JPH08193098A

JPH08193098A - インターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド

Info

Publication number: JPH08193098A
Application number: JP7262062A
Authority: JP
Inventors: Shinpei Ushio; 真平牛尾; Kakuji Torigoe; 角二鳥越; Tadao Tanimoto; 忠雄谷本; Haruki Okamura; 春樹岡村; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-11-15
Filing date: 1995-09-18
Publication date: 1996-07-30
Anticipated expiration: 2015-09-18
Also published as: JP3629264B2; JPH107699A; JP2003327542A; US6214584B1; JP3897316B2; JP2724987B2

Abstract

(57)【要約】【課題】免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘
導するポリペプチド、そのポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ、そのＤＮＡを含む組換えＤＮＡ及び形質転換体並
びにその形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法を
提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドと、そのポリペプチドをコードするＤＮＡと、そのＤ
ＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な
組換えＤＮＡと、その組換えＤＮＡを適宜宿主に導入し
てなる形質転換体と、その形質転換体を培養培地で培養
し、産生したポリペプチドを培養物から採取してなるポ
リペプチドの製造方法により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、免疫担当細胞に
おいてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と
略記する。）の産生を誘導する新規なポリペプチドに関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍
作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原
やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生
すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−
γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首さ
れ、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤
として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し
得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ
−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコード
するＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生す
る組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験におい
ては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」と
して投与されている。

【０００３】このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培
養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養
培地で培養し、その培養物を精製することにより製造さ
れる。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ
−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性
等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカ
ナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレ
クチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェン
が頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも
分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変
動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量
入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多
くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に
依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与して
ＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の目的は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産
生を誘導する新規なポリペプチドを提供することにあ
る。

【０００５】この発明の別の目的は、斯かるポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを提供することにある。

【０００６】この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮ
Ａと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組
換えＤＮＡを提供することにある。

【０００７】この発明のさらに別の目的は、斯かる組換
えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供す
ることにある。

【０００８】この発明のさらに別の目的は、斯かる形質
転換体を用いる上記ポリペプチドの製造方法を提供する
ことにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記第一の
課題を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列
又はそれに相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチド
により解決するものである。

【００１０】この発明は、上記第二の課題を、斯かるポ
リペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものであ
る。

【００１１】この発明は、上記第三の課題を、上記ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクター
を含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するも
のである。

【００１２】この発明は、上記第四の課題を、上記ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクター
を含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入
してなる形質転換体により解決するものである。

【００１３】この発明は、上記第五の課題を、上記ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクター
を含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入
してなる形質転換体を栄養培地で培養し、産生したポリ
ペプチドを培養物から採取してなるポリペプチドの製造
方法により解決するものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】この発明のポリペプチドは、前述
のごとく、従来公知のポリペプチドとは明らかに相違す
るアミノ酸配列を有しており、免疫担当細胞に単独又は
適宜補因子とともに作用させると、ＩＦＮ−γの産生を
誘導する。

【００１５】この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜
ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮ
Ａを、通常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、
容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質
転換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発
現する。

【００１６】この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、通
常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増
殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体と
することにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。

【００１７】この発明の形質転換体は、培養すると、当
該ポリペプチドを産生する。

【００１８】斯かる形質転換体をこの発明の製造方法に
したがって培養すれば、所望量のポリペプチドが容易に
得られる。

【００１９】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ
−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくもの
である。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサイ
トカイン類につき研究していたところ、マウスの肝臓中
に、ＩＦＮ−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な
蛋白質が存在することを見出した。カラムクロマトグラ
フィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの蛋白
質を単離し、その部分アミノ酸配列を決定するととも
に、マウス肝細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型に上記部
分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在
下でＲＴ−ＰＣＲ反応させて蛋白質を部分コードするＤ
ＮＡ断片を採取し、これをプローブにして上記ｍＲＮＡ
から別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索した
ところ、４７１塩基対からなる、配列表における配列番
号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片が得られた。この塩基
配列を解読したところ、マウス肝臓から単離した蛋白質
は１５７個のアミノ酸からなり、配列番号３に併記した
アミノ酸配列を有することが判明した。なお、その配列
番号３において、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ
酸はメチオニン又はトレオニンを表わすものとする。

【００２０】これらの知見に基づき、本発明者がヒト肝
細胞由来のｍＲＮＡを引続き検索したところ、免疫担当
細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する、さらに別の
ポリペプチドをコードする遺伝子が存在することを見出
した。この遺伝子は配列表における配列番号２に示す塩
基配列を含んでなり、解読したところ、１５７個のアミ
ノ酸からなる、配列表における配列番号１に示すアミノ
酸配列のポリペプチドをコードしていることが判明し
た。なお、その配列番号１において、符号「Ｘａａ」を
付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニン
を表わすものとする。

【００２１】配列表における配列番号１及び２に示すア
ミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作
を要約すると、次のようになる。（１）クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方
法を組合せてマウス肝細胞から免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を単離し、高度に精製
した。（２）精製蛋白質をトリプシン消化し、消化物から２
種類のペプチド断片を単離し、アミノ酸配列を決定し
た。（３）マウス肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳
型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライ
マーとしてのオリゴヌクレオチドの存在下でＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応させてＤＮＡ断片を調製する一方、それら部分ア
ミノ酸配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチ
ドをプローブにしてそれらＤＮＡ断片を検索し、蛋白質
を部分コードするＤＮＡ断片を得た。（４）このＤＮＡ断片を同位体標識した後、前記ｍＲ
ＮＡを鋳型に調製したｃＤＮＡライブラリーにハイブリ
ダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取し
た。（５）形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を
決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列と前
記部分アミノ酸配列を比較することにより、蛋白質が配
列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、マ
ウスにおいて、このアミノ酸配列が配列番号３に併記し
た塩基配列によりコードされていることを確認した。（６）さらに、ヒト肝細胞由来のｍＲＮＡを鋳型にｃ
ＤＮＡライブラリーを作製する一方、配列表における配
列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片を調製し、同位体
標識した後、上記ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイ
ズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取した。（７）形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を
決定し、解読したところ、この発明のポリペプチドは配
列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するこ
とがあり、ヒトにおいて、このアミノ酸配列は配列表に
おける配列番号２に示す塩基配列によりコードされてい
ることを確認した。

【００２２】免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導するこの発明のポリペプチドは、本発明者の長年に
亙る研究の一成果として見出されたものであり、配列表
における配列番号１に見られるごとく、従来公知のポリ
ペプチドとは明らかに相違するアミノ酸配列を有してい
る。天然由来のポリペプチドであろうと、組換えＤＮＡ
技術により創製されたポリペプチドであろうと、それが
配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミ
ノ酸配列を有するかぎり、すべてこの発明に包含される
ものとする。配列番号１のアミノ酸配列に相同的なアミ
ノ酸配列を有する変異体は、所期の生物作用を実質的に
変えることなく、配列番号１のアミノ酸配列におけるア
ミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換するこ
とにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであって
も、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換
体の培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・
ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の
修飾などにより、所期の生物作用は保持しているもの
の、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又
はＣ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失した
り、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加
した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、そ
れが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
かぎり、当然、この発明のポリペプチドに包含される。

【００２３】この発明のポリペプチドは、それをコード
するＤＮＡを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生
したポリペプチドを培養物から採取することにより製造
することができる。この発明で使用する形質転換体は、
例えば、配列表における配列番号２に示す塩基配列若し
くはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基
配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ること
ができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重
を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることな
く、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えても
よい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該ポリペプチド
の産生を発現するために、当該ポリペプチド又はその相
同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は
２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは云うまでも
ない。

【００２４】この発明で使用するＤＮＡは、それが前述
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、ヒトの肝臓が挙げられ、その
細胞からは、例えば、配列表における配列番号６に示す
塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、
例えば、市販のポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ｍＲＮＡを蔗糖
濃度勾配などにより分画してｍＲＮＡを単離する。この
ｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させ
て二重鎖ｃＤＮＡとし、これを自律複製可能な適宜ベク
ターに挿入し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌などの適
宜宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を
栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼー
ション法を適用してこの発明のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られ
た形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、この
発明のＤＮＡが得られる。一方、この発明のＤＮＡを人
為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号
２に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表に
おける配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮ
Ａとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体
を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該
ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。

【００２５】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡ
と自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手
できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、例えば、ｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲ
Ｌ−λ、ｐＢＴｒｐ２ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ
１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１
などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この
発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で
発現させるにはｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐ
ＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥ
ｐ１３が、また、動植物由来の細胞で発現させるにはＴ
ｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１が好適で
ある。

【００２６】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において通常一般の方法が採用される。
具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自
律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波に
より切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片
とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチ
ドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制
限酵素、詳細には、Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩなどを使用すれば、ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両
者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリ
ガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えＤ
ＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培
養することにより無限に複製可能である。

【００２７】この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、
枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入す
ることができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換
えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよ
く、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル
法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体を
クローニングするには、コロニーハイブリダイゼーショ
ン法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞に
おいてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを産生
するものを選択すればよい。

【００２８】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体又は細胞内外に当該ポリペプチドを
産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネ
ラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンな
どの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用さ
れ、個々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グ
ルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源とし
ては、例えば、アンモニア乃至アンモニウム塩、尿素、
硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンステ
ィープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が
挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄
養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ５乃至８に保ちつ
つ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日
間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られ
る。この培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま使用
可能なこともあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じ
て、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、
濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体又は
菌体破砕物から分離し、精製する。精製には菌体又は菌
体破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾
過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理
活性物質を精製するための斯界における通常一般の方法
が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せれ
ばよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリ
ペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよ
い。

【００２９】前述のとおり、この発明のポリペプチド
は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
性質を有する。この性質により、この発明のポリペプチ
ドは、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造の際の誘導剤
として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例え
ば、エイズや尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎
臓癌、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関
節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療
剤・予防剤として有用である。

【００３０】この発明のポリペプチドは、通常、免疫担
当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地
に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防の
ために哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者
の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血
球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞、Ｊｕｒｋ
ａｔ細胞、ＨｕＴ７８細胞、ＥＬ４細胞、Ｌ１２−Ｒ４
細胞などの培養株化された免疫担当細胞をこの発明のポ
リペプチドを１ｍｌ当たり約０．１ｎｇ乃至１μｇ、望
ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む適宜の培養培地に浮
遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやイ
ンターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質
を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃
至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えな
がら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養す
る。斯くして得られる培養物を生理活性物質を精製する
ための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃
縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種
以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを
採取することができる。

【００３１】一方、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防
のためには、哺乳類の体内にこの発明によるポリペプチ
ドを直接投与すればよい。具体的には、この発明のポリ
ペプチドを投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経
口又は経粘皮投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉
内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明のポリ
ペプチドを投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例え
ば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネ
コ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳
動物であってもよい。この発明のポリペプチドは強力な
ＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期
のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低い
ことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起すること
がない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用
に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−
γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、念のため
に申し述べると、この発明のポリペプチドは医薬品とし
ての安全性の要件を充たしている。

【００３２】以下、実施例に基づきこの発明を説明する
が、そこで用いられる手法は斯界において慣用のもので
あり、例えば、ティー・マニャティス等『モレキュラー
・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１
９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、村
松正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸
善出版発行などにも詳述されている。

【００３３】

【実施例１精製蛋白質の調製】８週齢の雌ＣＤ−１マ
ウス６００匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム
（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して調製
した死菌体を１ｍｇ／匹注射投与し、通常一般の方法で
７日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１
μｇ／匹注射投与した。１乃至２時間後、マウスを屠殺
し、採血後、肝臓を摘出し、８倍容の５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．３）中、ホモゲナイザーにより破砕して抽
出した。抽出物を約８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分
離し、得られた上清約９ｌに硫酸アンモニウムで飽和さ
せた５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）を硫酸アンモニ
ウムが４５％飽和になるように加え、４℃で１８時間静
置後、約８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清
約１９ｌを採取した。

【００３４】この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含
む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させてお
いたファルマシア製『フェニルセファロース』約４．６
ｌのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄
後、１Ｍから０．２Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃
度勾配下、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）をＳＶ
０．５７で通液した。硫酸アンモニウム濃度が０．８Ｍ
付近のときに溶出した画分約４．８ｌを採取し、膜濃縮
し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で
１８時間透析後、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．
５）で平衡化させておいたファルマシア製『ＤＥＡＥ−
セファロース』約２５０ｍｌのカラムに負荷した。カラ
ムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．２Ｍに上
昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに２０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）をＳＶ１．２で通液し、塩化
ナトリウム濃度０．１３Ｍ付近で溶出した画分約２６０
ｍｌを採取した。

【００３５】この画分を濃縮し、２５ｍＭビス−トリス
緩衝液（ｐＨ７．１）に対して４℃で１８時間透析後、
予め新鮮な同一緩衝液で平衡化させておいたファルマシ
ア製『Ｍｏｎｏ−Ｐ』約２４ｍｌのカラムに負荷し、ｐ
Ｈ７からｐＨ４に下降するｐＨ勾配下、カラムに１０％
（ｖ／ｖ）ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）を通液し
た。ｐＨが約４．８のときに溶出した画分約２３ｍｌを
採取し、濃縮し、予め７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、３
ｍＭ燐酸二水素ナトリウム及び１３９ｍＭ塩化ナトリウ
ムからなる混液（ｐＨ７．２）で平衡化させておいたフ
ァルマシア製『スーパーデックス７５』のカラムに負荷
し、新鮮な同一混液を通液してゲル濾過クロマトグラフ
ィーしたところ、分子量１９，０００ダルトン付近に目
的とする蛋白質が溶出した。蛋白質を含む画分を採取
し、濃縮して下記の実施例２に供した。収量は、マウス
１匹当たり約０．６μｇであった。

【００３６】

【実施例２部分アミノ酸配列】実施例１で調製した精
製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃
縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｖ／
ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍ
ｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間イン
キュベート後、１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲ
ル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。その後、
ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブル
ーＲ２５０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１
０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に浸漬して染色し、１
２％（ｖ／ｖ）水性メタノールと７％（ｖ／ｖ）酢酸水
溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に１８時間
浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアントブル
ー染色されたＩＦＮ−γ誘導活性ある部分を切出し、凍
結乾燥した。

【００３７】次に、乾燥ゲルをシグマ製『ＴＰＣＫトリ
プシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリ
ウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／
ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに
浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質を
トリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上
清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含む１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ
酢酸１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪後、遠心分離
して上清を採取した。新たに生じた沈澱を０．００１％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む７０％（ｖ／ｖ）水
性トリフルオロ酢酸、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅ
ｎ２０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸
及び５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの順序で上記
と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清を
プールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心濾過した。

【００３８】斯くして得られたペプチド断片を含む水溶
液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で
平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィ
ー用カラム『ＨＰＬＣＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、
カラムを０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で洗
浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により２１
４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしながら、０％
（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセト
ニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）ト
リフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そ
して、通液開始から約７５分後又は約５５分後に溶出し
た画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』又は『ペプ
チド断片Ｂ』と云う。）を別々に採取した。このときの
溶出パターンを図１に示す。

【００３９】その後、パーキン・エルマー製プロテイン
・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがっ
てこれらペプチド断片Ａ及びＢのアミノ酸配列を調べた
ところ、それぞれ、配列表における配列番号４及び５に
示すアミノ酸配列を有していた。

【００４０】

【実施例３蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と蛋
白質のアミノ酸配列】

【００４１】

【実施例３−１全ＲＮＡの調製】実施例１と同様にし
て調製したマウス肝細胞を湿重で３ｇとり、これを６Ｍ
グアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナト
リウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐ
Ｈ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕し
た。常法にしたがって、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩
化セシウムを含む０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を
２５ｍｌ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍｌ重層
し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間
超遠心分離後、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分
を１５ｍｌ容遠心管にとり、等容量のクロロホルム／ブ
タノール混液（４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、
１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部
を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で
２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取
し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄後、滅菌蒸
留水０．５ｍｌに溶解して下記の実施例３−２に供し
た。なお、全ＲＮＡの収量は約４ｍｇであった。

【００４２】

【実施例３−２蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片の
調製】実施例３−１で調製した全ＲＮＡ１μｇに２５
ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液
（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０
０ｍＭ塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭｄＮＴＰミッ
クスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビター
を１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ及び
２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留
水で２０μｌとした。混合物を０．５ｍｌ容反応管にと
り、常法にしたがって２５℃で１０分間、４２℃で３０
分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートし
て逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む
水溶液を得た。

【００４３】この第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μ
ｌに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ
緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮ
Ａポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマ
ー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及び
プライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留
水で１００μｌとした。そして、常法により、混合物を
９４℃で１分間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の順
序でインキュベートするサイクルを４０回繰返して反応
させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型に当該蛋白質を部
分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー
１及びプライマー２は、配列表の配列番号４及び５にお
けるＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
−Ｉｌｅ又はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ
−Ａｓｐ−Ｉｌｅで表わされるアミノ酸配列に基づき化
学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ５´−
ＡＴＲＴＣＲＴＣＤＡＴＲＴＴＹＴＣＮＧＧ−３´又は
５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＴＧＡＣＮＧＡＹＡＴ−３
´で表わされる塩基配列を有していた。

【００４４】このようにして得たＰＣＲ産物の一部をと
り、常法により２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気
泳動して分画し、ナイロン膜上に移取り、０．４Ｎ水酸
化ナトリウムで固定し、２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、
５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む
プレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３
時間インキュベートした。別途、プローブ１として、配
列表の配列番号４におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏで表わされるアミノ酸配列に基づ
き５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＲＡＴＧＧＡＹＣＣ−３´で
表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成
し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼにより同位体標識した。このプローブ１を１ｐｍｏ
ｌとり、これと５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．
５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４５℃で２
４時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。ナイ
ロン膜を６×ＳＳＣで洗浄後、常法によりオートラジオ
グラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣＲ
産物に含まれていた。

【００４５】次に、残りのＰＣＲ産物に宝酒造製プラス
ミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』を５０ｎｇと適量のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭＡＴ
Ｐを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間イ
ンキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿
入し、得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によ
りファルマシア製大腸菌『ＮｏＶａＢｌｕｅ』株に導
入して形質転換体とした。得られた形質転換体を１０ｇ
／ｌバクトトリプトン、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、
１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリ
ン、４０ｍｇ／ｌＸ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、
「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に接種
し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。
常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置
し、約３０秒間静置してコロニーを移取った後、ナイロ
ン膜を剥離し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。
その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸
漬し、２×ＳＳＣで洗浄し、０．４Ｎ水酸化ナトリウム
に２０分間浸漬して固定し、５×ＳＳＣでさらに洗浄
し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５
％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬
し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、常法
にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズ
させ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオ
グラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転
換体をプレート培地から採取した。

【００４６】この形質転換体をアンピシリン１００μｇ
／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、
３７℃で１８時間培養後、培養物から菌体を採取し、通
常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取し
た。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮ
Ａは配列表の配列番号３に示す塩基配列における第８５
乃至２８１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含ん
でいた。

【００４７】

【実施例３−３ｍＲＮＡの調製】実施例３−１で調製
した全ＲＮＡを含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに
１ｍＭＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ
加え、滅菌蒸留水で全量を１ｍｌとした。混合物に日本
ロシュ製オリゴｄ（Ｔ）₃₀ラテックス『オリゴテックス
−ｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加
熱して変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。
５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌを加え、３７℃で１０
分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状
の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６５
℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍＲ
ＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであっ
た。

【００４８】

【実施例３−４ｃＤＮＡライブラリーの作製】アマシ
ャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成シス
テム・プラス』を使用し、実施例３−３で調製したｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、
１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤
リボヌクレアーゼインヒビター溶液１μｌ、デオキシヌ
クレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄ（Ｔ）₁₆プ
ライマー溶液１μｌをこの順序で加え、さらに、実施例
３−３で調製したｍＲＮＡを２μｇ加えた後、滅菌蒸留
水で１９μｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含
む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分間インキュベート
して第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。

【００４９】反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液を３７．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを
０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序
で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６
０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを２単位加え、３７℃でさらに１０分
間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む反
応物を得た。反応物に０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してｃ
ＤＮＡを採取した。

【００５０】このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝
液を２μｌ、ＥｃｏＲＩアダプターを２５０ｐｍｏ
ｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加
え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間
インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏＲＩアダプ
ターを連結した。反応物に０．２５ＭＥＤＴＡを２μ
ｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグ
ラフィーにより未反応のＥｃｏＲＩアダプターを除去
し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で全量４００μｌと
し、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏＲＩ
切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱してＤＮＡを採取し
た。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝
液を１．５μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼを２．５単位加
え、滅菌蒸留水で全量１５μｌとし、１５℃で１６時間
インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パ
ッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージ
を得た。

【００５１】

【実施例３−５組換えＤＮＡのクローニング】アマシ
ャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実施例３−４で調製したフ
ァージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトト
リプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１
０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを
含む寒天培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時
間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン
膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥
離した後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン
膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリ
ウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾
後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍ
ｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートし
た。別途、実施例３−２で調製したＤＮＡ断片をアマシ
ャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識
システム』により³²Ｐ標識してプローブ２とし、その適
量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ
／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍ
ｌ含む混液にナイロン膜を浸漬し、６５℃で２０時間イ
ンキュベートしてハイブリダイズさせた後、室温下、６
×ＳＳＣ中で２０分間、２×ＳＳＣ中でさらに２０分間
インキュベートし、洗浄し、オートラジオグラフィー
し、プローブ２に顕著な会合を示したファージＤＮＡク
ローンを採取した。

【００５２】常法にしたがってこのクローンを大腸菌中
で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断する一方、プラスミ
ドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制
限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片
を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡと
した。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテント
セル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２
３）に導入し、形質転換体を得た。

【００５３】

【実施例３−６ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸
配列の決定】実施例３−５で調製した形質転換体をＬ−
ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間
振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常の
アルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを
含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シ
ーケンサにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配
列表における配列番号３に示す塩基配列を含んでなり、
解読したところ、同じく配列番号３に示すアミノ酸配列
をコードしていることが示唆された。このアミノ酸配列
においては、その第７９乃至１０３番目又は第２６乃至
４３番目に配列表における配列番号４及び５に示す部分
アミノ酸配列が含まれており、このことは、マウスにお
いて、配列番号３に示すアミノ酸配列のポリペプチド
が、同じく配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコ
ードされていることを示している。なお、その配列番号
３において、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は
メチオニン又はトレオニンを表わすものとする。

【００５４】次の実施例４乃至７では、配列表における
配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片をプローブに使
用し、ヒト肝臓ｍＲＮＡから免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導するさらに別のポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡを採取する。そして、そのｃＤＮＡの塩
基配列を決定し、解読して、この発明によるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を決定するとともに、ｃＤＮＡを大腸
菌で発現させ、産生したポリペプチドの性質・性状を調
べる。

【００５５】

【実施例４ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配
列とポリペプチドのアミノ酸配列】

【００５６】

【実施例４−１ｃＤＮＡライブラリーの作製】アマシ
ャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成シス
テム・プラス』を使用し、クローンテック製ポリ（Ａ）
付加ヒト肝臓ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃ
ＤＮＡ合成用溶液を１０μｌ、１ｍＭピロリン酸ナトリ
ウム溶液を２．５μｌ、１μｇ／μｌヒト胎盤リボヌク
レアーゼインヒビター溶液を２．５μｌ、１μｇ／μｌ
デオキシヌクレオチド三燐酸溶液を５μｌ及び１μｇ／
μｌオリゴｄＴプライマー溶液を２．５μｌとり、ポリ
（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡを５μｇ加え、滅菌蒸留水で
４５μｌとした後、逆転写酵素を１００単位含む溶液を
５μｌ加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一
ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。

【００５７】反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶
液を９３．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを
４単位、ＤＮＡポリメラーゼを１１５単位加え、滅菌蒸
留水で２５０μｌとし、１２℃で６０分間、２２℃で６
０分間、７０℃で１０分間この順序でインキュベートし
た後、Ｔ４ポリメラーゼを１０単位加え、３７℃でさら
に１０分間インキュベートした。０．２５ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）を１０μｌ加えて反応を停止させた後、
反応物を常法にしたがってフェノール／クロロホルム抽
出し、抽出物をエタノール沈澱して第二ストランドｃＤ
ＮＡを得た。

【００５８】このようにして得た第二ストランドｃＤＮ
ＡにＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を２μｌ、ＥｃｏＲ
Ｉアダプタを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
２．５単位加え、滅菌蒸留水で２０μｌとし、１５℃で
１６時間インキュベートしてｃＤＮＡの両端にＥｃｏ
ＲＩアダプタを連結した後、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）を２μｌ加えて反応を停止させた。分子篩ク
ロマトグラフィーにより反応物から未反応のＥｃｏＲ
Ｉアダプタを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を４
０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを８０単位加
え、滅菌蒸留水で４００μｌとし、３７℃で３０分間イ
ンキュベートしてＥｃｏＲＩ切断部位をメチル化した
後、フェノール／クロロホルム抽出し、抽出物をエタノ
ール沈澱してｃＤＮＡを採取した。その後、ｃＤＮＡに
適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．
０）を１．５μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼを２．５単位
加え、滅菌蒸留水で１５μｌとし、１５℃で１６時間イ
ンキュベートした後、通常の生体外パッケージングを適
用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。

【００５９】

【実施例４−２組換えＤＮＡのクローニング】常法に
より、大腸菌ＮＭ５１４株に実施例４−１で調製したフ
ァージを感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、
５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩
化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天培
地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間培養して
プラークを形成させた。常法にしたがって、寒天培地に
ナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移
取った後、ナイロン膜を剥離し、まず、０．５Ｎ水酸化
ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に７
分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３分間浸漬した。そ
の後、ナイロン膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４
Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣで濯
ぎ、再度風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、
０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを含
む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。

【００６０】組換えＤＮＡをクローニングすべく、別
途、アマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライム
ＤＮＡ標識システム』を使用し、配列表における配列番
号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片を同位体標識してプロ
ーブ３を調製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に実
施例３−５の方法により調製したＤＮＡ断片を２５ｎｇ
とり、滅菌蒸留水で４５μｌとし、９５℃で３分間加熱
した後、反応管にとり、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ溶液を５
μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートして同位体
標識した。その後、同位体標識したＤＮＡ断片を含む反
応物に通常の分子篩クロマトグラフィーを適用し、未反
応の［α−³²Ｐ］を除去した。

【００６１】次に、前記ナイロン膜をプローブ３の適量
と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ
含む混液に浸漬し、６０℃で２０時間インキュベートし
てハイブリダイズさせた後、室温下、６×ＳＳＣ中で２
０分間、２×ＳＳＣ中でさらに２０分間インキュベート
し、洗浄し、オートラジオグラフィーして、プローブ３
に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取し
た。常法によりこのＤＮＡクローンを大腸菌で増幅後、
菌体からＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３
７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断
片とベクター断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結し
て組換えＤＮＡとした。コンピテントセル法により、こ
の組換えＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３
２３）に導入してこの発明のＤＮＡを含む形質転換体を
得た。

【００６２】

【実施例４−３塩基配列とアミノ酸配列の決定】実施
例４−２で調製した形質転換体をアンピシリン５０μｇ
／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、
常法により３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠
心分離して菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を
適用して組換えＤＮＡを抽出し、その塩基配列を蛍光光
度計を使用する自動シーケンサにより調べたところ、配
列表における配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡを含ん
でいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はそ
の配列番号６に併記したとおりであり、このことは、こ
の発明のポリペプチドが配列表における配列番号１に示
すアミノ酸配列を有することがあり、ヒトにおいて、こ
のアミノ酸配列が配列表における配列番号２に示す塩基
配列のＤＮＡによりコードされていることを示唆してい
る。なお、その配列番号６においても、符号「Ｘａａ」
を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニ
ンを表わすものとする。

【００６３】

【実施例５複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体の調
製】０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを
８μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、１ｍＭｄＮ
ＴＰミックスを８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタッ
クＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、実施例４−２で調
製した組換えＤＮＡを１ｎｇとり、配列表の配列番号１
に示すアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端付近の配
列に基づき化学合成した５´−ＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴ
ＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧ−３´及び５´−ＣＡ
ＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧ−３
´で表わされる塩基配列の２種類のオリゴヌクレオチド
を、それぞれ、センスプライマー又はアンチセンスプラ
イマーとして適量加え、滅菌蒸留水で１００μｌとし
た。常法により、混合物を９４℃で１分間、６０℃とし
てで２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベート
するサイクルを４０回繰返し、得られたＰＣＲ産物を制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断してＢａｍ
ＨＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ
断片を適量の滅菌蒸留水に０．１μｇとり、これに、予
め制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断してお
いたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＧＥＸ−２
Ｔ』を１０ｎｇ、１０×ライゲーション緩衝液を１０μ
ｌ及び適量のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、さらに１０
ｍＭＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で
１８時間インキュベートして、この発明による複製可能
な組換えＤＮＡｐＨＩＧＩＦを得た。

【００６４】組換えＤＮＡｐＨＩＧＩＦをコンピテン
トセル法により東洋紡績製大腸菌ＤＨ５α株に導入し、
得られた形質転換体『ＨＩＧＩＦ』をアンピシリン５０
μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種
し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離
して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を
適用して組換えＤＮＡｐＨＩＧＩＦを抽出した。ジデ
オキシ法により調べたところ、図２に見られるとおり、
このｐＨＩＧＩＦにおいては、配列表における配列番号
２に示す塩基配列のｃＤＮＡ『ＨＩＧＩＦｃＤＮＡ』
がＴａｃプロモータ及びグルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ遺伝子の下流に連結されていた。

【００６５】

【実施例６形質転換体によるポリペプチドの産生】実
施例５で調製した形質転換体ＨＩＧＩＦをアンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に
接種し、振盪しながら３７℃で１８時間種培養した。次
に、３０ｌ容ジャーファーメンタに新鮮なＴ−ブロス培
地（ｐＨ７．２）を１８ｌずつとり、上記で得た種培養
物を１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、３７℃で通気撹拌
培養した。培養中、培養物の一部を光路長１ｃｍのキュ
ベットにとり、波長６５０ｎｍにおける吸光度が約１．
５に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭまで加
え、さらに５時間培養した。その後、遠心分離により培
養物から菌体を採取し、１３９ｍＭ塩化ナトリウム、７
ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び３ｍＭ燐酸二水素ナトリ
ウムを含む混液（ｐＨ７．２）に浮遊させ、常法により
超音波処理後、菌体破砕物を遠心分離し、上清を採取し
た。

【００６６】この上清を予め１３９ｍＭ塩化ナトリウ
ム、７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び３ｍＭ燐酸二水素
ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．２）で平衡化させてお
いたファルマシア製『グルタチオン・セファロース４
Ｂ』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液で洗浄後、カラ
ム中のゲル１ｍｌに対してトロンビンを１００Ｕ加え、
室温下で１６時間静置して酵素開裂反応させた。カラム
に新鮮な同一混液を通液して反応物を溶出させた後、予
め新鮮な前記と同一混液で平衡化させておいたファルマ
シア製『スーパーデックス７５』のカラムに通液し、分
子量１８，５００ダルトン付近の画分を採取した。この
画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、この発明のポリペ
プチドを含む固状物が培養物１ｌ当たり約８０μｇの収
量で得られた。

【００６７】

【実施例７ポリペプチドの理化学的性質】

【００６８】

【実施例７−１分子量】実施例６で調製した精製ポリ
ペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２
２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告して
いる方法に準じ、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，５０
０±３，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘
導活性ある主たるバンドが観察された。なお、このとき
の分子量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００
ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルト
ン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダル
トン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルト
ン）であった。

【００６９】

【実施例７−２等電点】精製ポリペプチドを常法にし
たがってクロマトフォーカシングしたところ、４．９±
１．０に等電点を示した。

【００７０】

【実施例７−３Ｎ末端アミノ酸配列】常法にしたがっ
て、パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４
７３Ａ型』を使用して分析したところ、精製ポリペプチ
ドは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの付加及び
トロンビンによる開裂により、配列表における配列番号
７に示すＮ末端アミノ酸配列のチロシン残基にＧｌｙ−
Ｓｅｒ−で表わされるペプチドが付加した構造を有して
いた。

【００７１】

【実施例７−４生物作用】

【００７２】

【実施例７−４（ａ）マウス脾細胞におけるＩＦＮ−
γ産生の誘導】８週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスから脾
臓を摘出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ
７．４）中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩
衝液（ｐＨ８．０）中に浸漬して溶血させた。得られた
脾細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭ
Ｉ１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０⁷個
／ｍｌになるように浮遊させ、口径９ｃｍのプラスチッ
クシャーレに１０ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ₂インキュ
ベータ中、３７℃で１時間培養した。シャーレ中の培養
物から浮遊細胞のみ採取し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血
清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で洗
浄し、下記のＩＦＮ−γ誘導試験に供した。

【００７３】細胞密度１×１０⁷個／ｍｌになるように
１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４
０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させたマウス脾細胞を９６
ウェルマイクロプレート上に０．１５ｍｌずつとり、精
製ポリペプチドを新鮮な同一培地で適宜希釈して０．０
５ｍｌ加えた後、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又
は５０ｕ／ｍｌインターロイキン２を０．０５ｍｌ添加
するか添加することなく５％ＣＯ₂インキュベータ中、
３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養
上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩＦＮ−γを通
常の酵素免疫法により測定した。同時に、精製ポリペプ
チド、コンカナバリンＡ及びインターロイキン２のすべ
て省略した以外は同一の系を設け、これを上記と同様に
処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γの標準品には、
米国国立公衆衛生研究所から入手した標準マウスＩＦＮ
−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を使用し、国際単位
（ＩＵ）に換算して表示した。結果を表１に示す。

【００７４】

【表１】

【００７５】

【実施例７−４（ｂ）ヒトリンパ球におけるＩＦＮ−
γ産生の誘導】ヘパリン加注射器を使用して健常者から
血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐ
Ｈ７．４）で２倍希釈後、フィコール上に重層し、２，
０００ｒｐｍで２０分間遠心してリンパ球を採取した。
リンパ球を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で洗浄後、リンパ球を
細胞密度５×１０⁶個／ｍｌになるように浮遊させると
ともに、ＩＦＮ−γの標準品に、米国国立公衆衛生研究
所から入手した標準ヒトＩＦＮ−γ（Ｇｇ２３−９０１
−５３０）を使用した以外は、実施例７−４（ａ）と同
様に試験した。結果を表２に示す。

【００７６】

【表２】

【００７７】表１及び２の結果は、この発明のポリペプ
チドに、ヒト及びマウスを始めとする哺乳類の免疫担当
細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質のあるこ
とを裏付けている。すなわち、対照系において有意なＩ
ＦＮ−γ産生が認められなかったところ、この発明のポ
リペプチドを添加した系においては、ポリペプチド濃度
に依存する有意なＩＦＮ−γの産生が認められた。そし
て、この性質は、補因子としてコンカナバリンＡやイン
ターロイキン２を共存させることにより、顕著に増強さ
れることが判明した。

【００７８】

【発明の効果】この発明は、免疫担当細胞においてＩＦ
Ｎ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの発見に基
づくものである。この発明のポリペプチドはアミノ酸配
列まで解明された物質であり、免疫担当細胞において安
定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この
発明のポリペプチドは、細胞培養法によりＩＦＮ−γを
製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、Ｉ
ＦＮ−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、
免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の
用途を有することとなる。

【００７９】この発明のポリペプチドは強力なＩＦＮ−
γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ
−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことか
ら、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがな
い。したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際
して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産
生を迅速に誘導できる利点がある。

【００８０】斯くも有用なるこの発明のポリペプチド
は、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用すること
により、所望量を容易に製造することができる。

【００８１】この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮
するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義の
ある発明であると云える。

【００８２】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp Met Thr 20 25 30 Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met 35 40 45 50 Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys 55 60 65 Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu 70 75 80 85 Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe 90 95 100 Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser 105 110 115 Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu 120 125 130 135 Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val 140 145 150 Gln Asn Glu Asp 155

【００８３】配列番号：2 配列の長さ：471 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列 TACTTTGGCA AGCTTGAATC TAAATTATCA GTCATAAGAA ATTTGAATGA CCAAGTTCTC 60 TTCATTGACC AAGGAAATCG GCCTCTATTT GAAGATATGA CTGATTCTGA CTGTAGAGAT 120 AATGCACCCC GGACCATATT TATTATAAGT ATGTATAAAG ATAGCCAGCC TAGAGGTATG 180 GCTGTAACTA TCTCTGTGAA GTGTGAGAAA ATTTCAAYTC TCTCCTGTGA GAACAAAATT 240 ATTTCCTTTA AGGAAATGAA TCCTCCTGAT AACATCAAGG ATACAAAAAG TGACATCATA 300 TTCTTTCAGA GAAGTGTCCC AGGACATGAT AATAAGATGC AATTTGAATC TTCATCATAC 360 GAAGGATACT TTCTAGCTTG TGAAAAAGAG AGAGACCTTT TTAAACTCAT TTTGAAAAAA 420 GAGGATGAAT TGGGGGATAG ATCTATAATG TTCACTGTTC AAAACGAAGA C 471

【００８４】配列番号：3 配列の長さ：471 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 配列の特徴起源生物名：マウス組織の種類：肝臓配列の特徴配列を表わす記号：mat peptide 存在位置：1..471 特徴を決定した方法：S 配列 AAC TTT GGC CGA CTT CAC TGT ACA ACC GCA GTA ATA CGG AAT ATA AAT 48 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 GAC CAA GTT CTC TTC GTT GAC AAA AGA CAG CCT GTG TTC GAG GAT ATG 96 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 ACT GAT ATT GAT CAA AGT GCC AGT GAA CCC CAG ACC AGA CTG ATA ATA 144 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 TAC ATG TAC AAA GAC AGT GAA GTA AGA GGA CTG GCT GTG ACC CTC TCT 192 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 GTG AAG GAT AGT AAA AYG TCT ACC CTC TCC TGT AAG AAC AAG ATC ATT 240 Val Lys Asp Ser Lys Xaa Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 TCC TTT GAG GAA ATG GAT CCA CCT GAA AAT ATT GAT GAT ATA CAA AGT 288 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 GAT CTC ATA TTC TTT CAG AAA CGT GTT CCA GGA CAC AAC AAG ATG GAG 336 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 TTT GAA TCT TCA CTG TAT GAA GGA CAC TTT CTT GCT TGC CAA AAG GAA 384 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 GAT GAT GCT TTC AAA CTC ATT CTG AAA AAA AAG GAT GAA AAT GGG GAT 432 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 AAA TCT GTA ATG TTC ACT CTC ACT AAC TTA CAT CAA AGT 471 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155

【００８５】配列番号：4 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln 1 5 10 15 Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys 20 25

【００８６】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Gln Pro Val Phe Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro 1 5 10 15 Gln

【００８７】配列番号：6 配列の長さ：1120 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル配列：No アンチセンス：No 起源生物名：ヒト組織の種類：肝臓配列の特徴特徴を表わす記号：5´UTR 存在位置：1..177 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：leader peptide 存在位置：178..285 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：286..756 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：3´UTR 存在位置：757..1120 特徴を決定した方法：S 配列 GCCTGGACAG TCAGCAAGGA ATTGTCTCCC AGTGCATTTT GCCCTCCTGG CTGCCAACTC 60 TGGCTGCTAA AGCGGCTGCC ACCTGCTGCA GTCTACACAG CTTCGGGAAG AGGAAAGGAA 120 CCTCAGACCT TCCAGATCGC TTCCTCTCGC AACAAACTAT TTGTCGCAGG AATAAAG 177 ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG GCA ATG 225 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met 1 5 10 15 AAA TTT ATT GAC AAT ACG CTT TAC TTT ATA GCT GAA GAT GAT GAA AAC 273 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn 20 25 30 CTG GAA TCA GAT TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA 321 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 35 40 45 AGA AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT 369 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 50 55 60 CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG 417 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 65 70 75 80 ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG 465 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 85 90 95 GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT 513 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys 100 105 110 GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC 561 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 115 120 125 AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA 609 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 130 135 140 CAT GAT AAT AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT 657 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 145 150 155 160 CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA 705 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 165 170 175 GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA 753 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 180 185 190 GAC TAGCTA TTAAAATTTC ATGCCGGGCG CAGTGGCTCA CGCCTGTAAT CCCAGCCCTT 812 Asp TGGGAGGCTG AGGCGGGCAG ATCACCAGAG GTCAGGTGTT CAAGACCAGC CTGACCAACA 872 TGGTGAAACC TCATCTCTAC TAAAAATACT AAAAATTAGC TGAGTGTAGT GACGCATGCC 932 CTCAATCCCA GCTACTCAAG AGGCTGAGGC AGGAGAATCA CTTGCACTCC GGAGGTAGAG 992 GTTGTGGTGA GCCGAGATTG CACCATTGCG CTCTAGCCTG GGCAACAACA GCAAAACTCC 1052 ATCTCAAAAA ATAAAATAAA TAAATAAACA AATAAAAAAT TCATAATGTG AAAAAAAAAA 1112 AAAAAAAA 1120

【００８８】配列番号：7 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス肝細胞由来の蛋白質をトリプシン消化し
て得られるペプチド断片の高速液体クロマトグラフィー
における溶出パターンを示す図である。

【図２】この発明による組換えＤＮＡであるｐＨＩＧＩ
Ｆの構造を示す図である。

【符号の説明】

ＨＩＧＩＦｃＤＮＡこの発明のポリペプチド
をコードするｃＤＮＡＰｔａｃｔａｃプロモータＧＳＴグルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ遺伝子ＡｍｐＲアンピシリン耐性遺伝子ｏｒｉ大腸菌における複製開始
点

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤＣ０７Ｋ 7/06 7/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表における配列番号１に示すアミノ
酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列（ただし、符号
「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又
はトレオニンを表わすものとする。）を有し、免疫担当
細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するポ
リペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡ。
【請求項３】配列表における配列番号２に示す塩基配
列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的
な塩基配列を有する請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
おける配列番号１に示すアミノ酸配列を変えることな
く、配列表における配列番号２に示す塩基配列における
塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項２
又は３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】配列表における配列番号６に示す塩基配
列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸
は、イソロイシン又はトレオニンを表わすものとす
る。）を有する請求項２、３又は４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】ヒトに由来する請求項２、３、４又は５
に記載のＤＮＡ。
【請求項７】請求項１に記載のポリペプチドをコード
するＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製
可能な組換えＤＮＡ。
【請求項８】ＤＮＡが配列表における配列番号２に示
す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれら
に相補的な塩基配列を有する請求項７に記載の複製可能
な組換えＤＮＡ。
【請求項９】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
たものである請求項７又は８に記載の複製可能な組換え
ＤＮＡ。
【請求項１０】ＤＮＡが配列表における配列番号６に
示す塩基配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示した
アミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすもの
とする。）を有する請求項７、８又は９に記載の複製可
能な組換えＤＮＡ。
【請求項１１】ＤＮＡがヒトに由来する請求項７、
８、９又は１０に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１２】ベクターがプラスミドベクターである
請求項７、８、９、１０又は１１に記載の複製可能な組
換えＤＮＡ。
【請求項１３】請求項１に記載のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複
製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転
換体。
【請求項１４】ＤＮＡが配列表における配列番号２に
示す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれ
らに相補的な塩基配列を有する請求項１３に記載の形質
転換体。
【請求項１５】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
たものである請求項１３又は１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】ＤＮＡが配列表における配列番号６に
示す塩基配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示した
アミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすもの
とする。）を有する請求項１３、１４又は１５に記載の
形質転換体。
【請求項１７】ＤＮＡがヒトに由来する請求項１３、
１４、１５又は１６に記載の形質転換体。
【請求項１８】ベクターがプラスミドベクターである
請求項１３、１４、１５、１６又は１７に記載の形質転
換体。
【請求項１９】宿主が大腸菌である請求項１３、１
４、１５、１６、１７又は１８に記載の形質転換体。
【請求項２０】請求項１に記載のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複
製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転
換体を栄養培地で培養し、産生したポリペプチドを培養
物から採取してなるポリペプチドの製造方法。
【請求項２１】ＤＮＡが配列表における配列番号２に
示す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれ
らに相補的な塩基配列を有する請求項２０に記載のポリ
ペプチドの製造方法。
【請求項２２】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を変
えることなく、配列表における配列番号２に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
たものである請求項２０又は２１に記載のポリペプチド
の製造方法。
【請求項２３】ＤＮＡが配列表における配列番号６に
示す塩基配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示した
アミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表わすもの
とする。）を有する請求項２０、２１又は２２に記載の
ポリペプチドの製造方法。
【請求項２４】ＤＮＡがヒトに由来する請求項２０、
２１、２２又は２３に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２５】ベクターがプラスミドベクターである
請求項２０、２１、２２、２３又は２４に記載のポリペ
プチドの製造方法。
【請求項２６】宿主が大腸菌である請求項２０、２
１、２２、２３、２４又は２５に記載のポリペプチドの
製造方法。
【請求項２７】産生したポリペプチドを塩析、透析、
濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォ
ーカシング、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動に
より採取する請求項２０、２１、２２、２３、２４、２
５又は２６に記載のポリペプチドの製造方法。