FI104903B - Menetelmä kädellis-IL-3-proteiinin tuottamiseksi ja proteiinia koodaava rekombinantti-DNA-sekvenssi - Google Patents

Description

104903

Menetelmä kädellis-IL-3-proteiinin tuottamiseksi ja proteiinia koodaava rekombinantti-DNA-sekvenssi

Kyseinen keksintö liittyy uuteen ryhmään kädellis-5 ten IL-3:n kaltaisia veren muodostamiseen liittyviä kasvutekijöitä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee menetelmää kädellis-IL-3-proteiinin tuottamiseksi geeniteknisten re-kombinaatiomenetelmien avulla sekä mainittua proteiinia koodaavan rekombinantti-DNA-sekvenssiä.

10 Tausta

Hematopoietiinit eli veren muodostamiseen liittyvät kasvutekijät, ovat veren muodostamiseen liittyvien tai vertamuodostavien, solujen eloonjääntiä, kasvua ja diffe-rentiaatiota edistäviä proteiineja. Pesäkkeitä stimuloivat 15 tekijät (DSF:t) ovat näiden veren muodostamiseen liittyvien kasvutekijöiden alaryhmä ja niille on tunnusomaista kyky tukea in vitro pesäkkeiden kasvua veren muodostamiseen liittyvistä soluista, jotka syntyvät luuytimen, sikiön maksan ja muiden verta muodostavien elimien kantaso-20 luista.

Tiettyjen hematopoietiinien biokemiallista ja biologista tunnistusta ja karakterisointia haittasivat ne pienet määtät luontaisesti esiintyviä tekijöitä, jotka ovat saatavissa luontaisista lähteistä, esim. verestä ja 25 virtsasta. Joitain näistä hematopoietiineistä on viime aikoina kloonattu molekyylitasolla, ilmaistu heterologi-sesti sekä puhdistettu homogeenisiksi. [D. Metcalf, "The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors", Blood 67:2 (1986) 257 - 30 267]. Näitä hematopoietiinejä ovat ihmis- ja hiiri-GM-CSF, ihmis-G-CSF, ihmis-CSF-1 ja hiiri-IL-3. Ihmis-GM-CSF [R. Donahue et ai., Nature 321 (1986) 872 - 875], hiiri-IL-3 [J. Kindler et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83 (1986) 1001 - 1005; Metcald et ai., Blood 68 (1986) 46 -35 57] ja ihmis-G-CSF [K. Welte et ai., J. Exp. Med. 165 2 104903 (1987) 941 - 948] ovat osoittaneet vaikutuksia verenmuo-dostukseen in vivo. Huolimatta laajoista, hiiren IL-3-pro-teiinia koskeneista tutkimuksista, tämän vastinetta ihmisessä ei tähän mennessä ollut löydetty [D.R. Cohen et ai., 5 Nucl. Acids. Res. 14 (1986) 3641].

Keksinnön suppea yhteenveto

Kyseinen keksintö tarjoaa menetelmän kädellisten IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden valmistamiseksi, jotka ovat oleellisesti vapaita muista kädellisproteiineista ja 10 joilla on samat tai niihin nähden oleellisesti homologiset peptidisekvenssit kuin jatkotekstissä taulukoissa I ja II esitetyt aminohapposekvenssit. Näitä kädellisproteiineja, mukaan lukien erityisesti ihmisproteiinit, kutsutaan tästä eteenpäin myös yksinkertaisesti IL-3:ksi. Näitä proteiine-15 ja koodaavat kyseisissä taulukoissa esitetyt DNA-sekvens-sit sekä niihin hybridoitumaan kykenevät sekvenssit tai sekvenssit, jotka kykenisivät hybridoitumaan niihin, ellei geneettinen koodi olisi degeneroitunut, jotka mainitut sekvenssit koodaavat IL-3:n kaltaisia biologisia ominai-20 suuksia omaavia polypeptidejä sekä muut vaihtelevin tavoin muunnetut tällaisia ominaisuuksia osoittavat sekvenssit. Näillä polypeptideillä on myös IL-3:n kaltaiset biologiset ominaisuudet.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista 25 se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa ihmispoly-peptidi, joka on oleellisesti vapaa vuorovaikutuksesta muihin ihmispolypeptideihin ja jolle on tunnusomaista pep-tidisekvenssi, joka käsittää saman tai oleellisesti saman 30 sekvenssin kuin on esitetty taulukossa II ja joka omaa ainakin yhden IL-3:n kaltaisen biologisen ominaisuuden. Toisena esimerkkinä valmistettavista polypeptideistä eräälle gibbonipolypeptidille, joka on oleellisesti vapaa vuorovaikutuksesta muihin kädellispolypeptideihin, on omi-35 naista peptidisekvenssi, joka käsittää saman tai oleelli- 3 104903 sesti saman sekvenssin kuin on esitetty taulukossa I ja joka omaa ainakin yhden IL-3:n kaltaisen biologisen ominaisuuden.

Esitetyillä polypeptideillä on kyky stimuloida 10 -5 100 pM: n pitoisuuksina useantyyppisten vertamuodostavien pesäkkeiden muodostumista erilaisista solulinjöistä tavanomaisessa ihmisen luuydinkokeessa. Muita IL-3:n kaltaisia ominaisuuksia, joita kyseisen keksinnön mukaiset proteiinit saattavat yhteisesti omata, ovat seuraavat: 10 (a) noin 14 - noin 35 kilodaltonin näennäinen mole- kyylipaino määritettynä pelkistävän SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesin avulla; (b) kyky stimuloida CML-solujakaantumista 10 - 100 pM:n pitoisuuksina CML-kokeessa; 15 (c) isoelektrinen piste pH-arvossa 6,0 - 7,6; (d) yksittäinen, edullisesti terävä, piikki 43 kd:n kohdalla Superose 6 -geelisuodatuskolonnissa; (e) yksittäinen 20,5 kd:n nauha geelissä N-glyka-naasikäsittelyn jälkeen; ja 20 (f) ei yli noin 2 % ylittävä epäpuhtaustaso N-pää- tyanalyysissä Edman-pilkkomisen mukaan.

Tässä kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokkaan määrän yhtä tai useampaa keksinnön mukaista polypeptidiä. Näitä koostumuk-25 siä voidaan käyttää menetelmissä lukuisten tautitilojen hoitamiseksi, joille on ominaista verta muodostavien solujen vajaa taso. Nämä menetelmät käsittävät tehokkaan määrän ainakin yhtä tässä kuvatun mukaista polypeptidiä antamisen potilaalle.

30 Tällaisten terapeuttisten menetelmien päämääränä voi olla erilaisten patologisten tilojen hoitaminen, jotka tilat ovat seurausta sairaudesta, altistuksesta säteilylle ja/tai huumeille ja joita ovat esim. valkosolujen vähäisyys veressä, verihiutaleiden niukkuus veressä, anemia, B-35 soluvajaus, T-soluvajaus, bakteeritartunta sekä virustar- 4 104903 tunta, mukaan lukien luuydinsiirtoa seuraava imuunisolu-tai verenmuodostussoluvajaus. Näihin menetelmiin saattaa kuulua myös IL-3:n kaltaisten polypeptidien kanssa samanaikaisesti tai sen jälkeisesti tai sitä edeltävästi tehok-5 kaan määrän ainakin yhden muun hematopoietiinin, inter-leukiinin tai kasvutekijän antaminen. Esimerkkejä hemato-poietiineistä tällaiseen käyttöön ovat GM-CSF, G-CSF, CSF-1 ja erytropoietiini. Esimerkkejä interleukiineista ovat IL-1, IL-2, IL-4 ja IL-6. Menetelmät voivat niinikään hyö-10 dyntää kasvutekijöitä, kuten B-solukasvutekijää, B-solu-differentiaatiotekijää ja eosiinisoludifferentiaatioteki-jää.

Tässä esitetään edelleen DNA-sekvenssit, mukaan lukien cDNA-sekvenssit, jotka koodaavat ainakin yhden, IL-15 3:n kaltaisen biologisen ominaisuuden omaavan kädellispo- lypeptidin ilmaisua. Tällaisiin sekvensseihin kuuluu taulukossa I tai II 5' - 3' suunnassa esitetty nukleotidisek-venssi. Vaihtoehtoisesti DNA-sekvenssi, joka hybridoituu rajoittavissa olosuhteissa taulukon I tai II mukaiseen 20 DNA-sekvenssiin tai DNA-sekvenssi, joka hybridoituu ei-rajoittavissa olosuhteissa esitettyihin DNA-sekvensseihin ja joka koodaa ainakin yhden, IL-3:n kaltaisen biologisen ominaisuuden omaavan proteiinin ilmaisua. Näihin sekvensseihin kuuluvat myös taulukkojen I ja II mukaisten sek-25 venssien alleelimuunnokset riippumatta siitä, johtavatko tällaiset nukleotidimuunnokset muutoksiin peptidisekvens-sissä vai eivät sekä mainittujen muut analogit ja johdannaiset .

Keksinnön mukaiselle rekombinantti-DNA-sekvenssille 30 on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 4 esitetään.

Edelleen kuvataan vektoreita, jotka sisältävät edellä kuvatun mukaisen DNA-sekvenssin toiminnallisessa vuorovaikutuksessa ilmaisua kontrolloivaan sekvenssiin 35 sekä tällaisella DNA-sekvenssillä transformoituja soluja.

5 104903 Näitä vektoreita ja transformoituja soluja voidaan käyttää uudessa menetelmässä kädellis-IL-3:n kaltaisten polypepti-dien tuottamiseksi, jonka menetelmän mukaan viljellään solulinjaa, joka on transformoitu IL-3:n kaltaisen poly-5 peptidin ilmaisua koodaavalla DNA-sekvenssillä toiminnallisessa vuorovaikutuksessa sen ilmaisua kontrolloivaan sekvenssiin. Tämä keksinnön mukainen menetelmä voi hyödyntää lukuisia tunnettuja soluja isäntäsoluina kyseisen po-lypeptidin ilmaisemiseksi. Tällä hetkellä edullisina pi-10 detyt solulinjat ovat nisäkässolulinjoja tai bakteerisoluja.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Kyseisen keksinnön muita näkökohtia ja etuja tulee ilmeiseksi arvioitaessa seuraavaa yksityiskohtaista ku-15 vausta sen edullisista suoritusmuodoista.

Kädellisten IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden ryhmän jäsenet ovat oleellisesti vapaita vuorovaikutuksesta muihin kädellisten proteiinipitoisiin materiaaleihin ja niille on ominaista samat tai niihin nähden oleellisesti 20 homologiset aminohapposekvenssit kuin on esitetty jatko-tekstissä taulukkojen I ja II sekvensseinä. Tämän uuden kasvutekijäryhmän jäsenille on niinikään ominaista, että ne omaavat ainakin yhden, IL-3:n kaltaisen kasvutekijän biologisen ominaisuuden alla kuvatun mukaisesti. Edulli-25 sesti kasvutekijäryhmän mikä tahansa yksittäinen jäsen osoittaa useampaa kuin yhtä IL-3:n kaltaista biologista ominaisuutta.

Ilmaisun "IL-3:n kaltainen biologinen ominaisuus" määritellään tässä kattavan yhden tai useamman seuraavan 30 biologisen ominaispiirteen sekä in vivo- ja in vitro -vaikutuksia. Eräs tällainen ominaisuus on punasolu-, imusoluja ydinsolusolulinjoihin kuuluvien kantasolujen kasvun ja differentiaation tukeminen. Esimerkiksi tavanomaisessa ihmisen luuydinkokeessa IL-3:n kaltainen biologinen omi-35 naisuus on jyvässolutyyppisten pesäkkeiden ja punasolury- 6 104903 kelmien stimulointi. Toinen tällainen ominaisuus on vuorovaikutus varhaismonitoimikantasolujen kanssa.

Toinen IL-3:n kaltainen biologinen ominaisuus on monitoimiprekursorisolujen kasvun ylläpito. Toinen ominai-5 suus on kyky stimuloida kroonisen ydinsoluleukemian leu-kemiasolujen (CML-solujen) jakaantumista. IL-3:n kaltainen biologinen ominaisuus on niinikään syöttösolujen jakaantumisen stimulointi. IL-3:n kaltaiset kasvutekijät voivat niinikään tukea erilaisten tekijäriippuvaisten solulinjo-10 jen kasvua ja/tai indusoida 20-a-steroididehydrogenaasin (20-ct-SPH:n) ja Thy-l-antigeenin ilmaisun. Muita IL-3:n kaltaisia biologisia ominaisuuksia ovat KG-l-solupesäke-muodostuksen stimulointi ja/tai lisääntyneen histamiini-synteesin stimulointi pernasolu- ja luuydinsoluviljelmis-15 sä. Edelleen seuraavan IL-3:n biologinen ominaisuus on noin 14 - noin 35 kd:n näennäinen molekyylipaino pelkistävässä natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesissa. IL-3:n kaltaisten proteiinien muita biologisia ominaisuuksia on julkistettu alan puitteissa 20 liittyen hiiri-IL-3:een.

Taulukoissa I ja II esitetyt spesifiset peptidisek-venssit ovat kyseisen keksinnön mukaisesti valmistettavan kasvutekijäryhmän kaksi edustavaa jäsentä. Taulukon I mukainen 865 bp:n DNA-sekvenssi eristettiin cDNA-ilmaisukir-25 jastosta, joka oli peräisin gibboniapinan leukemiaviruk-sella tartutetusta gibboni-T-solulinjasta UCD-144-MLA [T.G. Kuwakami, et. ai., Nature 235 (1972) 170]. Tämä sekvenssi sisältää yksittäisen pitkän, 456 nukleotidistä koostuvan avoimen lukualueen, joka koodaa noin 152 30 aminohappojäännöstä käsittävää proteiinia, jota kutsutaan CSF-80:ksi ja käsittää tavanomaisen, erittäin hydrofobisen sekvenssin (leu leu leu leu gin leu leu) osoittaman joh-toerityssekvenssin. Kypsä proteiini alkaa aminohappojäännöksestä nro 20, joka on alaniini, taulukossa I. Koodialue 35 sisältää kolme kysteiinijäännöstä, kaksi kypsässä prote- 7 104903 iinissa, mikä viittaa yhden disulfidisillan läsnäoloon. Läsnä on kaksi mahdollista asparagiinikytkentäistä gly-kosylaatiokeskusta, joita kuvaavat tunnusomaiset sekvenssit. Asn-X-Ser tai Asn-X-Thr. Koodisekvenssin osoittama 5 sekä koko että glykosylaatiokuvio ovat tyypilliset lymfo-kiinin kaltaisille proteiineille. 865 bp:n alueen jäljelle jäävällä ei-koodaavalla osuudella saattaa olla säätävä osa transkriptiossa luontaisessa isännässä. Sekvenssin 3'-pääty sisältää samoin AT-pitoisen segmentin, joka käsittää 10 useana toistona sekvenssin ATTTA, jonka arvellaan liittyvän RNA-lähettisanoman stabiilisuuteen [ks. G. Shaw ja R. Kamen, Cell 46:5 (1986) 659 - 677].

8 104903

Taulukko I

10 20 30 49

CTCEÄGCIÄC GTCAACGAAA AATAAAATOC AAAC AIG AGC IGC CDS CCC GTC CIG CTC

MET Ser Cys Leu Pro Vai Leu Leu 5 64 79 94 109

CXG CTC CAA CTC CTG CTC AGC CCC GGA CTC CAA GCT COC AITO ACC CAG ΜΆ ACG

l«u Lau Gin lau Leu Vai Ser Fro Gly Leu Gin Ala Pro KET Ihr Gin Thr Thr 124 139 154

TOC TIG AAG AGA AGC TQG GIT AAC TGT TCT AAC AIG ATC GAT GAA ATI ATA ACA

Ser leu lys lhr Ser Trp Vai Asn Cys Ser Asn MET Ile Asp Glu Ile Ile Uir 169 184 199 214

10 CAC ΊΏ AAG CAG CCA CCT TIG CCC TIG CIG GAC TIC AAC AAC CTC AAT GGG GAA

His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Ifce Asn Asn Leu Asn Gly Glu 229 244 259 274

GAC CAA GAC ATT CIG AIG GAA AAT AAC CTT OSA AGG CCA AAC CIG GAG GCA TTC

Asp Gin Asp Ile Leu MET Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Hie 289 304 319 AAC AAG GCT GTC AAG ACT TEA CAG AAT GCA TCA GCA A3G GAG AGC ATT CTT AAG ^5 Asn Lys Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys 334 349 364 379

AAT CIG COC GCA TGC CIG CCC AIG GOC ACA GCC GCA COC ACG OSA CAT CCA ATC

Asn Leu Pro Pro Cys Leu Pro MET Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro Ile 394 409 424

OCT AIG AAG GAC GCT GAC TGG AAT GAA TIG OSG AGG AAA CIG AAG TIG TÄT CIG

Arg Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Fhe Arg Arg Lys Leu Lys Ihe Tyr Leu 20 439 454 469 484

AAA ACC CIT GAG AAT GAG CAA GCT CAA CAG AIG ACT TIG AGC CCT GAG ATC TCT

Lys Ihr Leu Glu Asn Glu Gin Ala Gin Gin MET Ihr Leu Ser Leu Glu Ile Ser 500 510 520 530 540 550 560

TGACTCCAAC CTOCAGCICT CICTCIGGGC CCTCTCACOG CAGAGCCIGA GGACAIGAAA AACAGCAGAA

570 580 590 600 610 620 630

25 CTICIGAAAC CIGIGQCTCG TCTCICACAC ACTCCAGGAC CAGAAGCAIT TCACCTITIG CIGCGGCAIG

640 650 660 670 680 690 700

AGAIGAATIG TTAATEAICT AATITCTGAA AIGIGCAGCI COCATTIGGC CTIGIGIGCT TGIGTTCIGA

710 720 730 740 750 760 770

TTOTAIOCC AXIGAGACTA '11TAIUTAIG TCIGCfllöl ΊΤΕΑ2ΊΊΑΙΤ TATTIAIIGC CTICIGGAGC

30 780 790 800 810 820 830 840

CTGAACTCTA TCTAITIGAG CAGAGGAGOC ATCTCAIGCT GCITCIGCAA AAAACIGAAG ACTGGGCTGG

850 860

GGAGCA1GIT CAITiUIACC TCGAG

9 104903

Taulukon II mukainen 673 bp:n DNA-sekvenssi saatiin ihmisgenomikirjastosta [J.J. Toole et ai., Nature 312 (1984) 342 - 346] käyttämällä taulukon I mukaista sekvenssiä sensorina. Taulukon II mukainen DNA-sekvenssi raken-5 nettiin alunperin nivomalla yhteen ihmisgenomisekvenssin eksonit, jotka tunnistettiin vertaamalla taulukon I mukaiseen gibbonin IL-3:n kaltaisen polypeptidin DNA-sekvens-siin. Tämä ihmissekvenssi, jonka rakenne varmistettiin ihmis-cDNA-kloonin mRNA-analyysin avulla, koodaa myös noin 10 152 aminohappojäännöstä käsittävää polypeptidiä, joka kuu luu tähän kädellisproteiinien ryhmään. Tämä ihmispolypep-tidi käsittää tavanomaisen, erittäin hydrofobisen sekvenssin (leu leu leu gin leu leu) osoittaman johtoerityssek-venssin. Kypsä polypeptidi alkaa aminohappojäännöksestä 15 nro 20, joka on alaniini, taulukossa II. Koodialue sisältää kaksi kysteiinijäännöstä kypsässä proteiinissa, mikä viittaa yhden disulfidisillan läsnäoloon. Läsnä on kaksi mahdollista asparagiinikytkentäistä, tunnusomaisen sekvenssin, Asn-X-Ser, havainnollistamaa glykosylaatiokeskus-20 ta. 674 bp:n sekvenssin jäljelle jäävällä ei-koodaavalla osuudella saattaa olla säätävä osa transkriptiossa luontaisessa isännässä.

Ihmisgenomin geenin eksonien nukleotidisekvenssit (taulukko II) olivat yli 96-%:isesti homologiset gibboni-25 geenin DNA-sekvenssiin (taulukko I) nähden. Muutoksista 11 kodonin nukleotidisekvensseissä seuraa gibboni- ja ihmis-proteiinien välisiä aminohappojäännöseroja. Taulukon II sekvenssin yläpuolelle merkityt nukleotidit osoittavat kohdat, joissa gibbonisekvenssi poikkeaa likeisestä ihmis-30 sekvenssistä. Samoin ihmisaminohappojäännössekvenssin alapuolelle merkityt aminohapot osoittavat kohdat, joissa gibbonisekvenssi on erilainen.

10 104903

Taulukko li A 9 T 24 39 A54 GATOCAAAC ATS AGC CSC CTS CCC QIC CIG CXC CIC CIC CAA CTC CIG GIC OSC MET Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu leu leu Gin leu leu Veil Arg

Ser 5 20 (27) 69 84 [C] 99

CCC GGA CTC CAA GCT CCC ATS ACC CAG ACA ACG TOC TTS AAG ACA AGC TOG GTT

Pro Gly Leu Gin Ala Pko MET Thr Gin Thr Thr ser leu Lys Thr Ser Trp Vai 114 T 129 144 159

AAC TGC TCT AAC ATS ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG CCA CCT TTG

Aan Cys Ser Aan MET Ile Asp Glu Ile Ile Thr His leu Lys Gin Pro Pro leu 10 50 C 174 189 204 CCT ITS CTS GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA GAC ATT CTG ATG GAA Pro leu leu Asp R» Asn Asn leu Asn Gly Glu Asp Gin Asp Ile leu MET Glu 219 234 249 A 264 AAT AAC CIT GGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC AAC AGG GCT CTC AAG AGT TTA 15 Aan Asn leu Arg Arg Pro Asn leu Glu Ala Che Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu

Lys T 279 C 294 G 309 OC C 324 CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG AGC ATT CIT AAA AAT CTC CTS OCA TST CTG CCC Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile leu Lys Asn leu leu Pro Cys leu Pro 100 Pro A A 339 354 G 369

?n CIG GOC AOG GCC GCA COC ACG OSA CAT CCA ATC CAT ATC AAG GAC GGT GAC TGG

leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp MET Arg 429

384 399 A 414 AA

AAT GAA TTC CGG AGG AAA CIG AOG TTC TAT CIG AAA ACC CIT GAG AAT GCG CAG Asn Glu Che Arg Arg Lys leu Thr Che Tyr leu Lys Thr leu Glu Asn Ala Gin 130 lys du 444 459 485 25 T T A C G 475 _ TC _ 495 GCT CAA CAG AOS ACT TTS AGC CIC GCG ATC TTT T-AGICCAAOG TGCAGCTQST TCTCIGSGCC Ala Gin Gin Thr Thr leu Ser Leu Ala Ile Che MET 147 Glu Ser 505 515 555 £_ GAA 525 535 545 G 565

ITCTCACCAC AGCG0CIC3G GACATCAAAA ACAGCAGAAC TTCIGAAAOC TCIGGGICAT CTCTCACACA

30 G 575 585 _595 605 615 625 635

TTCCAGGAOC AGAAGCAITT CACCTTnCC TGGGGCAIGA GATGAAITGT ΤΑΑΠΑΓΟΑ ATTTCIGAAA

___ 645 655 T 665

TSIGCAGCTC CCAITIGGOC TIGTGCSCTT CTGTICICA

11 104903

Laitoksen National Biomedical Services, Washington D.C., suorittama tietokonehaku paljasti, että gibbonin ja ihmisen IL-3:n kaltaisten sekvenssien homologia aminohap-potasolla on noin 29 % ja nukleotiditasolla 45 % hiiren 5 IL-3-DNA-sekvenssiin nähden sellaisena kuin sen ovat julkistaneet M.C. Fung et ai., Nature 307 (1984) 233 - 237. Ihmisen IL-3:n kaltaisen geenin eksonirakenteet vastasivat samalla tavalla hiiri-IL-3:n koodialueita.

Taulukossa I esitetty uusi, 865 bp:n cDNA-sekvenssi 10 sisällytettynä plasmidiin E. coli -kannassa HB101 on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 11. heinäkuuta 1986, jossa se sai hakunumerokseen ATCC 67154. Uusi genomisekvenssi, jonka cDNA-sekvenssi on esitetty 15 edellä taulukossa II, sisällytettynä bakteriofagi lamb-daan, on vastaavasti talletettu 7. elokuuta 1986 ja sen hakunumero on ATCC 40246. Ihmis-IL-3-DNA sisällytettynä plasmidiin pSHIL-3-1 E. coli -kannassa HB101 on talletettu ATCC-talletuslaitokseen 24. helmikuuta 1987 ja saanut ha-20 kunumeron ATCC 67326.

Edustavia ihmisen ja gibbonin IL-3:n kaltaisia po- lypeptidejä on edelleen karakterisoitu transfektoiduista 35 COS-soluista peräisin olevien S-leimattujen proteiinien SDS-polyakryyliamidigeelianalyysin avulla, kuten on kuvat-25 tu jatkotekstissä esimerkeissä. Molemmat polypeptidit ovat kooltaan heterogeenisiä käsittäen molekyylilajeja, joiden näennäinen molekyylipaino on noin 14 - 35 kd ja tarkemmin 18 - 30 kd. Näiden edustavien IL-3:n kaltaisten tekijöiden tämän molekyylipainoalueen arvellaan olevan seurausta 30 vaihteluista puhdistettujen, COS-solujen tuottamien molekyylien glykosylaatiossa. Puhdistetut proteiinit, pitoisuuksina 10 - 100 pM, aiheuttavat pienten, jyvässolutyyp-pisten pesäkkeiden muodostusta in vitro -ihmisluuydinko-keissa. Lisäksi erytropoietiinin läsnä ollessa näissä ih-35 misluuydinkokeissa molemmat polypeptidit tukevat punasolu- 12 104903 ja ydinsolukantasolujen kasvua rinnastettavalla aktiivi-suustasolla. Täten nämä IL-3:n kaltaiset tekijät ovat moni-CSF:iä. Nämä IL-3:n kaltaiset tekijät aiheuttavat niinikään CML:ää potevista potilaista peräisin olevien 5 leukemialiitteisten emosolujen jakaantumista. Nämä poly-peptidit saattavat niinikään kyetä stimuloimaan apusolut ja kypsät solut, esim. monosyytit, tuottamaan muita, hema-topoietiinin kaltaisia tekijöitä, jotka puolestaan stimuloivat pesäkemuodostusta muista veren muodostukseen liit-10 tyvistä soluista sekä muita hematopoietiinityyppisiä vaikutuksia .

Polypeptidit voivat olla myös synteettisiä polypep-tidejä, jotka jäljittelevät täysin tai osittain taulukoiden I ja II mukaisten aminohappojäännösten jatkuvia sek-15 venssejä. Alan ammattilaiset ovat selvillä menetelmistä polypeptidien rakentamiseksi synteesikeinoin. Synteettisesti rakennetut sekvenssit voivat taulukoiden I ja II mukaisten IL-3:n kaltaisten polypeptidien kanssa yhteisten, primaari-, sekundaari- tai tertiaarirakenteen 20 sekä konformaation ominaispiirteiden ansiosta omata näiden kanssa yhteisiä IL-3:n kaltaisia biologisia ominaisuuksia. Täten niitä voidaan käyttää luontaisten, puhdistettujen kädellis-IL-3:n kaltaisten polypeptidien biologisesti aktiivisina tai immunologisina korvikkeina terapeuttisissa 25 ja immunologisissa prosesseissa.

Tässä tarjottujen IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden ryhmään kuuluu myös tekijöitä, joita koodaavat taulukkojen I ja II sekvensseihin nähden samankaltaiset sekvenssit lukuun ottamatta niissä luontaisesti esiintyviä tai niihin 30 tarkoituksellisesti suunniteltuja ja toteutettuja muunnoksia. Esimerkiksi eräs tällainen muunneltu ihmisproteiini omaa taulukossa II esitetyn kypsän peptidin sekvenssin lukuun ottamatta, että Ser-27 on korvattu proliinijäännöksellä. Tätä proteiinia koodaa taulukossa II esitetyn mu-35 kainen ihmis-cDNA-sekvenssi tämän käsittäessä sen muunnok- 13 104903 set, että proliinikodoni CCC esiintyy aminohappojäännös-asemassa nro 27 seriinikodonin TCC asemesta, joka viimeksi mainittu kyseisessä taulukossa esiintyy mainitussa asemassa. Tämä esimerkkiluonteinen muunneltu IL-3:n kaltainen 5 DNA-sekvenssi, joka tuottaa aktiivista IL-3:n kaltaista tekijää, E. coli -kantaan HB101 pHucIL-3-2:na sisällytettynä, talletettiin ATCC-talletuslaitokseen 13. helmikuuta 1987 hakunumerolla ATCC 67319.

Alan ammattilainen voi suorittaa muita muunnelmia 10 peptidiin tai sekvensseihin tunnettuja menetelmiä käyttäen. Nimenomaisiin kiinnostaviin muunnelmiin näissä IL-3:n kaltaisissa sukulaissekvensseissä voi kuulua yhden tai kummankin läsnä olevasta kahdesta kysteiinijäännöksestä korvaaminen kummassakin koodisekvenssissä muiden aminohap-15 pojen jäännöksellä. Edullisesti molemmat kysteiinijäännökset korvataan toisen aminohapon, esim. seriinin, jäännöksellä disulfidisillan poistamiseksi. Alan ammattilainen on hyvin perillä tällaiseen korvaamiseen tähtäävistä muta-tointimenetelmistä (ks. esim. US-patenttijulkaisu 4 518 20 584).

Muita nimenomaisia mutaatioita tässä kuvattujen IL-3:n kaltaisten tekijöiden sekvensseissä ovat yhden tai kummankin läsnä olevan glykosylaatiokeskuksen muunnelmat. Glykosylaation puuttuminen tai vain osittainen glykosylaa-25 tio on seurausta aminohappojäännöskorvauksesta tai -dele- tiosta yhdessä tai kummassakin asparagiinikytkentäisessä glykosylaatiotunnistuskeskuksessa, joka esiintyy taulukoissa I ja II esitettyjen IL-3:n kaltaisten tekijöiden sekvensseissä. Asparagiinikytkentäiset glykosylaatiotun-30 nistuskeskukset käsittävät tripeptidisekvenssejä, jotka solun sopivat glykosylaatioentsyymit spesifisesti tunnistustavat. Nämä tripeptidisekvenssit ovat joko asparagiini-X-treoniini tai asparagiini-X-seriini, joissa X on tavallisesti mikä tahansa aminohappo. Monet erilaiset aminohap-35 pojäännöskorvaukset tai -deletiot yhdessä tai kummassakin 14 104903 glykosylaatiotunnistuskeskuksen joko ensimmäisessä tai kolmannessa aminohappojäännösasemassa (ja/tai aminohappo-jäännösdeletio toisessa asemassa) johtavat glykosylaation puuttumiseen muunnellussa tripeptidisekvenssissä.

5 Esimerkiksi Asn34 taulukon I mukaisessa sekvenssissä voi olla korvattu glutamiinilla eräässä tällaisessa muunnellussa IL-3:n kaltaisessa tekijässä. Saatavan tekijän (Gln^) tulisi sisältää vain yksi asparagiinikytkentäinen hiilihydraattiosuus (kohdassa Angg) eikä kahta tällaista 10 osuutta. Alan ammattilaiset havainnevat, että analogisia, saman Asngg-monoglykosylaation käsittäviä glykoproteiineja voidaan valmistaa sijoittamalla jokin toinen aminohappo-jäännös asemaan 34 ja/tai sijoittamalla toinen aminohappo-jäännös muihin glykosylaatiotunnistuskeskukseen kuuluviin 15 asemiin, esim. insertoimalla väliini kohtaan Ser^g. Vastaavalla tavalla asemaa 89 vastaava Asn-kodoni ja/tai asemaa 91 vastaava seriinikodoni voidaan muuttaa mutatointi-teknisesti muiden aminohappojen kodoneiksi. Tällaisia muutettuja nukleotidisekvenssejä ilmaisemalla tuotetaan muun-20 noksia, jotka eivät ole glykosyloituja kyseisessä keskuk-sess. Vaihtoehtoisesti molempia keskuksia voidaan muuttaa kuten edellä. Tällaisia glykosylaatiokeskusmuunnelmia voidaan tehdä myös muunnelmien muodostamiseksi taulukon II mukaisesta sekvenssistä. [Ks. esim. A. Miyajima et ai., 25 EMBO J. 5:6 (1986) 1993 - 1197 sekä jatkotekstissä esimerkki IV.] Muita taulukkojen I ja II mukaisten sekvenssien analogeja ja johdannaisia, joilla oletettavasti olisi tallella IL-3:n kaltainen aktiivisuus kokonaisuudessaan tai osittain, voi alan ammattilainen niinikään helposti 30 suorittaa ottaen huomioon tässä esitetyt julkistukset.

Kyseinen keksintö käsittää niinikään kyseiset uudet DNA-sekvenssit, vapaina vuorovaikutuksesta muihin kädellispro-teiineja koodaaviin DNA-sekvensseihin, niiden koodatessa kädellisten IL-3:n kaltaisten polypeptidien tai kasvuteki-35 joiden ilmaisua. Näihin DNA-sekvensseihin kuuluvat taulu- is 104903 koissa I ja II 5' - 3'-suunnassa esitetyt sekvenssit sekä sekvenssit, jotka hybridoituvat rajoittavissa hybridisaa-tio-olosuhteissa [ks. T. Maniatis et ai., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbor Labora-5 tory, 1982, s. 387 - 389] taulukkojen I ja II mukaisiin DNA-sekvensseihin. Esimerkki eräistä tällaisista rajoittavista hybridisaatio-olosuhteista on hybridointi pitoisuudessa 4XSSC 65 eC:ssa, mitä seuraa peseminen 0,lXSSC:ssä 65 °C:ssa tunnin ajan. Vaihtoehtoisesti esi-10 merkinluonteiset rajoittavat hybridisaatio-olosuhteet ovat 50 % formamidi, 4XSSC:ssä 42 °C:ssa.

DNA-sekvenssit, jotka hybridoituvat taulukkojen I ja II mukaisiin sekvensseihin miedoissa hybridisaatio-olo-suhteissa ja jotka koodaavat kädellisten IL-3:n kaltaisia 15 biologisia ominaisuuksia omaavien kasvutekijöiden ilmaisua, koodaavat niinikään tämän uuden kasvutekijäryhmän jäseniä. Esimerkkejä tällaisista ei-rajoittavista hybridisaatio-olosuhteista ovat 4CSSC 50 °C:ssa tai hybridointi 30 - 40-%:isen formamidin avulla 42 °C:ssa. Esimerkiksi 20 DNA-sekvenssi, joka omaa huomattavan homologisia yhteisiä alueita, esim. glykosylaatiokeskuksia tai disulfidisilto-ja, taulukon I ja/tai II sekvenssien kanssa sekä koodaa yhden tai useamman IL-3:n kaltaisen biologisen ominaisuuden omaavaa kädellisproteiinia, koodaa selvästi tämän uu-25 den kasvutekijäryhmän jotain jäsentä, vaikka kyseinen DNA-sekvenssi ei ankarasti ottaen hybridoituisikaan taulukon I tai II mukaiseen sekvenssin.

Samoin DNA-sekvenssit, jotka koodaavat taulukon I tai II mukaisen sekvenssin koodaamia kädellisten IL-3:n 30 kaltaisia polypeptidejä, mutta jotka eroavat kodonisek-venssinsä osalta geneettisen koodin degeneraatti-ilmiöiden tai alleelivaihteluiden (luontaisesti esiintyviä emäsmuu-toksia lajipopulaatiossa, joista voi seurata tai olla seuraamatta aminohappomuutos) johdosta, koodaavat myös tämän 35 kuvatun ryhmän uusia kasvutekijöitä. Taulukkojen I ja II

16 104903 mukaisten DNA-sekvenssien vaihtelut, jotka johtuvat pis-temutaatioista tai mainittujen koodaamien polypeptidien aktiivisuuden, puoliintumisajan tai tuotannon parantamiseksi indusoiduista muunnelmista, kuuluvat myös keksinnön 5 piiriin.

Kyseisen keksinnön toisena näkökohtana tarjotaan uusi menetelmä kyseisen uuden, kädellisten IL-3:n kaltaisten tekijöiden ryhmän tuottamiseksi. Kyseisen keksinnön mukainen menetelmä käsittää sopivan solun tai solulinjan 10 viljelemisen, joka solu tai solulinja on transformoitu uuden, kädellisten IL-3:n kaltaisen polypeptidin ilmaisua koodaavalla DNA-sekvenssillä tunnettujen säätelysekvens-sien kontrollin alaisena. Sopivia soluja tai solulinjoja saattavat olla nisäkässolut, kuten kiinalaisen hamsterin 15 munasarjasolut (CHO-solut) tai 3T3-solut. Sopivien nisä-käsisäntäsolujen transformointi-, viljely-, vahvistus- ja seulontamenetelmien sekä tuotteen tuotanto- ja puhdistus-menetelmien valinnasta ollaan alan piirissä perillä. Ks. esim. Gething ja Sambrook, Nature 293 (1981) 620 - 625 tai 20 vaihtoehtoisesti Kaufman et ai., Mol. Cell. Biol. 5:7 (1985) 1750 - 1759 tai Howley et ai., US-patenttijulkaisu 4 419 446. Toinen sopiva nisäkässolulinja, jota kuvataan oheisissa esimerkeissä, on apinan COS-l-solulinja. Samoin käyttökelpoinen nisäkässolulinja on CV-l-solulinja.

25 Samoin hyödyllisiä kyseiseen keksintöön soveltuvina isäntäsoluina ovat bakteerisolut. Esimerkiksi eri E. coli -kannat (esim. HB101, MC1061 sekä seuraavissa esimerkeissä käytetyt kannat) ovat hyvin tunnettuja isäntäsoluja biotekniikan alalla. Tässä menetelmässä voidaan käyttää niin-30 ikään eri B. subtilis- ja Pseudomonas-kantoja sekä muita vastaavia.

Monia alan ammattilaisten tuntemia hiivasolukantoja on niinikään saatavana isäntäsoluiksi kyseisen keksinnön mukaisten polypeptidien ilmaisemiseksi. Lisäksi kyseisen 35 keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan haluttaessa 17 104903 käyttää isäntäsoluina hyönteissoluja. Ks. esim. Miller et ai., Genetic Engineering 8 (Plenum Press 1986) 277 - 298 sekä kyseisessä lähteessä mainitut viitteet.

Tässä kuvataan myös vektoreita käytettäviksi mene-5 telmässä näiden uusien kädellispolypeptidien ilmaisemiseksi. Nämä vektorit sisältävät edellä kuvattuja uusia DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat uusia kädellispolypeptidejä. Vaihtoehtoisesti vektorit, joihin sisältyy edellä kuvatun mukaisesti muunneltuja sekvenssejä, soveltuvat käytettä-10 viksi näitä IL-3:n kaltaisia polypeptidejä tuotettaessa. Menetelmässä käytetty vektori sisältää niinikään valittuja säätelysekvenssejä toiminnallisessa vuorovaikutuksessa keksinnön mukaisiin DNA-koodisekvensseihin, jotka sääte-lysekvenssit kykenevät ohjaamaan mainittujen toisiintumis-15 ta ja ilmaisua valituissa isäntäsoluissa.

Tässä julkistetun uuden, kädellisten IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden ryhmän jäseniä voidaan käyttää moninaisten patologisten tilojen tai tautitilojen hoidossa, erityisesti niiden, joille on tunnusomaista verenmuo-20 dostusjärjestelmän joko ydinsolujen, punasolujen, imusolu jen tai megakaryosyyttien tai niiden yhdistelmien alentunut pitoisuustaso. Lisäksi niitä voidaan käyttää kypsien ydin- ja/tai imusolujen aktivoimiseksi. Polypeptideillä hoitamiselle alttiisiin tiloihin lasketaan leukopenia, 25 kiertävien leukosyyttien (valkosolujen) lukumäärän aleneminen ääreisveressä. Altistuminen tietyille viruksille tai säteilylle voi aiheuttaa leukopeniaa. Se on usein syöpä-terapian eri muotoihin, esim. altistaminen kemotera-peuttisille lääkkeille, liittyvä sivuvaikutus. Leukopeniaa 30 terapeuttisesti näillä IL-3:n kaltaisten polypeptidien koostumuksilla hoitamalla mahdollisesti vältetään epätoivottavat, tämänhetkisesti saatavana olevilla lääkkeillä suoritetun hoidon aiheuttamat sivuvaikutukset.

Hoidolla keksinnön mukaisesti valmistetuilla poly-35 peptideillä saattaa niinikään olla myönteinen vaikutus eri 18 104903 immuunipuutoksiin, esim. T- ja/tai B-imusoluissa tai immuunijärjestelmän häiriöihin, esim. nivelreumaan. Nämä tekijät, yksinään tai yhdistettyinä muihin hoito-ohjelmiin, saattavat olla hyödyllisiä immuunipuutoksien hoidos-5 sa tai korjaamisessa, jotka ovat seurausta virustartunnoista, esim. HTLVI, HTLVII, HIV, vakavasti altistumisesta säteilylle, syöpäterapiasta tai seurausta muusta lääketieteellisestä hoidosta. Polypeptidejä voidaan niinikään käyttää, yksinään tai muihin hematopoietiineihin yhdistet-10 tyinä, muiden verisolupuutoksien, mukaan lukien verihiutaleiden niukkuus veressä (verihiutalevaje) tai anemian (pu-nasoluvaje), hoidossa. Näiden uusien polypeptidien muita käyttöjä ovat käyttö luuydinsiirroista toipuvien potilaiden hoidossa sekä käyttö tavanomaisilla menetelmillä 15 diagnoosi- tai terapiakäyttöön muodostettujen monoklonaa-listen ja polyklonaalisten vasta-aineiden kehittämisessä.

Tämän vuoksi tässä esitetään edelleen menetelmät sekä terapeuttiset koostumukset edellä mainittujen tautitilojen hoitamiseksi. Tällaiset koostumukset käsittävät 20 terapeuttisesti tehokkaan määrän yhtä tai useampaa kyseisen keksinnön mukaisen, kädellisten IL-3:n kaltaisten po-lypeptidien ryhmän jäsentä sekoitettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Tätä koostumusta voidaan systee-misesti antaa ruoansulatuskanavanulkopuolisesti. Vaihtoeh-25 toisesti koostumusta voidaan antaa laskimonsisäisesti. Haluttaessa koostumusta voidaan antaa ihonalaisesti. Sys-teemisesti annettaessa terapeuttinen koostumus on pyro-geenivapaan, ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen käyttöön hyväksyttävän vesiliuoksen muodossa. Tällaisen farmaseut-30 tisesti hyväksyttävän proteiiniliuoksen valmistus, jossa otetaan asianmukaisesti huomioon pH, isotonisuus, stabiilisuus ja muut vastaavat tekijät, kuuluu alan tekniseen tasoon.

Menetelmään edellä kuvattujen tautitilojen hoitami-35 seksi liittyvän annostusohjelman määrittää hoitava lääkä- 19 104903 ri, jolloin tulevat harkittaviksi erilaiset lääkkeiden vaikutusta muuntavat tekijät, esim. potilaan tila, paino, sukupuoli ja ravintotottumukset/ruokavalio, mahdollisen tartunnan vakavuus, antoajankohta sekä muut kliiniset te-5 kijät. Yleensä päivittäisen hoitoannoksen tulisi olla 200 - 1 000 mikrogrammaa polypeptidiä tai 50 - 5 000 yksikköä (jolloin yksikkö on polypeptidin se pitoisuus, joka johtaa on polypeptidin se pitoisuus, joka johtaa puolimak-simaaliseen stimulaatioon tavanomaisessa ihmisen luuydin-10 kokeessa) polypeptidiä painokiloa kohden.

Terapeuttiseen menetelmään ja sen mukaisiin terapeuttisiin koostumuksiin saattaa niinikään kuulua muiden ihmistekijöiden samanaikainen antaminen. Ei-kattavaan luetteloon muista tarkoituksenmukaisista hematopoetiineis-15 ta, CSFiistä ja interleukiineista tässä valmistettavien polypeptidien kanssa samanaikaisesti tai niitä edeltävästi tai niiden jälkeen annettaviksi lasketaan GM-CSF, CSF-1, G-CSF, Mg-CSF, erytropoietiini (EPO), IL-1, IL-4, IL-1, B-solukasvutekijä, B-soludifferentiaatiotekijä ja eo- 20 siinisoludifferentiaatiotekijä. Erityisen kiinnostava ver- tamuodostavien kantasolujen ja niiden jälkeläisten vahvistamiseksi in vivo on IL-3:n ja IL-6:n yhdistelmä (tunnetaan alalla myös B-solustimulaatiotekijä2:na), jotka mainitut solut osoittavat ihmisen emosolukokeissa kykyä ai-25 kaansaada varhaiskantasolupesäkkeiden lisääntymistä. Li säksi IL-3:n kaltaisia polypeptidejä voidaan antaa mono-klonaalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa tai niihin kemiallisesti kiinnitettyinä, terapeuttisessa käytössä. Vaihtoehtoisesti nämä kasvutekijät voidaan kiin-30 nittää tiettyihin toksiineihin, esim. risiiniin, terapeuttisessa hoito-ohjelmassa. Edellä ilmoitettua annostusta säädettäisiin tällöin tällaisten lisäaineosien terapeuttisessa koostumuksessa huomioon ottamiseksi. Hoidettavan potilaan edistymistä voidaan tarkkailla määrittämällä 20 104903 ajoittain verenkuva, esim. valkosolujen lukumäärä ja muita vastaavia seikkoja.

Seuraavat esimerkit kuvaavat havainnollistaen uuden, kädellisten IL-3:n kaltaisten polypeptidien ryhmän 5 jäseniä sekä kyseisen keksinnön mukaisia menetelmiä.

Esimerkki I

Gibbonin IL-3:n kaltaisen geenin eristys

Gibboni-T-solulinjaa, johon oli tartutettu gibboni-apinan leukemiavirus, UCD-144-MLA ja jota on saatavana 10 laitoksesta the National Institute of Health Laboratories, indusoitiin fytohemagglutiinilla ja forbolimyristaattiase-taatilla (PHA/PMA:11a). Näistä soluista valmistettiin ko-konais-RNA J.M. Chirgwinin et ai., Biochem 18 (1979) 5294, menettelyjen mukaan. Poly-A+-mRNA valikoitiin ja fraktioi-15 tiin 10 % - 30 % sukroosigradienttia käyttäen. Tätä uutta veren muodostumiseen liittyvää tekijää koodaavan mRNA:n identifioimiseksi 16 neste-erää UCD-144-MLA-solulinjasta peräisin olevaa, sukroosigradienttia käyttäen fraktioitua mRNA:ta mikroinjisoitiin Xenopus laevis -varhaismunasolui-20 hin ja saatua muunnettua kasvualustaa tutkittiin sen kyvyn suhteen stimuloida leukemiaemosolujen jakaantumista ihmis-GM-CSF:n vastaisen vasta-aineen läsnä ollessa, kuten havainnollistetaan CML-määrityksessä esimerkissä V. Sukroo-sigradienttifraktioista saatu mRNA, jonka oli tunnistettu 25 sisältävän IL-3:n kaltaisen kasvutekijän aktiivisuutta koodaavan lähettisanoman, muutettiin kaksijuosteiseksi cDNArksi U. Gublerin ja B.J. Hoffmanin, Gene 25 (1983), menettelyn mukaan.

COS-soluilmaisuvektori, pXM, joka sisältää SV40-te-30 hosteen, pääasiallisen adenovirusmyöhäispromoottorin, DHFR-koodisekvenssin, SV40-myöhäislähettisanomapoly-A-li-säyskeskuksen sekä Vall-geenin, linearisoitiin endonuk-leaasientsyymillä XhoI, minkä jälkeen sitä käsiteltiin DNA-polymeraasi-I:n suurella fragmentilla dTTP:n läsnä 35 ollessa sekä ligatoitiin ekvimolaariseen määrään cDNA:ta 2i 104903 DNA:n loppupitoisuuden ollessa 100 pg/ml. Ligatointituot-teet, jotka oli saatu pilkkomalla pXM:ää Xholrllä sekä insertoimalla Xhol-sopeutettu cDNA-sopeutettu cDNA-sek-venssi, transformoitiin E. coli -kantaan HB101, jota mal-5 joitettiin L+ Amp -maljoihin noin 30 x 103 pesäkkeen kirjaston luomiseksi. (Tässä menettelyssä voidaan käyttää myös muita funktionaalisesti samankaltaisia, alalla tunnettuja ilmaisuvektoreita pXM:n vaihtoehtoina.) cDNA-kirjasto pXM:ssä kopiomaljoitettiin nitrosel-10 luloosasuodattimille. Pesäkkeet kultakin suodattimelta raaputettiin L-liemeen, minkä jälkeen eristettiin plasmi-di-DNA. Kukin DNA-näyte valmistettiin 200 - 300 bakteeri-pesäkkeen poolista. DNA puhdistettiin J.A. Meyersin et ai., J. Bacteriol. 127 (1976) 1529, menetelmän mukaan.

15 Apinan COS-soluja (ATCC CRL 1650) transfektoitiin noin 5 pg:lla plasmidi-DNA: ta 106 kpl COS-solua kohden DEAE-välit-teisen DNA-transfektoinnin avulla, minkä jälkeen niitä käsiteltiin klorokiinilla lähteissä G.G. Wong et ai., Science 228 (1985) 810 - 815 ja R.J. Kaufman et ai., Mol. 20 Cell. Biol. 2 (1982) 1304, kuvattujen menettelyjen mukaan.

Kun transfektoinnista on kulunut 72 tuntia, kasvualusta kerätään talteen ja se analysoidaan ihmis-CML-mää-rityksen mukaan, kuten on kuvattu jatkotekstissä esimerkissä V. Yksi pooli tuotti pesäkkeitä stimuloivaa aktiivi-25 suutta sekä CML-lisääntymisaktiivisuutta, jotka olivat täysin resistenttejä GM-CSF:n vastaiselle neutraloivalle vastaseerumille ja se valittiin jatkoanalyyseihin. Valmistettiin plasmidi-DNA alkuperäisestä aktiivisesta poolista noukituista yksittäisistä pesäkkeistä ja transfektoitiin 30 edelleen muunnetun kasvualustan tuottamiseksi. Tästä muunnetusta kasvualustasta määritettiin CSF-aktiivisuus sekä CML-jakaantumisaktiivisuus. Eristettiin yksi yksittäinen tällaiseen aktiivisuuteen pystyvä klooni. Tämän kloonin cDNA-insertti alakloonattiin M13:een ja sekvenssoitiin 22 104903

Sangerin dideoksiketjupäätymenetelmän mukaan, (ks. taulukko I.)

Esimerkki II

Ihmisen IL-3:n kaltaisen geenin eristys 5 Taulukon I sekvenssiä sensorina käyttäen seulottiin 1 x 106 kloonia, jotka oli saatu ihmisgenomikirjastosta (ihmis-DNA:n osittainen Sau 3AI -pilkkomistuote kloonattuna lambdavektorin J1 BamHI-keskukseen) [J.J. Toole et ai., supra]. Tunnistettiin kolme plakkia, jotka sisälsivät 10 voimakkaasti cDNA-sensoriin hybridoituvia sekvenssejä.

Kahdesta näistä plakeista saatu DNA pilkottiin täydellisesti endonukleaasientsyymillä Sau 3AI ja tuote alakloo-nattiin bakteriofagi-lambda M13 -kloonausvektorin mp9 BamHI-keskukseen. Eksonisekvenssejä sisältävät alakloonit 15 tunnistettiin hybridoimalla gibboni-cDNArhan. Yksi ala- klooni, lambda CSF-16, joka sisälsi ihmisgenomi-DNA-sek-venssin noin 10 kb:n Bgll-inserttinä, talletettiin ATCC-talletuslaitokseen kuten edellä on kuvattu. Ihmisgeenin kaikkien eksonien täydelliset sekvenssit määritettiin 20 käyttäen dideoksiketjupääty-DNA-sekvenssointia joukon oli- gonukleotidipohjusteita kanssa, joiden sekvenssit perustuivat esimerkissä I kuvatun gibbonigeenin sekvenssiin. Koska ihmisgeenieksonien nukleotidisekvenssit olivat yli 96-%:isesti homologiset gibboni-cDNA-sekvenssiin nähden, 25 uudelleenrakennettiin vastaavan ihmis-cDNA:n nukleotidi- sekvenssi. Muutokset 11 kodonin nukleotidisekvensseissä johtavat aminohappoeroihin näistä kahdesta lajista peräisin olevissa polypeptideissä. (Ks. taulukko II.)

Ihmisgenomisekvenssi voidaan leikata irti lambda 30 CSF-16:sta ja insertoida ilmaisuvektoriin, joita alalla tunnetaan lukuisia tyyppejä nisäkäs-, hyönteis-, hiiva-, sieni- ja bakteeri-ilmaisua silmällä pitäen. Esimerkiksi ihmisgenomisekvenssi leikattiin talletetusta bakteriofagista pilkkomalla endonukleaaseilla. Smal ja XhoI, jotka 35 pilkkovat ihmisgeenialueella nukleotidin 629 ja vastaavas- 23 104903 ti 3 183 kohdalta. Saatava 2,5 kb:n fragmentti sisältää kokonaisuudessaan ihmisen IL-3-geenin koodisekvenssit ja käsittää "TATAA-likeis"sekvenssin promoottorialueella, mutta ei käsitä "CAT-likeis"sekvenssejä eikä polyadenylaa-5 tiosignaalia geenin 3'-päädyssä. Tämän fragmentin Smal-pääty muutettiin XhoI:ksi kaupallisesti saatavana olevan liittäjäsekvenssin avulla. Tämä fragmentti alakloonattiin tavanomaisten molekyylibiologiateknisten menettelyjen avulla [ks. esim. Y.-C. Yang et ai., Cell 47 (1986) 3 -10 10] XhoI:llä pilkottuun plasmidi-ilmaisuvektoriin pXM, jolloin saatiin plasmidi pY3.

pY3 vahvistettiin sitten bakteereissa, minkä jälkeen se transfektoitiin apinan COS-l-soluihin, joissa ihmisgeeni transkriptoituu ja RNA leikkautuu. Transfektoi-15 duista soluista peräisin oleva kasvualusta on positiivista IL-3:n kaltaisen biologisen aktiivisuuden määrityksissä ihmisen luuydinkokeessa sekä CML-määrityksessä kuten jat-kotekstissä on kuvattu. Gibboni-cDNA-sensoria käyttäen suoritettu Northern blot -analyysi osoittaa yksittäisen 20 1 kb:n mRNA-palasen läsnäolon, joka eristetään näistä so

luista ja joka vastaa kooltaan ääreisveren imusoluista saatua RNA:ta kuten jatkotekstissä kuvataan. cDNA syntetisoidaan mRNA:sta tavanomaisten menettelyjen avulla ja tunnistetaan yksi CML-aktiivisuutta omaava klooni. Siitä 25 eristetään uuden IL-3:n kaltaisen kasvutekijän cDNA. Esimerkki III

Ihmisen IL-3:n kaltainen kasvutekijä Ihmisen IL-3:n kaltaista polypeptidiä koodaava taulukon II mukainen cDNA-sekvenssi voidaan saada myös muilla 30 tavoilla kuin mitä kuvattiin esimerkissä II. Esimerkiksi taulukon II mukainen sekvenssi voidaan syntetisoida kemiallisesti alan ammattilaisten hyvin hallitsemien menettelyjen mukaan. Yhdessä tällaisessa kemiallisessa synteesimenetelmässä uudelleen rakennetaan gibbonin IL-3-geeni 35 ihmis-IL-3-koodisekvenssin saamiseksi. Ensimmäinen gibbo- 24 104903 ni- ja ihmis-IL-3-proteiinien kypsien muotojen välinen ero esiintyy aminohappojäännöksessä 82. Koodisekvenssi alkaen gibbonin IL-3-geenin aminohappojäännöksestä 82 geenin 3'-päätyyn asti voidaan korvata kemiallisesti syntetisoiduil-5 la, ihmis-IL-3:a koodaavilla DNA-sekvensseillä, jolloin saadaan funktionaalinen geeni, joka kykenee tuottamaan ihmis-IL-3:a sopivassa ilmaisujärjestelmässä.

Synteettisten DNA-osuuksien kloonauksessa voidaan käyttää gibbonisekvenssin kahta yksittäistä restriktiokes-10 kusta: AsuII-keskusta aminohappojäännöksen 73 kohdalla sekä EcoRIca aminohappojäännöksen 125 kohdalla. DNA-"kasetti" insertoitavaksi gibbonigeeniin syntetisoitiin AsuII-keskuksesta EcoRI:een tuottamalla entsymaattisesti noin 160 bp:n DNA-dupleksi kahdesta oligonukleotidistä, 15 jotka komplementoivat toisiaan 21 emäsparin matkalla.

Täydellinen dupleksi muodostettiin jatkamalla komplement-tialuetta oligonukleotidien päihin deoksinukleotiditrifos-faatteja ja DNA polymeraasi-I:tä, Klenow-fragmenttia, käyttäen. Täydellistä dupleksia pilkottiin AsuIItlla 20 ja/tai EcoRI:llä koheesiopäätyjen saamiseksi kloonausta jatkovaiheena silmällä pitäen.

Toinen synteettinen DNA-"kasetti" koostuu kahdesta oligonukleotidistä niiden komplementoidessa toisiaan koko pituudeltaan EcoRI-keskuksesta aminohappojäännöksen 125 25 kohdalta geenin päässä aminohappojäännöstä 152 seuraavaan lopetuskodoniin asti se mukaan lukien. Nämä oligonukleoti-dit suunniteltiin sisältämään EcoRI-koheesiopääty sekä sopivat restriktiokeskukset tai koheesiopäädyt lopetusko-donin kohdalla tai välittömästi sen jälkeen kloonausta eri 30 ilmaisuvektoreihin silmällä pitäen.

Syntetisoitiin kaksi sarjaa näitä kasetteja, yksi sarja ilmaisua nisäkkäissä silmällä pitäen ja toinen bakteeri-ilmaisua varten ottaen huomioon prokaryoottien ja eukaryoottien väliset kodonikäytäntöerot, CpG-duplettien 35 alhainen esiintymistiheys eukaryoottigeeneissä sekä eri- 25 104903 laisten restriktiokeskusten säilyttäminen tai niiden tarve kloonausta silmällä pitäen. Tällaiset kodonikäytäntösuosi-tuimmuudet ovat alan ammattilaisille tuttuja. Ks. esim. T. Maruyama et ai./ Nucl. Acids. Res. 14 (1986) rl51. Esi-5 merkkejä kodonimuutoksista sekä näitä kasetteja varten syntetisoiduista koheesiopäädyistä ilmenee seuraavasta taulukosta III. Kasetit kloonataan sitten vektoriin, pCSF-MLA:han, tämän muuttamiseksi vektoriksi, joka sisältää ihmisen IL-3:n kaltaista tekijää koodaavan geenin. Tätä 10 saatua vektoria käytetään sitten ihmistekijän ilmaisemiseksi .

26 104903

Taulukko III

I. Kodonimuutoksia

Aminohappojään- Bakteeri-ilmaisu Nisäkäsilmaisu nös nro

5 73 CGT

74 CGT

75 CCG

82 CGT

86 AGC

87 CTG CTG

88 CAA CAA

89 AAT

10 91 AGC

97 CTG CTG

100 CTG CTG

102 CCG

105 CCG

108 ACC ACA

109 GCT

15 111 CCG

112 ACC ACC

113 CGT AGG

115 CCG

120 GAT

127 CGC AGG

128 CGC

131 ACC ACC

20 137 CTG CTG

140 GCT GCT

143 CAG CAG

145 ACC ACC

14 6 ACC ACC

147 CTG CTG

152 TTC TTC

27 104903

Taulukko III (jatkoa) II. Kasettipäätyjä

Kasetti nro Bakteeri-ilmaisu 5 I 73 125

arg arg...glu phe arg T CGT...GAA TTC CGT λ GCA...CTT AAG GCA

Kasetti nro Nisäkäsilmaisu 10 I 71 125

asn leu arg arg...glu phe arg AAC CTT CGA AGG...GAA TCC CGTC TTG GAA GCT TCC...CTT AGG GCAG

Kasetti nro Bakteeri-ilmaisu II 126 152 15 phe arg phe

AA TTC CGC......TTC TAG AACTCGAGACTGCA

G GCG......AAG ATC TTGAGCTCTG

Kasetti nro Nisäkäsilmaisu II 126 152 20 phe arg ... phe

AA TTC AGG ... TTC TAG AACTCGAGA

G TCC ... AAG ATC TTGAGCTCTTTAA

Vaihtoehtoisesti ihmisen IL-3:n kaltaisesta kasvu-25 tekijästä peräisin olevan cDNA-sekvenssin hankkimiseen voi liittyä kudoslähteestä peräisin olevan cDNA:n kloonaus. Taulukon I mukaista gibboni-cDNA-sekvenssiä käytettiin sensorina T. Maniatiksen et ai., supra, mukaan ja tunnistettiin ääreisveren imusolut ihmislähteeksi tätä ihmisen 30 IL-3:n kaltaista polypeptidiä koodaavan mRNA:n eristämiseksi. Poly A*-RNA valmistettiin ääreisveri-imusoluläh-teestä, se muutetaan cDNA:ksi sekä kloonataan joko fagi-tai plasmidi-DNA-kirjastoksi. Ihmis-cDNA-klooni voidaan tunnistaa hybridoimalla taulukon I mukaiseen gibbonikoodi-35 28 104903 sekvenssiin DNA-sensorina sekä määrittämällä IL-3:n kaltaiset biologiset ominaisuudet.

Muita kudoslähteitä, joita niinikään voidaan seuloa ihmisen IL-3:n kaltaisen cDNA:n suhteen, ovat perna, mak-5 sa, kateenkorva, nielu/kitarisat, munuainen sekä muut ku-dosnäytteenotoista sekä ruumiista saatavina olevat tuoreet kudokset. Erityisen kiinnostavia ovat tapaukset, joissa kohonneet veren muodostamiseen liittyvien solujen lukumää-rälliset tasot voivat johtua kasvaimesta, kuten esim. leu-10 kemiassa. Lisälähteitä ovat julkiseen käyttöön talletus-laitoksiin, esim. ATCC-laitokseen, talletetut solulinjat tai solulinjat, joita on saatavana valtiollisista laitoksista sekä tietyistä yksityisistä lähteistä. Esimerkki-luonteisia solulinjoja ovat transformoidut T- ja B-solu-15 linjat sekä solulinjat, jotka eivät ole peräisin veren muodostamiseen liittyvistä soluista, mutta jotka muodostavat hematopoietiinejä.

Tämän ihmisen IL-3:n kaltaisen polypeptidin ilmaisemiseksi sitä koodaava cDNA siirretään sopivaan ilmaisu-20 vektoriin, esim. pCD:hen tai pXM:ään ja viedään valittuihin isäntäsoluihin tavanomaisten geeniteknisten menettelyjen avulla edellä kuvatun mukaisesti. Eräs nisäkäsilmaisu-järjestelmä biologisesti aktiiviselle rekombinaatiomenet-telyn tuloksena saadulle ihmisen IL-3:n kaltaiselle poly-25 peptidille ovat stabiilisti transformoidut CHO-solut. Ak tiivista polypeptidiä voidaan kuitenkin tuottaa solunsi-säisesti tai solun ulkopuolisesta E. colissa ja muissa bakteereissa. Ilmaisujärjestelminä voidaan niinikään käyttää hiiva- tai hyönteissoluja kuten on kuvattu esimerkissä 30 IV.

Vaihtoehtoinen menetelmä tämän, ihmisen IL-3:n kaltaisen polypeptidin, ilmaisemiseksi on käyttää lambda CSF-16:sta peräisin olevaa Bglll-fragmenttia, joka sisältää täydellisen ihmisgenomigeenin, kyseisen polypeptidin il-35 maisevien nisäkässolulinjojen rakentamiseksi, esim. kuten 29 104903 on kuvattu ihmisen erytropoietiiniä koskien PCT-hakemus-julkaisussa WO85/20 610. Lisäksi tämä ihmisgenomigeeni voidaan suunnitella ja rakentaa tarkoituksenmukaista promoottoria ja tarkoituksenmukaisia prosessointisignaaleja 5 käyttäen ilmaisun suorittamiseksi jossain muussa heterolo-gisessa järjestelmässä, esim. käyttäen hyönteispromootto-reita hyönteissolulinjaviljelmien rakentamiseksi. Vastaavasti tämä genomigeeni voidaan ilmaista hiivassa tai muissa eukaryoottisissa järjestelmissä.

10 Esimerkki IV

Rakennetaan plasmidi, pCSF-MLA, yksinkertaisesti insertoimalla taulukon I mukainen gibbonisekvenssi Xholrllä pilkottuun pXM:ään kuten on kuvattu edellä. Ih-missekvenssin käsittävä plasmidi, pSHIL-3-1 rakennetaan 15 synteettisesti nisäkäsilmaisua varten, kuten on kuvattu esimerkissä III. Toinen plasmidi pY3 saadaan kuten edellä on kuvattu. Kukin näistä kädellisten IL-3:n kaltaisen kasvutekijän käsittävistä plasmideista transformoidaan sitten tavanomaisen menettelytavan avulla valittuun isäntäsoluun 20 jonkin polypeptidin ilmaisemiseksi.

A. Nisäkässoluilmaisu: IL-3:n kaltaisten tekijöiden ilmaisun saamiseksi jatkotekstissä kuvatuissa määrityksissä käytettäväksi pSHIL-3-1 ja pCSF-MLA transfektoidaan COS-soluihin. Trans-25 fektoitujen COS-solujen muunnettu kasvualusta sisälsi kor keita kasvutekijäaktiivisuustasoja kuten on kuvattu.

Tässä kuvatut nisäkässoluilmaisuvektorit voidaan syntetisoida alan ammattilaisten hyvin tuntemien menettelytapojen mukaan. Vektorien rakenneosat, esim. replikonit, 30 valikointigeenit, tehostimet, promoottorit ja muut samankaltaiset, voidaan saada luontaisista lähteistä tai syntetisoida tunnettujen menettelyjen mukaan. Ks. Kaufman et ai., J. Mol. Biol. 159 (1982) 511 - 521; ja Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82 (1985) 689 - 693. Edustavia 35 nisäkäsisäntäsoluja ovat erityisesti kädellissolulinjat 30 104903 sekä jyrsijäsolulinjat, mukaan lukien transformoidut solu-linjat. Tavalliset diploidiset solut, peruskudosta in vitro viljelemällä saadut solulinjat sekä peruskudosviljelmät soveltuvat niinikään. Valikointigeenin ei tarvitse puuttua 5 ehdokassolujen genomista, kunhan valikointigeeni on luonteeltaan dominoiva. Vektori-DNA:n stabiiliksi integroimiseksi sekä integroidun vektori-DNA:n myöhemmäksi vahvistamiseksi, jotka molemmat suoritetaan tavanomaisten menetelmien mukaan, voidaan käyttää tai CHO-soluja. Vaihtoeh-10 toisesti vektori-DNA voi sisältää kokonaisuudessaan tai osittain nautapapilloomavirusgenomiin [Lusky et ai., Cell 36 (1984) 391 - 401] ja se voidaan siirtää solulinjoihin kuten C127-hiirisoluihin stabiilina episomaalisena yksikkönä. Muita sopivia nisäkässolulinjoja ovat mainittuihin 15 rajoittumatta HeLa-solut, COS-l-apinasolut, hiiren L-929-solut, 3T3-solulinjat, jotka on saatu Sveitsin hiiristä, Balb/c-hiiristä tai NIH-hiiristä, BHK- tai HaK-hamsteriso-lulinjat.

Stabiilit transformantit seulotaan sitten tuotteen 20 ilmaisun suhteen tavanomaisten immunologisten tai entsy-maattisten määritysten avulla. Muunnettuja proteiineja koodaavan DNA:n läsnäolo voidaan todeta tavanomaisten menettelyjen kuten Southern blot -analyysin avulla. Muunnoksia koodaavan DNA:n tilapäinen ilmaisu useampana, ilmaisu-25 vektori-DNA:n viemistä sopiviin isäntäsoluihin, kuten apinan COS-l-soluihin seuraavana päivänä mitataan valikointia suorittamatta suorittamalla viljelykasvualustan sisältämien proteiinien aktiivisuus- tai immuunimääritys.

Alan harjaantunut taitaja voi niinikään rakentaa 30 muita pCSF-MLA:han ja pSHIL-3-1:een rinnastettavia nisä-käsilmaisuvektoreita esim. leikkaamalla taulukon I tai II mukaisen DNA-sekvenssin vastaavista plasmideista XhoI:n avulla sekä käyttämällä tunnettuja rekombinaatiogeeniteknisiä menettelytapoja ja muita tunnettuja vektoreita kuten 35 pJL3 ja pJL4 [Gough et ai., EMBO J. 4 (1985) 645 - 653] ja 31 104903 pMT2 (lähtien liikkeelle pMT2-VWF:stä, ATCC nro 67122; ks. PCT-hakemusjulkaisu PCT/US87/00 033). Näiden vektorien transformointi sopiviin isäntäsoluihin voi johtaa IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden ilmaisuun.

5 B. Bakteeri-ilmaisujärjestelmät:

Vastaavasti alan harjaantunut taitaja saattaisi manipuloida taulukkojen I ja li mukaisia sekvenssejä poistamalla tai korvaamalla koodisekvenssejä sivuavat nisäkäs-säätelysekvenssit bakteerisekvensseillä bakteerivektorien 10 luomiseksi keksinnön mukaisten IL-3:n kaltaisten tekijöiden ilmaisemiseksi solunsisäisesti tai solun ulkopuolises-ti bakteerisoluissa. Tekijää koodaavaa DNA:ta voidaan edelleen muunnella esimerkin III mukaisesti sisältämään eri kodoneja ilmaisun suorittamiseksi bakteereissa kuten 15 alalla on tunnettua. Edullisesti sekvenssi kytketään toiminnallisesti lukualueella kypsän muunnellun proteiinin bakteeri-ilmaisun, -erityksen ja -prosessoinnin sallivaa eritysjohtopolypeptidiä koodaavaan nukleotidisekvenssiin kuten samoin alalla on tunnettua. Bakteeri-isäntäsoluissa 20 ilmaistuneet yhdisteet voidaan sitten ottaa talteen, puhdistaa ja/tai niitä voidaan karakterisoida niiden fysiko-kemiallisten, biokemiallisten ja/tai kliinisten parametrien osalta, jotka kaikki toimenpiteet voidaan suorittaa tunnettujen menetelmien avulla.

25 Yhden tällaisen bakteerivektorin rakentamiseksi bakteeri-ilmaisua silmällä pitäen rakennettiin osittain synteettinen ihmisen IL-3:n kaltainen DNA-sekvenssi gib-boni-cDNA:sta sekä esimerkissä III kuvatuista synteettisistä bakteerikaseteista. Tämä sekvenssi sijoitettiin 30 Ndel/Xbal:llä pilkottuun vektoriin pall81, joka on talletettu ATCC-talletuslaitokseen hakunumerolla 40134. Saatu vektori pPLHIL-3-181 transfektoitiin E. coli -kantaan GL400, jota viljeltiin GM-CSF:lle PCT-hakemusjulkaisussa 86/00 639 kuvatun mukaisissa olosuhteissa.

32 104903 E. colissa IL-3:n kaltainen tekijä tuotetaan liukenemattomina (virustartuntaliitteisinä) solunsisäisinä kappaleina. Niiden liukoiseksi tekemiseksi sekä proteiinin saamiseksi niistä noudatetaan seuraavaa menettelyä. Noin 5 50 g soluja jäädytettynä tahnana uudelleenliitetään 120 mitään liuosta 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM fenyy-limetyylisulfonyylifluoridi (PMSF) ja 2 mM ditiotreitoli (DTT) (puskuri A) . Solut rikotaan käyttämällä ne ranskalaisessa painekennossa tai Matin Gaulin -venttiilin kautta 10 paineen ollessa 700 kp/cm2 tai enemmän. Näitä rikottuja soluja sentrifugoidaan sitten 20 000 x gtssä 30 minuutin ajan solujätteen pelletoimiseksi sen sisältäessä kyseiset solunsisäiset kappaleet.

Pelletti uudelleen lietetään liuokseen, jossa on 15 55 % sukroosia puskurissa A, käyttämällä ranskalaisessa painekennossa, minkä jälkeen sentrifugoidaan toistamiseen 30 000 x g:ssä 30 minuutin ajan. IL-3:n kaltaisen tekijän solunsisäisissä kappaleissa sisältävä pelletti uudelleen lietetään liuokseen, jossa on 55 % sukroosia puskurissa A, 20 minkä jälkeen saatu liete asetetaan kerrokseksi vaihegra-dientit 60, 65 ja 70 % sukroosia käsittävälle liuokselle. Gradienttiliuosta sentrifugoidaan 150 000 x grssä kahden tunnin ajan. IL-3:n kaltaisen tekijän käsittävät solunsisäiset kappaleet sedimentoituvat 65 %:n kerrokseen, joka 25 otetaan talteen.

Tässä vaiheessa noin 80 %:n puhtausasteen omaavan IL-3:n kaltaisen tekijän rekonstituoimiseksi sekä uudelleen laskostamiseksi nämä solunsisäiset kappaleet uudelleen lietetään pitoisuudeksi noin 2 - 3 mg proteiinia mil-30 lilitraa kohden 8 M urealiuokseen. Tätä kyseisen proteiinin sisältävää urealiuosta laimennetaan liuoksella 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM PMSF; 2 mM DTT ja 0,1 mM etylee-nidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) (puskuri B) urean lop-pupitoisuuteen 3 M (jolloin IL-3-pitoisuus liuoksessa on 35 noin 1 pg/ml). Urealiuokseen lisätään pelkistävää/hapet- 33 104903 tavaa puskuria, joka sisältää 6 mM pelkistynyttä glutatio-nia ja 6 mM hapettunutta glutationia, minkä jälkeen inku-boidaan 20 °C:ssa kahden tunnin ajan. 3M urealiuosta dia-lysoidaan puskuria B vastaan yön yli urean poistamiseksi.

5 Sitten IL-3-proteiiniliuos sentrifugoidaan mahdollisen sakan poistamiseksi. Tässä vaiheessa IL-3:n kaltainen tekijä on uudelleen laskostunut ja sen puhtausaste on noin 85 %.

Uudelleen laskostettua IL-3:n kaltaista tekijää 10 dialysoidaan 50 mM MES-puskuria vastaan, pH 6,0, joka sisältää 0,1 mM EDTA, minkä jälkeen se panostetaan samalla puskurilla tasapainotettuun DEAE-Sepharose-kolonniin. IL-3:n kaltainen tekijä löytyy DEAE:n läpivirtausnesteestä ja sen puhtausaste on noin 99 %. Tässä vaiheessa poistuvat 15 niinikään mahdolliset pyrogeenit. DEAE-läpivirtausnesteenä saadun IL-3-liuoksen pH säädetään 5,0:ksi lisäämällä 200 mM natriumasetaattipuskuria, pH 4,0, IL-3:n kaltainen tekijä panostetaan sulfonyylipropyyli-Sepharose-kolonniin, jossa IL-3:n kaltainen tekijä sitoutuu SP-Sepharoseen ja 20 josta se eluoidaan mainitulla natriumasetaattia sisältävällä puskurilla. Tässä vaiheessa IL-3:n kaltainen tekijä on puhdasta sekä uudelleen laskostunut oikealla tavalla. CML-määrityksessä tämän ihmisen IL-3:n kaltaisen tekijän spesifinen aktiivisuus on 1 - 3 x 107 CML-yksikköä/mg.

25 Vastaavasti taulukon I tai II mukainen koodisek- venssi voitaisiin leikata pCSF-MLA:sta tai pSHIL-3-1:stä Xholrn avulla ja edelleen manipuloida sitä (esim. ligatoi-den muihin tunnettuihin liittäjiin tai muuntaen poistamalla siitä ei-koodaavat sekvenssit tai muuttamalla sen kä-30 sittämiä nukleotidejä muiden tunnettujen menettelytapojen avulla). Muunnettu IL-3:n kaltainen koodisekvenssi voitaisiin sitten insertoida johonkin tunnettuun bakteerivekto-riin käyttäen lähteessä T. Taniguchi et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 77 (1980) 5230 - 5233, kuvatun kaltaisia 35 menettelyä. Tämä esimerkinomainen bakteerivektori voitai- 34 104903 siin sitten transformoida bakteeri-isäntäsoluihin ja ilmaista IL-3:n kaltainen tekijä niissä. Strategian osalta IL-3:n kaltaisten tekijöiden solunulkoisen ilmaisun tuottamiseksi bakteerisoluissa, ks. esim. EP-A-hakemusjulkaisu 5 177 343.

C. Hyönteissoluilmaisu:

Vastaavia manipulointeja voidaan suorittaa hyön-teisvektorin rakentamiseksi (ks. esim. EP-A-hakemusjulkaisussa 155 476 kuvatut menettelyt) ilmaisua hyönteissoluis-10 sa silmällä pitäen. Hiivavektori voitaisiin rakentaa niin ikään käyttäen hiivasäätelysekvenssejä kyseisen keksinnön mukaisten proteiinien solunsisäistä tai solunulkoista ilmaisua hiivasoluissa silmällä pitäen. (Ks. esim. PCT-hake-musjulkaisussa WO/86 00 639 ja EPA-hakemusjulkaisussa 15 123 289 kuvatut menettelyt.)

Esimerkki V

Kädellisten IL-3:n kaltaista tekijää korkeina pitoisuustasoina ilmaisevien CHO-solulinjojen rakentaminen

Yhdessä menetelmässä keksinnön mukaisten uusien, 20 kädellisten IL-3:n kaltaisten polypeptidien muodostaman ryhmän tuottamiseksi nisäkässoluissa korkeissa pitoisuustasoissa rakennetaan heterologisen IL-3:n kaltaisen geenin monikopioita sisältäviä soluja. Heterologinen geeni voidaan kytkeä vahvistamiskelpoiseen merkkiin, esim. dihyd-25 rofolaattireduktaasi(DHFR)geeniin, jonka suhteen lisään tyneen lukumäärän geenikopioita sisältävät solut voidaan valikoida lisäännytettäviksi kasvavissa metotreksaatti-(MTX)pitoisuuksissa Kaufmanin ja Sharpin, J. Mol. Biol. (1982), supra, menettelyjen mukaan. Tätä lähestymistapaa 30 voidaan soveltaa lukuisiin erityyppisiin soluihin.

Esimerkiksi pY3 sisältää ihmisen IL-3:n kaltaisen geenin toiminnallisessa vuorovaikutuksessa muihin, sen ilmaisun mahdollistaviin plasmidisekvensseihin. pY3 ja DHFR-ilmaisuplasmidi pAdA26SV(A)3 (Kaufman ja Sharp, Mol. 35 Cell, Biol. 3:9 (1983) 1598 - 1608) voidaan viedä samanai- 35 104903 kaisesti CHO-soluihin, joista puuttuu DHFR, DUKX-BII-so-luihin, kalsiumfosfaattiyhteissaostuksen ja transfektoin-nin avulla. Vaihtoehtoisesti geeni voidaan viedä pMT2:een kuten aiemmin on mainittu ja saatu vektoria käyttää pY3:n 5 ja pAdA26SV(A)3:n asemesta. DHFR:n ilmaisevat transforman-tit valikoidaan kasvun perusteella dialysoitua vasikansi-kiöseerumia sisältävässä «-kasvualustassa, minkä jälkeen ne valikoidaan vahvistuksen suhteen kasvun perusteella kasvavissa MTX-pitoisuuksissa (perättäisvaiheina 0,02, 10 0,2, 1,0 ja 5 μΜ MTX:ssä), kuten on kuvattu lähteessä

Kaufman et ai., Mol. Cell. Biol. 5 (1983) 1750. Transfor-mantit kloonataan ja biologisesti aktiivisen IL-3:n kaltaisen polypeptidin ilmaistuksi tulemista tarkkaillaan CML-määrityksien avulla. IL-3:n kaltaisen polypeptidin 15 ilmaisun tulisi lisääntyä kasvavien MTX-vastuspitoisuus-tasojen myötä. Samankaltaisia menettelyjä noudattaen voidaan tuottaa tämän IL-3:n kaltaisten polypeptidien ryhmän muita jäseniä, mukaan lukien gibbonin IL-3:n kaltaisia polypeptidejä.

20 Esimerkki VI

IL-3:n kaltaisen polypeptidin biologiset vaikutukset

Seuraavat määritykset suoritettiin käyttäen sekä gibbonipolypeptidiä että ihmispolypeptidiä kyseisen kek-25 sinnön mukaisen uuden, kädellisten IL-3:n kaltaisten polypeptidien ryhmän edustavina jäseninä. Ryhmän muut jäsenet osoittaisivat kuitenkin IL-3:n kaltaisia biologisia ominaisuuksia näissä samoissa määrityksissä tai muissa määrityksissä yksittäisen polypeptidin osoittamien IL-3:n kal-30 täisten biologisten ominaisuuksien lukumäärästä riippuen.

A. CML-määritys CML-määritys suoritettiin oleellisesti lähteessä Blood, 63:4 (1984) 904 - 111, kuvattujen menettelyjen mukaan. Varastosoluerä saatiin jäädytetystä pussista, jossa 35 oli stabiilista CML-potilaasta peräisin olevaa ääreisver- 36 104903 ta. Tämä pussi sulatettiin ja uudelleen jäädytettiin 500 eränä, jotka tulivat sisältämään 15 x 106 solua/ampulli. Näitä soluja, "CML 8-3”, käytettiin IL-3:n kaltaisten po-lypeptidien IL-3:n kaltaisen aktiivisuuden tutkimiseksi.

5 Yksi ampulli sulatetaan nopeasti 37 °C:ssa määrityksen suoritusta edeltävänä päivänä. Sitten ampullin sisältö siirretään 15 ml:n koeputkeen, jossa se pestään kaksi kertaa liuoksella, jossa on 5 % Hi-ihmis-AB-seerumia RPMIrssä (Gibco, RPMI 1640) (HAB/RPMI). Soluja inkuboidaan yön yli 10 liuoksessa 5 % HiHAB/RPMI 5 % hiilidioksidia sisältävässä ilmakehässä 37 °C:ssa. Seuraavana päivänä solut poistetaan viljelmästä, niille suoritetaan fikolikäsittely, ne lasketaan toistamiseen sekä siirretään syrjään.

100 μΐ määritettävän materiaalin sisältävää kasvu-15 alustaa 10 % HIFCS2/RPMI maljoitetaan mikrotiitterilevyn kuhunkin kuoppaan. Edellä valmistetut solut ravistetaan nopeasti irtonaisiksi ja uudelleen lietetään pitoisuudeksi 1,3 - 2 x 105 solua/μΐ kasvualustaa 10 % HIFCS/RPMI. Kuhunkin kuoppaan maljoitetaan 100 μ1:η verran soluja, minkä 20 jälkeen maljoja inkuboidaan joko ihmisvastaisten CM-%-vas- ta-aineiden läsnä ollessa tai puuttuessa 37 °C:ssa 5 % hiilidioksidia sisältävässä ilmakehässä 48 tai 72 tunnin ajan. Sitten lisätään kuoppaa kohden 0,5 pCi 3H-tymidiiniä, minkä jälkeen maljoja inkuboidaan kuuden tunnin ajan 37 25 °C:ssa. Solut otetaan talteen käyttäen monivaihesuoda- tuslaitetta GFC Type C -suodatinpaperille (Schleicher CSF Schiill) , minkä jälkeen ne pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja kuivataan. Suodattimet upotetaan sitten tuikenesteeseen ja suoritetaan tuikemittaus 3H-kulutuksen 30 suhteen.

Tymidiinikulutuksen mittauksen perusteella sekä gibbonin IL-3:n kaltainen kasvutekijä että ihmisen IL-3:n kaltainen kasvutekijä ovat aktiivisia tässä määrityksessä leukemia-emosolujen jakaantumisen stimuloinnin suhteen.

37 104903 B. Luuydinmääritys:

Ihmisen luuydinmääritykset ei-takertuvia luuydin-soluja käyttäen suoritettiin kuten on kuvattu lähteessä G.C. Wong et ai., supra. Sekä gibboni- että toisaalta ih-5 mistekijöitä sisältävä muunnettu kasvualusta todettiin aktiiviseksi tässä määrityksessä, jolloin muodostui pieniä, ilmeisestikin jyvässolulinjatyyppiä edustavia solu-pesäkkeitä. Samoin värjättyjä agar-agar-viljelmiä morfolo-gisesti tarkasteltaessa todettiin muodostuneen makrofa-10 gi-, jyvässolu-makrofagi- ja eosiinisolupesäkkeitä. Suoritettaessa tämä määritys erytropoietiinin läsnä ollessa muunnetun kasvualustan kyvyn tukea punasolukantasolujen kasvua osoittaa veren punasoluista koostuvien pesäkkeiden muodostuminen. Verrattaessa GM-CSF:ää IL-3:n kaltaiseen 15 polypeptidiin ihmisen luuydinmäärityksessä todettiin, että IL-3:n kaltainen polypeptidi tuki useampien pesäkkeiden muodostiimistä kuin GM-CSF käytettäessä kumpaakin polypep-tidiä erytropoietiinin läsnä ollessa. GM-CSF:n tukemista pesäkkeistä valtaosa edusti yksisolulinjoja; kun taas ky-20 seisen keksinnön mukainen polypeptidi tuki monisolulinjo-jen muodostumista. Samoin emosolupesäkemuodostusmääritykeissä IL-3:n kaltainen polypeptidi tuotti useampia moniso-lutyyppiä edustavia emosolupesäkkeitä. GM-CSF tuotti samassa, määrityksessä hyvin harvoja sekundaaripesäkkeitä. 25 C. KG-l-solumääritys: KG-l-määritys suoritettiin kuten on kuvattu lähteessä G.G. Wong et ai., supra, gibbonin IL-3:n kaltaisen polypeptidin edustama jäsen kyseisen keksinnön mukaisesta uudesta, kädellisten IL-3:n kaltaisten kasvutekijöiden 30 ryhmästä oli tässä määrityksessä aktiivinen.

D. Sekalaisia määrityksiä:

Vasta-aineriippuvaisen soluvälitteisen myrkyllisyyden soluille määrityksessä kyseisen keksinnön mukainen IL-3:n kaltainen polypeptidi stimuloi eosiinisolut tappamaan 35 vasta-ainepäällysteisiä kasvainkohdesoluja annosriippuvai- 38 104903 sella tavalla. Polypeptidi stimuloi lisäksi eosiinisolut harjoittamaan syöjäsolutoimintaa seerumiopsonoitua leipo-mohiivaa kohtaan sekä stimuloi suoraan eosiinisolujen su-peroksidianionituotantoa. Alustavissa tutkimuksissa, jois-5 sa keksinnön mukaisia IL-3:n kaltaisia tekijöitä siirretään nestesiirron välityksellä terveisiin apinoihin, joiden valkosoluluvut määritetään, on todettu toistettavia kohoamisia sekä verihiutaleluvussa että eosiinisolujen lukumäärässä. Nämä alustavat tulokset on todettu sekä ihmi-10 sen että gibbonin IL-3:n kaltaisten tekijöiden kohdalla.

Esimerkki VII

IL-3:n kaltaisen polypeptidin puhdistus COS-soluil-la muunnetusta kasvualustasta Tällä hetkellä käytetään seuraavia menettelyjä ho-15 mogeenisen, IL-3:n kaltaisen proteiinin saamiseksi COS-soluista edellä esimerkissä IV kuvatun mukaisesti.

A. Ioninvaihto COS-soluilla muunnettu kasvualusta (DMEM, 0,5 % FBS rullapulloissa kokonaisproteiinipitoisuuden ollessa 20 200 pg/ml) sisälsi ihmisen IL-3:n kaltaista polypeptidiä noin pitoisuuden 2-3 pg/ml. Kasvualustaa laimennetaan vedellä, kunnes johtokyky on alle 8,0 ms/cm2. Ioninvaih-topatruuna (QAE Zeta Prep) tasapainotetaan 4 °C:ssa noin 500 ml:11a 0,1 M Tris-Cl:ää, pH 8,0 ja sitten kahdella 25 litralla 40 mM Tris-Cl:ää, pH 7,4. Kasvualusta panostettiin nopeudella 40 ml/min ja sitoutumaton fraktiot otettiin talteen. Panosta pestiin 40 mM Tris-Cl:llä, kunnes aktiivisuutta ei enää esiintynyt pesunesteessä. Työpöytä-määrien IL-3:n kaltaista proteiinia saamiseksi sitoutuma-30 tonta fraktiota konsentroitiin diasuodatusyksikkökalvolla (Amicon YM-10).

Vaihtoehto tälle konsentrointivaiheelle IL-3:n kaltaisen proteiinin puhdistamista suuremmassa mittakaavassa silmällä pitäen on tehdä QAE-Zeta Prep -panokseen sitoutu-35 maton fraktio happamaksi lisäämällä 1 M jääetikkaa pH:hon 39 104903 4,5. Kasvualusta panostetaan nopeudella 40 ml/min sulfo-nyylipropyyli(SP)Zeta Prep -panokseen, joka on tasapainotettu 4 °C:ssa 500 ml:11a 20 mM natriumasetaattiliuosta, pH 4,5. Panos pestään sitten 20 mM natriumasetaattiliuok-5 sella ja sitoutunut fraktiot eluoidaan käyttäen 20 mM natriumasetaattiliuosta sekä gradienttia 0,25 - 0,5 M nat-riumkloridi. Tämä fraktiot neutraloidaan lisäämällä IM Tris-Cl-liuosta, pH 8,0:sta pH 7,4:ään, minkä jälkeen lisätään Tween 20 -valmistetta 0,05 %:n loppupitoisuuteen.

10 B. Linssilektiinikolonni:

Linssilektiinikolonni tasapainotettiin 20 mM Tris-liuoksella, pH 7,4, joka sisälsi 0,05 I Tween 20 valmistetta, 4 °C:ssa (puskuri I), minkä jälkeen panostus suoritettiin nopeudella 1 kolonnitilavuus/tunti. Kolonnia pes-15 tiin puskurilla I ei-spesifisesti sitoutuneen proteiinin poistamiseksi, minkä jälkeen sitoutunut proteiini eluoi-tiin puskurilla I, joka sisälsi 0,2 M o-metyylimannopyra-nosidia. Eloidut fraktiot yhdistettiin.

C. Käänteisfaasi-HPLC: 20 Tälle IL-3:n kaltaiselle polypeptidivalmisteelle suoritettiin käänteisfaasi-HPLC huoneenlämpötilassa kuten alla on kuvattu. IL-3:n kaltaista polypeptidiä edustava valmiste ruiskutettiin RP-HPLC-kolonniin (C4 Vydac), joka oli tasapainotettu 100-%:isessa puskurissa A. Puskuri A 25 oli liuos, jossa oli 0,1 % trifluorietikkahappoa (TEA:ta) vedessä ja puskuri B oli liuos, jossa oli 0,1 % TFA:ta 95-%:isessa asetonitriilissä. Gradientti oli 0,2 %/minuut-ti välillä 45 % - 70 % puskuria B. Tätä gradienttia käyttäen saadut sittemmin yhdistetyt fraktiot eluoituivat pi-30 toisuusvälillä 46,8 % -* 47,5 % puskuria B. Nämä fraktiot pikatyhjöhaihdutettiin asetonitriilin poistamiseksi. Toisessa käänteisfaasi-HPLC-vaiheessa puskurina A oli liuos, jossa oli 0,15 % HFBA:ta vedessä ja puskurina B liuos, jossa oli 0,15 % heptafluorivoihappoa (HFBA) 95-%:ises-35 sa asetonitriilissä. Gradientti oli 0,2 %/minuutti välillä 4n 104903 40 45 % -* 70 % puskuria B. Tästä vaiheesta saadut sittemmin yhdistetyt fraktiot eluoituivat pitoisuusvälillä 49 % - 51 % puskuria B. Tämä HPLC-ajosta eluoituva fraktio ei sisältänyt pyrogeenejä.

5 Esimerkki VIII

IL-3:n kaltaisten polypeptidien analyysejä A. SDS-Page: R.J. Kaufmanin ja P.A. Sharpin, J. Mol. Biol. 159 (1982) 601 - 621, menettelyä noudattaen viedään 35S-metio-10 niiniä metabolian välityksellä pCSF-MLA:lla transfektoitu-jen ja toisaalta pY3:lla transfektoitujen COS-solujen valmistamiin polypeptideihin. Transfektoitujen COS-l-solujen erittämien leimattujen proteiinien SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesi (pelkistävät olosuhteet) paljasti po-15 lypeptidijakauman, jossa näennäinen molekyylipaino oli 14 - 35 kd, sekä gibboni- että ihmistekijoille. Tätä jakaumaa ei esiintynyt valetransfektoidussa verrokkinäyt-teessä. Tarkemmin ottaen COS-solujen tuottaman ihmisen IL-3:n kaltaisen tekijän jakaumaksi osoittautui 21 - 32 kd, 20 mikä on osoitus korkeammasta glykosylaatioasteesta kuin COS-solujen tuottamalla ihmistekijällä, jonka jakauma oli pääasiassa 21 - 28 kd.

Esimerkin VI mukaisten puhdistusmenettelyjen jälkeisessä hopeavärjäyksessä ilmeni kaksi pääasiallista nau-25 haa, jotka vastasivat keskimääräisiä molekyylipainoja 21 000 ja 25 000 likipitäen vastaavina määrinä kummallakin tekijällä. Kyseisten kahden nauhan välisten erojen katsotaan tämänhetkisesti johtuvan eroista N-kytkentäisessä glykosylaatiossa.

30 B. Isoelektrinen fokusointi:

Esimerkin VII mukaisia puhtaita polypeptidejä na-tiiveina isoelektrisesti fokusoitaessa paljastuu sekä gibboni- että ihmispolypeptideistä neljä lajia, joiden Pi-arvot ovat pH 6,0 - 7,6.

41 104903 C. Superose 6 -nopeaproteiininestekromatografia: HPLC-ajosta saadulla puhdistetulla fraktiolla suoritettiin ajo geelisuodatuskolonnissa (Superose 6) käyttäen liuosta, joka sisälsi 20 mM Tris, pH 7,4; 200 mM NaCl 5 ja 0,05 % Tween-20:tä. Tämä kolonniajo paljasti yhden terävän piikin, joka vastasi näennäistä molekyylipainoa 43 kd kummankin fraktion kohdalla.

D. Spesifinen aktiivisuus CML-määrityksessä:

Edustavan, gibbonin IL-3:n kaltaisen tekijän spesi-

10 finen aktiivisuus edellä kuvatussa CML-määrityksessä on 2 x 106 - 1 x 107 laimennosyksikköä/mg polypeptidiä keskiarvon ollessa 8 x 106 laimennosyksikköä/mg. Esimerkissä IV

(B) kuvatun bakteereissa tuotetun ihmispolypeptidin spesifiseksi aktiivisuudeksi todettiin 1 - 3 x 107 laimen-15 nosyksikköä milligrammaa polypeptidiä kohden. CHO-soluissa tuotetun, ihmisen IL-3:n kaltaisen tekijän spesifinen aktiivisuus on noin 2 - 3 x 106 yksikköä/mg proteiinia tässä määrityksessä. COS-soluissa tuotetun, ihmisen IL-3:n kaltaisen tekijän spesifinen aktiivisuus on noin 1 - 2 x 107 20 yksikköä/mg. Laimennosyksiköksi (tai CML-yksiköksi) määritellään se tekijän laimennos, joka tuottaa puolimaksimaa-lisen stimulaation CML-määrityksessä.

E. N-päätyanalyysi:

Gibbonipolypeptidin N-päätysekvenssin analyysi suo-25 ritettiin käyttäen automaattista Edman-pilkkomista, jossa puhtausastetekijäksi ilmeni 98 %.

F. N-glykanaasikäsittely: COS-soluissa tuotettuja ihmis- ja gibbonitekijöitä käsiteltiin entsyymillä N-glykanaasi, joka pilkkoo N kyt-30 kettyjä hiilihydraattiosuuksia. Kumpikin tekijä osoittautui puhdistuvan tämän menetelmän avulla. Kummankin tekijän geeleihin tuottama 14 - 35 kd -täplä muuttui gibboniteki-jän osalta yksittäiseksi, 15 kd:n nauhaksi ja ihmistekijän osalta 20,5 kd:n nauhaksi.

42 104903

Lukuisten muunnelmien ja muunnoksien tämän keksinnön käytännössä odotetaan juolahtavan mieleen alan ammattilaisilla heidän pohtiessaan edeltäviä, tämän keksinnön edullisten suoritusmuotojen kuvauksia. Oheisten 5 patenttivaatimusten uskotaan kattavan tällaiset muunnelmat ja muunnokset.

Claims (4)

104903

1. Menetelmä kädellis-IL-3-proteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että 5 (a) sopivassa viljelyalustassa viljellään isän- täsolua, joka on transformoitu kädellis-IL-3-proteiinia koodaavalla DNA-sekvenssillä, joka koodaa aminohapposekvenssin, joka on valittu seuraavasta ryhmästä: 1Q (i) 5’ (MET), Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai Arg Pro Gly Leu Gin Ala Pro MET Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Vai Asn Cys Ser Asn MET De Asp Glu De Ile Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin Asp Ile Leu MET Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn 15 Ala Ser Ala Ile Glu Ser He Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro De His De Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala He Phe 3’; 20 (ii) 5’ (MET), Ser Arg/Cys Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai Arg/Ser Pro Gly Leu Gin Ala Pro MET Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Vai Asn Cys Ser Asn MET He Asp Glu He He Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu 25 Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin Asp He Leu MET Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg/Lys Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala He Glu Ser He Leu Lys Asn Leu Leu/Pro Pro Cys Leu Pro Leu/MET Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro Ile His/Arg Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr/Lys Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu 30 _ Asn Ala/Glu Gin Ala Gin Gin Thr/MET Thr Leu Ser Leu Ala/Glu Ile Phe/Ser 3’; jossa a on 0 tai 1; ja jossa X/Y tarkoittaa, että joko X 35 tai Y voi olla läsnä; ja 44 104903 (iii) kohdan (i) ja (ii) alleeliset muunnokset, joissa IL-3:n biologiset ominaisuudet ovat säilyneet; ja mainittu DNA-sekvenssi on toiminnallisesti yhteydessä ilmentämiskontrollisekvenssin kanssa; ja 5 (b) IL-3-proteiini eristetään oleellisesti puh taassa muodossa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA sekvenssi on valittu seu-raavasta ryhmästä: 10 (i) ATG AGC TCC CTG CCC GTC CTG CTC CTG CTC CAA CTC CTG GTC AGC CCC MET SE» CYS LEO PRO VAL LEU LEO LEU LEU GLN LEO LEO VAL SER PRO GGA CTC CAA GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG TCC TTG AAG ACA AGC TGG CLY LEU GLN ALA PRO MET TKR GLN THR THR SER LEU LYS THR SER TRP

15 OTT AAC TGT TCT AAC ATG ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG VAL ASN CYS SER ASN MET ILE AS? GLU ILE ILE THR HIS LEO LYS GLN CCA CCT TTG CCC TTG CTG GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA PRO PRO LEO PRO LEO LEO AS? PHS ASN ASN LEU ASN GLY GLO AS? GLN GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC AS? ILE LEU MET GLO ASN ASN LEO ARG ARG PRO ASN LEO GLO ALA ΡΗΞ

20 AAC AAG GCT GTC AAG ACT TTA CAG AAT GCA TCA GCA ATC GAG AGC ATT ASN LYS ALA VAL LYS SER LEO GLN ASN ALA SER ALA ILE GLO SER ILE CTT AAG AAT CTC CCC CCA TGC CTG CCC ATG GCC ACA GCC GCA CCC ACG LEO LYS ASN LEO PRO PRO CYS LEO PRO MET ALA TKR ALA ALA PRO THR CGA CAT CCA ATC CGT ATC AAG GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC CGG AGG ARG HIS PRO ILE ARG ILE LYS AS? GLY AS? TR? ASN GLO ΡΗΞ ARG ARG

25 AAA CTG AAG TTC TAT CTG AAA ACC CTT GAG AAT GAG CAA GCT CAA CAG LYS LEO LYS PKE TYR LEO LYS TKR LEU GLO ASN GLO GLN ALA GLN GLN ATG ACT TTG AGC CTT CAG ATC TCT MET THR LEO SER LEO GLO ILE SER : 45 104903 , . . . T A (Hi atg agc cgc ctg ccc gtc ctg ctc ctg ctc caa ctc ctg gtc cgc ccc MET SER ARG LEU PRO VAL LEU LEU LEU LEU GLN LEU LEU VAL ARG PRO CYS SER

5 GGA CTC CAA GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG TCC TTG AAG ACA AGC TGG GLY LEU GLN ALA PRO MET THR GLN THR THR SER LEU LYS TKR SER TRP T GTT AAC TGC TCT AAC ATG ATC GAT GAA ATT ATA ACA CAC TTA AAG CAG VAL ASM CYS SER ASN MET ILE ASP GLU ILE ILE THR HIS LEU LYS GLN C CCA CCT TTG CCT TTG CTG GAC TTC AAC AAC CTC AAT GGG GAA GAC CAA

10 PRO PRO LEU PRO LEU LEU ASP PHE ASN ASN LEU ASN GLY GLU AS? GLN GAC ATT CTG ATG GAA AAT AAC CTT CGA AGG CCA AAC CTG GAG GCA TTC ASP ILE LEU MET GLU ASN ASN LEU ARG ARG PRO ASN LEU GLU ALA PHE A T C AAC AGG GCT GTC AAG AGT TTA CAG AAC GCA TCA GCA ATT GAG AGC ATT ASN ARG ALA VAL LYS SER LEU GLN ASN ALA SER ALA ILE GLU SER ILE LYS 15 G CC C A A CTT AAA AAT CTC CTG CCA TGT CTG CCC CTG GCC ACG GCC GCA CCC ACG LEU LYS ASN LEU LEU PRO CYS LEU PRO LEU ALA THR ALA ALA PRO THR PRO MET G CGA CAT CCA ATC CAT ATC AAG GAC GGT GAC TGG AAT GAA TTC CGG AGG ARG HIS PRO ILE HIS ILE LYS ASP GLY AS? TRP ASN GLU PHE ARG ARG 20 ARG A A A AAA CTG ACG TTC TAT CTG AAA ACC CTT GAG AAT GCG CAG GCT CAA CAG LYS LEU THR PHE TYR LEU LYS THR LEU GLU ASN ALA GLN ALA GLN GLN LYS GLU T T A C ACG ACT TTG AGC CTC GCG ATC TTT ;

25 THR THR LEU SER LEU ALA ILE PHE MET GLU SER (iii) DNA-sekvenssi, joka eroaa kohdan (i) tai (ii) DNA-sekvenssistä geneettisen koodin degeneraation seurauk- 30 sena; tai (iv) DNA-sekvenssi, joka pystyy hybridisoitumaan kohdan (i), (ii) tai (iii) DNA-sekvenssin koodaavan sek venssin kanssa ankarissa olosuhteissa; ja (b) lL-3-proteiini eristetään oleelliseesti puh-35 taassa muodossa. 104903

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ihmisen IL-3-proteiini tai ihmisen metionyyli-IL-3-proteiini tai niiden alleelinen muunnos, jossa IL-3:n biologiset ominaisuudet 5 ovat säilyneet.

4. Rekombinantti-DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodaa patenttivaatimuksessa 1 esitettyä kädellis-IL-3-proteiinia. 47 104903