JPH082310B2

JPH082310B2 - ヒト顆粒球哺乳類宿主細胞中におけるマクロファージコロニー刺激因子産生のための発現ベクター

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Publication number: JPH082310B2
Application number: JP63506432A
Authority: JP
Inventors: ヨコタ．，タカシ; リー，フランク・ディー; レニック，ドナ・エム; アライ，ケンイチ; アライ，ナオコ
Original assignee: SHERINGU BAIOTETSUKU CORP
Current assignee: SHERINGU BAIOTETSUKU CORP
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-15
Publication date: 1996-01-17
Anticipated expiration: 2011-01-17
Also published as: DE3880032D1; EP0370052A1; IE882147L; MY103542A; JPH1052280A; ATE87973T1; WO1989000582A3; EP0299782B1; KR970002212B1; EP0299782A3; DK12990D0; DK12990A; WO1989000582A2; ES2039624T3; JPH02502877A; KR890701627A; DE3880032T2; NZ225411A; CA1335717C; ZA885101B

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明はヒト造血系の増殖および分化のための蛋白性
因子、即ち、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子（GM−CSF）の哺乳類宿主細胞中における産生のた
めの発現ベクターおよびその産生に有用な新しいプロモ
ーターに関する。

背景技術循環血液細胞は、恒常的に新しく分化した細胞に置換
されている。置換する血液細胞は造血と呼ばれる過程に
よって形成され、そこで以下の少なくとも８種の成熟細
胞系列が作られる：赤血球、マクロファージ（単球）、
好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球（肥満細胞）、Ｔリンパ
球、そしてＢリンパ球（BurgessおよびNicola,「成長因
子と幹細胞（Growth Factors and Stem Cells）」（ア
カデミックプレス，ニューヨーク,1983）。血液細胞産
生の制御の多くは、コロニー刺激因子（CSF）と呼ばれ
る一連の活性糖蛋白質によって媒介される。これらの糖
蛋白質はその存在を検出するための生体内（in vivo）
および試験管内（in vitro）のアッセイ法から命名され
ている。半固体培地中での造血細胞のクローン培養技術
は、試験管内アッセイ法の発展に特に重要な役割を果た
した。このような培養系では、それぞれの駁細胞（即
ち、発生学的に一つの細胞系に分化が決定されている
が、まだ増殖能を有する細胞）は本質的に生態内におけ
る相同のプロセスと同一と考えられている様式で増殖
し、成熟細胞のコロニーを作ることができる。造血にお
けるCSFの働きは、最近多くの総説で取り上げられてい
る。例えば、メトカルフ（Metcalf）「造血系コロニー
刺激因子（The Hemopoietic Colony Stimulating Facto
rs）」（エルシーバー，ニューヨーク,1984）；メトカ
ルフ,Science,229,16−22（1985）；ニコラ（Nicola）
ら,Immunology Today,5,76−80（1984）；ウェットン
（Whetton）ら,TIBS,11,207:211（1986）；およびクラ
ーク（Clark）とカーメン（Kamen）Science,236,1229−
1237（1987）。

これらの因子の検出、単離および精製は、以下の理由
によりしばしば非常に困難である。それらが典型的に存
在する細胞上清の複雑さ，混合物中のさまざまの成分の
活性の多様性および重複、それらの因子の成分を確認す
るために使われるアッセイ法の感度（あるいは感度の欠
如）、それらの因子の分子量の範囲やその他の性質が屡
類似していること、そして自然の上体では因子の濃度が
非常に低いことである。

主として遺伝子クローニングによって多くのCSFが入
手可能になるにつれ，その臨床応用法の開発への興味が
増していた。ホルモン（例えば可溶性因子，成長メティ
エーター，細胞リセプターを介した作用）との生理学的
な類似性のため、CSFの使用の可能性は、現在のホルモ
ンの使用法から類推されている；例えば、デキスター
（Dexter）,Nature,321,198（1986）。これらの因子の
使用は、腫瘍の化学療法または放射線療法後の回復治
療、造血形成不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移
植後の造血系再生の促進のための治療、および慢性の感
染症に対する宿主の抵抗性を増すための治療等のよう
に、血球際産生刺激が必要となるいくつかの臨床の場
で、示唆されている。例えばデキスター（上述）、メト
カルフ（Science上述）およびクラークとカーメン（上
述）。

非組換えGM−CSFは、Mo細胞株の培養上清から精製さ
れ（米国特許4,438,032号に記載）、Ｎ末端から16アミ
ノ酸残基が配列決定された（ガッソン（Gasson）ら,Sci
ence,226,1339−1342（1984））。顆粒球およびマクロ
ファージの成長および分化を支える因子であるGM−CSF
の相補DNA（cDNA）は最近いくつかの研究室で数種類ク
ローニングされ、配列決定された；例えばゴー（Goug
h）ら,Nature,309,763−767（1984）（マウス）；リー
（Lee）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4360−4364（19
85）（ヒト）；ウォン（Wong）ら,Science,228,810−81
5（1985）（ヒトおよびテナガザル）；およびカントレ
ル（Cantrell）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,6250−6
254（1985）（ヒト）を参照。

ヒトGM−CSF等のリンホカインをコードするDNA配列を
含むプラスミド中で頻繁に使用されているプロモーター
は、SV40プロモーターである。

発明の概要本発明はここでSRαプロモーターと命名された使途顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）の
産生に有用な新たなプロモーターを含む、GM−CSFの発
現および／またはクローニングベクターに関する。特に
本発明は以下の順に共有結合した要素を含む（以下に詳
細に議論する）:SV40 DNA複製開始点（SV40 ori）,SV40
初期領域プロモーター（SV40アーリー）、SRαプロモー
ター、スプライスジャンクション、GM−CSFコード領域
（任意の順で）、およびポリアデニル化部位（ポリＡサ
イト）。

発明の詳細な説明故に本発明は哺乳類宿主細胞中でのヒト顆粒球−マク
ロファージコロニー刺激因子産生のための発現ベクター
を提供し、その発現ベクターは、 SV40DNAの複製開始点とSV40初期領域プロモーターと
を含むSRαプロモーター;; スプライスジャンクションおよびヒト顆粒球−マクロ
ファージコロニー刺激因子をコードする能力を持つヌク
レオチド配列；ならびにポリアデニル化部位；をこの順でセンス方向に含み、上記SRαプロモーター
は、SV40初期複製開始点のXhoI部位においてHTLV（Ｉ）
レトロウイルスのロングターミナルリピート（LTR）の
一部を含み、該一部は、完全なＲ領域およびR/U5境界か
ら最初の下流のTaqI部位までのU5領域の一部を含むセグ
メントを含むことによってさらに特徴づけられる。

また、SRαプロモーターはATCC67318として寄託され
たプラスミドからも得られる。

本発現ベクターは好ましくは上記SV40ポリアデニル化
部位の後に更に順に以下のものを含む：上記発現ベクターをバクテリア宿主中でクローニング
可能にする、バクテリアの複製開始点；および上記発現
ベクターによって形質転換されたバクテリア宿主を識別
するための選択可能なマーカー。

本発明における発現ベクターによって産生されるヒト
GM−CSFは、宿主の性質及びそのグリコシル化に影響を
与える能力によって、グリコシル化されたりされなかっ
たりする。

図面の簡単な説明第１図はヒトGM−CSF活性を示すポリペプチドをコー
ドするcDNA挿入のヌクレオチド配列および対応したアミ
ノ酸配列を示す。

第２図はヒトGM−CSF活性を示すポリペプチドをコー
ドするcDNA挿入を持つプラスミド,pcD−human−GM−CSF
を示す。

第2B図は第2A図のcDNA挿入の制限酵素地図である。

第３図はプラスミドpL1の制限酵素切断部位および主
要なコード領域を模式的に示す。

第４図はプラスミドpcDV1の制限酵素切断部位および
主要なコード領域を模式的に示す。

第１図に示されたクローンpcD−human−GM−CSFは、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,12301
パークローンドライブ，ロックビル,MD 20852,米国に
寄託番号39923で寄託されている。

本発明における発現あるいはクローニングベクター
は、以下の要素を順にセンス方向に有する。

スプライスジャンクション GM−CSFコード領域ポリＡサイト［ベクターの輪は、上記SV40 oriとつながって閉じ
る］。

好ましくは、この発現および／またはクローニングベ
クターはさらにSV40 oriとポリＡサイト間に挿入された
バクテリア複製開始部位（バクテリアori）および選択
可能なマーカー遺伝子を含む（以下参照）：スプライスジャンクション GM−CSFコード領域ポリＡサイトバクテリアori 選択可能なマーカー［ベクターの輪は、上記SV40 oriとつながって閉じ
る］。

さらに好ましくは、選択可能なマーカー遺伝子は、宿
主バクテリアにネオマイシン、アンピシリン、テトラサ
イクリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ヒグロ
マイシンあるいはその類似物に対する抵抗性等の薬剤耐
性を与える。最も好ましくは、バクテリアoriはpBR322
oriである。

全般にわたって、アミノ酸、ヌクレオチド、制限エン
ドヌクレアーゼ等を示すために標準的略号が使用されて
いる；例えばコーン（Cohn），「α−アミノ酸の命名お
よび記号（Nomenclature and Symbolism of α−Amino
Acids）」,Methods in Enzymology,106,3−17（198
4）；ウッド（Wood）ら，「生化学：問題へのアプロー
チ（Biochemistry:A Problems Approach）」，第２版
（ベンジャミン，メンロパーク,1981）；およびロパー
ツ（Roberts），制限エンドヌクレアーゼの目録（Direc
tory of Restriction Endonucleases）」,Methods in E
nzymology,68,27−40（1979）。

本発明における発現ベクターによって産生されるヒト
GM−CSFは血液細胞の再生刺激が可能であり、癌治療、
特定の血液疾患の治療および慢性の感染の治療において
有用であろう。

本発明によって産生されたGM−CSFはヒトGM−CSF活性
を示す、グリコシル化または非グリコシル化ポリペプチ
ドを含む。

本発明はまたはここで開示されたSRαプロモーターを
用いて、本発明のグリコシル化または非グリコシル化ポ
リペプチドを作る方法を含む。

本発明に従って産生されたヒトGM−CSFの作製、使
用、同定の技術は以下の一般的な項目中で説明される。
その後、一般的な技術が特殊な細胞種、ベクター、試薬
等に適用された、いくつかの具体例を示す。

I.GM−CSF cDNAのde novo調製 cDNAのde novo調製およびクローニング及びcDNAライ
ブラリーの構築のための種々な手法が現在使用可能であ
る。対応した文献の総説は、詳細な手法とともにWO87/0
2990として国際公開されているPCT/US 86/02464の29頁2
2行〜32頁下５行に述べられている。本発明におけるポ
リペプチドをコードするmRNAの好ましい由来は次節で議
論されている。PCT/US 86/02464中の開示は、ここでGM
−CSFの産生、特にその31頁と関連して読まれたい。

目的のポリペプチドをコードするmRNAの好ましい由来
は、Ｔリンパ球など、その上清が本発明におけるポリペ
プチドに伴う活性の一つを含む細胞である。それに由来
するGM−CSF cDNAのためのRNAは米国特許4,438,032号に
開示され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン,12301 パークローンドライブ，ロックビル,MD 20
852,米国に寄託番号CRL8066で寄託されているMo細胞株
より得られる。一般的には適当なＴ細胞はヒト脾臓、扁
桃腺および末梢血等、様々な由来から得られる。末梢血
Ｔ細胞より単離されたＴ細胞クローン等も使用可能であ
ろう（「免疫学での研究論文（Research Monographs in
Immunoligy）」，フォン・デーマー（vonDoehmer）お
よびハーフ（Haaf）編集，「ヒトＴ細胞クローン（Huma
n T Cell Clones）」，第８巻,243−333頁，エルシーバ
ー・サイエンス・出版社，ニューヨーク（1985）を参
照）。

II.開示されたcDNA由来のハイブリダイゼーションプロ
ーブを用いたGM−CSF cDNAの調製同一の生物学的活性を持つ近縁の蛋白質がしばしば存
在する。多く研究されている例は、以下のものである：（１）いわゆるアロザイムで、電気泳動的に区別され
る、一種の酵素のアレル型である；例えばセンザバウ
（Sensabaugh），法医学での多様性酵素の利用（The Ut
ilization of Polymorphic Enzymes in Forensic Scien
ce）」，Isozymes，11,137−154（1983）およびレウォ
ンティン（Lewontin），「進化学上の変化の遺伝学的基
礎（The Genetic Basis of Evolutionary Change）」
（コロンビア大学出版，ニューヨーク、（1974）の第３
章を参照のこと；（２）いわゆるアロアイプで、免疫グロブリンの定常領
域の多形性をいい、例えばフッド（Hood）ら，「Immuno
logy」,231−238頁（ベンジャミン／カミングス，メン
ロパーク,1978）および（３）ヘモグロビン、例えばディッカーソン（Dickerso
n）およびガイス（Geis），「Hemoglobin」（ベンジャ
ミン／カミングス，メンロパーク,1983）である。この
ような多形性はリンホカインにも存在すると考えられて
いる：（ｉ）PCTWO86/00639中では二種のヒトGM−CSFが
報告されており，（ii）ウォン（Wong）らはScience,23
5,1504−1508においてカワサキ（Kawasaki）らによって
Science,230,291−196（1985）に報告されたものとは異
なる型のヒトCSF−Ｉを報告している。

IV.GM−CSF活性のアッセイ GM−CSF活性を決定するために、造血系細胞、例えば
骨髄細胞あるいは胎児の臍帯血細胞が、遊離細胞浮遊液
とされた。バラバラの細胞を栄養および多くの場合ウシ
胎児血清を含む半固体（寒天）または粘性の高い（メチ
ルセルロース）培地中に固定する。適切な刺激因子の存
在下では個々の細胞は増殖して分化する。個々の細胞は
固定されているため、細胞が増殖および成熟するにつ
れ、コロニーが形成される。これらのコロニーは、７−
14日後に計数可能となる。GM−CSFアッセイを行うため
の詳細な解説は、バージェス（Burgess,A.），「成長因
子および幹細胞（Growth Factora snd stem Cells）,52
−55頁（アカデミックプレス，ニューヨーク,1984）、
およびメトカルフ（Metcalf）「造血系コロニー刺激因
子（The Hemopoietic Colony Stimulating Factors）」
（エルシーバー，ニューヨーク,1984）の103−125頁に
示されており、両文献の当該部分も本明細書に含まれる
ものとする。必要に応じてコロニーを単離し、スライド
グラスに載せて固定して、ライト／ギムザ染色すること
ができる（トッド−サンフォード（Todd−Sanford）
「実験室法による臨床診断（Clinical Diagnosis by La
boratory Methods）」,15版，デビッドソンおよびヘン
リー（Davidson and Henry）編,1974）。このようにし
て、個々のコロニーについての細胞種の形態学的な解析
が可能である。

血液疾患ではない患者から集めた骨髄細胞をフィコー
ル（Ficoll）（タイプ400,シグマ・ケミカル社、セント
ルイス,MO）上に重層し、遠心分離（600×g,20′）、界
面の細胞を除去した。これらの細胞を10％ウシ胎児血清
（FCS）を含むイスコフの改変ダルベッコ培地で２度洗
浄し、同じ培地中に再度懸濁し、プラスチックのペトリ
皿への接着によって、接着性細胞を除去した（接着性細
胞は、しばしばGM−CSF産生細胞である：メトカルフ，
上記）。非接着性細胞を20％FCS,50μＭの２−メルカプ
トエタノール,0.9％メチルセルロースおよび種々の濃度
のコロニー刺激因子を含むことが知られている培養上清
または試験サンプル上清を含む、イスコフの培地に10⁵
細胞/mlとなるように添加した。1mlの分画を35mmのペト
リ皿に添加し、37℃、飽和水蒸気、６％CO₂下で培養し
た。培養開始後、３日目に１ユニットのエリスロポエチ
ンを各皿に加えた。顆粒球−マクロファージのコロニー
および赤血球バーストを10−14日後に倒立顕微鏡を用い
て計数した。

ヘパリン中に集めた臍帯血液細胞は、600×ｇで６分
間遠心分離した。血漿と赤血球のピークの間の界面に存
在する白血球を、0.17N塩化アンモニウムおよび６％FCS
を含む試験管に移した。５分間氷上に放置した後、懸濁
液を4mlのFCSの下層になるように重層し、６分間600×
ｇで遠心分離した。骨髄細胞について述べた方法と同様
にして細胞塊をダルベッコの生理食塩水で洗浄し、フィ
コール、プラスチック接着を行った。低密度の非接着性
細胞を回収し、上述の方法で半固体培地中に10⁵細胞／
培養皿でまいた。

アッセイ終了後、個々のコロニーをスライドグラスに
載せ、ライト・ギムザ染色をして、細胞成分を決定し
た。好酸球はルクソールファストブルー（Luxol Fast B
lue）染色によって決定した（ジョンソンおよびメトカ
ルフ（Johnson,G.and Metcalf,D.）,Exp.Hematol.,8,54
9−561（1980）を参照）。

V.精製および薬剤組成物大腸菌（E.coli）、酵母または他の細胞中で発現され
る本発明のヒトGM−CSFは硫安沈澱、分画カラムクロマ
トグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、電気泳
動、アフィニティークロマトグラフィー等）、そして最
後に結晶化（一般的には「酵素精製および関連技術（En
zyme Purification and Related Techniques）,Methods
in Enzymology,22,233−577（1977）、およびスコープ
ス（Scopes,R.），「蛋白質の精製：原理と実際（Prote
in Purification:Principles and Practice）」，スプ
リンガー・フェアラーク，ニューヨーク,1982を参照）
を含む当業者に一般的な手法によって精製できる。詳細
な精製方法は主に使われた発現宿主によって決定され
る。例えば、哺乳類発現宿主（細胞）は、しばしば培地
中に血清が必要であるが、そのために血清蛋白質を除去
する余分な段階が必要となってくる。一方、成分既知の
培地で生育する酵母やバクテリアではたいていの場合、
分泌産物の分離はより単純である。いくつかの発現宿主
は発現産物を分泌しないこともあり、このような場合、
発現宿主の破砕物あるいは抽出物から産物を精製しなけ
ればならない。これらの全ての場合において予想される
精製上の問題は、生化学的な精製法の標準的な手法によ
って解決可能である。

部分精製あるいは完全精製されると、本発明のヒトGM
−CSFは、以下の研究の目的で使用できる。例えば、細
胞用培地（例えば、イーグルの最小培地、イスコフの改
変ダルベッコ培地またはRPMI1640,シグマ・ケミカル社
（セントルイス,MO）およびGIBCO Division（シャグリ
ンフォールス，オハイオ）から入手可能）の強化物質の
研究、および免疫アッセイ，免疫蛍光染色等に使う特異
的な免疫グロブリンを誘導するための抗原物質の研究
（一般的には、「免疫学的手法（Immunological Method
s）」，第ＩおよびII巻，レフコビッツおよびパーニス
（Lefkovits,I.and Pernis,B.）編，アカデミックプレ
ス，ニューヨーク（1979および1981），および「実験免
疫学のハンドブック（Handbook of Experimental Immun
ology）」，ワイア（Weir,D.）編，ブラックウェル・サ
ンエンティフィック・パブリケーションズ，セントルイ
ス,MO（1978）を参照）。

本発明におけるヒトGM−CSFは、例えば慢性の感染症
に対する自然の抵抗性を増加させる、血液細胞の再生を
促す、等の薬剤組成物中にも使用されるであろう。故
に、移植の必要なリュウマチ性関節炎、癌の化学療法、
高齢、免疫抑制剤等による免疫不全症の患者は、直接こ
のようなポリペプチドを用いて治療できる。あるいは、
ある人の造血細胞を体外で維持および／または増殖また
は分化させ、同一固体あるいは別の固体に再導入して治
療効果を高めることが出来るであろう。これらの組成物
は、免疫系の様々な成分を選択的に単独でまたはよく知
られた他の薬剤とともに刺激することができる。特にこ
の組成物は、リンホカイン等他の免疫反応性物質（例え
ばIL−１、IL−２、IL−３、IL−４、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF
等）を含むであろう。

本発明のヒトGM−CSFを含む薬剤組成物は、PCT/US86/
02464の44頁27行〜45頁21行に記載されている方法で調
製し、使用できる。特に、調製物単位量あたりの活性物
質の量は、用途および活性含有物の効力に応じて変化
し、または１μｇから100mgの値で調整されよう。

VI.発現系一旦本発明のcDNAがクローニングされると、幅広い発
現系（即ち、宿主−発現ベクターの組み合わせ）が、そ
の蛋白質の産生のために使用可能である。可能な宿主種
はバクテリア、酵母、昆虫、哺乳類類等を含むが、それ
に限られるものではない。発現系の選択およびその蛋白
質産生の最適化は、以下の多くの要因の考慮とバランス
が必要である。即ち、（１）発現される蛋白質の性質、
例えば、発現蛋白質はいくつかの宿主生物に対して毒性
を持つことがあり、またそれは宿主プロテアーゼの分解
を受けることがあり、またはある宿主中では、不活性型
や不溶性型で発現されるかもしれない、（２）目的の単
に対応するメッセンジャーRNA（mRNA）の性質、例えば
そのmRNAが宿主エンドヌクレアーゼに特に切断されやす
い配列を持つことがあり、そのためにmRNAの機能的な寿
命が極端に短くなる、あるいはmRNAが二次構造を取り、
リボソーム結合部位もしくは開始コドンを覆ってしまう
ことがあり、そのために或る宿主中では翻訳の開始が阻
害される、（３）コード領域に隣接する３′−および
５′−領域中の宿主許容性発現抑制領域の選択、入手可
能性および配置−これはプロモーター、５′−および
３′−プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写終
結因子、エンハンサー、ポリアデニル酸結合部位、キャ
ップ部位、イントロン−スプライス部位等を含む、
（４）その蛋白質が宿主によって切断され得る分泌シグ
ナル配列を持つか、または宿主性のシグナル配列をコー
ドする発現制御配列が成熟蛋白質をコードする領域中で
スプライスされないか、（５）宿主の感染または形質転
換の可能な形態および効率、そして発現は一過性が好ま
しいか、恒常的なものが好ましいか、（６）蛋白質の発
現のために必要な宿主培養系の規模及び費用、（７）転
写後の修飾は必要か、また必要ならどのような種類か；
例えば必要なグリコシル化の程度と種類で宿主を選択し
なければならない（例えば、ウイおよびウォルド（Uy a
nd Wold）,Science,198,890−896（1977））、（８）発
現した蛋白質を宿主および／または培地中の蛋白質およ
び他の物質から分離する方法の用意さ、例えばある場合
には後の精製段階のために特殊なシグナル配列を持つ融
合蛋白質を発現することが望ましい、（９）選択された
宿主中での当該ベクターの安定性およびコピー数、例え
ばホフシュナイダー（hofschneider）ら編，「大腸菌以
外の微生物での遺伝子クローニング（Gene Cloning in
Organisms Other than E.coli）」（スプリンガーフェ
アラーク，ベルリン,1982）、および（10）一般に知ら
れる類似の要因。

上述の要因に着目した、ある発現系の選択および／ま
たは修飾に関する指針を提供する多くの総説が入手可能
である：例えば、クルーン（Kroon）編，「遺伝子：構
造および発現（Genes:Structure and Expression）」の
中の、ドゥベールおよびシェパード（de Boer and Shep
ard），「大腸菌での外来遺伝子の発現を最適化する手
段（Strategies for Optimizing Foreign Gene Express
ion in Escherichia Coli）」,205−247;（ジョンワイ
リー＆サンズ，ニューヨーク,1983）は、いくつかの大
腸菌発現系を総説しており、クッヒャーラパティ（Kuch
erlapati）ら,Critical Reviews in Biochemistry,16
（４）,349−379（1984）およびバネルジ（Banerji）
ら,Genetic Engineering,5,19−31（1983）は、哺乳類
細胞の感染および形質転換法を総説し；レツニコフ（Re
znikoff）およびゴールド（Gold）編，「遺伝子発現の
最大化（Maximizing Gene Expression）」（バアーワー
ズ（Butterworths），ボストン,1986）は、大腸菌、酵
母および哺乳類細胞における遺伝子発現のトピックをい
くつか総説しており；スィリー（Thilly），「哺乳類細
胞工学（Mammalian Cell Technology）」（バターワー
ズ（Butterworths），ボストン,1986）は、哺乳類発現
系を総説している。

同様に、本発明における使用に適した発現ベクターを
作製および／または修飾するためのcDNAおよび発現制御
領域を結合および／または操作する方法および条件を記
載した多くの総説が入手可能である：例えばマニアチス
の「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l）」〔コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory）,1982〕；グロー
バー（Glover），「DNAクローニング：実際的アプロー
チ（DNA Cloning:A Practical Approach），第Ｉおよび
II巻（IRLプレス、オックスフォード,1985）；およびパ
ーバル（Perbal）「分子クローニングの実用ガイド（A
Practical Guide to Molecular Cloning）」（ジョンワ
イリー＆サンズ，ニューヨーク,1984）。

一般的には、本発明のcDNAの挿入のため発現ベクター
中に多くの部位を選択することが可能である。このよう
な部位は、通常それを切る制限エンドヌクレアーゼによ
って命名されており、当業者によって非常によく知られ
ている。組換えDNA分子を作製するため、このような部
位へDNA配列を挿入する種々の方法も非常によく知られ
ている。これらは、例えば、dG−dcまたはdA−dTによる
テーリング、直接のライゲーション、合成リンカー、エ
キソヌクレアーゼおよびライゲーションまたはDNAポリ
メラーゼおよびライゲーションに引き続く適切な一本鎖
鋳型によるDNA鎖伸長に続くポリメラーゼを用いた修復
反応を含む。

宿主培養液中の細胞のトランスフェクションおよび／
または形質転換を行う前にしばしば多量の本発明のcDNA
を含むベクターを得ることが必要となる。このために、
ベクターはしばしば最終的に発現に使用されるものとは
別の生物（クローニング宿主）中で、有意な発現を行わ
ずに増幅される。そして増幅の後、標準的な方法、例え
ばマニアチスら（上述）により記載された方法を用い
て、ベクターはクローニング宿主より分離される。

DNAの消化とは多くの場合、DNAのある領域にのみ働く
酵素を用いたDNAの触媒的切断を意味する。殆どの場
合、このような酵素は制限エンドヌクレアーゼであり、
それぞれが特異的に働くDNA上の部位は制限サイトと呼
ばれている。ここで用られる種々の制限酵素は、市販品
として入手可能なものであり、酵素販売者によって確立
されたそれらの反応条件、補助因子、および他の条件が
使用される。一般的には、約１マイクログラムのプラス
ミドまたはDNA断片が、約１ユニットの酵素とともに、
約20マイクロリットルの緩衝液中で使用される。特定の
制限酵素に対する適切な緩衝液および基質量は、製造者
によって指定されている。通常37℃で１時間のインキュ
ベーション時間が用いられているが、販売者の説明に従
って変化しうる。インキュベーションの後、蛋白質はフ
ェノールおよびクロロホルム抽出によって除去され、消
化された核酸は水相からエタノール沈澱によって回収さ
れる。

制限（酵素）（または他の）消化物からのDNA断片の
抽出または精製とは、消化物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離、既知分子量マーカーDNA断片との
移動度の比較による目的の断片の同定、目的の断片を含
むゲル断片の切除およびDNAからのゲルの分離を意味す
る。抽出方法は、よくしられている。例えばローン（La
wn）ら,Nucl.Acid Res.,9,6103−6114（1981）；ゲデル
（Goeddell）ら,Nucl.Acid Res.,8,4057（1980）および
マニアチスら（上述）を参照。

ライゲーションとは二つの二本鎖DNA間にホスホジエ
ステル結合を形成するプロセスをいう。ライゲーション
は10ユニットのT4DNAリガーゼをライゲーションするお
およそ等モル量のDNA断片0.5マイクログラムに加えると
いうような既知の条件および緩衝液で行われる。

プラスミドの増幅とは、適切な宿主を形質転換し、プ
ラスミドの総数を増すために宿主を増殖させることであ
る。

キナーゼ処理されたDNA断片とは、ポリヌクレオチド
キナーゼによってリン酸化された断片を示す。このよう
な処理は５′−リン酸基を欠くDNA断片のライゲーショ
ンの効果を上昇させる。

適切な発現ベクターは、大腸菌（E.coil）由来のプラ
スミド、例えば、Col El.pCRl,pBR322,pMB9およびそれ
らの誘導体、より広範な宿主のプラスミド例えばRP4、
ラムダファージなどのファージDNAおよびそのような誘
導体,M13等を含む。原核細胞のポリペプチドを融合ある
いは非融合形で、真核細胞の蛋白質を発現するための、
さらなるE.coliベクターは、マチアチスら（上述）の第
12章に記載されている。また、リッグス（Riggs）は米
国特許4,431,739号で、さらにE.coli発現系を開示して
おり、これはこの参照によって本明細書に含まれている
ものとする。

一般的に使用されている原核生物のプロモーターは、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース
プロモーター系（チャン（Chang）ら,Nature,275,615
（1978）；イタクラ（Itakura）ら,Science,198,1056
（1977）；ゲデル（Goeddel）ら,Nature,281,544（197
9）；およびトリプトファン（Trp）プロモーター系（ゲ
デルら,Nucl.Acid Res.,8,4057（1980）；ヨーロッパ特
許出願公開0036776）を含む。こられが最も一般的に用
いられているものである一方、他の微生物由来のプロモ
ーターも発見され使用されており、それらのヌクレオチ
ド配列に関する詳細が発表されて、当業者がそれを機能
的にプラスミドベクターとライゲートすることが可能に
なっている；例えばジーベンリスト（Siebenlist）ら,C
ell,20,269（1980）。

大腸菌中での高頻度発現に特に有用な原核細胞性のプ
ロモーターは、tacプロモーターであり、ドウボア（de
Boer）によって米国特許4,551,433号に開示されてい
る。この参照によってこの開示も本明細書に含まれる。
大腸菌宿主のための分泌発現ベクターも入手可能であ
る。特にグライエブ（Ghrayeb）らによってEMBO Journa
l,3,2437−2442（1984）に開示された、pIN−III−ompA
ベクターは有用であり、ここでは転写されるcDNAはompA
蛋白質のシグナルペプチドをコードするE.coli ompA遺
伝子の一部に融合されており、このため、成熟した蛋白
質はバクテリアの細胞周辺腔に分泌される。同様に米国
特許4,336,336号および4,338,397号は原核生物のための
分泌発現ベクターを開示している。この参照によって、
上記文献は本明細書に含まれる。

E.coli株例えばW3110（ATCC 27325）、JA221,C600,ED
767,DH1,LE392,HB101、X1776（ATCC 31224）,X2282,RP1
（ATCC 31343）,MRCI;枯草菌（Bacillus subtilus）の
株；およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella t
yphimurium）またはセラチア・マルセッセンス（Serrat
ia marcescens）等の他の腸内細菌、およびシュードモ
ナス（Pseudomonas）属の種々の種を含めて、各種バク
テリア株は原核生物の発現ベクターの適切な宿主であ
る。真核細胞の蛋白質の発現に有用なE.coli K12X1776
等のバクテリア株の誘導法は、カーチス（Curtis）によ
り米国特許4,190,495号に開示されている。従ってこの
特許の内容は本明細書に含まれる。

酵母等の真核微生物も本発明における蛋白質の発現に
使用可能である。サッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cereviciae）、即ち一般的なパン酵母は真核微
生物の中で最も一般的に使われているが、多くの他の株
も一般的に量可能である。サッカロミセスの中での発現
にはプラスミドYRp7が使用される。例えばスティンコー
ム（Stinchomb）ら、Nature,282,39（1979）、キングス
マン（Kingsman）ら、Gene,7,141（1979）、およびチェ
ンパー（Tschemper）ら、Gene,10,157（1980）。これら
のプラスミドは、既にトリプトファン中で生育出来ない
酵母の変異株の選択マーカーを提供するtrp1遺伝子を含
んでいる。例えば、ATCC 44076またはPEP40−１（ジョ
ーンズ（Jones）,Genetics,85,12（1977））。これによ
って酵母宿主細胞ゲノム中にtrp1障害がある場合、トリ
プトファン不存在下で生育させることにより形質転換を
検出するための有用な環境が提供される。さらなる酵母
のためのベクターは、ミヤジマ（Miyajima）ら,Nucl.Ac
id Res.,12,6397−6414（1984）によって開示されたpGA
Lプラスミド、およびベグス（Beggs）,Nature,275,104
−109（1978）によって開示された２μｍプラスミドを
含む。

酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は以下のも
のを含む:3−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモータ
ー（ヒッツェマン（Hitzeman）ら,J.Biol.Chem.,255,20
73（1980））またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセ
ルリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリ
ン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよ
びグルコキナーゼ等の解糖系の酵母のプロモーター（ヘ
ス（Hess）ら,J.Adv.Enzymen Reg.,7,149（1968）；ホ
ランド（Holland）ら,Biochemistry,17,4900（197
8））。適当な発現プラスミドを構築する際には、発現
してポリアデニル化および転写終結をするために、配列
の３′−末端に隣接してこれらの遺伝子に関する終結配
列が、発現ベクター中にライゲーションされる。生育条
件によって転写が制御される付加的な利点を持つ他のプ
ロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチ
ロクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝にかかわ
る消化酵素、および前述のグリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよびガラクト
ースの利用に関する酵素（ホランド，前述）のプロモー
ター領域である。また更に他の制御可能なプロモーター
は、メタロチオネインプロモーター系であり、フォーゲ
ル（Fogel）らによって米国特許4,511,652号に開示され
ている。この米国特許の内容も本明細書に含まれる。事
実上、酵母に使用可能なプロモーター、複製開始点およ
び転写終結配列を含むプラスミドベクターは全て適当で
ある。

サッカロミセス・セレビシエ宿主のための分泌発現ベ
クター、例えばミヤジマ（Miyajima）らによってGene,3
7,155−161（1985）に開示されたpMFα8;ヒッツェマン
（Hitzeman）らによってScience,219,620−625（1983）
に開示されたYEpIPT;ブレイク（Brake）らによりProc.N
atl.Acad.Sci.USA,81,4642−4646（1984）およびブレイ
クによりヨーロッパ特許出願0116201号に開示されたpY
αEGF−21;およびシン（Singh）によりヨーロッパ特許
出願0123544号およびカッジャン（Kurjan）らにより米
国特許4,546,082に開示されたプラスミド等は利用可能
である。

原核および親核の微生物に加え、多細胞生物由来の細
胞よりなる発現系が本発明における蛋白質を産生するた
めに使用される。特に興味が持たれるのは、その翻訳後
のプロセッシング機構が、より生物学的に活性のある哺
乳類の蛋白質を作りやすいと考えられる哺乳類発現系で
ある。哺乳類の宿主に対しては、ベクターとしていくつ
かのDNA腫瘍ウイルスが用られる：例えばトゥーズ（Too
ze）編，「DNA腫瘍ウイルス（DNA Tumor Viruses）」，
第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー,N.
Y.,1981）をその生物学の総説として参照。特に重要な
ものは、バクテリアの複製制御配列と結合したSV40複
製、転写、および／または翻訳制御配列を含む種々のベ
クターである。例えば、オカヤマおよびバーグ（Okayam
a and Berg）によって開発され、Mol.Cell.Biol.2,161
−170（1982）およびMol.Cell.Biol.3,280−289（198
3）に開示されているpcDベクター（参照により本明細書
に含まれる）；ハマー（Hamer）によりGenetic Enginee
ring,12,83−100（1980）および米国特許4,599,308に開
示されているSV40ベクター（参照により本明細書に含ま
れる）；カウフマンおよびシャープ（Kaufman and Shar
p）によりMol.Cell.Biol.2,1304−1219（1982）におよ
びカウフマンらによりヨーロッパ特許出願8406107号に
開示された、付加的にアデノウイルスの制御領域を含む
ベクター（参照により本明細書に含まれる）。サルの細
胞は多くの場合上述のベクターに望ましい宿主である。
このようなSV40ori配列と天然とＡ遺伝子を含むベクタ
ーはサルの細胞中で（非自律的に増幅するプラスミドよ
りも高いコピー数および／またはより安定なコピー数を
与えて）自律的に増幅することができる。その上、SV40
ori配列を含み、天然のＡ遺伝子持たずCOS7サル由来細
胞中で高コピー数に自律的（然し安定ではない）に増幅
できるぺくがグルツマン（Gluzman）によりCell,23,175
−182（1982）に記載されており、ATCC（寄託番号CRL 1
651）から入手可能である。上述のSV40を基本とするベ
クターはまた、宿主細胞のDNAに組み込まれることによ
り、マウスＬ細胞糖の他の哺乳類細胞を形質転換でき
る。

SV40を基本とするベクターの他に、本発明における使
用に適切な哺乳類発現系は以下のものを含むが、これら
に限られるものではない；（ｉ）サーバー（Sarver）ら
によりGenetic Engineering,5,173−190（1983）に開示
されたBPV−pBR322ハイブリッドおよびディマイオ（DiM
aio）らによってProc.Natl.Acad.Sci.USA,79,4030−403
4（1982）にウシおよびマウスの細胞を形質転換するた
めに開示されたもののようなウシパピローマウイルス
（BPV）配列を含むベクター；（ii）エプスタイン−バ
ールウイルス（EBV）配列を含むベクター、例えばヒト
およびサルの細胞を含む種々の哺乳類細胞の安定な形質
転換のためEBV oriP配列（核抗原EBNA−１のコードはい
を含む）を持つプラスミドで、イエーツ（Yates）らに
よりNature,313,812−815（1985）に、ライスマン（Rei
sman）らによりMol.Cell.Biol.,1822−1832（1985）
に、イエーツらによりProc.Natl.Acad.Sci.USA,81,3806
−3810（1984）に、およびサグデン（Sugden）らにより
Mol.Cell.Biol.,5,410−413（1985）に開示されている
もの；（iii）マウスおよびハムスターの細胞を形質転
換するためのネズミ類ポリオーマウイルス配列を含むベ
クター。例えば、オハラ（Ｏ′Hara）,J.Mol.Biol.,15
1,203（1981）；（iv）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhf
r）遺伝子を持つベクター；例えば、アルト（Alt）ら,
J.BiOl.Chem.,253,1357−1370（1978）で、これはメト
トレキセート処理によりネズミ類ゲノム（例えばdhfr活
性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞
株）に共に組み込まれた隣接するコード領域とともに複
製される。これは例えば、アーラム（Urlamb）らによ
り、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216（1980）に記載さ
れている；および（ｖ）アクセル（Axel）らにより米国
特許4,399,216に開示されている共形質転換系。入手可
能なDNA腫瘍ウイルスおよびレトロウイルス由来の種々
な要素、例えば複製開始点、エンハンサー配列（ラウス
肉腫ウイルス由来のロングターミナルリピート（long t
erminal repeat）配列（RSV−LTR）等で、ゴーマン（Go
rman）らにより、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6777−67
81（1982）に開示されている）、イントロン−スプライ
ス部位、ポリアデニル化部位等を用いることによりさら
なる哺乳類発現ベクターを構築、あるいは既存のものを
改変することが出来る。

無脊椎動物の発現系も本発明における使用のために構
築できる。例えばカイコ、Bombyx moriの幼虫にバキュ
ロウイルスベクター、BmNPVを感染させる。これはマエ
ダ（Maeda）らにより、Nature,315,892−894（1985）
に、また細胞工学（Saibo Kohaku）,4,767−779（198
5）に記載されている。

実施例以下の実施例は本発明を説明するためのものである。
cDNAライブラリー、ベクター、および宿主の選択、また
試薬の濃度、温度、および他の変数の値は、単に本発明
の適用を例示するためのものであり、これがその製薬で
あると考えられるものではない。

実施例は成熟GM−CSF（127アミノ酸残基）の産生およ
び精製について記述する。

実施例I.末梢血リンパ球及びＴ細胞クローンからのDNA
ライブラリーの構築、cDNAクローンの単離及びCOS7サル
由来細胞中での発現 cDNAライブラリーは、Ｔ−７と命名されたヒトのクロ
ーン化Ｔ細胞株およびヒトの末梢血リンパ球（PBL）か
ら単離したmRNAより構築した。ライブラリーはpcDプラ
スミド中でオカヤマおよびバーク（上述）の方法に従っ
て構築した。Ｔ−７ライブラリーから単一のクローンを
単離した後、PBLライブラリー中に同一のクローンの存
在を確認した。

A.クローン化ヘルパーＴ細胞Ｔ−７と命名したヒトのＴ細胞クローンは、「Ｔリン
パ細胞クローンの単離、同定および利用（Isolation,Ch
aracterization and Utilization of T Lymphocyte Clo
nes）」，ファスマンおよびフィッチ（Fathman and Fit
ch）編，アカデミックプレス，ニューヨーク（1982）の
第36および37章に記載されている方法に従って単離し
た。細胞株は、10％の熱非働化ウシ胎児血清、５×10^-5
Ｍの２−ME、2mMのグルタミン、非必須アミノ酸および
必須ビタミン類を含むダルベッコの改変イーグル（DM
E）培地に、フィトヘマグルチニン（PHA）で刺激したヒ
ト末梢血リンパ球の培養上清を30％添加したもので0.5
×10⁵細胞/mlの濃度で継代培養した。

B.GM−CSF産生の誘導Ｔ−７細胞を５×10⁵/mlで４％熱非働化ウシ胎児血
清、５×10^-5Ｍの２−ME、2mMのグルタミン、非必須ア
ミノ酸および必須ビタミン類および４μg/mlのコンカナ
バリンＡ（ConA）を含むDME中で培養した。37℃、10％C
O₂下４〜６時間の培養後、細胞浮遊液を1500rpmで10分
間遠心分離した。細胞塊を回収し、直ちに−70℃に凍結
した。培養上清は濾過し（ナルゲン（Nalgene）−0.22
ミクロン）、増殖因子源として−80℃で保存した。上清
の一部は、ConA処理による細胞株の誘導を確認するため
CSF活性をアッセイした（後述）。

PBLは７μg/mlのConAを用いた以外は同じ条件で誘導
した。

C.mRNAの抽出細胞の全RNAをチャーグウィン（Chirgwin,J.）ら（Bi
ochemistrym,18、5294−5299（1978））のグアニジンイ
ソチオシアネート法により抽出した。ConAで誘導したＴ
−７細胞またはPBL（刺激後４時間）の凍結した細胞塊
をグアニジンイソチオシアン酸溶解溶液に懸濁した。1.
5×10⁸個の細胞に対し、20mlの溶解溶液を用いた。細胞
塊をピペットで再懸濁し、注射器を用いて16ゲージの注
射針に４回通すことによりDNA切断した。溶解液を40ml
のポリアロマー遠心管中、20mlの5.7M CsCl,10mM EDTA
上に重層した。この溶液をベックマン（Bickman）社SW2
8ローター（Beckman Instruments,Inc.,Palo Alto,CA）
を用い、25000rpm,15℃で40時間遠心分離した。DNAを含
むグアニジンイソチアン酸の層を上部から界面まで吸い
出した。管壁および界面を２〜3mlのグアニジンイソチ
オシアン酸溶解溶液で洗浄した。遠心管をはさみを用い
て界面の下で切断し、CsCl溶液を排出した。RNA塊を冷
却した70エタノールで２回洗浄し、500μｌの10mMトリ
ス塩酸,pH7.4,1mM EDTA,0.05％SDSに再懸濁した。50μ
ｌの3M酢酸ナトリウムを添加し、RNAを1mlのエタノール
で沈澱させた。遠心分離によって0.3mgの全RNAが得ら
れ、RNA塊を冷エタノールで１回洗浄した。

洗浄し、乾燥した全RNAを900μｌのオリゴ（dT）溶出
緩衝液（10mMトリス塩酸,pH7.4,1mM EDTA,0.5％SDS）に
再懸濁した。RNAは３分間68℃で加熱しその後氷上で冷
却した。100μｌの5M NaClを添加した。RNA試料を結合
緩衝液（10mMトリス塩酸,pH7.4,1mM EDTA,0.5M NaCl,0.
5％SDS）で平衡化した1.0mlのオリゴ（dT）セルロース
カラム（タイプ3,コラボラティブリサーチ，ウォルサ
ム,MA）に添加した。カラムの流出液は更に２回カラム
に添加した。次にカラムを0mlの結合緩衝液で洗浄し
た。溶出緩衝液で洗浄し、ポリ(A)⁺のmRNAを回収した。
RNAは通常溶出緩衝液の最初の2mlで溶出した。RNAを0.1
1容の3M酢酸ナトリウム（pH6）および２容のエタノール
で沈澱した。RNA塊を遠心分離によって回収し、冷エタ
ノールで２回洗浄して乾燥させた。RNA塊を水に再懸濁
し、一部を希釈して260nmの吸光度を測定した。

D.pcD cDNAライブラリーの構築１）部および２）部，段階１）〜５）はPCT/US85/024
64の56〜60頁に開示されているようにして行った。ただ
しpcDV1 DNA（57頁,3〜４行目）はNsilエンドヌクレア
ーゼを用いて消化した。

（cDNAライブラリー調製の）第６段階： E.coilの形質転換。形質転換はコーエン（Cohen）ら
によりProc.Natl.Acad.Sci.USA,69、2110−2114（197
2）に記載された手段を若干改変して行った。カサバダ
ンおよびコーエン（Casabadan,M.and Cohen,S.）によっ
てJ.Mol.Biol.,138,179−207（1980）に記載されたE.co
li K−12株,MC1061を37℃で20mlのＬ−ブロス中、600nm
の吸光度が0.5になるまで培養した。細胞を遠心分離し
て集め、50mM CaCl₂を含む10mMトリス塩酸（pH7.3）10m
lに懸濁し、０℃で５分間遠心分離した。細胞を再び上
記の緩衝液2ml中に懸濁し、再び０℃で５分間インキュ
ベートした；次に0.2mlの細胞懸濁液を第５段階のDNA溶
液0.1mlと混合し、これを０℃で15分インキュベートし
た。次に細胞を37℃に２分間置き、次に室温に10分置い
た；次に0.5mlのＬ−ブロスを加え、37℃で30分間イン
キュベートし、その後2.5mlのＬ−ブロス軟寒天と42℃
で混合し、1mlあたり50μｇのアンピシリンを含むＬ−
ブロス寒天上に広げた。37℃で12〜24時間インキュベー
トした後、個々のコロニーを滅菌爪楊枝を用いて単離し
た。全体で約５×10⁴の独立したcDNAクローンが生産さ
れた。

E.DNAトランスフェクション（感染）によるヒトＴ細胞c
DNAライブラリーのスクリーニング 10⁴の独立したクローンを任意にＴ細胞cDNAライブラ
リーから抽出し、マイクロタイター培養皿のウエルで50
μg/mlのアンピシリンおよび７％のジメチルスルホキシ
ドを含むＬ−ブロス200μｌ中で増殖させた。マイクロ
タイアー培養皿より48のcDNAクローンが調製され、プー
ルされた。このプールから40のクローンを100μg/mlア
ンピシリンを含むＬ−ブロス中で１リットルまで増殖さ
せた。各培養物からプラスミドDNAを単離し、CsClグラ
ジエントを２回通して精製した。各プール由来のDNA配
列以下の方法でCOS7サル細胞に感染（トランスフェクシ
ョン）させた。

感染の前日、約10⁶のCOS7サル細胞を別々の60mmプレ
ートに、10％ウシ胎児血清および2Mグルタミンを含むDM
E中で播種した。感染のため、各プレートから培地を吸
引し、50mmトリス塩酸（pH7.4）,400μg/ml DEAE−デキ
ストランおよび15μｇの被検プラスミドDNAを含むDME1.
5mlで置換した。プレートを37℃で４時間インキュベー
トし、DNAを含む培地を除去、プレートを2mlの無血清DM
Eで２回洗浄した。プレートに150μＭクロロキンを含む
DMEを加え、さらに37℃で３時間インキュベートした。
プレートをDMEで１回洗浄し、４％のウシ胎児血清、2mm
グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むDM
Eを添加した。こののち、細胞を37℃で72時間インキュ
ベートした。培養上清を集め、上述の方法でGM−CSFの
活性をアッセイした。

４つのプール（グループ1A、3B、7Aおよび14A）がヒ
トGM−CSF活性を示した（下記第Ｉ表を参照）。各グル
ープをさらに、それぞれ、もともとプールされたクロー
ンのうち８つを含むような６つのプールに分割した。各
々のプール由来のサブプールのうち１つが感染アッセイ
で陽性であった。但し7Aは２つの陽性なサブプールを産
生した。４または５つのサブプールの中の各プラスミド
を別々にCOS7細胞に感染させた。３−8a、７−1a、７−
4d、および14−1eと名付けられた４つの独立したクロー
ンがGM−CSF活性を有した。制限エンドヌクレアーゼ解
析によってこれらのクローンの全てが実質的に同じ構造
を有することが示された。

第II表は２点の臍帯血アッセイにおける各感染サンプ
ルによって刺激された造血コロニーの数を示す。クラス
ターは20から50細胞を意味し、小コロニーは51から150
細胞、そしてコロニーは150以上の細胞を示す。

実質的に完全長cDNA挿入物を持つプラスミド（pcD−h
uman−GM−CSF）は第２図に示されており、このプラス
ミドを持つE.coliバクテリア（MC1061）はATCCに寄託さ
れた（寄託番号39923）。第２図ではpcD発現ベクターに
含まれる776bpのcDNA挿入物のSV40早期プロモーターか
らの転写を矢印で示した。スプライスの供与および受容
部位が示されている。SV40由来のポリアデニル化シグナ
ルは、cDNA挿入の３′−末端に位置する。cDNA挿入物中
のGM−CSFコード領域が濃い影の部分で非コード領域は
薄い影の部分である。β−ラクタマーゼ遺伝子（Amp^r）
および複製開始点を含むベクター配列の残りの部分はpB
R322由来である。

M13ダイデオキシチェーンターミネーター法（サン
ガー（Sanger,F.）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463
−5467（1977））および改変マクサム−ギルバート法
（ルビンおよびシュミット（Rubin,C.and Schmidt,C.）
Nucl.Acid Res.,8,4613−4619（1981））の双方を用い
て３−8aの配列を決定した。cDNA挿入物は唯一の読み枠
を持つ。最初のATGは５′−末端から33−35ヌクレオチ
ドに存在し、ヌクレオチド265−467の終結暗号（TGA）
までの間に144コドンを持つ。

第III表はクローン３−8a、７−1a、７−4d、および1
4−1eのそれぞれの影響下で培養された約60のヒト骨髄
および臍帯血液コロニーの細胞組成物の崩壊の割合をパ
ーセント表示したものである。好酸球および他の細胞種
の混合コロニーが存在するのは、コロニーが一緒に生育
したためであろう。

実施例II SRαプロモーターを用いた哺乳類細胞中での
GM−CSFの発現上昇 SV40初期複製開始点のXhoI切断部位にHTLV（Ｉ）レト
ロウイルスのロングターミナルリピート（LTR）の断片
を挿入して構築されるプロモーター（SRαと名付ける）
を用いて様々な哺乳類細胞中でのGM−CSFの発現上昇が
なされる。LTR断片が存在するとCOSサル細胞（例えば寄
託番号CRL 1650またはCRL 1651としてATCCより入手可
能）およびCV1サル細胞（例えば寄託番号CCL 70としてA
TCCより入手可能）およびマウスＬ細胞（例えば、Ｌ−
Ｍ（TK^-）はATCCより寄託番号CCL 1.3として入手可能）
中でGM−CSFの発現は20−50倍に上昇する。合成DNA断片
よりSRαプロモーターを構築する方法を以下に示す。SR
αはATCC寄託番号67318のプラスミドpcD−huIL−３−22
−１からも得られる。

レトロウイルスのLTRはいろいろな系で発現を上昇さ
せることが示されている：例えばチェン（Chen）ら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,82,7285−7288（1985）；ゴーマ
ン（Gorman）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6777−678
1（1982）；テミン（Temin）,Cell,27,1−３（1981）；
およびルシウ（Luciw）ら,Cell,33,705−716（1983）が
ある。pL1のXhoI切断部位に挿入されたHTLV（Ｉ）LTR断
片は、完全なＲ領域およびR/U5境界から最初の下流のTa
qI切断部位まで（全部で39塩基）のU5領域の一部（第３
図でU5′と命名されている）を含む267塩基部分を含
む。HTLV（Ｉ）LTRの配列は、ヨシダ（Yoshida）らによ
りCurrent Topics in Microbiology and Immunology,11
5,157−175（1985）に開示されている。

HTLV（Ｉ）LTRは、実施例IVに記載した方法を用い、
４段階でプラスミドpL1に挿入され、第３図に示す改変
プラスミド,pL1′が作られた。まずpL1をBglIおよびXho
Iで消化し、大きい断片を単離する。次に大きい断片を
合成した1A/Bおよび2A/B（以下で定義する）と標準的な
ライゲーション混合物中で混合する。合成物1A/Bおよび
2A/Bは共に５′→３′の順に以下の者を含む;SV40oriの
BglI/XhoI断片,LTRのＲ領域の267塩基の５′−断片およ
びSmaI、SacI、NaeI、およびXhoIの順にそれぞれの切断
部位を含むポリリンカー。

ライゲーションの後、第一段階より得られるプラスミ
ドを増幅、抽出し、SmaIおよびSacIで消化して大きい断
片を抽出した。大きい断片を次に合成物3A/Bおよび4A/B
（以下に定義する）と、標準的なライゲーション混合物
中で混合した。

ライゲーションの後、第二段階より得られるプラスミ
ドを増幅、単離し、SacIおよびNaeIで消化し、大きい断
片を単離した。大きい断片を合成物5A/B（以下に定義す
る）と標準的なライゲーション混合物中で混合した。

ライゲーションの後、第三段階より得られるプラスミ
ドを増幅、単離し、NaeIおよびXhoIで消化し、大きい断
片を抽出した。大きい断片を合成物6A/Bおよび7A/B（以
下に定義する）と標準的なライゲーション混合物中で混
合し、pL1′と名付けた改変pL1プラスミドを作製した。

増幅の後、pL1′を精製し、HindIIIおよびXhoIで切断
し、SV40 oriおよびＲ−U5′を含む小さい断片を単離し
た。また別にプラスミドpcDV1（第４図に図示する）を
精製し、HindIIIおよびXhoIで消化し、pBR322 oriおよ
びAmp^r遺伝子を含む大きい断片を単離した。pL1′の小
さい断片とpcDV1の大きい断片をライゲーションし、そ
こから得られるプラスミドpcD（SRα）を増幅した。ま
た、別にプラスミドpcD−human−GM−CSFをXhoIで消化
し、GM−CSFのコード領域を含む小さい断片を単離し、X
hoIで消化したpcD（SRα）とライゲーションした。これ
らより得られる組換え体は、例えば細胞株HB101またはM
C1061等の大腸菌にトランスフェクションさせ、培養皿
にまいた。アンピシリン抵抗性のコードのバクテリアを
無作為に選び、別々に増幅させた。プラスミドを抽出、
精製し、そして上述の方法でCOS7サル細胞を感染させる
ために用いた。その培養上清のアッセイで、GM−CSF活
性が陽性なCOS7培養物は、目的のpcD（SRα）−hGM−CS
Fプラスミドを持つ。

実施例III.パン酵母中でのGM−CSFの発現天然のヒトGM−CSFのシグナルペプチドのコード領域
を除去し、プラスミドpMFα８の酵母α−因子接合フェ
ロモンのシグナルペプチドのコード領域と置換した。パ
ン酵母（Saccharomyces cereviciae）は、pMFα８によ
って形質転換され、接合因子/GM−CSF融合蛋白質を発現
し、成熟GM−CSFを培地中に分泌する。この実施例の結
合はミヤジマ（Miyajima）らによりEMBO Journal,5,119
3−1197（1986）にも記載されている。

パン酵母（Saccharomyces cereviciae）は接合型に特
異的なオリゴペプチドのフェロモンを分泌する。Matα
細胞はα−因子を分泌し、これはMatα細胞の生育を細
胞周期のG₁期で停止する（ソーナー（Thorner,J.），
「パン酵母の分子生物学（The Molecular Biology of t
he Yeast Saccharomyces），コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー，ニューヨーク（1981）；特に143−180
頁を参照）。α−因子は20アミノ酸のNH₂−末端シグナ
ル配列、それに続くさらなる60アミノ酸のリーダー配
列、および最後に成熟α−因子の配列の４回の同一な繰
り返しからなる大きい前駆体として最初は合成される。
この繰り返しはお互いから６または８個のアミノ酸のス
ペーサーにより隔てられている（Lys−Arg−Glu−Ala−
Glu−AlaおよびLys−Arg−Glu−Ala−Glu〔またはAsp〕
−Ala−Glu−Ala）。このプレプロα因子はいくつかの
特異的な部位で切断を受ける。最初のプロセッシング
は、KEX2産物によって触媒される。スペーサー配列中の
Lys−ArgペアのCOOH−末端の結合である：ジュリウス
（Julius）ら,Cell,37,1075−1089（1984）。カルボキ
シペプチダーゼＢ様の酵素がLys−ArgペアのNH₂−末端
側で切断する。最終の段階はSTE13によってコードされ
るジアミノペプチダーゼによるGlu−AlaまたはAsp−Ala
ペアの除去である。ブレイク（J.Brake）らは、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,81,4642−4646（1984）で成熟ヒト蛋
白質をコードする配列と第一プロセッシング部位の融合
によってこのような蛋白質が分泌されることを示した。

アルファ因子プロモーターおよび下流のリーダー配列
を他の要素とともに含む、pMFα８と名付けられた一般
的な酵母の発現ベクターは、ATCCに寄託番号40140で寄
託されている。これは以下のようにして構築することが
できる： MFα１遺伝子を持つ1.7kbのEcoRI断片（カージャン
（Kurjan,J.）およびヘルショウィッツ（Hershowitz,
I.）,Cell,30,933−943（1982））をM13mp8（ビエラお
よびメッシング（Viera,J,and Messing,J.）,Gene,19,2
59−268（1982））中にクローニングした。第一スペー
サー領域のリジンコドンのあとにHindIII切断部位を導
入するため、合成オリゴヌクレオチドTCTTTTATCCAAAGAT
ACCCを単鎖M13−MFα1 DNAとハイブリダイズし、オリゴ
ヌクレオチドプライマーをDNAポリメラーゼＩクレノ
ー断片を用い伸長した。S1ヌクレアーゼ処理の後、DNA
をEcoRIで切断し、MFα１プロモーターおよびリーダー
配列を含む断片をpUC8（ビエラおよびメッシング，上
述）のEcoRIおよび埋められたHindIII制限酵素切断部位
にクローニングした。望ましい構造のプラスミドが一つ
単離された（pMFα４Δ１と命名した）。pMFα４Δ１を
HindIIIによって切断し、dATPおよびdGTP存在下でDNAポ
リメラーゼＩクレノー断片を用いて部分的に補足した。
DNAをヤエナリのヌクレアーゼで処理し、オリゴヌクレ
オチドリンカー（GCCTCGAGGC）を結合した。得られたプ
ラスミド（pMFα５と命名した）は、アルギニンコドン
の直後にStuI切断部位、またその後にXhoI制限酵素切断
部位を持つ。S.cereviciae−E.coliのシャトルベクター
（pTRP584）は以下のようにして構築される。２μｍプ
ラスミドの複製開始点（ブローチ（Broach,J.）上述）
を含むPstI−XbaI断片をpTRP56（ミヤジマ（Miyajima）
ら,Mol.Cell.Biol.,4,407−414（1984）のClaI制限酵素
切断部位にクローニングし、TRP1−ZRS1断片中のStuI制
限部位をPvuIIリンカー挿入によってPvuII制限部位へ変
換した。基本となるpTRP56のKpnI制限部位はXhoIリンカ
ー挿入によりXhoIに転換した。そしてpTRP584のBamHI−
XhoI制限部位にpMFα５のBglII−XhoI断片を挿入するこ
とにより、一般的な分泌ベクターpMFα８を得た。

pMFα８にクローニングする前に、ゾラー（Zoller）
およびスミス（Smith）によりMethods in Enzymology,1
00,468−500（1983）に開示された方法を用い、M13mp8
中のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、GM
−CSF cDNA中にFspI制限部位を導入した。導入したFspI
部位によってpMFα８への挿入前に内因製のシグナルペ
プチドのコード領域および成熟蛋白質をコードする領域
の中間でcDNA挿入物を切断することができる。

簡単に述べると、完全なcDNA挿入物（第2A図を参照）
を含むpcD−human−GM−CSFのBamHi断片をM13mp8の複製
型にクローニングし、それを用いてE.coli JM101を形質
転換した。挿入物を含むM13mp8はイソプロピル−ベータ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）および５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドイル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド
（Ｘ−gal）を含む寒天上で透明なプラークより選択し
た。それぞれ選ばれたプラークに対応する８つのE.coli
JM101培養物から標準的な技術（遠心分離、上清よりポ
リエチレングリコールを用いたファージ粒子の除去、フ
ァージのコート蛋白質からDNAを分離するためのフェノ
ール抽出、およびエタノール沈澱）を用いて、それぞれ
単鎖のM13mp8DNAを調製した。

クロスハイブリダイゼーションおよびゲル電気泳動を
用いて決定したcDNA挿入物の方向に従って、８セットの
DNAを２つのサブセットに分類した。各サブセットの単
鎖DNAに対してそれぞれオリゴヌクレオチド特異的突然
変異誘発を行った。逆に２つのサブセット中のDNAを配
列決定し、正しい方向でcDNA挿入物を含む単鎖DNAを決
定することもできる。

以下の配列を持つ（ミスマッチ（不一致）を下線で示
した）20残基のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し
た（Applied Biosystems,Inc.,モデル380A,フォスター
シティー,CA）： GTCGTAGACGCGTGGGCGGG ３−リン酸化の後、20残基のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを約30倍過剰の単鎖DNA（約１μｇ）と混合し、
５μｌ容の0.5M NaCl中で65℃で５分間加熱し、室温で
１時間放置した。緩衝液および塩類の濃度は以下のよう
に調製した。100mM NaCl,20mMトリス塩酸でpH7.5,10mM
ジチオスレイトール,10mM MgCl₂,4種のデオキシヌクレ
オシド３リン酸を約400μＭずつ,ATPを約500μＭ。DNA
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）およびT4DNAリガーゼ
を加え、反応液を12℃でインキュベートした。二重鎖環
状DNAをアルカリ蔗糖密度勾配遠心法によって単離し、C
aCl₂処理した大腸菌JM101を形質転換するのに用いた。
プライマーで使用したものと同じ配列を持³²P標識した
オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼーション
を行い、変異Ｃ−DNAを含む大腸菌JM101のコロニーをス
クリーニングした。

増幅の後、変異を含むM13ファージをEspIおよびBamHI
を用いて消化し、（BamHI切断部位の突出端を平にする
ために）DNAポリメラーゼＩクレノー断片で処理し、ゲ
ル電気泳動にかけた。最後に抽出されたGM−CSFを含む
断片をpMFα８のStuI切断部位に挿入した。

サッカロミセス・セレビシエ20B−12（MATα trp1−2
89 pep4−３）酢酸リチウム法（イトウ（Ito）ら,J.Bac
teriol.,153,163−168（1983））によりpMFα８で形質
転換し、0.67％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、0.
5％カザミノ酸および２％グルコースを含む培地で培養
した。

臍帯血を用いたコロニーアッセイにより、酵母培養液
中に分泌されたGM−CSFを確認した。

実施例IV.大腸菌中でのGM−CSFの発現成熟ヒトGM−CSFのコード領域をompA蛋白質のシグナ
ルペプチドコード領域を含むベクターpIN−III−OmpA2
に挿入した。pIN−III−OmpA2はグライェブ（Ghrayeb）
らによりEMBO Journal,3,2437−2442（1984）に、およ
びマスイ（Masui）らによりBiotechnology,2,81−85（1
984）に開示されている。これらの文献の内容は参照に
より本明細書に含まれる。

この挿入は３段階で行った。最初に成熟GM−CSFコー
ド領域を含むpcD−human−GM−CSFのPstI/BamHI断片をM
13mp10の複製型（RF）のPstI/BamHI消化物に挿入し、点
特異的突然変異誘発により、成熟GM−CSFの基礎と成る
コドンに隣接して、そよびその５′−末端に、EcoRI部
位を導入した。第２に変異したM13mp10のEcoRI/BamHI断
片をpIN−III−OmpA2のEcoRI/BamHI消化物に挿入した。
最後にpIN−III−OmpA2中のOmpAシグナルペプチドコー
ド領域および成熟GM−CSFコード領域間の余分な９塩基
対の配列を点特異的突然変異誘発により除去した。全て
の場合においてM13の変異型は合成プライマーをプロー
ブとして検出した。

全ての制限酵素消化、DNAポリメラーゼ、キナーゼお
よびリガーゼの反応は、本質的にマニアチスらにより記
載された方法にしたがって行った。酵素はニューイング
ランドバイオラボ社およびベーリンガーマンハイム社よ
り購入した。プラスミド抽出はアルカル法（小規模：マ
ニアチスら，上記）またはその変法（大規模：ツラウス
キ（Zurawski）ら,J.Immunol.,137,3354−3360（1986）
で行った。点特異的突然変異誘発は、M13mp10ベクター
にサブクローニングされたDNA断片を用いて行った。10n
gのキナーゼ処理したプライマーDNAを50〜100ngの単鎖
鋳型DNAとリガーゼ緩衝液40μｌ中で混合した。この混
合物に100ngの直鎖M13RFを添加した。反応混合物は95℃
で10分間加熱した。アニーリングは室温で30分、次に４
℃で15分おいて行った。dNTP（50μＭ），リガーゼ（40
0U）およびクレノー（5U）を加え（総量50μｌ）、混合
物を30分間４℃で、次に１時間12℃でインキュベートし
た。混合物をJM101細胞中に形質転換し、IPTGおよびＸ
−galを含むＬ−ブロス（LB）プレートに接種した。白
色のプラークをマイクロタイター培養皿の150μl L−ブ
ロス中に楊子で移した。M13感染細胞をLBプレート上のJ
M101細胞層上に接着法を用いて移した。37℃で16時間の
インキュベーションの後、予め湿らせたニトロセルロー
ス紙をプラーク上に１分間接着させた。フィルターを0.
05M NaOHに３分間、中和緩衝液（3M NaCl,0.5Mトリス塩
酸,pH7.5）に15分間浸した。再度15分間新しい中和緩衝
液液に浸した後、フィルターを２×SSC中に移した。フ
ィルターを乾燥し、80℃で1.5時間加熱した。フィルタ
ーの前−ハイブリダイゼーション処理は、0.09Mトリス
塩酸,pH7.5,1×Denhardts,0.9M NaCl,0.1M ATP,1mM Pi,
1mM PP,0.5％NP40,6mM EDTAおよび0.2mg/mlの大腸菌tRN
A中、室温で３時間行った。³²Pで標識したプローブを加
え、更に室温で16時間インキュベートした。フィルター
は加熱しながら、オートラジオグラフィーで背景のカウ
ントが検出されなくなるまで６×SSC,0.1％SDS中で洗浄
した。必要に応じて、SSCの濃度を下げた。陽性プラー
クより単鎖DNAを単離し配列決定を行った。

DNAの配列形質転換委は標準的なダイデオキシ法（サ
ンガー（Sanger）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463−54
67（1977））を使用した。DNAのオリゴヌクレオチド
は、アプライドバイオシステムズ社380A合成機を用い
て、ホスホルアミダイト化学法によって合成した。

pcD−human−GM−CSFのPstI/BamHI断片をPstIおよびB
amHIで消化したM13mp10RFにクローニングした。標準的
な技術（メッシング，上述）を用い、この組成物の単鎖
DNAを調製し、第１図に示されているGM−CSFのＣ−DNA
配列の83と84塩基対の間にEcoRI切断部位（GAATTC）を
導入するために点と特異的突然変異誘発を行った。下記
の合成プライマーを使用した：５′−CTGCAGCATCTCTGAATTCGCACCCGCCCGCT−３′ EcoRI切断部位を下線で示した。挿入変異体の配列を
決定した後、GM−CSF C−DNAを含むM13のEcoRI/BamHI断
片をEcoRI/BamHIで消化したpIN−III−OmpA2に挿入し
て、大腸菌JM101中で増幅、単離し、XbaIおよびBamHIで
消化した。GM−CSF C−DNAを含むXbaI/BamHI断片をXbaI
/BamHIで消化したM13mp10RFに挿入した。単鎖DNAを標準
的な方法を用いて単離し、下記の合成プライマーを用い
て点特異的突然変異誘発を行った：５′−GTAGCGCAGGCC GCACCCGCCCGCT−３′GCTGAATTC プライマーの配列の間隙および下段の下線を付した配
列は、９塩基対の欠失およびその欠失した配列を示す。
欠失変異体の配列を確認した後、そのXbaI/BamHI断片を
単離し、XbaI/BamHIで消化したpIN−III−OmpA2とライ
ゲーションして、大腸菌JM101を形質転換するために用
いる最終的な構築物を得た。

実施例V.大腸菌中で発現したGM−CSFの精製大腸菌（E.coli）の可溶性抽出物から順に、陰イオン
交換、色素−リガンドアフィニティー、ゲル漉過、およ
び逆相クロマトグラフィーを行って、GM−CSFを精製し
た。望ましくは一連のクロマトグラフィーはQAE（第四
アミノエチル）カラムクロマトグラフィー、マトレック
ス（Matrex）ゲルRed Aカラムクロマトグラフィー、限
外漉過による濃縮および／または硫酸アンモニウム沈
澱、セファデックス（Sephadex）Ｇ−100ゲル漉過、お
よびFPLCまたはHPLC逆相クロマトグラフィーのいずれか
を含む。この操作による最終票品は、特異性の高い生物
学的活性、95−100％の電気泳動的純度、低量の発熱物
質そして低量の大腸菌由来の夾雑物またはGM−CSFの誘
導物を示した。

特に示さない限り、全ての操作は２−15℃で行った。
各段階でコマジー青結合アッセイにより蛋白質濃度を決
定した。pH測定は＋0.2単位で、誘電率測定は＋3mSの巾
で変化し得る。どのクロマトグラフィー操作において
も、期待される精製度が得られない場合、溶出過区分を
集め、同じカラムで再クロマトグラフィー、または以前
の操作、または以前の一連の操作を再び行った。硫黄ア
ンモニウム沈澱および／または限外漉過法は、蛋白質を
濃縮および／または保存するために行った；例えばステ
ップＣの操作である。カラムの平衡化および溶出に使用
するものを含む全ての溶液は、使用前に0.2μ膜で漉過
した。ステップＤ以降の全ての溶液の調製にはUSPXIX級
の水を使用した。

A.細胞の殺滅および蛋白質の抽出 85％のリン酸を加えてpHを4.5に、次に50％トリクロ
ロ酢酸を加えてpHを2.0に調節し、細胞を殺した。0.2μ
膜で漉過した後、水を加えて誘電率を15−20mSに調節し
た。低い誘電率は、GM−CSFをQAEカラムに結合させるた
めに必要な希釈を最小限に抑えるために必要である。

B.第四アミノエチル（QAE）カラムクロマトグラフィー必要に応じて中和した抽出物を、水酸化ナトリウムま
たは塩酸で適切なpH7.5に調節した。中和した抽出物の
誘電率は、脱イオン水を加えて５−10mSに調節した。QA
Eカラムは少なくとも２〜３倍のカラム容の20mMトリス
塩酸,pH7.5で平衡化した。GM−CSFを含む抽出物は、1ml
の樹脂あたり20mg以下でカラムに添加した。カラムは平
衡化に用いたものと同じ緩衝液に溶かした塩化ナトリウ
ムの濃度勾配で０−0.5Mの巾で、10−20倍のカラム容で
溶出した。溶出分画をドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基ずいて集
め、ステップＣのクロマトグラフィーを行った。

C.色素アフィニティークロマトグラフィー QAEカラムからの溶出分画は、誘電率５−10mSまで脱
イオン水で希釈し、２〜３カラム容の20mMトリス塩酸,p
H7.5で平衡化したRedアフィニティーカラム（例えばア
ガロース支持体に結合したプロシオンレッド（Procion
Red）HE3Bに添加した。カラムに加える蛋白質の量は1ml
のゲル当たり10mgを越えてはならない。カラムは３〜４
カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は５〜15容の
20mMトリス塩酸,pH7.5に溶かした０〜0.75Mの塩化ナト
リウムの濃度勾配で行った。ステップＤで用いる分画は
SDS−PAGEの結果に基づいて集められた。

D.限外漉過および／または硫酸アンモニウム沈澱による
濃縮前の操作で回収された分画の蛋白質濃度が1.0mg/ml以
下である場合、排除分子量3000−5000の分離膜を用い、
限外漉過で濃縮した。最終の蛋白質濃度は1.0mg/ml以上
とする。硫酸アンモニウムを最終濃度60〜70％になるよ
うに加えた。沈澱を遠心によって回収し、沈澱に用いた
濃度の硫酸アンモニウムを含む、20mMトリス塩酸（pH7.
5）で一回洗浄した。沈澱を遠心によって集め、20mMト
リス塩酸,pH7.5に溶解した。

E.セファデックスＧ−100カラムクロマトグラフィー再度溶解した硫酸アンモニウム沈澱は、必要に応じて
遠心して不純物を除去した。溶液を0.2μフィルターで
漉過し、20mMトリス塩酸,pH7.5で平衡化したセファデッ
クスＧ−100カラムに添加した。カラムに添加される蛋
白質の量は、ゲル1mlあたり3mgを越えては成らない。カ
ラムは同じ緩衝液を用いて溶出した。ステップＦで用い
る分画をSDS−PAGEの結果に基づいて回収した。

F.逆相カラムクロマトグラフィー回収したセファデックスＧ−100溶出液を0.2μフィル
ターで漉過し、FPLC（高速蛋白質液体クロマトグラフィ
ー）およびHPLC（高速液体クロマトグラフィー）カラム
等の逆相カラムに添加した。カラムは0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）で平衡化し、溶出は0.1％TFA中に溶解し
た０−100％のアセトニトリル濃度勾配で行った。分画
はSDS−PAGEの結果に基づいて回収した。溶液を凍結乾
燥し、乾燥粉末を20mMリン酸ナトリウム、pH7.2に溶解
した。

G.精製したGM−CSFの透析ステップＦの溶液は20mMリン酸ナトリウム、pH7.2に
対して透析した。最低４〜５時間の間隔をおいて緩衝液
を２回交換した。必要に応じて、排除分子量3,000〜5,0
00の限外漉過膜を用い、透析した溶液を蛋白質濃度が最
低1.0mg/mlになるまで濃縮した。精製したGM−CSF溶液
は0.2μフィルターを通し、−20℃あるいはそれ以下で
凍結保存した。

上述の本発明における態様は、例解および解説の目的
で行った。これらは網羅的なものではなく、また、本発
明をここで開示された詳細な形式に限定するものでもな
い。そして、以上の既述に照らして明らかに多くの改変
や変形が可能である。本明細書における態様は、当業者
が種々の態様で、また、個々の使用状況に適切な種々の
改変を用いて本発明を最適に使用できるために、本発明
の原理とその実際の適用法を最もよく解説する目的で選
択、記載された。本発明の範囲は請求の範囲によって定
められる。

特許出願人はpcD−human−GM−CSFをATCCに寄託番号3
9923で寄託した。この寄託はブタペスト条約の要求を満
足する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者レニック，ドナ・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州94022, ロス・アルトス，アーモンド・アベニュー 601 (72)発明者アライ，ケンイチアメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，ジョージア・アベニュー 648 (72)発明者アライ，ナオコアメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，ジョージア・アベニュー 648

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳類細胞宿主中でのヒト顆粒球−マクロ
ファージコロニー刺激因子の産生のための発現ベクター
であって、 SV40DNAの複製開始点とSV40初期領域プロモーターとを
含むSRαプロモーター;; スプライスジャンクションおよびヒト顆粒球−マクロフ
ァージコロニー刺激因子をコードする能力を持つヌクレ
オチド配列；ならびにポリアデニル化部位；をこの順でセンス方向に含み、上記SRαプロモーター
は、SV40初期複製開始点のXhoI部位においてHTLV（Ｉ）
レトロウイルスのロングターミナルリピート（LTR）の
一部を含み、該一部は、完全なＲ領域およびR/U5境界か
ら最初の下流のTaqI部位までのU5領域の一部を含むセグ
メントを含むことによってさらに特徴づけられる、上記
発現ベクター。
【請求項２】SV40のポリアデニル化部位の後に、更に順
に、バクテリア宿主中での発現ベクターのクローニングを可
能にするバクテリアの複製開始点；および発現ベクターによって形質転換されたバクテリア宿主の
同定を可能にする選択可能なマーカー；を含むことを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】バクテリアの複製開始点はpBR322の複製開
始点であり、バクテリア宿主は大腸菌（Escherichia co
li）であり、そして選択可能なマーカーは大腸菌に抗生
物質抵抗性を与えることを特徴とする請求項２記載の発
現ベクター。
【請求項４】哺乳類細胞宿主がCOSサル細胞、CV1サル細
胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細
胞より選択されることを特徴とする、請求項３記載の発
現ベクター。
【請求項５】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
発現ベクターを入れた適当な哺乳類細胞宿主を培養する
ことを特徴とする、哺乳類細胞宿主中でヒト顆粒球−マ
クロファージコロニー刺激因子の生産方法。
【請求項６】哺乳類細胞宿主がCOSサル細胞、CV1サル細
胞、マウスＬ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細
胞から選択されることを特徴とする、請求項５記載の方
法。