから取
り出し、Ｆｅ3+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムに流
した。この画分のＦｅ3+キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムへの流入は１０ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で行なっ
た。
【００５４】次いで、このＦｅ3+キレートＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラムを５ベッド容量（１０ｍｌ）の上記酢酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄し、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ１０．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ １ｍｌを充填した２ｍｌ Ｐｏｌｙ−Ｐ
ｒｅｐ使い捨てポリプロピレン カラム（米国Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）にチューブを介
して連結した。
ｏｓｅカラムを５ベッド容量（１０ｍｌ）の上記酢酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄し、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ１０．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ １ｍｌを充填した２ｍｌ Ｐｏｌｙ−Ｐ
ｒｅｐ使い捨てポリプロピレン カラム（米国Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）にチューブを介
して連結した。
【００５５】Ｆｅ3+ キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムに吸着されたＴＮＦ阻害タンパク質は、１０ｍｌの
０．１Ｍトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ１０．０）を用
い、５ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で溶出させ、そしてこの
タンパク質をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに移
送させた。このＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを
５ベッド容量の上記トリス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄した。
ムに吸着されたＴＮＦ阻害タンパク質は、１０ｍｌの
０．１Ｍトリス−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ１０．０）を用
い、５ｍｌ／ｃｍ2 ／時の流速で溶出させ、そしてこの
タンパク質をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに移
送させた。このＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを
５ベッド容量の上記トリス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄した。
【００５６】ＴＮＦ阻害タンパク質を、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む１５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）を用いて重力によりカラムから溶出させ、ＴＮ
Ｆ阻害タンパク質を含む画分を得た。このようにして得
た画分をＭｕｌｔｉｐｌｅ−Ｍｉｃｒｏ−ＰｒｏｄｉＣ
ｏｎモデル３１０（米国、ＢｅａｖｅｒｔｏｎのＢｉｏ
−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ製）を使用し
て濃縮し、ＴＮＦ阻害タンパク質を含む濃縮物を得た。
ａＣｌを含む１５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）を用いて重力によりカラムから溶出させ、ＴＮ
Ｆ阻害タンパク質を含む画分を得た。このようにして得
た画分をＭｕｌｔｉｐｌｅ−Ｍｉｃｒｏ−ＰｒｏｄｉＣ
ｏｎモデル３１０（米国、ＢｅａｖｅｒｔｏｎのＢｉｏ
−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ製）を使用し
て濃縮し、ＴＮＦ阻害タンパク質を含む濃縮物を得た。
【００５７】工程３（ＴＮＦ阻害タンパク質の特徴化） 工程２で得た濃縮物の一部を１５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）にかけた。得られるゲルを銀染色すると、ゲル上
に２本のバンドが観察された。すなわち、主バンドは２
８ｋＤａの分子量に相当し、第２のバンドは３３．４ｋ
Ｄａの分子量に相当するものであった。
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）にかけた。得られるゲルを銀染色すると、ゲル上
に２本のバンドが観察された。すなわち、主バンドは２
８ｋＤａの分子量に相当し、第２のバンドは３３．４ｋ
Ｄａの分子量に相当するものであった。
【００５８】このゲルから、Ｅｌｕｔｒａｐ Ｓｙｓｔ
ｅｍ（米国、ＫｅｅｎｅのＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ製）を使用して、このシステムのマ
ニュアル記載の方法に従い、電気溶離によって約１００
ｎｇの２８ｋＤａタンパク質を単離した。単離した２８
ｋＤａタンパク質は、上記の方法に従って、ヒト線維芽
細胞系ＭＬＤの細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性およ
び／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性、およびＬ
９２９細胞に対する細胞毒性活性を阻害する活性に関し
て試験した。
ｅｍ（米国、ＫｅｅｎｅのＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎ
ｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ製）を使用して、このシステムのマ
ニュアル記載の方法に従い、電気溶離によって約１００
ｎｇの２８ｋＤａタンパク質を単離した。単離した２８
ｋＤａタンパク質は、上記の方法に従って、ヒト線維芽
細胞系ＭＬＤの細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性およ
び／または細胞増殖抑制活性を阻害する活性、およびＬ
９２９細胞に対する細胞毒性活性を阻害する活性に関し
て試験した。
【００５９】その結果から、このタンパク質はＭＬＤ細
胞をＴＮＦの細胞溶解活性から防御し、またＬ９２９細
胞を溶解させないことが分かる。濃縮物のもう一つの部
分を順次希釈し、得られる種々濃度の希釈物を、それぞ
れ、日本特許出願公開第６１−６３６９８号明細書記載
の方法によって得られた抗ＴＮＦモノクローナル抗体１
０００単位／ｍｌを含む溶液５０μｌ、抗ＩＬ−１ポリ
クローナル抗体（米国、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、ロット番
号♯０１７３７）１０００単位／ｍｌを含む溶液５０μ
ｌ、抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（米国Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ製、ロット番号♯Ｂ８１１２）１０００単位／ｍｌを
含む溶液５０μｌ、そして上記溶液を各１６．７μｌず
つ混合した混合溶液と共に、それぞれ２時間インキュベ
ートした。
胞をＴＮＦの細胞溶解活性から防御し、またＬ９２９細
胞を溶解させないことが分かる。濃縮物のもう一つの部
分を順次希釈し、得られる種々濃度の希釈物を、それぞ
れ、日本特許出願公開第６１−６３６９８号明細書記載
の方法によって得られた抗ＴＮＦモノクローナル抗体１
０００単位／ｍｌを含む溶液５０μｌ、抗ＩＬ−１ポリ
クローナル抗体（米国、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、ロット番
号♯０１７３７）１０００単位／ｍｌを含む溶液５０μ
ｌ、抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（米国Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ製、ロット番号♯Ｂ８１１２）１０００単位／ｍｌを
含む溶液５０μｌ、そして上記溶液を各１６．７μｌず
つ混合した混合溶液と共に、それぞれ２時間インキュベ
ートした。
【００６０】得られるインキュベーション溶液を各々２
００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４Ｂ（スウェーデンＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎ
ｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ製）と混合したのち、１時
間インキュベートした。次いで、それら混合物の各々を
遠心分離にかけて上清液を得た。この上清液を、ＭＬＤ
細胞に対するＴＮＦ活性を阻害する活性の上記方法によ
る検定に使用した。
００μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−４Ｂ（スウェーデンＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎ
ｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢ製）と混合したのち、１時
間インキュベートした。次いで、それら混合物の各々を
遠心分離にかけて上清液を得た。この上清液を、ＭＬＤ
細胞に対するＴＮＦ活性を阻害する活性の上記方法によ
る検定に使用した。
【００６１】その結果は、２８ｋＤａタンパク質のＴＮ
Ｆ阻害活性は、抗ＴＮＦモノクローナル抗体、抗ＩＬ−
１ポリクロ−ナル抗体、抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体
またはそれらの混合物のどれとインキュベートしても影
響されなかったことを示している。更に、ＴＮＦ阻害タ
ンパク質を６時間ＴＮＦと一緒に試験管中でインキュベ
ートした。
Ｆ阻害活性は、抗ＴＮＦモノクローナル抗体、抗ＩＬ−
１ポリクロ−ナル抗体、抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体
またはそれらの混合物のどれとインキュベートしても影
響されなかったことを示している。更に、ＴＮＦ阻害タ
ンパク質を６時間ＴＮＦと一緒に試験管中でインキュベ
ートした。
【００６２】得られる混合物を、マイクロタイタープレ
ート中に保持されているＭＬＤ細胞に加え、ＭＬＤ細胞
に対するＴＮＦの細胞溶解活性を試験した。その結果
は、ＴＮＦの細胞溶解活性が影響を受けないことを示し
ている。このことは、ＴＮＦ阻害タンパク質はＴＮＦの
細胞溶解活性を直接には阻害するものでないことを意味
する。
ート中に保持されているＭＬＤ細胞に加え、ＭＬＤ細胞
に対するＴＮＦの細胞溶解活性を試験した。その結果
は、ＴＮＦの細胞溶解活性が影響を受けないことを示し
ている。このことは、ＴＮＦ阻害タンパク質はＴＮＦの
細胞溶解活性を直接には阻害するものでないことを意味
する。
【００６３】上記データにより、本発明のＴＮＦ阻害タ
ンパク質は、尿から単離した従来のＴＮＦ結合因子とは
異なり、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの細胞溶
解活性を低下させるのではないこと、および本発明のＴ
ＮＦ阻害タンパク質はいくつかの代謝過程を誘発してＴ
ＮＦの細胞溶解活性を低下させることができることが示
唆される。
ンパク質は、尿から単離した従来のＴＮＦ結合因子とは
異なり、ＴＮＦに結合することによってＴＮＦの細胞溶
解活性を低下させるのではないこと、および本発明のＴ
ＮＦ阻害タンパク質はいくつかの代謝過程を誘発してＴ
ＮＦの細胞溶解活性を低下させることができることが示
唆される。
【００６４】
【実施例２】 工程１（培養上清液の調製） 末梢血液白血球（ＰＢＬ）を２５０ｍｌの供与体血液か
ら濃縮し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ（スウェーデ
ン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて単離した。それを
１０％ＦＢＳおよび上記方法によって調製されたＴＮＦ
（１００単位／ｍｌ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ １６
４０培地中に懸濁させた。
ら濃縮し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅ（スウェーデ
ン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いて単離した。それを
１０％ＦＢＳおよび上記方法によって調製されたＴＮＦ
（１００単位／ｍｌ）を含む５０ｍｌのＲＰＭＩ １６
４０培地中に懸濁させた。
【００６５】この混合物を３７℃で８時間インキュベー
トした後、４００×ｇで１０分間遠心分離にかけて細胞
を培養物から集め、培養物を消耗培地とＰＢＬとに分離
した。上清液を除去した後、ＰＢＬを集め、ＰＢＳで洗
浄してから遠心分離にかけた。この洗浄と遠心分離は合
計３回行なった。得られるＰＢＬを、３×１０6 個／ｍ
ｌの細胞濃度で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４
０培地中に懸濁させ、３７℃で２４時間インキュベート
した。
トした後、４００×ｇで１０分間遠心分離にかけて細胞
を培養物から集め、培養物を消耗培地とＰＢＬとに分離
した。上清液を除去した後、ＰＢＬを集め、ＰＢＳで洗
浄してから遠心分離にかけた。この洗浄と遠心分離は合
計３回行なった。得られるＰＢＬを、３×１０6 個／ｍ
ｌの細胞濃度で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４
０培地中に懸濁させ、３７℃で２４時間インキュベート
した。
【００６６】得られた順化培地をそのまま（すなわち、
ＭＬＤ細胞を使用した実施例１の場合のような細胞ホモ
ジネートではなく）、以下のようにＴＮＦ阻害タンパク
質の精製に供した。 工程２（ＴＮＦ阻害タンパク質の精製） 順化培地を培地から取り、８μｍ厚さの膜フィルターを
通してろ過することにより順化培地中に残っている細胞
砕片を除去した。
ＭＬＤ細胞を使用した実施例１の場合のような細胞ホモ
ジネートではなく）、以下のようにＴＮＦ阻害タンパク
質の精製に供した。 工程２（ＴＮＦ阻害タンパク質の精製） 順化培地を培地から取り、８μｍ厚さの膜フィルターを
通してろ過することにより順化培地中に残っている細胞
砕片を除去した。
【００６７】得られる上清液を下記のようにして精製し
た。以下の精製操作は全て４℃で行なった。２．７ｌの
培地を０．３ｌのＩＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）
〔９（培地）：１（酢酸ナトリウム）の容量比〕により
ｐＨ５．０の酸性にした。この酸性にした試料を、予め
０．１Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化しておいた抑制された
多孔ガラス（Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ販売のＣＰＧ）３０ｍｌを含むプラスチックフラスコ
に分配した（酸性化試料１００ｍｌに対してＣＰＧ１ｍ
ｌ）。
た。以下の精製操作は全て４℃で行なった。２．７ｌの
培地を０．３ｌのＩＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）
〔９（培地）：１（酢酸ナトリウム）の容量比〕により
ｐＨ５．０の酸性にした。この酸性にした試料を、予め
０．１Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化しておいた抑制された
多孔ガラス（Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ販売のＣＰＧ）３０ｍｌを含むプラスチックフラスコ
に分配した（酸性化試料１００ｍｌに対してＣＰＧ１ｍ
ｌ）。
【００６８】これを１時間静かに攪拌した後、液体を混
合物から吸引除去してＣＰＧを得た。このＣＰＧをＫ２
６／４０カラム（米国、ＰｉｓｃａｔｗａｙのＰｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）
に充填した。このカラムを、６ベッド容量（１８０ｍ
ｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、および
６ベッド容量（１８０ｍｌ）の０．０２Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．４）で順次洗浄した。溶出は、溶離剤と
して直線型濃度勾配のテトラメチルアンモニウム クロ
ライド（０〜０．５Ｍ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を
使用して３０ｍｌ／ｃｍ2 ／時（１５０ｍｌ／時）の流
速で行ない、４ｍｌずつの画分を集めた。使用した溶離
剤の量は１０ベッド容量（３００ｍｌ）に等しい。
合物から吸引除去してＣＰＧを得た。このＣＰＧをＫ２
６／４０カラム（米国、ＰｉｓｃａｔｗａｙのＰｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）
に充填した。このカラムを、６ベッド容量（１８０ｍ
ｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、および
６ベッド容量（１８０ｍｌ）の０．０２Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．４）で順次洗浄した。溶出は、溶離剤と
して直線型濃度勾配のテトラメチルアンモニウム クロ
ライド（０〜０．５Ｍ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を
使用して３０ｍｌ／ｃｍ2 ／時（１５０ｍｌ／時）の流
速で行ない、４ｍｌずつの画分を集めた。使用した溶離
剤の量は１０ベッド容量（３００ｍｌ）に等しい。
【００６９】このうちＮｏ．１７からＮｏ．４９の画分
がＴＮＦ阻害性を示した。これらの画分を合わせて、合
わせた画分に最終濃度が５Ｍになるように固形の塩化ナ
トリウムを加えた。得られた画分を、次に、予め５Ｍ
ＮａＣｌ水溶液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）１
５ｍｌを充填したＫ−１６／２０カラム（米国Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に
通した。この画分を２５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（５０ｍｌ／
時）の流速でカラムに通した。
がＴＮＦ阻害性を示した。これらの画分を合わせて、合
わせた画分に最終濃度が５Ｍになるように固形の塩化ナ
トリウムを加えた。得られた画分を、次に、予め５Ｍ
ＮａＣｌ水溶液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）１
５ｍｌを充填したＫ−１６／２０カラム（米国Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に
通した。この画分を２５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（５０ｍｌ／
時）の流速でカラムに通した。
【００７０】次いで、このカラムを６ベッド容量（９０
ｍｌ）の５Ｍ ＮａＣｌ、および３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）を含む６ベッド容量（９０ｍｌ）の０．０２Ｍ
リン酸塩緩衝液（以下、“ＰＢ”と称す）で洗浄した。
溶出は直線型濃度勾配のＮａＣｌ（３Ｍ〜０．１５Ｍ）
のＰＢ溶液２００ｍｌで行ない、４ｍｌずつの画分を集
めた。
ｍｌ）の５Ｍ ＮａＣｌ、および３Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ
７．４）を含む６ベッド容量（９０ｍｌ）の０．０２Ｍ
リン酸塩緩衝液（以下、“ＰＢ”と称す）で洗浄した。
溶出は直線型濃度勾配のＮａＣｌ（３Ｍ〜０．１５Ｍ）
のＰＢ溶液２００ｍｌで行ない、４ｍｌずつの画分を集
めた。
【００７１】このうちＮｏ．９〜Ｎｏ．３０の画分がＴ
ＮＦ阻害活性を示した。これらの画分を合わせて、最終
のイミダゾール濃度が１ｍＭになるように１００ｍＭイ
ミダゾールと混合した。得られる溶液を１Ｍ ＮａＯＨ
でｐＨ７．４に調整し、そして５ｍｌのＣｕ2+−イミダ
ゾール−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを充填したＫ−１６／２０
カラムに１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３０ｍｌ／時）の流速
で通した。
ＮＦ阻害活性を示した。これらの画分を合わせて、最終
のイミダゾール濃度が１ｍＭになるように１００ｍＭイ
ミダゾールと混合した。得られる溶液を１Ｍ ＮａＯＨ
でｐＨ７．４に調整し、そして５ｍｌのＣｕ2+−イミダ
ゾール−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを充填したＫ−１６／２０
カラムに１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３０ｍｌ／時）の流速
で通した。
【００７２】このＣｕ2+−イミダゾール−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅを充填したカラムは次のように調製したものであ
る。Ｃｈｅｌａｔｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを充填
したＫ−１６／２０カラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をｐＨ４のＣ
ｕＳＯ4 溶液で洗浄した。このカラムをＰＢＳで平衡化
した後、得られたカラム内のＣｕ2+−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅを６ベッド容量（２５ｍｌ）の２５ｍＭイミダゾール
ＰＢＳ溶液で飽和させ、１ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液
で平衡化した。
ｏｓｅを充填したカラムは次のように調製したものであ
る。Ｃｈｅｌａｔｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを充填
したＫ−１６／２０カラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）をｐＨ４のＣ
ｕＳＯ4 溶液で洗浄した。このカラムをＰＢＳで平衡化
した後、得られたカラム内のＣｕ2+−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅを６ベッド容量（２５ｍｌ）の２５ｍＭイミダゾール
ＰＢＳ溶液で飽和させ、１ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液
で平衡化した。
【００７３】このカラムを６ベッド容量（３０ｍｌ）の
１ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で洗浄した後、溶離剤と
して直線型濃度勾配のイミダゾール（１ｍＭ〜２５ｍ
Ｍ）を用いて溶出を行ない、２ｍｌずつの画分を２５ｍ
ｌ／ｃｍ2 ／時（５０ｍｌ／時）の流速で集めた。溶離
剤の全量は１００ｍｌ（２０ベッド容量）であった。こ
のうちＮｏ．６〜Ｎｏ．２０の画分がＴＮＦ阻害活性を
示した。これらの画分を合わせ、ＹＭ１０膜（米国Ａｍ
ｉｃｏｎ製）を備えたＡｍｉｃｏｎセル（モデル５２）
を使用して１ｍｌに濃縮した。
１ｍＭイミダゾールＰＢＳ溶液で洗浄した後、溶離剤と
して直線型濃度勾配のイミダゾール（１ｍＭ〜２５ｍ
Ｍ）を用いて溶出を行ない、２ｍｌずつの画分を２５ｍ
ｌ／ｃｍ2 ／時（５０ｍｌ／時）の流速で集めた。溶離
剤の全量は１００ｍｌ（２０ベッド容量）であった。こ
のうちＮｏ．６〜Ｎｏ．２０の画分がＴＮＦ阻害活性を
示した。これらの画分を合わせ、ＹＭ１０膜（米国Ａｍ
ｉｃｏｎ製）を備えたＡｍｉｃｏｎセル（モデル５２）
を使用して１ｍｌに濃縮した。
【００７４】この濃縮物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１
００ＨＲ（米国ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を充填したＫ−１６／１００カラ
ム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ製）に通して、５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（１０
ｍｌ／時）の流速でゲルろ過を行ない、２ｍｌずつの画
分を集めた。
００ＨＲ（米国ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を充填したＫ−１６／１００カラ
ム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ製）に通して、５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（１０
ｍｌ／時）の流速でゲルろ過を行ない、２ｍｌずつの画
分を集めた。
【００７５】このうちＮｏ．４６〜Ｎｏ．５２の画分が
ＴＮＦ阻害活性を示した。これら画分をプールして、Ｋ
１６／２０（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）カラム内に充填したＣｕ2+キ
レートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（５ｍｌ）〔米国Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であ
って、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１〜
７、１９８５にＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載された
方法で調製〕に通した。
ＴＮＦ阻害活性を示した。これら画分をプールして、Ｋ
１６／２０（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）カラム内に充填したＣｕ2+キ
レートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（５ｍｌ）〔米国Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であ
って、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１〜
７、１９８５にＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載された
方法で調製〕に通した。
【００７６】このカラムを６ベッド容量のＰＢＳ（３０
ｍｌ）、６ベッド容量（３０ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．０）および０．１５Ｍ ＮａＣｌを含
む６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
０）で順次洗浄し、溶離剤として１Ｍ ＮａＣｌを含む
直線型ｐＨ勾配の酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０からｐＨ
４．０）を用い、１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３０ｍｌ／
時）の流速で溶出を行なった。溶出液として２ｍｌずつ
の画分を集めた。
ｍｌ）、６ベッド容量（３０ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．０）および０．１５Ｍ ＮａＣｌを含
む６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
０）で順次洗浄し、溶離剤として１Ｍ ＮａＣｌを含む
直線型ｐＨ勾配の酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０からｐＨ
４．０）を用い、１５ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３０ｍｌ／
時）の流速で溶出を行なった。溶出液として２ｍｌずつ
の画分を集めた。
【００７７】このうちＮｏ．１４〜Ｎｏ．２８の画分
（ｐＨ４．７〜４．０）がＴＮＦ阻害活性を示した。こ
れらの画分をプールし、そして２ｍｌのＦｅ3+キレート
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ〔Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であ
って、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１〜
７、１９８５のＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載された
方法で調製したもの〕を充填し且つ１Ｍ ＮａＣｌを含
む０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で平衡化してある
Ｋ−９／１５カラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。
（ｐＨ４．７〜４．０）がＴＮＦ阻害活性を示した。こ
れらの画分をプールし、そして２ｍｌのＦｅ3+キレート
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ〔Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であ
って、トレンヅ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３，１〜
７、１９８５のＳｕｌｋｏｗｓｋｉによって記載された
方法で調製したもの〕を充填し且つ１Ｍ ＮａＣｌを含
む０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で平衡化してある
Ｋ−９／１５カラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。
【００７８】このカラムを１Ｍ ＮａＣｌを含む６ベッ
ド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４）、６ベッド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６）で順次洗浄した。ＴＮＦ阻害タンパク質
は６ベッド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ１０）でカラムから溶出させた。上記操作、すな
わちサンプルをＫ−９／１５カラムに通し、洗浄し、溶
出する操作は５０ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３２ｍｌ時）の流
速で行なった。
ド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４）、６ベッド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６）で順次洗浄した。ＴＮＦ阻害タンパク質
は６ベッド容量（１２ｍｌ）の０．１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ１０）でカラムから溶出させた。上記操作、すな
わちサンプルをＫ−９／１５カラムに通し、洗浄し、溶
出する操作は５０ｍｌ／ｃｍ2 ／時（３２ｍｌ時）の流
速で行なった。
【００７９】得られた溶出液は２ｍｌのＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂを充填したＫ−９／１５カ
ラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。このカラムを、６ベッド
容量の０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０）、０．０５Ｍ
ＮａＣｌを含む６ベッド容量の０．１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ１０）および６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．０）で順次洗浄した。
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂを充填したＫ−９／１５カ
ラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。このカラムを、６ベッド
容量の０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ１０）、０．０５Ｍ
ＮａＣｌを含む６ベッド容量の０．１Ｍトリス緩衝液
（ｐＨ１０）および６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６．０）で順次洗浄した。
【００８０】溶出は、直線型濃度勾配のＮａＣｌ（０〜
１５０ｍＭ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）溶液
２０ベッド容量（４０ｍｌ）で行ない、２ｍｌずつの画
分を集めた。このうちＮｏ．１０〜Ｎｏ．１５の画分が
ＴＮＦ阻害活性を示した。これらの画分をプールし、そ
して、２ｍｌのヒドロキシルアパタイト（米国Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ，ＲｉｃｈｍｏｎｄのＢｉｏ Ｒａｄ製）
を充填し且つ０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化してあるＫ−９／１５カ
ラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。
１５０ｍＭ）の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）溶液
２０ベッド容量（４０ｍｌ）で行ない、２ｍｌずつの画
分を集めた。このうちＮｏ．１０〜Ｎｏ．１５の画分が
ＴＮＦ阻害活性を示した。これらの画分をプールし、そ
して、２ｍｌのヒドロキシルアパタイト（米国Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ，ＲｉｃｈｍｏｎｄのＢｉｏ Ｒａｄ製）
を充填し且つ０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化してあるＫ−９／１５カ
ラム（米国Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ製）に通した。
【００８１】このカラムを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含
む６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）、
６ベッド容量の１Ｍ ＮａＣｌ、６ベッド容量の０．０
０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で順次洗浄し
た。ＴＮＦ阻害タンパク質を含む画分を、６ベッド容量
の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を用いて溶
出した。上記操作、すなわち、サンプルをＫ−９／１５
カラムに通し、洗浄し、溶出する操作は５０ｍｌ／ｃｍ
2 ／時（３２ｍｌ／時）の流速で行なった。
む６ベッド容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）、
６ベッド容量の１Ｍ ＮａＣｌ、６ベッド容量の０．０
０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で順次洗浄し
た。ＴＮＦ阻害タンパク質を含む画分を、６ベッド容量
の０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を用いて溶
出した。上記操作、すなわち、サンプルをＫ−９／１５
カラムに通し、洗浄し、溶出する操作は５０ｍｌ／ｃｍ
2 ／時（３２ｍｌ／時）の流速で行なった。
【００８２】この画分中のＴＮＦ阻害タンパク質を、Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ−Ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｏｄｉｃｏｎ Ｍｏ
ｄｅｌ ３１０（米国ＢｅａｖｅｒｔｏｎのＢｉｏ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ製）を使用して濃
縮し、ＴＮＦ阻害タンパク質の濃縮物を得た。 工程３（ＴＮＦ阻害タンパク質の特徴化） 工程２で得られた濃縮物に、１５％ ＳＤＳ−ポリアク
リルアミド ゲル電気泳動を行ない、銀染色を行なっ
た。
ｕｌｔｉｐｌｅ−Ｍｉｃｒｏ−Ｐｒｏｄｉｃｏｎ Ｍｏ
ｄｅｌ ３１０（米国ＢｅａｖｅｒｔｏｎのＢｉｏ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ製）を使用して濃
縮し、ＴＮＦ阻害タンパク質の濃縮物を得た。 工程３（ＴＮＦ阻害タンパク質の特徴化） 工程２で得られた濃縮物に、１５％ ＳＤＳ−ポリアク
リルアミド ゲル電気泳動を行ない、銀染色を行なっ
た。
【００８３】その結果、３７ｋＤａ、２８ｋＤａ、１８
ｋＤａ、および９〜１３ｋＤａの分子量に相当するタン
パク質のバンドが４本認められた。２８ｋＤａのタンパ
ク質を実施例１の工程３における方法と同じ方法でゲル
から単離し、約８０ｎｇのＴＮＦ阻害タンパク質を得
た。このＴＮＦ阻害タンパク質の活性を実施例１の工程
３と同じ方法で試験した。その結果は、このＴＮＦ阻害
タンパク質のＴＮＦ阻害活性は、抗ＴＮＦモノクローナ
ル抗体、抗ＩＬ−１ポリクローナル抗体、抗ＩＬ−６ポ
リクローナル抗体およびそれらの混合物のいずれとのイ
ンキュベーションによっても影響を受けなかったことを
示している。
ｋＤａ、および９〜１３ｋＤａの分子量に相当するタン
パク質のバンドが４本認められた。２８ｋＤａのタンパ
ク質を実施例１の工程３における方法と同じ方法でゲル
から単離し、約８０ｎｇのＴＮＦ阻害タンパク質を得
た。このＴＮＦ阻害タンパク質の活性を実施例１の工程
３と同じ方法で試験した。その結果は、このＴＮＦ阻害
タンパク質のＴＮＦ阻害活性は、抗ＴＮＦモノクローナ
ル抗体、抗ＩＬ−１ポリクローナル抗体、抗ＩＬ−６ポ
リクローナル抗体およびそれらの混合物のいずれとのイ
ンキュベーションによっても影響を受けなかったことを
示している。
【００８４】
（ＴＮＦ感受性細胞系ＲＴ４およびＡ２７８０のＴＮＦ
による溶解に対するＴＮＦ阻害タンパク質の阻害活性）
ＴＮＦ阻害タンパク質がＴＮＦの細胞溶解活性を阻害す
る活性は、ＴＮＦ感受性腫瘍細胞〔ヒト膀胱癌細胞系Ｒ
Ｔ４（ＡＴＴＣ ＨＴＢ２）〕およびヒト卵巣癌細胞系
Ａ２７８０（旭化成工業株式会社、大塚博士によって供
与されたもの）を用いて下記の方法により測定した。
による溶解に対するＴＮＦ阻害タンパク質の阻害活性）
ＴＮＦ阻害タンパク質がＴＮＦの細胞溶解活性を阻害す
る活性は、ＴＮＦ感受性腫瘍細胞〔ヒト膀胱癌細胞系Ｒ
Ｔ４（ＡＴＴＣ ＨＴＢ２）〕およびヒト卵巣癌細胞系
Ａ２７８０（旭化成工業株式会社、大塚博士によって供
与されたもの）を用いて下記の方法により測定した。
【００８５】ＲＴ４細胞及びＡ２７８０細胞を、それぞ
れ、９６ウェルのマイクロプレートに添加した上記培地
中に１×１０3 個／ウェルの密度で接種した。２４時間
のインキュベーションののち、各ウェルの培地を取り出
して、実施例１で得たＴＮＦ阻害タンパク質を１００単
位／ｍｌ濃度で含む新しい培地と取り代えた。２４時間
のインキュベーションののち、ＴＮＦを１、１０、１０
０、１０００、１００００単位／ｍｌと濃度を変えてウ
ェルに添加し、培養した。５日後の、各ウェルの細胞の
成長をＤａｎｉｚｏｔおよびＬａｎｇのＭＴＴ検定法
〔ジャーナル・オブ・イミュノロジカル メソッド
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．），８９，２７１−
２７７、１９８６〕によって測定した。
れ、９６ウェルのマイクロプレートに添加した上記培地
中に１×１０3 個／ウェルの密度で接種した。２４時間
のインキュベーションののち、各ウェルの培地を取り出
して、実施例１で得たＴＮＦ阻害タンパク質を１００単
位／ｍｌ濃度で含む新しい培地と取り代えた。２４時間
のインキュベーションののち、ＴＮＦを１、１０、１０
０、１０００、１００００単位／ｍｌと濃度を変えてウ
ェルに添加し、培養した。５日後の、各ウェルの細胞の
成長をＤａｎｉｚｏｔおよびＬａｎｇのＭＴＴ検定法
〔ジャーナル・オブ・イミュノロジカル メソッド
（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．），８９，２７１−
２７７、１９８６〕によって測定した。
【００８６】即ち、マイクロプレートを裏返して、軽く
はたき、ブロットすることによって、ウェル中に細胞を
のこしたままウェル中の培養培地を取り除いた。各々の
ウェルに、１ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロマイド（ＭＴＴ）を含む１００μｌのＲＰＭＩ１
６４０培地を加えた。
はたき、ブロットすることによって、ウェル中に細胞を
のこしたままウェル中の培養培地を取り除いた。各々の
ウェルに、１ｍｇ／ｍｌの３−（４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウ
ムブロマイド（ＭＴＴ）を含む１００μｌのＲＰＭＩ１
６４０培地を加えた。
【００８７】このプレートを３７℃で４時間インキュベ
ートした。インキュベーション終了後、変化しないで残
ったＭＴＴを各々のウェルから注意深く除去し、プロパ
ノール（１５０μｌ）を各々のウェルに加えた。プレー
トを振とうし、各ウェルの吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｍ
ｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ モデル３
１０（米国、Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＷｉｎｏｏｓｋｉのＢｉ
ｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用して
５７０ｎｍで測定した。
ートした。インキュベーション終了後、変化しないで残
ったＭＴＴを各々のウェルから注意深く除去し、プロパ
ノール（１５０μｌ）を各々のウェルに加えた。プレー
トを振とうし、各ウェルの吸光度をＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｍ
ｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ モデル３
１０（米国、Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＷｉｎｏｏｓｋｉのＢｉ
ｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を使用して
５７０ｎｍで測定した。
【００８８】対照として、ＴＮＦを各ウェルに加えなか
った以外は上記と同じ処理を繰り返した。細胞の成長
は、対照ウェルの細胞数に対するＴＮＦ添加ウェルの細
胞数の比率（％）によって表わした。検定は、ＴＮＦ濃
度およびＴＮＦ阻害タンパク質濃度の各々について３回
ずつ行ない、細胞成長の平均値および標準偏差を計算し
た。
った以外は上記と同じ処理を繰り返した。細胞の成長
は、対照ウェルの細胞数に対するＴＮＦ添加ウェルの細
胞数の比率（％）によって表わした。検定は、ＴＮＦ濃
度およびＴＮＦ阻害タンパク質濃度の各々について３回
ずつ行ない、細胞成長の平均値および標準偏差を計算し
た。
【００８９】結果を図１及び図２に示す。図１及び図２
において、○−○の記号はＴＮＦ阻害タンパク質濃度０
単位／ｍｌについて得られた結果を示し、●−●の記号
はＴＮＦ阻害タンパク質濃度１００単位／ｍｌについて
得られた結果を示す。これらの結果から明らかなよう
に、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦ感受性細
胞ＲＴ４およびＡ２７８０にＴＮＦ耐性を付与し、それ
によってそれら細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性を阻
害する。
において、○−○の記号はＴＮＦ阻害タンパク質濃度０
単位／ｍｌについて得られた結果を示し、●−●の記号
はＴＮＦ阻害タンパク質濃度１００単位／ｍｌについて
得られた結果を示す。これらの結果から明らかなよう
に、本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮＦ感受性細
胞ＲＴ４およびＡ２７８０にＴＮＦ耐性を付与し、それ
によってそれら細胞に対するＴＮＦの細胞溶解活性を阻
害する。
【００９０】
【発明の効果】本発明のＴＮＦ阻害タンパク質は、ＴＮ
Ｆ耐性の癌患者の検知のみならずこの患者の癌のＴＮＦ
耐性を除去するためにも極めて有用である特異抗体を産
生するための抗原として用いることができる。
Ｆ耐性の癌患者の検知のみならずこの患者の癌のＴＮＦ
耐性を除去するためにも極めて有用である特異抗体を産
生するための抗原として用いることができる。
【図１】ＴＮＦの濃度と、ＴＮＦ阻害タンパク質で処理
されたＲＴ４細胞（ヒト膀胱移行細胞乳頭腫系）の成長
率との関係（●−●で示す）を示したグラフで、細胞が
未処理の場合の対応する関係（○−○の記号で示す）と
比較して示している。
されたＲＴ４細胞（ヒト膀胱移行細胞乳頭腫系）の成長
率との関係（●−●で示す）を示したグラフで、細胞が
未処理の場合の対応する関係（○−○の記号で示す）と
比較して示している。
【図２】ＴＮＦの濃度と、ＴＮＦ阻害タンパク質で処理
されたＡ２７８０細胞（ヒト卵巣癌細胞系）の成長率と
の関係（●−●で示す）を示したグラフで、細胞が未処
理の場合の対応する関係（○−○の記号で示す）と比較
して示している。
されたＡ２７８０細胞（ヒト卵巣癌細胞系）の成長率と
の関係（●−●で示す）を示したグラフで、細胞が未処
理の場合の対応する関係（○−○の記号で示す）と比較
して示している。
Claims (12)
- 【請求項１】 （ａ）２８キロダルトンの分子量を有
し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性を直接阻害する活性を有
さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子感受性細胞に腫瘍壊死因
子耐性を付与し、それにより腫瘍壊死因子感受性細胞に
対する該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性および／または細
胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する、ことを特徴と
するＴＮＦ阻害タンパク質。 - 【請求項２】 上記腫瘍壊死因子感受性細胞がヒト線維
芽細胞系ＭＬＤである請求項１に記載のＴＮＦ阻害タン
パク質。 - 【請求項３】 上記腫瘍壊死因子感受性細胞がヒト膀胱
移行型細胞乳頭腫系ＲＴ４の細胞である請求項１に記載
のＴＮＦ阻害タンパク質。 - 【請求項４】 上記腫瘍壊死因子感受性細胞がヒト卵巣
癌細胞系Ａ２７８０の細胞である請求項１に記載のＴＮ
Ｆ阻害タンパク質。 - 【請求項５】 （１）腫瘍壊死因子を含まない栄養培地
中にてヒト由来の細胞を培養し； （２）上記細胞をＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−サ−
を含む培地中で培養して、（ａ）２８キロダルトンの分
子量を有し、（ｂ）腫瘍壊死因子の活性を直接阻害する
活性を有さず、かつ（ｃ）腫瘍壊死因子感受性細胞に腫
瘍壊死因子耐性を付与し、それにより腫瘍壊死因子感受
性細胞に対する該腫瘍壊死因子の細胞溶解活性および／
または細胞増殖抑制活性を阻害する活性を有する、こと
を特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質を含む培養物を該細
胞に産生させ；そして （３）上記培養物から該ＴＮＦ阻害タンパク質を単離す
る、ことを含むことを特徴とするＴＮＦ阻害タンパク質
の製造方法。 - 【請求項６】 上記ヒト由来の細胞がヒト線維芽ＭＬＤ
の細胞である請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 上記ヒト由来の細胞がＢＧ−９細胞系の
細胞である請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 上記ヒト由来の細胞がＦＳ−４細胞系の
細胞である請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】 上記ヒト由来の細胞が末梢血液白血球の
細胞である請求項５に記載の方法。 - 【請求項１０】 上記ＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−
サ−が腫瘍壊死因子である請求項５に記載の方法。 - 【請求項１１】 上記ＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−
サ−がＩＬ−１である請求項５に記載の方法。 - 【請求項１２】 上記ＴＮＦ阻害タンパク質インデュ−
サ−がＩＬ−６である請求項５に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3031043A JPH06256397A (ja) | 1991-02-26 | 1991-02-26 | Ｔｎｆ阻害タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3031043A JPH06256397A (ja) | 1991-02-26 | 1991-02-26 | Ｔｎｆ阻害タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256397A true JPH06256397A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=12320457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3031043A Withdrawn JPH06256397A (ja) | 1991-02-26 | 1991-02-26 | Ｔｎｆ阻害タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06256397A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120684A1 (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Yamaguchi University | 急性中枢神経障害の予後判定方法 |
-
1991
- 1991-02-26 JP JP3031043A patent/JPH06256397A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120684A1 (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Yamaguchi University | 急性中枢神経障害の予後判定方法 |
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