JPH07163390A - 新規なポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 組換えＤＮＡ技術により、細菌を用いてヒト
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを製
造する方法を提供する。 【構成】 ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポ
リペプチドの製造方法であって、そのポリペプチドのア
ミノ酸配列中に３６〜３８位（１位 Ｔｈｒ）がＶａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕである１７８個のアミノ酸の配列を含
むポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡを
含む組換え発現ベクターで形質転換された細菌を培養
し、次いで産生されたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性
を有するポリペプチドを分離することを特徴とする製造
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なポリペプチド、特
に主としてヒト顆粒球系細胞のコロニー形成をさせるた
めに必要な、特異的な刺激因子、すなわちコロニー刺激
因子（以下「ＣＳＦ」と略記する）活性を有するポリペ
プチドの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞と
して骨髄細胞を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養
すると、上層の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒
球（以下「顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）」と称
す）や単球マクロファージからなるコロニーが形成され
ることから、生体内にコロニー形成を促進する因子が存
在することが知られていた（ＰｌｕｚｎｉｋとＳａｃ
ｈ；Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，６６巻
３１９頁（１９６５），ＢｒａｄｌｅｙとＭｅｔｃａｌ
ｆ；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃ
ｉ．４４巻２８７頁（１９６６））。

【０００３】「ＣＳＦ」と総称されるこの因子は、正常
に広く生体内分布する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マ
クロファージ、繊維芽細胞、内皮細胞などより産生され
ることが知られている。ＣＳＦには顆粒球・単球マクロ
ファージの幹細胞に作用して、その増殖を刺激し分化を
誘導して、軟寒天中で顆粒球や単球マクロファージから
成るコロニーを形成させる作用をもつ顆粒球−単球マク
ロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦと略記する）、主とし
て単球マクロファージのコロニーを形成させる作用をも
つ単球マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦと略記す
る）、より未分化な多能性幹細胞に作用する多能性ＣＳ
Ｆ（ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦと略記する）、あるいは本発明
の如き、主として顆粒球系コロニーを形成させる作用を
もつ顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦと略記する）などのサブ
クラスが存在し、それぞれのサブクラスによって標的細
胞の分化段階も異なることが考えられる様になってきた
［Ａｓａｎｏ；代謝−Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ
Ｄｉｓｅａｓｅ，２２巻２４９頁（１９８５），Ｙｕｎ
ｉｓ等；“Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏ
ｎ Ｆａｃｔｏｒｓ”ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｕｒｏｆ
ｆ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１巻，２
０９頁（１９８３）］。

【０００４】従って個々のサブクラスを精製し、その化
学的性状や生物学的性状をより詳細に調べることは造血
機構や種々の血液学的疾患の病態の解析にきわめて重要
なことである。なかでもＧ−ＣＳＦの生物学的作用とし
て、骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢
進が注目されており、特に白血病の治療と予防へのＧ−
ＣＳＦの臨床的有用性が大いに期待されていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】Ｇ−ＣＳＦの単離精製
のために従来行われてきた試みは、細胞培養法を用いて
その培養上清からＧ−ＣＳＦを単離する方法であるが、
Ｇ−ＣＳＦが低濃度しか産生されないこと、大量の培養
液から微量のＧ−ＣＳＦを得るには複雑な精製過程を必
要とするなどの難点をかかえ未だ大量の均一なＧ−ＣＳ
Ｆを得るには至っていなかった。従って、組換えＤＮＡ
技術を用いてＧ−ＣＳＦを大量に製造することが渇望さ
れていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は請求項１に記載
したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基
配列からなるＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術によって
ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド
を製造する方法を提供するものである。本発明にとり特
に重要な構成要件はヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子であって、詳しくはショ糖密
度勾配遠心法により１５〜１７Ｓ画分として得られる、
ヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードする
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的なＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）であり、より詳しくは配列番号５又は６の
ポリペプチドをコードする遺伝子、或いはその一部を有
するものであり、更に詳細には配列番号４の塩基配列の
５′−末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧから
６５０〜６５２ヌクレオチド位のＣＣＣまでの配列、１
２２〜１２４位のＡＣＣから６５０〜６５２位のＣＣＣ
までの配列又は配列番号４に記載された配列或いはその
一部を有するものである。

【０００７】本発明のの遺伝子は、例えばＧ−ＣＳＦ活
性を有するポリペプチドを産生する能力を有する哺乳動
物細胞等からＧ−ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを調製し
た後、既知の方法により２本鎖のｃＤＮＡに変換するこ
とによって得られる。

【０００８】前記、ｍＲＮＡの供給源となる哺乳動物細
胞は本発明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞株ＣＨ
Ｕ−２（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ
ＤｅＣｕｌｔｕｒｅｓ Ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉ
ｓｍｅｓ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）寄託番号Ｉ−４８３）であ
るが、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳動物から分離できる
細胞、あるいは樹立した他の細胞株でもよい。

【０００９】又、ｍＲＮＡの調製はすでに他のいくつか
の生理活性タンパクの遺伝子をクローン化する際、用い
られた方法、例えば、バナジウム複合体等のリボヌクレ
アーゼインヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノー
ル処理を行う（ＢｅｒｇｅｒとＢｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ
；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５１４３頁（１９
７９）を参照）か、グアニジンチオシアナート処理後、
ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行う（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等；Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８巻５２９４頁（１９７９）
を参照）ことによって、全ＲＮＡを得た後、オリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリ
Ｕ−セファロース等を用いたアフィニティ−カラム法あ
るいはバッチ法によりポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を得ることができる。またショ糖密度勾配遠心法等によ
りポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを更に分画することもできる。

【００１０】上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｇ−
ＣＳＦ活性をもつポリペプチドをコードするものである
ことを確認するためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳
させ、生理活性を調べるか、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を用いて
そのタンパクを同定する等の方法を行えばよい。例え
ば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉ
ｓ）の卵母細胞にｍＲＮＡを注入して翻訳させたり（Ｇ
ｕｒｄｏｎ等；Ｎａｔｕｒｅ，２３３巻１７７頁（１９
７２）を参照）、あるいはウサギ網状赤血球（Ｒｅｔｉ
ｃｕｌｏｃｙｔｅ）系や小麦胚芽（Ｗｈｅａｔ ｇｅｒ
ｍ）系を利用した翻訳反応が行われている（Ｓｃｈｌｅ
ｉｆとＷｅｎｓｉｎｋ；“Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，（１９
８１））。

【００１１】Ｇ−ＣＳＦ活性の検定は骨髄細胞を用いた
軟寒天培養法を適用して実施できる。それらの手法につ
いては総説がある（Ｍｅｔｃａｌｆ；“Ｈｅｍｏｐｏｉ
ｅｔｉｃ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｉｂｅｒｇ，Ｎ
Ｙ（１９７７））。

【００１２】前述の如き方法で得たｍＲＮＡを鋳型にし
て１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡか
ら２本鎖ｃＤＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの
組換えプラスミドを作成する。これで大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などを形質転換して、形質
転換株のＤＮＡ群（ｃＤＮＡライブラリー）を得る。

【００１３】ｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得るには、
例えばｍＲＮＡの３′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的
なオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写酵素で処理
するか、またはＧ−ＣＳＦタンパクのアミノ酸配列の一
部に相応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプラ
イマーとして逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的な
ｃＤＮＡを合成する。２本鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理
でｍＲＮＡを分解・除去した後、得られた１本鎖ｃＤＮ
Ａを逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（例えばＫｌ
ｅｎｏｗ断片等）処理後Ｓｌヌクレアーゼ等で処理して
得るか、あるいは、直接ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポ
リメラーゼ（例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ
等）等で処理することによっても得ることができる（例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）およびＧｕｂｌｅｒと
Ｈｏｆｆｍａｎ；Ｇｅｎｅ２５巻２６３頁（１９８３）
を参照）。

【００１４】このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡを
適当なベクター、例えば、ｐＳＣ１０１，ｐＤＦ４１，
ＣｏｌＥ１，ｐＭＢ９，ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，
ｐＡＣＹＣ１などに代表されるＥＫ型プラスミドベクタ
ーや、λｇｔ．λｃ，λｇｔ１０，λｇｔＷＥＳなどに
代表されるファージベクターなどに組み込んだ後、大腸
菌（Ｘ１７７６；ＨＢ１０１；ＤＨ１，Ｃ６００株な
ど）等を形質転換してｃＤＮＡライブラリーを得ること
ができる（例えば、前出“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇ”を参照）。

【００１５】２本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるに
は、ＤＮＡ末端に連結可能な末端をつけるべく、適当な
化学合成ＤＮＡ断片を付加し、予め制限酵素を用いて開
裂させたベクターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ4 ファージ
ＤＮＡリガーゼで処理することにより行うことができ
る。あるいは、予め制限酵素を用いて開裂させたベクタ
ーＤＮＡと２本鎖ｃＤＮＡのそれぞれにｄＧ，ｄＣ−鎖
（あるいはｄＡ，ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両Ｄ
ＮＡを含む溶液を徐冷することによっても行うことがで
きる（前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参
照）。

【００１６】こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿
主細胞の形質転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合Ｈ
ａｎａｈａｎが詳細に記述している如き方法（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．；１６６巻５５７頁（１９８３））、す
なわち、ＣａＣｌ₂ やＭｇＣｌ₂ 又はＲｂＣｌを共存さ
せて調製したコンピテント細胞に該組換えＤＮＡ体を加
えることにより実施することができる。

【００１７】目的とする遺伝子を保有する細胞を検索す
るには、インターフェロンｃＤＮＡのクローン化で用い
られたプラス−マイナス法（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ等；Ｐ
ｒｏｃ．Ｊｐｎ．Ａｃａｄ．５５巻Ｓｅｒ．Ｂ，４６４
頁（１９７９））や、ハイブリダイゼーション−トラン
スレーションアッセイ法（Ｎａｇａｔａ等；Ｎａｔｕｒ
ｅ２８４巻３１６頁（１９８０））など、又は該タンパ
ク質のアミノ酸配列をもとにして化学合成したオリゴヌ
クレオチドプローブを用いたコロニーあるいはプラーク
ハイブリダイゼーション法（Ｗａｌｌａｃｅ等；Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻８７９頁（１９８
１））などを用いればよい。

【００１８】このようにしてクローン化されたヒトＧ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を
含む断片は適当なベクターＤＮＡに再び組み込むことに
より、他の原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転
換させることができる。更にこれらのベクターに適当な
プロモーター及び形質発現に係る配列を導入することに
より、それぞれの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させる
ことが可能である。

【００１９】原核生物宿主細胞としては、例えばＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ等が挙げられる。目的の遺伝子をこれ等の宿主細
胞内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来の
レプリコン、すなわち複製起源および調節配列を含んで
いるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させれば
よい。またベクターは形質転換細胞に表現形質（表現
型）の選択性を付与することができる配列をもつものが
望ましい。

【００２０】例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、それを宿主とす
るベクターであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換するこ
とができる（Ｂｏｌｉｖｅｒ等；Ｇｅｎｅ２巻９５頁
（１９７５）を参照）。ｐＢＲ３２２はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、どち
らかの耐性を利用することによって形質転換細胞を同定
することができる。原核生物宿主の遺伝子発現に必要な
プロモーターとしては、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロ
モーター（Ｃｈａｎｇ等；Ｎａｔｕｒｅ２７５巻６１５
頁（１９７８）），やラクトースプロモーター（Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ等；Ｎａｔｕｒｅ２８１巻５４４頁（１９７
９）を参照。）およびトリプトファンプロモーター（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ等；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．）８巻４０５７頁（１９８０）を参照）等があげら
れ、どのプロモーターも本発明のヒトＧ−ＣＳＦ活性を
もつポリペプチドの産生に使用することができる。

【００２１】以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒト
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを得るには、上記
ベクターの適当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤ
ＮＡ体により宿主細胞を形質転換させた後、得られた形
質転換体を培養すればよい。さらに細胞内または培養液
から該ポリペプチドを分離・精製するには、公知の手段
を用いて行うことができる。

【００２２】一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフ
ェロン遺伝子等で知られているように、多形現象（ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）を示すと考えられ（例えばＮｉ
ｓｈｉ等；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７巻１５３頁（１９
８５）を参照）、この多形現象によって１個またはそれ
以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の
変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

【００２３】また、配列番号５又は６のアミノ酸配列の
中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くか又は付加さ
れたポリペプチド、あるいは１個またはそれ以上のアミ
ノ酸が１個またはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリ
ペプチドでもＧ−ＣＳＦ活性を有することがある。例え
ば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシス
テインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列
に変換して得られたポリペプチドがインターロイキン２
活性を保持することもすでに公知となっている（Ｗａｎ
ｇ等；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４巻１４３１頁（１９８
４））。それゆえ、それ等天然に存在するかあるいは人
工合成されたポリペプチドがヒトＧ−ＣＳＦ活性を有す
る限りそれ等のポリペプチドをコードする遺伝子は全て
本発明に含まれる。

【００２４】本発明のヒト−Ｇ−ＣＳＦ活性をもつポリ
ペプチド、及びこれをコードする遺伝子を有する組換え
ベクター及びこれを有する形質転換体、さらにはその発
現ヒト−Ｇ−ＣＳＦ組成物を得る方法について簡単に説
明すると以下の通りである。

【００２５】（１） プローブの調製 腫瘍細胞株ＣＨＵ−２の培養上清から精製して得られた
均一ヒトＣＳＦタンパクについてＮ末端よりアミノ酸配
列を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン処理
などにより断片化した後その断片についてもアミノ酸配
列を決定した［実施例３（ｉ），（ii），（iii ）］。
そのアミノ酸配列中から配列番号１及び２に示される配
列に対応する２種類のヌクレオチドプローブ（Ａ），プ
ローブ（ＩＷＱ）を合成した（実施例４）。

【００２６】プローブ（Ａ）は連続した１４個のヌクレ
オチドからなる混合型プローブである。プローブ（ＩＷ
Ｑ）は、ヒトコレシストキニン遺伝子のクローン化で用
いられた如き（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等；Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２巻１９３１頁
（１９８５））デオキシイノシンを使用した３０個の連
続したヌクレオチドである。

【００２７】ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホト
リエステル法を固相法に適用して行うことができ、Ｎａ
ｒａｎｇの総説に記述されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ３９巻３−２２頁（１９８３））。使用するプロー
ブは、本発明で用いたプローブ以外の位置のアミノ酸配
列に基づくものであってもよい。

【００２８】（２） ｃＤＮＡライブイリーの構築 ＣＨＵ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全Ｒ
ＮＡを得る。この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロー
スカラムによりポリ（Ａ⁺ ）ＲＮＡを選別した後、逆転
写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅＨお
よびＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、２本
鎖ｃＤＮＡを得た。得られた２本鎖のｃＤＮＡにｄＣ鎖
を付加し、ＰｓｔＩ切断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢＲ
３２２ベクターとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ１７７６株を
形質転換させ、ｐＢＲ３２２系ｃＤＮＡライブラリーを
構築した（実施例５，６）。同様にＥｃｏＲＩリンカー
を用いて、２本鎖ｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターと連結
し、λファージ系ｃＤＮＡライブラリーを構築した（実
施例７）。

【００２９】（３） スクリーニング ｐＢＲ３２２系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え体を
ワットマン５４１濾紙に固定し、³²Ｐで放射標識したプ
ローブ（ＩＷＱ）を用いて、コロニーハイブリダイゼー
ションを行った結果、１個のクローンが選別できた。こ
のクローンを、サザンブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８巻５０３頁（１９７
５））を用いて更に詳細に検討したところ、プローブ
（Ａ）ともハイブリダイズした。このクローンの塩基配
列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ；Ｓｃｉｅｎｃｅ２１
４巻１２０５頁（１９８１））によって決定した。

【００３０】得られたｃＤＮＡインサートの塩基配列を
配列番号３に示す。配列番号３に示される如く、このｃ
ＤＮＡインサートはプローブ（ＩＷＱ）およびプローブ
（Ａ）を含む３０８塩基対からなり、実施例３(iii）に
示したアミノ酸配列を含む８３個のアミノ酸をコードす
るオープンリーディングフレームを有していることがわ
かった。この３０８塩基対を含むｐＢＲ３２２由来のプ
ラスミドを以下ｐＨＣＳ−１と略記する（実施例８）。

【００３１】ｐＨＣＳ−１から得られる３０８塩基対を
含むＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前出、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇを参照）にて放射
標識し、これをプローブとしてλｇｔ１０由来のｃＤＮ
Ａライブラリーをプラークハイブリダイゼーション（Ｂ
ｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６巻１８
０頁（１９７７）によりスクリーニングして５個のクロ
ーンを得、ｃＤＮＡを含むと思われるクローンについて
その塩基配列を前述と同様の方法で決定した（配列番号
４）。配列番号４に示される如く、このｃＤＮＡインサ
ートは一つの大きなオープンリーディングフレームを有
する。このｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列
は配列番号４に示された如く演えきできる。

【００３２】実施例３（ｉ）に示されているＧ−ＣＳＦ
タンパクのＮ末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤ
ＮＡは５’−末端から３２〜３４ヌクレオチド位のＡＴ
Ｇ配列から始まり、１１９〜１２１位のＧＣＣ配列で終
わる９０塩基対によってコードされるシグナルペプチド
および１２２〜１２４位のＡＣＣ配列から始まり６５０
〜６５２位のＣＣＣ配列で終わる５３１塩基対によって
コードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに相当する塩
基配列を含んでいることがわかった。従って配列番号５
に示されたアミノ酸配列のポリペプチドは２０７個のア
ミノ酸からなり、その分子量は２２２９２．６７ダルト
ンと計算された。同様に配列番号６に示されたアミノ酸
配列のポリペプチドは１８９８６．７４ダルトンであっ
た（実施例９）。

【００３３】但しタンパク質の開始部位に関しては、３
２〜３４位あるいは６８〜７０位のＡＴＧも同様に考え
得る。ＥｃｏＲ１切断部位にこのｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）
を挿入したｐＢＲ３２２を保持するエシエリヒア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｘ１７７６株は、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−９５
４）。図１には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を
示した。

【００３４】（４） 組換えベクターの構築 かくして得られたｐＢＲＶ２プラスミド（実施例９）か
らＧ−ＣＳＦポリペプチドのｃＤＮＡ断片を制限酵素に
より切り出して来て、これと ｔａｃプロモーターを含有するｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア社製）から調製した断片とアニーリングした
合成リンカーを連結（ライゲーション）し組換えベクタ
ーを構築するか（実施例１０） Ｐ_L プロモーターを含むｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ（ファ
ルマシア社製）から調製した３種の断片とアニーリング
した合成リンカーを連結し、再調整して組換えベクター
を構築するか（実施例１１） あるいはｔｒｐプロモーター含有ｐＯＹＩプラスミド
から調製した断片とアニーリングした合成リンカーを連
結して組換えベクターを構築する（実施例１２）。

【００３５】（５） 形質転換体の調製と培養、発現。 次に上記３種の組換えベクターを用いて前出のＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されている塩化カル
シウム法又は塩化ルビジウム法で、夫々Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ１株，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ４８３０株或いはＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０５株を形質転換した（実施例１０，１１，
１２）。得られた形質転換株をアンピシリン含有ルリア
（Ｌｕｒｉａ）培地でまず培養し次いで必要に応じて、
適宜誘導をかけ、培養を行い形質発現せしめた（実施例
１３）。

【００３６】（６） 大腸菌からのＧ−ＣＳＦポリペプ
チドの回収精製とアミノ酸分析 形質転換株の培養液を遠心にかけ集菌した後リゾチーム
処理をし、凍結−融解をくりかえし溶菌させる。次いで
塩酸グアニジン処理後遠心で上澄液を得る。これをＵｌ
ｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ５４カラム（ＬＫＢ社製）でゲル
濾過し、活性画分を限外濾過器で濃縮した。

【００３７】次に、ｎプロパノールを含むトリフルオロ
酢酸水溶液を添加し、氷中放置、遠心分離し、逆相Ｃ１
８カラムに吸着、溶出操作を施す。溶出後各画分の活性
を調べ、活性ピークを集め凍結乾燥した。この凍結乾燥
粉末を溶解し高速液体クロマトグラフィにかけ、再度上
記と同様の精製操作を行い取得したポリペプチドをＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ目的とする
Ｇ−ＣＳＦポリペプチドを示す単一のバンドを確認した
（実施例１４）。この様にして得られたポリペプチドは
ヒトＧ−ＣＳＦ活性を示した（実施例１５）。更に、得
られたＧ−ＣＳＦポリペプチドのアミノ酸分析はアミノ
酸組成を日立８３５アミノ酸自動分析装置（日立製作所
製）を使用し、特殊アミノ酸分析法によって分析した。
又、Ｎ末端アミノ酸分析は気相式シークエンサーを用い
てエドマン分解し、高速液体クロマトグラフィー及び、
Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラムを用いて行った
（実施例１６）。

【００３８】

【実施例】以下実施例をあげて本発明を詳細に説明する
が、その前にＣＳＦ活性の測定法について参考例で説明
しておく。

【００３９】＜参考例＞ＣＳＦ活性の測定方法 本発明において用いられたＣＳＦ活性（以下ＣＳＡと略
す）の測定方法は次のとおりである。 「ＣＳＡの測定方法」 （ａ） ヒト骨髄細胞を用いる場合：Ｂｒａｄｌｅｙ
Ｔ．Ｒ．，Ｍｅｔｃａｌｆ Ｄ．等の方法（Ａｕｓｔ．
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．４４巻２８７
〜３００頁，１９６６年）に準じて単層軟寒天培養法に
より行った。すなわちウシ胎児血清０．２ml，被検検体
０．１ml，ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液０．１ml（１〜
２×１０⁵ 有核細胞），改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液
０．２ml，寒天を０．７５％含む改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５
Ａ培養液０．４mlを混合して直径３５mmの組織培養プラ
スティックディッシュに入れて固まらせたのち、３７
℃，５％炭酸ガス／９５％空気，１００％湿度の条件で
培養を行い、１０日後に形成されたコロニー数（５０個
以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数え、
１個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）と
してＣＳＡを求めた。

【００４０】（ｂ） マウス骨髄細胞を用いる場合：ウ
マ血清０．４ml，被検検体０．１ml，Ｃ３Ｈ／Ｈｅ（メ
ス）マウスの骨髄細胞浮遊液０．１ml（０．５〜１×１
０⁵ 有核細胞），寒天を０．７５％含む改変ＭｃＣｏ
ｙ’ｓ５Ａ培養液０．４mlを混合し直径３５mmの組織培
養用プラスティックディッシュに入れて固まらせたの
ち、３７℃，５％炭酸ガス／９５％空気、１００％湿度
の条件下にて５日間培養し、形成されたコロニー数（５
０個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を数
え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Ｕｎｉ
ｔ）としてＣＳＡを求めた。

【００４１】尚、上記（ａ），（ｂ）の方法において用
いた「改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液及び（ａ）で用い
たヒト骨髄非付着性細胞浮遊液は次の如くして作成し
た。「改変ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液（２倍濃度）」Ｍ
ｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）１２ｇ，Ｍ
ＥＭアミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）２．５５
ｇ、重炭酸ナトリウム２．１８ｇ，ペニシリンＧカリウ
ム５００００単位を２回蒸溜水５００mlに溶解後、０．
２２μｍのミリポアフィルターにて濾過滅菌を行った。

【００４２】「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」健常人胸
骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭＩ １６４０培養液
にて５倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ液（ファル
マシア社製）に重層し、４００×ｇ，３０分，２５℃に
て遠心を行い、界面の細胞層（比重＜１．０７７）を回
収する。この細胞を洗浄後、２０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培養液にて５×１０⁶ Ｃｅｌｌ／ml
の濃度に調整し、２５cm² の組織培養用プラスチックフ
ラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて３０分間インキュベ
ートしたのち、上清の非付着性細胞を回収し、再度２５
cm² プラスチックフラスコに入れ、２時間３０分インキ
ュベートしたのち、上清の非付着性細胞を集めて用い
た。

【００４３】実施例１ 「ＣＨＵ−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約１０日
後に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。こ
の腫瘍を移植１２日後に無菌的に摘出し、１〜２mm³ 角
に細切し、これを以下の如く培養した。上記細切した腫
瘍塊１０〜１５片を５０mlのプラスチック遠心管に入
れ、５mlのトリプシン溶液（トリプシン０．２５％，Ｅ
ＤＴＡ ０．０２％含む）を加え、３７℃の温浴中で１
０分間振とうしたのち上清を捨て、再度、同トリプシン
溶液５mlを加え、３７℃で１５分間撹拌しながらトリプ
シン消化を行った。上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎
児血清を１ml加えてトリプシンの作用を止めたのち氷中
に保存した。

【００４４】以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収
し、前回の分と合わせて１，５００ｒ．ｐ．ｍ．１０分
間の遠心により細胞ペレットを得た。この細胞ペレット
をウシ胎児血清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄した
のち、２５cm² のプラスチック培養フラスコに細胞濃度
５×１０⁶ 個／フラスコになるようにして植え込んだ。
ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％，湿度１
００％）中にて一晩インキュベートしたのち、上清を非
付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を継
続した。

【００４５】培養開始後６日目に細胞がいっぱいに増殖
したので、この時点で培養液を新しいものに替えた。翌
日、この培養液を捨て、ＲＰＭＩ １６４０で５倍希釈
した抗マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）２mlと同
じくＲＰＭＩ １６４０で２．５倍希釈したモルモット
補体（極東製薬社製）２mlを加え３７℃，２０分間イン
キュベートした。インキュベーション終了後ウシ胎児血
清を１０％含むＦ−１０にて２回洗浄しｎｕ／ｎｕマウ
ス由来のフィブロブラストを除去し引き続きウシ胎児血
清を１０％含むＦ−１０培養液を加えて、さらに２日間
培養を行った後細胞の一部を取り出し限界希釈法により
クローニングを行った。得られた１１個のクローンにつ
いてＣＳＦ活性を調べたところ、他のものよりも約１０
倍高い活性を示すクローン（ＣＨＵ−２）が得られた。

【００４６】実施例２ ＣＳＦの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した１
５０cm² の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これを
ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０培養液５００ml
に浮遊させたのち、１５８０cm² のガラス製ローラーボ
トル（Ｂｅｌｃｏ社製）に移し、０．５ｒ．ｐ．ｍ．の
速度で回転培養を行った。細胞がローラーボトルの内壁
に完全に密に増殖した時点で培養液を血清を含まないＲ
ＰＭＩ１６４０に交換し、４日間培養したのち培養上清
を回収し、ウシ胎児血清を１０％含有するＦ−１０を加
えて培養を続行する。

【００４７】３日間培養した後再び血清を含まないＲＰ
ＭＩ １６４０に液替を行い、４日後に培養上清を回収
した。以下同様の操作を繰返すことにより、毎週１ボト
ルより５００mlずつの血清を含まない培養上清が得ら
れ、しかもこの方法によりかなり長期間にわたって細胞
を維持し、培養上清を回収することが可能であった。得
られた培養上清５ lを１バッチとし、これに０．０１％
ツィーン２０を添加後Ｈｏｌｌｏｗ ＦｉｂｅｒＤＣ−
４およびＡｍｉｃｏｎ ＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いた限外濾過法により約１０００倍に濃縮したのち、
これを以下の順序で精製した。

【００４８】（ｉ） 直径４．６cm，長さ９０cmのＵｌ
ｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ ５４カラム（ＬＫＢ社製）を用
い、０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１％ツィーン２０
（半井化学社製）を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いて前記濃縮した培養上清５mlを流
速約５０ml／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじ
めウシ血清アルブミン（分子量６７，０００），オボア
ルブミン（分子量４５，０００），チトクロームＣ（分
子量１２，４００）にてキャリブレーションを行った。
ゲル濾過終了後各フラクションより０．１mlずつを採取
し、１０倍に希釈した後、前述した「ＣＳＡの測定方法
（ｂ）」により活性を示す画分を調べた。この結果、先
ずＶｅ＝４００〜７００mlの画分がマクロファージ優位
のＣＳＡを示し、Ｖｅ＝８００〜１２００mlの画分が顆
粒球優位のＣＳＡを示すことがわかったので、後者の画
分を集めＰＭ−１０（アミコン社製）を用いる限外濾過
器によって約５mlに濃縮した。

【００４９】（ii） 上記濃縮画分にｎ−プロパノール
（東京化成社製，アミノ酸配列決定用）を３０％含む
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、氷中に１５
分程度放置したのち、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．１０分
の遠心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパノ
ールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化した
μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ １８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、セミ分取用，８mm×３０cm）に吸着後、３０〜６０
％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマ
ト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３８−４
１型検出器（いずれも日立製作所製）を用い、２２０ｎ
ｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。

【００５０】溶出後、各画分より１０μl を分取１００
倍希釈したのち、前述の「ＣＳＡの測定法（ｂ）」によ
り活性を示す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノー
ル４０％にて溶出されるピークに活性が認められたの
で、このピークを集め再度同じ条件で再クロマトを行い
上記と同様にしてＣＳＡを調べたところ、やはりｎ−プ
ロパノール４０％の位置のピークに活性が認められたの
で、このピークを集め（４フラクション＝４ml）凍結乾
燥した。

【００５１】（iii ） 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパ
ノールを４０％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２
００μl に溶解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東
洋曹達社製，７．５mm×６０cm）を用いた高速液体クロ
マトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけた。溶出は同水溶液に
より０．４ml／分の流速で行い、フラクションコレクタ
ーＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により０．４
mlずつ分取した。分取した各画分についてＣＳＡを前記
と同様にして調べた結果、保持時間が３７〜３８分の画
分（分子量約２万に相当）に活性が認められたので、こ
の画分を回収し、更に分析用μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１
８カラム（４．６mm×３０cm）による精製を施したの
ち、メインピークを回収し凍結乾燥した。得られた標品
について前述の「ＣＳＡの測定方法（ａ）」によって検
定したところヒトＧ−ＣＳＦ活性を有することを認め
た。

【００５２】実施例３ アミノ酸配列の決定 （ｉ） Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置
（ベックマン・インストルメンツ社製）およびＵｌｔｒ
ａｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラム（ベックマン・インスト
ルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム
（５μｍ，直径４．６mm，長さ２５０mm）を開始緩衝液
（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５，４０％ア
セトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのち、検体
（２０μl の開始緩衝液にて溶解）を注入して開始緩衝
液によるイソクラティック溶出により分離を行った。流
速は１．４ml／分、カラム温度は４０℃に保持した。

【００５３】ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２
０ｎｍの紫外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨ
アミノ酸（シグマ社製）各２ｎｍｏｌを同一の系で分離
して保持時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を
行った。この結果、Ｎ末端から２１残基目までのアミノ
酸配列は次の如く決定された。

【００５４】Ｈ₂ Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
（Ｃｙｓ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｖａｌ−

【００５５】（ii） ブロムシアン分解 試料を７０％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン
２００当量を加えて、３７℃で一夜反応させた。次に反
応物を凍結乾燥後、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷカラム（東
洋曹達社製）を用いたＨＰＬＣで分画し４つのピークを
得た。ピークを分子量の大きい順にＣＮ−１，ＣＮ−
２，ＣＮ−３，ＣＮ−４と命名し、収率のよいＣＮ−
１，ＣＮ−２についてアミノ酸配列を自動気相式シーク
エンサー（アプライドバイオシステム社製）を用いて
（ｉ）と同様の条件で分析した。その結果、ＣＮ−１は
Ｇ−ＣＳＦタンパクのＮ末端からのペプチドであること
がわかった。さらにＣＮ−２は以下のアミノ酸配列を有
していた。

【００５６】Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓ
ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−

【００５７】（iii ） トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶かし、０．１％２−メルカプトエタノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え
て最終的に２Ｍの尿素となるように調整した。次いで試
料と酵素が５０：１となるようにＴＰＣＫ処理トリプシ
ン（シグマ社製商品名）を加え、２５℃で４時間反応さ
せた後、さらに同量のＴＰＣＫ処理トリプシンを加え
て、再度２５℃で１６時間反応させた。反応後、反応物
をＣ８カラム（山村化学社製）を用いた高速逆相カラム
クロマトグラフィーに付した。溶出は０．１％ＴＦＡを
含むｎ−プロパノールを用い、ｎ−プロパノール濃度を
５％〜６０％に直線的に上げて行った。２８０ｎｍの紫
外部吸収を測定して得られたピークのうち、メインピー
クについて（ｉ）と同条件下に自動気相式シークエンサ
ー（アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ酸
配列を分析した。その結果、メインピークは（ｉｉ）の
ＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列を有するペプチド
であることがわかった。

【００５８】Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−
Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−

【００５９】実施例４ ＤＮＡプローブの作成 （ｉ） プローブ（ＩＷＱ）の合成 実施例３（iii ）で得られたアミノ酸配列の中からＩｌ
ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔで示される１０個のアミノ酸
の配列に基づいて、３０個の連続するヌクレオチドを得
た（配列番号１）。配列番号１の配列に於いて、例えば
５’−末端から９位のヌクレオチドはｄＡおよびｄＧを
等量含む混合物であることを示す。原料のヌクレオチド
は主にダイマーを使用し、必要に応じて随時モノヌクレ
オチドも使用した。グラスフィルター付きカラムに出発
原料のヌクレオチド樹脂Ａｐ−ｄ（Ｇ）（ヤマサ醤油社
製）２０mgを入れ塩化メチレンにて洗浄を繰り返した
後、３％トリクロロ酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、
４，４’−ジメトキシトリチル基を脱離せしめ、次いで
１mlの塩化メチレンでカラムを数回洗浄した。

【００６０】無水ピリジンで洗浄して溶媒を置換したの
ちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ）ＡｐＴｐ（ＮＨＲ
₃ )(日本ゼオン社製；ＮＨＲ₃ はトリエチルアンモニウ
ム，ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを示す）２０mgと
０．２mlのピリジンを加えて真空ポンプにてカラム内を
真空乾燥した。次いで、２，４，６−トリメチルベンゼ
ンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ，和
光純薬社製）２０mgと無水ピリジン０．２mlを加えた
後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に４５分間
時々振とうさせることによってヌクレオチド樹脂とダイ
マーを縮合させた。反応終了後、ピリジンにてカラムを
洗浄し、次いで未反応のＯＨ基を過剰の無水酢酸と４−
ジメチルアミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチ
ル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。

【００６１】以下同様に、（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨ
Ｒ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴ
ｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＣｐＴｐ（ＮＨＲ
₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＴｐＴｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合
物，（ＤＭＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）
ＡｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合物，（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）
の等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＧｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）ＴｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ａｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＧｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）
の等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＣｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）との等量混合物，（ＤＭＴｒ）ＧｐＣ
ｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭｔｒ）ＴｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），
（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ）（ＤＭＴｒ）ＡｐＴｐ
（ＮＨＲ₃ ）［（ＤＭＴｒ）Ｉｐ（ＮＨＲ₃ ）はヤマサ
醤油社製，その他は全て日本ゼオン社製］の順で、前述
の操作を繰り返すことによって縮合させた。

【００６２】最終段階の反応終了後、アセチル化するこ
となしに、ピリジン，塩化メチレン，エーテルの順で樹
脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた樹脂を１Ｍテ
トラメチルグアニジンおよび１Ｍα−ピコリンアルドキ
シムを含むジオキサン１ml，ピリジン０．５ml，水０．
２mlの混合液１．７mlに懸濁した後、一夜室温にて放置
した後、１００〜２００μl まで減圧濃縮した。この濃
縮液に少量（２〜３滴）のピリジンを加えた後、濃アン
モニア水２〜３mlを加え５５℃で６時間加温した。次い
で酢酸エチルを加えて抽出分離し、得られた水層を減圧
濃縮した後、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液
（ｐＨ７．０）に溶解せしめてＣ−１８カラム（１．０
×１５cm，Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いたカラムクロマト
グラフィーに付した。溶出は、５０ｍＭトリエチルアン
モニウム酢酸溶液（ｐＨ７．０）中１０％〜３０％の直
線濃度勾配のアセトニトリルで行い、アセトニトリル濃
度が２５％付近の位置で溶出されるピーク画分を減圧濃
縮した。

【００６３】この濃縮液に８０％酢酸を加えて室温下に
３０分間放置した後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し
得られた水層を減圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、
Ｃ１８カラム（センシュー科学社製，ＳＳＣ−ＯＤＳ−
２７２，６φ×２００mm）を用いた高速液体クロマトグ
ラフィーに付して、さらに精製した。溶出は５０ｍＭト
リエチルアンモニウム酢酸溶液（ｐＨ７．０）中１０％
〜２０％の直線濃度勾配のアセトニトリルを用いて行
い、１０Ａ₂₆₀ ｕｎｉｔｓ以上の収量で合成ＤＮＡが得
られた。得られたオリゴヌクレオチドはＭａｘａｍ−Ｇ
ｉｌｂｅｒｔ法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６５巻４９９
頁（１９８０）により塩基配列を調べた結果、配列番号
１に示された配列を有していることが確認された。

【００６４】（ii） プローブ（Ａ）の合成 実施例３（iii ）で得られたアミノ酸配列の中からＭｅ
ｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａで示される５個の
アミノ酸の配列に基づいて１４個の連続するヌクレオチ
ドを得た（配列番号２）。合成は、プローブ（ＩＷＱ）
と同様な方法で行いヌクレオチド樹脂ＡＰ−ｄ（Ｔ）
（ヤマサ醤油社製）に（ＤＭＴｒ）ＣｐＡｐ（ＮＨ
Ｒ₃ ）；（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）；（ＤＭＴ
ｒ）ＣｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＣｐＴｐ（Ｎ
ＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）および
（ＤＭＴｒ）ＣｐＣｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合物；（Ｄ
ＭＴｒ）ＡｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＴｐＧｐ
（ＮＨＲ₃ ），（ＤＭＴｒ）ＧｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）およ
び（ＤＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）の等量混合物；
（ＤＭＴｒ）ＡｐＡｐ（ＮＨＲ₃ ）；（ＤＭＴｒ）Ｃｐ
Ａｐ（ＮＨＲ₃ ）と（ＤＭＴｒ）ＣｐＧｐ（ＮＨＲ₃ ）
の等量混合物；（ＤＭＴｒ）Ｇｐ（ＮＨＲ₃ ）（いずれ
も日本ゼオン社製）の順に縮合させて約１０Ａ₂₆₀ ｕｎ
ｉｔｓの合成ＤＮＡを得た。得られたオリゴヌクレオチ
ドの塩基配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法により調
べたところ配列番号２示された塩基配列を有しているこ
とが確認された。

【００６５】実施例５ ＣＨＵ−２細胞の培養とｍＲＮ
Ａの精製 １） ＣＨＵ−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたＣＨＵ−２細胞を１５０cm² の培養フラスコ
２本に完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を
１０％含有するＲＰＭＩ １６４０培養液５００mlに浮
遊させたのち、１５８０cm² のガラス製ローラーボトル
（Ｂｅｌｃｏ社製）に移し、０．５ｒ．ｐ．ｍ．の速度
で４日間回転培養を行った。細胞がローラーボトルの内
壁に完全に密に増殖した時点で、ローラーボトルから培
養液を除き、あらかじめ３７℃に加温したＥＤＴＡを
０．０２％含む生理食塩水１００mlを加え、３７℃で２
分間加温後、ピペット操作にて細胞をはく離せしめた。
得られた細胞懸濁液を１５００ｒ．ｐ．ｍ．１０分間の
遠心にて細胞ペレットを得る。細胞をＥＤＴＡを含まな
い生理食塩水５mlに再び懸濁し、１５００ｒ．ｐ．ｍ．
１０分間遠心にて細胞ペレットを得た（湿重量約０．８
ｇ）、このようにして得られた細胞はＲＮＡ抽出操作を
行うまで−８０℃にて凍結保存する。

【００６６】２） ｍＲＮＡの精製 上記の如くして得られたＣＨＵ−２細胞からのｍＲＮＡ
の単離は本質的に“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”［Ｍａｎｉａｔｉｓ等，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，１９６頁（１９８２）］に記載されてい
るようにして実施した。凍結保存されていたＣＨＵ−２
細胞（湿重量３．８ｇ）に２０mlの６Ｍグアニジン溶液
（６Ｍグアニジンチオシアナート，５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０），０．１Ｍ β−メルカプトエタ
ノール，０．５％ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁
し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーにて２〜３分よく混合した
後、１８Ｇの注射針を装てんした２０ml容の注射器を用
いて１０回吸入排出を繰り返した。

【００６７】ベックマン社製ＳＷ４０Ｔｉローターに合
うポリアロマー製の遠心チューブに６mlの５．７Ｍ Ｃ
ｓＣｌ−０．１Ｍ ＥＤＴＡ，（ｐＨ７．５）を先に加
えておき、チューブが満たされるように上述の細胞が壊
れて粘稠になったグアニジン溶液約６mlを重層した。こ
のようにして調製された遠心チューブ４本を３０，００
０ｒ．ｐ．ｍ．、２０℃で１５時間遠心した後、得られ
たペレットを少量の７０％エタノールを用いて３回洗浄
した。各々のチューブから得られたペレットを合して５
５０μl の水に溶解せしめＮａＣｌ濃度が０．２Ｍとな
るように調整したのち、フェノールークロロホルム
（１：１）処理、クロロホルム処理後、２．５倍容量の
エタノールを加えてエタノール沈澱を行い全ＲＮＡを得
た（湿細胞３．８ｇより全ＲＮＡ約１０．１mgを得
た）。

【００６８】全ＲＮＡからポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡの精製
は以下の如く行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端に
ポリＡ鎖を付加していることを利用したアフィニティー
クロマトグラフィーである。オリゴ（ｄＴ）−セルロー
ス（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製Ｔｙｐｅ
７）を用い、吸着は全ＲＮＡを吸着緩衝液（１０ｍＭト
リスー塩酸（ｐＨ７．５），０．５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ溶液を含む）に溶解し、
６５℃で５分間加熱した後、同溶液にて充てんされたオ
リゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過させて行い、溶
出はＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）で行った。未吸着通過液は再
び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、１回目の溶
出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ４００μｇを得た。

【００６９】このようにして調製したｍＲＮＡをＳｃｈ
ｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎｋの実験技術書（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉ
ｎ，（１９８１））中に記載されている方法と同様の操
作で、ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。す
なわち、ＳＷ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）
用チューブに５％〜２５％のショ糖密度勾配を作る。シ
ョ糖溶液は０．１Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳの
溶液にそれぞれ５％、２５％の割合いでＲＮａｓｅフリ
ーのショ糖（Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍａｎｎ社製）を含んで
いる。

【００７０】上記で述べた如き方法で調製したｍＲＮＡ
（ポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ）８００μｇを２００μl 〜５
００μl のＴＥ溶液に溶解せしめ、６５℃で５分間加熱
後急冷した後、ショ糖密度勾配液の上にのせる。３００
００ｒ．ｐ．ｍ．にて２０時間遠心後０．５mlずつの分
画を集め２６０ｎｍの吸光度を測り、同様に行った標準
ＲＮＡ（２８Ｓ，１８Ｓ，５ＳのリボソームＲＮＡ）の
位置に基づいて、分画されたＲＮＡのサイズを決めると
同時に各分画のＧ−ＣＳＦ活性をアフリカツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞系を用い
て調べた。

【００７１】すなわち各分画のｍＲＮＡを１μｇ／μl
の濃度の水溶液に調製し、ツメガエル（生後約１年）か
ら取り出した卵母細胞１個に５０ｎｇのｍＲＮＡの割合
いで注入した後、９６穴のマイクロタイタープレートの
１穴に卵母細胞を１０個ずつ入れ、それぞれ１００μl
のバース培地（８８ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＫＣｌ，
２．４ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ ，０．８２ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄ ，０．３３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ₃ ）₂ ，０．４１ｍＭ
ＣａＣｌ₂ ，７．５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
６），ペニシリン１０mg／l ，ストレプトマイシン硫酸
１０mg／l ）中で４８時間室温で培養した後上清を回収
し、濃縮・精製してＧ−ＣＳＦ活性を測定する。この結
果、１５〜１７Ｓ画分にＧ−ＣＳＦ活性が認められた。

【００７２】実施例６ ｃＤＮＡの合成（ｐＢＲ系ｃＤ
ＮＡライブラリーの構築） 前述の方法で得られたポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡからＬａｎ
ｄ等の方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
９巻２２５１頁（１９８１）］に基づき、Ｇｕｂｌｅｒ
とＨｏｆｆｍａｎの方法［Ｇｅｎｅ，２５巻 ２６３頁
（１９８３）］を加味してｃＤＮＡを合成した。

【００７３】１） １本鎖ｃＤＮＡの合成 エッペンドルフ社製１．５ml容チューブに以下の如くの
順序で試薬を入れる。８０μl の反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ ＫＣl ，５０ｍＭ ＭｇＣl ₂ ，２５０ｍＭトリス
−塩酸，ｐＨ８．３），２０μl の２００ ｍＭジチオ
スレイトール，３２μl の１２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを各々１２．５
ｍＭ含む），１０μl のα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャ
ム製，ＰＢ １０２０５），３２μl のオリゴ（ｄＴ）
_12-18 （Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製，５０
０μｇ／ml），２０μl のポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ（２．
１μｇ／μl ），蒸溜水２０６μl の計４００μl の反
応液を６５℃で５分間加熱後、４２℃で５分間加温す
る。この反応液に逆転写酵素（宝酒造製）１２０単位を
加え、さらに４２℃、２時間反応させた後、ＲＮａｓｅ
インヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２μl 、２０μl のＴ
Ｅ溶液、１６μl の１００ｍＭピロリン酸ナトリウム、
４８単位（４μl ）の逆転写酵素を追加して、今度は４
６℃２時間反応せしめた。０．５Ｍ ＥＤＴＡ ８μl
，１０％ＳＤＳ ８μl を加えて反応を停止させた
後、フェノールークロロホルム処理、エタノール沈澱
（２回）を行い一本鎖ｃＤＮＡを得た。

【００７４】２） １本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを６０μl の蒸溜水に溶
解後、６０μl のｄＣ−鎖付加緩衝液（４００ｍＭカコ
ジル酸カリウム；５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．
９）；４ｍＭジチオスレイトール；１ｍＭ ＣｏＣ
ｌ₂ ；１ｍＭ ｄＣＴＰ）に加え、３７℃で５分間加温
した。この反応液にターミナルトランスフェラーゼ（２
７ｕｎｉｔ／μl ，Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
社製）３μl を加えて３７℃で２．５分間反応した後、
フェノールークロロホルム処理（１回）、およびエタノ
ール沈澱（２回）を行い、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む
ＴＥ溶液４０μl に溶解せしめた。

【００７５】３） ２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記４０μl のＤＮＡ溶液に４μl のオリゴ（ｄＧ）
_12-18 （２００μｇ／ml，Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ社製）を加え６５℃５分間、続いて４２℃で３０
分間加温した後、反応液を０℃に保った。この反応液に
緩衝液８０μl （１００ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．
５，２０ｍＭＭｇＣｌ₂ ，５０ｍＭ（ＮＨ₄ ）₂ Ｓ
Ｏ₄ ，５００ｍＭ ＫＣｌ），４μl の４ｍＭ ｄＮＴ
Ｐ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各々４
ｍＭ含む）、６０μl の１ｍＭ β−ＮＡＤ及び２１０
μl の蒸溜水、２０μl のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（宝酒造社製）、１５μl のＥ．ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）、１５μl のＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造社製）を加え１２℃にて１時
間反応させた後、さらに４μl の４ｍＭｄＮＴＰを追加
し、２５℃で１時間反応して、フェノールークロロホル
ム処理、エタノール沈澱（１回）を行って、約８μｇの
２本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖ｃＤＮＡをＴＥ溶液
に溶解せしめ、１．２％アガロースゲル電気泳動を行
い、約５６０塩基対（ｂｐ）〜２キロ塩基対（Ｋｂｐ）
の大きさに相当する部分をワットマンＤＥ８１（ワット
マン社製）に吸着させ溶出回収したところ、約０．２μ
ｇが回収された。

【００７６】４） ２本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖ｃＤＮＡを４０μl のＴＥ溶
液に溶解し、２）の項で述べたｄＣ−鎖付加緩衝液８μ
l を加え３７℃で２分間加温した後、１μl のターミナ
ルトランスフェラーゼ（２７ｕｎｉｔ／μl ）を加えて
３７℃で３分間反応せしめた。反応液を直ちに０℃に冷
却し０．５Ｍ ＥＤＴＡ１μl を加えて反応を停止した
後、フェノールークロロホルム処理、エタノール沈澱を
行い、得られた沈澱をＴＥ溶液１０μl に懸濁した。

【００７７】５） ｐＢＲ系ｃＤＮＡライブラリーの構
築 市販のオリゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２ベクター（ベ
セスダリサーチラボラトリーズ社製、１０ｎｇ／μl ）
４μl と上記ｄＣ−鎖付加２本鎖ｃＤＮＡ２μl を７５
μl の０．１Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ溶液の中でアニー
ルさせた。アニールは６５℃、５分加温した後４０℃に
て２時間加温、その後、室温になるまで放置して行っ
た。一方、Ｍａｎｉａｔｉｓらの実験書［Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ， ２４９頁（１９８２）］に記載されてい
る方法等を用いて大腸菌Ｘ１７７６株からコンピテント
細胞を調製し、上記アニールされたプラスミドにより形
質転換を行い、トランスフォーマント（形質転換体）が
得られた。

【００７８】実施例７ ｃＤＮＡ合成（λファージ系ラ
イブラリーの構築） １） １本鎖ｃＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って３．８ｇの凍結保存ＣＨ
Ｕ−２細胞から２回オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに
よる精製を経て４００μｇのポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡを得
た。このポリ（Ａ⁺ ）−ＲＮＡ１２μg を溶解したＴＥ
溶液１０μl を１０μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ
社製）を含む反応チューブに入れた後、以下の順序で試
薬類を加えた；２０μl の逆転写緩衝液（２５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ８．３），４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，２
５０ｍＭ ＫＣｌ），２０μl の５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄ
ＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを各々５ｍＭ含
む）、２０μlのオリゴ（ｄＴ）_12-18 （０．２μｇ／m
l Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製），１μl
の１Ｍジチオスレイトール，２μl の３０ｕｎｉｔ／μ
l のＲＮａｓｉｎ（プロメガバイオテク社），１０μl
の逆転写酵素（１０ｕｎｉｔ／μl 生化学工業社製），
１μl のα−［³²ｐ］ｄＡＴＰ（１０μＣｉアマシャム
社製），１６μl の水で計１００μl の液量の反応液に
なる。反応液を４２℃で２時間保った後、５μl の０．
５Ｍ ＥＤＴＡ及び１μl の２０％ＳＤＳを加えて反応
を停止した。フェノールークロロホルム（１００μl ）
処理、エタノール沈澱（２回）を行って約４μｇの１本
鎖 ｃＤＮＡを得た。

【００７９】２） ２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを２９μl のＴＥ溶液に溶
解し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；２５μ
l のポリメラーゼ緩衝液（４００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐ
Ｈ７．６）；１６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ；６３ｍＭのβ−メ
ルカプトエタノール；２７０ｍＭ ＫＣｌ）；１０μl
の５ｍＭ ｄＮＴＰ；１．０μl の１５ｍＭ β−ＮＡ
Ｄ；１．０μl のα−［³²ｐ］ｄＡＴＰ（１０μＣｉ／
μl ）；０．２μl Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（６０
ｕｎｉｔ／μl 宝酒造社製）；５．０μl のＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ社，１０ｕｎｉｔ／μl ）；０．１μl の
ＲＮａｓｅ Ｈ（６０ｕｎｉｔ／μl 宝酒造社製）；２
８．７μl の蒸溜水。

【００８０】反応液を１４℃で１時間インキュベートし
た後、室温にもどして、さらに１時間インキューベート
した。次いで５μl の０．５Ｍ ＥＤＴＡと１μl の２
０％ＳＤＳを加えて反応を停止させ、フェノールークロ
ロホルム処理、エタノール沈澱を行った。得られたＤＮ
Ａを０．５ｍＭ ＥＤＴＡ２０μl に溶解せしめ、３μ
l のＫｌｅｎｏｗ緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０），５０ｍＭＭｇＣｌ₂ ），３μl の５ｍＭ
ｄＮＴＰ，及び水４μl を加えて反応液を調製した後、
１μl のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）（宝
酒造社製）を加えて３０℃１５分インキュベートした。
この反応液に７０μl のＴＥ溶液を加えて希釈し、さら
に５μl の０．５ＭＥＤＴＡ，１μl の２０％ＳＤＳを
加えて反応を停止した。反応液をフェノールークロロホ
ルム処理し、エタノール沈澱を行って約８μｇの２本鎖
ｃＤＮＡを得た。

【００８１】３） ２本鎖ｃＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖ｃＤＮＡの水溶液３０μl 、
メチル化緩衝液（５００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．
０），５０ｍＭ ＥＤＴＡ）４０μl ，ＳＡＭ溶液（８
００μＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチルメチオニン（Ｓ
ＡＭ），５０ｍＭβ−メルカプトエタノール）２０μl
，水１００μl を加えた混合液にＥｃｏＲＩメチラー
ゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社，２０
ｕｎｉｔ／μl ）１５μl を加えて全反応液を２００μ
l とし、３７℃２時間インキュベートした。フェノール
処理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱を行っ
てＤＮＡを回収した。

【００８２】４） ＥｃｏＲＩリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約１．２μｇにリガー
ゼ緩衝液（２５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５），１
００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）１．５μl ，あらかじめリン酸
化されたＥｃｏＲＩリンカー０．５μl （１０ｍｅｒ，
宝酒造社製），１．５μl の１０ｍＭＡＴＰ，１００ｍ
Ｍジチオスレイトール１．５μl ，２μl のＨ₂ Ｏを加
え、反応液を１５μl としてＴ４ＤＮＡリガーゼ（３．
４ｕ／μl ，宝酒造社製）０．７μl を加えて４℃で一
晩反応させた後、６５℃にて１０分間加熱しリガーゼを
失活させた。

【００８３】この反応液をさらに１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ７．５），５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，１００μｇ／mlのゼラチンの濃度で全液量が５
０μl になるように調製した後、ＥｃｏＲＩ（１０ｕｎ
ｉｔ／μl ）３．５μl 加え、３７℃、２時間反応させ
た。次いで０．５ＭのＥＤＴＡ２．５μl 、２０％ＳＤ
Ｓ０．５μl を加えた後フェノールークロロホルム処理
を行いエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。この後
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４（ＬＫＢ社製）のゲル濾
過法あるいはアガロースゲル電気泳動法にて未反応のＥ
ｃｏＲＩリンカーを除去し、リンカー付加２本鎖ｃＤＮ
Ａ約０．５〜０．７μｇを回収した。

【００８４】５） ２本鎖ｃＤＮＡとλｇｔ１０ベクタ
ーの結合 上記のリンカー付加２本鎖ｃＤＮＡを、２．４μｇの予
じめＥｃｏＲＩ処理したλｇｔ１０ベクター（ベクター
クローニングシステム社），リガーゼ緩衝液（２５０
ｍＭトリス塩酸，１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ）１．４μl
，蒸溜水６．５μl を加えて、４２℃、１５分間処理
した後、１０ｍＭ ＡＴＰ１μl ，０．１Ｍジチオスレ
イトール１μl ，Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ０．５μl を加え
全量を１５μl とした後、１２℃で一晩反応させた。

【００８５】６） インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約１／３をインビ
トロパッケージングキット（プロメガ バイオテク社）
を用いてパッケージングし、ファージプラークを得た。

【００８６】実施例８ プローブ（ＩＷＱ）によるｐＢ
Ｒ系ライブラリーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン５４１濾紙
をのせ３７℃で２時間放置した。以下、ＴａｕｂとＴｈ
ｏｍｐｓｏｎの方法［Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２
６巻２２２頁（１９８２）］に準じて濾紙を処理した。
すなわち、５４１濾紙にコロニーを移した後、クロラム
フェニコール（２５０μｇ／μl ）を含んだ寒天培地に
移し、さらに３７℃で一晩放置した。５４１濾紙を取り
出した後、室温下で０．５Ｎ ＮａＯＨ溶液を浸した濾
紙上に３分間放置し、これを２回くり返した。以下同様
な操作を０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８）溶液を用いて
３分間、２回行ない、更に４℃下に０．０５Ｍトリス−
塩酸（ｐＨ８）溶液で３分、１．５mg／mlのリゾチーム
液（０．０５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８），２５％ショ糖
を含む）で１０分間、次いで３７℃下に１×ＳＳＣ
（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０１５Ｍクエン酸ナト
リウム）溶液で２分間、２００μｇ／mlプロテアーゼＫ
を含む１×ＳＳＣ溶液で３０分、再び室温下に１×ＳＳ
Ｃ溶液で２分間、９５％エタノール溶液で２分間、２回
行った後、５４１濾紙を乾燥させた。

【００８７】得られた乾燥５４１濾紙を室温下にフェノ
ール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２
４：１，１００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５），１０
０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化したも
の）溶液に３０分間浸した。以下同様の操作を５×ＳＳ
Ｃ溶液で３分間、３回、次いで９５％エタノール溶液で
３分間、２回行った後、濾紙を乾燥させた。

【００８８】プローブ（ＩＷＱ）を常法（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇを参照）に従って³²Ｐを用いて
放射標識した後、Ｗａｌｌａｃｅ等の方法（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻８７９頁（１９８１））
に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。６
×ＮＥＴ［０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍトリス−塩
酸（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＥＤＴＡ］，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液，０．１％ＳＤＳ，０．１mg／ml変性ＤＮ
Ａ（仔牛胸腺ＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーション緩
衝液中で６５℃、４時間、プレハイブリダイゼーション
を行った後、放射標識化したプローブ（ＩＷＱ）１×１
０⁶ ｃｐｍ／mlを含む前記ハイブリダイゼーション緩衝
液を用いて５６℃で一夜ハイブリダイゼーションを行っ
た。反応終了後５４１濾紙を室温下に０．１％ＳＤＳを
含む６×ＳＳＣ溶液で３０分、２回及び５６℃、１．５
分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行った。シ
グナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、プ
ローブ（ＩＷＱ）を用いてサザンプロッティングを行っ
た。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフ
ィーは前述と同一の条件で行なった。

【００８９】同様にプローブ（Ａ）を用いてサザンブロ
ッティングを行った。ハイブリダイゼーションは前述の
ハイブリダイゼーション緩衝液を用い、４９℃で１時間
行い、３９℃まで徐冷後さらに３９℃で１時間行なっ
た。反応終了後、ニトロセルロースフィルターを０．１
％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣで室温下に３０分で２回洗滌
し、次いで３９℃で３分間洗滌した後、オートラジオグ
ラフィーを行なった。この結果、１個のクローンがポジ
ティブなものとして得られ、ジデオキシ法により塩基配
列を決定したところ配列番号３に示した如く、プローブ
（ＩＷＱ）及びプローブ（Ａ）部分を含む３０８塩基対
よりなるＤＮＡであることが判明し、このインサートを
含むｐＢＲ３２２由来プラスミドをｐＨＣＳ−１と命名
した。

【００９０】実施例９ ｐＨＣＳ−１由来ＤＮＡプロー
ブによるλファージ系ライブラリーのスクリーニング ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９６巻，１８０頁，（１９７７）］に準じてプラークハ
イブリダイゼーションを行った。実施例８で得られたｐ
ＨＣＳ−１をＳａｕ３ＡおよびＥｃｏＲＩで処理して約
６００塩基対のＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を常法
に従いニックトランスレーションにより放射標識した。
ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセルロー
ス濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージを移し、０．５Ｍ
ＮａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以下の順序で濾紙を
処理した。０．１Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌで
２０秒続いて０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５），
１．５Ｍ ＮａＣｌで２０秒２回，最後に１２０ｍＭ
ＮａＣｌ，１５ｍＭ クエン酸ソーダ，１３ｍＭ ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で２０秒処理
した。

【００９１】次いで濾紙を乾燥し、８０℃で２時間加熱
して ＤＮＡを固定した。５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液，５０ｍＭリン酸緩衝液，５０％ホルムアミ
ド，０．２５mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ），及
び０．１％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液
中で４２℃にて一晩プレハイブリダイゼーションを行
い、ニックトランスレーションにより放射標識化したｐ
ＨＣＳ−１プローブ４×１０⁵ ｃｐｍ／mlを含むハイブ
リダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ，５×Denhａｒｄ
ｔ溶液，２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０），５０％
ホルムアミド，０．１％ＳＤＳ，１０％デキストラン硫
酸，０．１mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合
液）で４２℃にて２０時間ハイブリダイゼーションを行
った。

【００９２】ニトロセルロース濾紙を室温下に０．１％
ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２０分間洗滌し、次いで４４
℃で、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで３０分
間、さらに室温下で０．１×ＳＳＣで１０分間洗滌した
後、オートラジオグラィーで検出した。その結果、５個
のポジティブなクローン（Ｇ１〜５）が得られた。そこ
で、得られたクローンのうち完全長ｃＤＮＡを含むと思
われるクローンのＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法にて調
べたところ配列番号４に示される如き塩基配列が得られ
た。そこでこのｃＤＮＡをλｇｔ１０ベクターより切り
だし、ｐＢＲ３２７［Ｓｏｂｅｒｏｎ等；Ｇｅｎｅ９巻
２８７頁（１９８０）］とＥｃｏＲＩ部位で結合させ、
プラスミドとして大量調製した。このプラスミドをｐＢ
ＲＧ４と称する。

【００９３】実施例１０ ［ｔａｃプロモーター含有ベ
クターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ベクターの調製 ｔａｃプロモーター含有ベクターｐＫＫ２２３−３（フ
ァルマシア社製）５μｇを３０μｌの反応液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカトプトエタノール）
中、ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）８単位で３７℃、２時間
処理した。次いで、アルカリホスファターゼ（宝酒造社
製）３μｌを加え６０℃、３０分間処理し、常法に従い
フェノール処理３回、エーテル処理及びエタノール沈澱
を行ってＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤ
ＴＴ、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ
からなる５０μｌの混合液に溶解し、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）３μｌを
加えて１４℃、２時間反応せしめ、末端をブラントエン
ド（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）にした。

【００９４】合成リンカーの調製 合成リンカー、ＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣ
Ｃ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧの配列を有する
オリゴヌクレチオド３μｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ２−メルカプト
トエタノール、１ｍＭ ＡＴＰからなる反応液４０μｌ
中でＴ₄ ポリヌクレチオドキナーゼ４単位存在下、３７
℃、６０分間反応せしめ、リン酸化した。次いで該リン
酸化オリゴヌクレチオドを夫々０．２μｇを１００ｍＭ
ＮａＣｌを含むＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、６
５℃、１０分間処理した後、室温まで徐冷することによ
りアニーリングを行った。

【００９５】Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡ断片の調製 実施例９で得た配列番号４で示すｃＤＮＡを含有するｐ
ＢＲＧ４ ６０μｇを６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭ ２−メルカトプトエタノール
からなる反応液２００μｌ中、制限酵素ＡｐａＩ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００単
位、ＤｒａＩ（宝酒造社製）５０単位で３７℃、３時間
処理し、１．２％アガロースゲル電気泳動にて約５９０
ｂｐのＡｐａＩ−ＤｒａＩ断片約２μｇを回収した。

【００９６】上記各断片の連結 ，，各断片を夫々約０．１μｇとり、２０μｌの
連結反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）に溶解
しＴ₄ ＤＮＡリガーゼ１７５単位を加えて４℃で一晩反
応し組換えベクターを得た。

【００９７】２）形質転換 上記で得られた組換えベクターを含む反応液２０μｌ
を用いて塩化ルビジウム法（前出Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
等「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐ２５２
（１９８２）参照）によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５株
を形質変換した。得られた形質転換株はアンピシリン耐
性のコロニー培養液よりプラスミドを分離し、制限酵素
ＢａｍＨＩ、ＡｃｃII、ＡｐａＩで処理したところ目的
の形質転換株であることが確認できた。

【００９８】実施例１１ ［ＰL プロモーター含有ベク
ターを使用した例］ 1)組換えベクター構築 ベクターの調製 ＰＬプロモーターを含むベクターｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ
（ファルマシア社製）１００μｇを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、５０単位で反応液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．６、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ）１００μｌ中、３７℃、一晩処
理した。これから、１％アガロースゲル電気泳動にて、
約４Ｋｂｐの断片約４９μｇと約１．２Ｋｂｐの断片約
１１μｇを回収した。

【００９９】上記の断片のうち、まず約４Ｋｂｐの方を
前記のＴＥ緩衝液１００μｌに溶解し、アルカリホスフ
ァターゼ（宝酒造社製）５μｌと６０℃、６０分間反応
せしめ脱リン酸化した。残りの約１．２Ｋｂｐの断片の
方は緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）２０μ
ｌに溶解し、制限酵素ＭｂｏII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０単位で３７℃、一晩処理
した。次いで、４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より約２００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＭｂｏII断片約０．９
μｇと約３１０ｂｐのＭｂｏII−ＢａｍＨＩ断片約１．
９μｇを回収した。

【０１００】合成リンカーの調製 合成リンカーＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴお
よびＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧを実施例１
０のと同様にしてリン酸化しアニーリングし、合成Ｓ
／Ｄリンカーを得た。

【０１０１】発現用ベクターの調製 上記で調製した約４Ｋｂｐ断片０．１μｇ及びＯ_L Ｐ
_L 領域を有するＢａｍＨＩ−ＭｂｏII断片、ｔＬ₁ 領域
を有するＭｂｏII−ＢａｍＨＩ断片夫々０．０５μｇと
アニールした合成Ｓ／Ｄリンカー０．１μｇを４０μｌ
の反応液（６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）中、Ｔ
₄ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位存在下１２
℃、一晩反応せしめた。この反応液２０μｌを用い、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎ９９ｃＩ⁺ 株（ファルマシア社製）を
ＣａＣｌ₂ 法（前出の“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ”参照）にて形質転換した。

【０１０２】該形質転換株を培養し、そのアピシリン耐
性のコロニーの培養液よりプラスミドを分離して、制限
酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩで処理したとこ
ろ目的のプラスミドであることが確認された。次に、こ
のプラスミドを２μｇとり、２０μｌの緩衝液（１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ
ＮａＣｌ）中、制限酵素ＣｌａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を３７℃、２時間反応さ
せた後６５℃１０分間で失活させた。更にその反応液１
μｌを２０μｌの前記連結反応液及びＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社製）１７５単位を用いて１２℃、一晩反応
した後、上記と同様にしてＥ．ｃｏｌｉ Ｎ９９ｃＩ⁺
株（ファルマシア社製）を再び形質転換した。アンピシ
リン耐性コロニー培養液からプラスミドを分離しＥ．Ｃ
ｏＲＩ、ＢａｍＨＩで処理し、目的のプラスミドを確認
した。

【０１０３】Ｇ−ＣＳＦ発現用組換えベクター及び形
質転換体の調製 で得られた発現用プラスミドを制限酵素ＣｌａＩで処
理し、末端をブラントエンドにした後実施例１０と同様
にしてＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡ断片を組み込み組換えベク
ターを得た。これを用い、前出のＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されているＣａＣｌ₂ 法にてＥ．
ｃｏｌｉ Ｎ４８３０株（ファルマシア社製）を形質転
換した。なお、目的の形質転換体の確認も実施例１０と
同様に行った。

【０１０４】実施例１２ ［ｔｒｐプロモータ含有ベク
ターを用いた例］ １）組換えベクターの構築 ベクターの調製 ｐＢＲ３２２のＣｌａＩ部位にトリプトファンプロモー
ターを含む約３３０ｂｐのＨｐａII−ＴａｑＩ断片を挿
入し作製したｐＯＹ１プラスミド１０μｇを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌの反応液３０μｌ中、制限酵素ＣｌａＩ７単位Ｐ
ｖｕII ８単位で３７℃３時間処理した。次いで、アル
カリホスファターゼ（宝酒造社製）２μｌを加え６０
℃、１時間反応せしめた。これから１％アガロースゲル
電気泳動により約２．６Ｋｂｐの断片を約２．５μｇ回
収した。

【０１０５】合成リンカーの調製 合成リンカーＣＧＣＧＡＡＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧ
ＣＣ及びＣＡＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＣＧを実施例１０
のと同様にしてリン酸化し、アニーリングした。

【０１０６】組換えベクターの調製 上記で調製ベクターの断片約１μｇ、及びの合成リ
ンカー約１μｇと、実施例１０ので調製したＧ−ＣＳ
ＦのｃＤＮＡ断片約１μｇを前記の連結反応液２０μｌ
中、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）１７５単位と１
２℃で一晩反応せしめ組換えベクターを得た。

【０１０７】２）形質転換 上記の反応液２０μｌを前出「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ」の塩化ルビジウム法でＥ．ｃｏｌｉＤ
ＨＩ株に形質転換した。実施例１０と同様にしてアンピ
シリン耐性のコロニーからプラスミドをとり、制限酵素
ＡｐａＩ、ＤｒａＩ、ＮｒｕＩ、ＰｓｔＩで目的とする
形質転換体が得られていることを確認した。

【０１０８】実施例１３ 形質転換株の培養 １）実施例１０で得た形質転換株（Ｔａｃ含有）の培養 アンピシリン２５μｇ／ml又は５０μｇ／mlを含むルリ
ア（Ｌｕｒｉａ）培地１００mlに、３７℃、一晩培養し
た該形質転換株の培養液１mlを加え３７℃で２〜３時間
培養する。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド２ｍＭにして３７℃、２〜４時間培養した。

【０１０９】 ２） 実施例１１で得た形質転換株（Ｐ_L 含有）の培養 アンピシリン２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌを含む
ルリア培地１００mlに２８℃一晩培養した該形質転換株
の培養液１mlを加え28℃で約４時間培養した。その後、
これを４２℃にし２〜４時間培養を行った。

【０１１０】３）実施例１２で得た形質転換株（ｔｒｐ
含有）の培養０．５％グルコース、０．５％カザミノ酸
（Ｄｉｆｃｏ社製）、アンピシリン２５μｇ／ml又は５
０μｇ／mlを含むＭ９培地１００mlに３７℃一晩培養し
た該形質転換株の培養液１mlを加えて３７℃で４〜６時
間培養する。次いで、３−β−インドールアクリル酸
（ＩＡＡ）５０μｇ／mlを加えて３７℃で４〜８時間培
養した。

【０１１１】実施例１４ 大腸菌からのＧ−ＣＳＦポリ
ペプチドの回収・精製 １）回収 実施例１３で培養した形質転換株、夫々について以下の
回収操作を行った。培養液１００mlを遠心分離にかけて
菌体を集め、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、３０ｍＭ ＮａＣｌ混合液５mlに懸濁させた。次
いで、各々１ｍＭ、10ｍＭ、０．２μｇ／mlになるよう
に０．２Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド、
０．２Ｍ ＥＤＴＡ、リゾチームを加え、０℃で３０分
間放置した。次に凍結−融解を３回くりかえし溶菌させ
た。続いて８Ｍ塩酸グアニジンを用いて、最終的に６Ｍ
塩酸グアニジンにした後、３０，０００r.p.m.、５時間
の遠心分離を行い、その上澄液を取得した。

【０１１２】２）精製 （ｉ） １）で得た上澄液を直径４．６cm、長さ９０cm
のＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ５４カラム（ＬＫＢ社製）に
て、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０１％ツィーン２
０（半井化学社製）を含む０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）を用いて流速約５０ml／時間でゲル濾過
した。次いで、前述した「ＣＳＡの測定方法（ｂ）」に
より活性を示す画分をとりｐＭ−１０（アミコン社製）
を用いる限外濾過器によって約５mlに濃縮した。

【０１１３】（ii） 上記濃縮画分にｎ−プロパノール
（東京化成社製，アミノ酸配列決定用）を３０％含む
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を添加し、氷中に１５
分程度放置したのち、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．１０分
の遠心により沈澱を除去した。次いで先のｎ−プロパノ
ールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化した
μ Ｂｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社
製、セミ分取用，８mm×３０cm）に吸着後、３０〜６０
％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む０．１％ト
リフルオロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマ
ト装置は日立６８５−５０型を、検出は日立６３８−４
１型検出器（いずれも日立製作所製）を用い、２２０ｎ
ｍと２８０ｎｍの吸収を同時に測定した。溶出後、各画
分より１０μｌを分取１００倍希釈したのち、前述の
「ＣＳＡの測定方法（ｂ）」により活性を示す画分を調
べた。この結果、ｎ−プロパノール４０％にて溶出され
るピークに活性が認められたので、このピークを集め再
度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にしてＣＳＡ
を調べたところ、やはりｎ−プロパノール４０％の位置
のピークに活性が認められたので、このピークを集め
（４フラクション＝４ml）凍結乾燥した。

【０１１４】（iii ） 上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパ
ノールを４０％含む０．１％トリフルオロ酢酸水溶液２
００μｌに溶解し、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東
洋曹達社製，７．５mm×６０cm）を用いた高速液体クロ
マトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけた。溶出は同水溶液に
より０．４ml／分の流速で行い、フラクションコレクタ
ーＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）により０．４
mlずつ分取した。分取した各画分についてＣＳＡを前記
と同様にして調べ活性画分を回収し、更に分析用μ Ｂ
ｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラム（４．６mm×３０cm）に
よる精製を施したのち、メインピークを回収し凍結乾燥
した。得られたタンパク質を２−メルカプトエタノール
で処理してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１５．０
％）電気泳動（１５ｍＶ，６時間）にかけ、クマシーブ
ルーで染色したところ目的とするＧ−ＣＳＦポリペプチ
ドが単一のバンドとして確認できた。

【０１１５】 実施例１５ 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性の検定 実施例１４で得たＣＳＦ試料を前述の＜参考例＞ＣＳＦ
活性の測定方法（ａ）に従って検定した。この結果を表
１に示す。

【０１１６】

【表１】

【０１１７】実施例１６ アミノ酸分析 １） アミノ酸組成の分析 実施例１４で精製したＣＳＦ試料を常法により加水分解
し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を日立８３５アミ
ノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用いて特殊アミ
ノ酸分析法により分析した。この結果を表２に示した。
尚、加水分解条件は次の如くである。 ６Ｎ ＨＣｌ，１１０℃，２４時間，真空中 ４Ｎ メタンスルホン酸＋０．２％ ３−（２−アミ
ノエチル）インドール，１１０℃，２４時間，４８時
間，７２時間，真空中 試料は、４０％ｎ−プロパノールと０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含む溶液（１．５ml）に溶かした後、各々０．
１mlをとり、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又は
の試薬を加えて真空封管し、加水分解に供した。

【０１１８】表中、実測値はの２４時間値との２
４，４８，７２時間値の合計４回の平均値である。但
し、Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｖａｌ，
ＩｌｅおよびＴｒｐは以下の方法で算出した。（生化学
実験講座、タンパク質化学II（東京化学同人出版）を参
照） ・Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔはの２４，
４８，７２時間値の経時変化をとり、零時間に補外。 ・Ｖａｌ，Ｉｌｅはの７２時間値。 ・Ｔｒｐはの２４，４８，７２時間値の平均値。

【０１１９】

【表２】

【０１２０】２） Ｎ末端アミノ酸分析 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィ−装置
（ベックマン・インストルメンツ社製）およびＵｌｔｒ
ａｓｐｈｅｒｅ−ＯＤＳカラム（ベックマン・インスト
ルメンツ社製）を用いて常法により分析した。カラム
（５μｍ，直径４．６mm，長さ２５０mm）を開始緩衝液
（１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ４．５，４０％
アセトニトリルを含む水溶液）にて平衡化したのち、検
体（２０μｌの開始緩衝液にて溶解）を注入して開始緩
衝液によるイソクラティック溶出により分離を行った。
流速は１．４ml／分、カラム温度は４０℃に保持した。
ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍと３２０ｎｍの紫外
部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ酸（シ
グマ社製）各２ｎ ｍｏｌを同一の系で分離して保持時
間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行った。そ
の結果、ＰＴＨ−メチオニンおよびＰＴＨ−スレオニン
が検出された。

【０１２１】＜実験例＞ヒトＧ−ＣＳＦの感染防御効果 １．シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染に対する防御効
果 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）の ＩＣＲ系
マウス（雄）にエンドキサン（シオノギ社製、商品名）
２００mg／kgを腹腔内投与した後３群に分け、その２
群にヒトＧ−ＣＳＦ（２５０００ｕ／マウス又は５００
００ｕ／マウス）を含む溶媒（１％プロパノール、５％
（Ｗ／Ｖ）マウス血清アルブミン）を、そして別の１群
には溶媒のみを、それぞれ２４時間毎に０．１mlずつ４
回皮下投与した。４回目の投与後３時間して各々の群に
シュードモナス アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＧＮＢ−１３９（３．９
×１０⁴ ＣＦＵ／マウス）を皮下投与して感染させた。
感染後２１時間してさらにもう一度ヒトＧ−ＣＳＦ（２
５０００ｕ／マウス又は５００００ｕ／マウス）を含む
溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に皮下投与し
た。感染後１０日目までの生存マウス数により感染防御
効果を調べた。（表３）

【０１２２】（菌液の調製）ハートインフュージョン寒
天平板（Ｄｉｆｃｏ社製、商品名）を用いて３７℃で一
夜シュードモナス アエルギノーザＧＮＢ−１３９を振
とう培養する。培養液を生理食塩水に懸濁させて調製し
た。

【０１２３】

【表３】 表３に示される如く本発明のヒトＧ−ＣＳＦは顕著な感
染防御効果を有することが認められた。

【０１２４】

【発明の効果】以上、本発明によれば、従前入手が極め
て困難であったヒトＧ−ＣＳＦを組換えベクター技術を
用いて大量に、しかも高品質で提供することが可能とな
り、これまでＣＳＦにかけられていた数々の期待、例え
ば造血機構や種々の血液学的疾患の病態の解析に多大の
貢献をする他、骨髄性白血病細胞の分化誘導と成熟顆粒
球の機能亢進というＧ−ＣＳＦ本来の生化学的作用を利
用する治療、及び予防に使用しうるのである。したがっ
て放射線照射や抗癌剤投与により骨髄組織の機能が低下
したり白血球が減少して、抵抗力を失った悪性腫瘍患者
や、抗生物質で治療できない重症感染症患者等に対して
もこれを投与することが大いに期待されているのであ
る。

【０１２５】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATNTGGCARC ARATGGARGA RYTNGGNATG 30

【０１２６】配列番号：２ 配列の長さ：１４ 配列の形：核酸 鎖の数：１本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCRAANGCNG GCAT 14

【０１２７】配列番号：３ 配列の長さ：３０８ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG 47 CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA 95 GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG 143 GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC 191 TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC 239 CTT GCC CAG CCC TGA GCC AAG CCC TCC CCA TCC CAT GTA TTT ATC TCT 287 ATT TAA TAT TTA TGT CTA TTT 308

【０１２８】配列番号：４ 配列の長さ：１５３１ 配列の形：核酸 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGGAGCCTGC AGCCCAGCCC CACCCAGACC C ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG 52 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln -30 -25 AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA 100 Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln Leu Leu Leu Trp His Ser Ala -20 -15 -10 CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG 148 Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu -5 -1 1 5 CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG 196 Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln 10 15 20 25 GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG GTG AGT GAG TGT GCC ACC 244 Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr 30 35 40 TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG 292 Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu 45 50 55 GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG 340 Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln 60 65 70 CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG 388 Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln 75 80 85 GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC 436 Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr 90 95 100 105 TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG 484 Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 110 115 120 CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG 532 Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln 125 130 135 GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG 580 Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly 140 145 150 GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC 628 Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg 155 160 165 GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TGA GCCAAGCCCT CCCCATCCCA 675 Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro End 170 175 TGTATTTATC TCTATTTAAT ATTTATGTCT ATTTAAGCCT CATATTTAAA GACAGGGAAG 735 AGCAGAACGG AGCCCCAGGC CTCTGTGTCC TTCCCTGCAT TTCTGAGTTT CATTCTCCTG 795 CCTGTAGCAG TGAGAAAAAG CTCCTGTCCT CCCATCCCCT GGACTGGGAG GTAGATAGGT 855 AAATACCAAG TATTTATTAC TATGACTGCT CCCCAGCCCT GGCTCTGCAA TGGGCACTGG 915 GATGAGCCGC TGTGAGCCCC TGGTCCTGAG GGTCCCCACC TGGGACCCTT GAGAGTATCA 975 GGTCTCCCAC GTGGGAGACA AGAAATCCCT GTTTAATATT TAAACAGCAG TGTTCCCCAT 1035 CTGGGTCCTT GCACCCCTCA CTCTGGCCTC AGCCGACTGC ACAGCGGCCC CTGCATCCCC 1095 TTGGCTGTGA GGCCCCTGGA CAAGCAGAGG TGGCCAGAGC TGGGAGGCAT GGCCCTGGGG 1155 TCCCACGAAT TTGCTGGGGA ATCTCGTTTT TCTTCTTAAG ACTTTTGGGA CATGGTTTGA 1215 CTCCCGAACA TCACCGACGC GTCTCCTGTT TTTCTGGGTG GCCTCGGGAC ACCTGCCCTG 1275 CCCCCACGAG GGTCAGGACT GTGACTCTTT TTAGGGCCAG GCAGGTGCCT GGACATTTGC 1335 CTTGCTGGAC GGGGACTGGG GATGTGGGAG GGAGCAGACA GGAGGAATCA TGTCAGGCCT 1395 GTGTGTGAAA GGAAGCTCCA CTGTCACCCT CCACCTCTTC ACCCCCCACT CACCAGTGTC 1455 CCCTCCACTG TCACATTGTA ACTGAACTTC AGGATAATAA AGTGTTTGCC TCCAAAAAAA 1515 AAAAAAAAAA AAAAAA 1531

【０１２９】配列番号：５ 配列の長さ：２０７ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln 16 Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro 32 Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu 48 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 64 Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu 80 Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 96 Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His 112 Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile 128 Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala 144 Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 160 Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala 176 Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser 192 Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 207

【０１３０】配列番号：６ 配列の長さ：１７７ 配列の形：アミノ酸 鎖の数： トロポジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 16 Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 32 Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu 48 Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu 64 Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln 80 Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu 96 Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp 112 Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly 128 Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala 144 Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu 160 Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln 176 Pro 177

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＢＲＧ４由来ヒトＧ−ＣＳＦｃＤＮＡの制限
酵素切断部位を示す。

【図２】ｔａｃプロモーター含有ベクターの調製プロセ
スの一部を示す。

【図３】合成Ｐ_L プロモーター含有ベクターの調製プロ
セスを示す。

【図４】ｔｒｐプロモーター含有ベクターの調製プロセ
スを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 関森 泰男 東京都豊島区高田３丁目41番８号 中外製 薬株式会社内 (72)発明者 長田 重一 東京都大田区多摩川２丁目24番62号 ３号 棟305号室

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有す
   るポリペプチドであって、そのアミノ酸配列中に下記の
   アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列
   からなるＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換さ
   れた細菌を培養し、次いで産生されたヒト顆粒球コロニ
   ー刺激因子活性を有するポリペプチドを分離することを
   特徴とするヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポ
   リペプチドの製造法。 (Met)n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro （但しｎは０又は１を示す）
2. 【請求項２】 塩基配列が下記の塩基配列である請求項
   １記載のポリペプチドの製造法。 (ATG)n ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG GTG AGT GAG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC （但しｎは０又は１を示す）