JPH02502877A - ヒト顆粒球―マクロファージコロニー刺激因子およびそのミューティン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびそのミニ−ティン 免吸皇豆１ 本発明はヒト造血系の増殖および分化のための蛋白性因子、即ち、ヒト顆粒球− マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）の哺乳類宿主細胞中における 産生のための発現ベクターおよびその産生に有用な新しいプロモーターに関する 。

１量且ｌ 循環血液細胞は、恒常的に新しく分化した細胞に置換されている。Ｗ換する血液 細胞は造血と呼ばれる過程によって形成され、そこで以下の少なくとも８種の成 熟細胞系列が作られる：赤血球、マクロファージ（単球）、好酸性顆粒球、好酸 性顆粒球（肥満細胞）゛、Ｔ　ＩＪンパ球、そしてＢリンパ球（Ｂｕｒｇｅｓ！ ：およびＮｉｃ。

ｌａ、ｒ成長因子と幹細胞（Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔ。

ｒｓ　　ａｎｄ　　Ｓｔｅｍ　　Ｃｅ１ｌｓ）」　（アカデミツクプレス、ニュ ーヨーク、１９８３）、血液細胞産生の制御の多くは、コロニー刺激因子（Ｃ３ Ｆ）と呼ばれる一連の活性糖蛋白質によって媒介される。これらの糖蛋白質はそ の存在を検出するための生体内（ｉｎｖｉｖＯ）および試験管内（ｉｎ　　ｖｉ ｔｒｏ）のアッセイ法から命名されている。半固体培地中での造血細胞のクロー ン培養技術は、試験管内アッセイ法の発展に特に重要な役割を果たした。このよ うな培養系では、それぞれの駁細胞（即ち、発生学的に一つの細胞系に分化が決 定されているが、まだ増殖能を有する細胞）は本質的に生態内における相同のプ ロセスと同一と考えられている様式で増殖し、成熟細胞のコロニーを作ることが できる。造血におけるＣ３Ｆの働きは、最近多くの総説で取り上げられている０ 例えば、メトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）「造血系コロニー刺激因子（Ｔｈｅ　　 Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　　Ｃｏ１ｏｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　Ｆａ ｃｔｏｒｓ）」　（エルシーバー、ニューヨーク、１９８４）；メトカルフ、５ ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１６−２２　（１９８５）；ニコラ（Ｎｉｃｏｌａ）ら 、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　Ｔｏｄａｙ’、５．７６−８０（１９８４）：つｊ −７トン（Ｗｈｅｔｔｏｎ）ら、ＴｌＢ５，１１．２０７　　：２１１　　（１ ９８６）；およびクラーク（Ｃ１ａｒｋ）とカーメン（Ｋａｍｅｎ）Ｓｃ　１ｅ ｎｃｅ、２３６．１２２９−１２３７　（１９８７）。

これらの因子の検出、単離および精製は、以下の理由によりしばしば非常に困難 である。それらが典型的に存在する細胞上清の複雑さ、混合物中のさまざまの成 分の活性の多様性および重複、それらの因子の成分を確認するために使われるア ッセイ法の感度（あるいは感度の欠如）、それらの因子の分子量の範囲やその他 の性質が屡類似していること、そして自然の上体では因子の濃度が非常に低いこ とである。

主として遺伝子クローニングによって多くのＣ３Ｆが入手可能になるにつれ、そ の臨床応用法の開発への興味が増していた。ホルモン（例えば可溶性因子、成長 メチイエ−ター、細胞リセブターを介した作用）との生理学的な類似性のため、 Ｃ３Ｆの使用の可能性は、現在のホルモンの使用法から類推されている；例えば 、デキスタ−（Ｄｅｘｔｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１，１９８（１９８６）、 これらの因子の使用は、腫瘍の化学療法または放射線療法後の回復治療、造血形 成不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移植後の造血系再生の促進のための治 療、および慢性の感染症に対する宿主の抵抗性を増すための治療等のように、血 球際産生刺激が必要となるいくつかの臨床の場で、示唆されている０例えばデキ スタ−（上述）、メトカルフ（３（ｉｅｎｃｅ上述）およびクラークとカーメン （上述）。

顆粒球およびマクロファージの成長および分化を支える因子であるＧＭ−Ｃ３Ｆ の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は最近いくつかの研究室で数種類クローニングされ 、配列決定された；例えばゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０９．７６ ３　７６７　（１９８４）（マウス）；リー（Ｌｅｅ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．４３６０−４３６４　（１９８５）（ヒ ト）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８．８１０−８１５　（１ ９８５）（ヒトおよびテナガザル）；およびカントジル（Ｃａｎｔｒｅｌｌ）ら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　　ｔ　　１．Ａｃａｄ、　　Ｓｃ　　ｉ、　　ＵＳＡ、　 　８２゜６２５０−６２５４　（１９８５）（ヒト）を参照、さらにまた、非− 組換えＧＭ−ＣＳＦは、Ｍｏ細胞ライン（米国特許４，４３８．０３２に記載さ れている）の培養上清から精製されており、そしてＮ末端からの最初の１６アミ ノ酸は配列決定されている（Ｇａｓｓｏら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２６巻、１３３ ９−１３４２頁（１９８４））、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの中でもヌクレオチドおよび アミノ酸配列の相違（ヘテロジエニシティー）が観察されている０例えば、アミ ノ酸のレベルにおいて、成熟ポリペプチドのＮ末端のアラニンから１００位には 、スレオニンおよびイソロイシンの両者が観察されており、ヒト集団の中にＧＭ −Ｃ３Ｆの数種の対立遺伝子型または多型性が存在することが示されている。こ のことは驚くべきことではない；なぜならＬｅｗｏｎｔｉｎが、工ｈｅ　　　Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　　　Ｂａ５ｉｓ　　　ｏｆ　　　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒ　　　 Ｃｈａｎ　　ｅ　（Ｄｔｌ）ンビア大学出版。

ニューヨーク、１９７４）の第３章で、ヒトおよびショウジヨウバエのアロザイ ムのデータを再検討したとこぺそれらの酵素の構造遺伝子の全体の３／１以上は 、電気泳動で区別できる多量産物をコードしていた。　にＭ−Ｃ３Ｆの多型性の 存在は、ある種の多型性は、治療に使用されるＧＭ−Ｃ３Ｆに相当するにＭ−Ｃ ３Ｆと異なる対立遺伝子をもつサブ集団の免疫反応を引き起こす可能性があるか ら、それを治療剤として使用するときに重要である。

上記の観点から、天然に存在するにしても遺伝子工学的に操作されているにして も、代替型のＧＭ−Ｃ３Ｆが入手できることは、医療の世界において有利である 。

見旦Ω１１ 本発明はヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）　、お よびその遺伝子工学的に操作したミューティンに関する０本発明は、下記式Ｉで 表されるアミノ酸配列から選択された配列がらなり、標準的アッセイで顆粒球お よびマクロファージコロニー刺激因子活性を育するポリペプチドも包含する０本 発明はさらに式■で表されるポリペプチドをコードすることのできる核酸、本発 明の核酸を用いてそのようなポリペプチドを製造する方法、および本発明のポリ ペプチドを単独または他のＣ３Ｆと共に用いて、骨髄発育不全を含む症状を治療 し、または骨髄移植またはある種の癌治療に続（造血系の再生を増強させる方法 にも関する。

本発明の好ましい態様は、次式で表されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配 列からなるグリコジル化もしくは非グリコジル化ポリペプチドのセットである。

■−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ａｒｇ）−Ｘ（Ｓｅｔ） −Ｘ（Ｐｒｏ）−χ（Ｓｅｒ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｓｅｔ）−Ｘ（Ｔｈｒ）− Ｘ（Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｔｒｐ−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｈｉｓ）−χ（Ｖａ ｔ）−χ（Ａｓｎ）−χ（Ａｌａ）−Ｘ（ｌｉｅ）−χ（Ｇｉｎ）−Ｘ（Ｇｌｕ ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ａｒｇ）−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌｅｕ ）−Ｘ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｓｅｔ）−Ｘ（Ａｒｇ）−Ｘ（＾５ｐ） −Ｘ（Ｔｈｒ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−χ（Ｎｅｔ）− Ｘ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｔｈｒ）−χ（Ｖａｌ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ （Ｖａｌ）−Ｘ（Ｉｌｅ）−Ｘ（Ｓｅｔ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｍｅｔ）−Ｘ（ Ｐｈｅ）−Ｘ（Δ５ｐ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｐ ｒｏ）−Ｘ（Ｔｈｒ）−Ｃｙｓ　　−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｔｙｒ）−Ｘ（Ｌｙｓ ）−Ｘ（Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｇｌｙ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌｙｓ） −Ｘ（Ｇｌｙ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｔｈｒ）−Ｘ（Ｍｅｔ）− Ｘ（Ｎｅｔ）−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（ｓｅｔ）−Ｘ（Ｈｉｓ）−Ｘ（Ｔｙｒ）−Ｘ （Ｌｙｓ）−Ｘ（Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｈｉｓ）−Ｃｙｓ　　−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｐ ｒｏ）−Ｘ（Ｔｂｒ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（に１ｕ）−χ（Ｔｈｒ）−χ（Ｓｅ ｔ）−Ｃｙｓ　　−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ｔｈｒ）−Ｘ（Ｇｌｎ）−Ｘ（Ｉｌｅ） −Ｘ（Ｉｌｅ）−Ｘ（Ｔｂｒ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）−χ（Ｇｌｕ）−χ（Ｓｅｔ） −Ｘ（Ｐｂｅ）−χ（Ｌｙｓ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｌｅｕ）− Ｘ（Ｌｙｓ）−Ｘ（Ａｓｐ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ （Ｖａｌ）−Ｘ（Ｉｌｅ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ａｓｐ）−Ｃｙ ｓ　　−丁ｒｐ　　−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｖａｌ）−Ｘ（Ｇｌｎ ）−Ｘ（Ｇｌｕ）−ＯＢ （式Ｉ） （式中、Ｘ（Ｘａａ）は、同義アミノ酸のグループを表す、もっとも好ましくは 、本発明は非グリコジル化型の式Ｉのポリペプチドを含む。

グループ内の同義アミノ酸は、グループ内でのメンバーの交換において分子の生 物学的機能を保持するのに十分に類僚の物理化学的特性を持つ；グランサム（Ｇ 　ｒ　ａｎｔｈａｍ）、５ｃｉｅｎｃｅ、１８５巻、８６２−８６４　（１９７ ４）およびデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら。

「蛋白質の配列および構造の地図（Ａｔｌａｓ　　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ　　５ｅ ｑｕｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、１９７２第５巻の８９− ９９頁（ナショナル　バイオメディカル　リサーチ　ファウンデーテッン、ワシ ントン、Ｄ、Ｃ０）を参照、上記配列中でのアミノ酸の挿入および削除を生物学 的機能を変化させずに行うことは、特に削除されｔたは挿入されるアミノ酸の数 が、例えば１．２または３個のように少なく、機能的構成（コンホメーシヨン） に決定的なアミノ酸の除去または移動がない場合は、可能である；例えばジョー トル（Ｓｈｏｒｔｌｅ）およびリン（Ｌｉｎ）、Ｇｅｎｅｔｉｅｓ、１１０巻、 ５３９−５５５頁（１９８５）およびアンフィンゼン（Ａｎｆｉｎｓｅｎ）、ｒ 蛋白質の鎖の折り畳みを支配する原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｔｈａｔ　　Ｇｏ ｖｅｒｎ　　ｔｈｅ　　Ｆｏｌｄｉｎｇ　　。

ｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃｈａｉｎｓ）、５ｃｉｅｎｃｅ。

１８１巻、２２３−２３０頁（１９７３）を参照、そのような削除および／また は挿入により製造される蛋白質およびミューティンは本発明の範囲に含まれる０ 式Ｉの蛋白質のアミノ酸残基を番号で示すが、この番号は蛋白質のＮ末端からの 番号である。

好ましくは、同義アミノ酸のグループは第１表に示されるものである。より好ま しくは、同義アミノ酸のグループは第１表において／の前に与えられたもので、 最もも好ましくは各同義アミノ酸グループは単一アミノ酸。

即ちＸａａ自体で構成される。

第１表　石　　ミ　　の　嘘　い゛　び”　　　しいグループ Ｘａａ　　　　　　　　　　　Ｘ（Ｘａａ）Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ 、／Ｇｌｙ、ＡｓｎＡｒｇ　　Ａｒｇ、／Ｌｙｓ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ、／Ｖａｌ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ、／Ａｌａ Ｔｈｒ　　　Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ａｌａ　　　Ａｌａ、　　Ｓｅｒ、Ｔｈ ｒ、Ｇｕｙ、／Ｐｒｏ、　　Ｖａ　　ＩＶａｌ　　　Ｖａｌ、　　Ｉｌｅ、／Ａ ｌａ、　　ＬｅｕＧｌｙ　　Ｇｌｙ、Ａｌａ、／５ｅｒ １１ｅ　　　ｌｉｅ、Ｖａｌ、／ＬｅｕＰｈｅ　　Ｐｈｅ、／Ｔｙｒ Ｔｙｒ　　Ｔｙｒ、／Ｐｈｅ Ｈｉｓ　　Ｈｉｓ、／Ｃｒ１ｎ、ＡｓｎＧｉｎ　　　Ｇｌｎ、／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ Ａｓ　ｎ　　Ａｓ　ｎ、　Ａｓ　ｐ、　／Ｓ　ｅ　ｒ、　　Ｌｙ　５Ｌｙｓ　　 Ｌｙｓ、／Ａｒｇ、Ａｓｎ Ａｓｐ　　Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ／ Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ、Ａｓｐ、／Ｇｌｎ Ｍｅｔ　　Ｍｅｔ、／Ｌｅｕ、Ｎ１ｅ （Ｎｌｅはノルロイシンを表す） 本発明は、単一位置または複数位置に、（式］で表される天然配列のポリペプチ ドのアミノ酸と同義のアミノ酸での）アミノ酸の置換を有する、式Ｉのポリペプ チドを含む、「８回置換」の用語は、天然配列のアミノ酸００〜Ｎ個が同義アミ ノ酸で置換された式Ｉのポリペプチドの副集団を意味する。従って、例えば式！ の１回置換ポリペプチドのグループは、好ましいグループの同義アのポリペプチ ドからなる。これらの数字は、天然ＧＭ−ＣＳＦ配列の各種類のアミノ酸の数に 、対応する同義アミノ酸セット中の非天然アミノ酸の数に未置換配列のための１ を足したものを掛けて各々合計したものである。

好ましい態様に於いて、本発明は式Ｉの２回置換ポリペプチドのセントから選択 されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配列か らなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからなり、ここで置換ア ミノ酸は第１表の同義アミノ酸の各セットから選ばれる。

より好ましい態様において、本発明は式Ｉの１回置換ポリペプチドのセントから 選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配 列からなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからなり、ここで置 換アミノ酸は第１表の同義アミノ酸の各セントから選ばれる。

さらに好ましい態様において、本発明は式Ｉの１回置換ポリペプチドのセントか ら選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸 配列からなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからなり、ここで 置換アミノ酸は第１表の同義アミノ酸の各セットから選ばれ、そして残基１−７ ５．８９−８５．１０４−１１２および１１７−１２７で集合的に定義される領 域のアミノ酸は置換をうけていない。

さらにより好ましい態様において、本発明は式Ｉの２回置換ポリペプチドのセッ トから選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアミ ノ酸配列からなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからなり、こ こで置換アミノ酸は第１表の同義アミノ酸の各セットから選ばれる。

特に好ましい態様において、本発明は式■の１回置換ポリペプチドのセントから 選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配 列からなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからなり、ここで置 換アミノ酸は第１表のより好ましい同義アミノ酸の各セントから選ばれる。

さらに具体的に好ましい態様においては、本発明は式Ｉの１回置換ポリペプチド のセットから選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有す るアミノ酸配列からなるグリコジル化または非グリコジル化ポリペプチドからな り、ここで置換アミノ酸は第１表のより好ましい同義アミノ酸の各セントから選 ばれ、そして残基１−７５．８９−８５．１０４−１１２および１１７−１２７ で集合的に定義される領域のアミノ酸は置換をうけていない。

最も好ましくは、本発明は次式の配列からなる非グリコジル化ポリペプチドから なる： ■−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−５ｅ ｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−シａｌ−Ａｓｎ−Ａｌ ａ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｍｅ ｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｓ＆ｒ−Ｇｌ ｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｃ ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　Ｌ ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌ ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａ ｌａ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐ ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｎ−Ｉ）ｅ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｂｅ−Ｌｙｓ−Ｇ ｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｉ 　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−ＯＨ（式■） 式Ｉのポリペプチドについて１８回挿入」の用語は、式Ｉで定義された配列中に １〜Ｎ個のアミノ酸が挿入されたポリペプチドのセットを示すために用られる。

好ましくは、挿入アミノ酸は、該挿入をはさむアミノ酸と同義アミノ酸の好まし いグループ（第１表）から選択さ瓢より好ましくは、挿入アミノ酸は、該挿入を はさむアミノ酸と同義アミノ酸のより好ましいグループ（第１表）から選択され る。したがって、例えば１回挿入ペプチド群の一つのサブグループは、一つのア ミノ酸がＮ−末端Ｘ（Ａｌａ）と隣接Ｘ（Ｐｒｏ）の間に挿入されたものである 。このサブグループのメンバーを規定する挿入アミノ酸は、好ましくはＡｌ　ａ 、Ｐｒ　ｏ、Ｓｅ　ｔ、Ｔｈｒ、ＧｌｙおよびＶａｌから、より好ましくはＡ、 Ｐｒｏ。

Ｓｅｒ、Ｔ−ｈｒおよびｃｘｙから、そして最も好ましくはＡｌａおよびＰｒｏ から選択される。挿入は式ｌの任意の隣接アミノ酸の間に行ってもよく、あるい は式Ｉのアミノ酸配列のどちらの末端に行ってもよい、１２７アミノ酸が存在し 、したがって１２８箇所の可能な挿入部位が存在し、そして複数の挿入を同じ部 位に行ってもよいから、式Ｉの配列の２回挿入ポリペプチドは、１２８Ｘ１２Ｂ −１６，３８４のペプチドのサブグループを生じ、そして各サブグループの数は 該挿入をはさむアミノ酸と同義のアミノ酸グループの数に依存する。

式ｌのポリペプチドに関してｒＮ回削除」の用語は、式Ｉで定義される配列から １ないしＮ個のアミノ酸が削除されたペプチドのセットを意味する。したがって 、式Ｉの１回削除ポリペプチドは、各々１２６アミノ酸長さの（１２６−ｍｅｒ ）のポリペプチドの１２７個のサブグループからなる。サブグループの各々は、 置換の数に依存して、好ましい、より好ましい、そして最も好ましい同義アミノ 酸のグループにより規定される全部の１２６−ｍｅｒから構成される。

ポリペプチドのセットが式ｌの配列の削除および挿入で定義されるときは、最初 挿入で定義されるポリペプチドのセットが形成され、次に該セットの各メンバー について削除で定義されるポリペプチドのセットが形成される。後者の複数セッ ト全部のメンバーの合計は、挿入および削除の両者で定義されるポリペプチドの セットを形成する。

本発明はさらに、式１のポリペプチドをコードする能力を持つヌクレオチド配列 、および好ましい、より好ましいおよび最も好ましいグループの同義アミノ酸に ついて式■のポリペプチドの部分をコードする能力を持つ核酸カセットも包含す る０本明細書において、「核酸カセット」とは、（ｉ）式■で定義されるポリペ プチドの部分をコードする能力を持つヌクレオチド配列を存し、（０）その両端 は核酸およびその相補鎖を含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関し てユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位で規定される、ｌＯないし１２０塩基 の核酸である。より詳しくは後述するとおり、核酸カセットはＧＭ−Ｃ：ＳＦの ミュータント型を造成するために用いられる。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのＮ−末端に結合した付加的ペ プチドを有する長いポリペプチドの一部分であっても良い、付加的ペプチドは宿 主生物からの蛋白質の分泌に関与するシグナル配列であってもよく、例えば、酵 母のＭＦアルファシグナル配列（クルシャン（Ｋｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅ１ｌ、３ ０巻、９３３−９４３頁（１９８２））でもよい、あるいは、付加的ペプチドは 所望ポリペプチドの精製を助けるために用いてもよい；例えばサツセンフェルド （Ｓａｓｓｅｎｆｅｎｄ）ら、「組換え蛋白質の精製のために設計されたポリペ プチド融合物（Ａ、　　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｆｕｓｉｏｎ　　Ｄｅｓｉ ｇｎｅｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ＰｕｒｉｆｉｃａＬｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｒｅ ｃｏｍｂｉｎａｎｔ台、付加的ポリペプチドは所望ポリペプチドのＮ−末端に隣 接する選択的上位列部位を含んで、酵素的または化学的手段によって、（生物学 的活性に関して）余分なアミノ酸配列の部分を切り離すようにしても良い。

本発明のポリペプチドはまた、ノルロイシンのようなアミノ酸類縁体による置換 を含んでも良い。

特に、本発明はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、 　ロンクビル、メリーランドに受託番号３９９２３で寄託された、第１図に説明 されているクローンｐ　ｃＤ−ｈｕｍａ　ｎ−ＣＭ−Ｃ３ＦのｃＤＮＡ挿入物を 有する核酸を包含する。

さらにまた、本発明は（後述するように）共有結合で結合した次の配列要素を持 つＧＭ−Ｃ３Ｆの発現ベクタＶ４０（７）ＤＮＡ複製起点（ＳＶ４０　ｏ　ｒ　 ｉ）　、ＳＶ４０初期領域プロモーター（ＳＶ４０ｅａｒｌｙ）：５Ｒｃｒプロ モーター、スプライス・ジャンクシラン、およびＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域（任意 の向き）、およびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙＡ部位）： ５Ｖ４０ｏｒｉ ＳＶ４０ｅａｒｌｙプロモーター ＳＲαプロモーター スプライス・ジャンクション ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域 ｐｏｌｙＡ部位 ［ベクターの輪は上記５Ｖ４０ｏｒｉに閉じる］好ましくは、発現ベクターおよ びまたはクローニングベクターは、さらにＳＶ４０　ｏ　ｒ　ｉおよびｐｏｌｙ Ａ部位の間に挿入された細菌の複製開始起点（細菌ｏｒｉ）および選択可能マー カーの遺伝子（後に説明する）を含む： ５Ｖ４０ｏｒｉ ＳＶ４０ｅａｒｌ）’プロモーター ＳＲαプロモーター スプライス・ジャンクション ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域 ｐｏｌｙＡ部位 細菌ｏｒｉ ［ベクターの輪は上記５Ｖ４０ｏｒｉに閉じる〕さらに好ましくは、選択可能マ ーカーの遺伝子は宿主に薬剤耐性を付与し、例えばネオマイシン、アンピシリン 、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ヒグロマイシン、そ の他に対する抵抗性を付与する。最も好ましくは、細菌ｏｒｉはｐＢＲ３２２の Ｏｒｉである。

明細書を通して、アミノ酸、ヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ等を示すた めには、標準的略号が使用される：例えばコーン（Ｃｏｈｎ）、α−アミノ酸の 命名および記号（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　　ａｎｄ　　Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ 　　ｏｆ　　ａ−Ａｍｉｎｏ　　Ａｃ１ｄｓ）。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０６巻、３−１７頁（１ ９８４）　；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、問題へのアプローチ（Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　　Ａｐｐ ｒｏａｃｈ）、第２版（ベンジャミン、メンロパーク、１９８１）；およびグル ープ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、ｒ制限エンドヌクレアーゼ案内（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ 　　ｏｆ　　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｉｏｎ　　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻、２７−４０頁（１９７９ ）を参照。

本発明は医学的および／または獣医学的症状の治療のための免疫調節剤の使用に 伴う問題の解決にむけられている。特に、本発明は癌の治療、ある種の血液病の 治療および持続感染の治療に有用な、血液細胞の再生を！ＩＪ激することのでき る化合物を提供する。

゛　の−　な：゛ 第１図はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を示すポリペプチドをコードするｃＤＮＡ挿入の ヌクレオチド配列および対応したアミノ酸配列を示す。

第２図はヒ）ＣＭ−Ｃ３Ｆ活性を示すポリペプチドをコードするｃ　ＤＮＡ挿入 を持つプラスミド、ｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−ＣＳＦを示す。

第２Ｂ図は第２Ａ図のｃＤＮＡ挿入の制限酵素地図である。

第３図はプラスミドｐＬ１の制限酵素切断部位および主要なコード領域を模式的 °に示す。

第４図はプラスミドｐｃＤＶ１の制限酵素切断部位および主要なコード領域を模 式的に示す。

の−　　ｒ 本発明は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を示し、そして標準的蛋白質操作技術を用いて 、本明細書に開示されたＧＭ−Ｃ３Ｆポリペプチドから誘導された、グリコジル 化または非グリコジル化ポリペプチドに関する０本発明はまた、本発明のポリペ プチドをコードすることができる核酸配列も含む、最後に、本発明は本明細書に 開示されたヌクレオチド配列を用いてグリコジル化もしだは非グリコジル化ポリ ペプチドを製造する方法、および本発明のポリペプチドを使用する方法も包含す る。

本発明のポリペプチドを製造し、用い、および同定するための技術は下記におい て一般的に説明される。その後いくつかの具体的実施例を示し、その中で具体的 細胞タイプ、ベクター試薬、その他を用いた一般技術の応用が示される。

１．０Ｍ＝Ｃ３Ｆ　　ｃＤＮＡのｄｅ　　ｎｏｖｏｇ　　’ｃ　ＤＮＡのｄｅ　 　ｎｏｖｏｌｊ製およびクローニング及びｃＤＮＡライブラリーの構築のための 種々な手法が現在使用可能である。対応した文献の総説は、詳細な手法上ともに ＷＯ３７１０２９９０として国際公開されているＰＣＴ／ＵＳ　　８６１０２４ Ｅｉ４．（７）２９頁２２行〜３２頁下５行に述べられている０本発明における ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの好ましい由来は次節で議論さａている。Ｐ ＣＴ／ＵＳ　　８６１０２４６４中の開示は、ここでＧＭ−ＣＳＦの産生、特に その３１頁と関連して読まれたい。

目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの好ましい由来は、Ｔリンパ球など、 その上清が本発明におけるポリペプチドに伴う活性の一つを含む細胞である。そ れに由来するＧＭ−Ｃ３Ｆ　　ｃＤＮＡのためのＲＮＡは米国特許４．４３８． ０３２号に開示され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３ ０１　　パークローンドライブ、ロックビル、ＭＤ　　２０８５２．米国に寄託 番号ＣＲＬ８０６６で寄託されているＭＯ細胞株より得られる。一般的には適当 なＴ細胞はヒト肺臓、扁桃腺および末梢血等、様々な由来から得られる。末梢血 Ｔ細胞より単離されたＴ細胞クローン等も使用可能であろう（「免疫学での研究 論文（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｍ。

ｎｏｇｒａｐｈｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」。

フォノ・デー？　−（ｖｏｎＤｏｅｈｍｅｒ）およびハーフ（Ｈａａｆ）Ｗ集、 「ヒトＴ細胞クローン（Ｈｕｍａｎ　　Ｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｃ１ｏｎｅｓ）　」 、第８巻、２４３−３３３頁、エルシーバー・サイエンス・出版社、ニューヨー ク（１９８５）を参照）。

■、　　−たｃ　ＤＮＡ　　　のハイ　１　゛イゼーションロー゛　　いたＧＭ −ＣＳＦ　　ｃＤＮＡのｆＩ＋同一の生物学的活性を持つ近縁の蛋白質がしばし ば存在する。多く研究されている例は、以下のものである：（１）いわゆるアロ ザイムで、電気泳動的に区別される、一種の酵素のアレル型である；例えばセン ザバウ（Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ）、法医学での多様性酵素の利用（Ｔｈｅ　　Ｕ ｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏＥ　　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ 　　ｉｎ　　ＦｏｒｅｎｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅ）Ｊ、ｌ５ｏｚ　　ｍｅｓ、上ユ 、１３７−１５４　（１９８３）およびレウオンテイン（Ｌ　ｅ　ｗ　。

ｎｔｉｎ）、ｒ進化掌上の変化の遺伝学的基９（ＴｈｅＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｂａ ５ｉｓ　　ｏｆ　　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　　Ｃｈａｎｇｅ）ｊ　　（：２ ０ンビア大学出版。

ニューヨーク、（１９７４）の第３章を参照のこと；（２）いわゆるアロタイプ で、免疫グロブリンの定常領域の多形性をいい、例えばフッド（Ｈｏｏｄ）ら、 　　’Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２３１−２３８頁（ベンジャミン／カミングス 、メンロパーク、１９７８）および（３）　　ヘモグロビン、例えばディッカー ソン（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）およびガイス（Ｃｅ　ｉ　ｓ）、　　［Ｈｅｍｏ　 ｇ　１ｏｂｉｎ」　（ベンジャミン／カミングス、メンロバ−久１９８３）であ る、このような多形性はリンホカインにも存在すると考えられている：　　（ｉ ）ＰＣＴＷＯ８６１００６３９中では二種のヒトＣＭ−Ｃ３Ｆが報告されており 、（ｉｉ）ウォン（Ｗｏｎｇ）らは５ｃｉｅｎｃｅ。

２３５．１５０４−１５０８においてカヮサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）らによって ５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．２９１−１９６　（１９８５）に報告されたものとは 異なる型のヒトＣ５Ｆ−１を報告している。

無作為に選択した座（ローカス）が多形性である確率はかなり高い、レウォンチ ン（Ｌｅｗｏｎｔｉｎ）（上記）がヒトおよびショウジヨウバエのローカスにつ いて示したデータによると、全構造遺伝子の約１／３は電気泳動で区別かのうな 多形性生産物をコードしている。各ローカスでの主要変異体の数は大きくは無い ようである。

フォーゲル（Ｖｏｇｅｌ）ら、Ｈｕｍａｎ　　Ｃｅｎｅｔｉｃｓ、３７３−３７ ８頁（スプリンガー−フエアラーク、ニューヨーク、１９７９）は、３３種の主 要ヒト多形性を列挙しており、各ローカスでの対立遺伝子変異体は２〜６である 。ハースコピフッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　　　ｏｆ 　　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

第二版（マクミラン、ニューヨーク、１９７７）は、６４３頁に６．４．２．３ ．２、および３３対立遺伝子をもつショウジヨウバエの多形性ローカスの例を引 用している。

多形性変異体の配列は直ちには予測できないとはいえ、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆ ｆ）（上記）の研究等が強く示唆するのは多形性変異体と支配型との違いは、お そらく「保存的」アミノ酸変異を越えるものではないということである。さらに 、多形性変異体のヌクレオチド配列は支配型のそれと高度にホモロガスである、 例えば９９％以上ホモロガスである。

本明細書に開示するｃＤＮＡは、多形性変異体および／または異なる細胞種のホ モロガス配列を同定するためのプローブとして、ＣＡＭ−Ｃ３Ｆコードヌクレオ チドのｄｅ　　ｎｏｖｏｌｉｌｔおよびクローニングの代替法のために使用する ことができる。標準的技術が採用され、例えばベルツ（Ｂｅｌｔｚ）ら、「フィ ルター　ハイブリダイゼーション法による、多遺伝子ファミリーの単離およびホ モロジーの決定（１ｓｏｌａ、ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　　Ｆ ａｍｉｌｉｅｓ　　ａｎｄ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｈｏｍ ｏｌｏｇｉｅｓ　　ｂｙ　　ｆｉｌｔｅｒ　　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　　 Ｍｅｔｈｏｄｓ）３．Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍ。

ｌｏｇ）’、１００巻、２６６−２８５頁：およびキー１−ラハン（Ｃａｌｌａ ｈａｎ）ら、「マウス乳癌ウィルスゲノムに関連するヒトＤＮＡ配列の検出およ びクローニング（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　。

ｆ　　Ｈｕｍａｎ　　ＤＮＡ　　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　ｔ ｏ　　ｔｈｅ　　Ｍｏｕｓｅ　　ＭａｍｍａｒｙＴｕｍｏｒ　　Ｖｉｒｕｓ　　 Ｇｅｎｏｍｅ）」、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７９巻、５５０３−５５０７頁（１９８２ ）を参照：前者の文献は参照により本明細書に含まれる０本発明のｃＤＮＡを含 むベクターの制限エンドヌクレアーゼフラグメントは、（ＧＭ−Ｃ３Ｆを生産す ると予測される細胞種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー（これ らのライブラリーは標準的技術で作成される）を低いハイブリダイゼーションの ストリンジエンシーでスクリーニングするために、（二フクトランスレーション のような照準的技術を用いて；上記マニアチス参照）プローブを造成するために 使用される。標準的スクリーニング方法が使用される；例えばグルンシェタイン （Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７２巻、３９６１−３９６５頁（１ ９７５）またはベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８ ０−１８３頁（１９７７）またはう−（Ｗｏｏ）、Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ）’、６８巻、３８９−３９６頁（１９７ ９）を参照、別法として、ライブラリーのスクリーニングを、式Ｉの配列もしく は相当するアンチ−センス配列から決定された標識オリゴヌクレオチドプローブ で行うこともできる。そのようなプローブは市販のＤＮＡ合成装置、例えばアプ ライド・バイオシステムズ・モデル３８１によって、例えばゲイト（Ｇａｉｔ） 、オリゴヌクレオチド合成：実際的アプローチ（０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ） （ＩＲＬプレス、ワシントン　Ｄ、Ｃ，，１９８４）に記載されている標準的技 術を用いて合成できる。いずれの場合も、プローブは少なくとも１Ｂ−３０塩基 の長さであることが好ましい、より好ましくは、プローブは少なくとも１００− ２００塩基の長さである０例示として、各々のもしくは対の制限エンドヌクレア ーゼでの消化によって生じた第２Ｂ図に示す制限フラグメントを用いて、ホモロ ガス核酸のスクリーニングに適するプローブを造成することができる。

■、　　　　　　に　　ヒ　ＧＭ−Ｃ３Ｆ棗ニー−インの天然蛋白質について、 一旦核酸配列および／またはアミノ酸配列の情報が入手できたら、該天然配列の 実質的に任意のミューチーシランを製造するための種々野技術が使用できる。ジ ョートル（Ｓｈｏｒｔｌｅ）、５ｃｉｅｎｃｅ）、２２９巻、１１９３−１２０ １頁（１９８５）は、核酸のミューティン作成技術を概説しており、本発明に通 用できる。好ましくは、天然ＧＭ−Ｃ３Ｆのミュータント、即ちＣＭ−Ｃ３Ｆミ ユーテインは部位特異的オリゴヌクレオチドへの変異形成法によって製造される か（例えば、シラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒａｎｄ　　Ｓｍ１ｔｈ）、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０巻、４６Ｂ−５００頁（１ ９８３）；マーク（Ｍａｒｋ）ら、米国特許４５１８５８４号　（発明の名称「 ヒト組換えインターロイキン−２ミユーテイン（Ｈｕｍａｎ　　Ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔ　　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２Ｍｕｔｅｉｎｓ）Ｊ　　（参照により ここに含まれる））；または固相法による直接合成で製造されるか（例えば、ク ラーク−ルイス（Ｃ１ａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１巻、１ ３４−１３９頁（１９８６）；およびドニシ−？−（Ｄ。

ｅｓｃｈｅｒ）、Ｍｅｔｈｏ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、４７巻、５７８−６１７へ（ １９７７））；またはいわゆる「カセット・ミュータ゛ジェネシス法により製造 される（ウェルズ（Ｖｅｉｌｓ）ら、Ｇｅｎｅ、３４巻、３１５−３２３頁（１ ９８５）　：エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、６５９ −６６３頁（１９８６）により記載され、およびミューリンバッハ（Ｍｕｌｌｅ ｎｂａｃｈ）ら、Ｊ、Ｂｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、。

２６１巻７１９−７２２　（１９８６）およびフエレツティ　　（Ｆｅｒｅｔｔ 　　　ｉ）　　　ら　、　　　Ｐｉｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、、８３巻、５９７−６０３頁（１９８６）に実質的に記載されている）。

天然ポリペプチドのミューティンは、種々の状況で望ましいであろう０例えばあ る種のミューティンでは、特にもし副作用が所望活性の部位と異なるポリペプチ ドの部位に付随するのである場合は、不所望副作用を低下させるであろう、ある 種の発現システムに置いて、天然ポリペプチドはプロテアーゼによる分解に影響 されるであろう、そのようなシステムに置いて、影響を受ける配列を変化させる アミノ酸の選択的置換および／または削除は、収率を存意に増大するであろう； 例えば英国特許出＠２１７３−８０４−Ａにおいては、ヒト組織プラスミノーゲ ン活性化因子の２７５位のＡｒｇがｃｌｙまたはＧｌｕに置換されている。ミュ ーティンはまた精製過程において収率を増大するであろうし、および／または酸 化、アシル化、アルキル化または他の化学修飾に影響されるアミノ酸を削除する ことにより、蛋白質の保存寿命を増大させるであろう０例えば、メチオニンは容 易に酸化されてスルホキシドに変化し、これは多くの蛋白質において生物学的活 性の消失をもたらす、例えばプロットおよびワイスバッハ（Ｂｒｏｔ　　ａｎｄ 　　Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ。

、２２３巻、２７１頁（１９８３）を参照、しばしばメチオニンを生物学的活性 の消失はとんどもしくは全°く無しに不活性アミノ酸に置換することができる０ 例えばオーストラリア特許出願Ａ　ｕ　−Ａ　−５２４５１／　８６を参照、細 菌発現システムにおいては、ある場合コンホメーションに必須でないシスティン 残基を削除または置換して収率を増大させることができる、例えばマーク（Ｍａ ｒｋ）ら、米国特許４５１８５８４ｔ−参照。

以下のセクションでは、エステル（Ｅｓｔｅｒ）ら（前記）によりミニ−ティン を規定するために用いられた記号が遵守され、−ｉ化されている０例えば、「ヒ トＧＭ−Ｃ３ＦミューティンＡｌａ’（または、文意から天然蛋白質と理解され るときは単にＡｌａ’）は、Ｎ−末端から９位以外は天然の蛋白質とアミノ酸配 列が同じポリペプチドを意味する。該位置でＳｅｒの代わりにＡｌａが置換して いる。ミューティンが１以上の置換を有する場合、例えば９位のＳｅｒの代わり にＡ　１　ａ　、そして１００位のｌｌｅＯ代わりにＶａｌが置換しているとき は、該ミューティンはヒトＩＬ−３ミューティン（Ａｌａ’、Ｖａｔ””）と呼 ばれる。削除は”Δ′”で示される０例えば４位のＡ　ｒ　ｇを欠失するミュー ティンはヒトＣＭ−Ｃ３ＦミューティンΔ４と表される。挿入は”ＩＮ　（ＸＡ Ａ）’　”で示される０例えば４位のＡｒｇの後にＬｅｕが挿入されたミニ−テ ィンは、ヒトＧＭ−Ｃ３ＦミューティンＩＮ’　　（Ｌｅｕ）と表される。した がッテ、ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆミユーテイン（Ｓ　ｅ　ｔ　”。

Δ’、ＩＮ’　　（Ｇ１３Ｆ））は、天然ｈトＧＭ−Ｃ３Ｆ配列が修飾されて、 １０位のＴｈｒがＳｅｔに置換され、４位のＧｉｎが削除され、そして６位のＰ ｒｏの直後にｃｔｙが挿入されたものを表す、同じ位置での複数アミノ酸の挿入 はＩＮ’　　（Ｘａａ＋−Ｘａａｚ−χａ　ａ　３−００．）で表され、その際 、Ｘａａ、−Ｘａａ、−Ｘａａｌｏｏ、は１位の後に挿入された配列である。Ｎ −末端への付加は、上つきの”０”で表され、例えばＩＮ”（Ｘ　ａ　ａ　）と 表され、および例えばアミノ酸６−１０の欠失した配列は、Δ＆−１０または（ Δ６．Δ７．Δ３．Δ９、Δ１１）と表される。

最も好ましくはヒトＧＭ−Ｃ３Ｆミューティンの形成のためには、カセットミュ ータジェネシス法が用いられる。後により詳しく説明するように、合成ヒトＧＭ −Ｃ３Ｆ遺伝子は、一連のユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位がほぼ均一に 該遺伝子に沿って存在するように造成される。制限部位のユニーク性は、該遺伝 子を適当なベクターに挿入した際に、該遺伝子のセグメントを都合よく削除して 所望のミューチージョンをコードする合成オリゴヌクレオチド（即ちカセット） に置換することができるために必要である。

ユニークな制限部位の数および分布の決定において版いくつかの要因を考慮する 必要があり、その要因には次のものが含まれる：（１）発現に採用されるベクタ ーにあらかじめ存在する制限部位、（２）種物異的もしくは属特異的コドンの使 用が好ましいかどうか、（３）利用可能な異なる非−ベクターー切断性制限エン ドヌクレアーゼの数（および該合成遺伝子中でのそれらの数）、および（４）該 ユニーク制限部位間のセグメントの合成および／または配列決定の容易さおよび 信較性。

一般に、式■は、成熟天然ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆ配列に対して、保存的アミノ酸が置 換、挿入および／または削除されたポリペプチドのセットを規定する０本明細書 で「保存的」とは、（ｉ）変更がコンホメーション面にできるだけ中立であり、 即ち天然ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆと比較してミュータントポリベプチドの三次元構造の 変化が最少であるように設計されていること、および（ｉｉ　）変更が抗原性の 面でできるだけ中立であること、即ち天然ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆと比較して、ミュー タントポリベプチドの抗原決定箕に最少の変化しか生じないように設計されてい ること、を意味する。コンホメーション面での中立性は、生物学的活性の保持の ために好ましく、抗原性の面での中立性は、本発明の化合物で治療される患者も しくは動物の免疫応答の誘発を避けるために望ましい、いかなる変更がコンホメ ーション面および抗原面から中立であるかを絶対的確実性を持って選択すること は困難ではあるが、コンホメーション面および抗原性面で中立である確率の高い 変更を行うために当業者の指針となる法則は存在し、例えば、アンフィンゼン（ 前記）、およびベルシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、５ｃｉｅｎｃｅ、２２ ９巻、９３２−９４０　（１９８５）を参照、比較的重要な法則のあるものを挙 げると、（１）疎水性残基の置換は、抗原性の変化を生じない可能性が大きい、 なぜなら疎水性残基は蛋白質の内部に位置する可能性が太きいからである、例え ばベルシフスキー（上記）参照；（２）物理化学的にＲ位の残基、即ち同義残基 の置換はコンホメーション上の変化を引き起こす可能性は小さい、なぜならば置 換したアミノ酸が置換されたアミノ酸と同じ構造上の役割を果たすことができる からである；（３）発生学的に保存されている配列の変更は、コンホメーション に悪影響を引き起こしやすい、なぜなら発生学的に保存されていることは、その 配列が機能的に重要であることを示唆しているからである、そして（４陰性に荷 電した残基例えばＡ　ｓ　ｐ　、およびＧｌｕは中性または陽性電化残基よりも 抗原性である：ゲイセン（Ｃｒｅｙｓｅｎ）　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、 １１８４−１１９０　（１９８７）を参照。

ミューティン配列の選択のための上記基本法則に加えて、操作された分子の生物 学的活性およびコンホメーションの確認のためのアッセイ法も、知られている０ 本発明のポリペプチドの生物学的アッセイは、後に詳述する。

コンホメーションの変化は少なくとも二種のよく知られたアッセイによって試験 できる：蛋白質の三次元構造の発生学的研究に広く使用されている、微少補体結 合法（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎＬ　　ｆｉｘａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）、 例えばワラセルマンら、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．．８７巻、２９〇二２９５　（１ ９６１）、またはレビンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、１１巻、９２Ｂ−９３６（１９，６７）；およびコンホメーション−特異的モ ノクローナル抗体のセントに対する親和性、例えばルイスら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、２２巻、９４Ｂ−９５４（１９８３）を参照。

ＩＶ、ＣＭ−Ｃ３Ｆ　　　の　−セイ ＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を決定するために、造血系細胞、例えば骨髄細胞あるいは胎児 の調帯血細胞が、遊離細胞浮遊液とされた。バラバラの細胞を栄養および多くの 場合ウシ胎児血清を含む半固体（寒天）または粘性の高い（メチルセルロース） 培地中に固定する。適切な刺激因子の存在下では個りの細胞は増殖して分化する ０個々の細胞は固定されているため、細胞が増殖および成熟するにつれ、コロニ ーが形成される。これらのコロニーは、７−１４日後に計数可能となる。ＧＭ− Ｃ３Ｆアツセイを行うための詳細な解説は、バージニス（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ａ、 ）、ｒ成長因子および幹細胞（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒａ　　ｓｎｄ　　ｓｔ ｅｍ　　Ｃｅ１ｌｓ）、５２−５５頁（アカデミツクプレス、ニューヨーク、１ ９８４）、およびメトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）ｒ造血系コロニー刺激因子（Ｔ ｈｅ　　ＨｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃＣｏｌｏｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　 ＦａｃｔｏｒＳ）」　（エルシーバー、ニューヨーク、１９８４）の１０３−１ ２５頁に示されており、両文献の当該部分も本明細書に含まれるものとする。必 要に応じてコロニーを単離し、スライドグラスに載せて固定して、ライト／ギム ザ染色することができる（トッド−サンフォード（Ｔｏｄｄ−３ａｎｆｏｒｄ） ｒ実験室法による臨床診断（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　ｂｙ 　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１５版、デビッドソンおよ びヘンリー（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　　ａｎｄＨｅｎｒｙ）編、１９７４）、このよ うにして、個りのコロニーについての細胞種の形態学的な解析が可能である。

血液疾患ではない愚者から集めた骨髄細胞をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（タイ プ４００．シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）上に重層し、遠心分Ｍ　 （６００ｘｇ、２０’）、界面の細胞を除去した。これらの細胞を１０％ウシ胎 児血清（Ｆｅ２）を含むイスコツの改変ダルベツコ培地で２度洗浄し、同じ培地 中に再度懸濁し、プラスチックのベトリ皿への接着によって、接着性細胞を除去 した（接着性細胞は、しばしばＧＭ−Ｃ３Ｆ産生細胞である：メトカルラ。上記 ）、非接着性細胞を２０％ＦＣ３，５０μＨの２−メルカプトエタノール、０゜ ９％メチルセルロースおよび種々の濃度のコロニー刺激因子を含むことが知られ ている培養上清または試験サンプル上清を含む、イスコツの培地に１０５細胞／ ｄとなるように添加した。１１ＩｌＯ分画を３５腫のベトリ皿に添加し、３７° Ｃ，飽和水蒸気、６％ＣＯ２下で培養した。

培養開始後、３日目に１ユニツトのエリスロポエチンを各皿に加えた。！ｉ粒球 −マクロファージのコロニーおよび赤血球バーストを１０−１４日後に倒立顕微 鏡を用いて計数した。

ヘパリン中に集めた調帯血液細胞は、６００Ｘｇで６分間遠心分離した。血漿と 赤血球のピークの間の界面に存在する白血球を、（１１７Ｎ塩化アンモニウムお よび６％ＦＣ３を含む試験管に移した。５分間氷上に放置した後、懸濁液を４７ のＦｅ２の下層になるように重層し、６分間６００Ｘｇで遠心分離した。骨髄細 胞について述べた方法と同様にして細胞塊をダルベツコの生理食塩水で洗浄し、 フィコール、プラスチック接着を行った。低密度の非接着性細胞を回収し、上述 の方法で半固体培地中に１０’細胞／培養皿でまいた。

アッセイ終了後、個々のコロニーをスライドグラスに載せ、ライト・ギムザ染色 をして、細胞成分を決定した好酸球はルクソールファストブルー（Ｌｕｘｏｌ　 　Ｆａｓｔ　　Ｂｌｕｅ）染色によって決定した（ジョンソンおよびメトカルフ （Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃ；、ａｎｄ　　Ｍｅｔｃａ　Ｉｆ、Ｄ、）、Ｅｘｐ、Ｈｅ ｍａｔｏｌ、、８，５４９−５６１　（１９８０）を参照）。

■、　　′Ｉおよび− 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）、酵母または他の細胞中で発現される本発明のヒトＣ Ｍ−Ｃ３Ｆは硫安沈澱、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、 ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等）、そして最後に結 晶化（一般的には「酵素精製および関連技術（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　　　ｉｎ　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ）’、２２，２３３−５７７　（ １９７７）、およびスコープス（Ｓ　ｃ　ｏ　ｐ　ｅｓ、Ｒｏ）、’蛋白質の精 製：原理と実Ｆｉ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒ１ｎ ｃｉｐｌｅｓ　　ａｎｄ　　Ｐｒａｃｔｉ、ｃｅ）」、スブリンガー〇フェアラ ーク、ニューヨーク、１９８２を参照）を含む当業者に＝般的な手法によって精 製できる。詳細な精製方法は主に使われた発現宿主によって決定される０例えば 、哺乳類発現宿主（細胞）は、しばしば培地中に血清が必要であるが、そのため に血清蛋白質を除去する余分な段る酵母やバクテリアではたいていの場合、分泌 産物の分離はより単純である。いく９かの発現宿主は発現産物を分泌しないこと もあり、このような場合、発現宿主の破砕物あるいは抽出物から産物を精製しな ければならない。

これらの全ての場合において予想される精製上の問題１生化学的な精製法の標準 的な手法によって解決可能である。

部分精製あるいは完全精製されると、本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、以下の研究 の目的で使用できる０例えば、細胞用培地（例えば、イーグルの最小培地、イス コツの改変ダルベツコ培地または　ＲＰＭ１１６４０．　シグマ・ケミカル社（ セントルイス、’ＭＯ）およびＧＩＢＣＯＤｉｖｉｓｉｏｎ（ジャグリンフォー ルス、オハイオ）から入手可能）の強化物質の研究、および免疫アッセイ、免疫 蛍光染色等に使う特異的な免疫グロブリンを誘導するための抗原物質の研究（一 般的には、「免疫学的手法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　ＭｅｔｈｏｄＳ） 」、第１および■巻、レフコビッッおよびバーニス（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、１． ａｎｄ　　Ｐｅｒｎｉｓ、Ｂ。

）編、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９７９および１９８１）、および 「実験免疫学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ、ワイア（Ｗｅ　ｉ　ｒ、Ｄ。

）編、ブラックウェル・サイエンティフィック・バプリケーションズ、セントル イス、ＭＯ（１９７８）を参照）。

本発明におけるヒトＧＭ、−Ｃ３Ｆは、例えば慢性の感染症に対する自然の抵抗 性を増加させる、血液細胞の再生を促す、等の薬剤組成物中にも使用されるであ ろう。

故に、移植の必要なリュウマチ性関節炎、癌の化学療法、高齢、免疫抑制剤等に よる免疫不全症の愚者は、直接このようなポリペプチドを用いて治療できる。あ るいは、ある人の造血細胞を体外で維持および／または増殖または分化させ、同 一固体あるいは別の固体に再導入して治療効果を高めることが出来るであろう、 これらの組成物は、免疫系の様々な成分を選択的に単独でまたはよく知られた他 の薬剤とともに刺激することができる。特にこの組成物は、リンホカイン等地の 免疫反応性物質（例えばＩＬ−１％ＩＬ−２、ＩＬ−３、Ｉ　Ｌ−４、Ｇ−Ｃ３ Ｆ％Ｍ−Ｃ３Ｆ等）を含むで−あろう。

本発明のヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む薬剤組成物は、ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４６４ の４４頁２７行〜４５頁２１行に記載されている方法で調製し、使用できる。特 に、調製物単位量あたりの活性物質の量は、用途および活性含有物の効力に応じ て変化し、または１μｇから１００■の値で調整されよう。

■、ｉ互五 一旦本発明のｃＤＮＡがクローニングされると、幅広い発現系（即ち、宿主−発 現ベクターの組み合わせ）力（その蛋白質の産生のために使用可能である。可能 な宿主種はバクテリア、酵母、昆虫、哺乳類類等を含むが、それに限られるもの ではない０発現系の選択およびその蛋白質産生の最適化は、以下の多（の要因の 考慮とバランスが必要である。即ち、（１）発現される蛋白質の性質、例えば、 発現蛋白質はいくつかの宿主生物に対して毒性を持つことがあり、またそれは宿 主プロテアーゼの分解を受けることがあり、またはある宿主中では、不活性型や 不溶性型で発現されるかもしれない、（２）目的の単に対応するメツセンジャー ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の性質、例えばそのｍ　ＲＮ　Ａが宿主エンドヌクレアー ゼに特に切断されやすい配列を持つことがあり、そのためにｍＲＮＡの機能的な 寿命が極端に短くなる、あるいはｍ　ＲＮ　Ａが二次構造を取り、リポソーム結 合部位もしくは開始コドンを覆ってしまうことがあり、そのために成る宿主中で は翻訳の開始が阻害される、（３）コード領域に隣接する３′−および５′−領 域中の宿主許容性発現抑制領域の選択、入手可能性および配置−これはプロモー ター、５′−および３′−プロモーター配列、リポゾーム結合部位、転写終結因 子、エンハンサ−、ポリアデニル酸結合部位、キャップ部位、インドロン−スプ ライス部位等を含む、（４）その蛋白質が宿主によって切断され得る分泌シグナ ル配列を持つか、または宿主性のシグナル配列をコードする発現制御配列が成熟 蛋白質をコードする領域中でスプライスされないか、〔５）宿主の感染または形 質転換の可能な形態および効率、そして発現は一過性が好ましいか、恒常的なも のが好ましいか、（６）蛋白質の発現のために必要な宿主培養系の規模及び費用 、（７）転写後の修飾は必要か、また必要ならどのような種類か；例えば必要な グリコジル化の程度と種類で宿主を選択しなければならない（例えば、ライおよ びウォルド（Ｕｙ　　ａｎｄ　　Ｗｏｌｄ）、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８，８９０ −８９６　（’１９７７　）　）　、（８）発現した蛋白質を宿主および／また は培地中の蛋白質および他の物質から分離する方法の用意さ、例えばある場合に は後の精製段階のために特殊なシグナル配列を持つ融合蛋白質を発現することが 望ましい、（９）選択された宿主中での当該ベクターの安定性およびコピー数、 例えばホフシュナイダ−（ｈ、ｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら編、「大腸菌以外の 微生物での遺伝子クローニング（Ｃｒｅｎｅ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ｉｎ　　Ｏ ｒｇａｎｉｓｍｓ　　０ｔｈｅｒ　　ｔｈａｎ　　Ｅ、ｃｏｌｉ）」　（スブリ ンガーフェアラーク、ベルリン、１９Ｂ２）、およびＱ［Ｄ一般に知られる類似 の要因。

上述の要因に着目した、ある発現系の選択および／または修飾に関する指針を提 供する多くの総説が入手可能である：例えば、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）編、「遺 伝子：構造および発現（Ｇｅｎｅｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　　Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ）」の中の、ドウベールおよびシェパード（ｄｅ　　Ｂｏｅｒ　　ａ ｎｄ　　Ｓ’ｈｅｐａｒｄ）、ｒ大腸菌での外来遺伝子の発現を最適化する手段 （Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　　ｆｏｒ　　Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　　Ｆｏｒｅｉｇ ｎ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｔｏｎ　　ｆｎ　　Ｅｓｃｈｅ、ｒｉｃｈｉ ａ　　ｃｏｌｉ）」。

２０５−２４７；　　（ジョンヮイリー＆サンズ、ニューヨーク、ｌ９８３）は 、い（っかの大腸菌発現系を総説しており、クッヒャーラバティ、（Ｋｕｃｈｅ ｒ　１　ａｐａｔｉ）ら、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ　　　ｉｎ　　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６　（４）、３４９−３７９（１９８４）および バネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 ５．１９−３１、（１９８３）は、哺乳類細胞の怒染および形質転換法を総説し ：レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏｌｄ）ｍ、ｒ遺伝子 発現の最大化（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ） 」（バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ポスト：／、１９８６）は、 大腸菌、酵母および哺乳類細胞における遺伝子発現のトビツクをいくつか総説し ており：スイリー（Ｔｈｉｌｌｙ）、ｒ哺乳類細胞工学（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　 　Ｃｅ１ｌ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」　（バターワース（Ｂｕｔｔｅｒｗｏ ｒｔｈｓ）、　ボストン。

１９８６）は、哺乳類発現系を総説している。

同様に、本発明における使用に通した発現ベクターを作製および／または修飾す るためのｃＤＮＡおよび発現抑制領域を結合および／または操作する方法および 条件を記載した多くの総説が入手可能である：例えばマニアチスの「モレキュラ ー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ １ｏｎｉｎ−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒ ｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ）、１９８２）；グローバー （Ｇｌｏｖｅｒ）、’ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ（ＤＮＡＣ１゜ｎ ｉｎｇ：Ａ　　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第１および■巻（ Ｉ　ＲＬプレス、オックスフォード、１９８５）：およびパーパル（Ｐｅｒｂａ ｌ）ｒ分子クローニングの実用ガイド（Ａ　　ＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ　 　ｔｏ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ｊ　（ジョンワイリー＆サ ンズ、ニューヨーク、１９８４）。

一般的には、本発明のｃ　ＤＮＡの挿入のため発現ベクター中に多くの部位を選 択することが可能である。このような部位は、通常それを切る制限エンドヌクレ アーゼによって命名されており、当業者によって非常によ（知られている０組換 えＤＮＡ分子を作製するため、このような部位へＤＮＡ配列を挿入する種々の方 法も非常によく知られている。これらは、例えば、ｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴ によるテーリング、直接のライゲージジン、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼ およびライゲーションまたはＤＮＡポリメラーゼおよびライゲーションに引き続 く適切な一本鎖鋳型によるＤＮＡ鎖伸長に続くポリメラーゼを用いた修復反応を 含む。

宿主培養液中の細胞のトランスフェクションおよび／または形質転換を行う前に しばしば多量の本発明のｃＤＮＡを含むベクターを得ることが必要となる。この ために、ベクターはしばしば最終的に発現に使用されるものとは別の生物（クロ ーニング宿主）中で、有意な発現を行わずに増幅される。そして増幅の後、標準 的な方法、例えばマニアチスら（上述）により記載された方法を用いて、ベクタ ーはクローニング宿主より分離される。

ＤＮＡの消化とは多くの場合、ＤＮＡのある領域にのみ働く酵素を用いたＤＮＡ の触媒的切断を意味する。殆どの場合、このような酵素は制限エンドヌクレアー ゼであり、それぞれが特異的に働＜　ＤＮＡ上の部位は制限サイトと呼ばれてい る。ここで用られる種々の制限酵素り市販品として入手可能なものであり、酵素 販売者によって確立されたそれらの反応条件、補助因子、および他の条件が使用 される。一般的には、約１マイクログラムのプラスミドまたはＤＮＡ断片が、約 １ユニツトの酵素とともに、約２０マイクロリツトルの緩衝液中で使用される。

特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および基質量は、製造者によって指定され ている０通常３７℃で１時者の説明に従って変化しうる。インキュベーシヨンの 後、蛋白質はフェノールおよびクロロホルム抽出によって除去され、消化された 核酸は水相からエタノール沈澱によって回収される。

制限（酵素）（または他の）消化物からのＤＮＡ断片の抽出または着装とは、消 化物のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離、既知分子量マーカーＤＮＡ 断片との移動度の比較による目的の断片の同定、目的の断片を含むゲル断片の切 除およびＤＮＡからのゲルの分離を意味する。抽出方法は、よ（しられている０ 例えばローン（Ｌａｗｎ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、９゜６１０３ −６１１４　（１９８１）；ゲデル（Ｃ，ｏｅｄｄｅｌｌ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ ｉ、ｄ　　Ｒｅｓ、、８，４０５７　（１９８０）およびマニアチスら（上述） を参照。

ライゲーションとは二つの二本１ＤＮＡ間にホスホジエステル結合を形成するプ ロセスをいう、ライゲーションは１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼをライゲー ションするおおよそ等モル量のＤＮＡ断片０．５マイクログラムに加えるという ような既知の条件および緩衝液で行われる。

プラスミドの増幅とは、適切な宿主を形質転換し、プラスミドの総数を増すため に宿主を増殖させることである。

キナーゼ処理されたＤＮＡ断片とは、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸 化された断片を示す、このような処理は５′−リン酸基を欠＜ＤＮＡ断片のライ ゲーションの効率を上昇させる。

適切な発現ベクターは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、例えば、Ｃ ｏｌ　　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ｐ１３Ｒ３２２，ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、よ り広範な宿主のプラスミド例えばＲＰ４．　ラムダファージなどのファージＤＮ Ａおよびそのような誘導体９Ｍ１３等を含む、原核細胞のポリペプチドを融合あ るいは非融合形で、真核細胞の蛋白質を発現するための、さらなるＥ、ｃ。

１ｉベクターは、マチアチスら（上述）の第１２章に記載されている。また、リ ッグス（Ｒｉｇｇｓ）は米国特許４，４３１，７３９号で、さらにＥ、ｃｏｌｉ 発現系を開示しており、これはこの参照によって本明細書に含まれているものと する。

一般的に使用されている原核生物のプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ベニシ リナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔ ｕｒｅ、２７５．６１５　（１９７°８）；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）　　ら 、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８．１０５６　　（１９７７）ニゲデル（Ｇｏｅｄｄｅ ｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ。

２８１．５４４　（１９７９））；およびトリプトファン（Ｔ　ｒ　ｐ　）プロ モーター系（ゲデルら、　Ｎｕ　ｃ　１．　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、８．４０５ ７　　（１９８０）；ヨー０７バ特許出願公開００３６７７６）を含む、こられ が最も一般的に用いられているものである一方、他の微生物由来のプロモーター も発見され使用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が発表され て、当業者がそれを機能的にプラスミドベクターとライゲートすることが可能に なっている；例えばジ−ベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、Ｃｅ１ｌ、２ ０，２６９　　（１９８０）。

大腸菌中での高頻度発現に特に有用な原核細胞性のプロモーターは、ｔａｃプロ モーターであり、ドウポア（ｄｅ　　Ｂｏｅｒ）によって米国特許４，５５１． ４３３号に開示されている。この参照によってこの開示も本明細書に含まれる。

大腸菌宿主のための分泌発現ベクターも入手可能である。特にンライエブ（Ｇｈ ｒａｙｅｂ）らによってＥＭＢＯＪｏｕ、ｒｎａｌ、３．２４３７−２４４２　 （１９８４）に開示された、ｐｌＮ−ｎ［−ｏｍｐＡベクターは有用であり、こ こでは転写されるＣＤＮＡはｏ　ｍ　ｐ　Ａ蛋白質のシグナルペプチドをコード するＥ、ｃｏｌｉ　　ｏｍｐＡ遺伝子の一部に融合されており、このため、成熟 した蛋白質はバクテリアの細胞周辺腔に分泌される。同様に米国特許４，３３６ ，３３６号および４，３３８，３９７号は原核生物のための分泌発現ベクターを 開示している。この参照によって、上記文献は本明細書に含まれる。

Ｅ、ｃｏｌｉ株例えばＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＪＡ２２１．Ｃ６０ ０，ＥＤ７６７、ＤＨＩ。

ＬＥ３９２．ＨＢｌｏｌ、Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）、Ｘ２２Ｂ２．Ｒ ＰＩ　　（ＡＴＣＣ３１３４３）、ＭＲＣＩ　；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　 ５ｕｂｔｉ　１　ｕｓ）の株：およびサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセッセンス（Ｓ ｅｒｒａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の他の腸内細菌、およびシュード モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の種を含めて、各種バクテリア株は 原核生物の発現ベクターの適切な宿主である。真核細胞の蛋白質の発現に有用な Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｘ１７７６等のバクテリア株の誘導法は、カーチス（Ｃｕｒ ｔｉｓ）により米国特許４，１９０．４９５号に開示されている。従ってこの特 許の内容は本明細書に含まれる。

酵母等の真核微生物も本発明における蛋白質の発現に使用可能である。サツカロ ミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅ’ｒｅｖｉｃｉａｅ ）、即ち一般的なパン酵母は真核微生物の中で最も一般的に使われているが、多 （の他の株も一般的に量可能である。サツカロミセス中での発現にはプラスミド ＹＲｐ７が使用される０例えばスティンコーム（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ）ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、２８２．３９　　（１９７９）、キンゲスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ） ら、Ｇｅｎｅ、７，１４１（１９７９）、およびチェンバー（Ｔｓ　ｃ　ｈ　ｅ ｍｐ　ｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ、１０，１５７　　（１９８０）、これらのプラスミ ドは、既にトリプトファン中で生育出来ない酵母の変異株の選択マーカーを提供 するｔｒｐｌ遺伝子を含んでいる０例えば、ＡＴＣＣ４４’０７６またはＰＥＰ ４０−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５，１２　（１９ ７７））、これによって酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐｌ障害がある場合、トリ ブトファン不存在下で生育させることにより形質転換を検出するための有用な環 境が提供される。さらなる酵母のためのベクターは、ミャジマ（Ｍｔｙａｊｉｍ ａ）ら、Ｎｕｃｌ−Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、１２．６３９７−６４１４　（１９ ８４）によって開示されたｐＧＡＬプラスミド、およびベグス（Ｂｅｇｇｓ）、 Ｎａｔｕｒｅ、２７５＋１０４−１０９　（１９７Ｂ）によって開示された２μ 閣プラスミドを含む。

酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は以下のものを含む：３−ホスホグリ セリン酸キナーゼのプロモーター（ヒッツｊ−７ン（ＨｉＬｚｅｍａｎ）ら、Ｊ −Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５５．２０７３　（１９８０））またはエノラーゼ 、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イ ソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ ースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ 等の解糖系の酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、Ａｄｖ−Ｅｎｚｙ ｍｅ　　Ｒｅｇ、、７，１４９（１９６Ｂ）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、 Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７．４９００　（１９７Ｂ））、。

適当な発現プラスミドを構築する際には、発現してポリアデニル化および転写終 結をするために、配列の３′−末端に隣接してこれらの遺伝子に関する終結配列 が、発現ベクター中にライゲーションされる。生育条件によって転写が制御され る付加的な利点を持つ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ ソチトクロームＣ５酸性ホスフアターゼ、窒素代謝にかかわる消化酵素、および 前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよ びガラクトースの利用に関する酵素（ホラノド。前述）のプロモーター領域であ る。また更に他の制御可能なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター系 であり、フォーゲル（Ｆ。

ｇｅｌ）らによって米国特許４，５１１，６５２号°に開示されている。この米 国特許の内容も本明細書に含まれる。事実上、酵母に使用可能なプロモーター、 複製開始点および転写終結配列を含むプラスミドベクターは全て適当である。

サツカロミセス・セレビシェ宿主のための分泌発現ベクター、例えばミャジマ（ Ｍｉ　ｙａ　ｊ　ｉｍａ）　らによってＧｅｎｅ、３７．１５５　１６１　（１ ９８５）に開示されたｐＭＦα８；ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）らによっ て５ｃｉｅｎｃｅ、２１９，６２０−６２５（１９８３）に開示されたＹＥｐｌ ＰＴ；ブレイク（Ｂｒａｋｅ）らによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ、８１．４６４２　４６４６　（１９８４）およびブレイクによりヨー ロッパ特許出［０１１６２０１号に開示されたｐＹｃｒＥＧＦ−２１；およびシ ン（Ｓｉｎｇｈ）によりヨーロッパ特許出１ｉｏ１２３５４４号およびカンジャ ン（Ｋｕ　ｒ　ｊ　ａ　ｎ）らにより米国特許４゜５４６．０８２に開示された プラスミド等は利用可能である。

原核および親核の微生物に加え、多細胞生物由来の細胞よりなる発現系が本発明 における蛋白質を産生ずるために使用される。特に興味が持たれるのは、その翻 訳後のプロセッシング機構が、より生物学的に活性のある哺乳類の蛋白質を作り やすいと考えられる哺乳類発現系である。＠乳類の宿主に対しては、ベクターと してい（つかのＤＮＡ腫瘍ウィルスが用られる：例えばトゥーズ（Ｔｏ　ｏ　ｚ 　ｅ）　編、’ＤＮＡ１！瘍ウィルス（ＤＮＡ　　Ｔｕｍｏｒ　　Ｖｔｒｕｓｅ ｓ）」、第２版（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、Ｎ、Ｙ、、１９８ １）をその生物学の総説として参照、特に重要なものは、バクテリアの複製制御 配列と結合したＳＶ４０複製、転写、および／または翻訳制御配列を含む種々の ベクターである６例えば、オカヤマおよびバーブ（Ｏｋａｙａｍａａｎｄ　　Ｂ ｅｒｇ）によって開発され、Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、２，１６１−１７０ 　（１９８２）およびＭｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、３，２８０−２８９　（ １９８３）に開示されているｐｃＤベクター（参照により本明細書に含まれる） ；ハマー（Ｈａｍｅｒ）によりＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１ ２．８３−１００　（１９８０）および米国特許４，５９９，３０８に開示され ているＳＶ４０ベクター（参照により本明細書に含まれる）：カウフマンおよび 、シャープ（Ｋａ　ｕ　ｆｍａｎ　　ａｎｄ　　５ｈａｒｐ）によりＭｏｌ、Ｃ ｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、２．１３０４　１２１９　（１９８２）におよびカウフマンらにより ヨーロッパ特許出１ｆｉ８４０６１０７号に開示された、付加的にアデノウィル スの制御領域を含むベクター（参照により本明細書に含まれる）、サルの細胞は 多くの場合上述のベクターに望ましい宿主である。このような５Ｖ４０ｏｒｉ配 列と天然のＡ遺伝子を含むベクターはサルの細胞中で（非自律的に増幅するプラ スミドよりも高いコピー数および／またはより安定なコピー数を与えて）自律的 に増幅することができる。

その上、５Ｖ４０ｏｒｉ配列を含み、天然のＡ遺伝子持たずＣＯ３７サル由来細 胞中で高コピー数に自律的（然し安定ではない）に増幅できるべくがグルラマン （Ｇｌｕｚｍａｎ）によりＣｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（１９Ｂ２）に記載 されており、ＡＴＣＣ（寄託番号ＣＲＬ　　１６５１）から入手可能である。上 述のＳＶ４０を基本とするベクターはまた、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれるこ とにより、マウスＬ細胞糖の他の哺乳類細胞を形質転換できる。

ＳＶ４０を基本とするベクターの他に、本発明における使用に適切な哺乳類発現 系は以下のものを含むが、これらに限られるものではない：　（ｉ）サーバー（ Ｓａｒｖｅｒ）らによりＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５，１７ ３−１９０　（１９８３）に開示されたＢＰＶ−ｐＢＲ３２２ハイブリッドおよ びディマイオ（ＤｉＭａｉｏ）らによってＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．４０３０−４０３４　（１９８２）にウシおよびマウス の細胞を形質転換するために開示されたもののようなウシパピローマウィルス（ ＢＰＶ）配列を含むベクター；　（■）エプスタイン−パールウィルス（ＥＢＶ ）配列を含むベクター、例えばヒトおよびサルの細胞を含む種々の哺乳類細胞の 安定な形質転換のためＥＢｖ　ｏｒｉＰ配列（核抗原ＥＢＮＡ−１のコードはい を含む）を持つプラスミドで、イエーツ（Ｙａｔｅｓ）らによりＮａｔｕｒ’ｅ 、３１３．８１２−８１５（１９８５）に、ライスマン（Ｒｅｉｓｍａｎ）らに よりＭｏ１．Ｃｅｌ　ｌ、Ｂｉｏｌ、、１８２２−１８３２　（１９８５）に、 イエーツらによりＰｒｏｅ、ＮａＬ　　］　、　Ａｃａｄ−Ｓｃ　　ｔ、　　Ｕ ＳＡ、　　８１．　３８０６−３８１０　（１９８４）に、およびサグデン（Ｓ ｕｇｄｅｎ）らによりＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、５．４１０−４１３　（ １９８５）に開示されているもの；　（正）マウスおよびハムスターの細胞を形 質転換するためのネズミ類ポリオーマウィルス配列を含むベクター、例えば、オ ハラ（０’　Ｈａｒａ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１５１．２０３　（１９８ １）；　　（ｉｖ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を持つベクタ ー；例えば、アル）（Ａｌｔ）　　　ら　、　　　　Ｊ、　　　　Ｂｉｏｌ　　 、　　　Ｃｈｅｍ、　　　、　　　　２５３゜１３５７−１３７０　（１９７Ｂ ）で、これはメトトレキセート処理によりネズミ類ゲノム（例えばｄｈｆｒ活性 を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株）に共に組み込まれた 隣接するコード領域とともに複製される。これは例えば、アーラム（Ｕ’ｒｌａ ｍｂ）らにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７７． ４２１６　（１９８０）に記載されている；および（Ｖ）アクセル（Ａｘｅｌ） らにより米国特許４゜３９９．２１６に開示されている共形質転換系、入手可能 なり　Ｎ　ＡｍＴＨｚウィルスおよびレトロウィルス由来の種々な要素、例えば 複製開始点、エンハンサ−配列（ラウス肉腫ウィルス由来のロングターミナルリ ピート（ｌＯｎｇ　　ｔｅｒｍｉｎａｌ　　ｒｅｐｅａｔ）配列（Ｒ５Ｖ−ＬＴ Ｒ）等で、ゴーマン（Ｇｏ　ｒｍａ　ｎ）らにより、Ｐｒ　　ｏｃ、　　Ｎａ　 　ｔ、１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ　　ｉ、　ＵＳＡ、　　７９゜６７７７−６ ７８１　（１９８２）に開示されている）、イントロン−スプライス部位、ポリ アデニル化部位等を用いることによりさらなる哺乳類発現ベクターを構築、ある いは既存のものを改変することが出来る。

無を椎動物の発現系も本発明における使用のために構築できる０例えばカイコ、 Ｂｏｍｂｙｘ　　ｍｏｒｉの幼虫にバキュロウィルスベクター、ＢｍＮＰＶを感 染させる。これはマエダ（Ｍａｅｄａ）らにより　ＮａＬｕｒｅ、３１５．８９ ２−８９４　（１９８５）に、また細胞工学（Ｓａｉｂｏ　　Ｋｏｈａｋｕ）、 ４，７６７−７７９　（１９８５）に記載されている。

支流１ 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。

ｃＤＮＡライブラリー、ベクター、および宿主の選択、また試薬の濃度、温度、 およびイ比Ｑ変数の値は、単に本発明の適用を例示するためのものであり、これ がその製薬であると考えられるものではない。

実施例は成熟ＧＭ−ＣＳＦ　（１２７アミノ酸残基）の産生および精製について 記述する。

実施例！、　　　　　富ンパ　　　Ｔ　　　ローンＡ゛のＤＮＡ−イ　°″″１ −の　　　ｃＤＮＡ　　ローンのＣＯ３７ル　　　　　　　　　の ｃ　ＤＮＡライブラリーは、Ｔ−７と命名されたヒトのクローン化Ｔ細胞株およ びヒトの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離したｍＲＮＡより構築した。ライブ ラリーはｐｃＤプラスミド中でオカヤマおよびパーク（上述）の方法に従って構 築した。Ｔ−７ライブラリーから単一のクローンを単離した後、ＰＢＬライブラ リー中に同一のクローンの存在を確認した。

Ａ、クローン化ヘルパーＴ細胞 Ｔ−７と命名したヒトのＴ細胞クローンは、「Ｔリンパ細胞クローンの単離、同 定および利用（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ａ ｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｔ　　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　Ｃ１ ｏｎｅｓ）」、ファスマンおよびツイツチ（Ｆａｔｈｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｆｉ ｔｃｈ）！、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９Ｂ２）の第３６および３ ７章に記載されている方法に従って単離した。細胞株は、１０％の熱非働化ウシ 胎児血清、５Ｘ１０→Ｍの２−ＭＥ、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸およ び必須ビタミン類を含むダルベツコの改変イーグル（ＤＭＥ）培地に、フィトヘ マグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したヒト末梢血リンパ球の培養上清を３０％添加 したもので０゜５Ｘ１０’細胞／ｄの濃度で継代培養した。

Ｂ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ産生の誘導 Ｔ−７細胞を５Ｘ１０’／ｄで４％熱非働化ウシ胎児血清、５Ｘ１０−’Ｍの２ ＭＥ、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸および必須ビタミン類および４μｓ ／ｄのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むＤＭＥ中で培養した。３７℃、１０ ％ＣＯｔ下４〜６時間の培養後、細胞浮遊液を１５００　ｒｐ−で１０分間遠心 分離した。細胞塊を回収し、直ちに一７０″Ｃに凍結した。培養上清は濾過しく ナルゲン（Ｎａ　Ｉｇｅｎｅ）−０，２２ミクロン）、増殖因子源として一８０ ℃で保存した。上滑の一部は、ＣｏｎＡ処理による細胞株の誘導を確認するため ＣＳＦ活性をアッセイした（後述）。

ＰＢＬは７μｇ／ｄのＣｏｎＡを用いた以外は同じ条件で誘導した。

Ｃ，ｍＲＮＡの抽出 細胞の全ＲＮＡをチャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｔｎ。

Ｊ−）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８．５２９４−５２９９　（１９７９ ））のグアニジンイソチオシアネート法により抽出した。ＣｏｎＡで誘導したＴ −７細胞またはＰＢＬ　（刺激後４時間）の凍結した細胞塊をグアニジンイソチ オシアン酸溶解溶液に懸濁した。１．５Ｘ１０３個の細胞に対し、２０ｄの溶解 溶液を用いた。細胞塊をビペフトで再悲濁し、注射器を用いて１６ゲージの注射 針に４回通すことによりＤＮＡ切断した。溶解液を４０ｄのポリアロマ−遠心管 中、２０ｄの５．７ＭＣ３ＣＩ、ＩＯＪＩＭ　　ＥＤＴＡ上に重層した。この溶 液をベックマン（Ｂｉｃｋｍａｎ）社５Ｗ２Ｂ！−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ　　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用い、２５ ００Ｏｒｐｍ、１５℃で４０時間遠心分離した。ＤＮＡを含むグアニジンイソチ アン酸の層を上部から界面まで吸い出した。管壁および界面を２〜３１ｄのグア ニジンイソチオシアン酸溶Ｍ溶液で洗浄した。遠心管をはさみを用いて界面の下 で切断し、ＣｓＣ１溶液を排出した。ＲＮＡ塊を冷却した７０エタノールで２回 洗浄し、５００μｍの１０ｍ？Ｉ）−リス塩酸、ｐＨ７，４，１ｍＭ　　ＥＤＴ Ａ、０．０５％ＳＤＳに再懸濁した。５０ｄ１０３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、 ＲＮＡを１Ｍｌのエタノールで沈澱させた。遠心分離によって０．３ｍＭｇの全 ＲＮＡが得られ、ＲＮＡ塊を冷エタノールで１回洗浄した。

洗浄し、乾燥した全ＲＮＡを９００μｌのオリゴ（ｄＴ）溶出緩衝液（ｌＱｔＭ ）リス塩酸、　ｐＨ７，４，１ｗＭＥＤＴＡ、０．５％５ＤＳ）に再！！濁した 。ＲＮＡは３分間６８℃で加熱しその後氷上で冷却した。１００μｍの５Ｍ　　 ＮａＣ１を添加した。ＲＮＡ試料を結合緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７− ４，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０．５Ｍ　　ＮａＣ１，０，５％５ＤＳ）で平衡化した１゜０−のオリゴ（ｄＴ ）セルロースカラム（タイプ３．コラボラティブリサーチ、ウオルサム、ＭＡ） に添加し九カラムの流出液は更に２回カラムに添加した０次にカラムを０−の結 合緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液で洗浄し、ポリ（Ａ）゛のｍＲＮＡを回収した 。ＲＮＡは通常溶出緩衝液の最初の２ｉで溶出した。ＲＮＡを０．１１容の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）および２容のエタノールで沈澱した。ＲＮＡ塊を遠心 分離によって回収し、冷エタノールで２回洗浄して乾燥させた。ＲＮＡ塊を水に 再懸濁し、一部を希釈して２６０ｎｍの吸光度を測定した。

Ｄ、ｐｃＤ　　ｃＤＮＡライブラリーの構築１）部および２）部１段階１）〜５ ）はＰＣＴ／ＵＳ８５１０２４６４の５６〜６０頁に開示されているようにして 行った。ただしｐｃＤＶＩ　　ＤＮＡ（５７頁、３〜４行目）はＮ５ｉＩエンド ヌクレアーゼを用いて消化した。

（ｃＤＮＡライブラリー調製の）第６段階：ＵＳＡ、６９．２１１０−２１１４ 　（１９７２）に記載された手段を若干改変して行った。カサバダンおよびコー エン（Ｃａｓａｂａｄａｎ、Ｍ、ａｎｄ　　Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、　）によってＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、、１３８，１７９−２０７　（１９８ ０）に記載されたＥ、ｃｏｌｉＫ−１２株、ＭＣ１０６１を３７℃で２０ｄのＬ −ブロス中、６００ｎ−の吸光度が０．５になるまで培養した。細胞を遠心分離 して集め、５０ｍＭ　　ＣａＣ１ｚを含む１０−ｈトリス塩酸（ｐＨ７，３）１ ０ｄに懸濁し、Ｏ″Ｃで５分間遠心分離した。細胞を再び上記の緩衝液２１１１ 中に懸濁し、再び０℃で５分間インキュベートした；次に０．２ｄの細胞懸濁液 を第５段階のＤＮＡ溶液０．ｌａｄと混合し、これを０°Ｃで１５分インキュベ ートした０次に細胞を３７℃に２分間置き、次に室温に１０分１いた；次に０゜ ５Ｉ１１のＬ−ブロスを加え、３７℃で３００分間インキュベート、その後２． ５１ｍ１！！のし一プロス軟寒天と４２℃で混合し、１ｄあたり５０ｄｇのアン ピシリンを含むＬ−ブロス寒天上に広げた。３７℃で１２〜２４時間インキュベ ートした後、個々のコロニーを滅菌爪楊枝を用いて単離した。全体で約５ＸＩＯ ’の独立したｃＤＮＡクローンが生産された。

Ｅ、ＤＮＡ）ランスフエフシラン（感染）によるヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリ ーのスクリーニング１０４の独立したクローンを任意にＴ細胞ｃＤＮＡライブラ リーから抽出し、マイクロタイター培養皿のウェルで５０ｄｇ／ｄのアンピシリ ンおよび７％のジメチルスルホキシドを含むＬ−ブロス２００μｌ中で増殖させ た。マイクロタイター培養皿より４８のｃＤＮＡクローンが調製され、プールさ れた。このプールから４０のクローンを１１００ｊＪ／ｄアンピシリンを含むし 一ブロス中で１リツトルまで増殖させた。各培養物からプラスミドＤＮＡを単離 し、ＣｓＣ１グラジェントを２回通して精製した。各プール由来のＤＮＡ配列以 下の方法でＣ０Ｓ７サル細胞に感染（トランスフエフシラン）させた。

感染の前日、約１０＆のＣ０Ｓ７サル細胞を別々の６０■プレートに、１０％ウ シ胎児血清および２Ｍグルタミンを含むＤＭＥ中で播種した。感染のため、各プ レートから培地を吸引し、５０　ｗｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，４）。

４００　ａｇ　／ａｌｌ　　ＤＥＡＥ−デキストランおよび１５ｄｇの被検プラ スミドＤＮＡを含むＤＭＥｌ、５ｍで置換した。プレートを３７℃で４時間イン キュベートし、ＤＮＡを含む培地を除去、プレートを２Ｍｌの無血清ＤＭＥで２ 回洗浄した。プレートに１５０μＨクロロキンを含むＤＭＥを加え、さらに３７ ℃で３時間インキュベートした。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、４％のウシ胎 児血清、２−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥを添加 した。こののち、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。培養上清を集め 、上述の方法でＣ，Ｍ−Ｃ３Ｆの活性をアッセイした。

４つのプール（グループＩＡ、３Ｂ、７Ａおよび１４Ａ）がヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆ活 性を示した（下記第１表を参照）、各グループをさらに、それぞれ、もともとブ ーｌしされたクローンのうち８つを含むような６つのプールに分割した。各々の プール由来のサブプールのうち１つが感染アッセイで陽性であった。但し７Ａは ２つの陽性なサブプールを産生じた。４または５つのサブプールの中の各プラス ミドを別々にＣＯＳ　７細胞に感染させた。３−８ａ、７−１ａ、７−４ｄ、お 、よび１４−１　ｅと名付けられた４つの独立したクローンがＧＭ−Ｃ３Ｆ活性 を有した。制限エンドヌクレアーゼ解析によってこれらのクローンの全てが実質 的に同じ構造を有することが示された。

第■表は２点の鯛帯血アッセイにおける各怒染サンブルによって！１激された造 血コロニーの数を示す、クラスターは２０から５０細胞を意味し、小コロニーは ５１から１５０細胞、そしてコロニーは１５０以上の細胞を示す。

第■表 偽感染ＣＯ３７７’−１２クラスター プールＩＡ＝　　　　　　　　２９＋２５クラスタープール３Ｂ＝　　　　　　 　３８＋２０タラスクープ−ルアＡ：　　　　　　　　２２＋１９クラスタープ ール１４Ａ：　　　　　　２６＋３２クラスター他の全てのプール　　　　２０ クラスター以下第２スクリーニング　８クローンのサブブール偽感染ＣＯ３７９ ＋１５クラスター サブプール１−５＝　　　　５６＋５４クラスターサブプール３−８：　　　　 ９Ｂ＋５２小コロニーサブプール？−１：　　　　２９＋４１小コロニーサブブ ール７−４：　　　１００＋９３小コロニーサブブール１４−１：　　　４０＋ ７３小コロニー他の全てのサブプール　　２０クラスター以下第３スクリーニン グ　個々のクローン クローン３−８ａ　：　　　１２Ｇ＋１２７小コロニークローン７−１ａ：　　 　１９Ｂ−’、１６４小コロニークローン７−４ａ　＝　　　１７６＋１６０小 コロニークローン１４−１ｅ：　　’６２÷６７　小コロニー他の全てのクロー ン　　　２０クラスター以下実質的に完全長ｃＤＮＡ挿入物を持つプラスミド（ ｐ　ｃＤ−ｈｕｍａ　ｎ−ＧＭ−ＣＳＦ）は第２図に示されており、このプラス ミドを持つＥ、ｃｏｌｉバクテリア（ＭＣ１０６１）はＡＴＣＣに寄託された（ 寄託番号３９９２３）、第２図ではｐｃＤ発現ベクターに含まれる７　７６ｂｐ （Ｚ）ｃ　ＤＮＡ挿入物（７）ＳＶ４０早期７’Ｏモー１−からの転写を矢印で 示した。スプライスの供与および受容部位が示されている。ＳＶ４０由来のポリ アデニル化シグナルは、ｃＤＮＡ挿入の３゛−末端に位置する。ＣＤＮＡ挿入物 中のＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域が濃い影の部分で非コード領域は薄い影の部分であ る。β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ’）および複製開始点を含むベクター配列 の残りの部分はｐＢＲ３２２由来である。

Ｍ１３グイデオキシ　チェーンターミネータ−法（サンガー（Ｓａ　ｎｇ　ｅ　 ｒ、’　Ｆ、）ら、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔ）。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、？４．５４６３７５４６７（１９７７））および改 変マクサム−ギルバート法（ルピンおよびシュミット（Ｒｕｂｉｎ、Ｃ０ａｎｄ 　　５ｅ４６１３−４６１９　（１９８１））の双方を用いて３−８３の配列を 決定した。ｃＤＮＡ挿入物は唯一つの読み枠を持つ、最初のＡＴＧは５′−末端 から３３−３５ヌクレオチドに存在し、ヌクレオチド２６５−４６７の終結暗号 （ＴＧＡ）までの間に１４４コドンを持つ。

第■表はクローン３−８ａ、７−１ａ、７−４ｄ、および１４−１ｅのそれぞれ の影響下で培養された約６０のヒト骨髄および調帯血液コロニーの細胞組成物の 崩壊の割合をパーセント表示したものである。好酸球および他の細胞種の混合コ ロニーが存在するのは、コロニーが一緒に生育したためであろう。

第■表 ヒト骨髄コロニーの細胞組成 Ｎｅｕ　　Ｍφ　　Ｅｏｓ　　Ｎｅｕ／Ｍφ　　ｈφ／Ｅｏｓ　　Ｎｅｕ／Ｍφ ／Ｅｏｓ１５χ　３０χ　７χ　　３７χ　　　　２ｚ９χのＧＭ−Ｃ３Ｆの しへ４０早期複製開始点のＸｈｏｌ切断部位にＨＴＬＶ　（Ｉ）レトロウィルス のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の断片を挿入して構築されるプロモータ ー（ＳＲαと名付ける）を用いて様々な哺乳類細胞中での（１；Ｍ−Ｃ３Ｆの発 現上昇がなされる。ＬＴＲ断片が存在するとＣＯＳサル細胞（例えば寄託番号Ｃ ＲＬ　　１６５０またはＣＲＬ　　１６５１としてＡＴＣＣより入手可能）およ びＣＶＩサル細胞（例えば寄託番号ＣＣＬ　　７０としてＡＴＣＣより入手可能 ）およびマウスＬ細胞（例えば、Ｌ−Ｍ　（ＴＫ−）はＡＴＣＣより寄託番号Ｃ ＣＬ１．３として入手可能）中でＧＭ−Ｃ３Ｆの発現は２０−５０倍に上昇する ０合成りＮＡ断片よりＳＲαプロモーターを構築する方法を以下に示す、ＳＲα はＡＴＣＣ寄託番号６７３１ＢのプラスミドｐｃＤ−ｈｕｌＬ−３−２２−１か らも得られる。

レトロウィルスのＬＴＲはいろいろな系で発現を上昇させることが示されている ：例えばチェノ（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ。

８２．７２８５−７２８８　（１９８５）；ゴーマン（Ｇｏ　ｒｍａ　ｎ）　ら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．６７７７　６７８ １　（１９８２）；チミン（Ｔｅｍｉｎ）、Ｃｅｌ　１，２７．１−３　（１９ ８１）：およびルシウ（Ｌｕｃｉｗ）ら、Ｃｅ１ｌ、３３．７０５−７１６　（ １９８３）がある、ｐＬｌのｘｈＯＩ切断部位に挿入されたＨＴＬＶ　（Ｉ）Ｌ ＴＲＴＲ断片全完全ｉ域およびＲ／Ｕ５境界から最初の下流のＴａｑＩ切断部位 まで（全部で３９塩基）のＵ　Ｓ　ｊＩ域の一部（第３図で０５’と命名されて いる）を含む２６７塩基部分を含む、）ＩＴＬＶ　（Ｉ）ＬＴＲの配列は、ヨシ ダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）らによりＣｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇ）’、１１５，１５ ７　１７５　（１９８５）に開示されている。

ＨＴＬＶ　（Ｉ）ＬＴＲは、実施例■に記載した方法を用い、４段階でプラスミ ドｐ　Ｌ’　１に挿入され、第３図に示す改変プラスミド、ｐＬ１’が作られた 。まずｐＬｌをＢｇｌｌおよびＸｈｏＩで消化し、大きい断片を単離する８次に 大きい断片を合成したＬＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂ（以下で定義する）と標準的なラ イゲーション混合物中で混合する０合成物ＩＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂは共に５′→ ３′の順に以下の者を含む：５Ｖ４０ｏｒｉのＢｇ１１／Ｘｈｏｌ断片、ＬＲＴ のＲりのの２６７塩基の５′−断片およびＳｍａ　Ｉ％　Ｓａ　ｃ　１、Ｎａｅ ｌ、およびＸｈｏｌの順にそれぞれの切断部位を含むポリリンカー。

（Ｂｇｌｌ） ＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣ ＴＴＴＴＴＴＧＧＡ−ＣＧＧＡ　ＧＣＣＧ　ＧＡＧＡＣＴＣＧ　ＡＴＡ　ＡＧ　 ＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＣＴＣＣＧ　ＡＡ　Ａ　Ａ　ＡＡＣＣＴ　−Ｇｌｌ ；ＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴ ｃｃｃ 合成物Ｉ　Ａ／Ｂ ＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣ ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＣＴ 合成物２Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第一段階より得られるプラスミドを増幅、抽出し、Ｓｍａ ｌおよび５ａｃｌで消化して大きい断片を抽出した。大きい断片を次に合成物３ Ａ／Ｂおよび４Ａ／Ｂ（以下に定義する）と、標準的なうイゲーション混合物中 で混合した。

ＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＧＧＴＴＧＡ ＧＴＣＧＣＧＴＴＣ丁ＣＧＧＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧにＣＧＧＴＡＧＧＴ ＧＣＧにＣＣＡＡＣＴＣ合成物３　Ａ／Ｂ ＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＧＴＣ ＣＧＣ−ＡｃｃｃｃＡＡＧＡｃｃｃｃｃｃｘｃｃｃｃｃｃａｃＡｃｃＡｃｃｃＡ ｃｃａｃ丁ＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＧ−ａｃＩ ＣＧＴＣＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＴＴＣＡＡＡ ＴＣ ライゲーションの後、第二段階より得られるプラスミドを増幅、単離し、５ａｃ ｌおよびＮａｅｌで消化し、大きい断片を単離した。大きい断片を合成物５Ａ／ Ｂ（以下に定義する）と標準的なライゲーション混合物中で混合した。

ＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＣＧＧＧＣＣＴττＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＴ丁Ｇ ＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴ−ＴＣＧＡ　ＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＡ　 ＡＣＡＧＧＣＣＧ　ＣＧＡＧＧＧＡ　Ａ　ＣＣＴＣＧＧＡＴＧＧ　Ａ　−Ｎａｅ ｌ ＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣ ＴＣＴＧＡＧＴＣＧＧ 合成物５　Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第三段階より得られるプラスミドを増幅、単離し、Ｎａｅ ｌおよびＸｈｏＩで消化し、大きい断片を抽出した。大きい断片を合成物６Ａ／ Ｂおよび？Ａ／Ｂ（以下に定義する）と標準的なライゲーション混合物中で混合 し、ｐＬ１’と名付けた改変ｐＬ１プラスミドを作製した。

Ｎａｅｌ ＧＧＣＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣ ＴＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＡＣ ＧＡＧ合成物６　Ａ／Ｂ ＸｈｏＩ ＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＴＡＣＡＧＡＴ ＣＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧ ＧＣＡＡＴＧＴＣＴＡＧＡＧＣＴ合成物７　Ａ／Ｂ 増幅の後、ｐＬ１’を精製し、Ｈｉｎｄｌ［Ｉおよびｘｈｏｌで切断し、ＳＶ４ ０　　ｏｒｉおよびＲ−Ｕ５’を含む小さい断片を単離した。また別にプラスミ ドｐｃＤＶ１（第４図に図示する）を精製し、１（ｉｎｄｌｌおよびＸｈｏｌで 消化し、ｐＢＲ３２２ｏｒｉおよびＡ　ｍ　ｐ　’遺伝子を含む大きい断片を単 票した。ｐＬ１’の小さい断片とｐｃＤＶｌの大きい断片をライゲーションし、 そこから得られるプラスミドｐｃＤ（ＳＲα）を増幅したまた、別にプラスミド ｐ　ｃＤ−ｈｕｍａ　ｎ−ＧＭ−ＣＳＦをＸｈｏｌで消化し、ＧＭ−Ｃ３Ｆのコ ード領域を含む小さい断片を単離し、Ｘｈｏｌで消化したｐｃＤ（ＳＲα）とラ イゲーションした。これらより得られる組換え体は、例えば細胞株ＨＢＩＯＩま たはＭＣ１０６１等の大腸菌にトランスフェクションさせ、培養皿にまいたアン ピシリン抵抗性のコードのバクテリアを無作為に選び、別々に増幅させた。プラ スミドを抽出、精製し、そして上述の方法でＣＯ３７サル細胞を感染させるため に用いた。その培養上清のアッセイで、ＧＭ−ＣＳＦ活性が陽性なＣＯ３７培養 物は、目的のｐｃＤ（ＳＲα）−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆプラスミドを持つ。

実施例■、パン　　　・のＧＭ−Ｃ３Ｆの天然のヒト（１；Ｍ−Ｃ３Ｆのシグナ ルペプチドのコード領域を除去し、プラスミドｐＭＦα８の酵母α−因子接合フ ェロモンのシグナルペプチドのコード領域と置換した。パン酵母（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）は、ｐＭＦαＢによって形質転換さ れ、接合因子／Ｃ，Ｍ−Ｃ３ＦＦａ合蛋白質を発現し、成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆを培地 中に分泌する。この実施例の結合はミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）らによりＥＭ ＢＯＪｏｕｒｎａｌ、５．１１９３　１１９７　（１９８６）にも記載されてい る。

パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉ　ｃ　ｉ　ａ　ｅ）は 接合型に特異的なオリゴペプチドのフェロモンを分泌する。Ｍａｔα細胞はα− 因子を分泌し、これはＭａｔα細胞の生育を細胞周期の６７期で停止する（ソー ナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ、Ｊ、）、ｒパン酵母の分子生物学（Ｔｈｅ　　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、　 コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−。

ニューヨーク（１９８１）；特に１４３−１８０頁を参照）、α−因子は２０ア ミノ酸のＮＨよ一末端シグナル配列、それに続くさらなる６０アミノ酸のリーダ ー配７ｉ１１゜および最後に成熟α−因子の配列の４回の同一な繰り返しからな る大きい前駆体として最初は合成される。この繰り返しはお互いから６または８ 個のアミノ酸のスペーサーにより隔てられている（Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ− Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＡｌａおよびＬ　ｙ　ｓ　−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｇ　１　ｕ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ（またはＡｓ　ｐ）−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｕ　−Ａ　１　ａ　）　＊こ のプレプロα因子はいくつかの特異的な部位で切断を受ける。最初のプロセッシ ングは、ＫＥＸ２産物によって触媒される。スペーサー配列中のＬｙｓ−Ａｒｇ ペアのＣ００Ｈ−末端の結合であるニジユリウス（Ｊｕｌｉｕｓ）　ら、Ｃｅ、 １１，３７．１０７５−１０８９　（１９８４）、カルボキシペプチダーゼＢ様 の酵素がＬｙｓ−ＡｒｇベアのＮＨ工°−末端側で切断する。最終の段階は５Ｔ Ｅ１３によってコードされるジアミノペプチダーゼによるＧｌｕ−Ａｌａまたは Ａｓｐ−Ａｌａペアの除去である。ブレイク（Ｊ、Ｂｒａｋｅ）；）は、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１゜４６４２−４６４６　（１ ９８４）で成熟ヒト蛋白質をコードする配列と第一プロセッシング部位の融合に よってこのような蛋白質が分泌されることを示した。

アルファ因子プロモーターおよび下流のリーダー配列を他の要素とともに含む、 ｐＭＦα８と名付けられた一般的な酵母の発現ベクターは、ＡＴＣＣに寄託番号 ４０１４０で寄託されている。これは以下のようにして構築することができる： ＭＦα１遺伝子を持つ１．７ｋｂのＥｃ　ｏＲＩ断片（カージャン（Ｋｕｒ　ｊ ａｎ、Ｊ、）およびヘルショウィンッ（Ｈｅｒｓｈｏｗｉｔｚ、１．）、Ｃｅ１ １，３０゜９３３−９４３　（１９８２））をＭ１３ｍｐ８（ビエラおよびメフ シング（Ｖｉｅｒａ、Ｊ、ａｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）、Ｇｅｎｅ、１９ ，２５９−２６８　（１９Ｂ２））中にクローニングした。第一スペーサー領域 のりジンコドンのあとにＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部位を導入するため、合成オリゴヌ クレオチドＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣを単鎖Ｍｉ３−ＭＦαＩ 　　ＤＮＡとハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドブライマーをＤＮＡポリメ ラーゼＩ　クレノー断片を用い伸長した。Ｓ１ヌクレアーゼ処理の後、ＤＮＡを Ｆ、　ｃ　ｏ　ＲＩで切断し、ＭＦα１プロモーターおよびリーダー配列を含む 断片をｐＵｃ８　（ビエラおよびメッシング、上述）のＥｃｏＲ■および埋めら れたＨｉｎｄｍ制限酵素切断部位にクローニングした。望ましい構造のプラスミ ドが一つ単離された（ｐＭＦα４Δ１と命名した）、ｐＭＦα４Δ１をＨｉｎｄ ｎ［によって切断し、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼＩク レノー断片を用いて部分的に補足した。ＤＮＡをヤエナリのヌクレアーゼで処理 し、オリゴヌクレオチドリンカー（ＧＣＣＴＣＧＡＣ；ＧＣ）を結合した。得ら れたプラスミド（ｐＭＦα５と命名した）は、アルギニンコドンの直後に５ｊｕ ｌ切断部位、またその後にＸｈｏｌ制限酵素切断部位を持つ、Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ−Ｅ、ｃｏｌｉのシャトルベクタ（ｐ　Ｔ　ＲＰ　５８４ 　）は以下のようにして構築される。

２μ■プラスミドの複製開始点（ブローチ（Ｂ　ｒ　ｏ　ａ　ｃｈ、Ｊ、）、上 述）を含むＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ断片をＰＴＲＰ５６（ミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍ ａ）ら、Ｍｏ１−Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、４．４０７−４１４　　（１９８４） のＣ１ａＩ制限酵素切断部位にクローニングし、ＴＲＰＩ−ＡＲ３ＩＲ３中の３ ｔｕ’Ｉ制限部位をＰｖｕＩＩリンカ−挿入によってＰｖｕＩＩ制限部位へ変換 した。基本となるｐＴＲＰ５６のＫｐｎｌｉｊｌ＠部位はＸｈｏ　Ｉリンカ−挿 入によりＸｈｏＩに転換した。そしてｐＴＲＰ５８４のＢａｍＨＩ−Ｘｈ　ｏ　 ｌ制限部位にｐＭＦａ５のＢｇ　ｌ　ＩＩ−Ｘｈｏ　１断片を挿入することによ り、−ａ的な分泌ベクターｐＭＦα８を得た。

ｐＭＦα８にクローニングする前に、シラー（Ｚｏｌ１ｅｒ）およびスミス（Ｓ ｍｉｔｈ）によりＭ　ｅ　ｔ　ｈ　Ｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １００，４６８−５００　（１９８３）に開示された方法を用い、Ｍ　１３　ｍ Ｐｓ中のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　ｃＤ ＮＡ中にＦｓｐＩｆＢｌ］限部位を導入した。導入したＦｓｐ１部位によってｐ ＭＦα８への挿入前に内因型のシグナルペプチドのコード領域および成熟蛋白質 をコードする領域の中間でｃＤＮＡ挿入物を切断することができる。

簡単に述べると、完全なｃＤＮＡ挿入物（第２Ａ図を参照）を含むｐｃＤ−ｈｕ ｍａｎ−ＧＭ−ＣＳＦのＢａｍＨＩ断片をＭｌ　３ｍｐ　８の複製型にクローニ ングし、それを用いてＥ、ｃｏＬｉ　　ＪＭＩＯＩを形質転換した挿入物を含む Ｍ１３ｍｐ８はイソプロとルーベーターＤ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）およ び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ベーターＤ−ガラクトシド（Ｘ− ｇａｌ）を含む寒天上で透明なプラークより選択した。それぞれ選ばれたプラー クに対応する８つのＥ。

ｃｏｌｉ　　ＪＭＩＯＩ培養物から標準的な技術（遠心分離、上滑よりポリエチ レングリコールを用いたファージ粒子の除去、ファージのコート蛋白質からＤＮ Ａを分離するためのフェノール抽出、およびエタノール沈Ｂ）を用いて、それぞ れ単鎖のＭ１３ｍｐ８ＤＮＡを調製したクロスハイブリダイゼーションおよびゲ ル電気泳動を用いて決定したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の方向に従って、８セツトの ＤＮＡを２つのサブセントに分類した。各サブセットの単鎖ＤＮＡに対してそれ ぞれオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行った。逆に２つのサブセント中 のＤＮＡを配列決定し、正しい方向でｃＤＮＡ挿入物を含む単鎖ＤＮＡを決定す ることもできる。

以下の配列を持つ（ミスマツチ（不一致）を下線で示した）２０残基のオリゴヌ クレオチドプライマーを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ。

、モデル３８０Ａ、フォスターシティ−、ＣＡ）：ＧＴＣＧＴＡＧＡ以旦ＣＧＴ ＧＧＧＣＧＧＧ３−リン酸化の後、２０残基のオリゴヌクレオチドプライマーを 約３０倍過剰の単ＭＤＮＡ　（約１μｇ）と混合し、５μｌ容の０．５ＭＮａＣ １中で６５°Ｃで５分間加熱し、室温で１時間放置した。緩衝液および塩類の濃 度は以下のように調製した。１００ｍＭ　　ＮａＣ１，２（１＋Ｍ）リス塩酸で ｐＨ７，５，１０ｍＭジチオスレイトール。

１０ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、４種のデオキシヌクレオシド３リン酸を約４００． ｃｒＭずつ、ＡＴＰを約５００ｕＭ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片） およびＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、反応液を１２℃でインキエベートした。

二重鎖環状ＤＮＡをアルカリ巨糖密度勾配遠心法によって単離し、ＣａＣ１ｇ処 理した大腸菌ＪＭＩ　Ｏ１を形質転換するのに用いた。ブライマーで使用したも のと同じ配列を持２ｔ　ｐ標識したオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイ ゼーションを行い、変異Ｃ−ＤＮＡを含む大腸菌ＪＭＩＯＩのコロニーをスクリ ーニングした。

増幅の後、変異を含むＭ１３ファージをＥｓｐｌおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩを用い て消化し、（ＢａｍＨＩ切断部位の突出端を平にするために）ＤＮＡポリメラー ゼＩクレノー断片で処理し、ゲル電気泳動にかけた。最後に抽出されたＣＭ−Ｃ ３Ｆを含む断片をｐＭＦｃｒ８のＳｔｕ　Ｉ切断部位に挿入した。

サツカロミセス・セレビシェ２０Ｂ−１２（ＭＡＴαｔｒｐｌ−２８９ｐｅｐ４ 　３）酢酸リチウム法（イトウ（Ｉｔｏ）ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５ ３．１６３−１６８　（１９８３））によりｐＭＦα８で形質転換し、０．６７ ％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸および２％グルコー スを含む培地で培養した。

鱈帯血を用いたコロニーアッセイにより、酵母培養液中に分泌されたＧＭ−Ｃ３ Ｆを確認した。

実施例　■、　　　ＣＤ　・のカセー　ミュー　ジェネシス゛　　ＣＯ３７ル　 　・の　　のた の入　ＧＭ−Ｃ３Ｆ”　　　の゛告 本実施例での合成遺伝子の造成および発現の技術は、分子生物学分で標準的なも のである０例えばスブロートおよびゲイト（Ｓｐｒｏａｔ　　ａｎｄ　　Ｇａ１ ｔ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１３巻２９５９− ２９７７　（１９８５）；ミューリンバッハ（Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈ）　　ら、 Ｊ、Ｂｉｏｔ、Ｃｈｅｍ。

、２６１巻、７１９−７２２　（１９８６）：フエレンチ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ） 　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、８３巻、５９９−６０３　 （１９８６）：ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら、Ｇｅｎｅ、３４巻、３１５−３２３ 　（１９８５）；およびエステルら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３３巻、６５９−６６ ３　（１９８６）を参照。

スブロートおよびディト（上記）およびフエレツチら（上記）は、遺伝子合成の 技術の応用の指針とて、参照により本明細書に含まれる。Ｎ単に述べると、合成 ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子のは、複数の化学合成された二重鎖ＤＮＡフラグメント から集成される０合成意地の塩基配列は、集成された合成遺伝子が、該遺伝子を 運ぶベクターに関して一連のユニークな制限部位を含むように選択される。

一連のユニークな制限部位は一連のセグ、メントを規定し、これらのセグメント は容易に切断して変更塩基配列を有するセグメントに置換することができる０合 成フラグメントは直接または他のフラグメントと連結してから、適当なベクター 例えばｐｃＤプラスミド等に連結する。

これらのセグメントは、ウェルズ（Ｖｅｉｌｓ）ら（上記）のカセットに相当す る０合成フラグメントの合成は標準的技術で行われる、例えばゲイト、オリゴヌ クレオチド合成：実際的アプローチ（ＩＲＬブレス、オックスフォード、英国、 １９８４）を参照、好ましくは、アプｙｓＬｅｍｓ、Ｉｎｃ、）（フォスターシ ティ−、ＣＡ）のモデル３８０Ａのような、自動合成装置が使用される。ｐｃＤ プラスミドおよび他の適当なベクターは、例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）から市販されている。ｐｃＤはそのクローニングを大腸菌（Ｅ、　　ｃｏ ｌｉ）　　ＭＣ１０６１またはＨＢＩＯＩで、そして完本実施例において、合成 ヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子がＰｃＤプラスミド中への挿入のために造成される。簡 単に述べると、ｐｃＤベクターの造成には先ず、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼで四つ のフラグメントを連結する：　ｐＢＲ３２２のｏｒｉおよびＡｍｐ、’ｗｉ域を 含むｐｃＤＶｌからの大きいＨｉｎｄＩ［Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント、ＳＶ４ ０の早期領域プロモーターおよび後期領域イントロンを含むｐＬｌからのＨｉｎ ｄＩ［［／ＰｓｔＩフラグメント、および合成物１１Ａ／Ｂ（後述）０次に、一 連の増幅、精製、および挿入工程の間に、残りの合成フラグメント１２Ａ／Ｂか ら１９Ａ／Ｂまでを、完全合成ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子がｐｃＤベクター中に生じる まで付加する。この合成遺伝子は、制限部位５ａｃＩ、Ｎａｒｌ、ＢｓｔＥＩ［ 、Ｎａ　ｅ　Ｉｓ　Ｘｍａｌ［［、Ｂｃｌ　Ｉ、Ｍｌｕｌ、５ａｕＩ％Ａｐａｌ 、ＮｈｅＩ、Ｂ　ｓ　ｐ　Ｍ　ｎ、５ｐｅｌ、および５ａｃｎおよう規定される 複数配列カセットからなる。

制限エンドヌクレアーゼ消化およびリガーゼ反応は、標準手順、例えばマニアチ スら、Ｍ　ｏ　ｌｅ　ｃ　ｕ　１　ａ　ｒＣ１ｏｎｉｎｇ＝Ａ　　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、ニュー ヨーク、１９８２）を用いて行われる。

アルカリ法（上記、マニアチス）は、小規模なプラスミド調製に用いられる。大 規模な調製のためには、アルカリ法の修正法が用いられ、それによると澄明化し た溶解物（ライゼート）から核酸を沈澱させるために、同容量のイソプロパツー ルが用いられる。塩化セシウム平衡密度遠心および臭化エチジウムでの検出の前 に、冷２゜５Ｍ酢酸アンモニウムを用いてＲＮＡを除去する。

クローニングすべき合成りＮＡの相補鎖（各々約４００ｎｇ）を混合し、５０μ ｌ０反応容量中で、ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホリル化する。この ＤＮＡを適当な制限酵素で消化してベクターＤＮＡＩμｇと、５０μｌの容量中 で室温で４ないし１２時間連結させる。

ホスホリル化、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、連結、および細菌の形質転換 に関する条件は、前記マニアチスらに記載されている。

工程１においてｐｃＤＶｌを増幅、単離しおよびＨｉｎｄｌ［ｌとＢａｍＨＩで 消化する。ｐＢＲ３２２のｏｒｉおよびＡｍｐ’ＳＪｉ域を含むフラグメントを 、例えば前記マニアチスらの標準的方法を用いてゲル電気泳動で単離する。ｐＬ ｌを増幅し、単離し、そしてＨｉｎｄｌＩ［とＰｓｔｌで消化する。ＳＶ４０の 早期領域プロモーターを含むフラグメントをゲル電気泳動で単離するａ　ｐ　ｃ 　Ｄ　ＶｌおよびｐＬｌから単離された二つのフラグメントを、次に合成物１１ Ａ／Ｂ（後述する）と、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で混合する０合成物１ １Ａ／Ｂは新たに生じるｐｃＤベクターの挿入物となり、このｐｃＤベクターを 大腸菌中で増幅し、次いで単離する。

工程２において工程１で単離されたｐｃＤベクターを５ａｃ１およびＮａｅＩで 消化する。大きいフラグメントを分離しそして合成物１２Ａ／Ｂおよび１３Ａ／ Ｂと標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で混合し、工程２のｐｃＤベクターを生じ させ、これを大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅させて単離する。

工程３において、工程２で単離されたｐｃＤベクターをＮａｅｌおよびＭｌｕｌ で消化する。大きいフラグメントを単離して、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中 で合成物１４Ａ／Ｂおよび１５Ａ／Ｂと混合し、工程３のＰｃＤベクターを生じ させ、これを大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅させて単離する。

工程４において、工程３で単離したｐｃＤベクターをＭ　１　ｕ　ＩおよびＢ　 ｓ　ｐ　Ｍ　ＩＩで消化する。大きいフラグメントを分離して、合成物１６Ａ／ Ｂおよび１７Ａ／Ｂと標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液と混合して工程４のｐｃＤ ベクターを生じさせ、これを大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅して単離する。

工程５において、工程４で単離されたｐｃＤベクターをＢ　ｓ　ｐ　Ｍ　Ｕおよ び５ａｃｎで消化する。大きいフラグメントを分離しそして標準的Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼ溶液中で合成物１８Ａ／Ｂおよび１９Ａ／Ｂと混合してｐｃＤ中に完全合 成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を生じさせる。増幅の後、単離したベクターを、前記した ようにＣＯ３７サル細胞を形質転換するために使用する。

合成物１１Ａ／Ｂないし１９Ａ／Ｂを以下に列挙する。

ユニークな制限部位の位置及び種類は配列の上に示されている。

（ｐｓＴＩ）　　５ａｃｌ　　Ｎａｅｌ　　旧ｕｌ　ＢｓｐＭＩＩ　ＳａｃＩＩ （ＢａｍＨＩ）ＧＧＡＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＡＣＧＣＧＴＴＣＣＧＧＡＣＣＧＣ ＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧ ＣＣＣＣＴＡＧ合成物　１１Ａ／Ｂ （ＳａｃＩ） ＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡにＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＴ ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣ−丁ＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＴＣＴＣＧＧＡＣＧＡ ＣＧＡＣＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＡＣＧＴＣＧ−Ｎａｒｌ ＡＴＣＴＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＣ ＡＧＡＧＣ 合成物　１２Ａ／Ｂ ＢｓｔＥＩＩ Ｃ（８ＧＴＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡ［；ＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣ ＡＴＧ４Ｇ−ＣＧＣ［；ＧＧＣＧ［；ＧＣＣＡＣ；ＴにＧｆｄＣにＧＧＧＴＣＧ ＴＩ；ＣＧＴＣＧＧＧＡＣＣＣＴＣにＴＡＣＡＣ−（Ｎａｅｌ） ＡＡ７ＧＣＣＡ７ＣＣＡＧＩｌ；ＡＧＧＣＣＣＧＣＣＴＴＡＣＧＧＴＡＧＧＴＣ ＣＴＣＣＧＧＧＣＧＧ合成物　１３Ａ／Ｂ （Ｎａａｌ）　　　　　　　　　　　　　χ−ａｌｌｌ　　　　’　　　　　　 Ｂｅ１ｌＧＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡ ＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴ−ＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧ ＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＴＣＴＡＣＴＴＡＣＴＴＴＧ　丁 ＣＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＡ 合成物　１４Ａ／Ｂ （Ｍｌｕｌ） ＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧ ＡＣＡＣＴＡＧＴＣＡＣＴＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧ ＧＡＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＧＣ合成物　１５Ａ／Ｂ （旧ｕｌ）　　　　　　　　５ｓｕｌ ＣＧＣＧＴＴＴＧ　ＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡ　ＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧＧ ＣＡＧＣＣＴＣＡ　ＣＣＡＡ　ＧＣＴＣＡＡ　Ａ　ＡＣＣＴＴＧ　ＡＣＡＴＧＴ ＴＣＧＴＣＣＣＧＧ　ＡＣＴＣＣＣＣＧ　ＴＣＧＧ　ＡＧＴＧＧＴＴＣＧ　ＡＧ ＾ｐａ！ ＡＧＧＧＣＣＣＣ 合成物　１６Ａ／Ｂ ＮｈｅＩ ＣＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＴＧ ＣＣＣＴ−ＴＴＣＣＣＧＧＧ　ＧＧＡＡ　ＣＴＧＧ　ＴＡＣＴＡＣＣＧＡＴＣＧ ＧＴＧ　ＡＴＧＴＴＣＧＴＣＧＴＧ　ＡＣＧ　ＧＧＡ　−（ＢｓｐＭＩＩ） ＣＣＡＡＣτ ＧＧＴＴＧＡＧＧＣＣ 合成物　１７Ａ／Ｂ （Ｂｓｐ？ｌ１１） ＣＣＧＧ　ＡＡ　ＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧ　ＣＡ　Ａ　ＣＣＣＡ　ＧＡＴＴＡＴＣ Ａ　ＣＣＴＴＴＧＡＡ　ＡＧＴＴＴＣＡ　ＡＡ　−ＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＣＧ ＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＴＧＧＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴ−ＧＡＧＡ ＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣ ＴＣＴＴＧ 合成物　１８Ａ／Ｂ ｐｅＩ ＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＣＴにＧＧＡＧＣＣＡ Ｇ４Ｃ−ＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡ　ＧＡＴＧ　Ａ　ＴＣＡＧＴＡ　ＧＧＧＧ　 ＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＣＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧ　−（ＳａｃＩＩ） ＣＡＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣ ＧＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧ 合成物　１９Ａ／Ｂ 実施例　Ｖ　、　　　Ｇ　Ｍ　　’ＣＳ　Ｆ　Ｑ　ｓ、　　−４７Ｌ　ｅ　ｕ　 ”　（Ｄ造およびＣＯ３７サルーに二重」 アミノ酸７９位のＭｅｔをＬｅｕに変化させてヒトＧＭ−Ｃ３ＦミューティンＬ ミューティンを造成する。完全合成ＣＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を含む実施例■のｐｃＤ プラスミドをＡｐａＩｋよびＮｈｅＩで消化する。大きいフラグメントを単離し て次の合成片と標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で混合する： ＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧ ＣＣＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧ［；ＡＣＴＡＣＣＧＡＴＣ修飾コドンをアンダーライ ンで示した。得られるｐｃＤベクターを大腸菌ＭＣ１０６１中で増幅し、単離し 、そして実施例Ｉで記載したようにしてＣＯ３７サル細胞中に形質転換する。３ 〜４日インキュベートした後、ＣＯ３７の培養上澄を収穫しＣ；Ｍ−Ｃ３Ｆ活性 をアッセイする。ＧＭ−ＣＳＦのミューティンＬ　ｅ　ｕ　”を標準的方法を用 いて精製する。

実施例　■、　広竺二二玉」」」とヨ２仁と７１ｅ二二二゛告　およびＣＯ３７ サル　　での アミノ酸１１６位のＶａｔをＩｌｅに変化させて、ヒ）ＣＭ−Ｃ３Ｆミユーテイ ン１１ｅ１１４を造成する。完全合成ＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を含む実■のｐｃＤプ ラスミドをＢ　ｓ　ｐ　Ｍ　Ｉ！および５ａｃｌｌで消化する。大きいフラグメ ントを単離して、標準的Ｔ４ＤＮＡリガーゼ溶液中で次の合成フラグメント１お よび２と混合する。：ＣＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＡＴ ＴＡＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣ丁ＴＴＧＡＡＧＧ ＡＣＡＣＧＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＴＧＧＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＡＧスｉＬ Ｌ之止ユ ＣＴＧＡＡＧｔｌ；ＡＣＴＴＴＣＴＧＣ丁丁ＡＴＣＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＴ ＧＣＴＧＧＧ−ＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＡＡＴＡ ＧＴＡＧＧＧＧＡＡＡＣτＧＡＣＧＡＣＣＣ−ＡＧＣＣＡＧ丁ＣＣＡＧＧＡＧＴ ＧＡＣＣ［；ＣＴＣＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＣＴにＧフラグメント２ 修飾されたコドンはアンダーラインで示されている。得られるｐｃＤベクターは 、大腸菌ＭＣ１０６１で増幅され、単離され、実施例１で記載されたようにして ＣＯ５７サル細胞中に形質転換される。３〜４日のインキュベート野の血ＣＯ３ ７培養上澄を収穫しＣＡＭ−Ｃ３Ｆ活性についてアッセイされる。にＭ−Ｃ３Ｆ ミユーテイン１１　ｅ１１６は標準的方法で精製される。

実施例■、１′　　　・のＧＭ−Ｃ３Ｆの成熟ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのコード領域を ｏ　ｍ　ｐ　Ａ蛋白質のシグナルペプチドコード領域を含むベクターｐＩＮ−グ ライエブ（Ｇ　ｈ　ｒ　ａ　ｙ　ｅ、　ｂ　）らによりＥＭＢＯＪ。

ｕｒｎａｌ、３．２４３７−２４４２　（１９８４）に、および？スイ（Ｍａｓ ｕｉ）らによりＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２．８１−８５　（１９８４）に 開示されている。これらの文献の内容は参照により本明細書に含まれる。

この挿入は３段階で行った。最初に成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域を含むｐｃＤ− ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片をＭ１ ３ｍｐｌＯの複製型（ＲＦ）のＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ消化物に挿入し、点特異的 突然変異誘発により、成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆの基礎と成るコドンに隣接して、そよび その５゛−末端に、Ｅｃ。

Ｒ１部位を導入した。第２に変異したＭ１３ｍｐｌＯのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨＩ 断片をｐ　ＩＮ−ｍ−ＯｍｐＡ２のＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ消化 物に挿入した。最後にＰＩＮ−ｍ−ＯｍｐＡ２中のＯｍｐＡシグナルペプチドコ ード領域および成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域間の余分な９塩基対の配列を点特異 的突然変異誘発により除去した全ての場合においてＭ２Ｓの変異型は合成ブライ マーをプローブとして検出した。

全ての制限酵素消化、ＤＮＡポリメラーゼ、キナーゼおよびリガーゼの反応は、 本質的にマニアチスらにより記載された方法にしたがって行った。酵素はニュー イングランドバイオラボ社およびベーリンガーマンハイム社より購入した。プラ スミド抽出はアルカリ法（小規模：マニアチスら、上記）またはその変法（大規 模：ツラウスキ（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．。

１３７．３３５４−３３６０　（１９８６））で行った。

点特異的突然変異誘発は、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１０ベクターにサブクローニング されたＤＮＡ断片を用いて行った。１０ｎＨのキナー讐処理したブライマーＤＮ Ａを５０〜１００ｎＨの単鎖鋳型ＤＮＡとりガーゼ緩衝液４０μｍ中で混合した 。この混合物に１１００ｎの直鎮Ｍ１３ＲＦを添加した８反応混合物は９５℃で １０分間加熱した。アニーリングは室温で３０分、次に４℃で１５分おいて行っ た。

ｄＮＴＰ（５０ＭＭ）、リガーゼ（４０００）およびクレノー（５Ｕ）を加え（ 総量５０μｌ）、混合物を３０分間４℃で、次に１時間１２℃でインキュベート した。

混合物をＪＭＩＯＩ細胞中に形質転換し、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬ− ブロス（ＬＢ）プレートにｆｆ１ｆ！した。白色のプラークをマイクロタイター 培養皿の１５０μＩＬ−プロス中に楊子で移した０Ｍ１３惑染細胞をＬＢプレー ト上のＪＭ１０１ｍ胞層上に接着法を用いて移した。３７℃で１６時間のインキ ユベーションの後、予め湿らせたニトロセルロース紙をプラーク上に１分間接着 させた。フィルターを０．０５Ｍ　　ＮａＯＨに３分間、中和緩衝液（３Ｍ　　 Ｎａｃｌ、０．５Ｍ　　）リス塩酸、ｐ！１７．５）に１５分間浸した。再度１ ５分間新しい中和緩衝液液に浸した後、フィルターを２ＸＳＳＣ中に移した。フ ィルターを乾燥し、８０℃で１．５時間加熱した。フィルターの前−へイブリダ イゼーション処理ｃ′Ｌ０．０９Ｍ）リス塩酸、ｐＨ７，５，ＩＸＤｅｎｈａ　 ｒｄｔｓ、　　０．　　９Ｍ　　　ＮａＣ１，Ｏ，ＩＭ　　　ＡＴＰ、　　　１ ｍＭＰｉ、１ｍＭ　　ＰＰ、０．５％ＮＦ４０，６ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび０． ２■／ｄの大腸菌ｔ　ＲＮＡ中、室温で３時間行った。３２Ｐで標識したプロー ブを加え、更に室温で１６時間インキュベートした。フィルターは加熱しながら 、オートラジオグラフィーで背景のカウントが検出されなくなるまで６ＸＳＳＣ ，０，１％ＳＤＳ中で洗浄した。

必要に応じて、ＳＳＣの濃度を下げた。ＶＢ性プラークより単鎖ＤＮＡを単離し 配列決定を行った。

ＤＮＡの配列形質転換委は標準的なグイデオキシ法（サンガー（Ｓａ　ｎｇ　ｅ 　ｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１゜Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　、　　７４．　５ ４６３−５４６７　　（１９７７））を使用した。ＤＮＡのオリゴヌクレオチド は、アプライドバイオシステムズ社３８０Ａ合成機を用いて、ホスホルアミダイ ト化学法によって合成した。

ｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨ１断片を ＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ　１０ＲＦにクローニングした 。標準的な技術（メフシング、上述）を用い、この組成物の単鎖ＤＮＡを調製し 、第１図に示されているＧＭ−Ｃ３ＦのＣ−ＤＮＡ配列の８３と８４塩基対の間 にＥｃｏＲＩ切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）を導入するために点と特異的突然変異誘 発を行った。下託の合成ブライマーを使用した：５”−ＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＴ ＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴ−３’Ｅｃ　ｏＲＩ切断部位を下 線で示した。挿入変異体の配列を決定した後、ＣＭ−Ｃ３ＦＣ−ＤＮＡを含むＭ ２ＳのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１断片をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ で消化したｐ　Ｉ　Ｎ　−ｍ　−Ｏｍ　ｐ　Ａ　２に挿入して、大ｖｉｉ菌ＪＭ １０１中で増幅、単離し、ＸｂａｌおよびＢａｍＨＪで消化した。ＧＭ−Ｃ３Ｆ 　　Ｃ−ＤＮＡを含むＸ　ｂ　ａ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩ断片をＸｂａＩ／Ｂａ ｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ　１０ＲＦに挿入した。単鎖ＤＮＡを標準的な方法 を用いて単離し、下記の合成ブライマーを用いて点特異的突然変異誘発を行った ： ５’−ＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣ丁−３′ＧＣＴＧＡ ＡＴＴＣ ブライマーの配列の間隙および下段の下線を付した配列は、９塩基対の欠失およ びその欠失した配列を示す、欠失変異体の配列を確認した後、そのＸｂａＩ／Ｂ ａｍＨ１断片を単離し、Ｘｂａｌ／ＢａｍＨＩで消化したｐｉＮ　−ｍ　−Ｏｍ 　ｐ　Ａ　２とライゲーションして、大１ｇ面ＪＭ１０１を形質転換するために 用いる最終的な構築物を得た。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の可溶性抽出物から順に、陰イオン交換、色素−リガン トアフィニティー、ゲル漉基および逆相クロマトグラフィーを行って、ＧＭ−Ｃ ３Ｆを精製した。望ましくは一連のクロマトグラフィーはＱＡＥ（第四アミノエ チル）カラムクロマトグラフィー、マドレックス（Ｍａｔｒｅｘ）ゲルＲｅｄ　 　Ａカラムクロマトグラフィー、限外濾過による濃縮および／または硫酸アンモ ニウム沈澱、セファデックス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄｅｘ）Ｇ−１００ゲル漉 過、お、よびＦＰＬＣまたはＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーのいずれかを含む 、この操作による最終票品は、特異性の高い生物学的活性、９５−１００％の電 気泳動的純度、゛低量の発熱物質そして低量の大腸菌由来のきょう雑物またはＧ Ｍ−Ｃ３Ｆの誘導物を示した。

特に示さない限り、全ての繰作は２−１５℃で行っ旭各段階でコマジー青結合ア ッセイにより蛋白質濃度を決定した。　ｐＨ測定は＋０．２単位で、誘電率測定 は＋３ｍｓの巾で変化し得る。どのクロマトグラフィー操作においても、期待さ れる精製度が得られない場合、溶出過区分を集め、同じカラムで再クロマトグラ フィー、または以前の操作、または以前の一連の操作を再び行った。硫酸アンモ ニウム沈澱および／または限外濾過法は、蛋白質を濃縮および／または保存する ために行った；例えばステップＣの操作である。カラムの平衡化および溶出に使 用するものを含む全ての溶液は、使用前に０．２μ膜で漉遇した。ステップＤ以 降の全ての溶液の調製にはＵＳ　Ｐ　ＸＩＸ級の水を使用した。

Ａ、細胞の殺滅および蛋白質の抽出 ８５％のリン酸を加えてｐＨを４．５に、次に５０％トリクロロ酢酸を加えてｐ ｎを２．０に調節し、細胞を殺した。０．２μ膜で濾過した後、水を加えて誘電 率を１５−２０ｍＳに調節した。低い誘電率は、ＧＭ−Ｃ３ＦをＱＡＥカラムに 結合させるために必要な希釈を最小限に抑えるために必要である。

Ｂ、第四アミノエチル（ＱＡＥ）カラムクロマトグラフ必要に応じて中和した抽 出物を、水酸化ナトリウムまたは塩酸で適切なｐＨ７，５に調節した。中和した 抽出物の誘電率は、脱イオン水を加えて５　１０ｍ５に調節した。ＱＡＥカラム は少なくとも２〜３倍のカラム容の２０−Ｍトリス塩酸、ｐＨ７−５で平衡化し た。ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む抽出物は、ＩＭｌの樹脂あたり２０ｇ＋ｇ以下でカラム に添加した。カラムは平衡化に用いたものと同じ緩衝液に溶かした塩化ナトリウ ムの濃度勾配でＯ−０，５Ｍの巾で、１０−２０倍のカラム容で溶出した。溶出 分画をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）に基ずいて集め、ステップＣのクロマトグラフィーを行った。

Ｃ１色素アフィニティークロマトグラフィーＱＡＥカラムからの溶出分画は、誘 電率５−５−１Ｏまで脱イオン水で希釈し、２〜３カラム容の２０ｍＭ）リス塩 酸、ｐＨ７，５で平衡化したＲｅｄアフィニティーカラム（例えばアガロース支 持体に結合したプロジオンレッド（Ｐｒｏｃｉｏｎ　　Ｒｅｄ）ＨＥ３Ｂに添加 した。

カラムに加える蛋白質の量は１１ｄ、のゲル当たり１０ｇを越えてはならない、 カラムは３〜４カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は５〜１５容の２ＣＩ ＋Ｍ）リス塩酸ｐｌ＋７．５に溶かした０−０，７５Ｍの塩化ナトリウムの濃度 勾配で行った。ステップＤで用いる分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて集 められた。

Ｄ、限外濾過および／または硫酸アンモニウム沈澱による濃縮 前の操作で回収された分画の蛋白質濃度が１．０＋ｇ／ｉ以下である場合、排除 分子量３０００−５０００の分離膜を用い、限外濾過で：ａ縮した。最終の蛋白 質濃度は１、　Ｏｗ：／ｘｒ１以上とする０ｇ酸アンモニウムを最終濃度６０〜 ７０％になるように加えた。沈澱を遠心によって回収し、沈澱に用いた濃度の硫 酸アンモニウムを含む、２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）で−回洗浄した。沈 澱を遠心によって集め、２０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５に溶解した。

Ｅ、セファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフイ再度溶解した硫酸アンモ ニウム沈澱は、必要に応じて遠心して不純物を除去した。溶液を０．２μフイル ターで漉遇し、２（１＋Ｍ）リス塩酸、ＰＨ１，５で平衡化したセファデックス Ｇ−１００カラムに添加した。カラムに添加される蛍白質の量は、ゲル１ｉあた り３■を越えては成らない、カラムは同じ緩衝液を用いて溶出した。ステップＦ で用いる分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて回収した。

Ｆ、逆相カラムクロマトグラフィー 回収したセファデックスＧ−１００溶出液を０．２μフイルターで漉遇し、ＦＰ ＬＣ（高速蛋白質液体クロマトグラフィー）およびＨＰＬＣ（高速液体クロマト グラフィー）カラム等の逆相カラムに添加した。カラムは０゜１％トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）で平衡化し、溶出は０゜１％ＴＦＡ中に溶解した０−１００％の ア七ト二トリル濃度勾配で行った０分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて回 収した。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末を２０ｏＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２ にＦｆ４解した。

Ｇ、精製したＧＭ−Ｃ３Ｆの透析 ステップＦの溶液は２０ｓ＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７゜２に対して透析した 。最低４〜５時間の間隔をおいて緩衝液を２回交換した。必要に応じて、排除分 子量３，０００〜５，０００の限外濾過膜を用い、透析した溶液を蛋白質濃度が 最低１．０■／ｄになるまで濃縮した。精製したＧＭ−ＣＳＦ溶液は０．２μフ イルターを通し、−２０℃あるいはそれ以下で凍結保存した。

上述の本発明における態様は、例解および解説の目的で行った。これらはｍｓ的 なものではなく、また、本発明をここで開示された詳細な形式に限定するもので もない、そして、以上の既述に照らして明らかに多くの改変や変形が可能である ０本明細書における態様は、当業者が種々のＢ様で、また、個々の使用状況に適 切な種々の改変を用いて本発明を最適に使用できるために、本発明の原理とその 実際の適用法を最もよく解説する目的で選択、記載された０本発明の範囲は請求 の範囲によって定められる。

特許出願人はｐ　ｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦをＡＴＣＣに寄託番号３９９ ２３で寄託した。この寄託゛はブタペスト条約の要求を満足する。

浄書（内容に変更なし） 第２Ａ図 第２８図 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 第４図 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　２年　１月１４１ 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２３３４ ２、発明の名称 ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびそのミューティン３、特許 ８臥 住　所　　アメリカ合衆国カリフォルニア用９４３０４．パロ・アルド。

カリフォルニア・アベニュー　９０１ 名　称　　シェリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号５、補正書の提出日 明細書 哺乳類宿主細胞中におけるヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子産生のた めの発現ベクター灸−皇玉！ 本発明はヒト造血系の増殖および分化のための蛋白性因子、即ち、ヒト顆粒球− マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）の哺乳類宿主細胞中における 産生のための発現ベクターおよびその産生に有用な新しいプロモーターに関する 。

１量且ｌ 循環血液細胞は、恒常的に新しく分化した細胞に置換されている。置換する血液 細胞は造血と呼ばれる過程によって形成され、そこで以下の少なくとも８種の成 熟細胞系列が作られる：赤血球、マクロファージ（単球）、好酸性顆粒球、好酸 性顆粒球（ｙｅ満細胞）、Ｔリンパ球、そしてＢリンパ球（Ｂｕｒｇｅｓｓおよ びＮｉｃ。

ｌａ、ｒ成長因子と幹細胞（Ｇｒｏｗｔｈ　　Ｆａｃｔ。

ｒｓ　　ａｎｄ　　Ｓｔｅｍ　　Ｃｅ１ｌｓ）　」　（アカデミツクプレス、ニ ューヨーク、１９８３）、血液細胞産生の制御の多くは、コロニー！１激因子（ Ｃ３Ｆ）と呼ばれる一連の活性糖蛋白質によって媒介される。これらの糖蛋白質 はその存在を検出するための生体内（ｉｎｖｉｖＯ）および試験管内（ｉｎ　　 ｖｉｔｒｏ）のアッセイ法から命名されている。半固体培地中での造血細胞のク ローン培養技術は、試験管内アッセイ法の発展に特に重要な役割を果たした。こ のような培養系では、それぞれの駁細胞（即ち、発生学的に一つの細胞系に分化 が決定されているが、まだ増殖能ををする細胞）は本質的に生態内における相同 のプロセスと同一と考えられている様式で増殖し、成熟細胞のコロニーを作るこ とができる。造血におけるＣ３Ｆの働きは、最近多（の総説で取り上げられてい る０例えば、メトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）「造血系コロニー刺激因子（Ｔｈｅ 　　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　　Ｃｏ１ｏｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　　 Ｆａｃｔｏｒｓ）、１　　（エルシーバー、ニューヨーク、１９８４）；メトカ ルフ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１６−２２　（１９８５）；二：２う（Ｎｉｃ ｏｌａ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　Ｔｏｄａｙ、５．７６−８０　（１９８ ４）；つｘ７トン（Ｗｈｅｔｔｏｎ）ら、ＴｌＢ５，１１．２０７　　：２１１ 　　（１９８６）；およびクラーク（Ｃ１ａｒｋ）とカーメン（Ｋａｍｅｎ）Ｓ ｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２３６．１２２９−１２３７　（１９８７）。

これらの因子の検出、単離および精製は、以下の理由によりしばしば非常に困難 である。それらが典型的に存在する細胞上清の複雑さ、混合物中のさまざまの成 分の活性の多様性および重複、それらの因子の成分を確認するために使われるア ッセイ法の感度（あるいは感度の欠如）、それらの因￥の分子量の範囲やその他 の性質が屡類似していること、そして自然の上体では因子の濃度が非常に低いこ とである。

主として遺伝子クローニングによって多くのＣＳＦが入手可能になるにつれ、そ のＲ床応用法の開発への興味が増していた。ホルモン（例えば可溶性因子、成長 メチイエ−ター、細胞リセブターを介した作用）との生理学的な類似性のため、 Ｃ３Ｆの使用の可能性は、現在のホルモンの使用法から類推されている；例えば 、デキスタ−（Ｄｅｘｔｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１，１９８（１９８６）、 これらの因子の使用は、腫瘍の化学療法または放射線療法後の回復治療、造血形 成不全の治療、好中球欠損症の治療、骨髄移植後の造血系再生の促進のための治 療、および慢性の感染症に対する宿主の抵抗性を増すための治療等のように、血 球際産生刺激が必要となるい（つかの臨床の場で、示唆されている０例えばデキ スター（上述）、メトカルフ（Ｓｃｉｅｎｃｅ上述）およびクラークとカーメン （上述）。

非組換えＧＭ−Ｃ３Ｆは、Ｍｏ細胞株の培養上清から精製され（米国特許４，４ ３８，０３２号に記載）、Ｎ末端から１６アミノ酸残基が配列決定された（ガッ ソン（Ｇａｓｓｏｎ）　ら、５ｃｉｅｎｃｅ’、２２６．１３３９−１３４２　 （１９８４））、顆粒球およびマクロファージの成長および分化を支える因子で あるＧＭ−ＣＳ　Ｆの相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）は最近いくつかの研究室で数種 類クローニングされ、配列決定された：例えばゴー（Ｇｏｕｇｈ）ら、Ｎａｔｕ ｒｅ、３０９，７６３−７６７　（１９８４）（７ウス）：リー（Ｌ　ｅ　ｅ） ら、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａ　　Ｌ　　１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃ　　ｉ、　　Ｕ ＳＡ、　　８２．　４３６０−４３６４　（１９８５）（ヒト）；ウォン（Ｗ　 。

ｎｇ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８，８１０−８１５（１９８５）（ヒトおよび テナガザル）；およびカントジル（Ｃａｎｔｒｅｌｌ）　ら、Ｐｒｏｃ＋　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．６２５０−６２５４（１９８５）（ヒ ト）を参照。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ等のリンホカインをコードするＤＮＡ配列を含むプラスミド中 で頻繁に使用されているプロモーターは、ＳＶ４０プロモーターである。

λ豆Ω量１ 本発明はここでＳＲαプロモーターと命名された使途顆粒球−マクロファージコ ロニー刺激因子（ａＭ−ｃｓＦ）の産生に有用な新たなプロモーターを含む、Ｇ Ｍ−Ｃ３Ｆの発現および／またはクローニングベクターに関する。特に本発明は 以下の順に共有結合した要素を含む（以下に詳細に議論する”）：ＳＶ４０　　 ＤＮＡ複製開始点（ＳＶ４０　　ｏｒｉ）、ＳＶ４０初期領域プロモータ（ＳＶ ４０７−！Ｊ　　）　、ＳＲａブロー（−−ター、スプライスジャンクション、 ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域（任意の順で）、およびポリアデニル化部位（ポリＡサ イト）。

Ｈの−　なｒ 故に本発明は哺乳類宿主細胞中でのヒト顆粒球−マク凸ファージコロニー刺激因 子産生のための発現ベクターを提供し、その発現ベクターは順に以下のものを含 む：ＳＶ４０のＤＮＡ複製開始点； ＳＶ４０の初期領域プロモーター： プロモーター： ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子をコード可能であるヌクレオチド 配列およびスプライスジャンクション；および ポリアデニル化部位。

ここで、上記プロモーターはＡＴＣＣ６７３１Ｂとして寄託されたプラスミドの ＳＲαプロモーターであるという点で特徴づけられる。

本発現ベクターは好ましくは上記ＳＶ４０ポリアデニル化部位の後に更に順に以 下のものを含む：上記発現ベクターをバクテリア宿主中でクローニング可能にす る、バクテリアの複製開始点：および上記発現ベクターによって形質転換された バクテリア宿主を識別するための選択可能なマーカー。

本発明における発現ベクターによって産生されるヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、宿主の性 質及びそのグリコジル化に影響を与える能力によって、グリコジル化されたりさ れなかったりする。

−の　　　　な− 第１図はヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を示すポリペプチドをコードするｃＤＮＡ挿入の ヌクレオチド配列および対応したアミノ酸配列を示す。

第２図はヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドをコードするｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 挿入を持つプラスミド、ｐｃＤ−ｈｕｍａ　ｎ−ＧＭ−Ｃ３Ｆを示す。

第２Ｂ図は第２Ａ図のｃＤＮＡ挿入の制限酵素地図である。

第３図はプラスミドｐＬ１の制限酵素切断部位および主要なコード領域を模式的 に示す。

第４図はプラスミドｐｃＤＶ１の制限酵素切断部位および主要なコード領域を模 式的に示す。

第１図に示されたクローンｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３Ｆは、アメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクシシン、１２３０１　　バークローンドライブ、ロ ックビル、Ｍｏ　　２０８５２．米国に寄託番号３９９２３で寄託されている。

本発明における発現あるいはクローニングベクターＬ以下の要素を順に有する。

ＳＶ４０　　ｏｒｉ ＳＶ４０初期プロモーター ＳＲαプロモーター スプライスジャンクシテン ＧＭ−ＣＳＦコ７ド領域 ポリＡサイト 〔ベクターの輪は、上記５Ｖ４０ｏｒｉとつながって閉じる〕。

好ましくは、この発現２および／またはクローニングベクターはさらにＳＶ４０ 　　ｏｒｉとポリＡサイト間に挿入されたバクテリア複製開始部位（バクテリア ｏｒｉ）および選択可能なマーカー遺伝子を含む（以下参照）ＳＶ４Ｑ　　ｏｒ ｉ ＳＶ４０初期プロモーター ＳＲαプロモーター スプライスジャンクション ＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域 ポリＡサイト バクテリアｏｒｉ 選択可能なマーカー 〔ベクターの輪は上記５Ｖ４０ｏｒｉとつながって閉じる〕。

さらに好ましくは、選択可能なマーカー遺伝子は、宿主バクテリアにネオマイシ ン、アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ヒ グロマイシンあるいはその類似物に対する抵抗性等の薬剤耐性を与える。最も好 ましくは、バクテリアｏｒｉはｐＢＲ３２２ｏｒｔである。

全般にわたって、アミノ酸、ヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ等を示すた めに標準的略号が使用されている；例えばコーン（Ｃｏｈｎ）、ｒα−アミノ酸 の命名および記号（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　　ａｎｄ　　Ｓｙｍｂｏｌｉｓ ｍ　　ｏｆ　　ａ−Ａｍｉｎｏ　　Ａｃ１ｄｓ）」　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　　ｉ ｎ　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

１０６．３−１７　（１９８４）；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら。

「生化学二問題へのアプローチ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ　　Ｐｒｏｂｌ ｅｍｓ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｊ。

第２Ｍ　（ベンジャミン、メンロパーク、１９８１）；およびロバーツ（Ｒｏｂ ｅｒｔｓ）、制限エンドヌクレアーゼの目録（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ　　ｏｆ　　 Ｒｅ５Ｌｒｉｃｔｉｏｎ　　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８．２７−４０　（１９７９）。

本発明における発現ベクターによって産生されるヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは血液細胞の 再生刺激が可能であり、癌治療、特定の血液疾患の治療および慢性の感染の治療 において宵月であろう。

本発明によって産生されたＣＭ−Ｃ３ＦはヒトＧＭ−〇ＳＦ活性を示す、グリコ ジル化または非グリコジル化ポリペプチドを含む。

本発明はまたはここで開示されたＳＲαプロモーターを用いて、本発明のグリコ ジル化または非グリコジル化ポリペプチドを作る方法を含む。

本発明に従って産生されたヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆの作製、使用、同定の技術は以下の 一般的な項目中で説明される。

その後、一般的な技術が特殊な細胞種、ベクター、試薬等に適用された、い（つ かの具体例を示す。

１、Ｃ；Ｍ−Ｃ３Ｆ　　ｃＤＮＡのｄｅ　　ｎｏｖｏ：ｃ　ＤＮＡのｄｅ　　ｎ ｏｖ□調製およびクローニング及びｃ　ＤＮＡライブラリーの構築のための種々 な手法が現在使用可能である。対応した文献の総説は、詳細な手法とともにＷＯ ３７１０２９９０として国際公開されているＰＣＴ／ＵＳ　　８６１０２４６４ の２９頁２２行〜３２頁下５行に述べられている０本発明におけるポリペプチド をコードするｍＲＮＡの好ましい由来は次節で議論されている。ＰＣＴ／ＵＳ　 　８６１０２４６４中の開示は、ここでＧＭ−ＣＳＦの産生、特にその３１頁と 関連して読まれたい。

目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの好ましい由来は、Ｔリンパ球など、 その上清が本発明におけるポリペプチドに伴う活性の一つを含む細胞である。そ れに由来するＣＭ−Ｃ３Ｆ　　ｃＤＮＡのためのＲＮＡは米国特許４．４３８， ０３２号に開示され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３ ０１　　パークローンドライブ、ロックビル、ＭＤ　　２０８５２．米国に寄託 番号ＣＲＬ８０６６で寄託されているＭＯ細胞株より得られる。一般的には適当 なＴ細胞はヒト肺臓、扁桃腺および末梢血等、様々な由来から得られる。末梢血 Ｔｍ胞より単離されたＴ細胞クローン等も使用可能であろう（「免疫学での研究 論文（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｍ。

ｎｏｇｒａｐｈｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）’）Ｊ。

フォノ・デー？　−（Ｖ　Ｏｎ　Ｄ　ｏ　ｅ　ｈ　ｍ　ｅ　ｒ　）およびハーフ （Ｈａａｆ）ｍ集、「ヒトＴ細胞クローン（１（ｕｍａｎ　　Ｔ　　Ｃｅ１ｌ　 　Ｃ１ｏｎｅｓ）」、第８巻、２４３−３ｓｓ頁、エルシーバー・サイエンス・ 出版社、ニューヨーク（１９８５）を参照）。

同一の生物学的活性を持つ近縁の蛋白質がしばしば存在する、多く研究されてい る例は、以下のものである：（１）いわゆるアロザイムで、電気泳動的に区別さ れる、一種の酵素のアレル型である；例えばセンザバウ（Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ ）、法医学での多様性酵素の利用（Ｔｈｅ　　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ 　　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｉｎ　　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、ｌ５ｏｚ　　ｍｅｓ、上ユ、１３７−１５４　（１９８３ ）およびレウォンティン（Ｌｅｗ。

ｎｔｉｎ）、ｒ進化掌上の変化の遺伝学的基礎（ＴｈｅＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｂａ ５ｉｓ　　ｏｒ　　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　　Ｃｈａｎｇｅ）Ｊ　（コロン ビア大学出版。

二ニーヨーク、（１９７４）の第３章を参照のこと；（２）　　いわゆるアロタ イプで、免疫グロブリンの定常領域の多形性をいい、例えばフンド（Ｈｏｏｄ） ら、　　’Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇｙ」、２３１−２３８頁（ベンジャミン／カミン グス、メンロバーク、１９７Ｂ）および（３）　　ヘモグロビン、例えばデー７ カーソ７（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ）およびガイス（Ｇｅｉｓ）、’Ｈｅｍｏｇｌｏ ｂｉｎ」　（ベンジャミン／カミングス、メンロバ−久１９８３）である、この ような多形性はリンホカインにも存在すると考えられている：　　（ｉ）ＰＣＴ ＷＯ８６１００６３９中では二種のヒトＣＭ−ＣＳＦが報告されており、　　（ ｉｉ）ウォン（Ｗｏｎｇ）らは５ｃｉｅｎｃｅ。

２３５．１５０４−１５０８においてカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）らによって ５ｃｉｅｎｃｅ、２３０，２９１−１９６　（１９８５）に報告されたものとは 異なる型のしトＣ３Ｆ−１を報告している。

ｒＶ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　　のアーセイ ＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を決定するために、造血系細胞、例えば骨髄細胞あるいは胎児 の請帯血細胞が、遊離細胞浮遊液とされた。バラバラの細胞を栄養および多（の 場合ウシ胎児血清を含む半固体（寒天）または粘性の高い（メチルセルロース） 培地中に固定する。適切な刺激因子の存在下では個々の細胞は増殖して分化する ０個々の細胞は固定されているため、細胞が増殖および成熟するにつれ、コロニ ーが形成される。これらのコロニーは、７−１４日後に計数可能となる。Ｃ；Ｍ −Ｃ３Ｆアツセイを行うための詳細な解説は、バージニス（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ａ 、）、’成長因子および幹細胞（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒａ　　ｓｎｄ　　ｓ ｔｅｍ　　Ｃｅ１ｌｓ）、５２−５５頁（アカデミツクプレス、ニューヨーク、 １９８４）、およびメトカルフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）ｒ造血系コロニー刺激因子（ Ｔｈｅ　　ＨｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃＣｏｌｏｎｙ　　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　 　ＦａｃｔｏｒＳ）」　（ニルシーバー、ニューヨーク、１９８４）の１０３− １２５頁に示されており、両文献の当該部分も本明細書に含まれるものとする。

必要に応じてコロニーを単離し、スライドグラスに載せて固定して、ライト／ギ ムザ染色することができる（トッド−サンフォード（Ｔｏｄｄ−３ａｎｆｏｒｄ ）ｒ実験室法による臨床診断（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　ｂ ｙ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１５版、デビンドソンお よびヘンリー（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　　ａｎｄＨｅｎｒｙ）Ｗ、１９７４）＊この ようにして、個々のコロニーについての細胞種の形態学的な解析が可能である。

血液疾患ではない患者から集めた骨髄細胞をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（タイ プ４００．シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）上に重層し、遠心分離（ ６００ｘｇ、２０’　）、界面の細胞を除去した。これらの細胞をｌＯ％ウシ胎 児血清（Ｆｅ２）を含むイスコツの改変ダルベツコ培地で２度洗浄し、同じ培地 中に再度懸濁し、プラスチックのベトリ皿への接着によって、接着性細胞を除去 した（接着性細胞は、しばしばＧＭ−ＣＳ　Ｆ産生細胞である：メトカルフ、上 記）、非接着性細胞を２０％ＦＣ３，５０μｈの２−メルカプトエタノール。

０．９％メチルセルロースおよび種々の濃度のコロニー刺激因子を含むことが知 られている培養上清または試験サンプル上清を含む、イスコツの培地に１０’細 胞／ｄとなるように添加した。ＩＨ１０分画を３５ｍ！のペトリ皿に添加し、３ ７°Ｃ５飽和水蒸気、６％ＣＯ□下で培養した。培養開始後、３日目に１ユニツ トのエリスロポエチンを各国に加えた。顆粒球−マクロファージのコロニーおよ び赤血球バーストを１０−１４日後に倒立顕微鏡を用いて計数した。

ヘパリン中に集めた調帯血液細胞は、６００Ｘｇで６分間遠心分離した。血漿と 赤血球のピークの間の界面に存在する白血球を、０．１７Ｎ塩化アンモニウムお よび６％ＦＣ３を含む試験管に移した。５分間氷上に放置した後、懸濁液を４７ のＦｅ２の下層になるように重層し、６分間６００Ｘｇで遠心分離した。骨髄細 胞について述べた方法と同様にして細胞塊をダルベフコの生理食塩水で洗浄し、 フィコール、プラスチック接着を行った。低密度の非接着性細胞を回収し、上述 の方法で半固体培地中に１０５細胞／培養皿でまいた。

アッセイ終了後、個々のコロニーをスライドグラスに載せ、ライト・ギムザ染色 をして、細胞成分を決定した好酸球はルクソールファストブルー（Ｌｕｘｏｌ　 　Ｆａｓｔ　　Ｂｌｕｅ）染色によって決定した（ジョンソンおよびメトカルフ （Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｇ、ａｎｄ　　Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、）、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａ ｔｏｌ、、８，５４９−５６１　（１９８０）を参照）。

■、　　および′　組 大腸Ｅｉｆ（Ｅ、ｃｏｌｉ）、酵母または他の細胞中で発現される本発明のヒ） ＧＭ−Ｃ３Ｆは硫安沈澱、分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換 、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等）、そして最後に 結晶化（一般的には「酵素精製および関連技術（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｐｕｒｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２２，２３３−５７７　（１９ ７７）、およびスコープス（Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ，）、’蛋白質の精製：原理と実 際（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｔｎｃｉｐｌｅｓ　　 ａｎｄ　　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、スブリンガー・フェアラーク、ニューヨーク 、１９Ｂ２を参照）を含む当業者に一般的な手法によって精製できる。詳細な精 製方法は主に使われた発現宿主によって決定される０例え番戴補乳類発現宿主（ 細胞）は、しばしば培地中に血清が必要であるが、そのために血清蛋白質を除去 する余分な段階が必要となってくる。一方、成分既知の培地で生育する酵母やバ クテリアではたいていの場合、分泌産物の分離はより単純である。いくつかの発 現宿主は発現産物を分泌しないこともあり、このような場合、発現宿主の破砕物 あるいは抽出物から産物を精製しなければならない。

これらの全ての場合において予想される精製上の問題【叡生化学的な精製法の標 準的な手法によって解決可能である。

部分精製あるいは完全精製されると、本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、以下の研究 の目的で使用できる０例えば、細胞用培地（例えば、イーグルの最小培地、イス コツの改変ダルベンコ培地または　ＲＰＭ１１６４０．　シグマ・ケミカル社（ セントルイス、ＭＯ）およびＧＩＢＣＯＤｉｖｉｓ　ｉｏｎ　（ジャグリンフォ ールス、オハイオ）から入手可能）の強化物質の研究、および免疫アッセイ、免 疫蛍光染色等に使う特異的な免疫グロブリンを誘導するための抗原物質の研究（ 一般的には、「免疫学的手法（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｇｉｃａｌ　　ＭｅｔｈｏｄＳ ）Ｊｌ第１および■巻、レフコビッツおよびバーニス（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、１ ．ａｎｄ　　Ｐｅｒｎｉｓ、Ｂ。

）編、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９７９および１９８１）、および 「実験免疫学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ ｎｔａｌＩｍｍｕｎｏ　１　ｏｇｙ）Ｊ、ワイア（Ｗｅｉｒ、Ｄ＋）編、ブラッ クウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ、セントルイス、ＭＯ（ １９７８）を参照）。

本発明におけるヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは、例えば慢性の感染症に対する自然の抵抗性 を増加させる、血液細胞の再生を促す、等の薬剤組成物中にも使用されるであろ う。

故に、移植の必要なリュウマチ性関節炎、癌の化学療法、高齢、免疫抑制剤等に よる免疫不全症の愚者は、直接このようなポリペプチドを用いて治療できる。あ るいは、ある人の造血細胞を体外で維持および／または増殖または分化させ、同 一固体あるいは別の固体に再導入して治療効果を高めることが出来るであろう、 これらの組成物は、免疫系の様々な成分を選択的に単独でまたはよ（知られた他 の薬剤とともに刺激することができる。特にこの組成物は、リンホカイン等地の 免疫反応性物質（例えばＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｃ−Ｃ５ Ｆ、Ｍ−Ｃ３Ｆ等）を含むであろう。

本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを含む薬剤組成物は、ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２４６４ の４４頁２７行〜４５頁２１行に記載されている方法で調製し、使用できる。特 に、調製物単位量あたりの活性物質の量は、用途および活性含有物の効力に応じ て変化し、または１μｇから１００■の値で調整されよう。

■、灸里五 一旦本発明のｃ　ＤＮＡがクローニングされると、幅広い発現系（即ち、宿主− 発現ベクターの組み合わせ）力（その蛋白質の産生のために使用可能である。可 能な宿主種はバクテリア、酵母、昆虫、哺乳類類等を含むが、それに限られるも のではない０発現系の選択およびその蛋白質産生の最適化は、以下の多くの要因 の考慮とバランスが必要である。即ち、（１）発現される蛍白質の性質、例えば 、発現蛋白質はいくつかの宿主生物に対して毒性を持つことがあり、またそれは 宿主プロテアーゼの分解を受けることがあり、またはある宿主中では、不活性型 や不溶性型で発現されるかもしれない、（２）目的の単に対応するメツセンジャ ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の性質、例えばそのｍＲＮＡが宿主エンドヌクレアーゼ に特に切断されやすい配列を持つことがあり、そのためにｍＲＮＡの機能的な寿 命が極端に短（なる、あるいはｍＲＮＡが二次構造を取り、リポソーム結合部位 もしくは開始コドンを覆ってしまうことがあり、そのために成る宿主中では翻訳 の開始が阻害される、（３）コード領域に隣接する３′−および５′−領域中の 宿主許容性発現抑制領域の選択、入手可能性および配置−これはプロモーター、 ５′−および３′−プロモーター配列、リポゾーム結合部位、転写終結因子、エ ンハンサ−、ポリアデニル酸結合部位、キャップ部位、イントロン−スプライス 部位等を含む、（ａその蛋白質が宿主によって切断され得る分泌シグナル配列を 持つか、または宿主性のシグナル配列をコードする発現制御配列が成熟蛋白質を コードする領域中でスプライスされないか、（５）宿主の感染または形質転換の 可能な形態および効率、そして発現は一過性が好ましいか、恒常的なものが好ま しいか、（６）蛋白質の発現のために必要な宿主培養系の規模及び費用、（７） 転写後の修飾は必要か、また必要ならどのような種類か：例えば必要なグリコジ ル化の程度と種類で宿主を選択しなければならない（例えば、ライおよびウォル ド（Ｕｙ　　ａｎｄ　　Ｗｏｌｄ）、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８，８９０−８９６ 　（１９７７）　）　、（８）発現した蛋白質を宿主および／または培地中の蛋 白質および他の物質から分離する方法の用意さ、例えばある場合には後の精製段 階のために特殊なシグナル配列を持つ融合蛋白質を発現することが望ましい、（ ９）選択された宿主中での当該ベクターの安定性およびコピー数、例えばホフシ ュナイダ−（ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら編、「大腸菌以外の微生物での遺伝 子クローニング（Ｇｅｎｅ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ｉｎ　　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ 　　０ｔｈｅｒ　　ｔｈａｎ　　Ｅ＋　ｃｏｌｉ）」　（スプリンガーフェアラ ーク、ベルリン、１９８２）、およ上述の要因に着目した、ある発現系の選択お よび／または修飾に関する指針を提供する多くの総説が入手可能である：例えば 、クルーン（Ｋｒｏｏｎ）編、「遺伝子：ｔｓ造および発現（Ｇｅｎｅｓ：５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」の中の、ドウベールおよび シェパード（ｄｅ　　Ｂｏｅｒ　　ａｎｄ　　５ｈｅｐａｒｄ）、ｒ大腸菌での 外来遺伝子の発現を最適化する手段（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　　ｆｏｒ　　Ｏｐ Ｌｉｍｉｚｉｎｇ　　Ｆｏｒｅｉｇｎ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘｐｒｅｓｓｔｏｎ　 　ｉｎ　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｊ。

２０５−２４７；　　（ジョンヮイリー＆サンズ、ニューヨーク、１９８３）は 、いくつかの大腸菌発現系を総説しており、クッヒャーラパテ４　（Ｋｕｃｈｅ ｒｌａｐａｔｉ）ら、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗｓ　　　ｉｎ　　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６　（４）、３４９　３７９（１９８４）およびバネ ルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５ ．１９−３を総説し；レツニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）およびゴールド（Ｇｏ ｌｄ）編、「遺伝子発現の最大化（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　　Ｇｅｎｅ　　Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ）」（バターワーズ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ボストン 、１９８６）は、大腸菌、酵母および哺乳類細胞における遺伝子発現のトビツク をいくつか総説しており；スイリー（Ｔｈｉｌ１３’）、’哺乳類細胞工学（Ｍ ａｍｍａｌｉａｎ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」　（バターワーズ （Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）、ポストン劇１９８６）は、哺乳類発現系を総説 している。

同様に、本発明における使用に適した発現ベクターを作製および／または修飾す るためのｃＤＮＡおよび発現抑制領域を結合および／または繰作する方法および 条件を記載した多（の総説が入手可能である：例えばマニアチスの「モレキュラ ー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）」　（コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒ ｂｏｒ　　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ）、１９８２）；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ） 、ｒｐＮＡクローニング：実際的アプローチ（ＤＮＡ　　Ｃ１゜ｎｉｎｇ：Ａ　 　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第１および■巻（ＩＲＬブレス 、オフクスフォード、１９８５）；およびバーパル（Ｐｅｒｂａｌ）ｒ分子クロ ーニングの実用ガイド（Ａ　　ＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ　　ｔｏ　　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」　（ジョンワイリー＆サンズ、ニューヨ ーク、１９８４）。

一般的には、本発明のｃＤＮＡの挿入のため発現ベクター中に多くの部位を選択 することが可能である。このような部位は、通常それを切る制限エンドヌクレア ーゼによって命名されており、当業者によって非常によく知られている０組換え ＤＮＡ分子を作製するため、このような部位へＤＮＡ配列を挿入する種々の方法 も非常によく知られている。これらは、例えば、ｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴに よるテーリング、直接のライゲーション、合成リンカ−、エキソヌクレアーゼお よびライゲーションまたはＤＮＡポリメラーゼおよびライゲーションに引き続く 適切な一本鎖鋳型によるＤＮＡ鎖伸長に続くポリメラーゼを用いた修復反応を含 む。

宿主培養液中の細胞のトランスフェクションおよび／または形質転換を行う前に しばしば多量の本発明のｃＤＮＡを含むベクターを得ることが必要となる。この ために、ベクターはしばしば最終的に発現に使用されるものとは別の生物（クロ ーニング宿主）中で、有意な発現を行わずに増幅される。そして増幅の後、標準 的な方法、例えばマニアチスら（上述）により記載された方法を用いて、ベクタ ーはクローニング宿主より分離される。

ＤＮＡの消化とは多くの場合、ＤＮＡのある領域にのみ働く酵素を用いたＤＮＡ の触媒的切断を意味する。殆どの場合、このような酵素は制限エンドヌクレアー ゼであり、それぞれが特異的に働＜　ＤＮＡ上の部位は制限サイトと呼ばれてい る。ここで用られる種々の制限酵素上市販品として入手可能なものであり、酵素 販売者によって確立されたそれらの反応条件、補助因子、および他の条件が使用 される。一般的には、約１マイクログラムのプラスミドまたはＤＮＡ断片が、約 １ユニツトの酵素とともに、約２０マイクロリツトルの緩衝液中で使用される。

特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および基質量は、製造者によって指定され ている０通常３７℃で１時間のインキュベーション時間が用いられているが、販 売者の説明に従って変化しうる。インキュベーションの後、蛋白質はフェノール およびクロロホルム抽出によって除去され、消化された核酸は水相からエタノー ル沈澱によって回収される。

制限（酵素）（または他の）消化物からのＤＮＡ断片の抽出または精製とは、消 化物のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離、既知分子量マーカーＤＮＡ 断片との移動度の比較による目的の断片の同定、目的の断片を含むゲル断片の切 除およびＤＮＡからのゲルの分離を意味する。抽出方法は、よ（しられている０ 例えばローン（Ｌａｗｎ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、９゜６１０３ −６１１４　（１９８１）；ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌｆ）　　ら、Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、８，４０５７　（１９８０）およびマニアチスら（上述） を参照。

ライゲーションとは二つの二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ間にホスホジエステル結合を形成す るプロセスをいう、ライゲーションは１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼをライ ゲーションするおおよそ等モル量のＤＮＡ断片０．５マイクログラムに加えると いうような既知の条件および緩衝液で行われる。

プラスミドの増幅とは、適切な宿主を形質転換し、プラスミドの総数を増すため に宿主を増殖させることである。

キナーゼ処理されたＤＮＡ断片とは、ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸 化された断片を示す、このような処理は５′−リン酸基を欠＜ＤＮＡ断片のライ ゲーションの効率を上昇させる。

適切な発現ベクターは、大腸菌（Ｅ、ｃｏ）ｉ）由来のプラスミド、例えば、Ｃ ｏｌ　　Ｅｌ、ｐｃＲｌ、ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、より 広範な宿主のプラスミド例えばＲＰ４．ラムダファージなどのファージＤＮＡお よびそのような誘導体、Ｍ２Ｓ等を含む、原核ｗＡ記のポリペプチドを融合ある いは非融合形で、真核細胞の蛋白質を発現するための、さらなるＥ−ｃ。

１ｉベクターは、マチアチスら（上述）の第１２章に記載されている。また、リ ッグス（Ｒｉ　ｇ　ｇ　ｓ　）は米国特許４，４３１，７３９号で、さらにＥ、 ｃｏｌｉ発現系を開示しており、これはこの参照によって本明細書に含まれてい るものとする。

−ａ的に使用されている原核生物のプロモーターは、β−ラクタマーゼ（ペニシ リナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャン（Ｃ，ｈａｎｇ）ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、２７５，６１５　（１９７Ｂ）；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら、５ ｃｉｅｎｃｅ、１９８．１０５６　　（１９７７）；ゲデル（Ｇｏ　ｅｄｄ　ｅ 　１）ら、Ｎａｔｕｒｅ。

２８１．５４４　（１９７９））；およびトリプトファン（Ｔ　ｒ　ｐ　）プロ モーター系（ゲデルら、Ｎｕｃ　ｌ、Ａｅバ特許出願公開００３６７７６）を含 む、こられが最も−ａ的に用いられているものである一方、他の微生物由来のプ ロモーターも発見され使用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細 が発表されて、当業者がそれを機能的にプラスミドベクターとライゲートするこ とが可能になっている：例えばジ−ベンリスト（Ｓ　ｉ　ｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら 、Ｃｅ１ｌ、２０，２６９　　（１９８０）。

大腸菌中での高頻度発現に特に有用な原核細胞性のプロモーターは、Ｌａｃプロ モーターであり、ドウポア（ｄｅ　　Ｂｏｅｒ）によって米国特許４，５５１， ４３３号に開示されている。この参照によってこの開示も本明細書に含まれる。

大腸菌宿主のための分泌発現ベクターも入手可能である。特にブライニブ（Ｇｈ ｒａｙｅｂ）らによってＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、３．２４３７−２４４２　（ １９８４）に開示された、ｐｌＮ−Ｉ［［−ｏ　ｍ　ｐ　Ａベクターは有用であ り、ここでは転写されるＣＤ　Ｎ　Ａ　ハｏ　ｍ　ｐ　Ａ　蛋白質のシグナルペ プチドをコードするＥ、ｃｏｌｉ　　ｏｍｐＡ遺伝子の一部に融合されており、 このため、成熟した蛋白質はバクテリアの細胞周辺腔に分泌される。同様に米国 特許４，３３６，３３６号および４，３３８．３９７号は原核生物のための分泌 発現ベクターを開示している。この参照によって、上記文献は本明細書に含まれ る。

Ｅ、ｃｏｌｉ株例えばＷ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＪＡ２２１．Ｃ６ ００，ＥＤ７６７、ＤＨＩ。

ＬＥ３９２．ＨＢＩＯＩ、Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４）、Ｘ２２８２．Ｒ ＰＩ　（ＡＴＣＣ３１３４３）、ＭＲＣＩ　；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　５ ｕｂｔｉ１ｕｓ）の株：およびサルモネラ・チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセツセンス（Ｓｅｒｒ ａｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）等の他の腸内細菌、およびシニードモナス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種々の種を含めて、各種バクテリア株は原核生 物の発現ベクターの通切な宿主である。真核細胞の蛋白質の発現に有用なＥ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｘ１７７６等のバクテリア株の誘導法は、カーチス（Ｃｕｒ 　Ｌ　ｉ　ｓ）により米国特許４，１９０．４９５号に開示されている。従って この特許の内容は本明細書に含まれる。

酵母等の真核微生物も本発明における蛋白質の発現に使用可能である。サツカロ ミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ） 、即ち一般的なパン酵母は真核微生物の中で最も一般的に使われているが、多（ の他の株も一般的に量可能である。サツカロミセス中での発現にはプラスミドＹ Ｒｐ７が使用される。例えばスティンコーム（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ）ら、Ｎａｔ ｕｒｅ、２８２．３９　（１９７９）、キンゲスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、 Ｇｅｎｅ、７，１４１（１９７９）、およびチェンバー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ） ら、Ｇｅｎｅ、１０，１５７　　（１９８０）、これらのプラスミドは、既にト リプトファン中で生育出来ない酵母の変異株の選択マーカーを提供するＬｒｐｌ 遺伝子を含んでいる０例えば、ＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４０−１　（ジ ョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５，１２　（１９７７））、こ れによって酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐｌ障害がある場合、トリブトファン不 存在下で生育させることにより形質転換を検出するための有用な環境が提供され る。さらなる酵母のためのベクターは、ミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）ら、Ｎｕ ｃｌ、Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、、１２．６３９７−６４１４　（１９８４）によっ て開示されたｐＣＯＡＬプラスミド、およびベグス（Ｂｅｇｇｓ）、Ｎａｔｕｒ ｅ、２７５゜１０４−１０９　（１９７８）によって開示された２μ腸プラスミ ドを含む。

酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は以下のものを含む＝３−ホスホグリ セリン酸キナーゼのプロモーター（ヒフツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−，２５５，２０７３（１９８０））またはエノラーゼ、グ リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸 デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメ ラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等の 解糖系の酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ 　　Ｒｅｇ、、７．１４９（１９６８）、ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉ 。

ｃｈｅｍｉ　ｓ　Ｌｒｙ、１７．４９００　（１９７Ｂ））。

適当な発現プラスミドを構築する際には、発現してポリアデニル化および転写終 結をするために、配列の３′−末端に隣接してこれらの遺伝子に関する終結配列 が、発現ベクター中にライゲーションされる。生育条件によって転写が制御され る付加的な利点を持つ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イ ソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素代謝にかかわる消化酵素、および 前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよびマルトースおよ びガラクトースの利用に関する酵素（ホランド、前述）のプロモーター領域であ る、また更に他の制御可能なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター系 であり、フォーゲル（Ｆ。

ｇｅｌ）らによって米国特許４，５１１．６５２号に開示されている。この米国 特許の内容も本明細書に含まれる。事実上、酵母に使用可能なプロモーター、複 製開始点および転写終結配列を含むプラスミドベクターは全て適当である。

サツカロミセス・セレビシェ宿主のための分泌発現ベクター、例えばミャジマ（ Ｍｉ　ｙａ　ｊ　ｉｍａ）　ら、’：よってＧｅｎｅ、３７，１５５−１６１　 （１９８５）に開示されたｐＭＦα８　；ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら によって５ｃｉｅｎｃｅ、２１９，６２０−６２５（１９８３）に開示されたＹ Ｅｐ　Ｉ　ＰＴ　ｉブレイク（Ｂｒａｋｅ）らによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１．４６４２　４６４６　（１９８４）およびブレイ クによりヨーロッパ特許出願０１１６２０１号に開示されたｐｙαＥＧＦ−２１ ；およびシン（Ｓｉｎｇｈ）によりヨーロッパ特許出願０１２３５４４号および カフジャン（Ｋｕｒｊａｎ）らにより米国特許４゜５４６．０８２に開示された プラスミド等は利用可能である。

原核および親核の微生物に加え、多細胞生物由来の細胞よりなる発現系が本発明 における蛋白質を産生ずるために使用される。特に興味が持たれるのは、その翻 訳後のプロセンシング機構が、より生物学的に活性のある哺乳類の蛋白質を作り やすいと考えられる哺乳類発現系である。哺乳類の宿主に対しては、ベクターと していくつかのＤＮＡ腫瘍ウィルスが用られる：例えばトゥーズ（Ｔｏｏｚｅ） ！、ｒＤＮＡ腫瘍ウィルス（ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　　Ｖｉｒｕｓｅｓ）」、第２ 版（コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、Ｎ、Ｙ、、１９８１）をその生 物学の総説として参照、特に重要なものは、バクテリアの複製制御配列と結合し たＳＶ４０複製、転写、および／または翻訳制御配列を含む種々のベクターであ る０例えば、オカヤマおよびバーブ（Ｏｋａｙａｍａａｎｄ　　Ｂｅｒｇ）によ って開発され、Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、２．１６ｒ−１７０（１９８２） およびＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３，２８０−２８９　（１９８３）に開示 されているｐｃＤベクター（参照により本明細書に含まれる）；ハマー（Ｈａ　 ｍ　ｅ　ｒ　）によりＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１２．８３ −１００　（１９８０）および米国特許４，５９９，３０８に開示されているＳ Ｖ４０ベクター（参照により本明細書に含まれる）；カウフマンおよびシャープ （Ｋａｕｆｍａｎ　　ａｎｄ　　５ｈａｒｐ）によりＭｏ　１．Ｃｅ　１１゜８ ｉｏ１．２．１３０４−１２１９　（１９８２）におよびカウフマンらによりヨ ーロッパ特許８１１８４０６１０７号に開示された、付加的にアデノウィルスの 制ｍ　領域を含むベクター（参照により本明細書に含まれる）、サルの細胞は多 くの場合上述のベクターに望ましい宿主である。このような５Ｖ４０ｏｒｉ配列 と天然のＡ遺伝子を含むベクターはサルの細胞中で（非自律的に増幅するプラス ミドよりも高いコピー数および／またはより安定なコピー数を与えて）自律的に 増幅することができる。

その上、５Ｖ４０ｏｒｉ配列を含み、天然のＡ遺伝子持たずＣＯ３７サル由来細 胞中で高コピー数に自律的（然し安定ではない）に増幅できるべくがグルラマン （（１，１ｕｚｍａｎ）によりＣｅｌ　１，２３，１７５−１８２（１９８２） に記載されており、ＡＴＣＣ（寄託番号ＣＲＬ　　１６５１）から入手可能であ る。上述のＳＶ４０込まれることにより、マウスＬ細胞糖の他の哺乳類細胞を形 質転換できる。

ＳＶ４０を基本とするベクターの他に、本発明における使用に適切な哺乳類発現 系は以下のものを含むが、これらに限られるものではない：　（ｉ）サーバー（ Ｓａｒｖｅｒ）らによりＧｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５，１７ ３−１９０　（１９８３）に開示されたＢＰＶ−ＰＢＲ３２２ハイブリッドおよ びディマイオ（ＤｉＭａｉｏ）らによってＦｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．４０３０−４０３４　（１９８２）にウシおよびマウス の細胞を形質転換するために開示されたもののようなウシパピローマウィルス（ ＢＰＶ）配列を含むベクター：　（■）エプスタイン−パールウィルス（Ｅ　Ｂ 　Ｖ）配列を含むベクター、例えばヒトおよびサルの細胞を含む種々の哺乳類細 胞の安定な形質転換のためＥＢＶ　　ｏｒｔＰ配列（＠抗原ＥＢＮＡ−１のコー ドはいを含む）を持つプラスミドで、イエーツ（Ｙａｔｅｓ）らにより’ｐＪａ Ｌｕｒｅ、３１３．８１２−８１５　（１９８５）に、ライスマン（Ｒｅｉｓｍ ａｎ）らによりＭｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、１８２２−１８３２　（１９８ ５）に、イエーツらによりＰｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ 、８１．３８０６−３８１０　（１９８４）に、およびサグデン（Ｓｕｇｄｅｎ ）らによりＭｏ、１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、５，４１０−４１３　（１９８５ ）に開示されているもの：　（ｍ）マウスおよびハムスターの細胞を形質転換す るためのネズミ類ポリオーマウィルス配列を含むベクター、例えば、オハラ（０ ’　Ｈａ　ｒａ）、ＪｌＭｏ　１．８ｉ　ｏ　１−．１５１．２０３　（１９８ １）；　　（ｉｖ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を持つベクタ ー；例えば、アル）　　（Ａｌ　　ｔ）　　　ら　、　　　Ｊ−Ｂｉｏｌ　　、 　　Ｃｈｅｍ、　　　、　　　２５３゜１３５７−１３７０　（１９７８）で、 これはメトトレキセート処理によりネズミ類ゲノム（例えばｄｈｆｒ活性を欠損 したチャイニーズハムスター卯、ＭＬ（ＣＨＯ）細胞株）に共に組み込まれた隣 接するコード領域とともに複製される。これは例えば、アーラム（Ｕｒ　１　ａ ｍｂ）らにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　１．’　Ａｃａｄ、Ｓｅ　ｔ、ＵＳＡ、 ７７．４２１６　（１９８０）に記載されている；および（Ｖ）アクセル（Ａｘ 　ｅ　１　）らにより米国特許４゜３９９．２１６に開示されている共形質転換 系、入手可能なり　Ｎ　Ａｌｌ瘍ウィルスおよびレトロウィルス由来の種々な要 素、例えば複製開始点、エンハンサ−配列（ラウス肉腫ウィルス由来のロングタ ーミナルリピート（Ｉ。

ｎｇ　　ｔｅｒｍｉｎａｌ　　ｒｅｐｅａｔ）配列（Ｒ３Ｖ−ＬＴＲ）等で、ゴ ーマン（Ｇｏ　ｒｍａ　ｎ）らにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃ　ｉ、ＵＳＡ、７９゜６７７７−６７８１　（１９８２）に開示されている） 、イントロン−スプライス部位、ポリアデニル化部位等を用いることによりさら なる哺乳類発現ベクターを構築、あるいは既存のものを改変することが出来る。

無を椎動物の発現系も本発明における使用のために構築できる０例えばカイコ、 Ｂｏｍｂｙｘ　　ｍｏｒｉの幼虫にバキュロウィルスベクター、Ｂ　ｍ　Ｎ　Ｐ 　Ｖを感染させる。これはマエダ（Ｍ’ａｅｄａ）らにより　ＮａＬｕｒｅ、３ １５．８９２−８９４　（１９８５）に、また細胞工学（Ｓａｉｂｏ　　Ｋｏｈ ａｋｕ）、４，７６７−７７９　（１９８５）に記載されている。

１隻１ 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。

ｃＤＮＡライブラリー、ベクター、および宿主の選択、また試薬の濃度、温度、 および／ｌｊの変数の値は、単に本発明の通用を例示するためのものであり、こ れがその製薬であると考えられるものではない。

実施例は成塾ＣＭ−Ｃ３Ｆ　（１２７アミノ酸残基）の産生および精製について 記述する。

実施例１．　　　　１ンバ、　びＴ　　クローンか°のＤＮＡ”″イブー１−の 　Ｈ″　ｃ　ＤＮＡクローンの　−びＣＯ３７サル　−　　　での ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーは、Ｔ−７と命名されたヒトのクローン化Ｔ細胞株 およびヒトの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離したｍＲＮＡより構築した。ラ イブラリーはｐｃＤプラスミド中でオカヤマおよびパーク（上述）の方法に従っ て構築した。Ｔ−７ライブラリーから単一のクローンを単離した後、ＰＢＬライ ブラリー中に同一のクローンの存在を確認した。

Ａ、クローン化ヘルパーＴＲＩ胞 Ｔ−７と命名したヒトのＴ細胞クローンは、「Ｔリンパ細胞クローンの単離、同 定および利用（ｒｓｏｌａｔｉｏｎ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ａ ｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｔ　　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　　Ｃ１ ｏｎｅｓ）Ｊ、　ファスマンおよびツイツチ（ＦａＬｈｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｆ ｉｔｃｈ）編、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９Ｂ２）の第３６および ３７章に記載されている方法に従って単離した。細胞株は、１０％の熱非働化ウ シ胎児血清、５Ｘ１０−’Ｍの２−ＭＥ、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸 および必須ビタミン類を含むダルベツコの改変イーグル（ＤＭＥ）培地に、フィ トヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激したヒト末梢血リンパ球の培養上清を３０％ 添加したもので０５５Ｘ１０’ｉｌ胞／ｄの濃度で継代培養した。

Ｂ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ産生の誘導 Ｔ−７１１胞を５Ｘ１０’／ｄで４％熱非働化ウつ胎児血清、５Ｘ１０−’Ｍの ２ＭＥ、２ｍＭのグルタミン、非必須アミノ酸および必須ビタミン類および４μ ｇ／ｘｉのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むＤＭＥ中で培養した。３７°Ｃ １１０％ＣＯ□下４〜６時間の培養後、細胞浮遊液を１５００　ｒｐｔａで１０ 分間遠心分離した。細胞塊を回収し、直ちに一７０℃に凍結した。培養上清は濾 過しくナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）−０，２２ミクロン）、増殖因子源として一 ８０°Ｃで保存した。上清の一部は、ＣｏｎＡ処理による細胞株の誘導を確認す るためＣＳＦ活性をアッセイした（後述）。

ＰＢＬは７μｇ／ｄのＣｏｎＡを用いた以外は同じ条件で誘導した。

Ｃ，ｍＲＮＡの抽出 細胞の全ＲＮＡをチャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ。

Ｊ、　）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８．５２９４−５２９９　（１９７ ９））のグアニ゛ジンイソチオシアネート法により抽出した。ＣｏｎＡで誘導し たＴ−７細胞またはＰＢＬ　（刺激後４時間）の凍結した細胞塊をグアニジンイ ソチオシアン酸溶解溶液に！！濁した。１．５Ｘ１０１個の細胞に対し、２０ｄ の溶解溶液を用いた。細胞塊をピペットで再懸濁し、注射器を用いて１６ゲージ の注射針に４回通すことによりＤＮＡ切断した。溶解液を４０ｄのポリアロマ− 遠心管中、２０ＩＩ＆の５．７ＭＣｓＣ１，１０ｓ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ上に重層し た。この溶液をベックマン（Ｂ　ｉ　ｃ　ｋｍａ　ｎ）社Ｓ　Ｗ２　Ｂローター （Ｂｅｃｋｍａｎ　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、Ｐａ　１　ｏ　　Ａ Ｉ　Ｌ　ｏ、　ＣＡ）を用い、２５０００ｒｐａ＋、１５°Ｃで４０時間遠心分 離した。ＤＮＡを含むグアニジンイソチアン酸の層を上部から界面まで吸い出し た。管壁および界面を２〜３ｄのグアニジンイソチオシアン酸溶解溶液で洗浄し た。遠心管をはさみを用いて界面の下で切断し、ＣｓＣ１溶液を排出した。ＲＮ Ａ塊を冷却した７０エタノールで２回洗浄し、５００Ｉｌの１０１　トリス塩酸 、ｐＨ７，４，１ｓ＋Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳに再懸濁した。５０μ ｌの３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、ＲＮＡをｌｄのエタノールで沈澱させた。遠 心分離によって０．３＋ｌＩｇの全ＲＮＡが得られ、ＲＮＡ塊を冷エタノールで １回洗浄した。

洗浄し、乾燥した全ＲＮＡを９００ｔ１１のオリゴ（ｄＴ）溶出緩衝液（１０ｍ Ｍ）リス塩酸、　ｐｔ１７．　４．　１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％５ＤＳ）に再！ Ａ濁した。ＲＮＡは３分間６８°Ｃで加熱しその後氷上で冷却した。１００μｌ の５Ｍ　　ＮａＣ１を添加した。ＲＮＡ試料を結合緩衝液（１０ｍＭ）リス塩酸 、ｐＨ７，４，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

０．５Ｍ　　ＮａＣ１，０，５％５ＤＳ）で平衡化した１゜０ｄのオリゴ（ｄＴ ）セルロースカラム（タイプ３．コラボラティブリサーチ、ウオルサム、ＭＡ） に添加したカラムの流出液は更に２回カラムに添加した０次にカラムを０−の結 合緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液で洗浄し、ポリ（Ａ）′″のｍ　ＲＮ　Ａを回 収した。ＲＮＡは通常溶出緩衝液の最初の２ａｆ？−溶出した。ＲＮＡを０．１ １容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）および２容のエタノールで沈澱した。ＲＮ Ａ塊を遠心分離によって回収し、冷エタノールで２回洗浄して乾燥させた。ＲＮ Ａ塊を水に再懸濁し、一部を希釈して２６０ｎｍの吸光度を測定した。

Ｄ、ｐｃＤ　　ｃＤＮＡライブラリーの構築ｌ）部および２）部２段階１）〜５ ）はＰＣＴ／ＵＳニシテ行った。ただしｐ　ｃ　ＤＶ　Ｉ　　ＤＮＡ　（５７頁 、３〜４行目）はＮ５ｉｌエンドヌクレアーゼを用いて消化した。

（ｃＤＮＡライブラリー調製の）第６段階：Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換、形質転換 はコーエン（Ｃｏ　ｈｅｎ）らによりＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、６９．２１１０−２１１４　（１９７２）に記載された手段を若干改変 して行った。カサバダンおよびコーエン（Ｃａｓａｂａｄａｎ、Ｍｏ、ａｎｄ　 　Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、）によってＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１３８，１７９−２０７　（１９８０ ）に記載されたＥ、ｃｏｌｉＫ−１２株、ＭＣ１０６１を３７℃で２０ｄのＬ− ブロス中、６００　ｉｓの吸光度が０．５になるまで培養した。細胞を遠心分離 して集め、５０ｍＭ　　ＣａＣ１ｚを含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，３）１ ０ｄに！！濁し、０℃で５分間遠心分離した。細胞を再び上記の緩衝液２ｄ中に ！！濁し、再び０°Ｃで５分間インキエベートした；次に０．２ｄの細胞懸濁液 を第５段階のＤＮＡ溶液０．１−と混合し、これを０°Ｃで１５分インキュベー トした０次に細胞を３７℃に２分間置き、次に室温に１０分１いた；次に０゜５ ｉのＬ−ブロスを加え、３７℃で３０分間インキニベートし、その後２．５１ｄ のし一ブロス軟寒天と４２℃で混合し、１ｍあたり５０μｇのアンピシリンを含 むＬ−プロス寒天上に広げた。３７℃で１２〜２４時間インキニベートした後、 個々のコロニーを滅菌爪楊枝を用いて単離した。全体で約５Ｘ１０’の独立した ｃＤＮＡクローンが生産された。

Ｅ、ＤＮＡ）ランスフエクション（感染）によるヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリ ーのス、クリーニング１０’の独立したクローンを任意にＴ細胞ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ ライブラリーから抽出し、マイクロタイター培養皿のウェルで５０ｔ！ｇ／ｌｉ のアンピシリンおよび７％のジメチルスルホキシドを含むし一ブロス２００μｌ 中で増殖させた。マイクロタイター培養皿より４８のｃＤＮＡクローンが調製さ れ、プールされた。このプールから４０のクローンを１００μｇ／ｄアンピシリ ンを含むし一ブロス中で１リツトルまで増殖させた。各培養物からプラスミドＤ ＮＡを単離し、ＣｓＣｌグラジェントを２回通して精製した。各プール由来のＤ ＮＡ配列以下の方法でＣＯ３７サル細胞に感染（トランスフェクション）させた 。

感染の前日、約１０６のＣＯ３７サル細胞を別々の６０８１Ｉｌ１１プレートに 、１０％ウシ胎児血清および２Ｍグルタミンを含むＤＭＥ中で播種した。感染の ため、各プレートから培地を吸引し、５０　ｒｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，４）。

４００μ、／、ｄ　　ＤＥＡＥ−デキストランおよび１５μｇの被検プラスミド ＤＮＡを含むＤＭＥｌ、５ｄで置換した。プレートを３７℃で４時間インキュベ ートし、ＤＮＡを含む培地を除去、プレートを２ｄの無血清ＤＭＥで２回洗浄し た。プレートに１５０μとクロロキンを含むＤＭＥを加え、さらに３７℃で３時 間インキュベートした。プレートをＤＭＥで１回洗浄し、４％のウシ胎児血清、 ２ｍグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥを添加した。こ ののち、細胞を３７°Ｃで７２時間インキュベートした。培養上清を集め、上述 の方法でＧＭ−ＣＳＦの活性をアッセイした。

４つのプール（グループＩＡ、３Ｂ、７Ａおよび１４Ａ）がヒ）ＧＭ−Ｃ３Ｆ活 性を示した（下記第１表を参照）、各グループをさらに、それぞれ、もともとプ ールされたクローンのうち８つを含むような６つのプールに分割した。各々のプ ール由来のサブプールのうち１つが感染アッセイで陽性であった。°但し７Ａは ２つの陽性なサブプールを産生した。４または５つのサブプールの中の各プラス ミドを別々にＣＯ３７細胞に感染させた。３−８ａ、７−１ａ、７−４ｄ、およ び１４−１ｅと名付けられた４つの独立したクローンがＧＭ−ＣＳＦ活性を有し た。制限エンドヌクレアーゼ解析によってこれらのクローンの全てが実質的に同 じ構造を有することが示された。

第■表は２点の調帯血アンセイにおける各感染サンプルによって刺激された造血 コロニーの数を示す、クラスターは２０から５０細胞を意味し、小コロニーは５ １から１５０細胞、そしてコロニーは１５０以上の細胞を示す。

第■表 偽感染ＣＯ３７７÷１２クラスター ブールＩＡ：　　　　　　　　２９＋２５クラスターブー／Ｌ／３Ｂ：　　　　 　　　　３８’−，２０クラスターブール７Ａ：　　　　　　　２２÷１９クラ スタープール１４Ａ：　　　　　　　２６÷３２クラスター他の全てのプール　 　　　２０クラスター以下第２スクリーニング　８クローンのサブプール偽感染 ＣＯ３７９＋１５クラスター サブプール１−５：　　　　５６÷５４クラスターサブプール３−８：　　　　 ９Ｂ＋５２小コロニーサブブール７−１：　　　、　　２９−！−４１小コロニ ーサブプール？−４：　　　１００＋９３小コロニーサブプール１４−１　：　 　　４０−’、　７３小コロニー他の全てのサブブール　　２０クラスター以下 第３スクリーニング　個々のクローン クローン３−８ａ：　　　１２Ｇ＋１２７小コロニークローン７−１ａ：　　　 １９Ｂ’−，１６４小コロニークローン７−４ａ：　　　１７６’−，１６０小 コロニークローン１４−１ｅ：　　’６２＋６７　　小コロニー他の全てのクロ ーン　　　２０クラスター以下実譬的に完全長ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物を持つプラ スミド（ｐ　ｃＤ−ｈｕｍａ　ｎ−ＧＭ−Ｃ’ＳＦ）は第２図に示されており、 このプラスミドを持つＥ、ｃｏｌｉバクテリア（ＭＣ１０６１）はＡＴＣＣに寄 託された（寄託番号３９９２３）、第２図ではｐｃＤ発現ベクターに含まれる７ ７６ｂＰのｃ　ＤＮＡ挿入物のＳＶ４０早期プロモーターからの転写を矢印で示 した。スプライスの供与および受容部位が示されている。ＳＶ４０由来のポリア デニル化シグナルは、ｃＤＮＡ挿入の３′−末端に位置する。ＣＤＮＡ挿入物中 のＧＭ−Ｃ３Ｆコード領域が濃い影の部分で非コード領域は薄い影の部分である 。β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ’）および複製開始点を含むベクター配列の 残りの部分はｐＢＲ３２２由来である。

Ｍ１３ダイデオキシ　チェーンターミネータ−法（サンガー（Ｓａ　ｎｇ　ｅ　 ｒ、Ｆ、）’ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３−５４６７（１９７７））および改 変マクサム−ギルバート法（ルピンおよびシュミット（Ｒｕｂｉｎ、Ｃ９ａｎｄ 　　Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｃ０）Ｎｕｃ　１．Ａｃ　ｉｄ　　Ｒｅｓ、、８゜４６１ ３−４６１９　（１９８１））の双方を用いて３−８３の配列を決定した。ｃＤ ＮＡ挿入物は唯一つの読み枠を持つ、最初のＡＴＧは５′−末端から３３−３５ ヌクレオチドに存在し、ヌクレオチド２６５−４６７の終結暗号（ＴＣ；Ａ）ま での間に１４４コドンを持つ。

第ｍ表はクローン３−８ａ、？−１ａ、？−４ｄ、および１４−１ｅのそれぞれ の影響下で培養された約６０のヒト骨髄および腰帯血液コロニーの細胞組成物の 崩壊の割合をパーセント表示したものである。好酸球および他の細胞種の混合コ ロニーが存在するのは、コロニーが一緒に生育したためであろう。

第■表 ヒト骨髄コロニーの細胞組成 Ｎｅｕ　　　　？Ｉ　　φ　　　Ｅｏｓ　　　　Ｎｅｕ／Ｍφ　　　ｊφ／Ｅｏ ｓ　　　　Ｎｅｕノ９φ／Ｅｏｓ１５χ　３０χ　７χ　　３７χ　　　　２χ 　　　　　９工のＧＭ−Ｃ３ＦＯ日 しへ４０早期複製開始点のＸｈｏ　Ｉ切断部位にＨＴＬＶ　（１）レトロウィル スのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の断片を挿入して構築されるプロモー ター（ＳＲαと名付ける）を用いて様々な哺乳類細胞中での１：、Ｍ−Ｃ３Ｆの 発現上昇がなされる。ＬＴＲ断片が存在するとＣｏＳサル細胞（例えば寄託番号 ＣＲＬ　　１６５０またはＣＲＬ　　１６５１とし、てＡＴＣＣより入手可能） およびＣＶＩサル細胞（例えば寄託番号ＣＣＬ　　７０としてＡＴＣＣより入手 可能）およびマウスＬ細胞（例えば、Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）はＡＴＣＣより寄託番号 ＣＣＬＩ、３として入手可能）中でＧＭ−Ｃ３Ｆの発現は２０−５０倍に上昇す る０合成りＮＡ断片よりＳＲαプロモーターを構築する方法を以下に示す、ＳＲ αはＡＴＣＣ寄託番号６７３１ＢのプラスミドｐｃＤ−ｈｕＩＬ−３−２２−１ からも得られる。

レトロウィルスのＬＴＲはいろいろな系で発現を上昇させることが示されている ：例えばチェノ（Ｃｈ　ｅ　ｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ。

８２．７２８５−７２８８　（１９８５）；ゴーマン（Ｇｏ　ｒｍａ　ｎ）ら、 Ｐｒｏｃ、ＮａＬ　１．Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＵＳＡ、７９．６７７７　６７８１ 　（１９Ｂ２）；チミン（Ｔｅｍｉｎ）、Ｃｅｌ　ｌ、２７．１−３　（１９８ １）：およびルシウ（Ｌｕｃｉｗ）ら、Ｃｅ１ｌ、３３．７０５−７１６　（１ ９８３）がある、ｐＬＬのｘｈｏＩ切断部位に挿入されたＨＴＬｖ（Ｉ）ＬＴＲ 断片（叡完全なＲ’ｌ域およびＲ／Ｕ５境界から最初の下流のＴａｑｌ切断部位 まで（全部で３９塩基）のＵ　Ｓ　ｉＩ域の一部（第３図でＵＳ’　と命名され ている）を含む２６７塩基部分を含む、ＨＴＬＶ　（Ｉ）ＬＴＲの配列は、ヨシ ダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）らによりＣｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｔｃｓ　　ｉｎ　　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇ７，１１５，１５７ −１７５　（１９８５）に開示されている。

ＨＴＬＶ　（１）ＬＴＲは、実施例■に記載した方法を用い、４段階でプラスミ ドｐＬ１に挿入され、第３図に示す改変プラスミド、ｐＬ１’が作られた。まず ｐＬｌをＢｇｌｌおよびＸｈｏｌで消化し、大きい断片を単離する０次に大きい 断片を合成したＩＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂ（以下で定義する）と標準的なライゲー ジ３ン混合物中で混合する０合成物ＩＡ／Ｂおよび２Ａ／Ｂは共に５′→３′の 順に以下の者を含む；５Ｖ４０ｏｒｉのＢｇ１１／Ｘｈｏｌ断片、ＬＲＴのＲり のの２６７塩基の５′〜断片およびＳｍａ　Ｉ、Ｓａ　ｃ　１％　Ｎａ　ｅ　Ｉ 、およびＸｈｏＩの順にそれぞれの切断部位を含むポリリンカー。

（Ｂｇｌｌ） ＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡ　ＧＡＡＧ　ＴＡＧＴ　ＧＡＧＧ　 ＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧ　ＧＡ　−ＣＧＧ　ＡＧＣＣＧＧＡＧＡ　ＣＴＣＧ　Ａ ＴＡ　ＡＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡ　ＣＴＣＣＴＣＣＧ　ＡＡＡ　Ａ　ＡＡＣＣＴ −にＣＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴ？ ｃｃｃ ＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＡＧＣＴ 合成物２Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第一段階より得られるプラスミドを増幅、抽出し、Ｓｍａ ＩおよびＮａｅＩで消化して大きい断片を抽出した。大きい断片を次に合成物３ Ａ／Ｂおよび４Ａ／Ｂ（以下に定義する）と、標準的なライゲーション混合物中 で混合した。

ＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣＧにＴＴＧＡ ＣＴＣＧＣＧＴＴＣＴＣＧＧＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＧＴ ＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＣ合成Ｔｈ３Ａ／Ｂ ＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＧＴＣ ＣＧＣ−Ａ　ＧＣＧ　ＣＡＡＧ　ＡＣＧ　Ｇ　ＣＧＧＡ　ＧＧＧ　ＣＧＧＡ　Ｃ Ａ　ＣＣＡＣＧＧ　ＡＧＧＡ　ＣＴＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧＧ　ＣＧ　| ａｃＩ ＣＧＴＣＴＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＡＴ丁ＣＡＡＡ ＴＣ 合成物４　Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第二段階より得られるプラスミドを増幅、単離し、５ａｃ ｌおよびＮａｅＩで消化し、大きい断片を単なした。大きい断片を合成物５Ａ／ Ｂ（以下に定義する）と標準的なライゲーション混合物中で混合した。

ＣＡｆｌ：ＧＴＣＧＡ［；ＡＣＣＣＧＧＣＣＴＴＴにＴＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣ ＴＴＧＧＡＧＣＣ’ｒＡＣＣＴ−ＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＣＧＧ ＡＡＡＣ７１ＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣにＧＡＴＧＧＡ−ＮａｅＩ ＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣ ＴＣＴＧＡＧＴＣＧＧ 合成物５　Ａ／Ｂ ライゲーションの後、第三段階より得られるプラスミドを増幅、単離し、Ｎａｅ ｌおよびＸｈｏｌで消化し、大きい断片を抽出した。大きい断片を合成物６Ａ／ Ｂおよび７Ａ／Ｂ（以下に定義する）と標準的なライゲージＮ　ａ　ｅ　Ｉ ＧＧＣＴＣＴＣＣＡＣＧＣττＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣ ＴＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＩＩ；ＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡ ＡＣＧＡＧ合成物６　Ａ／Ｂ ＸｈｏＩ ＴＣＴＴＴＧＴＴτＣＧＴＴτＴＣＴＧττＣτＧＣＧＣＣＧＴ’ＴＡＣＡＧＡ τＣＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡにＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣ ＧＧＣＡＡ丁ＧＴＣＴＡＧＡＧＣτ合成物７Ａ／Ｂ 増幅の後、ｐＬ１’を精製し、ＨｉｎｄＩＩ［およびｘｈＯＩで切断し、ＳＶ４ ０　　ｏｒｉおよびＲ−ＵＳ’を含む小さい断片を単離した。また別にプラスミ ドｐｃＤＶ１（第４図に図示する）を精製し、Ｈｉｎｄｌｌ！およびＸｈｏＩで 消化し、ｐＢＲ３２２ｏｒｉおよびＡｍｐ’遺伝子を含む大きい断片を単離した 。ｐＬ１″の小さい断片とｐｃＤＶｌの大きい断片をライゲーションし、そこか ら得られるプラスミドｐｃＤ（ＳＲα）を増幅しへまだ、別にプラスミドｐｃＤ −ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦをＸｈｏＩで消化し、ＣＭ−Ｃ３Ｆのコード領域を 含む小さい断片を単離し、Ｘｈｏｌで消化したｐｃＤ（ＳＲα）とライゲーショ ンした。これらより得られる組換え体は、例えば細胞株ＨＢＩＯＬまたはＭＣ１ ０６１等の大腸面にトランスフェクションさせ、培養皿にまいたアンピシリン抵 抗性のコードのバクテリアを無作為に選び、別々に増幅させた。プラスミドを抽 出、精製し、そして上述の方法でＣＯ３７サル細胞を感染させるために用いた。

その培養上清のアンセイで、ＧＭ−Ｃ３Ｆ活性が陽性なＣＯ３７培養物は、目的 のｐｃＤ（ＳＲα）−ｈＧＭ−Ｃ３Ｆプラスミドを持つ。

実施例■、パン　　　でのＧＭ−Ｃ３Ｆの天然のヒトＣＭ−ＣＳＦのシグナルペ プチドのコード領域を除去し、プラスミドｐＭＦα８の酵母α−因子接合フエ口 モンのシグナルペプチドのコード領域と置換した。パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）は、ｐＭＦｃｒ８によって形質転換され 、接合因子／Ｃ，Ｍ−ＣＳＦ融合蛋白質を発現し、成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆを培地中に 分泌する。この実施例の結合はミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）らによりＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、５．１１９３−１１９７　（１９８６）にも記載されている。

パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖ１ｃｉａｅ）は接合型に 特異的なオリゴペプチドのフェロモンを分泌する。ＭａｔＩ：ｘｉ胞はα−因子 を分泌し、これはＭ　ａ　ｔ　ａ細胞の生育を細胞周期の０１期で停止する（ソ ーナー（Ｔｈｏｒｎｅｒ、Ｊ、）、’パン酵母の分子生物学（Ｔｈｅ　　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌ。

ｇｙ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＹｅａｓＬ　　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、コ ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−。

ニューヨーク（１９８１）；特に１４３−１８０頁を参照）、α−因子は２０ア ミノ酸のＮＨよ一末端シグナルしからなる大きい前駆体として最初は合成される 。この繰り返しはお互いから６または８個のアミノ酸のスペーサーにより隔てら れている（Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ａｌ　ａ−Ｃ１ｕ−Ａｌ　ａおよびＬｙ ｓ−Ａｒｇ−ＧｌｕＡ　１　ａ　　Ｇ　ｌ　ｕ　ＣまたはＡｓｐ）−Ａｌａ−Ｇ ｌｕ−Ａ　１　ａ　）　、このプレプロα因子はいくつかの特異的な部位で切断 を受ける。最初のプロセッシングは、ＫＥＸ２産物によフて触媒される。スペー サー配列中のＬｙｓ−ＡｒｇペアのＣ００Ｈ−末端の結合であるニジエリウス（ Ｊｕｌｉｕｓ）　　ら、Ｃｅ１ｌ、３７．１０７５−１０８９　（１９８４）、 カルボキシペプチダーゼＢ様の酵素がＬｙｓ−ＡｒｇベアのＮＨ，−末端側で切 断する。最終の段階はＳＴＥ　１３によってコードされるジアミノペプチダーゼ によるＧｌｕ−ＡｌａまたはＡｓｐ−Ａｌａベアの除去である。ブレイク（Ｊ、 Ｂｒａｋｅ）らは、Ｐｒ　ｏｃ、Ｎａ　Ｌ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、 ８１゜４６４２−４６４６　（１９８４）で成熟ヒト蛋白質をコードする配列と 第一プロセンシング部位の融合によってこのような蛋白質が分泌されることを示 した。

アルファ因子プロモーターおよび下流のリーダー配列を他の要素とともに含む、 ｐＭＦα８と名付けられた一般的な酵母の発現ベクターは、ＡＴＣＣに寄託番号 ４０１４０で寄託されている。これは以下のようにして構築することができる： ＭＦαｌ遺伝子を持つ１．７ｋｂのＥｃ　ｏＲＩ断片（カージャン（Ｋｕｒｊａ ｎ、Ｊ、）およびヘルショウィンツ（ＨｅｒｓｈｏｗｉＬｚ、１．）、Ｃｅ１ｌ 、３０゜９３３−９４３　（１９Ｂ２））をＭ１３ｍｐ８　（ビエラおよびメフ シング（Ｖｉｅｒａ、Ｊ、ａｎｄ　　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）、Ｇｅｎｅ、１９ ，２５９−２６８　（１９８２））中にクローニングした。第一スペーサー領域 のりジンコドンのあとにＨｉｎｄｌｎ切断部位を導入するため、合成オリゴヌク レオチドＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＡＣＣＣを単鎖Ｍ１３−ＭＦαＩ　 　ＤＮＡとハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドブライマーをＤＮＡポリメラ ーゼＩ　クレノー断片を用い伸長した。Ｓ１ヌクレアーゼ処理の後、ＤＮＡをＥ ｃ　ｏＲＩで切断し、ＭＦα１プロモーターおよびリーダー配列を含む断片をｐ ＵＣ８（ビエラおよびメツラング。上述）のＥｃｏＲＩおよび埋められたＨｉｎ ｄｌｌＩ制限酵素切断部位にクローニングした。望ましい構造のプラスミドが一 つ単離されたＣＰＭＦα４Δ１と命名した）、ｐＭＦα４Δ１をＨｉｎｄｌｌＩ によって切断し、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼ！クレノ ー断片を用いて部分的に補足した。ＤＮＡをヤエナリのヌクレアーゼで処理し、 オリゴヌクレオチドリンカー（ＧＣＣＴＣＣ；ＡＧＧＣ）を結合した。得られた プラスミド（ＰＭＦα５と命名した）は、アルギニンコドンの直後に５ｔｕＩ切 断部位、またその後にＸｈｏｌ制限酵素切断部位を持つ、Ｓ。

ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ−Ｅ、ｃｏｌｉのシャトルベクター（ｐＴＲＰ５８４）は 以下のようにして構築される。

２μ■プラスミドの複製開始点（ブローチ（Ｂ　ｒ　ｏ　ａ　ｃｈ、Ｊ、）、上 述）を含むＰｓＬＩ−Ｘｂａｌ断片をＰＴＲＰ５６（ミャジ？（Ｍｉｙａｊｉｍ ａ）ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ−Ｂｉｏｌ、、４，４０７−４１４　（１９８４）のＣ１ａＩ制限酵素 切断部位にクローニングし、ＴＲＰＩ−ＡＲ３！Ｒ３中の５ｊｕｌ制限部位をｐ ｖｕＩＩリンカ−挿入によってＰｖｕｌＩ制限部位へ変換した。基本となるｐＴ ＲＰ５６のＫｐｎＩ制限部位はＸｈｏ　Ｉリンカ−挿入によりＸｈｏＩに転換し た。そしてｐＴＲＰ５８４のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ制限部位にｐＭＦｃｒ５のＢ ｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ断片を挿入することにより、−ａ的な分泌ベクターｐＭＦα ８を得た。

ｐＭＦα８にクローニングする前に、シラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓ ｍｉＬｈ）によりＭｅＬｈ。

ｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１００，４６８−５００　（１９８３ ）に開示された方法を用い、Ｍｌ　３ｍＰｓ中のオリゴヌクレオチド特異的突然 変異誘発により、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　ｃＤＮＡ中にＦｓｐｌ制限部位を導入した。

導入したＦｓｐＩ部位によってｐＭＦα８への挿入前に内因型のシグナルペプチ ドのコード領域および成熟蛋白質をコードする領域の中間でｃ　ＤＮＡ挿入物を 切断することができる。

簡単に述べると、完全なｃＤＮＡ挿入物（第２Ａ図を参照）を含むｐ　ｃ　Ｄ　 −ｈ　ｕ　ｒｎ　ａ　ｎ　−Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　（７）　Ｂ　ａｍＨＩ断片を Ｍ１３ｍｐ８の複製型にクローニングし、それを用いてＥ、ｃｏｌｉ、ＪＭＩＯ Ｉを形質転換した挿入物を含むＭ１３ｍｐ８はイソプロとルーベーター〇−チオ ガラクトシド（Ｉ　ＰＴＣ，）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル −ベーターＤ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む寒天上で透明なプラークより 選択した。それぞれ選ばれたプラークに対応する８つのＥ。

ｃｏｌｔ　　ＪＭＩＯＩ培養物から標準的な技術（遠心分離、上清よりポリエチ レングリコールを用いたファージ粒子の除去、ファージのコート蛋白質からＤＮ Ａを分離するためのフェノール抽出、およびエタノール沈澱）を用いて、それぞ れ単鎖のＭ１３ｍｐ８ＤＮＡをｉ＝したクロスハイブリダイゼーションおよびゲ ル電気泳動を用いて決定したｃ　ＤＮＡ挿入物の方向に従って、８セットのＤＮ Ａを２つのサブセットに分類した。各サブセントの単鎖ＤＮＡに対してそれぞれ オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行った。逆に２つのサブセット中のＤ ＮＡを配列決定し、正しい方向でｃＤＮＡ挿入物を含む単ｇＤＮＡを決定するこ ともできる。

以下の配列を持つ（ミスマツチ（不一致）を下線で示した）２０残基のオリゴヌ クレオチドブライマーを合成した（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ。

、モデル３ＢＯＡ、フォスターシティ−、ＣＡ）：ＧＴＣＣ；ＴＡＧＡＣＧＣＧ ＴＧＧＧＣＧＧＧ３−リン酸化の後、２０残基のオリゴヌクレオチドブライマー を約３０倍過剰の単鎖ＤＮＡ　（約１ｕｇ）と混合し、５μｌ容の０．５Ｍ−Ｎ ａＣ１中で６５℃で５分間加熱し、室温で１時間放置した。緩衝液および塩類の 濃度は以下のように調製した。１００ｍＭ　　ＮａＣ１，２０ｍＭ）リス塩酸で ＰＨ７，５，１０鳳ｈジチオスレイトール。

１０ｍＭ　　Ｍｇｅｔ、、４種のデオキシヌクレオシド３リン酸を約４００μｉ ずつ、ＡＴＰを約５００μ？ｌ、ＤＮＡポリメラーゼ！　（クレノー断片）およ びＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、反応液を１２℃でインキュベートした。

二重鎖環状ＤＮＡをアルカリ蔗糖密度勾配遠心法によって単離し、（ａ　Ｃ１ｚ 処理した大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換するのに用いた。プライ→−で使用したも のと同じ配列を持１Ｐ標諏したオリゴヌクレオチドプローブでハＪＭＩＯＩのコ ロニーをスクリーニングした。

増幅の後、変異を含むＭ１３ファージをＥｓｐｌおよびＢａｍＨＩを用いて消化 し、（Ｂａｍｌ（Ｉ切断部位の突出端を平にするために）ＤＮＡポリメラーゼＩ クレノー断片で処理し、ゲル電気泳動にかけた。最後に抽出されたＧＭ−Ｃ３Ｆ を含む断片をｐ　Ｍ　Ｆ　αＢの５ｊｕｌ切断部位に挿入した。

サツカロミセス・セレビシェ２０Ｂ−１２（ＭＡＴαｔｒｐｌ−２８９ｐｅｐ４ −３）酢酸リチウム法（イトウ　（ＩＬｏ）　ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 ！５３．１６３−１６８　（１９８３））によりｐＭＦα８で形質転換し、０． ６７％のアミノ酸を含まない酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸および２％グル コースを含む培地で培養した。

調帯血を用いたコロニーアッセイにより、酵母培養液中に分泌されたＧＭ−Ｃ３ Ｆを確認した。

実施例■、　　　　でのＣＭ−Ｃ３Ｆの成熟ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのコード領域をｏ ｍｐＡ蛋白質のシグナルペプチドコード領域を含むベクターｐＩＮ−ｍ−Ｏｍｐ Ａ２に挿入した。ｐ　ＩＮ−ｍ−ＯｍｐＡ２はブライニブ（Ｇｈｒａｙｅｂ）ら によりＥＭＢＯＪ。

ｕｒｎａｌ、３，２４３７　２４４２　（１９８４）に、およびマスイ　（Ｍａ ｓｕｉ）らによりＢｉｏＬｅｃｈｎｏ１ｏｇ７，２．８１　８５　（１９８’４ ）に開示されている。これらの文献の内容は参照により本明細書に含まれる。

この挿入は３段階で行った。最初に成熟ＣＭ−Ｃ３Ｆコード領域を含むｐ　ｃ　 Ｄ　−ｈ　ｕｍａ　ｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＰ　ｓ　Ｌ　Ｉ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ 断片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１０の複製型（ＲＦ）のＰｓｔｌ／ＢａｍＨＩ消化物 に挿入し、点特異的突然変異誘発により、成熟Ｃ，Ｍ−Ｃ３Ｆの基礎と成るコド ン辷隣接して、そよびその５°−末端に、Ｅｃ。

Ｒ１部位を導入した。第２に変異したＭ　１３　ｍ　ｐ　１０のＥｃｏＲＩ／Ｂ ａｍＨＩ断片をＰ　Ｉ　Ｎ−ｍ−Ｏｍｐ　Ａ２のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化物 に挿入した。最後にＰ−ド領域および成熟ＣＭ−Ｃ３Ｆコード領域間の余分な９ 塩基対の配列を点特異的突然変異誘発により除去し九全ての場合においてＭｌ３ の変異型は合成ブライマーをプローブとして検出した。

全ての制限酵素消化、ＤＮＡポリメラーゼ、キナーゼおよびリガーゼの反応は、 本質的にマニアチスらにより記載された方法にしたがって行った。酵素はニュー イングランドバイオラボ社およびベーリンガーマンハイム社より購入した。プラ スミド抽出はアルカリ法（小規模：マニアチスら、上記）またはその変法（大規 模：ツラウスキ（Ｚｕｒａｗｓｋｉ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３７．３３５４−３３６０　’（１９８６））で行った。

点特異的突然変異誘発は、Ｍｌ　３ｍｐ　１０ベクターにサブクローニングされ たＤＮＡ断片を用いて行った。１０ｎｇのキナーゼ処理したブライマーＤＮＡを ５Ｏ−１００ｎＨの単鎖鋳型ＤＮＡとりガーゼ緩衝液４０μ！中で混合した。こ の混合物に１１００ｎの直１１Ｍ１３ＲＦを添加した０反応混合物は９５℃で１ Ｏ分間加熱した。アニーリングは室温で３０分、次に４℃で１５分おいて行った 。

ｄＮＴＰ　（５０，ｚＭ）、リガーゼ（４００Ｕ）およびりり、／−（５Ｕ）を 加え（総３１５０μｌ）、混合物を３０分間４℃で、次に１時間１２℃でインキ ュベートした。

混合物をＪＭＩＯＩ細胞中に形質転換し、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬ− プロス（Ｌ　Ｂ）プレートに接種した。白色のプラークをマイクロタイター培養 皿の１５０μＩＬ−ブロス中に楊子で移した０Ｍ１３惑染細胞をＬＢプレート上 のＪＭ１０１ｍ胞層上に接着法を用いて移した。３７℃で１６時間のインキュベ ーションの後、予め湿らせたニトロセルロース紙をプラーク上に１分間接着させ た。フィルターを０．０５Ｍ　　ＮａＯＨに３分間、中和緩衝液（３Ｍ　　Ｎａ ｃｌ、０．５Ｍ　　）リス塩酸、ｐＨ７，５）に１５分間浸した。再度１５分間 新しい中和緩衝液液に浸した後、フィルターを２ＸＳＳＣ中に移した。フィルタ ーを乾燥し、８０　”Ｃで１．５時間加熱した。フィルターの前−ハイプリダイ ゼーション処理！ム０．０９Ｍ）リス塩酸、ｐＨ１，５，ＩＸＤｅｎｈａｒｄｔ ｓ、０．９Ｍ　　ＮａＣ１，Ｏ，ＩＭ　　ＡＴＰ、１ａａＭＰｉ、１ｍＭ　　Ｐ Ｐ、０．５％ＮＰ４０，６ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび０．２■／ｄの大腸菌ｔ　Ｒ ＮＡ中、室温で３時間行った　Ｓｔ　ｐで標識したプローブを加え、更に室温で １６時間インキュベートした。フィルターは加熱しながら、オートラジオグラフ ィーで背景のカウントが検出されなくなるまで６ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で 洗浄した。

必要に応じて、ＳＳＣの濃度を下げた。陽性プラークより単＠ＤＮＡを単離し配 列決定を行った。

ＤＮＡの配列形賞転換委は標準的なダイデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ） ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、７４．５４６３−５４６１　（１９７７））を使用した 。ＤＮＡのオリゴヌクレオチドは、アブライドバイオシステムズ社３８０Ａ合成 機を用いて、ホスホルアミダイト化学法によって合成した。

ｐｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３ＦのＰ　ｓ　ｔ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩ断片を ＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐｌＯＲＦにクローニングした。

標準的な技術（メッシング、上述）を用い、この組成物の単１ＤＮＡを調製し、 第１図に示されている（１．Ｍ−Ｃ３ＦのＣ−ＤＮＡ配列の８３と８４塩基対の 間にＥｃｏＲＩ切断部位（ＧＡＡＴＴＣ）を導入するために点と特異的突然変異 誘発を行った。下記の合成プライマーを使用した：５’　−ＣＴＧＣＡＧＣＡＴ ＣＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴ−３’ＥｃｏＲＩ切断部位を 下線で示した。挿入変異体の配列を決定した後、ＧＭ−ＣＳＦＣ’−ＤＮＡを含 むＭ２ＳのＥｃｏ　Ｒ１／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで 消化したｐ　ＩＮ−ｍ−ＯｍｐＡ２に挿入して、大腸菌ＪＭ１０１中で増幅、単 離し、ＸｂａｌおよびＢａｍＨＩで消化した。　ＣＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｃ−ＤＮＡを 含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片をＸｂａｌ／ＢａｍＨＩで消化したＭ１３ｍｐ　 １０ＲＦに挿入した。単鎖ＤＮＡを標準的な方法を用いて単離し、下記の合成ブ ライマーを用いて点特異的突然変異誘発を行った： ５’−ＧＴＡＧＣにＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴ−３’ｒ、ＣＴＧ ＡＡＴＴＣ ブライマーの配列の間隙および下段の下線を付した配列は、９塩基対の欠失およ びその欠失した配列を示す、欠失変異体の配列を確認した後、そのＸｂａＩ／Ｂ ａｍＨ■断片を単離し、Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ　／　Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１で消化したｐｌ Ｎ　−ｍ　−Ｏｍ　ｐ　Ａ　２とライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０１を形質 転換するために用いる最終的な構築物を得た。

実施例Ｖ、　　　ｗ　　　テーシたＧＭ−ＣＳＦ（７）　　！大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）の可溶性抽出物から順に、陰イオン交換、色素−リガントアフィニティー 、ゲル漉息および逆相クロマトグラフィーを行って、ＣＭ−Ｃ３Ｆを精製した。

望ましくは一連のクロマトグラフィーはＱＡＥ（第四アミノエチル）カラムクロ マトグラフィー、マドレックス（Ｍａｔｒｅｘ）ゲルＲ’ｅｄＡカラムクロマト グラフィー、限外濃過による濃縮および／または硫酸アンモニウム沈澱、セファ デツクス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄｅＸ＞Ｇ−１００ゲル漉過、およびＦＰＬＣ またはＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーのいずれかを含む、この操作による最終 票品は、特異性の高い生物学的活性、９５−１００％の電気泳動的純度、低量の 発熱物質そして低量の大腸菌由来の夾雑物またはＧＭ−ＣＳＦの誘導物を示した 。

特に示さない限り、全ての操作は２−１５℃で行った各段階でコマジー青結合ア ンセイにより蛋白質濃度を決定した。ｐＨ測定は＋０．２単位で、誘電率測定は ＋３ｍいても、期待される精製度が得られない場合、溶出過区分を集め、同じカ ラムで再クロマトグラフィー、または以前の操作、または以前の一連の操作を再 び行った。硫酸アンモニウム沈澱および／または限外濃過法は、蛋白質を濃縮お よび／または保存するために行った：例えばステップＣの操作である。カラムの 平衡化および溶出に使用するものを含む全ての溶液は、使用前に０．２μ膜で濾 過した。ステップＤ以降の全ての溶液の調製にはＵＳＰＸＩＸｗＬ（７）水を使 用した。

Ａ、細肥の殺滅および蛋白質の抽出 ８５％のリン酸を加えてｐＨを４．５に、次に５０％トリクロロ酢酸を加えてｐ Ｈを２．０に調節し、細胞を殺した。０．２μ膜で濃過した後、水を加えて誘電 率を１５−２０ｍＳに調節した。低い誘電率は、ＣＭ−Ｃ３ＦをＱＡＥカラムに 結合させるために必要な希釈を最小限に抑えるために必要である。

Ｂ、第四アミノエチル（ＱＡＥ）カラムクロマトグラフ必要に応じて中和した抽 出物を、水酸化ナトリウムまたは塩酸で適切なｐＨ７，５に調節した。中和した 抽出物の誘電率は、脱イオン水を加えて５　１０ｍ５に調節した。ＱＡＥカラム は少なくとも２〜３倍のカラム容の２０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５で平衡化し た。ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む抽出物は、１ｍｌの樹脂あたり２０■以下でカラムに添 加した。カラムは平衡化に用いたものと同じ緩衝液に溶かした塩化ナトリウムの 濃度勾配でＯ−０，５Ｍの巾で、１０−２０倍のカラム容で溶出した。溶出分画 をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク、リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ）に基ずいて集め、ステップＣのクロマトグラフィーを行った。

Ｃ０色素アフィニティークロマトグラフィーＱＡＥカラムからの溶出分画は、誘 電率５　１０ｍ５まで脱イオン水で希釈し、２〜３カラム容の２０１トリス塩酸 、ｐＨ７，５で平衡化したＲｅｄアフィニティーカラム（例えばアガロース支持 体に結合したプロジオンレッド（Ｐｒｏｃｉｏｎ　　Ｒｅｄ）ＨＥ３Ｂに添加し た。

カラムに加える蛋白質の量は１ｄのゲル当たり１０■を越えてはならない、カラ ムは３〜４カラム容の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は５〜１５容の２０ｍＭ） リス塩酸ｐＥ７．５に溶かした０〜０．７５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配で行 った。ステップＤで用いる分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づいて集められた 。

Ｄ、限外濾過および／または硫酸アンモニウム沈澱による：ａ縮 前の掻作で回収された分画の蛋白質濃度が１．０■／−以下である場合、排除分 子量３０００−５０００の分離膜を用い、限外濾過で：ａ縮した。最終の蛋白質 濃度は１．０ｗｇ／ｄ以上とする。硫酸アンモニウムを最終濃度６０〜７０％に なるように加えた。沈澱を遠心によって回収し、沈澱に用いた濃度の硫酸アンモ ニウムを含む、２０ｍ？！）リス塩酸（ｐＨ７，５）で−回洗浄した。沈澱を遠 心によって集め、２０■Ｈトリス塩酸、ＰＨ７，５に溶解した。

Ｅ、セファデックスＣ；−１００カラムクロマトグラフイ再度溶解した硫酸アン モニウム沈澱は、必要に応じて遠心して不純物を除去した。溶液を０．２μフイ ルターで漉遇し、２０１トリス塩酸、ｐＨ７，５で平衡化したセファデックスＧ −１００カラムに添加した。カラムに添加される蛋白質の量は、ゲルＩＪＩ＋！ あたり３■を越えては成らない、カラムは同じ緩衝液を用いて溶出した。゛ステ ップＦで用いる分画を５ＤＳＬＰＡＧＥの結果に基づいて回収した。

Ｆ、逆相カラムクロマトグラフィー 回、収したセファデフクスＣ，−１００溶出液を０．２μフイルターで濾過し、 ＦＰＬＣ（高速蛋白質液体クロマトグラフィー）およびＨＰＬＣ（高速液体クロ マトグラフィー）カラム等の逆相カラムに添加した。カラムは０゜１％トリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化し、溶出はＯ０１％ＴＦＡ中に溶解した０−１００ ％のア七ト二トリル濃度勾配で行った０分画は５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づい て回収した。溶液を凍結乾燥し、乾燥粉末を２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐｕ’ ７．２に溶解した。

Ｇ、精製したＧＭ−Ｃ３Ｆの透析 ２に対して透析した。最低４〜５時間の間隔をおいて緩衝液を２回交換した。必 要に応じて、排除分子量３，０００〜ｓ、ｏｏｏの限外濾過膜を用い、透析した 溶液を蛋白質濃度が最低１．０■／ｄになるまで濃縦した。精製したＧＭ−Ｃ３ Ｆ溶液は０．２μフイルターを通し、−２０°Ｃあるいはそれ以下で凍結保存し た。

上述の本発明における態様は、例解および解説の目的で行った。これらはｍｓ的 なものではなく、また、本発明をここで開示された詳細な形式に限定するもので もない、そして、以上の既述に照らして明らかに多くの改変や変形が可能である ０本明細書における態様は、当業者が種々のＢ様で、また、個々の使用状況に適 切な種々の改変を用いて本発明を最適に使用できるために、本発明の原理とその 実際の適用法を最もよく解説する目的で選択、記載された０本発明の範囲は請求 の範囲によって定められる。

特許出願人はｐ　ｃＤ−ｈｕｍａｎ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ＠ＡＴＣＣに寄託番号３９９ ２３で寄託した。この寄託はブタペスト条約の要求を特徴する 請求の範囲 １、哺乳類細胞宿主中でのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の産生 のための発現ベクターであって、５Ｖ４０ＤＮＡの複製開始点； ＳＶ４０初期領域プロモーター； プロモーター； スプライスジャンクションおよびヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子 をコードする能力を持つヌクレオチド配列；および ポリアデニル化部位； をこの順に含み、且つ該プロモーターがＡＴＣＣ６７３１８の寄託番号で寄託さ れているプラスミドのＳＲαプロモーターであることを特徴とする上記発現ベク ター。

２、ＳＶ４０のポリアデニル化部位の後に、更に順に、バクテリア宿主中での発 現ベクターのクローニングを可能にするバクテリアの複製開始点：および発現ベ クターによって形質転換されたバクテリア宿主の同定を可能にする選択可能なマ ーカー：を含むことを特徴とする請求項１記載の発現ベクター。

３、バクテリアの複製開始点はｐＢＲ３２２の複製開始点であり、バクテリア宿 主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）であり、そして選択可能な マーカーは大腸直に抗生物質抵抗性を与えることを特徴とする特求項２記載の発 現ベクター。

４．＠乳類細胞宿主がＣＯＳサル細胞、ＣＶＩサル細胞、マウスＬｍ！ＩＩ胞お よびチャイニーズハムスター卵巣細胞より選択されることを特徴とする請求項３ 記載の発現ベクター。

５、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の発現ベクターを入れた適当な哺乳 類細胞宿主を培養することを特徴とする、哺乳類細胞宿主中でヒト顆粒球−マク ロファージコロニー刺激因子の生産方法。

６、哺乳類細胞宿主がＣＯＳサル細胞、ＣＶＩサル細胞、マウスＬ細胞およびチ ャイニーズハムスター卵巣細胞から選択されることを特徴とする請求項５記載の 方法。

手続補正書動力 平成　２年　６月７日 特許庁長官　　　吉　１）文　毅　　殿１、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２３３４ ２、発明の名称 ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびそのミューティン ３、補正をする者 名　称　　シエリング・バイオチック・コーポレーション４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　平成　１年　５月　８日　■送田６、補正の対象 国際調査報告 １ｍｌ＃＋＋Ｉ＋ｖｌ　ＡＭ”ｃ＃Ｉ’ｓ”　？、ＰＣτ／υＳ　８８１０２３ ３４　　２１”ｌｔ’Ｍｌ’ｌ”Ｊｌ　＾ｍｍｔａ１１１＋　４１１．　ｐｃ： 　／υ５　　Ｅε／Ｃ：二３４国際調査報告

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．次式： 【配列があります】 で表されるセットから選択されたグリコシル化もしくは非グリコシル化２回置換 ポリペプチドからなる、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活性を示す 蛋白質； 但し、 Ｘ（Ｓｅｒ）は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎを表し、 Ｘ（Ａｒｇ）はＬｙｓまたはＡｒｇを表し、Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕまたはＶａｌ を表し、Ｘ（Ｐｒｏ）はＡｌａまたはＰｒｏを表し、Ｘ（Ｔｈｒ）はＴｈｒ、Ｓ ｅｒまたはＡｌａを表し、Ｘ（Ａｌａ）はＰｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｙ、またはＶａｌを表し、 Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌ、ｌｌｅ、Ａｌａ、またはＬｅｕを表し、 Ｘ（Ｇｌｙ）はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒを表し、Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、Ｖ ａｌまたはＬｅｕを表し、Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅまたはＴｙｒを表し、Ｘ（Ｔｙ ｒ）はＴｙｒまたはＰｈｅを表し、Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎ を表し、Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎ、ＣｌｕまたはＨｉｓを表し、Ｘ（Ａｓｎ）はＡ ｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＬｙｓを表し、 Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓ、ＡｒｇまたはＡｓｎを表し、Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ、Ａ ｓｎまたはＣｌｕを表し、Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを表し、 そして Ｘ（Ｍｅｔ）はＮｌｅ、ＭｅｔまたはＬｅｕを表す。
2. ２．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８９−９５（両端を含 む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で規 定される領域において、１回より多くは置換されていない、請求項１記載の蛋白 質。
3. ３．ポリペプチドが１回より多くは置換されていない、請求項２記載の蛋白質。
4. ４．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８９−９５（両端を含 む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で規 定される領域において、置換されていない、請求項３記載の蛋白質。
5. ５．Ｘ（Ｓｅｒ）は、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒを表し、 Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇを表し、 Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕを表し、 Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏを表し、 Ｘ（Ｔｈｒ）はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａを表し、Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ、Ｓ ｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙを表し、 Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌまたはＩｌｅを表し、Ｘ（Ｇｌｙ）はＧｌｙまたはＡｌａ を表し、Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅまたはＶａｌを表し、Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅを表 し、 Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒを表し、 Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓを表し、 Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎを表し、 Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎまたはＡｓｐを表し、Ｘ（Ｌｙｓ）はＬｙｓを表し、 Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｓｎを表し、Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ、ま たはＡｓｐを表し、そしてＸ（Ｍｅｔ）はＭｅｔを表す、 請求項１記載の蛋白質。
6. ６．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８９−９５（両端を含 む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で規 定される領域において、１回より多くは置換されていない、請求項５記載の蛋白 質。
7. ７．ポリペプチドが１回より多くは置換されていない、請求項２記載の蛋白質。
8. ８．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８９−９５（両端を含 む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で規 定される領域において、置換されていない、請求項７記載の蛋白質。
9. ９．ポリペプチドがグリコシル化されておらず、そして、次式： 【配列があります】 で規定されるアミノ酸配列から成る、請求項８記載の蛋白質。
10. １０．次式： 【配列があります】 （式中、Ｘ（Ｘａａ）の型で示される記号の意味は、請求項１で与えられたもの と同じである。）で規定されるセットから選択された、グリコシル化された、ま たはされていない、１回置換、１回削除および／または１回挿入されたポリペプ チドからなる、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活性を有する蛋白質 。
11. １１．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８８−９６（両端を 含む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で 規定される領域において、置換、削除または挿入の何れもされていない、請求項 １０記載の蛋白質。
12. １２．ポリペプチドが置換も挿入もされていない、請求項１１記載の蛋白質。
13. １３．治療学上許容される担体および請求項１記載の蛋白質の有効量を含有して 成る、血液細胞の成長および発達をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで刺 激するための医薬組成物。
14. １４．蛋白質が次式： 【配列があります】 で規定されるアミノ酸配列から成る、請求項１３記載の医薬組成物。
15. １５．蛋白質が哺乳類細胞発現宿主によってグリコシル化されたものである、請 求項１４記載の医薬組成物。
16. １６．蛋白質がグリコシル化されていない、請求項１４記載の医薬組成物。
17. １７．ＳＶ４０のＤＮＡ複製起点； ＳＶ４０の早期領域プロモーター； ＳＲαプロモーター； スプライスジャンクションおよびヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を コードする能力を持つヌクレオチド配列；および ポリアデニル化部位； を順に有して成る、哺乳類細胞宿主中でヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激 因子を生産するための発現ベクター。
18. １８．ＳＶ４０ポリアデニル化部位の後に、さらに発現ベクターが細菌宿主中で クローニングできるようにする細菌の複製起点；および 該発現ベクターにより形質転換された宿主の同定を可能にする選択マーカー； を順に有して成る、請求項１７記載の発現ベクター。
19. １９．細菌の複製起点がｐＢＲ３２２の複製起点であり、細菌宿主が大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり、そして選択マーカーが大腸菌に抗生 物質耐性を付与するマーカーである、請求項１８記載の発現ベクター。
20. ２０．哺乳類細胞宿主がＣＯＳサル細胞、ＣＶＩサル細胞、マウスＬ細胞および チャイニーズハムスター卵巣細胞から選択される、請求項１８記載の発現ベクタ ー。
21. ２１．第一末端、第二末端および核酸配列を有する二重鎖ＤＮＡフラグメントか ら選択されるカセットであって、該第一末端および第二末端は各々、Ｓａｃｌ、 Ｎａｒｌ、ＢｓｔＥＩＩ、ＮａｅＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｃｌＩ、ＭｌｕＩ、Ｓａ ｕＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩから選択 される任意の二つの制限エンドヌクレアーゼにより規定される末端であり、前記 核酸配列は下記式で規定される２回置換ポリペプチド中の３〜４０アミノ酸のセ グメントをコードすることができる配列である、ｐｃＤ発現ベクター中でヒト顆 粒球マクロファージコロニー刺激因子ミューテインを造成するための上記核酸カ セット： 【配列があります】 （式中、Ｘ（Ｘａａ）の型で示される記号の意味は、請求項１で与えられたもの と同じである）。
22. ２２．核酸配列が、下記式： 【配列があります】 （式中、Ｘ（Ｘａａ）の型で示される記号の意味は、請求項５で与えられたもの と同じである）で規定される１回置換ポリペプチド中の３〜３０アミノ酸のセグ メントをコードすることがきる配列である、請求項２１記載の核酸カセット。
23. ２３．ポリペプチドが、アミノ酸１−７５（両端を含む）、８９−９５（両端を 含む）、１０４−１１２（両端を含む）および１１７−１２７（両端を含む）で 規定される領域においては置換されていない、請求項２２記載の核酸カセット。