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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von IL-3-ähnlichen
hämatopoetischen
Wachstumsfaktoren von Primaten und ein Verfahren zu deren Herstellung
durch Rekombinations-Gentechnik-Verfahren.
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Stand der
Technik
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Hämatopoetine,
d.h. hämopoetische
Wachstumsfaktoren, sind Proteine, die das Überleben, das Wachstum und
die Differenzierung hämatopoetischer
Zellen fördern.
Koloniestimulierende Faktoren (CSFs) zählen zu diesen hämatopoetischen
Wachstumsfaktoren, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind,
in vitro das Wachstum von Kolonien hämatopoetischer Zellen zu fördern, welche
aus Vorläuferzellen
des Knochenmarks, der fetalen Leber und von anderen hämatopoetischen
Organe hervorgehen.
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Die
biochemische und biologische Identifizierung und Charakterisierung
bestimmter Hämatopoetine wurde
dadurch erschwert, dass die in der Natur vorkommenden Faktoren,
die aus natürlichen
Quellen, z.B. aus Blut und Urin, erhalten werden, nur in kleinen
Mengen verfügbar
sind. Einige dieser Hämatopoetine
wurden kürzlich
molekular cloniert, heterolog exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt.
[D. Metcalf, "The
Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony
Stimulating Factors",
Blood 67 (2) (1986), 257–267].
Zu diesen Hämatopoetinen
zählen
der menschliche und der murine GM-CSF, der menschliche G-CSF, der
menschliche CSF-1 und das murine IL-3. Es wurde nachgewiesen, dass
der menschliche GM-CSF [R. Donahue et al., Nature 321 (1986), 872–875], das
murine IL-3 [J. Kindler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986),
1001–1005;
Metcalf et al., Blood 68 (1986), 46–57] und der menschliche G-CSF
[K. Wette et al., J. Exp. Med. 165 (1987) 941–948] in vivo auf die Hämatopoese
wirken. Trotz intensiver Forschungsarbeit mit dem murinen Protein
IL-3 wurde bisher kein menschliches Gegenstück gefunden. [D. R. Cohen et
al., Nucl. Acids. Res. 14 (1986), 3641].
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Kurze Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Familie von IL-3-ähnlichen
Wachstumsfaktoren von Primaten, die im Wesentlichen frei von anderen
Primaten-Proteinen
sind und die durch Peptidsequenzen gekennzeichnet sind, die mit
den in den nachstehenden Tabellen I und II dargestellten Aminosäuresequenzen
identisch sind oder die zu diesen Sequenzen im Wesentlichen homolog
sind. Diese Primaten-Proteine,
einschließlich
insbesondere der menschlichen Proteine, werden nachstehend auch
einfach als IL-3 bezeichnet. Diese Proteine werden codiert durch
die in den Tabellen dargestellten DNA-Sequenzen und durch Sequenzen,
die unter stringenten Bedingungen daran hybridisieren können, oder
durch solche Sequenzen, die auf Grund der Degeneration des genetischen
Codes unter diesen Bedingungen daran nicht hybridisieren können, wobei
sie Polypeptide mit IL-3-ähnlichen
biologischen Eigenschaften codieren, und durch andere, verschieden
modifizierte Sequenzen, die solche Eigenschaften zeigen. Außerdem sind
diese Polypeptide durch IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaften gekennzeichnet.
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Die
Erfindung stellt als ein Beispiel bereit:
eine DNA-Sequenz,
die ein Polypeptid codiert, umfassend eine oder mehrere Sequenzen
reifer Peptide, die in Tabelle I oder Tabelle II gezeigt werden,
wobei die Aminosäure
27 ein Serinrest ist und das Polypeptid mindestens eine der biologischen
Eigenschaften von Primaten-IL-3 besitzt, wobei die biologischen
Eigenschaften ausgewählt
sind aus:
- (a) der Fähigkeit, das Wachstum und die
Differenzierung von Primaten-Progenitorzellen
zu fördern,
die für die
Erythrocyten-, Lymphocyten- und Myelocyten-Linie determiniert sind;
- (b) der Fähigkeit,
in einem menschlichen Knochenmark-Standardtest Granulocyten-Kolonien
und die Entstehung erythroider Vorläuferzellen zu stimulieren;
- (c) der Fähigkeit,
das Wachstum von pluripotenten Primaten-Vorläuferzellen aufrechtzuerhalten;
und
- (d) der Fähigkeit,
die Proliferation chronisch-myeloischer Leukämie(CML)-Zellen von Primaten
im CML-Test zu stimulieren oder
eine DNA-Sequenz, die
befähigt
ist, unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz zu hybridisieren, oder eine
DNA-Sequenz, die auf Grund der Degeneration des genetischen Codes
unter diesen Bedingungen nicht befähigt ist, mit einer DNA-Sequenz zu hybridisieren,
die ausgewählt
ist aus: - (a) der DNA-Sequenz von Tabelle I;
- (b) der DNA-Sequenz von Tabelle II, wobei das Codon für die Aminosäure 27 TCC
ist;
- (c) der XhoI-Insertion in pXM (ATCC 67154); und
- (d) der genomischen BamHI- oder BglII-Insertion im Bakteriophagen
Lambda M13 Clonierungsvektor mp9 (ATCC 40246);
wobei die
DNA ein Polypeptid codiert, das mindestens eine biologische Eigenschaft
des Primaten-IL-3 besitzt, ausgewählt aus: - (i)
der Fähigkeit,
das Wachstum und die Differenzierung von Primaten-Progenitorzellen
zu fördern,
die für die
Erythrocyten-, Lymphocyten- und Myelocyten-Linie determiniert sind;
- (ii) der Fähigkeit,
in einem menschlichen Knochenmark-Standardtest Granulocyten-Kolonien
und die Entstehung erythroider Vorläuferzellen zu stimulieren;
- (iii) der Fähigkeit,
das Wachstum von pluripotenten Primaten-Vorläuferzellen aufrechtzuerhalten;
und
- (iv) der Fähigkeit,
die Proliferation chronisch-myeloischer Leukämie(CML)-Zellen von Primaten im CML-Test zu stimulieren.
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Diese
DNA-Sequenzen können
menschliche oder Gibbon-DNASequenzen sein und umfassen außerdem cDNAs.
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Die
Erfindung stellt ferner Polypeptide oder Proteine bereit, die durch
die vorstehend erwähnten DNA-Sequenzen
codiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Polypeptide
die in Tabelle I oder Tabelle II dargestellte Aminosäuresequenz
auf, wobei die Aminosäuresequenz
von Tabelle II an Position 27 die Aminosäure Serin enthält, gegebenenfalls
fehlt diesem Protein der Methionylrest am N-Terminus.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
haben die Polypeptide oder Proteine ein Molekulargewicht von etwa
14.000 bis etwa 35.000, das Molekulargewicht wird durch reduzierende
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung stellt Arzneimittel bereit, die eine
therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Polypeptide
enthalten. Diese Mittel können
in Verfahren für
die Behandlung einer ganzen Anzahl von Krankheitszuständen eingesetzt
werden, die durch einen Mangel an hämatopoetischen Zellen gekennzeichnet
sind. Diese erfindungsgemäßen Verfahren
umfassen die Verabreichung einer wirksamen Menge mindestens eines
hier beschriebenen Polypeptids an einen Patienten.
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Solche
Therapieverfahren können
für die
Behandlung verschiedener Krankheitszustände eingesetzt werden, die
in Folge einer Krankheit, von Bestrahlung und/oder Arzneistoffen
entstehen, z.B. Leukopenie, Thrombocytopenie, Anämie, B-Zellen-Mangel, T-Zellen-Mangel,
Bakterieninfektion und Virusinfektion, einschließlich Mangel an Immunzellen
oder an hämatopoetischen
Zellen nach einer Knochenmarktransplantation. Diese Verfahren der
vorliegenden Erfindung können
auch die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer
wirksamen Menge mindestens eines anderen Hämatopoetins, Interleukins oder
Wachstumsfaktors zusammen mit den IL-3-ähnlichen Polypeptiden umfassen.
Hämatopoetine
für eine
solche Verwendung umfassen z.B. GM-CSF, G-CSF, CSF-1 oder Erythropoetin.
Interleukine sind z.B. IL-1, IL-2, IL-4 oder IL-6. In den Verfahren
können
auch Wachstumsfaktoren eingesetzt werden, wie z.B. ein B-Zellen-Wachstumsfaktor, ein
B-Zellen-Differenzierungsfaktor oder ein Eosinophilen-Differenzierungsfaktor.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung sind Vektoren, die eine DNA-Sequenz
enthalten, wie vorstehend beschrieben, vorzugsweise in funktioneller
Verknüpfung
mit einer Expressionskontrollsequenz, und Zellen, die mit einer
solchen DNA-Sequenz transformiert sind. Solche Vektoren und solche
transformierten Zellen können in
einem neuen Verfahren zur Herstellung eines IL-3-ähnlichen
Primaten-Polypeptides eingesetzt werden, wobei eine Zelllinie gezüchtet wird,
die mit einer die Expression eines IL-3-ähnlichen Polypeptides codierenden DNA-Sequenz
transformiert ist, die in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz
vorliegt. In diesem erfindungsgemäßen Verfahren können für die Expression
des Polypeptids eine Anzahl bekannter Zellen als Wirtszellen eingesetzt
werden. Zur Zeit bevorzugte Zelllinien sind Säugerzelllinien, Bakterienzellen und
Hefezellen.
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Andere
Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung
der folgenden genauen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
deutlich.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Die
Familie von IL-3-ähnlichen
Wachstumsfaktoren von Primaten, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt
werden, umfasst Polypeptide oder Proteine, die durch die vorstehend
erwähnten
DNA-Sequenzen codiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die Polypeptide oder Proteine die in Tabelle I oder Tabelle
II dargestellte Aminosäuresequenz
auf, wobei die Aminosäuresequenz
von Tabelle II an Position 27 die Aminosäure Serin enthält, gegebenenfalls
fehlt dem Protein der Methionylrest am N-Terminus. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
haben die Polypeptide oder Proteine ein Molekulargewicht von etwa 14.000
bis etwa 35.000, das Molekulargewicht wird durch reduzierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt.
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Vorzugsweise
zeigt jedes Mitglied der Familie von Wachstumsfaktoren der vorliegenden
Erfindung mehr als eine IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaft.
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Der
Begriff "IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaft" umfasst
in der vorliegenden Definition eines oder mehrere der folgenden
biologischen Merkmale sowie in vivo- und in vitro-Aktivitäten. Eine
solche Eigenschaft ist die Förderung
des Wachstums und der Differenzierung von Progenitorzellen, die
für die
Erythrocyten-, Lymphocyten- und Myelocyten-Linie determiniert sind.
Zum Beispiel lässt
sich in einem menschlichen Knochenmark-Standardtest eine IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaft zeigen, indem Granulocytentyp-Kolonien und die
Entstehung erythroider Vorläuferzellen
stimuliert werden. Eine weitere solche Eigenschaft zeigt sich in
einer Beeinflussung früher
multipotenter Stammzellen.
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Eine
weitere IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaft ist das Aufrechterhalten des Wachstums pluripotenter
Vorläuferzellen.
Eine weitere Eigenschaft ist die Fähigkeit, die Proliferation
chronisch-myeloischer Leukämie-Zellen
(CML-Zellen) zu stimulieren. Eine IL-3-ähnliche biologische Eigenschaft
ist außerdem
die Stimulation der Proliferation von Mastzellen. IL-3-ähnliche
Wachstumsfaktoren können
außerdem
das Wachstum verschiedener Faktor-abhängiger Zelllinien fördern und/oder
die Expression von 20-Alpha-Steroiddehydrogenase (20-Alpha-SPH)
und Thy-I-Antigen induzieren. Weitere IL-3-ähnliche biologische Eigenschaften
sind die Stimulation einer Koloniebildung von KG-1-Zellen und/oder
die Stimulation einer gesteigerten Histamin-Synthese in Kulturen
von Milz- und Knochenmarkzellen. Noch eine weitere biologische IL-3-Aktivität ist ein
offensichtliches Molekulargewicht zwischen etwa 14 und etwa 35 kD,
das durch reduzierende Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt
wird. Weitere biologische Eigenschaften IL-3-ähnlicher Proteine wurden in
der Fachliteratur beschrieben, wobei die Eigenschaften des murinen
IL-3 dargestellt sind.
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Die
in den Tabellen I und II erläuterten
spezifischen Peptidsequenzen stellen zwei Beispiele der erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor-Familie
dar. Die 865 Bp-große
DNA-Sequenz von Tabelle I wurde aus einer cDNA-Expressions-Genbank
der mit dem Gibbon-Affenleukämievirus
infizierten Gibbon-T-Zelllinie UCD-144-MLA isoliert [T. G. Kuwakami
et al., Nature 235 (1972), 170]. Diese Sequenz enthält ein einziges
langes offenes Leseraster von 456 Nucleotiden, das ein Protein mit
etwa 152 Aminosäuren
codiert, genannt CSF-80, und umfasst eine herkömmliche sekretorische Leadersequenz,
die durch eine stark hydrophobe Sequenz (leu leu leu leu gln leu
leu) gekennzeichnet ist. Das reife Protein beginnt bei Aminosäure Nr.
20, Alanin, in Tabelle I. Die codierende Region enthält drei
Cysteinreste, zwei im reifen Protein, wodurch eine Disulfidbindung
nahegelegt wird. Es liegen zwei mögliche Asparagin-gekoppelte
Glykosylierungsstellen vor, die durch die charakteristischen Sequenzen
Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr gekennzeichnet sind. Sowohl die Größe als auch das
Glykosylierungsmuster des durch die codierende Sequenz erhaltenen
Proteins, sind für
Lymphokin-ähnliche
Proteine typisch. Die verbleibenden nicht codierenden Anteile des
865 Bp-großen
Bereichs könnten
bei der Regulation der Transkription im natürlichen Wirt eine Rolle spielen.
Das 3'-Ende der
Sequenz enthält
außerdem
ein AT-reiches Segment, umfassend mehrere Wiederholungen der Sequenz
ATTTA, das vermutlich mit der Stabilität der RNA-Message zusammenhängt [siehe
G. Shaw und R. Kamen, Cell 46 (5) (1986), 659–677].
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Die
674 Bp-große
DNA-Sequenz von Tabelle II wurde aus einer menschlichen Genbank
erhalten [J. J. Toole et al., Nature 312 (1984), 342–346], indem
die Sequenz von Tabelle I als Sonde eingesetzt wurde. Die DNA-Sequenz
von Tabelle II wurde anfangs konstruiert, indem die Exons der menschlichen
genomische Sequenz, die durch Vergleich mit der DNA-Sequenz des
IL-3-ähnlichen
Gibbon-Polypeptides von Tabelle I identifiziert wurden, zusammengespleißt wurden.
Diese menschliche Sequenz, die durch mRNA-Analyse des menschlichen cDNA-Clons
bestätigt
wurde, codiert auch ein Polypeptid mit etwa 152 Aminosäuren, welches ein
Mitglied dieser Familie von Primaten-Proteinen ist. Dieses menschliche
Polypeptid umfasst eine herkömmliche
sekretorische Leadersequenz, die durch eine stark hydrophobe Sequenz
(leu leu leu gln leu leu) gekennzeichnet ist. Das reife Polypeptid
beginnt bei Aminosäure
Nr. 20, Alanin, in Tabelle II. Die codierende Region enthält im reifen
Protein zwei Cysteinreste, wodurch eine Disulfidbindung nahegelegt
wird. Es liegen zwei mögliche
Asparagin-gekoppelte Glykosylierungsstellen vor, die durch die charakteristische
Sequenz, Asn-X-Ser, gekennzeichnet sind. Die verbleibenden nicht
codierenden Bereiche der 674 Bp-großen Sequenz könnten bei der
Regulation der Transkription im natürlichen Wirt eine Rolle spielen.
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Die
Nucleotidsequenzen der Exons des menschlichen genomischen Gens [Tabelle
II] waren zu der DNA-Sequenz des Gibbon-Gens [Tabelle I] zu mehr
als 96% homolog. Änderungen
der Nucleotidsequenzen in 11 Codons führen zu Unterschieden beiden
Aminosäuren
im Gibbon-Protein und im menschlichen Protein. Die in Tabelle II über der
Sequenz angegebenen Nucleotide bezeichnen die Stellen, an denen
sich die Gibbon-Sequenz von der verwandten menschlichen Sequenz
unterscheidet. Ebenso bezeichnen die unter der menschlichen Aminosäuresequenz
angegebenen Aminosäuren
die Stellen, an denen sich die menschliche Aminosäuresequenz
von der Gibbon-Sequenz unterscheidet.
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Ein
computergestützter
Vergleich, der von den National Biomedical Services of Washington,
D. C., durchgeführt
wurde, zeigte, dass die Gibbon-Sequenz und die menschliche IL-3-ähnliche
Sequenz zu der murinen IL-3-DNA-Sequenz, wie sie von M. C. Fung
et al., Nature 307 (1984), 233–237,
veröffentlicht
wurde, auf Aminosäureebene
etwa 29% Homologie und auf Nucleotidebene etwa 45% Homologie aufweisen.
Der Vergleich von Exonstrukturen des menschlichen IL-3-ähnlichen Gens mit den codierenden
Regionen des murinen IL-3 zeigte ähnliche Ergebnisse.
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Die
in Tabelle I dargestellte neue 865 Bp-große cDNA-Sequenz, enthalten
in einem Plasmid in E. coli HB101, wurde in der American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD, am 11. Juli 1986 hinterlegt
und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 67154. Die neue genomische
Sequenz, deren cDNA-Sequenz
in Tabelle II nachstehend erläutert
wird, enthalten im Bakteriophagen Lambda, wurde am 7. August 1986
genauso hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 40246.
Die menschliche IL-3-DNA, enthalten in Plasmid pSHIL-3-1 in E. coli
HB101, wurde am 24. Februar 1987 bei der ATCC hinterlegt und erhielt
die Hinterlegungsnummer ATCC 67326.
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Die
beispielhaften IL-3-ähnlichen
Polypeptide von Mensch und Gibbon wurden weiter charakterisiert, indem
eine SDS-Polyacrylamidgel-Analyse der 35S-markierten
Proteine aus transfizierten COS-Zellen durchgeführt wurde, wie in den Beispielen
beschrieben wird. Beide Polypeptide zeigen eine heterogene Größe, wobei
Moleküle
mit einem offensichtlichen Molekulargewicht im Bereich von etwa
14 kD bis 35 kD, und insbesondere von 18 kD bis 30 kD vorliegen.
Dieser Bereich von Molekulargewichten für diese beispielhaften IL-3-ähnlichen
Faktoren ist vermutlich eine Folge von Variationen der Glykosylierung
der gereinigten, durch COS-Zellen produzierten Moleküle. Die
gereinigten Proteine bewirken in menschlichen Knochenmark-in-vitro-Tests
in Konzentrationen von 10 bis 100 Picomol die Erzeugung kleiner
Granulocytentyp-Kolonien. Außerdem
fördern
beide Polypeptide in diesen menschlichen Knochenmark-Tests in Gegenwart
von Erythropoetin in vergleichbaren Aktivitätsniveaus das Wachstum von
Erythrocyten-artigen und Myelocyten-artigen Progenitorzellen. Somit sind
diese IL-3-ähnlichen
Faktoren Multi-CSFs. Diese IL-3-ähnlichen
Faktoren können
auch die Proliferation leukämischer
Blastenzellen von Patienten mit CML bewirken. Diese Polypeptide
können
auch befähigt
sein, akzessorische und reife Zellen, z.B. Monocyten, dazu zu stimulieren,
andere hämopoetisch
wirkende Faktoren zu produzieren, die ihrerseits die Bildung von
Kolonien anderer hämatopoetischer
Zellen und außerdem
andere hämatopoetische
Aktivitäten
stimulieren.
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Außerdem sind
in der vorliegenden Erfindung synthetische Polypeptide eingeschlossen,
in denen fortlaufende Sequenzen der Aminosäurereste der Tabellen I und
II vollständig
oder teilweise wiederholt werden. Verfahren zur Konstruktion der
erfindungsgemäßen Polypeptide
auf synthetischem Weg sind dem Fachmann bekannt. Die synthetisch
konstruierten Sequenzen können,
wenn sie Merkmale der Primär-,
Sekundär-
oder Tertiärstruktur
und der Konformation mit den IL-3-ähnlichen Polypeptiden der Tabellen
I und II gemeinsam haben, auch die entsprechenden IL-3-ähnlichen
biologischen Aktivitäten
besitzen. Somit können
sie als biologisch aktiver Ersatz oder als immunologischer Ersatz
anstelle der natürlichen
gereinigten IL-3-ähnlichen
Primaten-Polypeptiden für
therapeutische und immunologische Zwecke eingesetzt werden.
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Die
hier bereitgestellte Familie von IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktoren
umfasst auch Faktoren, die durch Sequenzen codiert werden, die den
Sequenzen der Tabellen I und II ähnlich
sind, in denen jedoch Modifikationen auf natürlichem Weg erhalten oder gezielt
konstruiert werden. Zum Beispiel weist ein solches modifiziertes
menschliches Protein die Sequenz des reifen Peptides auf, die in
Tabelle II dargestellt ist, mit der Ausnahme, dass Ser-27 durch
einen Prolinrest ersetzt ist. Dieses Protein wird durch eine menschliche
cDNA-Sequenz codiert, wie sie in Tabelle II dargestellt ist, mit
der Modifikation, dass an Aminosäureposition
27 das Prolin-Codon CCC anstelle des Serin-Codons TCC vorliegt,
welches in der Tabelle an dieser Position erscheint. Diese beispielhafte
modifizierte IL-3-ähnliche
DNA-Sequenz, die einen aktiven menschlichen IL-3-ähnlichen
Faktor erzeugt, eingefügt
in E. coli HB101 als pHucIL3-2, wurde am 13. Februar 1987 bei der ATCC
unter der Hinterlegungsnummer ATCC 67319 hinterlegt. EP-A 0 275
589, das ein Dokument gemäß Art. 54
(3) EPC darstellt, offenbart auch eine Sequenz, in der die Aminosäureposition,
die der Aminosäureposition 27
in Tabelle II entspricht, Pro ist und in der das Codon, das dem
Codon 27 in Tabelle II entspricht, TCC ist.
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Andere
Modifikationen des Peptides oder der Sequenzen können vom Fachmann unter Verwendung bekannter
Techniken durchgeführt
werden. Spezifische Modifikationen von Interesse dieser IL-3-ähnlichen verwandten
Sequenzen können
in jeder codierenden Sequenz auch einen Austausch eines oder beider
Cysteinreste durch andere Aminosäuren
umfassen. Vorzugsweise werden beide Cysteinreste durch eine andere Aminosäure, z.B.
Serin, ersetzt, um die Disulfidbrücke zu entfernen. Mutagene
Techniken für
einen solchen Austausch sind dem Fachmann bekannt [siehe z.B. US-Patent
4,518,584].
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Andere
spezifische Mutationen der Sequenzen der hier beschriebenen IL-3-ähnlichen Faktoren umfassen
Modifikationen der einen oder der beiden Glykosylierungsstellen.
Das Fehlen der Glykosylierung oder eine nur teilweise Glykosylierung
ergibt sich aus einer Aminosäuresubstitution
oder -deletion an der einen oder an beiden Asparagin-gekoppelte
Glykosylierungs-Erkennungsstellen, die in den Sequenzen der IL-3-ähnlichen
Faktoren vorliegen, die in den Tabellen I und II gezeigt werden.
Die Asparagin-gekoppelten Glykosylierungs-Erkennungsstellen umfassen
Tripeptidsequenzen, die durch geeignete zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch
erkannt werden. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin
oder Asparagin-X-Serin, wobei X üblicherweise
eine beliebige Aminosäure
darstellt. Verschiedene Aminosäuresubstitutionen
oder -deletionen an der ersten und/oder der dritten Aminosäureposition
einer Glykosylierungserkennungsstelle (und/oder eine Aminosäuredeletion
an der zweiten Position) führen
zu einer Nicht-Glykosylierung an der modifizierten Tripeptidsequenz.
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Zum
Beispiel kann ASn34 der Sequenz von Tabelle
I in einem solchen modifizierten IL-3-ähnlichen Faktor durch Glutamin
ersetzt werden. Der resultierende Faktor (Gln34)
sollte nur eine Asparagin-gekoppelte Kohlenhydrateinheit enthalten
(an Asn89), anstelle von zwei solchen Einheiten.
Dem Fachmann ist bewusst, dass analoge Glykoproteine mit der gleichen
Asn89-Monoglykosylierung hergestellt werden
können,
indem eine andere Aminosäure
an Position 34 eingesetzt wird und/oder indem eine andere Aminosäure an den
anderen Positionen innerhalb der Glykosylierungserkennungsstelle
ersetzt wird, z.B. indem Valin anstelle von Se36 eingesetzt
wird. Auf ähnliche
Weise können
das der Position 89 entsprechende Asn-Codon und/oder das der Position
91 entsprechende Serin-Codon mittels einer mutagenen Technik zu
Codons für
andere Aminosäuren
umgewandelt werden. Die Expression von solchen geänderten
Nucleotidsequenzen ergibt Varianten, die an dieser Stelle nicht
glykosyliert sind. In einer anderen Ausführungsform können die
beiden Stellen wie vorstehend verändert werden. Solche Modifikationen
der Glykosylierungsstellen können
auch durchgeführt
werden, um Modifikationen der Sequenz von Tabelle II zu erzeugen
[siehe z.B. A. Miyajima et al., EMBO J. 5 (6) (1986), 1993–1197, und
das nachstehende Beispiel IV]. Außerdem kann der Fachmann einfach
anhand der hier dargestellten Beschreibungen andere Analoga und
Derivate der Sequenzen der Tabellen I und II herstellen, die voraussichtlich
die IL-3-ähnliche
Aktivität
noch insgesamt oder zum Teil besitzen. Solche offensichtlichen Modifikationen
sollen in dieser Erfindung enthalten sein.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst außerdem die vorstehend erwähnten neuen
DNA-Sequenzen, die bei Expression die IL-3-ähnlichen Polypeptide oder Wachstumsfaktoren
der Primaten codieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen die in Tabelle
I und Tabelle II dargestellten Sequenzen in einer 5'- zu 3'-Richtung und diejenigen
Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [siehe
T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold
Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387–389] mit den DNA-Sequenzen
der Tabellen I und II hybridisieren. Ein Beispiel einer solche stringenten
Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung in 4 × SSC bei
65°C, gefolgt
von einem Waschgang in 0,1 × SSC
bei 65°C,
eine Stunde. Ein anderes Beispiel einer stringenten Hybridisierungsbedingung
ist eine Hybridisierung in 50 Formamid, 4 × SSC, bei 42°C.
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Beispiele
solcher nicht stringenten Hybridisierungsbedingungen sind eine Hybridisierung
in 4 × SSC bei
50°C oder
eine Hybridisierung mit 30 bis 40% Formamid bei 42°C.
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Genauso
codieren auch DNA-Sequenzen, die IL-3-ähnliche Primaten-Polypeptide
codieren, welche durch die Sequenz von Tabelle I oder II codiert
werden, die sich jedoch auf Grund der Degeneration des genetischen
Codes oder auf Grund von Allel-Variationen in der Codon-Sequenz
unterscheiden (in der Natur vorkommende Basenänderungen in der Artenpopulation,
die zu einer oder keiner Aminosäureänderung
führen können), die
neuen Wachstumsfaktoren dieser Familie, die hier beschrieben wird.
Auch Variationen der DNA-Sequenzen der Tabellen I und II, die durch
Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen verursacht
werden, um die Aktivität,
Halbwertszeit oder Produktion der dadurch codierten Polypeptide
zu steigern, sind in der Erfindung eingeschlossen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein neues Verfahren
zur Herstellung der neuen Familie von IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktoren
von Primaten bereit. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst
die Züchtung
einer geeigneten Zelle oder Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz,
welche bei Expression ein neues IL-3-ähnliches Primat-Polypeptid
codiert, unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen
transformiert worden ist. Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugerzellen,
wie z.B. Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder 3T3-Zellen
sein. Die Auswahl geeigneter Säuger-Wirtszellen
und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifikation, zum
Absuchen und zur Produktion und Reinigung des Produktes sind dem
Fachmann bekannt, siehe Gething und Sambrook, Nature 293 (1981),
620–625,
oder alternativ, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (7) (1985),
1750–1759,
oder Howley et al., US-Patent 4,419,446. Eine andere geeignete Säuger-Zelllinie,
die in den beigefügten
Beispielen beschrieben wird, ist die Affen-COS-1-Zelllinie. Eine ähnlich nützliche
Säuger-Zelllinie
ist die CV-1-Zelllinie.
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Als
Wirtszellen für
die vorliegende Erfindung sind auch Bakterienzellen ähnlich nützlich.
Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101,
MC1061 und die in den folgenden Beispielen verwendeten Stämme) auf
dem Fachgebiet der Biotechnologie als Wirtszellen bekannt. Außerdem können in
diesem Verfahren verschiedene Stämme
von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bakterien und dergleichen
eingesetzt werden.
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Ferner
sind viele Stämme
von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, als Wirtszellen für die Expression
der erfindungsgemäßen Polypeptide
verfügbar.
Außerdem
können
im erfindungsgemäßen Verfahren gewünschtenfalls
Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden, siehe z.B. Miller
et al., Genetic Engineering 8 (Plenum Press 1986), 277–298, und
die darin zitierten Dokumente.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Vektoren für die Verwendung
im Verfahren zur Expression dieser neuen Primaten-Polypeptide bereit.
Diese Vektoren enthalten die vorstehend beschriebenen neuen DNA-Sequenzen,
welche die erfindungsgemäßen neuen
Primaten-Polypeptide codieren. Andere Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfassen auch Vektoren, die die vorstehend beschriebenen modifizierten
Sequenzen enthalten; sie sind zur Herstellung dieser IL-3-ähnlichen
Polypeptide nützlich.
Der in dem Verfahren eingesetzte Vektor umfasst auch ausgewählte regulatorische
Sequenzen, die mit den erfindungsgemäßen codierenden DNA-Sequenzen
funktionell verbunden sind und befähigt sind, die Replikation und
Expression dieser Sequenzen in den gewählten Wirtszellen zu steuern.
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Die
Mitglieder der neuen Familie von IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktoren
von Primaten, die hier beschrieben werden, können für die Behandlung einer Anzahl
von Leiden oder Krankheitszuständen
eingesetzt werden, insbesondere solcher Krankheiten, die durch einen
verminderten Spiegel von Myelocyten-, Erythrocyten-, Lymphocyten-artigen
oder Megakaryocyt-Zellen des hämatopoetischen
Systems oder einer Kombination daraus gekennzeichnet sind. Außerdem können sie
dazu verwendet werden, reife Myelocyten- und/oder Lymphocyten-artige
Zellen zu aktivieren. Zu den Krankheitszuständen, die auf eine Behandlung
mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung ansprechen, zählt die
Leukopenie, eine Verminderung der Zahl der zirkulierenden Leukocyten
(weißen
Blutkörperchen)
im peripheren Blut. Eine Leukopenie kann durch Kontakt mit bestimmten
Viren oder durch Bestrahlung ausgelöst werden. Sie tritt häufig als
Nebenwirkung bei verschiedenen Formen der Krebstherapie, z.B. bei
einer Behandlung mit Chemotherapeutika, auf. Eine therapeutische Behandlung
der Leukopenie mit diesen IL-3-ähnlichen
Polypeptid-Zusammensetzungen
kann die unerwünschten
Nebenwirkungen verhindern, die durch die Behandlung mit den zur
Zeit verfügbaren
Arzneistoffen ausgelöst
werden.
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Auch
verschiedene Immunmangelzustände,
z.B. der T- und/oder B-Lymphocyten, oder Immunleiden, z.B. rheumatoide
Arthritis, können
von einer Behandlung mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung
profitieren. Diese Faktoren, alleine oder in Kombination mit anderen
Behandlungsschemata, können
für die
Behandlung oder Besserung von Immunmangelzuständen nützlich sein, die in Folge von
Virusinfektionen, z.B. HTLVI, HTLVII, HIV, einer starken Strahlenexposition,
einer Krebstherapie oder einer anderen medizinischen Behandlung
auftreten. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch,
alleine oder in Kombination mit anderen Hämatopoetinen, für die Behandlung
anderer Blutzellen-Mangelzustände
verwendet werden, einschließlich
Thrombocytopenie (Mangel an Blutplättchen) oder Anämie (Mangel
an roten Blutkörperchen).
Andere Anwendungsmöglichkeiten
für diese
neuen Polypeptide bestehen in der Behandlung von Patienten, die sich
von Knochenmarktransplantationen erholen, und in der Entwicklung
von monoclonalen und polyclonalen Antikörpern, erzeugt nach Standardverfahren
für den
diagnostischen oder therapeutischen Einsatz.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung sind somit Arzneimittel, die ein oder
mehrere erfindungsgemäße Polypeptide
oder Proteine unter Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen
Trägers
umfassen. Die Polypeptide oder Proteine können außerdem zur Herstellung eines
Arzneimittels für
die Behandlung der vorstehend beschriebenen Leiden verwendet werden.
Solche Mittel umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines oder
mehrerer Mitglieder der Familie von IL-3-ähnlichen Primat-Polypeptiden
der vorliegenden Erfindung unter Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen
Trägers.
Dieses Mittel kann systemisch parenteral verabreicht werden. Alternativ
kann das Mittel intravenös
verabreicht werden. Gewünschtenfalls
kann das Mittel subkutan verabreicht werden. Wenn das Arzneimittel
systemisch verabreicht wird, liegt es in der erfindungsgemäßen Verwendung
in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung vor. Der Fachmann kann eine
solche pharmazeutisch verträgliche
Proteinlösung
herstellen, wobei auf den pH-Wert, die Isotonie, die Stabilität und dergleichen
geachtet werden muss.
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Das
Dosierungsschema für
die Behandlung der vorstehend beschriebenen Leiden kann vom behandelnden
Arzt festgelegt werden, wobei verschiedene Faktoren beachtet werden
müssen,
welche die Wirkung von Arzneistoffen beeinflussen, wie z.B. der
Krankheitszustand, das Körpergewicht,
das Geschlecht, die Ernährung
des Patienten, die Schwere der jeweiligen Infektion, die Zeit der
Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte
die tägliche
Dosis im Bereich von 200 bis 1000 μg Polypeptid oder 50 bis 5.000 Einheiten
Polypeptid pro kg Körpergewicht
liegen (d.h., wobei eine Einheit die Konzentration des Polypeptids ist,
die in einem menschlichen Knochenmark-Standardtest zur Hälfte der
maximalen Stimulation führt).
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Die
Arzneimittel der vorliegenden Erfindung können auch andere menschliche
Faktoren enthalten. Eine nicht ausschließliche Liste anderer geeigneter
Hämatopoetine,
CSFs und Interleukine für
die gleichzeitige oder abwechselnde Verabreichung zusammen mit den
Polypeptiden der vorliegenden Erfindung umfasst GM-CSF, CSF-I, G-CSF,
Meg-CSF, Erythropoetin (EPO), IL-1, IL-4, IL-2, B-Zellen-Wachstumsfaktor,
B-Zellen-Differenzierungsfaktor und Eosinophilen-Differenzierungsfaktor. Von besonderem
Interesse für
die Amplifikation hämatopoetischer
Stammzellen und ihrer Abkömmlinge
in vivo ist eine Kombination von IL-3 und IL-6 (dem Fachmann auch
bekannt als B-Zell-Stimulierungsfaktor-2), die in Tests mit menschlichen
Blastenzellen die Fähigkeit
zeigt, die Proliferation früher
Stammzellen-Kolonien auszulösen.
Außerdem
können
die IL-3-ähnlichen
Polypeptide in einer therapeutischen Anwendung zusammen mit monoclonalen
oder polyclonalen Antikörpern
verabreicht werden, oder sie können
chemisch daran gekoppelt werden. In einer anderen Ausführungsform
können
diese Wachstumsfaktoren in einem therapeutischen Dosierungsschema
an bestimmte Toxine, z.B. Ricin, angehängt werden. Die vorstehend
angegebene Dosierung muss dann entsprechend angepasst werden, um
solche weiteren Komponenten im Arzneimittel auszugleichen. Der Krankheitsverlauf
des behandelten Patienten kann durch regelmäßige Kontrolle des Blutbildes,
d.h. Zählung
der weißen
Blutkörperchen und
dergleichen, überwacht
werden.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben zur Erläuterung die Mitglieder der
neuen Familie von IL-3-ähnlichen
Polypeptiden von Primaten und die Verfahren der vorliegenden Erfindung.
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BEISPIEL I
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Isolierung des IL-3-ähnlichen
Gibbon-Gens
-
Eine
Gibbon-T-Zelllinie, infiziert mit dem Gibbon-Affenleukämievirus,
UCD-144-MLA, die vom National Institute of Health Laboratories verfügbar ist,
wurde mit Phytohämagglutinin
und Phorbolmyristatacetat (PHA/PMA) induziert. Die Gesamt-RNA wurde
aus diesen Zellen nach Verfahren von J. M. Chirgwin et al., Biochem.
18 (1979), 5294, präpariert.
Poly-A+-mRNA wurde selektiert und auf einem
10 bis 30% Saccharosegradienten fraktioniert. Zur Identifizierung
der mRNA, die diesen neuen hämatopoetischen
Faktor codiert, wurden 16 Aliquots der auf dem Saccharosegradienten
fraktionierten mRNA aus der UCD-144-MLA-Zelllinie in Oocyten von
Xenopus laevis mikroinjiziert und sodann das resultierende konditionierte
Medium auf die Fähigkeit
getestet, die Proliferation von Leukämie-Stammzellen in Gegenwart von Antikörpern gegen
GM-CSF zu stimulieren, wie im CML-Test von Beispiel V erläutert. Die
mRNA aus den Fraktionen des Saccharosegradienten, die, wie nachgewiesen
wurde, die Information zur Codierung der IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktor-Aktivität enthielt,
wurde nach dem Verfahren von U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene 25
(1983), 263, in doppelsträngige cDNA
umgewandelt.
-
Ein
COS-Zellen-Expressionsvektor, pXM, enthaltend den SV40-Enhancer,
den Haupt-Adenovirus-späten-Promotor,
die DHFR-codierende Sequenz, die SV40-späte-Message-PolyA-Additionsstelle
und das Val-Gen, wurde mit dem Endonuclease-Enzym XhoI linearisiert,
mit dem großen
Fragment der DNA-Polymerase-I
in Gegenwart von dTTP behandelt und an äquimolare Mengen cDNA ligiert,
bei einer DNA-Endkonzentration von 100 μg/ml. Die Ligierungsprodukte,
die durch die XhoI-Spaltung von pXM und die Insertion der mit XhoI
behandelten cDNA-Sequenz erhalten wurden, wurden in E. coli Stamm
HB101 transformiert und dieser auf L+ Amp-Platten plattiert, wodurch
eine Genbank mit etwa 30 × 103 Kolonien erzeugt wurde. [In diesem Verahren
können
anstelle von pXM auch andere, funktionell ähnliche Expressionsvektoren
verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind.]
-
Die
cDNA-Genbank in pXM wurde mit Replika-Filter-Technik auf Nitrocellulosefilter
plattiert. Von jedem Filter wurden die Kolonien in L-Brühe abgeschabt
und die Plasmid-DNA isoliert. Jede DNA-Probe wurde aus einem Pool
von 200 bis 300 Bakterienkolonien hergestellt. Die DNA wurde nach
dem Verfahren von J. A. Meyers et al., J. Bacteriol. 127 (1976),
1529, gereinigt. Affen-COS-Zellen (ATCC CRL 1650) wurden mit etwa
5 μg Plasmid-DNA
pro 106 CM-Zellen durch DEM-vermittelte
DNA-Transfektion infiziert und mit Chloroquin versetzt, wobei die
Verfahren verwendet wurden, die in G. G. Wong et al., Science 228
(1985), 810–815,
und R. J. Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 2 (1982), 1304, beschrieben
werden.
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72
Stunden nach der Transfektion wurde das Medium geerntet und im menschlichen
CML-Test getestet, wie im nachstehenden Beispiel V beschrieben.
Ein Pool erzeugte konditioniertes Medium mit Koloniestimulierungsfaktor-Aktivität, die gegenüber neutralisierendem
Antiserum gegen GM-CSF vollständig
resistent war, dieser Pool wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Plasmid-DNA
aus einzelnen Kolonien, die aus dem ursprünglichen aktiven Pool herausgegriffen
wurden, wurde präpariert
und transfiziert, um konditioniertes Medium zu erzeugen. Dieses
konditionierte Medium wurde auf CSF- und CML-Proliferations-Aktivität getestet. Ein
einzelner Clon, der für
eine solche Aktivität
verantwortlich war, wurde isoliert. Die cDNA-Insertion dieses Clons
wurde in M13 subcloniert und nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren
von Sanger sequenziert [Siehe Tabelle I].
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BEISPIEL II
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Isolierung eines menschlichen
IL-3-ähnlichen
Gens
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Unter
Verwendung der Sequenz von Tabelle I als Sonde wurden 1 × 106 Clone aus einer menschlichen Genbank (menschliche
DNA, partiell gespalten mit Sau3AI, cloniert in die BamHI-Stelle
des Lambda-Vektors J1) [J. J. Toole et al., a.a.O.] abgesucht. Drei
Plaques wurden identifiziert, die Sequenzen enthielten, welche mit
der cDNA-Sonde stark hybridisierten. Die DNAs aus zwei dieser Phagen
wurden mit dem Endonuclease-Enzym Sau3AI vollständig gespalten und in die BamHI-Stelle
des Bakteriophagen Lambda M13 Clonierungsvektor mp9 subcloniert.
Subclone, die Exonsequenzen enthielten, wurden durch Hybridisierung
mit der Gibbon-cDNA identifiziert. Ein Subclon, Lambda-CSF-16, der
die menschliche genomische DNA-Sequenz als etwa 10 kB-große BglII-Insertion
enthielt, wurde bei der ATCC hinterlegt, wie vorstehend beschrieben.
Die vollständigen
Sequenzen aller Exons des menschlichen Gens wurden bestimmt, wobei
die Didesoxy-Kettenabbruch-DNA-Sequenzierung mit einer Reihe von
Oligonucleotid-Primern verwendet wurde, deren Sequenzen auf der
Sequenz des in Beispiel I beschriebenen Gibbon-Gens beruhten. Da
die Nucleotidsequenzen der Exons des menschlichen Gens mit der Sequenz
der Gibbon-cDNA zu mehr als 96% homolog waren, wurde die Nucleotidsequenz
der entsprechenden menschlichen cDNA rekonstruiert. Abweichungen
der Nucleotidsequenzen in 11 Codons führen zu den unterschiedlichen
Aminosäuren
in den Polypeptiden aus den zwei Arten [siehe Tabelle II].
-
Die
menschliche genomische Sequenz kann aus dem Lambda-CSF-16 ausgeschnitten
und in einen Expressionsvektor eingefügt werden, dem Fachmann sind
zahlreiche Typen solcher Expressionsvektoren für eine Säuger-, Insekten-, Hefe-, Pilz-,
und bakterielle Expression bekannt. Z.B. wurde die menschliche genomische
Sequenz aus dem hinterlegten Bakteriophagen durch Spaltung mit den
Endonucleasen SmaI und XhoI ausgeschnitten, wodurch die menschliche
Genregion an den Nucleotiden 629 bzw. 3183 gespalten wird. Der resultierende
2,5 kB-große
Abschnitt enthält
die codierenden Sequenzen für
das gesamte menschliche IL-3-Gen und umfasst die "TATAA-betreffende" Sequenz in der Promotorregion,
ihm fehlen jedoch die "CAT-betreffenden" Sequenzen und das
Polyadenylierungssignal am 3'-Ende
des Gens. Das SmaI-Ende dieses Fragmentes wurde mit einer im Handel
erhältlichen
Linkersequenz zu XhoI umgewandelt. Dieses Fragment wurde nach Standardtechniken
der Molekularbiologie [siehe z.B. Y.-C. Yang et al., Cell 47 (1986),
3–10]
in einen mit XhoI gespaltenen Plasmid-Expressionsvektor, pXM, subcloniert,
wodurch Plasmid pY3 erhalten wurde.
-
Anschließend wurde
pY3 in Bakterien amplifiziert und in Affen-COS-1-Zellen transfiziert,
wo das menschliche Gen transkribiert und die RNA gespleißt wird.
Medien von den transfizierten Zellen sind in Tests auf die IL-3-ähnliche
biologische Aktivität
im menschlichen Knochenmark-Test und im CML-Test, wie nachstehend
beschrieben, positiv. Die Northern-Blot-Analyse mit einer Gibbon-cDNA-Sonde
zeigt das Vorliegen einer einzigen 1 kB-großen mRNA, die aus diesen Zellen
erhalten wird, sie hat die gleiche Größe wie RNA, die aus peripheren
Blutlymphocyten erhalten wurde, wie nachstehend beschrieben. Die
cDNA wird aus der mRNA nach Standardverfahren synthetisiert und
ein Clan identifiziert, der CML-Aktivität besitzt. Hieraus wird die cDNA
für einen
neuen IL-3-ähnlichen
Wachstumsfaktor isoliert.
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BEISPIEL III
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Ein menschlicher IL-3-ähnlicher
Wachstumsfaktor
-
Die
cDNA-Sequenz von Tabelle II, die ein menschliches IL-3-ähnliches
Polypeptid codiert, kann auch auf andere Art, als in Beispiel II
beschrieben, erhalten werden. Zum Beispiel kann die Sequenz von
Tabelle II nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, chemisch
synthetisiert werden. Ein solches chemisches Syntheseverfahren für die Bereitstellung
der menschlichen IL-3-codierenden Sequenz umfasst die Rekonstruktion
des Gibbon-IL-3-Gens. Die erste Aminosäureabweichung zwischen den
reifen Formen des Gibbon- und des menschlichen IL-3-Proteins liegt
bei Aminosäure
82 vor. Die codierende Sequenz von Aminosäure 82 im Gibbon-IL-3-Gen bis
zum 3'-Ende des
Gens kann durch chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ersetzt werden,
die menschliches IL-3 codieren, hierdurch wird ein funktionelles
Gen erhalten, das befähigt
ist, in einem geeigneten Expressionssystem menschliches IL-3 zu
produzieren.
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Für die Clonierung
synthetischer DNA-Abschnitte können
zwei einmalig vorliegende Restriktionsstellen in der Gibbon-Sequenz
verwendet werden: eine AsuII-Stelle bei Aminosäure 73 und eine EcoRI-Stelle
bei Aminosäure
125. Eine DNA-"Kassette" für die Insertion
in das Gibbon-Gen von der AsuII-Stelle bis zur EcoRI-Stelle wurde
synthetisiert, indem ein DNA-Doppelstrang mit etwa 160 Bp aus zwei
Oligoncleotiden enzymatisch bereitgestellt wurde, die über eine
Länge von 21
Basenpaaren zueinander komplementär sind. Der vollständige Doppelstrang
wurde hergestellt, indem der komplementäre Bereich unter Verwendung
von Desoxynuceosid-Triphosphaten und DNA-Polymerase-I, Klenow-Fragment,
bis zu den Enden der Oligonuoleotide aufgefüllt wurde. Der vollständige Doppelstrang
wurde mit AsuII und/oder EcoRI gespalten, um kohäsive Enden für die ausschließende Clonierung
zu erhalten.
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Eine
zweite synthetische DNA-"Kassette" besteht aus zwei
Oligonucleotiden, die auf ganzer Länge zueinander komplementär sind,
von der EcoRI-Stelle bei Aminosäure
125 bis einschließlich
zum Terminations-Codon hinter Aminosäure 152 am Ende des Gens. Diese
Oligos wurden so entworfen, dass sie ein kohäsives EcoRI-Ende und geeignete
Restriktionsstellen oder kohäsive
Enden am oder direkt hinter dem Terminations-Codon für die Clonierung
in verschiedene Expressionsvektoren enthalten.
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Zwei
Sätze dieser
Kassetten wurden synthetisiert, ein Satz für die Säuger-Expression, der andere für die bakterielle
Expression, auf Grund der unterschiedlichen Codon-Verwendung bei
Prokaryonten und bei Eukaryonten, der niedrigen Inzidenz von CpG-Doppelstücken in
eukaryontischen Genen oder der Beibehaltung oder dem Bedarf an verschiedenen
Restriktionsstellen für
die Clonierung. Solche Bevorzugung bestimmter Codons sind dem Fachmann
bekannt, siehe z.B. T. Maruyama et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986),
r151. Beispiele solcher Codon-Änderungen
und kohäsiver
Enden, die für
diese Kassetten synthetisiert wurden, werden in der nachstehenden
Tabelle III gezeigt. Anschließend
werden die Kassetten in den Vektor pCSF-MLA cloniert, um ihn zu
einem Vektor zu transformieren, der das den menschlichen n-3-ähnlichen
Faktor codierende Gen trägt.
Dieser resultierende Vektor wird dann für die Expression des menschlichen
Faktors verwendet.
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TABELLE
III I.
CODON-ÄNDERUNGEN
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TABELLE
III (Fortsetzung) II.
KASSETTEN-TERMINI
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In
einer anderen Ausführungsform
kann die cDNA-Sequenz eines menschlichen IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktor erhalten
werden, indem die cDNA aus einer Gewebequelle cloniert wird. Die
Gibbon-cDNA-Sequenz von Tabelle I wurde als Sonde gemäß T. Maniatis
et al., a.a.O., eingesetzt, und mit ihrer Hilfe wurden periphere
Blut-Lymphocyten als menschliche Quelle für die Isolierung von mRNA identifiziert,
die dieses menschliche IL-3-ähnliche
Polypeptid codiert. Die PolyA+-RNA wird
aus der Quelle der peripheren Blut-Lymphocyten hergestellt, zu cDNA
umgewandelt und entweder als Phagen- oder als Plasmid-cDNA-Genbank
cloniert. Ein menschlicher cDNA-Clon kann durch Hybridisierung mit
den codierenden Gibbon-Sequenzen von Tabelle I als DNA-Sonde und
durch Bestimmung der IL-3-ähnlichen
biologischen Eigenschaften identifiziert werden.
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Weitere
Gewebequellen, die auch nach menschlicher IL-3-ähnlicher cDNA abgesucht werden
können, umfassen
Milz, Leber, Thymus, Tonsillen, Niere und andere frische Gewebe,
die aus Biopsien und Leichen erhalten werden können. Von besonderem Interesse
sind Fälle,
bei denen möglicherweise
ein Tumor für
eine erhöhte
Zahl hämatopoetischer
Zellen verantwortlich ist, z.B. bei Leukämie. Weitere Quellen sind Zelllinien,
die für
die allgemeine Verwendung in Hinterlegungsstellen, z.B. ATCC, hinterlegt
wurden oder die über
staatliche Stellen oder bestimmte private Quellen erhältlich sind.
Zelllinien umfassen z.B. transformierte T- und B-Zelllinien und
Zelllinien, die nicht hämatopoetischen
Ursprungs sind, die aber Hämatopöetine erzeugen.
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Um
dieses menschliche IL-3-ähnliche
Polypeptid zu exprimieren, wird die dieses Polypeptid codierende
cDNA in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. pCD oder pXM, transfiziert
und in ausgewählte
Wirtszellen eingeführt,
wobei herkömmliche
Techniken der Gentechnik eingesetzt werden, wie vorstehend beschrieben.
Ein Säuger-Expressionssystem,
das für
die Produktion eines biologisch aktiven rekombinanten menschlichen
IL-3-ähnlichen
Polypeptids geeignet ist, besteht aus stabil transformierten CHO-Zellen.
Jedoch kann ein aktives Polypeptid auch intrazellulär oder extrazellulär aus E.
coli und anderen Bakterien produziert werden. Auch Hefe- oder Insektenzellen
können
als Expressionssysteme eingesetzt werden, wie in Beispiel IV beschrieben.
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Ein
anderes Verfahren für
die Expression dieses menschlichen IL-3-ähnlichen Polypeptids stellt
die Verwendung des BglII-Fragmentes aus Lambda-CSF-16 dar, das das
vollständige
menschliche genomische Gen enthält,
um Säugerzelllinien
zu konstruieren, die das Polypeptid exprimieren, wie z.B. von PCT WO85/20610
für menschliches
Erythropoetin beschrieben. Außerdem
kann dieses menschliche genomische Gen mit dem geeigneten Promotor
und geeigneten Prozessierungs-Signalen
gentechnisch so präpariert
werden, dass es in einem anderen heterologen System exprimiert werden
kann, z.B. mit Insekten-Promotoren für die Konstruktion von Insektenzellkulturlinien.
Auf ähnliche
Weise kann dieses genomische Gen in Hefe- oder anderen eykaryontischen
Systemen exprimiert werden.
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BEISPIEL IV
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Expression IL-3-ähnlicher
Wachstumsfaktoren
-
Ein
Plasmid, pCSF-MLA, wird einfach konstruiert, indem die Gibbon-Sequenz
von Tabelle I in mit XhoI gespaltenes pXM eingefügt wird, wie vorstehend beschrieben.
Ein Plasmid mit der menschlichen Sequenz, pSHIL-3-1, wird für die Säuger-Ex pression
synthetisch konstruiert, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben. Ein
weiteres Plasmid, pY3, wird hergestellt, wie vorstehend beschrieben.
Anschließend
wird jedes dieser Plasmide, die einen IL-3-ähnlichen Primat-Wachstumsfaktor
tragen, nach herkömmlichen
Techniken für
die Expression eines Polypeptids in eine ausgewählte Wirtszelle transformiert.
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A. Expression in Säugerzellen:
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Um
die Expression der IL-3-ähnlichen
Faktoren für
die Verwendung in den nachstehend beschriebenen Tests zu erhalten,
werden pSHIL-3-1 und pCSF-MLA in COS-Zellen transformiert. Das konditionierte
Medium der transfizierten COS-Zellen
enthielt hohe Werte an Wachstumsfaktor-Aktivität, wie beschrieben.
-
Die
hier beschriebenen Säugerzell-Expressionsvektoren
können
durch Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Komponenten der Vektoren, z.B. Replicons, Selektionsgene, Enhancer,
Promotoren und dergleichen, können
aus natürlichen
Quellen erhalten werden oder nach bekannten Verfahren synthetisiert
werden, siehe Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159 (1982), 511–521, und
Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689–693. Säuger-Wirtszellen
umfassen z.B. insbesondere Primaten-Zelllinien und Nager-Zelllinien,
einschließlich
transformierte Zelllinien. Auch geeignet sind normale diploide Zellen,
Zellstämme,
die von einer in vitro-Kultur primärer Gewebe stammen, außerdem primäre Explantate.
Den zur Auswahl stehenden Zellen muss im Genotyp das Selektionsgen
nicht unbedingt fehlen, solange das Selektionsgen dominant ist.
Für einen
stabilen Einbau der Vektor-DNA und für die anschließende Amplifikation
der eingebauten Vektor-DNA, beides nach herkömmlichen Verfahren, können CHO-Zellen verwendet
werden. In einer anderen Ausführungsform
kann die Vektor-DNA das gesamte Rinderpapillomavirus-Genom oder
einen Teil davon umfassen (Lusky et al., Cell 36 (1984), 391–401] und
in Zelllinien, wie z.B. C127-Mauszellen, als stabiles episomales
Element enthalten sein. Andere geeignete Säugerzelllinie umfassen, sind
aber nicht beschränkt auf,
HeLa-, COS-1-Affenzellen, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, hergeleitet von
Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen,
BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien.
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Stabile
Transformanten werden sodann auf eine Expression des Produktes abgesucht,
wobei herkömmliche
immunologische oder enzymatische Tests verwendet werden. Das Vorliegen
der DNA, welche die Proteinvarianten codiert, kann durch Standardverfahren,
wie z.B. Southern-Blotting, nachgewiesen werden. Eine transiente
Expression der die Varianten codierenden DNA während mehrerer Tage nach Einführung der Expressionsvektor-DNA
in geeignete Wirtszellen, wie z.B. COS-1-Affenzellen, wird ohne
Selektion gemessen, indem die Proteine im Kulturmedium einem Aktivitätstest oder
einem immunologischen Test unterworfen werden.
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Der
Fachmann kann auch andere Säuger-Expressionsvektoren,
die mit pCSF-MLA und pSHIL-3-1 vergleichbar sind, konstruieren,
indem er z.B. die DNA-Sequenz von Tabelle I oder Tabelle II aus
den entsprechenden Plasmiden mit XhoI ausschneidet und bekannte
Techniken der rekombinanten Gentechnik sowie andere Vektoren, wie
z.B. pJL3 und pJL4 [Gough et al., EMBO J. 4 (1985), 645–653] und
pMT2 (beginnend mit pMT2-VWF, ATCC #67122; siehe EP-A-0 253 870),
einsetzt. Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen
kann zur Expression der IL-3-ähnlichen
Wachstumsfaktoren führen.
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B. Bakterielle Expressionssysteme:
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In ähnlicher
Art und Weise kann der Fachmann die Sequenzen der Tabellen I und
II behandeln, indem er regulatorische Säuger-Sequenzen, die die codierenden
Sequenzen flankieren, entfernt oder durch bakterielle Sequenzen
ersetzt, wodurch bakterielle Vektoren für eine intrazelluläre oder
extrazelluläre
Expression der erfindungsgemäßen IL-3-ähnlichen
Faktoren durch bakterielle Zellen hergestellt werden. Die den Faktor
codierende DNA kann ferner wie in Beispiel III modifiziert werden,
so dass sie verschiedene Codons für die bakterielle Expression
enthält,
wie dem Fachmann bekannt ist. Vorzugsweise ist die Sequenz funktionell
mit einer Nucleotidsequenz im Raster verknüpft, welche ein sekretorisches
Leader-Polypeptid codiert, das eine bakterielle Expression, Sekretion
und Prozessierung der reifen Proteinvariante ermöglicht, wie auch dem Fachmann bekannt
ist. Die in den bakteriellen Wirtszellen exprimierten Verbindungen
können
sodann gewonnen, gereinigt und/oder hinsichtlich physikalisch-chemischer,
biochemischer und/oder klinischer Parameter charakterisiert werden,
dies sind alles bekannte Verfahren.
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Um
einen solchen bakteriellen Vektor für die bakterielle Expression
zu konstruieren, wurde eine zum Teil synthetische menschliche IL-3-ähnliche
DNA-Sequenz aus der Gibbon-cDNA und den in Beispiel III beschriebenen
synthetischen bakteriellen Kassetten konstruiert. Diese Sequenz
wurde in einen mit NdeI/XbaI gespaltenen Vektor, pal181, eingefügt, der
bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 40134 hinterlegt ist. Der
resultierende Vektor, pPLHIL-3-181, wurde in E. coli GL400 transfiziert
und gemäß den Bedingungen
gezüchtet,
die für
GMCSF in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung 86/00639 beschrieben werden.
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Der
IL-3-ähnliche
Faktor wird in E. coli in unlöslichen
Einschlusskörpern
produziert. Anschließend
wird das folgende Verfahren zur Solubilisierung und zum Erhalt des
Proteins durchgeführt.
Etwa 50 g Zellen als gefrorene Paste werden in 120 ml 50 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF] und 2 mM Dithiothreit
[DTT] (Puffer A) resuspendiert. Die Zellen werden mittels Passage
durch eine French-Presse oder eine Manton-Gaulin-Ventil bei 10.000
psi oder mehr aufgeschlossen. Diese aufgeschlossenen Zellen werden
sodann 30 Minuten bei 20.000 × g
zentrifugiert, wodurch die Zelltrümmer als Pellet erhalten werden,
welches die Einschlusskörper
enthält.
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Das
Pellet wird in 55% Saccharose in Puffer A mittels Passage durch
die French-Press
resuspendiert und erneut 30 Minuten bei 30.000 × g zentrifugiert. Das Pellet,
das die Einschlusskörper
mit dem IL-3-ähnlichen
Faktor enthält,
wird in 55% Saccharose in Puffer A resuspendiert und auf einen Stufengradienten
von 60, 65 und 70% Saccharose aufgetragen. Der Gradient wird zwei
Stunden bei 150.000 × g
zentrifugiert. Die Einschlusskörper
mit dem IL-3-ähnlichen
Faktor sedimentieren in der 65% Schicht, die sodann gesammelt wird.
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Um
den nun zu etwa 80% reinen IL-3-ähnlichen
Faktor zu rekonstituieren und neu zu falten, werden diese Einschlusskörper mit
2 bis 3 mg Protein pro ml in 8 M Harnstoff resuspendiert. Die das
Protein enthaltende Harnstofflösung
wird mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM PMSF, 2 mM DTT und 0,1 mM
Ethylendiamintetraessigsäure
[EDTA] (Puffer B) auf eine Endkonzentration von 3 M Harnstoff verdünnt (wobei
die IL-3-Konzentration etwa 1 μg/ml
beträgt).
Ein Reduktions/Oxidations-Puffer, der 6 mM reduziertes Glutathion
und 0,6 mM oxidiertes Glutathion enthält, wird zu der Harnstofflösung zugegeben
und zwei Stunden bei 20°C
inkubiert. Die 3-M-Harnstofflösung
wird über
Nacht gegen Puffer B dialysiert, um den Harnstoff zu entfernen.
Die IL-3-Protein-Lösung
wird sodann zentrifugiert, um jegliche Ausfällung zu entfernen. In diesem
Stadium ist der IL-3-ähnliche
Faktor wieder gefaltet und zu etwa 85% rein.
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Der
wieder gefaltete IL-3-ähnliche
Faktor wird gegen 50 mM MES-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,1 mM EDTA,
dialysiert und auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sepharose®-Säule aufgetragen.
Der IL-3-ähnliche
Faktor befindet sich im Durchfluss der DEAE-Säule mit einer Reinheit von
etwa 99%. Bei diesem Schritt werden auch eventuell vorhandene Pyrogene
entfernt. Der pH-Wert des IL-3 aus dem DEAE-Durchfluss wird mit
200 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,0, auf 5,0 eingestellt. Der IL-3-ähnliche
Faktor wird auf eine Sulfonylpropyl-Sepharose®-Säule aufgetragen,
wobei der IL-3-ähnliche
Faktor an die SP-Sepharose® bindet, und mit dem Natriumacetat
enthaltenden Puffer eluiert. In diesem Stadium ist der IL-3-ähnliche
Faktor rein und wieder korrekt gefaltet. Im CML-Test hat dieser
menschliche IL-3-ähnliche
Faktor eine spezifische Aktivität
zwischen 1 und 3 × 107 CML Einheiten pro mg.
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In ähnlicher
Art und Weise kann die codierende Sequenz von Tabelle I oder die
von Tabelle II aus pCSF-MLA oder pSHIL-3-1 mit XhoI ausgeschnitten
und weiter behandelt werden (z.B. an andere bekannte Linker ligiert
oder durch Deletion nicht codierender Sequenzen oder Änderung
darin enthaltener Nucleotide modifiziert werden, wobei andere bekannte
Techniken eingesetzt werden). Die modifizierte IL-3-ähnliche
codierende Sequenz kann sodann in einen bekannten bakteriellen Vektor
eingefügt
werden, wobei Verfahren verwendet werden, die in T. Taniguchi et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 5230–5233, beschrieben werden.
Dieser als Beispiel angegebene bakterielle Vektor kann anschließend in
bakterielle Wirtszellen transformiert werden, die sodann den IL-3-ähnlichen
Faktor exprimieren. Vorschriften zur Herstellung IL-3-ähnlicher Faktoren
mittels extrazellulärer
Expression in Bakterienzellen finden sich z.B. in der Europäischen Patentanmeldung
EPA 177 343.
-
C. Expression in Insektenzellen:
-
Die
Konstruktion eines Insektenvektors für die Expression in Insektenzellen
kann mit Hilfe ähnlicher Behandlungen
erzielt werden [siehe, z.B., Verfahren, die in der veröffentlichten
Europäischen
Patentanmeldung 155 476 beschrieben werden]. Ferner kann auch ein
Hefevektor unter Einsatz regulatorischer Hefesequenzen konstruiert
werden, wobei eine intrazelluläre
oder extrazelluläre
Expression der erfindungsgemäßen Proteine
durch Hefezellen erreicht wird [siehe, z.B., Verfahren, die in der
veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 86 00639 und der Europäischen Patentanmeldung
EP 123 289 beschrieben werden].
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BEISPIEL V
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Konstruktion von CHO-Zelllinien,
die große
Mengen des IL-3-ähnlichen
Primaten-Wachstumsfaktors
exprimieren
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Ein
Verfahren zur Produktion großer
Mengen der erfindungsgemäßen neuen
Primaten-Familie von IL-3-ähnlichen
Polypeptiden aus Säugerzellen
umfasst die Konstruktion von Zellen, die multiple Kopien des heterologen
IL-3-ähnlichen
Gens enthalten. Das heterologe Gen kann an einen amplifizierbaren
Marker gekoppelt sein, z.B. das Dihydrofolat-Reductase(DHFR)-Gen,
wobei Zellen, die vermehrte Genkopien enthalten, auf Grund ihres
Wachstums in erhöhten
Konzentrationen von Methotrexat (MTX) selektiert werden können, gemäß den Verfahren
von Kaufman & Sharp,
J. Mol. Biol. (1982), a.a.O. Dieses Vorgehen kann bei einer ganzen Anzahl
von verschiedenen Zelltypen eingesetzt werden.
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Zum
Beispiel enthält
pY3 ein menschliches IL-3-ähnliches
Gen in funktioneller Verknüpfung
mit anderen Plasmidsequenzen, welche die Expression dieses Gens
ermöglichen.
pY3 und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 (Kaufman & Sharp, J. Mol.
Biol. 3 (9) (1982), 1598–1608)
können
zusammen durch Calciumphosphat-Copräzipitation und Transfektion
in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, eingeführt werden. In einer anderen
Ausführungsform
kann das Gen in pMT2, wie vorstehend erwähnt, eingeführt und der resultierende Vektor
anstelle von pY3 und pAdA26SV(A)3 eingesetzt werden. DHFR-exprimierende
Transformanten werden durch Züchtung
in Alpha-Medien mit dialysiertem fetalem Kälberserum selektiert und anschließend auf
Amplifikation durch Wachstum in erhöhten MTX-Konzentrationen selektiert
(aufeinanderfolgende Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 μM MTX), wie
in Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5 (1983), 1750, beschrieben. Transformanten
werden cloniert und die Expression des biologisch aktiven IL-3-ähnlichen Polypeptids durch CML-Tests überwacht.
Die Expression des IL-3-ähnlichen
Polypeptids sollte mit steigenden Werten der MTX-Resistenz zunehmen. Ähnliche
Verfahren können
eingesetzt werden, um andere Mitglieder dieser Familie von IL-3-ähnlichen
Polypeptiden, einschließlich
die IL-3-ähnlichen
Gibbon-Polypeptide,
herzustellen.
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BEISPIEL VI
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Biologische Aktivitäten eines
IL-3-ähnlichen
Polypeptids
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Die
folgenden Tests wurden durchgeführt,
indem sowohl das Gibbon-Polypeptid als auch das menschliche Polypeptid
als repräsentative
Mitglieder der neuen Familie von IL-3-ähnlichen Primaten-Polypeptiden
der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurden. Jedoch zeigen auch
andere Mitglieder der Familie in diesen Tests oder in anderen Tests
IL-3-ähnliche
biologische Eigenschaften, abhängig
von der Zahl IL-3-ähnlicher
biologischer Eigenschaften, die das jeweilige Polypeptid besitzt.
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A. CML-Test
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Der
CML-Test wurde im Wesentlichen gemäß den Verfahren durchgeführt, die
in Blood 63 (4) (1984), 904–111,
beschrieben werden. Als Zellvorrat diente eine eingefrorene, in
einem Beutel enthaltene Menge peripheren Blutes von einem CML-Patienten
in stabiler Phase. Dieser Beutel wurde aufgetaut und in 500 Aliquots mit
jeweils 15 × 106 Zellen pro Gläschen erneut eingefroren. Diese
Zellen, "CML 8-3", wurden verwendet, um die IL-3-ähnliche
Aktivität
der IL-3-ähnlichen
Polypeptide zu testen. Ein Gläschen
wird am Tag vor dem Test bei 37°C
rasch aufgetaut. Anschließend
wird der Inhalt des Gläschens
in ein 15 ml-Röhrchen übertragen
und zweimal mit 5% Hi Human AB-Serum in RPMI (GIBCO, RPMI 1640)
[HAB/RPMI] gewaschen. Die Zellen werden über Nacht in 5% HiHAB/RPMI
bei 5% CO2 und 37°C inkubiert. Am folgenden Tag
werden die Zellen aus der Kultur entfernt, Ficoll-präpariert,
gewaschen, erneut gezählt
und aufbewahrt.
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100
gl 10-prozentiges HIFCS2/RPMI-Medium, das zu testende Material enthaltend,
werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte plattiert. Die
vorstehend präparierten
Zellen werden abzentrifugiert und mit einer Konzentration von 1,3
bis 2 × 105 Zellen/μl
erneut in 10 HIFCS/RPMI suspendiert. Sodann werden in jede Vertiefung
100 μl Zellen
plattiert und in Gegenwart oder Abwesenheit von Anti-Mensch-GM-CSF-Antikörpern bei
37°C in
5% CO2 48 oder 72 Stunden inkubiert. Danach
wird pro Vertiefung 0,5/Ci 3H-Thymidin zugesetzt und
die Vertiefungen sechs Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden
geerntet, wobei eine Filtrations-Verteiler-Apparatur mit GFC-Typ-C-Filterpapier
(Schleicher & Schüll) verwendet
wird, mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und getrocknet.
Sodann werden die Filter in Szintillationsflüssigkeit eingelegt und die 3H-Aufnahme gezählt.
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Wie
die Messung der Thymidin-Aufnahme zeigt, stimuliert in diesem Test
sowohl der IL-3-ähnliche Gibbon-Wachstumsfaktor
als auch der menschliche IL-3-ähnliche
Wachstumsfaktor aktiv die Proliferation leukämischer Stammzellen.
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B. Knochenmark-Tests
-
Menschliche
Knochenmark-Tests unter Verwendung nicht-haftender Knochenmarkzellen
wurden durchgeführt,
wie in G. G. Wong et al., a.a.O. beschrieben. Es zeigte sich, dass
sowohl die konditionierten Medien der Gibbon-Faktoren als auch die der menschlichen
Faktoren in diesem Test aktiv waren, wobei sie kleine, offensichtlich
Granulocytentyp-artige Kolonien produzierten. Bei der morphologischen
Untersuchung der gefärbten
Agarkulturen wurde deutlich, dass auch Makrophagen-, Granulocyten-Makrophagen-
und Eosinophilen-Kolonien produziert wurden. Wenn dieser Test in
Gegenwart von Erythropoetin durchgeführt wird, zeigt sich die Fähigkeit
des konditionierten Mediums, das Wachstum Erythrocyten-artiger Stammzellen
zu fördern, durch
die Produktion von Kolonien roter Blutkörperchen. Beim Vergleich des
GM-CSF mit dem IL-3-ähnlichen Polypeptid
im menschlichen Knochenmark-Test zeigte sich, dass das IL-3-ähnliche
Polypeptid die Bildung von mehr Kolonien förderte als der GM-CSF, wenn
beide Polypeptide in Gegenwart von Erythropoetin vorlagen. Der größte Teil
der durch GM-CSF geförderten
Kolonien bestand aus einer einzigen Linie, während das erfindungsgemäße Polypeptid
die Bildung von Kolonien mehrerer Linien förderte. Ein ähnliche
Ergebnis zeigte sich in Stammzellen-Koloniebildungstests, wobei
das IL-3-ähnliche
Polypeptid eine größere Anzahl
von Stammzellenkolonien mehrerer Linien produzierte. Im gleichen
Test erzeugte GM-CSF sehr wenige sekundäre Kolonien.
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C. KG-1-Zelltest
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Der
KG-1-Test wurde durchgeführt,
wie in G. G. Wong et al., a.a.O., beschrieben. Das IL-3-ähnliche Gibbon-Polypeptid,
Mitglied der neuen Familie von IL-3-ähnlichen Wachstumsfaktoren,
hergestellt gemäß der vorliegenden
Erfindung, war in diesem Test aktiv.
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D. Verschiedene Tests
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In
einem antikörperabhängigen zellvermittelten
Cytotoxizitätstest
stimulierte das erfindungsgemäße IL-3-ähnliche
Polypeptid Eosinophile, mit Antikörpern bedeckte Tumorzielzellen
in dosisabhängiger
Art und Weise abzutöten.
Das Polypeptid stimulierte außerdem
Eosinophile, Serum-opsonisierte Bäckerhefe zu phagozytieren und
die Superoxidanion-Produktion durch Eosinophile direkt zu stimulieren.
In vorläufigen
Untersuchungen, in denen erfindungsgemäße IL-3-ähnliche
Faktoren in gesunde Affen infundiert wurden und sodann die Zahl
der weißen
Blutkörperchen
bestimmt wurde, wurden reproduzierbare Zunahmen sowohl der Thrombocytenzahlen
als auch der Eosinophilenzahlen beobachtet. Diese vorläufigen Ergebnisse
wurden sowohl mit dem menschlichen IL-3-ähnlichen Faktor als auch mit
dem Gibbon-Faktor beobachtet.
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BEISPIEL VII
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Reinigung des IL-3-ähnlichen
Polypeptids aus konditioniertem Medium von COS-Zellen
-
Die
folgenden Verfahren werden zur Zeit eingesetzt, um homogenes IL-3-ähnliches
Protein aus COS-Zellen zu erhalten, wie im vorstehenden Beispiel
IV beschrieben.
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A. Ionenaustausch
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Das
konditionierte Medium von COS-Zellen [DMEM, 0,5% FBS in Rollenflaschen
mit einer Gesamtprotein-Konzentration von 200 μg/ml] enthielt das menschliche
IL-3-ähnliche
Polypeptid in einer Konzentration von etwa zwei bis drei μg/ml. Das
Medium wurde mit Wasser so lange verdünnt, bis eine Leitfähigkeit
von weniger als 8,0 ms/cm2 erhalten wurde.
Die Ionenaustauscher-Kartusche [QAE Zeta Prep®) wurde
bei 4°C
mit etwa 500 ml 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, und anschließend mit
zwei Liter 40 mM Tris-Cl, pH 7,4, äquilibriert. Das Medium wurde
mit 40 ml pro Minute aufgetragen und die ungebundene Fraktion gesammelt.
Die Kartusche wurde mit 40 mM Tris-Cl so lange gewaschen, bis keine
weitere Aktivität
mehr weggewaschen wurde. Um Mengen des IL-3-ähnlichen Proteins im Labormaßstab zu
erhalten, wurde die ungebundene Fraktion auf einer Diafiltrationseinheit-Membran
[Amicon YM-10®]
eingeengt.
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Eine
andere Möglichkeit
zur Durchführung
dieser Einengungs-Stufe für
die Reinigung eines IL-3-ähnlichen
Proteins in größerem Maßstab besteht
darin, die ungebundene Fraktion von QAE-Zeta Prep® mit
1 M Eisessig auf einen pH-Wert von 4,5 anzusäuern. Das Medium wird mit 40
ml pro Minute auf eine Sulfonylpropyl(SP)-Zeta Prep® aufgetragen,
die bei 4°C
mit etwa 500 ml 20 mM Natriumacetat, pH 4,5, äquilibriert wird. Die Kartusche
wird mit 20 mM Natriumacetat gewaschen und die gebundene Fraktion
mit 20 mM Natriumacetat und 0,25 bis 0,5 M Natriumchlorid eluiert.
Diese Fraktion wird mit 1 M Tris-Cl, pH 8,0 bis pH 7,4, neutralisiert und
mit Tween-20 bis zu einer Endkonzentration von 0,05 versetzt.
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B. Lentil-Lectin-Säule
-
Eine
Lentil-Lectin-Säule
wurde in 20 mM Tris, pH 7,4, 0,05% Tween-20, bei 4°C [Puffer
I] äquilibriert und
sodann mit 1 Säulenvolumen
pro Stunde beladen. Die Säule
wurde mit Puffer I gewaschen, um nicht-spezifisch gebundenes Protein
zu entfernen, anschließend
wurde gebundenes Protein mit Puffer I plus 0,2 M Alpha-Methylmannopyranosid
eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt.
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C. Revers-Phasen-HPLC
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Dieses
Präparat
des IL-3-ähnlichen
Polypeptids wurde einer Revers-Phasen-HPLC bei Raumtemperatur unterworfen,
wie nachstehend beschrieben. Das Präparat des IL-3-ähnlichen
Polypeptids wurde auf eine RP-HPLC-Säule [C4 Vydac] aufgetragen,
die in 100% Puffer A äquilibriert
war. Puffer A war 0,1% Trifluoressigsäure [TFA] in Wasser, Puffer
B war 0,1% TFA in 95% Acetonitril. Der Gradient erfolgte mit 0,2%
pro Minute von 45 bis 70% Puffer B. Die Fraktionen, die aus diesem
Gradienten vereinigt wurden, lagen zwischen 46,8% und 47,5% Puffer
B. Diese Fraktionen wurden zur Entfernung von Acetonitril einem
schnell angelegten verminderten Druck unterworfen. In einer zweiten
RP-HPLC-Stufe bestand Puffer A aus 0,15% HFBA in Wasser und Puffer
B aus 0,15% Heptafluorbuttersäure
[HFBA] in 95% Acetonitril. Der Gradient erfolgte mit 0,2% pro Minute von
45 bis 70% Puffer B. Die Fraktionen, die aus dieser Stufe vereinigt
wurden, lagen zwischen 49% und 51% Puffer B. Diese Fraktion, die
von der HPLC eluiert wurde, war pyrogenfrei.
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BEISPIEL VIII
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Analysen der IL-3-ähnlichen
Polypeptide
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A. SDS-PAGE
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Unter
Befolgung des Verfahrens von R. J. Kaufman und P. A. Sharp, J. Mol.
Biol. 159 (1982), 601–621, wird 35S-Methionin über Stoffwechselwege in die
Polypeptide eingebaut, die durch mit pCSF-MLA transfizierte COS-Zellen
und durch mit pY3 transfizierte COS-Zellen hergestellt werden. Eine
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (reduzierende Bedingungen) [U.
K. Laemmli, Nature 227 (1970), 680–685] der markierten Proteine, die
durch die transfizierten COS-1-Zellen ausgeschieden wurden, zeigte
sowohl für
den Gibbon-Faktor als auch für
den menschlichen Faktor eine Verteilung der Polypeptide mit offensichtlichen
Molekülmassen
im Bereich zwischen 14 und 35 kD. Diese Verteilung lag in der scheintransfizierten
Kontrollprobe nicht vor. Insbesondere zeigte der CHO-produzierte
menschliche IL-3-ähnliche
Faktor eine Verteilung zwischen 21 und 32 kD, was auf eine stärkere Glykosylierung
bei diesem Faktor hinweist als bei dem durch COS-Zellen produzierten menschlichen
Faktor, der eine Verteilung hauptsächlich zwischen 21 und 28 kD
aufweist.
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Bei
der Silberfärbung
nach den Reinigungsverfahren von Beispiel VI erschienen zwei Hauptbanden mit
durchschnittlichen Molekulargewichten von 21.000 und 25.000 bei
beiden Faktoren in etwa gleichen Mengen. Die Unterschiede der beiden
Banden werden zur Zeit den Unterschieden in der N-gekoppelten Glykosylierung
zugeschrieben.
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B. Isoelektrische Fokussierung
-
Eine
native isoelektrische Fokussierung der gereinigten Polypeptide von
Beispiel VII zeigt sowohl beim Gibbon-Polypeptid als auch beim menschlichen
Polypeptid vier Arten, deren pI-Wert im Bereich zwischen pH 6,0
und pH 7,6 liegt.
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C. Superose 6-Fast-Protein-Flüssigchromatographie
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Die
gereinigte Fraktion aus HPLC ließ man über eine Gelfiltrationssäule [Superose
6®]
in 20 mM Tris, pH 7,4, 200 mM NaCl und 0,05% Tween-20® laufen.
Dieser Säulenlauf
zeigte für
beide Faktoren einen scharfen Peak mit einem offensichtli chen Molekulargewicht
von 43 kD.
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D. Spezifische Aktivität im CML-Test
-
Die
spezifische Aktivität
eines als Beispiel dienenden IL-3-ähnlichen Gibbon-Faktors im vorstehend beschriebenen
CML-Test fällt
in den Bereich von 2 × 106 bis 1 × 107 Verdünnungseinheiten
pro mg Polypeptid, wobei der Durchschnitt 8 × 106 Verdünnungseinheiten
pro mg beträgt.
Das in Beispiel IV (B) beschriebene bakteriell hergestellte menschliche
Polypeptid zeigte in diesem Test eine spezifische Aktivität von 1
bis 3 × 107 Verdünnungseinheiten
pro mg Polypeptid. Der CHO-produzierte menschliche IL-3-ähnliche
Faktor weist in diesem Test eine spezifische Aktivität von etwa
2 bis 3 × 106 Einheiten pro mg Protein auf. Der COS-produzierte menschliche
IL-3-ähnliche
Faktor weist eine spezifische Aktivität von etwa 1 bis 2 × 107 Einheiten pro mg auf. Eine Verdünnungseinheit
(oder CML-Einheit) ist als die Verdünnung des Faktors definiert,
die im CML-Test die Hälfte
der maximalen Stimulation ergibt.
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E. Analyse des N-Terminus
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Die
Analyse der N-terminalen Sequenz des Gibbon-Polypeptids wurde mit
Hilfe eines automatisierten Edman-Abbaus durchgeführt, sie
zeigte eine Reinheit des Faktors von 98%.
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F. N-Glycanase-Behandlung
-
Der
menschliche Faktor und der Gibbon-Faktor, die in COS-Zellen produziert
wurden, wurden mit dem Enzym N-Glycanase behandelt, welches die
N-gekoppelten Kohlenhydrateinheiten
abspaltet. Es wurde gezeigt, dass beide Faktoren durch dieses Verfahren
gereinigt wurden. Bei beiden Faktoren wurde aus dem verschmierten
Fleck auf den Gelen von 14 bis 35 kD jeweils eine einzelne Bande,
die für
den Gibbon-Faktor bei 15 kD und für den menschlichen Faktor bei
20,5 kD lag.
