JPH07203967A - 霊長動物造血成長因子の新規種族 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 霊長動物ＩＬ−３蛋白質を提供すること。 【構成】 実質的に他の蛋白質性材料を随伴しない霊長
動物ＩＬ−３蛋白質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、霊長動物ＩＬ−３様
造血成長因子の新規種族および組換え遺伝子工学技術に
よるそれらの製造方法に関するものである。

【０００２】

【背景】ヘマトポイエチン、すなわち造血成長因子は、
造血細胞の生存、成長および分化を促す蛋白質である。
コロニー刺激因子(ＣＳＦ)は、骨髄、胎児肝臓および他
の造血器官の前駆細胞から生じる造血細胞コロニーのイ
ンビトロ成長に対する促進能を特徴とする、これらの造
血成長因子のサブセットである。

【０００３】ある種のヘマトポイエチンの生化学的およ
び生物学的同定および特徴分析は、天然供給源、例えば
血液および尿から入手され得る少量の天然因子により阻
まれていた。これらのヘマトポイエチンの中には、最近
分子クローン化され、異種発現され、均質に精製された
ものがある。[メットカーフ、『ザ・モレキュラー・バ
イオロジー・アンド・ファンクションズ・オブ・ザ・グ
ラニュロサイト−マクロファージ・コロニー・スティミ
ュレーティング・ファクターズ』、「ブラッド」、６７
(２)：２５７−２６７(１９８６)]。これらのヘマトポ
イエチンには、ヒトおよびネズミＧＭ−ＣＳＦ、ヒトＧ
−ＣＳＦ、ヒトＣＳＦ−１およびネズミＩＬ−３があ
る。ヒトＧＭ−ＣＳＦ[ドナヒュー等、「ネイチャ
ー」、３２１：８７２−８７５(１９８６)]、ネズミＩ
Ｌ−３[キンドラー等、「プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８３：１００１−１００５(１９８６)、メットカ
ーフ等、「ブラッド」、６８：４６−５７(１９８６)]
およびヒトＧ−ＣＳＦ[ベルテ等、「J．Exp．Med.」、
１６５：９４１−９４８(１９８７)]は、インビボでの
造血に対する効果を立証した。ネズミ蛋白質ＩＬ−３に
よる研究は広範に行なわれたが、ヒト類縁体はまだ発見
されていない。[コーエン等、「ニュークリーク・アシ
ッズ・リサーチ」、１４：３６４１(１９８６)]。

【０００４】

【発明の簡単な要約】この発明は、実質的に他の霊長動
物蛋白質を含まず、後記第１および２表に示したアミノ
酸配列と同一または実質的に相同性であるペプチド配列
を有することを特徴とする、霊長動物ＩＬ−３様成長因
子の一種族を提供する。特にヒト蛋白質を含め、これら
の霊長動物蛋白質もまた、以後単にＩＬ−３と称する。
これらの蛋白質は、表に描かれたＤＮＡ配列、およびそ
れとハイブリダイゼーション可能または遺伝子コードの
縮重を除きそれとハイブリダイゼーション可能な配列で
あって、ＩＬ−３様生物学的特性を有するポリペプチド
をコードする配列、およびこれらの特性を示す他の多様
に修飾された配列によりコードされる。これらのポリペ
プチド類はまた、ＩＬ−３様生物学的特性を特徴とす
る。

【０００５】一例として、この発明は、少なくとも１つ
のＩＬ−３様生物学的特性を有し、表２に描かれた配列
と同一または実質的に同じ配列を含むペプチド配列を特
徴とする、他のヒト・ポリペプチドの随伴が実質的にな
いヒトポリペプチドを提供する。この発明のポリペプチ
ドの別の例として、他の霊長動物ポリペプチドの随伴が
実質的にないテナガザルポリペプチドは、表１に示され
た配列と同一または実質的に同じ配列を含み、少なくと
も１つのＩＬ−３様生物学的特性を有するペプチド配列
を特徴とする。

【０００６】この発明のポリペプチドは、標準ヒト骨髄
検定において１０〜１００ピコモル濃度で様々な系統の
多数のタイプの造血コロニーに対する形成刺激能を有す
ることを特徴とする。この発明の蛋白質により共有され
得る他のＩＬ−３様特性には下記の特性がある。

【０００７】(a)還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動により測定された約１４〜約３５キロダルトンの
見かけの分子量、(b)ＣＭＬ検定における１０〜１００
ピコモル濃度でのＣＭＬ細胞増殖刺激能、(c)pＨ６.０
〜７.６間の等電点、(d)スーパローズ６ゲルろ過カラム
における４３kdでの単一の、好ましくは鋭いピーク、
(e)Ｎ−グリカナーゼ処理後のゲルにおける２０.５kdの
単一バンド、および(f)エドマン分解法を用いたＮ−末
端分析における約２％以下の汚染物質レベル。

【０００８】この発明の別の態様は、この発明による１
種またはそれ以上のポリペプチドの治療有効量を含む医
薬組成物に関するものである。これらの組成物は、造血
細胞レベルの不足を特徴とする幾つかの疾患状態の処置
方法において使用され得る。この発明によるこれらの方
法は、この明細書に記載された少なくとも１種のポリペ
プチドの有効量を患者に投与することを含む。

【０００９】これらの治療方法は、例えば、骨髄移植後
の免疫細胞または造血細胞欠乏症を含む、白血球減少
症、血小板減少症、貧血、Ｂ細胞欠乏症、Ｔ細胞欠乏
症、細菌感染症およびウイルス感染症を含む、病気、放
射線被曝および／または薬剤の結果として生じる様々な
病的状態の処置を指向し得る。この発明によるこれらの
方法はまた、少なくとも１種の他のヘマトポイエチン、
インターロイキンまたは成長因子の有効量とＩＬ−３様
ポリペプチドとの同時または連続投与を含み得る。この
用途におけるヘマトポイエチンの例には、ＧＭ−ＣＳ
Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１またはエリスロポイエチン
がある。インターロイキンの例には、ＩＬ−１、ＩＬ−
２、ＩＬ−４またはＩＬ−６がある。これらの方法はま
た、Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子または好酸球分化
因子などの成長因子も使用し得る。

【００１０】この発明のさらに別の態様は、少なくとも
１種のＩＬ−３様生物学的特性を有する霊長動物ポリペ
プチドの発現をコードする、cＤＮＡ配列を含めたＤＮ
Ａ配列に関するものである。これらの配列は、表１また
は表２に示された５'〜３'方向のヌクレオチド配列を含
む。他方、ストリンジェント条件下で表１または表２の
ＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列または非ス
トリンジェント条件下で示されたＤＮＡ配列とハイブリ
ダイズし、少なくとも１種のＩＬ−３様生物学的特性を
有する蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配列もこの発明
に含まれる。表１および表２の配列の対立遺伝子変異形
もまた、それらのヌクレオチド変化がペプチド配列の変
化を誘導する場合もしない場合も含めて、それらの他の
類縁体および誘導体と共にこの発明に含まれる。

【００１１】この発明のさらに別の態様は、発現制御配
列と効果的に組合わされた上記ＤＮＡ配列を含むベクタ
ー、およびそれらにより形質転換された細胞に関するも
のである。これらのベクターおよび形質転換細胞は、発
現制御配列と効果的に組合わされたＩＬ−３様ポリペプ
チドの発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換され
たセルラインを培養する、霊長動物ＩＬ−３様ポリペプ
チドの新規製造方法において使用され得る。この発明の
方法は、ポリペプチド発現用宿主細胞として幾つかの既
知細胞を使用し得る。現在好ましいセルラインは、ほ乳
類セルラインおよび細菌細胞である。以下、好ましい実
施態様の詳細な記載を考慮すれば、この発明の他の態様
および利点は明白である。

【００１２】

【発明の詳細な記載】この発明により提供される霊長動
物ＩＬ−３様成長因子の種族は、他の霊長動物蛋白質性
材料との組合わせを実質的に含まず、下記表１および表
２に示された配列と同一または実質的に相同性のアミノ
酸配列を特徴とする。成長因子のこの新規科の構成員は
また、後述する通り、ＩＬ−３様成長因子の少なくとも
１つの生物学的特性を有することを特徴とする。好まし
くはこの発明の成長因子の種族に属する因子は全て、複
数のＩＬ−３様生物学的特性を示す。

【００１３】この明細書では、「ＩＬ−３様生物学的特
性」なる語は、下記生物学的特徴並びにインビボおよび
インビトロ活性の１つまたはそれ以上を含むものと定義
される。前述の一特性は、赤血球、リンパ球および脊髄
系統に関与した前駆細胞の成長および分化の促進性であ
る。例えば、標準ヒト骨髄検定の場合、ＩＬ−３様生物
学的特性は、か粒球タイプのコロニーおよび赤血球バー
ストの刺激性である。前述の別の特性は、初期多分化能
幹細胞との相互作用である。

【００１４】別のＩＬ−３様生物学的特性は、多能性前
駆細胞の成長の持続性である。別の特性は、慢性骨髄性
白血病(ＣＭＬ)細胞増殖に対する刺激能である。またＩ
Ｌ−３様生物学的特性は、マスト細胞増殖の刺激性であ
る。ＩＬ−３様成長因子はまた、様々な因子依存性セル
ラインの成長を促進および／または２０−アルファ−ス
テロイドデヒドロゲナーゼ(２０−アルファ−ＳＰＨ)お
よびＴhy−１抗原の発現を誘発し得る。さらにＩＬ−３
様生物学的特性は、ＫＧ−１細胞におけるコロニー形成
の刺激および／またはひ臓および骨髄培養における高い
ヒスタミン合成の刺激である。さらに別のＩＬ−３様生
物学的特性は、還元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による約１４〜約３５kdの見かけ
の分子量である。ＩＬ−３様蛋白質の他の生物学的特性
は、ネズミＩＬ−３に関する当技術分野の文献に開示さ
れている。

【００１５】表１および表２に示された具体的なペプチ
ド配列は、この発明の成長因子種族に属する２例の配列
である。表１の８６５bp ＤＮＡ配列は、テナガザル白
血病ウイルス感染テナガザルＴ−セルラインＵＣＤ−１
４４−ＭＬＡのcＤＮＡ発現ライブラリーから分離され
た[クワカミ等、「ネイチャー」、２３５：１７０(１９
７２)]。この配列は、約１５２個のアミノ酸蛋白質、い
わゆるＣＳＦ−８０をコードし、高疎水性配列(leu leu
leu leu gln leu leu)により示される慣用的リーダー
分泌配列を含む、４５６ヌクレオチドから成る１本の長
いオープン・リーディング・フレームを含む。成熟蛋白
質は、表１におけるアミノ酸数２０のアラニンから始ま
る。コード領域は３個のシステインを含み、成熟蛋白質
には２個存在するため、１個のジスルフィド結合の存在
が考えられる。特徴的な配列、Ａsn−Ｘ−ＳerまたはＡ
sn−Ｘ−Ｔhrにより示される２つのアスパラギン結合グ
リコシル化部位が存在し得る。コード配列により示され
たサイズおよびグリコシル化パターンは共に、リンホカ
イン様蛋白質の典型的なものである。８６５bp領域の残
りの非コード部分は、天然宿主での転写において調節的
役割を有し得る。この配列の３'端はまた、配列ＡＴＴ
ＴＡの幾つかの反復を含むＡＴ−濃化セグメントを含
み、これはＲＮＡメッセージ安定性に関係すると思われ
る[ショーおよびカーメン、「セル」、４６(５)：６５
９−６７７(１９８６)参照]。

【００１６】

【表５】

【表６】

【００１７】表２の６７４bp ＤＮＡ配列は、プローブ
として表１の配列を用いることにより、ヒト・ゲノム・
ライブラリー[ツール等、「ネイチャー」、３１２：３
４２−３４６(１９８４)]から得られた。表２のＤＮＡ
配列は、最初ヒト・ゲノム配列のエクソン(表１のテナ
ガザルＩＬ−３様ポリペプチドのＤＮＡ配列との比較に
より同定された)と一緒にスプライシングすることによ
り構築された。ヒトcＤＮＡクローンのmＲＮＡ分析によ
り確認されたこのヒト配列もまた、霊長動物蛋白質のこ
の種族の一員である約１５２個から成るアミノ酸のポリ
ペプチドをコードする。このヒトポリペプチドは、高疎
水性配列(leu leu leu gln leu leu)により示される慣
用的リーダー分泌配列を含む。成熟ポリペプチドは、表
２におけるアミノ酸数２０のアラニンから始まる。コー
ド領域は、成熟蛋白質において２個のシステインを含む
ため、１個のジスルフィド結合の存在が考えられる。特
徴的な配列、Ａsn−Ｘ−Ｓerにより示される２つのアス
パラギン結合グリコシル化部位が存在し得る。６７４bp
配列の残りの非コード部分は、天然宿主での転写におい
て調節的役割を有し得る。

【００１８】ヒト・ゲノム遺伝子[表２]のエクソンのヌ
クレオチド配列は、テナガザル遺伝子[表１]のＤＮＡ配
列と９６％を越える相同性を示した。１１コドンにおけ
るヌクレオチド配列変異は、テナガザルおよびヒト蛋白
質におけるアミノ酸の差異をもたらす。表２の配列の上
部に見られるヌクレオチドは、テナガザル配列が類縁ヒ
ト配列と相異している部位を示す。同様に、ヒトアミノ
酸配列の下部に見られるアミノ酸は、テナガザル配列と
相異している部位を示す。

【００１９】

【表７】

【表８】

【００２０】ファング等、「ネイチャー」、３０７：２
３３−２３７(１９８４)により発表されたところでは、
ワシンシン、ディーシーのナショナル・バイオメディカ
ル・サービシーズによるコンピューター検索は、テナガ
ザルおよびヒトＩＬ−３様配列が、ネズミＩＬ−３ Ｄ
ＮＡ配列に対しアミノ酸レベルでは約２９％の相同性お
よびヌクレオチドレベルでは約４５％の相同性を有する
ことを示した。同様にヒトＩＬ−３様遺伝子のエクソン
構造もネズミＩＬ−３のコード領域と比較された。

【００２１】エシェリヒア・コリＨＢ１０１におけるプ
ラスミドに含まれる表１に示された新規８６５bp cＤＮ
Ａ配列は、１９８６年７月１１日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(メリーランド、ロックビ
ル、パークローン・ドライブ１２３０１)に寄託され、
ＡＴＣＣ６７１５４の受託番号が与えられた。バクテリ
オファージ・ラムダに含まれる新規ゲノム配列(そのcＤ
ＮＡ配列は下記表２に示されている)も同様に１９８６
年８月７日に寄託され、ＡＴＣＣ４０２４６の受託番号
が与えられた。エシェリヒア・コリＨＢ１０１における
プラスミドpＳＨＩＬ−３−１に含まれるヒトＩＬ−３
ＤＮＡは、１９８７年２月２４日にＡＴＣＣに寄託さ
れ、ＡＴＣＣ６７３２６の受託番号が与えられた。

【００２２】さらに具体例としてのヒトおよびテナガザ
ルＩＬ−３様ポリペプチドは、実施例で後述する通り、
形質転換ＣＯＳ細胞由来の³⁵Ｓ標識蛋白質のＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル分析により特徴が明らかにされた。
両ポリペプチドは、見かけの分子量が約１４kd−３５k
d、さらに限定すれば１８kd−３０kdの範囲に含まれる
分子の種類とサイズの点で不均一である。これらの具体
例としてのＩＬ−３様因子に関する分子量の前記範囲
は、純化ＣＯＳ細胞生産分子のグリコシル化における変
化の結果であると考えられる。純化蛋白質は、インビト
ロ・ヒト骨髄検定において１０〜１００ピコモル濃度で
小か粒球タイプのコロニーの形成を誘発する。さらに、
これらのヒト骨髄検定においてエリスロポイエチンの存
在下では、両ポリペプチドは、同等の活性レベルで赤血
球および脊髄前駆細胞の成長を促す。すなわちこれらの
ＩＬ−３様因子はマルチ−ＣＳＦである。またこれらの
ＩＬ−３様因子は、ＣＭＬ患者から得られた(白血病の)
白血球芽細胞の増殖を誘発する。これらのポリペプチド
はまた、付帯および成熟細胞、例えば単核白血球を刺激
して他の造血様因子を生産させ得ると共に他の造血細胞
のコロニー形成および他の造血タイプ活性をも刺激し得
る。

【００２３】表１および表２のアミノ酸残基の連続配列
を全体的または部分的に複製する合成ポリペプチドもま
たこの発明に含まれる。合成手法によるこの発明のポリ
ペプチドの構築方法は、当業界の熟練者には周知であ
る。合成構築された配列は、表１および表２のＩＬ−３
様ポリペプチドと一次、二次または三次構造および立体
配座に関する特徴を共有することにより、それらと共通
したＩＬ−３様生物学的特性を有し得る。すなわち、そ
れらは、治療および免疫学的プロセスにおいて天然純化
霊長動物ＩＬ−３様ポリペプチドの生物学的活性または
免疫学的代用物として使用され得る。

【００２４】また、この発明により提供されたＩＬ−３
様成長因子の種族は、表１および表２の配列と類似した
配列によりコードされる因子をも含むが、それらに対す
る修飾は自然に行なわれるか、または工学的に慎重に誘
導されるものである。例えば、それらの一修飾ヒト蛋白
質は、Ｓer−２７がプロリンと置き換えられている点を
除き表２に描かれた成熟ペプチド配列を有する。その蛋
白質は表２に示されたヒトcＤＮＡ配列によりコードさ
れるが、ただし、その表では２７位に存在しているセリ
ン・コドンＴＣＣがプロリン・コドンＣＣＣと置き換え
られている点で修飾されている。pＨucＩＬ３−２とし
てエシェリヒア・コリＨＢ１０１に含まれるこの具体例
としての修飾ＩＬ−３様ＤＮＡ配列(活性ヒトＩＬ−３
様因子を生産する)は、１９８７年２月１３日にＡＴＣ
Ｃに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６７３１９が与えられ
た。

【００２５】ペプチドまたは配列における他の修飾は、
公知技術を用いて当業界の熟練者により遂行され得る。
これらのＩＬ−３様関連配列における興味深い特定の修
飾には、各コード配列における２個のシステイン残基の
一方または両方と他のアミノ酸との置換が含まれ得る。
好ましくは、両方のシステインを別のアミノ酸、例えば
セリンと置換することにより、ジスルフィド架橋を排除
する。このような置換に関する突然変異誘発技術は、当
業界の熟練者にはよく知られている。[例えば、アメリ
カ合衆国特許第４５１８５８４号参照。]

【００２６】この明細書に記載されたＩＬ−３様因子の
配列の他の具体的な突然変異には、グリコシル化部位の
一方または両方の修飾が含まれる。グリコシル化の不在
または一部のみのグリコシル化は、表１および表２に示
されたＩＬ−３様因子の配列に存在するアスパラギン結
合グリコシル化認識部位の一方または両方におけるアミ
ノ酸置換または欠失により生じる。アスパラギン結合グ
リコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素に
より特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これ
らのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニ
ンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン(ただし、Ｘは通常
アミノ酸である)である。グリコシル化認識部位の第１
または第３アミノ酸位の一方または両方における様々な
アミノ酸置換または欠失(および／または第２位におけ
るアミノ酸欠失)の結果、修飾トリペプチド配列におけ
る非グリコシル化が生ずる。

【００２７】例えば、これらの一修飾ＩＬ−３様因子で
は、表１の配列のＡsn₃₄はグルタミンと置換され得る。
生成した因子(Ｇln₃₄)は、２箇所ではなく１箇所のアス
パラギン結合炭水化物部分(Ａsn₈₉)のみを含むべきであ
る。当技術分野に精通しておれば、３４位における別の
アミノ酸との置換および／またはグリコシル化認識部位
内の他の位置における別のアミノ酸との置換、例えばＳ
er₃₆におけるバリンの挿入により、同じＡsn₈₉モノグリ
コシル化部位を有する類似糖蛋白質が製造され得ること
は明らかである。同様に、８９位に対応するＡsnコドン
および／または９１位に対応するセリン・コドンは、突
然変異技術により他のアミノ酸に対するコドンに改変さ
れ得る。それらの改編されたヌクレオチド配列の発現に
より、その部位がグリコシル化されていない変異体が生
成される。別法として、両方の部位が前記と同様に改編
され得る。またグリコシル化部位に対してこれらの修飾
を行うことにより、表２の配列の修飾体が作製され得
る。[例えば、宮島等、ＥＭＢＯジャーナル、５(６)：
１９９３−１１９７(１９８６)および後記実施例４参
照]。全体的または部分的にＩＬ−３様活性を保持して
いると予想される表１および表２の配列の他の類縁体お
よび誘導体もまた、この明細書の開示に従い当業界の熟
練者により容易に製造され得る。それらの明白な修飾体
は、この発明に包含されるものと考えられる。

【００２８】またこの発明は、他の霊長動物蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列との組合わせを含まず、霊長動物Ｉ
Ｌ−３様ポリペプチドまたは成長因子の発現をコードす
る新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、
５'−３'方向の表１および表２に描かれた配列並びにス
トリンジェント・ハイブリダイゼーション条件[マニア
チス等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリ
ー・マニュアル)、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(１９８２)、３８７−３８９頁参照]下で
表１および表２のＤＮＡ配列とハイブリダイズする配列
を含む。それらのストリンジェント・ハイブリダイゼー
ション条件の一例は、６５℃４×ＳＳＣにおけるハイブ
リダイゼーション、次いで６５℃で１時間０.１×ＳＳ
Ｃ中での洗浄である。別法として、具体例としてのスト
リンジェント・ハイブリダイゼーション条件は、５０％
ホルムアミド中４２℃４×ＳＳＣである。

【００２９】また、緩いハイブリダイゼーション条件下
で表１または表２の配列とハイブリダイズし、霊長動物
ＩＬ−３様生物学的特性を有する成長因子の発現をコー
ドするＤＮＡ配列は、新規成長因子のこの種族の一員を
コードする。それらの非ストリンジェント・ハイブリダ
イゼーション条件の例としては、５０℃で４×ＳＳＣま
たは４２℃で３０−４０％ホルムアミドによるハイブリ
ダイゼーションがある。例えば、ＤＮＡ配列がストリン
ジェント条件下で表１または表２の配列とハイブリダイ
ズしない場合でも、表１および／または表２の配列と重
要な相同性を示す領域、例えばグリコシル化部位または
ジスルフィド結合部位を共有し、１つまたはそれ以上の
ＩＬ−３様生物学的特性を有する霊長動物蛋白質をコー
ドするＤＮＡ配列は、成長因子のこの新規種族の一員を
明らかにコードする。

【００３０】同様に、表１または表２の配列によりコー
ドされる霊長動物ＩＬ−３様ポリペプチドをコードする
が、遺伝子コードの縮重または対立(遺伝子)性変形(ア
ミノ酸変化を誘導する場合もしない場合もあり得る種の
集団における天然塩基の変化)故にコドン配列が異なる
ＤＮＡ配列はまた、明細書に記載されたこの種族に属す
る新規成長因子をコードする。コードされるポリペプチ
ドの活性、半減期または生産性が点突然変異または誘導
修飾により高められた表１および表２のＤＮＡ配列にお
ける変形もまたこの発明に包含される。

【００３１】この発明は、別の態様において霊長動物Ｉ
Ｌ−３様成長因子の新規種族の新規製造方法を提供す
る。この発明の方法は、既知調節配列の制御下で新規霊
長動物ＩＬ−３様ポリペプチドの発現をコードするＤＮ
Ａ配列により形質転換された適当な細胞またはセルライ
ンの培養を含む。適当な細胞またはセルラインは、ほ乳
類細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(Ｃ
ＨＯ)または３Ｔ３細胞であり得る。適当なほ乳類宿主
細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニン
グおよび製品製造および精製の方法は当業界では周知で
ある。例えば、ゲッシングおよびサンブルック等、「ネ
イチャー」、２９３：６２０−６２５(１９８１)また
は、別法として、カウフマン等、「Ｍoll．Ｃell．Ｂio
l.」、５(７)：１７５０−１７５９(１９８５)またはハ
ウレイ等、アメリカ合衆国特許第４４１９４４６号参
照。別の適当なほ乳類セルライン(後記実施例に記載さ
れている)は、サルＣＯＳ−１セルラインである。同様
に有用なほ乳類セルラインはＣＶ−１セルラインであ
る。

【００３２】この発明に適した宿主細胞として同様に有
用なのは細菌細胞である。例えば、エシェリヒア・コリ
の様々な菌株(例、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１および後
記実施例で使用されている株)は、生物工学分野では宿
主細胞としてよく知られている。バシルス・スブチリス
(枯草菌)、シュードモナス、他のかん菌などの様々な菌
株もまたこの方法において使用され得る。

【００３３】当業界の熟練者に周知の酵母細胞の様々な
株もまた、この発明のポリペプチドの発現における宿主
細胞として利用され得る。さらに所望ならば、昆虫細胞
もこの発明の方法における宿主細胞として使用され得
る。例えば、ミラー等、「ジェネティック・エンジニア
リング」、８：２７７−２９８(プレナム・プレス１９
８６)およびそこに引用された参考文献参照。

【００３４】この発明は、別の態様においてこれらの新
規霊長動物ポリペプチドの発現方法で使用されるベクタ
ーを提供する。これらのベクターは、この発明の新規霊
長動物ポリペプチドをコードする前記新規ＤＮＡ配列を
含む。他方、前記修飾配列が組込まれたベクターもまた
この発明の具体例であり、これらのＩＬ−３様ポリペプ
チドの製造において有用である。この方法で使用される
ベクターはまた、この発明のＤＮＡコード配列と効果的
に組合わされ、選択された宿主細胞におけるそれらの複
製および発現を指示し得る選択された調節配列を含む。

【００３５】この明細書で開示されている霊長動物ＩＬ
−３様成長因子の新規種族に属する因子は、幾つかの病
的または疾患状態、特に低レベルの造血系骨髄、赤血
球、リンパ球または血小板生成細胞またはそれらの組合
わせを特徴とする状態の処置に使用され得る。さらに、
それらは成熟骨髄および／またはリンパ様細胞の活性化
に使用され得る。この発明のポリペプチドによる処置に
対して感受性を示す状態には、白血球減少症、末梢血に
おける循環白血球数の減少がある。白血球減少症は、あ
る種のウイルスまたは放射線に対する暴露により誘発さ
れ得る。それは様々な形態の癌治療、例えば化学療法剤
への暴露の副作用であることが多い。これらのＩＬ−３
様ポリペプチド組成物による白血球減少症の治療処置
は、現在入手可能な薬剤を用いた処置により生じる望ま
しくない副作用を回避し得る。

【００３６】例えばＴおよび／またはＢリンパ球におけ
る様々な免疫不全症または免疫疾患、例えば慢性関節リ
ウマチもまた、この発明のポリペプチドを用いた処置に
より改善され得る。これらの因子を単独または他の処置
体制と組合わせて用いると、ウイルス感染症、例えばＨ
ＴＬＶＩ、ＨＴＬＶII、ＨＩＶ、重度放射能被曝、癌治
療または他の医薬処置の結果生じた免疫不全症の処置ま
たは矯正に有用であり得る。この発明のポリペプチドは
また、単独または他のヘマトポイエチンと組合わされ
て、血小板減少症(血小板欠乏)または貧血(赤血球欠乏)
を含む他の血液細胞不全症の処置に使用され得る。これ
らの新規ポリペプチドの他の用途は、骨髄移植から回復
中の患者の処置並びに診断または治療用として標準的方
法により生成されるモノクローナルおよびポリクローナ
ル抗体の開発に存する。

【００３７】従って、この発明のさらに別の態様は、上
記状態の処置に用いられる方法および治療組成物に関す
るものである。それらの組成物は、この発明の霊長動物
ＩＬ−３様ポリペプチドの種族に属する因子の１種また
はそれ以上の治療有効量を医薬的に許容し得る担体と混
合した形で含有する。この組成物は非経口的に全身投与
され得る。別法として、この組成物は静脈内投与され得
る。所望により、この組成物は皮下投与され得る。全身
投与される場合、この発明で用いられる治療組成物は、
発熱源不含有の非経口的に許容され得る水溶液形態を呈
する。pＨ、等張性、安定性などに関して医薬的に許容
し得る前記蛋白質溶液の製造は、当業界の技術領域内に
含まれる。

【００３８】前記状態の処置方法に含まれる用量体制
は、薬剤の作用を変える様々な因子、例えば患者の状
態、体重、性別および食餌療法、感染の重さ、投与時間
および他の臨床因子を考慮した上で担当医により決定さ
れる。一般的には、一日摂取量は、体重１kg当たり２０
０−１０００マイクログラムのポリペプチドまたは５０
〜５０００単位(すなわち、この単位は、標準ヒト骨髄
検定において半最大刺激を誘導するポリペプチド濃度で
ある)のポリペプチドの範囲内とすべきである。

【００３９】またこの発明の治療方法および組成物は、
他のヒト因子との共投与を含み得る。この発明のポリペ
プチドと同時または連続共投与される他の適当なヘマト
ポイエチン、ＣＳＦおよびインターロイキンを非限定的
に列挙すると、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、Ｍeg−ＣＳＦ、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、ＩＬ
−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分
化因子および好酸球分化因子が挙げられる。造血前駆細
胞およびそれらの子孫のインビボ増幅に関して特に興味
深いものは、ＩＬ−３とＩＬ−６(当業界ではＢ細胞刺
激因子２としても知られている)の組合わせであり、ヒ
ト芽細胞検定において初期幹細胞コロニー増殖の誘導能
を示す。さらに、ＩＬ−３様ポリペプチドは、治療用途
においてモノクローナルまたはポリクローナル抗体と共
に、またはそれらと化学的に結合させた形で投与され得
る。別法として、これらの成長因子は、治療体制におい
てある種の毒素、例えばリシンと結合され得る。上述の
用量を調節することにより、治療組成物におけるこれら
の追加成分に関する調整を行う。処置された患者の進行
状態は、血液プロフィール、例えば白血球数などの定期
的評価によりモニターされ得る。

【００４０】以下、実施例により、霊長動物ＩＬ−３様
ポリペプチドの新規種族の構成員およびこの発明の方法
に関して詳述する。 実施例１ テナガザルＩＬ−３様遺伝子の分離。テナガザル白血病
ウイルス、ＵＣＤ−１４４−ＭＬＡにより感染した、ナ
ショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス・ラボラ
トリーズから入手可能なテナガザルＴセルラインをフィ
トヘマグルチニンおよびホルボール・ミリステート・ア
セテート(ＰＨＡ／ＰＭＡ)により誘導した。チャーグウ
ィン等、「バイオケミストリー」、１８：５２９４(１
９７９)の手順によりこれらの細胞から全ＲＮＡを調製
した。ポリＡ⁺mＲＮＡを選択し、１０％〜３０％しょ糖
勾配により分画した。この新規造血因子をコードするm
ＲＮＡを同定するため、ＵＣＤ−１４４−ＭＬＡセルラ
インから得られたしょ糖勾配分画mＲＮＡの１６アリコ
ートを、ゼノプス・レビス卵母細胞にマイクロインジェ
クションし、実施例５のＣＭＬ検定において示される通
り、ヒトＧＭ−ＣＳＦに対する抗体の存在下における白
血病芽細胞の増殖刺激能に関して生成した条件培地を試
験した。ＩＬ−３様成長因子活性をコードするメッセー
ジを含むものとして同定されたしょ糖勾配分画から得ら
れたmＲＮＡを、グプラーおよびホフマン、「ジー
ン」、２５：２６３(１９８３)の方法により２本鎖cＤ
ＮＡに変換した。

【００４１】ＳＶ４０エンハンサー、主アデノウイルス
後期プロモーター、ＤＨＦＲコード配列、ＳＶ４０後期
メッセージ・ポリＡ追加部位およびＶaＩ遺伝子を含む
ＣＯＳ細胞発現ベクター、pＸＭをエンドヌクレアーゼ
酵素ＸhoＩにより線状にし、dＴＴＰの存在下ＤＮＡポ
リメラーゼＩ大フラグメントにより処理し、当モル量の
cＤＮＡと結合させた(最終ＤＮＡ濃度１００μg／ml)。
pＸＭのＸhoＩ消化およびＸhoＩ受容cＤＮＡ配列の挿入
から得られた結合生成物をエシェリヒア・コリ株ＨＢ１
０１に形質転換し、Ｌ＋Ａmpプレートにおいて培養する
ことにより、約３０×１０³コロニーから成るライブラ
リーを生成された。[当業界で公知の他の機能的に類似
した発現ベクターもまた、この方法においてpＸＭの代
替ベクターとして使用され得る]。

【００４２】pＸＭにおけるcＤＮＡライブラリーに対し
てニトロセルロース・フィルターを用いたレプリカ平板
法を行った。各フィルターからのコロニーをＬブロス中
に掻はし、プラスミドＤＮＡを分離した。２００−３０
０個の細菌コロニーのプールから各ＤＮＡ試料を調製し
た。メイヤース等「ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー」、１２７：１５２９(１９７６)の方法によりＤＮＡ
を精製した。ウォング等、「サイエンス」、２２８：８
１０−８１５(１９８５)およびカウフマン等、「Ｍol．
Ｃell Ｂiol.」、２：１３０４(１９８２)記載の方法
に従い、ＤＥＡＥ介在ＤＮＡトランスフェクションによ
り、サルＣＯＳ細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０)を１０
⁶ＣＯＳ細胞に対し約５μgのプラスミドＤＮＡでトラン
スフェクションし、クロロギンにより処理した。

【００４３】トランスフェクションの７２時間後、培地
を採収し、後記実施例５の記載に従いヒトＣＭＬ検定に
おいて測定した。一プールは、ＧＭＣＳＦに対する抗血
清の中和に完全に耐性を示すコロニー刺激活性およびＣ
ＭＬ増殖活性を有する条件培地を生成し、さらに別の分
析用に選択された。元の活性プールから選ばれた個々の
コロニーからのプラスミドＤＮＡを調製し、トランスフ
ェクションすることにより、条件培地を製造した。この
条件培地をＣＳＦおよびＣＭＬ増殖活性に関して検定し
た。この活性に関与する単一クローンを分離した。この
クローンのcＤＮＡ挿入体をＭ１３中にサブクローン
し、サンガー・ジデオキシ鎖末端基分析方法により配列
決定した。[表１参照]

【００４４】実施例２ ヒトＩＬ−３様遺伝子の分離 プローブとして表１の配列を用い、ヒト・ゲノム・ライ
ブラリー(ラムダ・ベクターＪ１のＢam ＨＩ部位にク
ローン化されたヒトＤＮＡのＳau ３ＡＩ部分消化物)
[ツール等、前出]から得られた１×１０⁶個のクローン
をスクリーニングした。cＤＮＡプローブと強くハイブ
リダイズする配列を含む３プラークが同定された。これ
らのファージのうちの２つによるＤＮＡをエンドヌクレ
アーゼ酵素Ｓau ３ＡＩにより完全消化し、バクテリオ
ファージ・ラムダＭ１３クローニング・ベクターmp９の
Ｂam ＨＩ部位にサブクローン化した。テナガザルcＤ
ＮＡとのハイブリダイゼーションによりエクソン配列を
含むサブクローンが同定された。１サブクローン、すな
わち約１０kbのＢgl II挿入体としてヒト・ゲノムＤＮ
Ａ配列を含むラムダＣＳＦ−１６は、前記と同様ＡＴＣ
Ｃに寄託された。実施例１記載のテナガザル遺伝子の配
列に基づく配列を有する一連のオリゴヌクレオチド・プ
ライマーによるジデオキシ鎖末端ＤＮＡ配列分析法を用
いてヒト遺伝子のエクソンの全ての完全な配列を決定し
た。ヒト遺伝子のエクソンのヌクレオチド配列はテナガ
ザルcＤＮＡの配列と９６％を越える相同性を示したた
め、対応するヒトcＤＮＡのヌクレオチド配列が再構築
された。１１コドンにおけるヌクレオチド配列の変化の
結果、２種とのポリペプチドにおけるアミノ酸相異が生
じた[表２参照]。

【００４５】ヒト・ゲノム配列は、ラムダＣＳＦ−１６
から切除され、発現ベクター(当業界では、ほ乳類、昆
虫、酵母、真菌および細菌の発現に関して多くのタイプ
のベクターが知られている)に挿入され得る。例えば、
エンドヌクレアーゼＳmaＩおよびＸhoＩによる消化(そ
れぞれヌクレオチド６２９および３１８３のヒト遺伝子
領域を開裂する)によりヒト・ゲノム配列を寄託された
バクテリオファージから切除した。生成した２.５キロ
塩基は、全ヒトＩＬ−３遺伝子コード配列を含み、プロ
モーター領域における「ＴＡＴＡＡ関連」配列を含む
が、「ＣＡＴ関連」配列および遺伝子の３'端のポリア
デニル化シグナルを欠く。このフラグメントのＳmaＩ端
を、市販されているリンカー配列によりＸhoＩに変換し
た。標準分子生物学技術[例えば、ヤング等、「セ
ル」、４７：３−１０(１９８６)参照]によりこのフラ
グメントをＸhoＩ消化プラスミド発現ベクターpＸＭに
サブクローン化してプラスミドpＹ３を得た。

【００４６】次に、pＹ３を細菌において増殖させ、サ
ルＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。前記細
胞においてヒト遺伝子は転写され、ＲＮＡスプライシン
グが行なわれる。トランスフェクションされた細胞によ
る培地は、後記ヒト骨髄検定およびＣＭＬ検定における
ＩＬ−３様生物学的活性に関する検定で陽性を示す。テ
ナガザルcＤＮＡプローブを用いたノーザン・ブロット
分析は、後述する通り、これらの細胞から得られ、末梢
血リンパ球から得られるＲＮＡと同じサイズの単一１キ
ロ塩基mＲＮＡの存在を示す。標準的方法によりcＤＮＡ
をmＲＮＡから合成し、ＣＭＬ活性を有するクローンを
同定する。新規ＩＬ−３様成長因子のｃＤＮＡをそこか
ら分離する。

【００４７】実施例３ ヒトＩＬ−３様成長因子 ヒトＩＬ−３様ポリペプチドをコードする表２のｃＤＮ
Ａ配列はまた、実施例２記載の方法以外の方法でも製造
され得る。例えば、表２の配列は、当業界の熟練者によ
く知られている方法に従い化学合成され得る。それらの
一化学合成方法では、テナガザルＩＬ−３遺伝子を再構
築することにより、ヒトＩＬ−３コード配列を生成させ
る。テナガザルおよびヒトＩＬ−３蛋白質の成熟形態間
における第１アミノ酸の相異はアミノ酸８２位に存在す
る。テナガザルＩＬ−３遺伝子のアミノ酸８２位からこ
の遺伝子の３'末端までのコード配列が、ヒトＩＬ−３
をコードする化学合成ＤＮＡ配列と置換され得ることに
より、適当な発現系においてヒトＩＬ−３を生産し得る
機能性遺伝子が生成される。

【００４８】テナガザル配列における２つの特有な制限
部位は、ＤＮＡの合成部分のクローニングに使用され得
る(すなわち、アミノ酸７３位のＡsuII部位およびアミ
ノ酸１２５位のＥcoＲＩ)。テナガザル遺伝子に挿入さ
れるＤＮＡ「カセット」は、２１塩基対に亙って互いに
相補的である２つのオリゴヌクレオチドから得られた約
１６０bpのＤＮＡ２本鎖を酵素的に生成させることによ
り、ＡsuII部位からＥcoＲＩまで合成された。完全な２
本鎖は、デオキシヌクレオシド・トリホスフェートおよ
びＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ・フラグメントを用
いて相補領域をオリゴヌクレオチドの端部まで延ばすこ
とにより形成された。完全な２本鎖をＡsuIIおよび／ま
たはＥcoＲＩで消化することにより、後続のクローニン
グで使用される付着末端が得られた。

【００４９】第２の合成ＤＮＡ「カセット」は、アミノ
酸１２５のＥcoＲＩ部位から遺伝子の端部に位置するア
ミノ酸１５２の次の終止コドン(これも含める)までの配
列全体に亙って互いに相補的な２つのオリゴヌクレオチ
ドで構成される。これらのオリゴは、異なる発現ベクタ
ーへのクローニングを目的として、終止コドン自体また
はその直後にＥcoＲＩ付着末端および適当な制限部位ま
たは付着末端を伴う形で設計された。

【００５０】これらのカセットの２セット、即ち一方の
セットはほ乳類発現用、他方のセットは細菌発現用とし
て合成されたが、これらは原核生物および真核生物間の
コドン使用の相異、真核生物遺伝子におけるＣpＧ２本
鎖の低い発生率およびクローニング用の種々の制限部位
の保持性またはそれらに対する必要性に応じたものであ
った。これらのコドン優先性は、当業界の熟練者には周
知である。例えば丸山等、「ニュークリーク・アシッズ
・リサーチ」、１４：r１５１(１９８６)参照。これら
のカセット用に合成された具体例としてのコドン変化お
よび付着末端は下記表３に示されている。次に、これら
のカセットをベクターpＣＳＦ−ＭＬＡにクローン化す
ることにより、ヒトＩＬ−３様因子をコードする遺伝子
を担うベクター中にそれを形質転換する。次いで、ここ
に製造されたベクターを用いてヒト因子を発現させる。

【００５１】

【表９】

【表１０】

【００５２】ヒトＩＬ−３様成長因子のcＤＮＡ配列を
得る別の手順は、組織供給源から得られたcＤＮＡのク
ローニングを含み得る。マニアチス等(前出)の方法に従
い表１のテナガザルcＤＮＡ配列をプローブとして用
い、このヒトＩＬ−３様ポリペプチドをコードするmＲ
ＮＡを分離するためのヒト材料として末梢血リンパ球を
同定した。末梢血リンパ球材料からポリＡ⁺ＲＮＡを調
製し、cＤＮＡに変換し、ファージまたはプラスミドcＤ
ＮＡライブラリーとしてクローン化する。ヒトcＤＮＡ
クローンは、ＤＮＡプローブとして表１のテナガザルコ
ード配列とのハイブリダイゼーションおよびＩＬ−３様
生物学的特性の測定により同定され得る。

【００５３】同様にヒトＩＬ−３様cＤＮＡに関してス
クリーニングされ得る追加の組織供給源には、ひ臓、肝
臓、胸腺、へん桃、腎臓並びにバイオプシーおよび死体
から入手され得る他の新鮮な組織がある。特に興味深い
のは、腫ようが高い造血細胞数の原因であり得る場合、
例えば白血病である。追加されるべき供給源には、受託
所、例えばＡＴＣＣに公的用途のため寄託されたセルラ
インまたは政府機関およびある種の私的筋を通じて入手
可能なセルラインがある。具体例としてのセルラインに
は、形質転換ＴおよびＢセルライン、並びに造血源には
属しないがヘマトポイエチンを生産するセルラインがあ
る。

【００５４】ヒトＩＬ−３様ポリペプチドを発現させる
ためには、それをコードするcＤＮＡを適当な発現ベク
ター、例えばpＣＤまたはpＸＭ中に組入れ、前述の常用
的遺伝子工学技術により選択された宿主細胞へ導入す
る。生物学的活性組換えヒトＩＬ−３様ポリペプチドに
関する一ほ乳類発現系は、安定状態で形質転換されたＣ
ＨＯ細胞である。しかしながら、活性ポリペプチドは、
エシェリヒア・コリおよび他の細菌から細胞内的または
細胞外的に製造され得る。酵母または昆虫細胞もまた、
実施例４に記載された通り発現系として使用され得る。

【００５５】このヒトＩＬ−３様ポリペプチドのさらに
別の発現方法は、例えばヒト・エリスロポイエチンに関
するＰＣＴ ＷＯ８５／２０６１０の記載による、完全
なヒト・ゲノム遺伝子を含むラムダＣＳＦ−１６から得
られたＢglIIフラグメントを用いてポリペプチドを発現
するほ乳類セルラインを構築する方法である。さらに、
このヒト・ゲノム遺伝子は、他の異種系における発現に
適当なプロモーターおよびプロセッシング・シグナル、
例えば昆虫細胞培養株構築用昆虫プロモーターを用いて
工学技術的に製造され得る。同様に、このゲノム遺伝子
は、酵母または他の真核生物系においても発現され得
る。

【００５６】実施例４ ＩＬ−３様成長因子の発現 プラスミド、pＣＳＦ−ＭＬＡは、前記に従い表１のテ
ナガザル配列をＸhoＩ−消化pＸＭに挿入することによ
り簡単に構築される。ヒト配列を有するプラスミド、p
ＳＨＩＬ−３−１は、前記実施例３に従いほ乳類発現用
に合成的に構築される。別のプラスミドpＹ３は、前記
と同様に作製される。次に、霊長動物ＩＬ−３様成長因
子を担うこれらのプラスミドの各々を常套技術によりポ
リペプチド発現用に選択された宿主細胞へ形質転換す
る。

【００５７】Ａ．ほ乳類細胞の発現 下記検定で使用されるＩＬ−３様因子の発現を達成する
ために、pＳＨＩＬ−３−１およびpＣＳＦ−ＭＬＡによ
りＣＯＳ細胞をトランスフェクションする。トランスフ
ェクションされたＣＯＳ細胞の条件培地もまた、高レベ
ルの成長因子活性を含んでいた。

【００５８】この明細書に記載されたほ乳類細胞発現ベ
クターは、当業界の熟練者に周知の技術により合成され
得る。ベクターの構成成分、例えばレプリコン、選択遺
伝子、エンハンサー、プロモーターなどは、天然供給源
から入手されるか、または公知方法により合成され得
る。例えば、カウフマン等、「ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー」、１５９：５１１−５２１
(１９８２)およびカウフマン、「プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメ
リカ」、８２：６８９−６９３(１９８５)参照。具体例
としてのほ乳類宿主細胞には、特に、形質転換セルライ
ンを含めた霊長動物セルラインおよびげっ歯動物セルラ
インが含まれる。正常なディプロイド(２倍体)細胞、一
次組織のインビトロ培養由来の細胞株および一次外植体
もまた適当である。選択遺伝子が優位に作用している限
り、候補細胞は選択遺伝子において遺伝子型的に不完全
である必要は無い。ベクターＤＮＡの安定した組込みお
よびそれに続く組込まれたベクターＤＮＡの増幅には、
共に常用方法によりＣＨＯ細胞が使用され得る。別法と
して、ベクターＤＮＡは、うし乳頭腫ウイルス・ゲノム
の全部または一部を含み得[ラスキー等、「セル」、３
６：３９１−４０１(１９８４)]、安定したエピソーム
構成要素としてセルライン、例えばＣ１２７マウス細胞
に導入され得る。他の適当なほ乳類セルラインには、Ｈ
eＬa、ＣＯＳ−１サル細胞、マウスＬ−９２９細胞、ス
イス、Ｂalb−cもしくはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、
ＢＨＫもしくはＨaＫハムスター・セルラインがある
が、これらに限定される訳ではない。

【００５９】次に、安定した形質転換体を標準免疫学的
または酵素検定により生成物の発現に関してスクリーニ
ングする。変異蛋白質をコードするＤＮＡの存在は、標
準的方法、例えばサザーン・ブロッティングにより検出
され得る。発現ベクターＤＮＡを適当な宿主細胞、例え
ばＣＯＳ−１サル細胞に導入後、数日間変異体をコード
するＤＮＡの一時的発現を培養培地における蛋白質の活
性または免疫学的検定により選択せずに測定する。

【００６０】また当業界の熟練者であれば、例えばＸho
Ｉにより各プラスミドから表１または表２のＤＮＡ配列
を切断し、よく知られている組換え遺伝子工学技術およ
び他の既知ベクター、例えばpＪＬ３およびpＪＬ４[ガ
フ等、「ＥＭＢＯジャーナル」、４：６４５−６５３
(１９８５)]およびpＭＴ２(pＭＴ２−ＶＷＦ、ＡＴＣＣ
＃６７１２２により出発、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７
／０００３３参照)を用いることにより、pＣＳＦ−ＭＬ
ＡおよびpＳＨＩＬ−３−１に匹敵する他のほ乳類発現
ベクターも構築し得る。適当な宿主に対するこれらのベ
クターの形質転換の結果、ＩＬ−３様成長因子の発現が
行なわれ得る。

【００６１】Ｂ．細菌発現系 同様に、当業界の熟練者であれば、コード配列の側面に
位置するほ乳類調節配列を削除または細菌配列と置換す
ることにより表１および表２の配列を操作して、細菌細
胞によるこの発明のＩＬ−３様因子の細胞内または細胞
外発現を目的とする細菌ベクターを作製することができ
る。さらに因子をコードするＤＮＡを実施例３の記載に
従い修飾することにより、当業界で周知の通り細菌発現
用の異なるコドンを含ませることが可能である。同様に
当業界では周知のことであるが、好ましくはこの配列
は、成熟変異型蛋白質の細菌性発現、分泌およびプロセ
ッシングを行わせる分泌を促すリーダー・ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列とフレーム内で効果的に
結合される。次に、全て公知方法により、細菌性宿主細
胞で発現された化合物は、回収され、精製され、および
／または生理化学的、生化学的および／または臨床パラ
メーターに関して特徴分析され得る。

【００６２】細菌性発現を目的とする前記の一細菌性ベ
クターを構築するために、部分合成的ヒトＩＬ−３様Ｄ
ＮＡ配列をテナガザルcＤＮＡおよび実施例３記載の合
成的細菌性カセットから構築した。この配列は、受入れ
番号４０１３４としてＡＴＣＣに寄託されているＮdeＩ
／ＸbaＩ消化ベクターpa１１８１中に組込まれた。生成
したベクターpＰＬＨＩＬ−３−１８１によりエシェリ
ヒア・コリＧＬ４００をトランスフェクションし、公開
されたＰＣＴ出願８６／００６３９でＧＭ−ＣＳＦに関
して記載された条件に従い培養した。

【００６３】エシェリヒア・コリにおけるＩＬ−３様因
子は、不溶性細胞封入体で生産される。そこから蛋白質
を可溶化し、入手するためには、次の手順に従う。細胞
(冷凍ペースト)約５０gを１２０mlの５０mＭトリス−Ｈ
Ｃl、pＨ７.５、０.１mＭフェニル−メチルスルホニル
フルオリド[ＰＭＳＦ]および２mＭジチオトレオトール
[ＤＴＴ](緩衝液Ａ)に再懸濁する。細胞を１００００ps
iまたはそれ以上でフレンチ・プレスまたはマーチン・
ガウリン・バルブに通すことにより崩壊する。次に、こ
れらの崩壊された細胞を３０分間２００００×Ｇで遠心
分離にかけて、細胞破片を沈澱させる。この破片は細胞
封入体を含む。

【００６４】この沈澱を、フレンチ・プレスに通すこと
により緩衝液Ａ中５５％しょ糖に再懸濁し、再び３００
００×Ｇで３０分間遠心分離を行う。ＩＬ−３様因子細
胞封入体を含む沈澱物を緩衝液Ａ中５５％しょ糖に再懸
濁し、６０、６５および７０％しょ糖の段階的勾配によ
り層状にする。この勾配を１５００００×Ｇで２時間遠
心分離にかける。６５％層に対して沈降したＩＬ−３様
因子細胞封入体を集める。

【００６５】現在約８０％純度のＩＬ−３様因子を再構
築し、再び折り畳むために、これらの細胞封入体を８モ
ル尿素中１ml当たり２−３mg蛋白質の割合で再懸濁す
る。蛋白質を含有する尿素溶液を、５０mＭトリス−Ｈ
Ｃl、pＨ８.０、０.１mＭのＰＭＳＦ、２mＭのＤＴＴお
よび０.１mＭのエチレンジアミン四酢酸[ＥＤＴＡ](緩
衝液Ｂ)により希釈して３モル尿素の最終濃度(ただし、
ＩＬ−３濃度は約１μg／mlである)とする。６mＭ還元
グルタチオンおよび６mＭ酸化グルタチオンを含む還元
／酸化緩衝液を尿素溶液に加え、摂氏２０度で２時間イ
ンキュベーションする。３モル尿素溶液を一夜緩衝液Ｂ
に対して透析することにより尿素を除去する。次いで、
ＩＬ−３蛋白質溶液を遠心分離にかけて沈澱物を全て除
去する。この段階で、ＩＬ−３様因子は再び折り畳ま
れ、純度は約８５％である。

【００６６】再び折り畳まれたＩＬ−３様因子を５０m
ＭのＭＥＳ緩衝液(pＨ６.０、０.１mＭのＥＤＴＡ含有)
に対して透析し、同緩衝液中で平衡状態のＤＥＡＥ−セ
ファロース・カラムに適用する。ＩＬ−３様因子は、約
９９％純度でＤＥＡＥのフロー・スルーに存在する。ま
た、この段階では発熱源が全て除去される。ＤＥＡＥフ
ロー・スルーから得られたＩＬ−３のpＨを、２００mＭ
酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ４.０)により５.０に調節す
る。ＩＬ−３様因子をスルホニルプロピル−セファロー
ス・カラムに適用すると、ＩＬ−３様因子はＳＰ−セフ
ァロースに結合し、酢酸ナトリウム含有緩衝液により溶
離する。この段階でＩＬ−３様因子は純粋であり、正確
に再び折り畳まれている。ＣＭＬ検定において、このヒ
トＩＬ−３様因子は１〜３×１０⁷ＣＭＬ単位／mgの比
活性を有する。

【００６７】同様に、表１または表２のコード配列は、
ＸhoＩによりpＣＳＦ−ＭＬＡまたはpＳＨＩＬ−３−１
から切断され、さらに操作(例、他の既知リンカーに結
合または他の公知技術によりそこから非コード配列を欠
失またはそこに存在するヌクレオチドを改編することに
より修飾)され得る。次に、修飾されたＩＬ−３様コー
ド配列は、例えば谷口等、「プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、７７：５２３０−５２３３(１９８０)記載の方法
を用いて既知細菌性ベクターに挿入され得る。次に、こ
の具体例としての細菌性ベクターにより細菌性宿主細胞
を形質転換し、ＩＬ−３様因子をそこで発現させ得る。
細菌性細胞におけるＩＬ−３様因子の細胞外発現達成ス
トラテジーに関しては、例えばヨーロッパ特許出願ＥＰ
Ａ１７７３４３参照。

【００６８】Ｃ．昆虫細胞発現 昆虫細胞での発現を目的とする昆虫ベクターの構築[例
えば、公開されたヨーロッパ特許出願１５５４７６記載
の方法参照]に関しても同様の操作が実施され得る。酵
母ベクターもまた、酵母細胞によるこの発明の蛋白質の
細胞内または細胞外発現を目的とする酵母調節配列を用
いて構築され得る。[例えば、公開されたＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ８６００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰ１２３
２８９記載の方法参照]。

【００６９】実施例５ 高レベルの霊長動物ＩＬ−３様成長因子を発現するＣＨ
Ｏセルラインの構築。この発明のＩＬ−３様ポリペプチ
ドの新規霊長動物科を高レベルでほ乳類細胞から生産さ
せる方法は、異種ＩＬ−３様遺伝子の多数のコピーを含
む細胞の構築を含む。異種遺伝子は、増幅可能なマーカ
ー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)遺伝子に結
合され得、それにより、カウフマンおよびシャープ、
「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、
(１９８２)(前出)の手順に従い、多数の遺伝子コピーを
含む細胞が、濃度を高めたメトトレキセイト(ＭＴＸ)に
おける増殖用に選択され得る。この方法は、幾つかの異
なる細胞タイプにより使用され得る。

【００７０】例えば、pＹ３は、ヒトＩＬ−３様遺伝子
を、その発現を可能にする他のプラスミド配列と効果的
に組合わせた形で含む。pＹ３およびＤＨＦＲ発現プラ
スミドpＡdＡ２６ＳＶ(Ａ)３[カウフマンおよびシャー
プ、「Ｍol.Ｃell Ｂiol.」、３(９)：１５９８−１６
０８(１９８３)]は、燐酸カルシウム共沈降およびトラ
ンスフェクションによりＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、Ｄ
ＵＫＸ−ＢＩＩに共に導入され得る。別法として、この
遺伝子は前述のpＭＴ２に導入され、生成したベクター
はpＹ３およびpＡdＡ２６ＳＶ(Ａ)３の代わりに使用さ
れ得る。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析胎児うし血清
を含むアルファ培地における成長に関して選択し、続い
てカウフマン等、「Ｍol.Ｃell Ｂiol.」、５：１７５
０(１９８３)の記載に従い、濃度を高めたＭＴＸ(０.０
２、０.２、１.０および５μＭのＭＴＸによる連続段
階)中での成長による増殖に関して選択する。形質転換
体をクローン化し、生物学的活性ＩＬ−３様ポリペプチ
ド発現をＣＭＬ検定によりモニターする。ＩＬ−３様ポ
リペプチド発現は、ＭＴＸ耐性のレベルの増加に伴い高
まるべきである。同様の手順に従い、テナガザルＩＬ−
３様ポリペプチドを含むＩＬ−３様ポリペプチドのこの
科に属する他のポリペプチドも生産され得る。

【００７１】実施例６ ＩＬ−３様ポリペプチドの生物学的活性 この発明の霊長動物ＩＬ−３様ポリペプチドの新規科に
属する代表的ポリペプチドとして、テナガザル・ポリペ
プチドおよびヒト・ポリペプチドの両方を用いて下記検
定を実施した。しかしながら、この科に属する他のポリ
ペプチドも、個々のポリペプチドが示すＩＬ−３様生物
学的特性の数に左右されるこれらの同検定または他の検
定においてＩＬ−３様生物学的活性を呈する。

【００７２】Ａ．ＣＭＬ検定 本質的に「ブラッド」、６３(４)：９０４−１１１(１
９８４)記載の手順に従いＣＭＬ検定を実施した。安定
相のＣＭＬ患者から採取された末梢血の冷凍袋から細胞
ストックを得た。この袋を解凍し、１５×１０⁶細胞／
バイアルの５００アリコート中に再冷凍した。これらの
細胞、「ＣＭＬ８−３」を用いてＩＬ−３様ポリペプチ
ドのＩＬ−３様活性を試験した。検定開始の前日に１バ
イアルを３７℃で急速解凍する。次いで、バイアルの内
容物を１５mlの管に移し、ＲＰＭＩ(ギブコ、ＲＰＭＩ
１６４０)中５％ＨiヒトＡＢ血清[ＨＡＢ／ＲＰＭＩ]で
２回洗浄する。これらの細胞を、５％ＣＯ₂および３７
℃において一夜５％ＨiＨＡＢ／ＲＰＭＩ中でインキュ
ベーションする。翌日細胞を培養から除去し、フィコル
で処理し、洗浄し、再計数し、取って置く。

【００７３】検定材料を含む１０％ＨＩＦＣＳ２／ＲＰ
ＭＩ培地１００μlをマイクロタイター・プレートの各
ウェルに入れる。上記で調製された細胞を回転(脱水)さ
せ、１０％ＨＩＦＣＳ／ＲＰＭＩに１.３〜２×１０⁵細
胞／μlの濃度で再懸濁する。細胞１００μlを各ウェル
に入れ、３７℃で５％ＣＯ₂中４８または７２時間抗ヒ
トＧＭＣＳＦ抗体の存在下または非存在下でインキュベ
ーションする。その後、１ウェルに対し０.５μＣi ³Ｈ
−チミジンを加え、ウェルを３７℃で６時間インキュベ
ーションする。ろ過多岐装置を用いて細胞をＧＦＣタイ
プＣフィルター紙(シュライヒエル-シュレル)に採収
し、燐酸緩衝食塩水で洗浄し、乾燥する。次いで、フィ
ルターをシンチレーション流体に浸し、³Ｈ取り込みに
関して計数する。

【００７４】チミジン取り込み測定に基づくと、テナガ
ザルＩＬ−３様成長因子およびヒトＩＬ−３様成長因子
は、両方共白血病芽細胞の増殖刺激においてこの検定で
活性を示す。

【００７５】Ｂ．骨髄検定 非付着性骨髄細胞を用いたヒト骨髄検定をウォング等
(前出)記載の方法に従い実施した。テナガザルおよびヒ
トの両因子に対する条件培地は、この検定において活性
であることが見出され、明らかなか粒球タイプ系統の小
コロニーを製造した。また、染色寒天培養の組織検査で
は、マクロファージ、か粒球-マクロファージおよび好
酸球コロニーが生成していた。この検定をエリスロポイ
エチンの存在下で実施する場合、条件培地が呈する赤血
球前駆細胞成長促進能は、赤血球コロニーの生産により
示される。ヒト骨髄検定においてＧＭ−ＣＳＦをＩＬ−
３様ポリペプチドと比較した場合、ＩＬ−３様ポリペプ
チドは、ＧＭ−ＣＳＦの場合よりも多くのコロニーの形
成を促進した(ただし、両ポリペプチド共エリスロポイ
エチンの存在下であった)。ＧＭ−ＣＳＦにより助長さ
れたコロニーの大部分はシングル系統であったが、この
発明のポリペプチドは、マルチ系統コロニーの形成を促
進した。同様に、芽細胞コロニー形成検定では、ＩＬ−
３様ポリペプチドは、さらに多数のマルチ系統芽細胞コ
ロニーを生産した。同検定においてＧＭ−ＣＳＦは、ご
く僅かしか二次コロニーを生産しなかった。

【００７６】Ｃ．ＫＧ−１細胞検定 ウォング等(前出)記載の要領に従いＫＧ−１検定を実施
した。この発明に従い製造されたＩＬ−３様成長因子の
新規霊長動物科に属するテナガザルＩＬ−３様ポリペプ
チドは、この検定で活性を呈した。

【００７７】Ｄ．多方面にわたる検定 抗体依存性細胞介在性細胞毒検定では、この発明のＩＬ
−３様ポリペプチドは好酸球を刺激することにより、用
量依存形式で抗体被覆腫よう標的細胞を殺した。さらに
このポリペプチドは、好酸球による血清オプソニン化パ
ン酵母食作用を刺激し、好酸球による超酸化アニオン生
成を直接刺激した。この発明のＩＬ−３様因子を健康な
サルに注入し、白(血球)数を観察する予備試験では、血
小板数および好酸球数の両方において再生可能な増加が
観察された。これらの予備結果は、ヒトおよびテナガザ
ルＩＬ−３様因子の両方において観察された。

【００７８】実施例７ ＣＯＳ細胞条件培地からのＩＬ−３様ポリペプチドの精
製 上記実施例４の記載に従い、現在下記の方法を用いてＣ
ＯＳ細胞から均質のＩＬ−３様蛋白質が得られる。

【００７９】Ａ．イオン交換 ＣＯＳ細胞条件培地[ローラー・ボトル中ＤＭＥＭ、０.
５％ＦＢＳ、合計蛋白質濃度２００μg／ml]は、約２−
３μg／mlの濃度でヒトＩＬ−３様ポリペプチドを含
む。伝導率が８.０ms／cm²未満となるまで培地を水で希
釈する。イオン交換カートリッジ[ＱＡＥ ゼータ・プ
レプ]を約５００mlの０.１モルのトリス−Ｃl、pＨ８.
０、次いで２lの４０mＭトリス−Ｃl、pＨ７.４により
摂氏４度で平衡状態にする。培地を４０ml／分の割合で
負荷し、未結合フラクションを集めた。活性が洗浄流出
しなくなるまでカートリッジを４０mＭトリス−Ｃlで洗
浄した。ベンチ・スケール量のＩＬ−３様蛋白質を得る
ために、未結合フラクションをジアフィルトレーション
・ユニット膜[アミコンＹＭ−１０]で濃縮した。

【００８０】ＩＬ−３様蛋白質の大規模精製を目的とす
るこの濃縮工程に代わる方法は、ＱＡＥ−ゼータ・プレ
プ未結合フラクションを１Ｍ氷酢酸で酸性化してpＨ４.
５とする方法である。培地をスルホニルプロピル(ＳＰ)
−ゼータ・プレプ(約５００mlの２０mＭ酢酸ナトリウム
(pＨ４.５)により摂氏４度で平衡状態にされている)に
４０ml／分の割合で負荷する。カートリッジを２０mＭ
酢酸ナトリウムで洗浄し、結合フラクションを２０mＭ
酢酸ナトリウムおよび０.２５〜０.５モル塩化ナトリウ
ムで溶離させる。このフラクションを１Ｍトリス−Ｃl
によりpＨ８.０〜pＨ７.４に中和し、トゥイーン−２０
を加えて最終濃度０.０５％とする。

【００８１】Ｂ．ヒラマメ・レクチン・カラム ヒラマメ・レクチン・カラムを摂氏４度で２０mＭトリ
ス、pＨ７.４、０.０５％トゥイーン−２０[緩衝液Ｉ]
において平衡状態にし、次いで１時間当たり１カラム容
量の割合で負荷した。カラムを緩衝液Ｉで洗浄して非特
異的結合蛋白質を除去し、次いで結合蛋白質を緩衝液Ｉ
＋０.２Ｍアルファ−メチルマンノピラノシドにより溶
離させた。溶離フラクションをプールした。

【００８２】Ｃ．逆相ＨＰＬＣ ＩＬ−３様ポリペプチドのこの調製物を以下の要領によ
り室温で逆相(ＲＰ)ＨＰＬＣに付した。ＩＬ−３様ポリ
ペプチド調製物を１００％緩衝液Ａ中平衡状態のＲＰ
ＨＰＬＣカラム[Ｃ４バイダック]に注入した。緩衝液Ａ
は、０.１％トリフルオロ酢酸[ＴＦＡ](水中)であり、
緩衝液Ｂは９５％アセトニトリル中０.１％ＴＦＡであ
った。勾配は、４５〜７０％緩衝液Ｂまで０.２％／分
であった。この勾配からプールされたフラクションは、
４６.８％Ｂ〜４７.５％の緩衝液Ｂであった。これらの
フラクションを急速真空吸引にかけてアセトニトリルを
除去した。第２逆相ＨＰＬＣ段階では、緩衝液Ａは水中
０.１５％ＨＦＢＡであり、緩衝液Ｂは９５％アセトニ
トリル中０.１５％ヘプタフルオロ酪酸[ＨＦＢＡ]であ
った。勾配は、４５〜７０％緩衝液Ｂまで０.２％／分
であった。この段階からプールされたフラクションは４
９％〜５１％の緩衝液Ｂであった。ＨＰＬＣから溶離す
るこのフラクションは発熱源を含まなかった。

【００８３】実施例８ ＩＬ−３様ポリペプチドの分析 Ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー」、１５９：６０１−６２１
(１９８２)の手順に従い、pＣＳＦ−ＭＬＡによりトラ
ンスフェクションされたＣＯＳ細胞およびpＹ３により
トランスフェクションされたＣＯＳ細胞により生成され
たポリペプチドに³⁵Ｓメチオニンを代謝的に組込む。ト
ランスフェクションされたＣＯＳ−１細胞により分泌さ
れた標識蛋白質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動(還元条件)[レムリ、「ネイチャー」、２２７：６８
０−６８５(１９７０)]は、テナガザルおよびヒト因子
の両方に関して１４kdないし３５kdの範囲の見かけの分
子量を有するポリペプチドの分布を示した。この分布
は、見せかけのトランスフェクション対照試料には存在
しなかった。さらに詳しくは、ＣＨＯ生産ヒトＩＬ−３
様因子は２１〜３２kd間の分布を示し、主として２１な
いし２８kdの分布を呈するＣＯＳ細胞生産ヒト因子より
も高いグリコシル化を示した。

【００８４】実施例６の生成工程後の銀染色により、平
均分子量２１０００〜２５０００の２本の主要なバンド
が両因子において大体等量で現れた。現在これら２本の
バンドにおける差異は、Ｎ−結合グリコシル化における
差異に帰因している。

【００８５】Ｂ．等電点電気泳動 実施例７の精製ポリペプチドの自然等電点電気泳動は、
テナガザルおよびヒト・ポリペプチドの両方に関して４
種類を示し、Ｐi値の範囲はpＨ６.０ないしpＨ７.６で
ある。

【００８６】Ｃ．スーパローズ６高速蛋白質液体クロマ
トグラフィー ＨＰＬＣからの精製フラクションを、２０mＭトリス、p
Ｈ７.４、２００ミリモルＮaＣlおよび０.０５％トウィ
ーン−２０中ゲルろ過カラム[スーパローズ６]において
溶出させた。このカラム溶出は、両因子に関して見かけ
の分子量４３kdの１つの鋭いピークを示した。

【００８７】Ｄ．ＣＭＬ検定における比活性 上記ＣＭＬ検定における具体例としてのテナガザルＩＬ
−３様因子の比活性は、ポリペプチド１mg当たり２×１
０⁶〜１×１０⁷希釈単位の範囲内に含まれ、平均は８×
１０⁶希釈単位／mgである。実施例４(Ｂ)記載の細菌生
産ヒトポリペプチドは、ポリペプチド１mg当たり１〜３
×１０⁷希釈単位の比活性を有することが見出された。
ＣＨＯ生産ヒトＩＬ−３様因子は、この検定では蛋白質
１mg当たり約２〜３×１０⁶単位の比活性を有する。Ｃ
ＯＳ生産ヒトＩＬ−３様因子は、１mg当たり約１〜２×
１０⁷単位の比活性を有する。希釈単位(またはＣＭＬ単
位)は、ＣＭＬ検定において半最大刺激を与える因子の
希釈の単位として定義される。

【００８８】Ｅ．Ｎ−末端分析 テナガザル・ポリペプチドのＮ−末端配列の分析は自動
エドマン分解法を用いて行なわれ、９８％の因子純度の
レベルが示された。

【００８９】Ｆ．Ｎ−グリカナーゼ処理 ＣＯＳ細胞において生産されたヒトおよびテナガザル因
子を、Ｎ−結合炭水化物部分を消化する酵素Ｎ−グリカ
ナーゼで処理した。各因子はこの方法により精製される
ことが示された。ゲル上の各因子の１４−３５kdスミア
を、テナガザル因子については１５kdおよびヒト因子に
ついては２０.５kdの単一バンドに縮小させた。

【００９０】前述の好ましい実施態様の記載を考慮する
と、この発明の実施において多くの修正および変更が行
なわれることは当業界の熟練者であれば容易に想到でき
るはずである。それらの修正および変更も後記請求の範
囲に包含されるものと考えられる。

【００９１】

【表１１】微 生 物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション 寄託機関の住所 １２３０１ パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国寄託物の名称 ＡＴＣＣ番号 引用頁／行 寄託の日付 pCSF-MLA ６７１５４ １２／１３ 1986年7月1
1日 CSF-16 ４０２４６ １２／１６ 1986年8月5
日 pHucIL3-2 ６７３１９ １３／３２ 1987年2月1
3日 pSHIL-3-1 ６７３２６ １２／１９ 1987年2月2
4日

【００９２】この発明によって可能となる事項を挙げる
と次の通りである。 （１）実質的に他の蛋白質性材料を随伴しないヒトＩＬ
−３蛋白質。 （２）実質的に他の蛋白質性材料を随伴せず、下記配列

【表１２】 (ただし、a は０または１である)、または

【表１３】 (ただし、a は０または１である)、およびそのアレルと
実質的に同じ配列を含むペプチド配列を特徴とするＩＬ
−３蛋白質であって、標準ヒト骨髄検定において１０〜
１００ピコモル濃度で様々な系統の造血コロニーの多数
のタイプの形成に対する刺激能を有する蛋白質である、
１記載の蛋白質。 （３）さらに、 a．還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
測定された約１４〜約３５キロダルトンの見かけの分子
量、 b．ＣＭＬ検定における１０〜１００ピコモル濃度での
ＣＭＬ細胞増殖刺激能、 c．pＨ６.０ないし７.６間の等電点、 d．スーパローズ６ゲルろ過カラムにおける４３kdでの
鋭い単一ピーク、 e．Ｎ−グリカナーゼ処理後のゲルにおける２０.５kdの
単一バンド、および f．エドマン分解法を用いたＮ−末端分析における約２
％以下の汚染物質レベル から成る群から選ばれる少なくとも一特性を有すること
を特徴とする、２記載の蛋白質。 （４）エドマン分解法を用いたＮ−末端分析において約
２％以下の汚染物質レベルを有する２記載の蛋白質。 （５）医薬的に許容し得る賦形剤中に、請求項１〜４記
載のＩＬ−３蛋白質の治療有効量を含有する医薬組成
物。 （６）低い造血細胞レベルを高めるのに使用される医薬
組成物における霊長動物ＩＬ−３。 （７）他のヘマトポイエチン、インターロイキンまたは
成長因子の少なくとも１種と組合わせて低い造血細胞レ
ベルを高めるのに使用される医薬組成物における霊長動
物ＩＬ−３。 （８）ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、エリス
ロポイエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４および／
またはＩＬ−６と組合わせて低い造血細胞レベルを高め
るのに使用される医薬組成物における霊長動物ＩＬ−
３。 （９）Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子または好酸球分
化因子と組合わせて低い造血細胞レベルを高めるのに使
用される医薬組成物における霊長動物ＩＬ−３。 （10）霊長動物ＩＬ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列
および異種ＤＮＡを含むベクターであって、ＩＬ−３蛋
白質をコードするＤＮＡ配列が、 a．実質的に表１に示されたペプチド配列をコードする
ＤＮＡ配列、 b．実質的に表２に示されたペプチド配列をコードする
ＤＮＡ配列、 c．(a)または(b)の配列の対立遺伝子変異型、 d．ストリンジェント条件下で(a)、(b)または(c)のＤＮ
Ａ配列とハイブリダイズし得るＤＮＡ配列、 から成る群から選ばれる配列である、ベクター。 （11）霊長動物ＩＬ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を発現させ得る１０記載のベクターにより形質転換され
た細胞および前記細胞の子孫。 （12）ほ乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞および酵母細胞
から成る群から選ばれる、請求項１１記載の形質転換細
胞。 （13）霊長動物ＩＬ−３蛋白質の製造方法であって、
(a)発現制御配列と操作可能に組合わされた、霊長動物
ＩＬ−３をコードするＤＮＡ配列により形質転換された
宿主細胞を適当な培養培地において培養し、(b)ＩＬ−
３を実質的に純粋な形態で分離することを含む方法。 （14）下記配列

【表１４】 (ただし、a は０または１である)または

【表１５】 (ただし、a は０または１である)およびそのアレルと実
質的に同じペプチド配列を特徴とする均等なＩＬ−３蛋
白質であって、ＣＭＬ検定においてポリペプチド１mg当
たり少なくとも２×１０⁶希釈単位の比活性を有するＩ
Ｌ−３蛋白質。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＸ 38/22 ＡＤＹ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 5/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｋ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＣ ＡＤＸ 37/24 ＡＤＹ 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 (31)優先権主張番号 ０２１８６５ (32)優先日 1987年３月４日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 アグネス・ビー・シアーレッタ アメリカ合衆国01876マサチューセッツ、 テュークスバリー、プレザント・ストリー ト36番 (72)発明者 ユ−チャング・ヤン アメリカ合衆国02174マサチューセッツ、 アーリントン、アパートメント19、バイキ ング・コート３番

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に他の蛋白質性材料を随伴しない
   霊長動物(ヒトを除く)ＩＬ−３蛋白質。
2. 【請求項２】 実質的に他の蛋白質性材料を随伴せず、
   下記配列 【表１】 (ただし、a は０または１である)、または 【表２】 (ただし、a は０または１である)、およびそのアレルと
   実質的に同じ配列を含むペプチド配列を特徴とするＩＬ
   −３蛋白質であって、標準ヒト骨髄検定において１０〜
   １００ピコモル濃度で様々な系統の造血コロニーの多数
   のタイプの形成に対する刺激能を有する蛋白質である、
   請求項１記載の蛋白質。
3. 【請求項３】 さらに、 a．還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
   測定された約１４〜約３５キロダルトンの見かけの分子
   量、 b．ＣＭＬ検定における１０〜１００ピコモル濃度での
   ＣＭＬ細胞増殖刺激能、 c．pＨ６.０ないし７.６間の等電点、 d．スーパローズ６ゲルろ過カラムにおける４３kdでの
   鋭い単一ピーク、 e．Ｎ−グリカナーゼ処理後のゲルにおける２０.５kdの
   単一バンド、および f．エドマン分解法を用いたＮ−末端分析における約２
   ％以下の汚染物質レベル から成る群から選ばれる少なくとも一特性を有すること
   を特徴とする、請求項２記載の蛋白質。
4. 【請求項４】 エドマン分解法を用いたＮ−末端分析に
   おいて約２％以下の汚染物質レベルを有する請求項２記
   載の蛋白質。
5. 【請求項５】 請求項１〜４記載のＩＬ−３蛋白質を有
   効成分とする、医薬組成物。
6. 【請求項６】 低い造血細胞レベルを高めるのに使用さ
   れる、請求項５記載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 更に他のヘマトポイエチン、インターロ
   イキンおよび成長因子の少なくとも１種を含有する、請
   求項５または６記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 更にＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ
   −１、エリスロポイエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ
   −４およびＩＬ−６の少なくとも１種を含有する、請求
   項５または６記載の医薬組成物。
9. 【請求項９】 更にＢ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子お
   よび好酸球分化因子の少なくとも１種を含有する、請求
   項５または６記載の医薬組成物。
10. 【請求項１０】 下記配列 【表３】 (ただし、a は０または１である)または 【表４】 (ただし、a は０または１である)およびそのアレルと実
    質的に同じペプチド配列を特徴とする均等なＩＬ−３蛋
    白質であって、ＣＭＬ検定においてポリペプチド１mg当
    たり少なくとも２×１０⁶希釈単位の比活性を有するＩ
    Ｌ−３蛋白質である、均質な形の請求項１記載の蛋白
    質。
11. 【請求項１１】 ＩＬ−３蛋白質をコードし、 ａ．表１の配列、 ｂ．表２の配列、 ｃ．ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のＤ
    ＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列、 ｄ．（ａ）または（ｂ）の配列の対立遺伝子変異型 から成る群から選ばれた５’〜３’方向でのヌクレオチ
    ド配列を含むｃＤＮＡ配列。
12. 【請求項１２】 発現制御配列と効果的に組合わされた
    請求項１１記載のｃＤＮＡ配列により形質転換された細
    胞。
13. 【請求項１３】 発現制御配列と効果的に組合わされた
    ＩＬ−３蛋白質の発現をコードするｃＤＮＡ配列により
    形質転換されたセルラインを培養することを含むＩＬ−
    ３蛋白質の製造方法。
14. 【請求項１４】 細胞が哺乳類セルラインである、請求
    項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 細胞が細菌性セルラインである、請求
    項１３記載の方法。