KR100490447B1 - 인터페론-γ의생산을유도하는폴리펩피드,이폴리펩티드에특이적인모노클로날항체및감수성질환체 - Google Patents

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Abstract

SDS-DAGE 에 의한 분자량 18,500 ± 3,000 달톤이고, 크로마토포커싱에 의한 등전점 (pI) 이 4.9 ± 1.0 인 폴리펩티드.
이 폴리펩티드는 소량만이라도 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 강력히 유도하고 인간에게 비교적 많은 양을 투여하더라도 심각한 부작용을 일으키지 않는다. 이것은 하이브리도마에서 수득한 모노클로날 항체를 사용하여 용이하게 제조되며, 악성종양, 바이러스성 질환, 세균성 감염증 및 면역질환 등의 치료 및/또는 예방을 위한 의약에 첨가할 수 있다.

Description

인터페론-γ 의 생산을 유도하는 폴리펩티드, 이 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체 및 감수성 질환제
본 발명은 면역담당 세포에 의한 인터페론-γ (이하, " IFN-γ " 라 약칭함)의 생산을 유도하는 신규의 폴리펩티드, 이 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체, 및 이 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 감수성 질환제에 관한 것이다.
IFN-γ 는 항바이러스 작용, 항종양 작용 및 면역조절 작용을 가진 단백질인데, 항원 또는 유사분열 물질 (mitogen) 에 의해 자극을 받은 면역담당 세포에 의해 생성된다. 이들 생물 활성으로 인해 IFN-γ 는 발견 당초부터 항종양제로서의 용도가 기대되어 뇌종양을 비롯한 일반적인 악성 종양의 치료제로서 임상시험이 정력적으로 진행되고 있다. 현재 시판되고 있는 IFN-γ 제제는 면역 담당 세포에 의해 생산되는 천연형 IFN-γ 와 천연형 IFN-γ 를 코우드하는 DNA 를 에쉐리히아 콜리종의 미생물에 도입하여 제조되는 형질 전환체에 의해 생산되는 재조합형 IFN-γ 의 두가지로 대별된다. 위의 임상시험에 있어서 이들 IFN-γ 중의 어느 하나를 " 외래 IFN-γ " 로 하여 환자에게 투여하고 있다.
이들 IFN-γ 중에서 천연형 IFN-γ 는 통상적으로 주화 (株化) 된 면역담당 세포를 IFN-γ 유도제를 첨가한 영양배지중에서 배양하고, 생성된 IFN-γ 를 정제하여 제조되고 있다. IFN-γ 유도제의 종류가 IFN-γ 생산수율, IFN-γ 정제의 용이성 및 최종 제품의 안전성 등에 크게 영향을 미치고 있다는 것은 잘 알려져 있다. 일반적으로 콘카나발린 A (Con A), 렌즈 쿨리나리스 (Lenz culinaris), 피톨라카 아메리카나 (Phytolacca americana), 엔도톡신 및 리포다당 등의 유사분열 물질이 사용된다. 그러나, 이들 유사분열 물질은 그 기원과 정제방법에 따라 분자량과 품질의 다양성을 가지며 일정한 IFN-γ 유도능으로 소요의 양을 수득하기가 어렵다는 문제점이 있다. 더욱이 이들 유사분열 물질의 대부분은 생체에 투여할 경우 바람직하지 못한 부작용을 유발하고 이들중 어떤 것들은 독성을 나타내는 것도 있다. 따라서, 이러한 유사분열 물질을 생체에 직접 투여하여 IFN-γ 생산을 유도하는 것이 실질적으로 곤난하다.
본 발명자들은 포유동물 세포에 의해 생성되는 사이토카인류에 대한 연구를 통해 IFN-γ 생산을 유도하는 물질을 마우스의 간에서 발견하였다. 본 발명자들은 칼럼 크로마토그래피를 중심으로 한 각종 정제방법을 이용함으로써 이 물질을 분리하여 그 특성과 성상에 대해 연구를 한 결과, 그 실체는 아래의 물리화학적인 성질을 가진 단백질이라는 것이 판명되었다.
(1) 분자량
소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE) 에 의해 분자량 19,000 ± 5,000 달톤을 나타냄.
(2) 등전점 (pI)
크로마토포커싱 (chromatofocusing) 에 의해 등전점 4.8 ± 1.0 을 나타냄.
(3) 부분 아미노산 배열
배열번호 4 (SEQ ID NO:4) 및 배열번호 5 (SEQ ID NO:5) 의 부분 아미노산 배열을 가짐.
(4) 생물작용
면역담당 세포에 의해 IFN-γ 생산을 유도함.
이들 물리화학적 성질을 가진 단백질은 아직까지 알려진 바 없으므로 그 실체는 신규 물질이라는 결론을 내릴 수 있다. 본 발명자들은 마우스 간세포에 대해 연구를 계속한 결과, 이 물질의 DNA 는 471 염기쌍으로 되어 있고 배열번호 3 (SEQ ID NO:3) 의 아미노산 배열을 코우드하는 것임을 확인하였다 (배열번호를 이후부터는 " SEQ ID NO: " 라 함.)
SEQ ID NO:3 :
이 발견에 근거하여 본 발명자들은 인간의 간세포에 대해 더욱 연구를 계속하여 면역담당 세포에 의해 IFN-γ 생산을 유도하는 또 다른 신규의 물질을 코우드하는 DNA 를 얻었다. 본 발명자들은 그 실체가 폴리펩티드인 것을 판명하였고, 또한 그 DNA 를 해독한 결과 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열을 가지고 있음이 판명되었다.
SEQ ID NO:1 :
본 발명자들은 DNA 를 에쉐리히아 콜리 (Excherichia coli) 에 도입하여 폴리펩티드를 발현시켜 배지에서 고수율로 생성시켰다.
위에 나온 바와 같이 이 폴리펩티드는 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 성질을 가지고 있으므로 IFN-γ 유도체, 항바이러스제, 항종양제, 항세균제, 면역 조절제, 혈소판 증강제 등으로서 여러가지 분야에서 사용될 수 있는 것으로 기대된다. 일반적으로 폴리펩티드를 의약에 첨가해야 할 경우에 있어서 생물활성이 있는 폴리펩티드를 비교적 고순도로 효율적으로 정제하고, 수많은 샘플을 동시에 분석하는 방법의 개발이 불가피하게 필요하다. 이러한 정제와 분석을 가능하게 하는 가장 적당한 재료는 모노클로날 항체이지만 폴리펩티드에 특이적인 것은 아직까지 얻지 못하고 있다.
근래, 유효성분으로서 인터페론-α , 인터페론-β, TNF-α, TNF-β, 인터로이킨 2 및 인터로이킨 12 등의 사이토카인류와 IFN-γ 을 함유하는 몇가지 의약이 개발되었고, 기타는 실사용을 위해 검토중에 있다. 이들 의약을 항종양제, 항바이러스제, 항균제, 방부제, 면역 조절제 등으로 사용할 수 있고, 필요한 경우 기타 의약과 더불어 사용할 수 있다.
화학적으로 합성된 의약과는 달리 위에 나온 의약들은 심각한 부작용 없이 비교적 장기간 동안 환자에게 용이하게 투여할 수 있다는 가장 큰 특징이 있으나 치료효과가 비교적 낮아 치료 대상이 되는 질환과 증상의 종류에 따라 단독으로 사용할 경우 질환을 경감 또는 치유할 수 없다는 단점도 가지고 있다. 따라서 이러한 의약은 현재 악성 종양 등의 난치성 질환 치료시에 화학합성 의약의 보충약으로 사용되고 있거나 환자의 수명을 연장하기 위한 수단으로 사용되고 있다.
위와 같은 사정을 고려하여 본 발명의 목적은 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 신규의 폴리펩티드를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 를 제공함에 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 이러한 DNA 와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA 를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 DNA 를 적당한 숙주속에 도입하여 수득되는 형질 전환체를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이 형질 전환체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리 펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 이 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 제공함에 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 상기 모노클로날 항체의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 모노클로날 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 정제하는 정제방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 모노클로날 항체를 사용하여 폴리펩티드를 분석하기 위한 검출방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 IFN-γ 감수성 질환용 의약을 제공함에 있다.
본 발명의 제 1 목적은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 또는 이것에 상동적(相同的) 인 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드에 의해 달성된다.
본 발명의 제 2 목적은 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 에 의해 달성된다.
본 발명의 제 3 목적은 상기 DNA 와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는 복제가능한 재조합 DNA 에 의해 달성된다.
본 발명의 제 4 목적은 복제가능한 DNA 를 적당한 숙주속에 도입하여 수득되는 형질 전환체에 의해 달성된다.
본 발명의 제 5 목적은 재조합 DNA 를 숙주속에 도입하고, 형질 전환체를 영양배지에서 배양하며, 생성된 단백질을 배양물로 부터 채취하여서 되는 단백질 제조방법에 의해 달성된다.
본 발명의 제 6 목적은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 또는 이것과 상동적인 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드에 특이적이고 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 모노클로날 항체에 의해 달성된다.
본 발명의 제 7 목적은 상기 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마에 의해 달성된다.
본 발명의 제 8 목적은 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 생체외, 즉 영양배지에서 배양하거나, 또는 생체내, 즉 동물의 체내에서 배양하고, 수득한 배양물 또는 체액으로 부터 항체를 채취하여서 되는 모노클로날 항체의 제조방법에 의해 달성된다.
본 발명의 제 9 목적은 상기 폴리펩티드와 불순물을 함유한 혼합물에 모노클로날 항체를 접촉시켜 폴리펩티드를 흡착시키고, 항체로 부터 상기 폴리펩티드를 탈착시켜서 되는 폴리펩티드의 정제방법에 의해 달성된다.
본 발명의 제 10 목적은 샘플을 상기 모노클로날 항체와 접촉시켜 이들을 면역 반응시켜서 되는 폴리펩티드 검출방법에 의해 달성된다.
본 발명의 제 11 목적은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 의약에 의해 달성된다.
위에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의한 폴리펩티드는 종래의 폴리펩티드의 경우와는 다른 아미노산 배열을 가지고 있고, 면역담당 세포에 단독으로 또는 적당한 보인자 (cofactor) 와 더불어 작용시키면 IFN-γ 생산을 유도한다.
본 발명에 의한 DNA 는 자체 복제가능한 벡터에 DNA 를 도입하여 재조합 DNA 를 생성시키고, 통상적으로 이 재조합 DNA 를 이 폴리펩티드를 생산하지는 않더라도 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주에 도입함으로써 상기 폴리펩티드의 생산을 발현한다.
일반적으로 본 발명에 의한 복제가능한 재조합 DNA 는 이 폴리펩티드를 생산하지 않더라도 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주에 도입함으로써 이 폴리펩티드의 생산을 발현한다.
형질 전환체는 배양하면 이 폴리펩티드를 생산한다.
이 형질 전환체를 본 발명의 방법에 따라 배양하면 이 폴리펩티드를 바라는 양으로 용이하게 얻게된다.
본 발명은 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 신규의 폴리펩티드의 발견에 근거한 것이다. 본 발명자들이 포유동물 세포로 부터 생산되는 사이토카인류에 대해 연구한 결과, 마우스 간장중에 IFN-γ 생산을 유도할 수 있는 신규의 단백질이 존재함을 발견하였다. 칼럼 크로마토그래피를 주로한 정제 방법중 두가지 이상을 이용하여 단백질을 분리하고, 그 부분 아미노산 배열을 결정하였다. 이 배열에 근거하여 마우스 간 세포로 부터 분리한 mRNA 를 주형 (template) 으로 사용하여 프라이머를 화학적으로 합성한 다음, 상기 프라이머 존재하에 상기 단백질을 역전사 폴리머라아제 연쇄반응 (RT-PCR) 시켜 단백질을 부분적으로 코우드하는 DNA 단편을 채취하였다. 이 DNA 단편을 프로우브 (probe) 로 사용하여 상기 mRNA 로 부터 별도로 제조한 cDNA 라이브러리를 예의 검색한 결과, 471 염기쌍으로 되어 있는 SEQ ID NO:3 의 염기배열을 가진 DNA 단편을 얻었다. 이 염기배열을 해독한 결과, 마우스 간장으로 부터 분리된 단백질은 157 개의 아미노산으로 되어 있고 SEQ ID NO:3 의 아미노산 배열 (여기서 " Xaa "는 " 메티오닌 " 또는 " 트레오닌 " 을 뜻함) 을 가지고 있음이 판명되었다.
이들 발견에 근거하여 본 발명자들은 인간의 간 세포 유래의 mRNA 에 관해 더욱 연구를 한 결과, 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 폴리펩티드를 코우드하는 새로운 유전자가 존재함을 발견하였다. 이 유전자는 SEQ ID NO:2 의 염기배열을 가지고 있고, 이것을 해독한 결과, SEQ ID No:1 의 아미노산 배열 (여기서 " Xaa "는 " 이소로이신 " 또는 " 트레오닌 " 을 뜻함) 을 가진 폴리펩티드를 코우드하는 것이 판명되었다.
SEQ ID NO:2 :
SEQ ID NO:1 및 2 의 아미노산 배열과 염기배열을 해명하는데 사용된 기법을 요약하면 아래와 같다.
(1) 크로마토그래피를 주요 기술로 한 종래의 정제방법을 조합하여 마우스 간세포로 부터 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 단백질을 분리하여 고도로 정제하였다.
(2) 수득한 정제 단백질을 트립신으로 소화하고, 수득한 혼합물로 부터 2 종류의 폴리펩티드 단편을 분리하여 아미노산 배열을 결정하였다.
(3) 마우스 간세포로 부터 mRNA 를 채취하여, 이것을 주형으로 하여, 상기 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 프라이머로서의 올리고뉴클레오티드 존재하에 역전사-폴리머라아제 연쇄반응 (RT-PCR) 시켜 DNA 단편을 얻었다. 이들 부분 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 프로우브로서의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 DNA 단편을 검색한 다음, 단백질을 부분적으로 코우드하는 DNA 단편을 채취하였다.
(4) 이 DNA 단편을 표지한 후 mRNA 를 주형으로하여 제조된 cDNA 라이브러리에 하이브리다이즈시켜 강력하게 하이브리다이즈된 형질 전환체를 선택하였다.
(5) 이 형질 전환체로 부터 cDNA 를 분리하여 염기배열을 결정하고 해독하였다. 해독된 아미노산 배열과 부분 아미노산 배열을 비교한 결과, 이 단백질은 SEQ ID NO:3 의 아미노산 배열을 가지며, 마우스에 있어서 SEQ ID NO:3 의 염기배열이 이 아미노산 배열을 코우드한다는 것을 판명하였다.
(6) SEQ ID NO:3 의 염기배열을 가진 DNA 단편을 제조하여 표지한 후, 인간의 간 세포 유래의 mRNA 를 주형으로 사용하여 제조한 cDNA 라이브러리에 하이브리다이즈시킨 다음 강력하게 하이브리다이드된 형질 전환체를 선택하였다.
(7) 이 형질 전환체로 부터 cDNA 를 제조하여 염기배열을 결정하고 해독함으로써 인간 폴리펩티드인 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 염기배열에 의해 코우드된 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열을 가진 것들을 포함하고 있음을 판명하였다.
장기간에 걸친 연구를 통하여 본 발명자들은 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 본 발명의 폴리펩티드를 발견하였고, SEQ ID NO:1 로 부터 명백한 바와 같이 종래 공지된 폴리펩티드와는 상이함을 알 수 있다. SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 또는 이것에 상동적인 아미노산 배열을 가진 것인 한 천연형 폴리펩티드와 재조합형 폴리펩티드는 모두 본 발명의 폴리펩티드에 속한다. SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열에 상동적인 아미노산 배열을 가진 변이체는 본 발명의 폴리펩티드의 고유의 생물작용을 변화시킴이 없이 SEQ ID NO:1의 아미노산 1 개 이상을 다른 아미노산으로 치환함으로써 얻을 수가 있다. 동일한 DNA 를 사용할 경우라도 DNA 가 도입되는 숙주와 이 DNA 를 함유한 형질 전환체의 배양에 사용되는 영양배지의 성분, 배양 온도, pH 등의 조건에 따라서는 숙주의 내효소에 의한 DNA 발현후의 수식 (modification) 등에 의하여 폴리펩티드의 고유의 생물학적 특성을 유지하면서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열에서의 N 말단 및/또는 C 말단 부근의 아미노산 1 개 이상이 결실되어 있거나 SEQ ID NO:1 에서 N 말단 부근에 1 개 이상의 아미노산이 새로 부가된 변이체를 생성하는 경우가 있다. 이러한 변이체도 그것이 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 한 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 를 함유한 형질 전환체를 영양배지중에서 배양하고, 생성된 폴리펩티드를 배양물로 부터 채취함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 형질 전환체는 예컨대 SEQ ID NO:2 의 염기배열 또는 이것에 상동적인 염기배열 혹은 이들 염기배열에 대해 상보적인 염기배열을 가진 DNA 를 숙주에 도입함으로써 얻을 수 있다. 그리고 유전자 코우드의 축중 (degeneracy) 을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 배열을 바꿈이 없이 이들 염기배열의 염기 한개 이상을 다른 염기로 치환할 수 있다. 또한, 이 DNA 를 사용하여 숙주중에서 이 폴리펩티드 생산을 발현하기 위해서는 이 폴리펩티드 또는 그 변이체를 코우드하는 염기배열의 염기 1 개 이상을 다른 염기로 치환할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 DNA 는 그것이 위에 나온 염기 배열을 가지고 있는 한 그것이 천연에서 유래하는 것인가 또는 인위적으로 합성한 것인가는 관계없다. 천연의 공급원으로서는 예컨대 인간의 간세포를 들 수 있는데, 이 간세포로 부터 SEQ ID NO:6 의 염기배열의 DNA 를 함유한 유전자가 얻어진다.
SEQ ID NO:6 :
그 제조방법은 다음과 같다. 시판되고 있는 폴리 (A) 부가 인간 간장 mRNA 를 수크로오스 농도 기울기 완충액으로 분획하여 정제 mRNA 를 분리한다. 이 mRNA 를 주형으로 하여 여기에 역전사 효소와 폴리머라아제를 작용시켜 이중쇄 (double-stranded) cDNA 를 생성시키고, 이 cDNA 를 자체 복제 가능한 적당한 벡터에 도입하여, 수득한 재조합 DNA 를 에쉐리히아 콜리 등의 적당한 숙주에 도입한다. 수득한 형질 전환체를 영양배지에서 배양하고, 콜로니 하이브리다이제이션법 (colony hybridization method) 으로 본 발명의 폴리 펩티드를 코우드하는 DNA 를 함유한 증식된 형질 전환체를 채취한다. 이 형질 전환체를 종래의 방법으로 처리하여 본 발명에 의한 DNA 를 얻게 된다. 본 발명의 DNA 를 인위적으로 제조하자면, 예컨대 SEQ ID NO:2 의 염기배열에 근거하여 화학적 합성법으로 제조하거나, 혹은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 를 적당한 벡터에 도입하여 재조합 DNA 를 생성시키고, 이 재조합 DNA 를 적당한 숙주에 도입하여 수득한 형질 전환체를 영양배지에서 배양한 후, 배양물로 부터 증식된 균체를 분리하고, 이 균체로 부터 목적의 DNA 를 함유한 플라스미드를 채취함으로써 제조한다.
일반적으로 이러한 DNA 를 재조합 DNA 형태로 숙주에 도입한다. 이러한 재조합 DNA 는 통상적으로 DNA 와 자체 복제가능한 벡터를 함유하는데, DNA 를 입수할 수 있으면 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 용이하게 제조할 수 있다.
이러한 자체 복제가능한 벡터의 예로서는 pKK223-2, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA, pUB110, YEp13, Ti 플라스미드, Ri 플라스미드 및 pBI121 등의 플라스미드 벡터가 있는데, 이들 벡터중에서 pKK223-2, pGEX-2T, pRL-λ, pBTrp2 DNA, pUB110 및 YEp13 등은 본 발명의 DNA 를 에쉐리히아 콜리, 바실루스서브탈리스 등의 미생물 및 효모 등의 원핵생물에서 발현시킬 경우에 적절히 사용되는 반면, Ti 플라스미드, Ri 플라스미드 및 pBI121 은 동물세포와 식물세포에서 발현시키는데 적절히 사용된다.
본 발명의 DNA 를 이들 벡터에 도입하기 위해서는 이 분야에서 사용되는 종래의 방법을 임의로 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 DNA 를 함유한 유전자와 자체 복제가능한 벡터를 제한효소 및/또는 초음파로 절단한 다음, 수득한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 유전자와 벡터를 절단하기 위해서는 뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한효소, 특히 Sau 3AI, Eco RI, Hind III, Bam HI, Sal I, Xba I, Sac I 및 Pst I 등의 타입 II 제한 효소를 사용하면 DNA 단편과 벡터 단편을 용이하게 연결할 수 있다. DNA 단편과 벡터 단편을 연결하자면 필요에 따라 이들을 먼저 어니일링한 후 생체내 또는 생체외에서 DNA 리가아제로 처리한다. 이렇게 하여 얻은 재조합 DNA 를 적당한 숙주에 용이하게 도입할 수 있으므로 형질 전환체를 배양함으로써 DNA 를 무한하게 복제할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 재조합 DNA 를 에쉐리히아 콜리, 바실루스 서브틸리스 등의 미생물 및 효모 등의 적당한 숙주에 도입할 수 있다. 즉, 에쉐리히아 콜리를 숙주로 사용할 경우에는 재조합 DNA 와 칼슘 이온 존재하에 배양하고, 바실루스 서브틸리스를 숙주로 사용할 경우에는 컴피턴트 셀법 (competent cell method) 이나 프로토플라스트법 (protoplast method) 을 사용한다. 목적의 형질 전환체를 클로닝하자면 콜로니 하아브리다이제이션법을 적용하거나, 영양배지에서 형질 전환체를 모두 배양하고, 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 생산하는 것을 선택하면 좋다.
이렇게 하여 얻은 형질 전환체는 영양배지에서 배양하면 본 발명의 폴리펩티드를 세포내 또는 세포외에서 생산한다. 이러한 영양배지의 예로서는 탄소원, 질소원, 미네랄, 필요에 따라서는 아미노산이나 비타민 등의 미량 영양소를 함유한 일반적인 액체형태의 배지가 사용된다. 본 발명에서 사용되는 탄소원으로서는 전분, 전분 가수분해물, 글루코오스, 프룩토오스 및 수크로오스 등의 당류가 있다. 본 발명에서 사용되는 질소원으로서는 암모니아 및 이들의 염, 우레아, 질산염, 펩톤, 효모엑스, 탈지 대두, 콘스티프 리커 및 육(肉)엑스 등의 무기 화합물 및 유기 화합물이 있다. 형질 전환체를 영양배지에 접종하고, 온도 25∼65℃, pH 5∼8 에서 통기교반 등에 의한 호기적 조건하에서 약 1∼10 일 동안 배양하여 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 배양물을 얻는다. 이 배양물을 그대로 IFN-γ 유도제로 사용할 수 있으나, 필요한 경우 초음파 처리 및/또는 세포벽 용해 효소처리를 하여 균체를 파쇄한 후, 수득한 현탁액을 여과 또는 원심분리하여 이 폴리펩티드를 균체 또는 균체 파쇄물로 부터 분리하고, 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 상청액을 다시 정제한다. 본 발명에서 사용되는 정제법은 예컨대 생리활성물질을 정제하기 위해 이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법들인데, 즉 농축, 염석, 투석, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등이 있으며, 필요에 따라 이들 방법중 두가지 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 수득한 정제 용액을 최종 용도에 따라 농축 및/또는 동결건조하여 액상 또는 고상으로 할 수 있다.
위에 나온 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드는 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유발하는 작용을 가진다. 이로 인하여 본 발명의 폴리펩티드를 에이즈, 첨규 콘틸롬 (condyloma acuminatum) 등의 바이러스성 질환 ; 신장암, 육아종, 균상 식육증 (mycosis fungoides), 뇌종양 등의 악성종양 ; 및 관절 류마티즘, 알레르기증 등의 면역질환에 대한 치료제 및/또는 예방제로 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 영양배지중에 공존시켜 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하거나 직접 포유동물에 투여하여 IFN-γ 감수성 질환을 예방 및/또는 치료한다. 전자의 경우에서는 포유류의 말초혈로 부터 분리되는 백혈구, 또는 HLB-38 세포, Mo 세포, Jurkat 세포, HuT78 세포, EL4 세포 및 L12-R4 세포 등의 주화된 면역담당 세포를, 본 발명의 폴리펩티드를 1 ml 당 약 0.1 ng ∼ 약 1 ㎍, 바람직하게는 약 1∼100 ng 함유한 적당한 영양배지중에 현탁시켜 IFN-γ 생산을 유도한다. 필요에 따라 이 영양배지에 유사분열 물질, 인터로이킨 2 및 항(抗) CD-3 항체 등의 T 세포 자극물질을 가하고 온도 약 30∼40℃ 및 pH 약 5∼8 에서 배지를 신선한 것으로 교체해 주면서 약 1∼100 시간 동안 균체를 배양한다. 이렇게 하여 수득한 배양물로 부터 생리활성 물질 정제에 통상적으로 사용되는 종래의 방법, 예컨대 농축, 염석, 투석, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등의 방법중에서 한가지 이상의 방법으로 IFN-γ 를 얻을 수 있다.
IFN-γ 감수성 질환의 치료 및/또는 예방을 위해서는 본 발명의 IFN-γ 유도제를 직접 포유동물에 투여한다. 예컨대 IFN-γ 유도체를 적당한 제형으로 제제화하여 포유동물에 경구투여하거나 피내(皮內), 피하(皮下), 근육내, 정맥내 또는 복강내에 주사 투여한다. 본 발명의 폴리펩티드를 투여할 수 있는 포유류는 사람에게만 한정되지 않고, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 원숭이 등의 기타 동물도 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 IFN-γ 유도능이 강하고 독성이 극히 낮으므로 소량만을 사용하여도 IFN-γ 생성을 용이하게 유도할 수 있고, 또한 포유동물에 비교적 대량 투여하여도 심각한 부작용을 야기하지 않는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 용량을 엄밀히 관리하지 않더라도 소망량의 IFN-γ 를 원활하게 유도한다. 본 발명의 폴리펩티드는 의약품에서 요구되는 안정성을 충족하고 있음은 물론이다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 특정의 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드와 특이하게 반응한다.
본 발명에 의한 하이브리도마는 생체외에서 배양할 경우 모노클로날 항체를 생산한다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체의 제조방법에 의하여 항체를 필요로 하는 양으로 용이하게 생산할 수 있다.
본 발명에 의한 폴리펩티드의 정제방법에 의하여 폴리펩티드와 불순물을 함유한 혼합물로 부터 폴리펩티드를 비교적 고품위로 효율적으로 회수할 수 있다.
본 발명에 의한 검출방법에 있어서 폴리펩티드만이 샘플중에서 면역 반응을 한다. 적당한 방법으로 면역반응 정도를 측정하면 폴리펩티드를 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 그 공급원, 기원 및 클라스에 관계없이 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 또는 이 아미노산 배열의 상동적인 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체 전반을 포함한다. 상동적인 아미노산 배열에는 면역담당 세포에서의 IFN-γ 생산 유도활성을 실질적으로 상실하지 않으면서 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열의 아미노산 1 개 이상을 다른 아미노산으로 치환하여 수득되는 것, SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에 아미노산 1 개 이상을 부가하여 수득되는 것 또는 SEQ ID NO:1 의 아미노산의 N 말단 및/또는 C 말단의 아미노산 1 개 이상을 결실하여 수득되는 것을 포함한다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 이러한 폴리펩티드 또는 그 항원성 단편을 사용하여 얻을 수 있다. 예컨대 이러한 단편으로 면역감작시킨 포유동물로 부터 채취한 항체 생산 세포 및 무한증식 가능한 포유동물 세포를 사용하여 하이브리도마를 제조하고, 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마의 클론(clone) 을 선택하여 이 클론을 생체내 또는 생체외에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
항원으로서의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 또는 이 배열에 상동적인 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 를 도입한 형질 전환체를 배양하여 얻을 수 있는데, 일반적으로 이들을 그대로 사용하거나 부분 정제 형태로 사용한다. 항원성 단편은 완전 정제 또는 부분 정제 폴리펩티드를 화학적 또는 효소적으로 가수분해하여 제조하거나, SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열에 근거하여 펩티드 합성에 의해 합성할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 면역감작법은 종래의 방법들을 포함한다. 예컨대 항원 단독 또는 적당한 보조제와 더불어 포유동물의 정맥내, 피내, 피하 또는 복강내에 주사하고 일정기간 동안 사육한다. 사용되는 포유동물에는 특히 한정은 없고, 소요의 항체 생산 세포를 얻을 수 있는 한 종류, 체중, 성별은 관계없다. 일반적으로 래트, 마우스, 햄스터 등의 설치류가 사용되고, 무한증식 가능한 위에 나온 포유동물 세포와의 적합성을 판단하면서 가장 적합한 동물이 선택된다. 사용되는 포유동물의 종류와 체중에 따라 항원의 총 투여량은 일반적으로 한마리당 약 5∼500 ㎍ 의 범위내로 하여 1∼2 주간의 간격을 두고 2 회 내지 5 회로 나누어 투여한다. 최종 투여로 부터 3∼5 일 후에 동물의 비장을 적출하여 분산시켜 항체 생산 세포로서의 비장 세포의 현탁액을 얻는다.
이어서, 위에서 얻은 항체 생산 세포와 포유동물 세포를 융합시켜 목적의 하이브리도마를 함유한 세포 융합 혼합물을 얻는다. 무한증식 가능한 포유동물 세포로서는 P3-NS1-Ag4-1 세포 (ATCC TIB18), P3-X63-Ag8 세포 (ATCC TIB9), SP2/O-Ag14 세포 (ATCC CRL1581) 등의 마우스 골수종 유래의 세포주 또는 이들의 변이주를 포함한다. 본 발명에서 사용하는 세포 융합법은 폴리에틸렌 글리콜 및 센다이 바이러스 (HVJ) 등의 세포 융합 촉진제와 전기 펄스를 사용하는 종래의 방법들이 있는데, 예를 들자면 융합 촉진제를 함유한 융합배지에 항체 생산 세포와 이러한 포유동물 세포를 약 1 : 1 ∼ 1 : 10 의 비율로 부유시키고 약 30∼40℃ 에서 약 1∼5 분간 인큐베이트 한다. 융합배지로서는 최소 필수배지 (MEM), RPMI 1640 배지 및 Iscove 개변 달베코 배지 (Iscove s Modified Dulbecco'S Medium : IMDM) 등의 종래의 배지를 소혈청 등의 혈청류를 첨가하지 않고 사용하는 것이 바람직하다.
목적의 하이브리도마를 선택하기 위하여 위에서 수득한 세포 융합 혼합물을 HAT 배지를 등의 선택용 배지에 옮겨 약 30∼40℃ 에서 약 3 일 ∼ 3 주 동안 배양하여 하이브도마 이외의 세포를 사멸시킨다. 이 하이브리도마를 통상의 방법으로 배양하고, 배양물중에 분비된 항체를 사용하여 이 폴리펩티드와의 반응성을 시험하였다. 이러한 시험의 예로서는 효소 면역시험, 방사선 면역시험 및 생물학적 시험 등의 항체 검출을 위한 종래의 방법이 있다. 예컨대, 문헌 [" Tan-Clone-Kotai-Jikken-Manual (Experimental Manual for Monoclonal Antibody) ", edited by Sakuji TOYAMA and Tamie ANDO, published by Kodansha Scientific, Ltd., Tokyo, Japan, pp.105-152 (1991)] 에는 이들 여러가지 시험 방법에 관해 상세히 기재되어 있다. 이 폴리펩티드에 특이적인 항체를 생산하는 하아브리도마는 한계 희석법으로 용이하게 클로닝되어 본 발명에 의한 하이브리도마를 생성한다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 동물의 생체내 또는 생체외에서 하이브리도마를 배양하여 얻을 수 있다. 배양에는 포유동물 세포를 배양하는 종래의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대 생체내 배양의 경우에 있어서 동물의 복수 (ascite) 및/또는 혈액으로 부터 모노클로날 항체를 채취한다. 아래에 나오는 하이브리도마 H-1 및 H-2 는 모노클로날 항체 생산성이 높고 생체내외에서 용이하게 배양되는 특징을 가지고 있다. 항체 정제에 일반적으로 사용되는 종래의 방법을 이용하여 배양물, 또는 동물의 복수 혹은 혈액으로 부터 모노클로날 항체를 채취한다. 이러한 방법의 예로서는 염석, 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC), 겔 전기영동 및 등전점 전기영동 등을 들 수 있는데, 필요에 따라 이들 중 두가지 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 수득한 정제 모노클로날 항체를 농축 또는 건조하여 최종 용도에 부합하는 액상 또는 고상의 제품을 얻는다.
본 발명의 모노클로날 항체는 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 본 발명의 폴리펩티드 정제에 극히 유용하다. 이러한 정제방법은 이 폴리펩티드와 이 폴리펩티드 이외의 단백질 등의 불순물을 함유한 혼합물과 모노클로날 항체를 접촉시켜 항체에 폴리펩티드를 흡착시키고, 이 항체로 부터 폴리펩티드를 탈착시키는 것으로 되어 있다. 이들 공정은 일반적으로 수성계에서 실시된다. 일반적으로 모노클로날 항체를 겔 상태의 수불용성 (water-insoluble) 담체에 고정화한 형태로 사용하는데, 이 수불용성 담체를 원통형 칼럼에 충전한 다음, 이 칼럼에 형질 전환체의 배양액 또는 이들의 부분 정제품을 공급하여 실질적으로 모노클로날 항체에 폴리펩티드를 흡착시킨다. 항체 주위의 pH 를 변화시켜 줌으로써 이 폴리펩티드는 항체로 부터 용이하게 탈착한다. 예컨대, IgG 클라스의 모노클로날 항체를 사용할 경우에 있어서, 흡착된 폴리펩티드는 산성 pH, 통상적으로 pH 2∼3 에서 탈착하여 칼럼으로 부터 용출하는 반면, IgM 클라스의 모노클로날 항체를 사용할 경우에 있어서는 알칼리성 pH, 통상적으로 pH 10∼11 에서 폴리펩티드가 탈착하여 칼럼으로 부터 용출한다.
본 발명에 의한 정제방법에 의하여 최소한의 인건비와 시간으로 비교적 고순도의 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 위에 나온 바와 같이 이 폴리펩티드는 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 작용을 가지고 있고, 정제 폴리펩티드를 균체 배양시 IFN-γ 유도제로 사용하여 IFN-γ 를 생산할 수 있으며, 에이즈나 첨규 콘딜롬 등의 바이러스성 질환, 신장암, 육아종, 균상식육종 및 뇌종양 등의 악성종양 및 관절 류머티즘, 알레르기증 등의 면역 질환에 대한 치료 및/또는 예방에 에 사용된다. 이 폴리펩티드가 킬러 세포 (killer cell) 의 세포독성을 증강하는 활성을 가지면 인터로이킨 2 및/또는 종양 괴사 인자와 더불어 사용하여 폐암, 신장암 및 유방암 등의 고형암을 비롯한 악성 종양의 양자 면역요법 (adoptive immunity) 에 의한 치료효과를 개선하고 이러한 치료시의 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 의한 모노클로날 항체는 이 폴리펩티드의 검출을 필요로 하는 각종 분야에 비교적 넓은 용도를 가진다. 방사선 면역시험, 효소 면역시험 및 형광 면역시험 등의 표지 면역시험에 사용할 경우에는 모노클로날 항체에 의해 샘플중의 폴리펩티드를 신속하고도 정확하게 정량 및 정성분석할 수 있다. 이러한 분석에 있어서 본 발명의 모노클로날 항체를 예컨대 방사성 물질, 효소 및/또는 형광물질로 표지하여 사용한다. 이 항체는 이 폴리펩티드와 특이적으로 반응하여 면역반응을 나타내므로 이들 표지된 물질의 면역반응 정도를 측정함으로써 샘플중의 극미량의 폴리펩티드를 정확히 검출한다. 생물학적 시험과 비교하면 표지 면역시험은 다음의 특징이 있다. 즉, 다수의 시료를 동시에 분석할 수 있고, 분석시간과 인건비를 절감할 수 있으며, 그 정밀도가 비교적 높은 데이타를 제공한다. 따라서, 본 발명의 검출방법은 폴리펩티드의 제조단계의 제어와 최종 제품의 품질관리에 유용하다. 본 발명은 모노클로날 항체를 항체의 표지 방법 또는 표지 시험법에 관한 것이 아니므로 이들에 대한 상세한 설명을 생략하겠으나, 이들 방법은 문헌 [" Enzyme Immunoassay ", edited by P.Tijssen, translated by Eiji ISHIKAWA, published by Tokyo-Kagaku-Dojin, pp.196-348 (1989)] 에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 감수성 질환제는 사람에게 투여하면 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하여 IFN-γ 감수성 질환의 치료 및/또는 예방 효과를 발휘한다. 이 폴리펩티드가 킬러 세포의 세포독성을 증강하거나 킬러 세포의 생성을 유도하는 작용을 가지면 악성 종양을 비롯한 난치성 질환치료에 강력한 효과를 발휘한다.
본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열 (여기서 " Xaa "는 " 이소로이신 " 또는 " 트레오닌 " 을 뜻함) 또는 이것에 상동적인 아미노산 배열을 가지며, 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도한다. 이러한 상동적인 아미노산 배열의 예로서는 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열에서 아미노산 1 개 이상이 다른 아미노산으로 치환된 것, N 말단 및/또는 C 말단에 아미노산 1 개 이상이 부가된 것, 및 N 말단 및/또는 C 말단의 아미노산 1 개 이상이 결실된 것을 포함한다. 예컨대, 본 발명에서 폴리펩티드가 이러한 아미노산 배열과 성질을 가지고 있는 것이면 세포 배양법으로 천연의 공급원으로부터 분리된 것이어도, 그리고 재조합 DNA 기술이나 펩티드 합성법으로 인위적으로 합성된 것이어도 본 발명에서 모두 사용할 수 있다.
경제적 관점에서 재조합 DNA 기술이 본 발명에서 유리하게 사용하는데, 이 방법에 의하여 이들 아미노산 배열을 코우드하는 DNA 를 미생물 및 동물 유래의 적당한 숙주에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음, 통상의 방법으로 영양배지 중에서 배양하고, 수득한 배양물을 사이토카인 정제에 사용되는 종래 방법으로 정제하여 목적의 폴리펩티드를 얻는다.
위에 나온 바와 같이 이 폴리펩티드는 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 성질이 있다. 사람에게 투여하면 본 발명의 감수성 질환제는 체내에서 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하고 IFN-γ 감수성 질환에 대해 양호한 치료 및/또는 예방 효과를 발휘한다. SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드는 NK 세포, LAK 세포 (림포카인-활성화 킬러 세포), 세포독성 T 세포 등의 킬러 세포의 세포독성을 증강하는 성질과 킬러 세포의 생성을 유도하는 성질 및 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 성질을 가지므로 킬러 세포도 폴리펩티드-감수성 질환을 치료 및/또는 예방한다. 따라서 본 발명에서 말하는 " 감수성 질환 " 이라 함은 IFN-γ 감수성 질환을 포함하여 IFN-γ 및/또는 킬러 세포에 의해 직접 또는 간접적으로 치료 및/또는 예방할 수 있는 일반적인 질환을 의미한다. 예컨대 간염, 헤르페스증, 첨규 콘딜롬 및 에이즈 등의 바이러스성 질환 ; 칸디다증, 말라리아증 등의 세균성 질환 ; 신장암, 균상식육증, 만성 육아종 등의 고형의 악성 종양 ; 성인 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 악성 임파종 등의 혈구계 악성 종양 ; 및 알레르기증, 류마티즘 등의 면역질환을 들 수 있다. 이 폴리펩티드를 인터로이킨 3 과 더불어 사용하면 백혈병, 골수종의 완치 또는 경감, 더욱이는 악성 종양을 치료하기 위한 방사선 조사 및 화학요법제 투여에 따른 백혈구 감소증과 혈소판 감소증의 완치 또는 경감에 강력한 효과를 발휘한다.
본 발명의 감수성 질환제는 위에 나온 감수성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 항종양제, 항바이러스제, 항균제, 면역치료제, 혈소판 증가제 및 백혈구 증가제 등으로서 널리 사용할 수 있다. 감수성 질환제의 제형과 감수성 질환의 종류에 따라 달라지지만 본 발명의 감수성 질환제는 통상적으로 액상, 페이스트상 또는 고상으로 제조되는데, 이 폴리펩티드를 건조 고형물 기준 (d.s.b.) 으로 0.000001∼100 w/w ％, 바람직하게는 0.0001∼0.1 w/w ％ 함유한다.
본 발명의 감수성 질환제는 그대로 사용하거나, 혹은 혈청 알부민, 젤라틴, 당류 (예 : 말토오스, 트레할로오스) 등의 생리학적으로 허용되는 담체, 보조제, 부형제, 희석제 및/또는 안정제 등과, 필요에 따라서는 인터페론-α , 인터페론-β, 인터로이킨 2, 인터로이킨 3, 인터로이킨 12, TNF-α, TNF-β, 카르보콘 (carboquone), 시클로포스파미드, 아클라루비신, 티오테파, 부술판, 안시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 5-플루오로-1-(테트라히드로-2-푸릴)우라실, 메토트렉세이트, 악티노마이신 D, 크로모마이신 A3, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신 C, 빈크리스틴, 빈블라스틴, L-아스파라기나아제, 금콜로이드, 크레스틴, 피시바닐, 렌티난 및 마루야마 백신 등의 기타 생리활성물질 1 종 이상과 혼합하여 조성물로 가공할 수 있다. 이들 조합중에서 폴리펩티드와 인터로이킨 2 로 된 것은 폴리펩티드가 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도할 때 인터로이킨 2 가 폴리펩티드의 보인자(補因子)로서 작용하므로 특히 유용하다. 천연형 또는 재조합형 인간 인터로이킨 2 와 이 폴리펩티드를 병용함으로써 이 폴리펩티드가 실질적으로 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하지 않더라도 소망량의 IFN-γ 생산을 유도한다.
이 폴리펩티드와 인터로이킨 12 를 병용하면 이 폴리펩티드 또는 인터로이킨 12 를 단독으로 사용하여 용이하계 달성할 수 없는 다량의 IFN-γ 생산을 유도할 수 있다.
본 발명의 감수성 질환제는 투여에 적합한 물리적으로 분리되어 성형된 의약으로서의 단위 투여형태의 것들을 포함하는데, 이 폴리펩티드를 1 일 투여량 또는 1 일 투여량의 1/40∼몇배 (4 배까지) 의 용량으로 함유한다. 이러한 약제의 예로서는 주사제, 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 설하제 (舌下劑), 점안제, 점비제 및 좌제 등이 있다.
본 발명의 감수성 질환제는 환자에게 경구적으로 또는 비경구적으로 투여할 수 있고, 아래에 나온 바와 같이 생체외에서 항종양 세포를 활성화 하는데 사용할 수 있다. 두가지 투여의 경우에서도 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 만족스러운 효과를 발휘한다. 감수성 질환의 종류와 증상에 따라 따라 달라지겠으나 감수성 질환제를 약 0.1∼50 mg/회, 바람직하게는 약 1 ㎍/회 ∼ 1 mg/회의 투여량으로 하여 1 일 1∼4 회 또는 1 주 1∼5회, 1 일 ∼ 1 년동안 경구 투여하거나 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내에 비경구 투여한다.
본 발명의 감수성 질환제는 인터로이킨 2 를 사용하는 소위 " 항종양 면역요법 " 에도 사용할 수 있다. 일반적으로 항종양 면역요법은 (가) 악성 종양 환자의 체내에 직접 인터로이킨 2 를 투여하는 방법과, (나) 인터로이킨 2 에 의해 생체외에서 활성화시킨 항종양 세포를 체내에 도입하는 방법 (양자 면역요법) 으로 크게 나누어진다. 이 폴리펩티드와 더불어 투여할 경우에는 면역요법 효과를 유의하게 증가시킬 수 있다. (가) 의 방법에서는 인터로이킨 2 의 투여와 동시에 또는 투여전에 이 폴리펩티드를 성인 1 인당 1 회에 약 0.1 ㎍ ∼ 1 mg 의 투여량으로 하여 1 회 ∼ 10 회 환자에게 투여한다. 인터로이킨 2 의 투여량은 악성 종양의 종류, 환자의 증상, 폴리펩티드의 용량에 따라 달라지겠으나 성인 1 인당 약 10,000∼1,000,000 단위/회로 한다. (나) 의 방법에서는 악성 종양 환자로 부터 채취한 단핵 세포 또는 임파구를 인터로이킨 2 존재하에 배양하는데, 이들 혈구 1×106 개당 이 폴리펩티드를 약 1 ng ∼ 1 mg 공존시켜둔다.
일정시간 동안 배양한 후 배양물로 부터 NK 세포와 LAK 세포를 회수하여 환자의 체내에 도입한다. 본 발명의 항종양 면역요법으로 치료할 수 있는 질환의 예로서는 결장암, 직장암, 위암, 갑상선암, 혀암, 방광암, 융모암, 간암, 전립선암, 자궁암, 후두암, 폐암, 유방암, 악성 흑색종, 카포시 육종, 뇌종양, 신경아세포종, 난소 종양, 고환 종양, 골육종, 췌장암, 신장암, 부신종, 혈관내피종 등의 고형 악성 종양과, 백혈병, 악성 임파종 등의 혈구계 악성 종양을 들 수 있다.
다음의 실시예에 따라 본 발명을 설명하는데, 여기에 사용되는 재조합 DNA 기술 그 자체는 이 분야에서 종래 부터 공지된 것이다. 예컨대 이 기술은 문헌 [J. Sumbrook et al. in " Molecular Cloning, A Laboratory Manual ", 2nd edition (1989), published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, and by Masami MURAMATSU in " Laboratory Manual for Genetic Engineering " (1988), published by Maruzen Co., Ltd., Tokyo, Japan] 에 기재되어 있다.
실시예 A-1 : 정제 폴리펩티드 제조
8 주령의 암컷 CD-1 마우스 600 마리에 대해 60℃ 에서 1 시간 동안 예열하여 사멸시킨 코리네박테륨 파르붐 (ATCC 11827) 을 1 마리당 1 mg 으로 하여 복강내에 주사하고 통상의 방법으로 7 일 동안 사육한 후 에쉐리히아 콜리 유래의 정제 리포다당을 1 마리당 1 ㎍ 정맥 주사하였다. 정맥 주사 1∼2 시간후 마우스를 도살하여 혈액을 채취한 다음, 간장을 제거하여 8 배 체적의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.3) 중에서 호모지나이저 (homogenizer) 로 간장을 파쇄하고, 수득한 현탁액을 추출하였다. 수득한 추출물을 약 8,000 rpm 에서 20 분간 원심분리하여 얻은 약 9 리터의 상청액에 황산 암모늄으로 포화된 50 mM 인산 완충액 (pH 7.3) 을 혼합하여 포화도 45 w/v ％ 되게 하였다. 수득한 용액을 4℃ 에서 18 시간 방치한 후 8,000 rpm 정도에서 30 분간 원심분리하여 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 상청액 약 19 리터를 얻었다.
이 상청액을 1 M 황산 암모늄을 함유한 50 mM 인산 완충액 (pH 7.3) 으로 평형화시켜 둔 " PHENYL SEPHAROSE " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 약 4.6 리터가 충전된 칼럼에 공급하고, 이 칼럼을 신선한 동일 완충액으로 세척한 후 1 M 로 부터 0.2 M 까지의 황산 암모늄의 직선 기울기로 50 mM 인산 완충액 (pH 7.3) 을 SV (공간속도) 0.57 로 공급하였다. 황산 암모늄 농도 0.8 M 에서 용출한 본 발명의 폴리펩티드 함유 획분을 약 4.8 리터 회수하여 멤브레인 필터로 농축하고 20 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 에 대해 4℃ 에서 18시간 투석한 후 " DEAE-SEPHAROSE " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 약 250 ml 가 충전된 칼럼에 가하였다. 이 칼럼을 신선한 동일 완충액으로 세척하고 0 M 로 부터 0.2 M 까지의 염화 나트륨의 직선 농도 기울기로 20 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 을 SV 1.2 로 가하여 염화 나트륨 농도 약 0.13 M 에서 용출하는 본 발명의 폴리펩티드 함유 획분을 약 260 ml 을 회수하였다.
본 발명의 폴리펩티드 함유 획분을 농축하여 25 mM 비스-트리스 완충액 (pH 7.1) 에 대해 4℃ 에서 18 시간 투석하였다. 투석액을 " MONO-P " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 약 24 ml 가 충전된 칼럼에 가하고 pH 를 7 에서 부터 4 로 감소시키면서 10 v/v ％ 폴리버퍼 (polybuffer) 74 (pH 4.0) 로 용출시켜 본 발명의 폴리펩티드 함유 용출액 약 23 ml 을 얻었다.
이 용출액을 농축하여 7 mM 인산 수소 2 나트륨, 3 mM 인산 2 수소 나트륨 및 139 mM 염화 나트륨을 함유한 혼합액 (pH 7.2) 으로 평형화시켜 둔 " SUPER-DEX 75 " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 로 충전된 칼럼에 가하고, 신선한 동일 용액으로 겔 여과 크로마토그래피 처리하여 분자량 약 19,000 달톤의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 획분을 용출시켰다. 이 획분을 농축하여 실시예 A-2 에 사용하였다. 본 발명의 폴리펩티드의 수득량은 마우스 1 마리당 약 0.6 ㎍ 이었다.
실시예 A-2 : 폴리펩티드의 부분 아미노산 배열
실시예 A-1 에서 얻은 정제 폴리펩티드를 함유하는 수용액 일부를 약 50 ㎕ 까지 농축한 다음, 여기에 3 w/v ％ SDS, 60 v/v ％ 글리세롤 및 디티오트레이톨 60 mg/ml 을 함유한 용액 25 ㎕ 을 혼합하였다. 수득한 혼합물을 50℃ 에서 30 분간 인큐베이트한 후 15 w/v ％ 폴리아크릴아미드 겔위에 두고 통상의 방법으로 전기영동하였다. 수득한 겔을 0.1 w/v ％ 쿠우마시이 브릴리안트 블루우 (coomassie brilliant blue) R250 을 함유한 50 v/v ％ 수성 메탄올과 10 v/v ％ 아세트산 수용액의 혼합액중에 침지하여 염색하고, 12 v/v % 수성 메탄올과 7 v/v % 아세트산 수용액의 혼합액으로 겔을 반복하여 세척함으로써 탈색한 후 증류수중에서 18 시간 동안 침지하여 세척하였다. 쿠우마시이 브릴리안트 블루우로 염색된 본 발명의 폴리펩티드 함유의 겔을 절단하여 동결건조하였다.
동결건조된 겔을 " TPCK TRYPSIN " 2 ㎍/ml 을 함유한 100 mM 탄산 수소 나트륨, 0.5 mM 염화 칼슘 및 0.02 v/v % Tween 20 수용액으로 된 용액 0.6 ml 중에 침지한 후 37℃ 에서 18 시간 인큐베이트하여 단백질을 트립신 소화하였다. 수득한 소화물을 원심분리하여 상청액을 얻는 한편, 수득한 침전물을 0.001 v/v % Tween 20 을 함유한 1 v/v % 수성 트리플루오로아세트산 1 ml 중에 침지하여 실온에서 4시간 진탕한 후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 새로 생성된 침전물을 0.001 v/v % Tween 20 을 함유한 70 v/v % 수성 트리플루오로아세트산 및 50 v/v % 수성 아세토니트릴의 순서로 위와 마찬가지로 연속적으로 처리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액과 앞서 얻은 상청액을 한데 모아 250 ㎕ 까지 농축한 다음 원심여과하였다.
수득한 펩티드 단편 함유의 수용액을 0.1 v/v % 수성 트리플루오로아세트산으로 미리 평형화시켜둔 " HPLC ODS-120T " (일본국의 Tosoh 사 판매의 HPLC 용 칼럼) 에 가하고 이 칼럼을 0.1 v/v % 수성 트리플루오로아세트산으로 세척한 후 수성 아세토니트릴의 농도를 0 v/v % 로 부터 70 v/v % 로 증가시키면서, 그리고 용출액중의 펩티드 농도를 파장 214 nm 와 280 nm 에서 분광 광도계로 모니터링하면서 0.1 v/v % 트리플루오로아세트산을 0.5 ml/min 의 유속으로 칼럼에 가하였다. 용출개시로 부터 약 75 분후 및 약 55 분후에 용출한 획분 (이하, " 펩티드 단편 A " 및 " 펩티드 단편 B " 라 함)을 각각 회수하였다. 그 용출 패턴은 제 1 도에 나와 있다.
이들 펩티드 단편 A 와 B 를 프로테인 시퀀서 " MODEL 473 A " (미합중국의 Perkin-Elmer 사 판매) 로 분석한 결과, 이들은 SEQ ID NO:4 및 5 의 아미노산 배열을 가지고 있음이 판명되었다.
실시예 A-3 :
단백질을 코우드 하는 DNA 의 염기 배열과 폴리펩티드의 아미노산 배열
실시예 A-3-1 : 전(全) RNA 제조
실시예 A-1 의 방법과 마찬가지 방법으로 제조한 마우스 간세포 3 g 을 취하여 6 M 구아니딘 이소티오시아네이트, 10 mM 시트르산 나트륨 및 0.5 w/v % SDS 를 함유하는 혼합액 20 ml 중에 침지하여 호모지나이저로 파쇄하였다. 35 ml 용량의 원심 튜우브에 5.7 M 염화 세슘을 함유한 0.1 M EDTA (pH 7.5) 을 25 ml 주입하고 이 튜우브중의 용액의 상부에 호모지나이즈된 세포 현탁액 10 ml 을 가한 다음 25,000 rpm 에서 20 시간 원심분리하여 RNA 획분을 채취하였다. 이 획분을 15 ml 용량의 원심튜우브에 넣고 동일 체적의 클로로포름-이소부탄올 (4 : 1 체적비) 혼합액을 가하여 혼합한 후 이 튜우브를 5 분간 진탕한 다음 4℃ 및 10,000 rpm에서 10 분간 원심분리하고, 형성된 물층을 회수하여, 여기에 2.5 배 체적의 에탄올을 혼합하여 -20℃에서 2 시간 방치함으로써 전(全) RNA 를 침전시켰다. 이 침전물을 회수하여 75 v/v % 수성 에탄올로 세척한 후 멸균 증류수 0.5 ml 에 용해하여 실시예 A-3-2 에 사용하였다. 이 RNA 의 수득량은 건조 고형물 기준으로 약 4 mg 이었다.
실시예 A-3-2 : 폴리펩티드를 부분 코우드하는 DNA 단편 제조
실시예 A-3-1 에서 제조한 전(全) RNA 1 ㎍ 을 10×PCR 완충액, 100 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.3) 및 500 mM 염화 칼륨으로 된 용액 2 ㎕, 25 mM 염화 마그네슘 4 ㎕, 1 mM dNTP 믹스 8 ㎕, RNase 억제제 1 단위/㎕ 함유의 용액 1 ㎕, 역전사 효소 2.5 단위/㎕ 함유의 용액 1 ㎕ 및 2.5 M 랜덤 헥사머 (random hexamer) 1 ㎕ 와 혼합한 후, 여기에 물을 혼합하여 전체 체적을 20 ㎕ 되게 하였다. 이 혼합액을 0.5 ml 용량의 반응관에 넣고 통상의 방법으로 25℃ 에서 10 분, 42℃ 에서 30 분, 99℃ 에서 5 분 및 5℃ 에서 5 분의 순서로 연속적으로 인큐베이트하여 역전사 효소반응을 시킨 다음 제 1 스트랜드 cDNA 를 함유하는 수용액을 회수하였다.
이 수용액 20 ㎕ 에 25mM 염화 마그네슘 4 ㎕, 10×PCR 완충액 8 ㎕, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 (미합중국의 Perkin-Elmer 사 판매) 2.5 단위/ml 함유 용액 0.5 ㎕ 및 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머로서의 프라이머 1 및 2 를 각각 1 pmole 씩 가하고, 이 혼합액을 멸균 증류수로 100 ㎕ 로 하였다. 이 혼합액을 통상의 방법으로 94℃ 에서 1 분, 45℃ 에서 2 분, 72℃ 에서 3 분의 순서로 연속적으로 인큐베이트하는 사이클을 40 회 반복하여 반응시켜 제 1 스트랜드 cDNA 를 주형으로 하여 이 폴리펩티드를 부분 코우드하는 DNA 단편을 증폭하였다. 프라이머 1 및 프라이머 2 는 SEQ ID NO:4 및 5 의 아미노산 배열 Pro-Glu-Asn-Ile-Asp-Asp-Ile 및 Phe-Glu-Asp-Met-Thr-Asp-Ile 에 근거하여 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오티드인데 5'-ATRTCRTCDATRTTYTCNGG-3' 및 5'-TTYGARGAYATGACNGAYAT-3' 의 염기배열을 가지고 있었다.
수득한 PCR 생성물의 일부를 2 w/v % 아가로오스 겔에서 전기영동하여 분획하고, 나일론 막위에 옮겨 0.4 N 수산화 나트륨으로 고정하고, 2×SSC 로 세척하여 공기중에서 건조후 5×SSPE, 5×덴하트르액 (Denhard's solution), 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 100 ㎍/ml 을 함유한 프리하이브리다이제이션 액중에 침지하여 65℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 5'-TTYGARGARATGGAYCC-3' 의 염기배열을 가진 프로우브 1 로서의 올리고뉴클레오티드를 SEQ ID NO:4 의 아미노산 배열 Phe-Glu-Glu-Met-Asp-Pro 에 근거하여 합성하고 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지하였다.
SEQ ID NO:4 :
프로우브 1 을 1 pmole, 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 100 ㎍/ml 을 함유한 용액중에 나일론막을 침지하여 45℃ 에서 24 시간 인큐베이트하여 하이브리다이제이션시켰다. 수득한 나일론막을 6×SSC 로 세척후 통상의 방법으로 오토라디오그래피 처리한 결과, PCR 생성물 중에는 목적의 DNA 단편이 함유되어 있음이 판명되었다.
나머지 PCR 생성물을 플라스미드 벡터 " pT7 BLUE T " (일본국의 Takara Shuzo 사 판매) 50 ng 및 적당량의 T4 리가아제와 혼합하고, 다시 100 mM ATP 를 가해 농도 1 mM 로 한 후 16℃ 에서 18 시간 인큐베이트하여 DNA 단편을 플라스미드 벡터속에 삽입하였다. 이렇게 하여 수득한 재조합 DNA 를 에쉐리히아 콜리 NoVa Blue 주 (스웨덴국의 Pharamacia LKB Biotechnology AB 판매) 에 도입하여 형질 전환체를 얻은 다음, 이 형질 전환체를 10 g/ℓ 박토트립톤, 2.5 g/ℓ 염화 나트륨, 15 g/ℓ 박토-한천, 100 mg/ℓ 앰피실린, 40 mg/ℓ X-Gal 및 23.8 mg/ℓ 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (이하, 간단히 " IPTG " 라 함) 를 함유한 플레이트 배지에 접종하고 37℃ 에서 24 시간 배양하여 콜로니를 형성시켰다.
통상의 방법으로 플레이트 배지위에 나일론막을 올려놓고 약 30 초 동안 방치하여 나일론막에 콜로니를 부착시킨 다음, 나일론막을 플레이트에서 떼어내어 0.5 N 수산화 나트륨과 1.5 M 염화 나트륨을 함유한 용액중에서 7 분간 침지하여 용균 (cell lysis) 하였다. 이어서, 다시 나일론막을 1.5 M 염화나트륨 함유의 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 7.2) 중에 3 분 침지하고 2×SSC 로 세척후 0.4 N 수산화 나트륨중에 20 분간 침지하여 DNA 를 고정하고, 5×SSC 로 세척하고 공기중에서 건조하여 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 100 ㎍/ml 의 변성 연어 정자 DNA 를 함유한 프리하이브리다이제이션 용액중에 침지하여 65℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다.
나일론막 위에 형성된 콜로니를 통상의 방법으로 프로우브 1 로 하이브리다이즈시키고 6×SSC 로 세척후 위에서와 마찬가지로 오토라디오그래피 처리한 다음 프로우브 1 과 강력히 하이브리다이즈된 형질 전환체를 선택하였다.
이 형질 전환체를 앰피실린 100 ㎍/ml 을 함유한 L-브로스(L-broth) 배지 (pH 7.2) 에 접종하고, 37℃ 에서 18 시간 배양후 배양물로 부터 균체를 채취하여 통상의 알칼리-SDS 법으로 재조합 DNA 를 채취하였다. 디데옥시법으로 분석한 결과, 이 재조합 DNA 는 SEQ ID NO:3 의 염기 배열의 85∼281 번째에 상당하는 염기배열로 구성된 DNA 단편을 가지고 있었다.
실시예 A-3-3 : mRNA 제조
실시예 A-3-1 에서 제조한 전 RNA 를 함유한 수용액 0.05 ml 을 시험관에 넣고, 여기에 1 mM EDTA 와 0.1 w/v ％ SDS 를 함유한 10 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 0.5 ml 을 가하여 멸균 증류수로 전체량을 1 ml 로 하였다.
이 혼합물에 올리고-d(T)30 라텍스 " OLIGOTEX-dT30 SUPER " (일본국의 Nippon Roche 사 판매) 을 1 ml 가한 다음 65℃에서 5 분간 인큐베이트하여 RNA 를 변성시키고 얼음 냉각욕중에서 3 분간 냉각하였다. 수득한 혼합물을 5 M 염화 나트륨 0.2 ml 와 혼합하여 37℃ 에서 10 분간 인큐베이트한 후 10,000 rpm 및 25℃ 에서 10 분간 원심분리하였다. 펠릿 형상의 침전물을 멸균 증류수 0.5 ml 중에 현탁하고 65℃ 에서 5 분간 인큐베이트하여 올리고-d(T)30 라텍스로 부터 mRNA 를 추출하였다. 이 mRNA 의 수득량은 약 5 ㎍ 이었다.
실시예 A-3-4 : cDNA 라이브러리 제조
cDNA 클로닝 키트인 " cDNA SYNTHESIZING SYSTEM PLUS " (미합중국의 Amersham 사 판매) 를 사용하여 실시예 A-3-3 의 mRNA 로 부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 그 방법은 다음과 같다. 1.5 ml 용량의 반응관에 제 1 스트랜드 cDNA 합성용 용액 4 ㎕, 피로인산 나트륨 용액 1 ㎕, 인간 태반 리보뉴클레아제 억제제 용액 1 ㎕, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 믹스 2 ㎕ 및 올리고-d(T)16 프라이머 1 ㎕ 을 연속적인 순서로 가하고, 수득한 혼합물을 실시예 A-3-3 의 mRNA 2 ㎕ 와 혼합하였다. 여기에 멸균 증류수를 가해 전체량을 19 ㎕ 로 한 후 역전사 효소 20 단위를 함유한 용액을 1 ㎕ 가하고 42℃ 에서 40 분간 인큐베이트하여 제 1 스트랜드 cDNA 를 함유한 반응 혼합물을 얻었다.
이렇게 하여 수득한 혼합물에 제 2 스트랜드 cDNA 합성용 용액 37.5 ㎕, 에쉐리히아 콜리 유래의 리보뉴클레아제 H 0.8 단위, DNA 폴리머라아제 23 단위를 가하여 혼합하고 멸균 증류수로 100 ㎕ 로 한 후 12℃ 에서 60 분간, 22℃ 에서 60 분간 인큐베이트하고, T4 DNA 폴리머라아제를 2 단위 가하여 37℃ 에서 10 분간 인큐베이트하여 제 2 스트랜드 cDNA 를 함유한 반응 혼합물을 얻었다. 이 반응 혼합물에 0.25 M EDTA (pH 8.0) 를 4 ㎕ 가하여 반응을 정지시키고, 수득한 혼합물을 통상의 방법으로 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 처리하여 목적의 cDNA 를 침전시켜 회수하였다.
이렇게 하여 수득한 cDNA 에 L/K 완충액 2 ㎕, Eco RI 어댑터 250 pmole 및 T4 DNA 리가아제 2.5 단위의 순서로 가한 다음, 이 용액에 멸균 증류수를 가해 20 ㎕ 로 하였다. 이 혼합물을 15℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 Eco RI 어댑터를 cDNA 의 양단에 연결하였다. 이 반응 혼합물에 0.25 M EDTA 2 ㎕ 을 가하여 잔존 효소를 실활한후 분자체 크로마토그래피로 처리하여 미반응 Eco RI 어댑터를 제거하였다. 수득한 생성물에 L/K 완충액 40 ㎕, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 80 단위를 가하고, 이 혼합물을 멸균 증류수와 혼합하여 400 ㎕ 로 한 다음, 37℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 Eco RI 절단부위를 메틸화하였다. 수득한 반응 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 처리하여 목적의 DNA 를 침전시켜 회수하였다. 이 DNA에 적당량의 λgt 10 arm 을 함유한 L/K 완충액 1.5 ㎕ 와 T4 DNA 리가아제 2.5 단위를 가하고, 여기에 멸균 증류수를 혼합하여 15 ㎕ 로 한 다음 15℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 연결한 후 종래의 생체외 패키징법 (in vitro packaging method) 으로 처리하여 재조합 DNA 를 함유한 파아지 (phage) 를 얻었다.
실시예 A-3-5 : 재조합 DNA의 클로닝
에쉐리히아 콜리 NM514 주의 종배양액에 실시예 A-3-4 의 파아지를 통상의 방법으로 감염시킨 후, 감염된 균체를 10 g/ℓ 박토-트립톤, 5 g/ℓ 박토-효모엑스, 10 g/ℓ 염화 나트륨 및 15 g/ℓ 박토-한천을 함유한 한천 배지 (pH 7.0) 에 접종한 다음 37℃ 에서 16 시간 배양하여 플라아크를 형성시켰다.
한천배지에 나일론막을 씌워 약 3 0초 동안 방치하여 나일론막에 플라아크를 부착시켰다. 이 나일론막을 한천배지에서 떠어내어 0.5 M 수산화 나트륨과 1.5 M 염화 나트륨을 함유한 수용액중에 7분 동안 침지하고, 이어서 1.5 M 염화 나트륨을 함유한 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 7.0) 중에 3 분간 침지하였다. 이 나일론막을 2×SSC 로 세척하고 공기중에서 건조후 0.4 N 수산화 나트륨중에 20 분간 침지한 다음 5×SSC 로 세척하고, 공기중에서 건조한 후 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 100 ㎍/ml 을 함유한 용액중에 침지하여 다음, 65℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 이어서, 수득한 나일론막을 실시예 A-3-2 에서 제조한 DNA 단편을 DNA 표지키트 (미합중국의 Amersham 사제의 " READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM ") 로 32P 표지하여 프로우브 2 로 한 것 적당량과, 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 100 ㎍/ml 을 함유한 용액중에서 침지하여 65℃ 에서 20 시간 인큐베이트하여 하이브리다이제이션시켰다. 수득물을 위와 마찬가지로 오토라디오그래피 처리하여 프로우브 2 와 강력히 하이브리다이즈된 파아지 DNA 클론을 선택하였다.
종래의 방법에 따라 이 클론을 에쉐리히아 콜리중에서 증폭한 다음 균체로 부터 재조합 DNA 를 추출하였다. 제한 효소 EcoRI 로 재조합 DNA 를 절단하는 한편, 상기와 동일한 제한 효소로 플라스미드 벡터 pUC19 (ATCC 37254) 를 절단하고, 수득한 절단된 DNA 단편과 플라스미드 단편을 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA 를 얻은 다음, 종래의 컴피턴트셀법으로 에쉐리히아 콜리 JM109 주 (ATCC 53323) 에 도입하여 형질 전환체를 얻었다.
실시예 A-3-6 : DNA 염기배열과 폴리펩티드의 아미노산 배열의 결정
실시예 A-3-5 의 형질 전환체를 L-브로즈 배지 (pH 7.2) 에 접종하고 37℃ 에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양하였다. 증식시킨 균체를 채취하여 종래의 알칼리-SDS 법으로 처리하여 본 발명의 DNA 를 함유한 재조합 DNA 를 얻었다. 형광 광도계를 사용하는 자동 시퀀서로 분석한 결과, 재조합 DNA 에는 SEQ ID NO:3 의 염기배열을 가지고 있음이 판명되었다. 이 염기배열을 해독한 결과, SEQ ID NO:3 의 아미노산 배열을 코우드하고 있는 것이 시사되었다. 이 아미노산 배열은 SEQ ID NO:3 의 79∼103 번째 및 26∼43 번째의 아미노산에 상응한 SEQ ID NO:4 및 5 의 부분 아미노산 배열을 가지고 있는데, 이것은 마우스에 있어서 SEQ ID NO:3 의 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드가 마찬가지로 SEQ ID NO:3 (여기서 " Xaa " 는 "메티오닌 " 또는 "트레오닌 "을 뜻함)의 DNA 에 의해 코우드되어 있음을 나타내고 있다.
SEQ ID NO:5 :
아래의 실시예 A-4 ∼ A-7 에 있어서, SEQ ID NO:3 의 염기배열의 DNA 단편을 프로우브로 사용하여 인간 간장 mRNA 로 부터 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 또 다른 폴리펩티드를 코우드 하는 cDNA 를 제조한다. 이 cDNA의 염기배열을 분석하여 해독함으로써 이 폴리펩티드의 아미노산 배열을 결정하였다. cDNA 를 에쉐리히아 콜리중에서 발현시킨 다음 생성된 폴리펩티드의 성상과 성질을 조사하였다.
실시예 A-4 :
폴리펩티드를 코우드하는 DNA 의 염기배열과 폴리펩티드의 아미노산 배열
실시예 A-4-1 : cDNA 라이브러리 제조
cDNA 클로닝 키트 " cDNA SYTHESIZING SYSTEM PLUS " (미합중국의 Amersham 사 판매) 를 사용하여 " POLY A " (프랑스국의 Clonatec-BIOSOFT 사 판매) 가 부가된 인간의 간장 RNA 로 부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 그 방법은 다음과 같다. 1.5 ml 용량의 반응관에 제 1 스트랜드 cDNA 합성용 용액 10 ㎕, 1 mM 피로인산 나트륨 2.5 ㎕, 인간 태반 리보뉴클레아제 억제제 1 ㎍/ℓ 함유 용액 2.5 ㎕, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스 1 ㎍/ℓ 함유 용액 5 ㎕, 올리고-dT 프라이머 1 ㎍/ℓ 함유 용액 2.5 ㎕, 폴리(A)부가 인간 간장 RNA 5 ㎕ 을 연속적으로 가하고, 멸균 증류수로 45 ㎕ 로 하였다. 이어서, 이 혼합물에 역전사 효소 100 단위를 함유한 용액 5 ㎕ 을 혼합하여 42℃ 에서 40 분간 인큐베이트하여 제 1 스트랜드 cDNA 를 함유한 반응 혼합물을 얻었다.
이 반응 혼합물에 제 2 스트랜드 cDNA 합성용 용액 93.5 ㎕, 에쉐리히아 콜리 유래의 리보뉴클레아제 H 4 단위, DNA 폴리머라아제 115 단위를 가하고 멸균 증류수로 250 ㎕ 로 하였다. 수득한 혼합물을 12℃ 에서 60 분간, 22℃ 에서 60 분간, 70℃ 에서 10 분간 연속적으로 인큐베이트 한 후 T4 폴리머라아제 10 단위를 혼합하고 다시 37℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이 반응 혼합물에 0.25 M EDTA (pH 8.0) 를 10 ㎕ 가하여 반응을 정지시키고 통상의 방법으로 페놀과 클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 처리하여 목적의 제 2 스트랜드 cDNA 를 침전시켜 회수하였다.
이렇게 수득한 제 2 스트랜드 cDNA 에 L/K 완충액 (pH 8.0) 2 ㎕, Eco RI 어댑터 250 pmole 및 T4 DNA 리가아제 2.5 단위를 가하고 멸균 증류수로 20 ㎕ 로 한 후 15℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 Eco RI 어댑터를 cDNA의 양단에 연결하였다. 수득한 혼합물을 0.25 M EDTA 2 ㎕와 혼합하여 반응을 정지시킨 후 분자체 크로마토그래피로 처리하여 미반응 Eco RI 어댑터를 제거하였다. 이 수득물에 L/K 완충액 (pH 8.0) 40 ㎕ 와 T4 폴리뉴클레오티드키나아제 80 단위를 가한 다음 이 혼합물에 멸균 증류수를 가해 400 ㎕ 로 하여 37℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 Eco RI 절단부위를 메틸화하였다. 수득한 혼합물을 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 처리하여 목적의 cDNA 를 침전시켜 회수하였다. 이 cDNA 에 적당량의 λgt 10 arm 를 함유한 L/K 완충액 (pH 8.0) 1.5 ㎕ 와 T4 DNA 리가아제 2.5 단위를 가한 다음 멸균 증류수를 혼합하여 전체량 15 ㎕ 로 한 후 15℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여 연결하고, 종래의 생체외 패키징법으로 처리하여 재조합 λDNA 를 함유한 파아지를 얻었다.
실시예 A-4-2 : 재조합 DNA 의 클로닝
통상의 방법으로 에쉐리히아 콜리 NM514 주에 실시예 A-4-1 에서의 파아지를 감염시킨 후 감염된 균체를 10 g/ℓ 박토-트립톤, 5 g/ℓ 박토-효모엑스, 10 g/ℓ 염화 나트륨 및 15 g/ℓ 박토-한천을 함유한 한천 배지 (pH 7.0) 에 접종하고 37℃ 에서 16 시간 배양하여 플라아크를 형성시켰다. 종래의 방법에 따라 한천 배지를 나일론막으로 씌우고 약 30 초 동안 방치하여 나일론막에다 플라아크를 부착시켰다. 이어서, 나일론막을 한천 배지에서 떼어내고 0.5 N 수산화 나트륨과 1.5 M 염화 나트륨을 함유하는 수용액에 7 분 동안 침지하고, 이어서 1.5 M 염화 나트륨을 함유한 0.5 M 트리스-염산 완충액 (pH 7.0) 중에 3 분간 침지하였다. 이 나일론막을 2×SSC 로 세척하고 공기중에서 건조하여 0.4 N 수산화 나트륨중에 20 분간 침지하고 5×SSC 로 세척하여 공기중에서 건조한 후 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 를 함유한 용액중에 침지하여 65℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 목적의 재조합 DNA 를 클로닝하기 위해 SEQ ID NO:3 의 염기 배열을 가진 DNA 단편을 DNA 표지 키트 " READY PRIME DNA LABELLING SYSTEM " (미합중국의 Amersham 사 판매) 하여 32P 로 표지하여 프로우브 3 을 제조하였다.
그 방법은 다음과 같다. 1.5 ml 용량의 반응관에 실시예 A-3-5 의 방법으로 제조한 DNA 단편 25 ng 를 넣고 멸균 증류수로 45 ㎕ 로 한 후 95℃ 에서 3 분간 인큐베이트하고 다른 반응관에 옮겼다. 이 반응관에 [α-32P]dCTP 5 ㎕ 을 가하고 37℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 표지한 후, 표지된 DNA 단편을 함유한 생성물을 종래의 분자체 크로마토그래피로 처리하여 미반응 [α-32P] 를 제거하였다.
위의 나일론막을 5×SSPE, 5×덴하르트액, 0.5 w/v ％ SDS 및 변성 연어 정자 DNA 100 ㎍/ml 을 함유한 혼합액중에 침지하여 60℃ 에서 20 시간 인큐베이트함으로써 하이브리다이제이션시킨 후, 실온하에서 6×SSC 에서 20 분간, 그리고 2×SSC 에서 20 분간 인큐베이트하였다. 수득물을 세척하고 위에서와 마찬가지로 오토라디오그래피 처리하여 프로우브 3 으로 강력히 하이브리다이즈된 파아지 DNA 클론을 선택하였다. 종래의 방법으로 DNA 클론을 에쉐리히아 콜리에서 증폭한 다음 균체로 부터 재조합 DNA 를 추출하였다. 이 재조합 DNA 를 제한 효소 Eco RI 로 절단하였다. 동일한 제한 효소로 플라스미드 벡터 pUC19 (ATCC 37254) 를 절단하고, 절단된 DNA 단편과 플라스미드 단편을 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA 를 얻은 다음, 이것을 종래의 컴피턴트셀법으로 에쉐리히아 콜리 JM109 주 (ATCC 53323) 에 도입하여 본 발명의 DNA 를 함유한 형질 전환체를 얻었다.
실시예 A-4-3 : 폴리펩티드의 아미노산 배열과 염기배열의 결정
실시예 A-4-2 의 형질 전환체를 앰피실린 50 ㎍/ml 을 함유하는 L-브로스 배지 (pH 7.2) 에 접종하고 37℃ 에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양하였다. 증식된 균체를 원심분리하여 채취하고 종래의 알칼리-SDS 법으로 처리하여 재조합 DNA 를 추출하였다. 형광 광도계를 사용하는 자동 시퀀서로 염기배열을 분석한 결과, 재조합 DNA 는 SEQ ID NO:6 의 염기배열을 함유하고 있었다. 이 염기배열로 부터 추정되는 아미노산 배열은 SEQ ID NO:6 에 나와 있는데, 이것은 본 발명의 폴리펩티드가 예컨대 SEQ ID NO:1 의 아미노산 배열을 가지고 있고, 이 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 염기배열의 DNA 에 의해 코우드되어 있음을 시사하고 있다. SEQ ID NO:6 에 있어서 " Xaa " 로 나타낸 아미노산은 " 이소로이신 " 또는 "트레오닌 " 을 뜻한다.
실시예 A-5 : 복제가능한 재조합 DNA 와 형질 전환체 제조
0.5 ml 용량의 반응관에 25 mM 염화 마그네슘 8 ㎕, 10×PCR 완충액 10 ㎕, 1 mM dNTP 믹스 8 ㎕, 2.5 단위/㎕ AmpliTag DNA 폴리머라아제 함유 용액 0.5 ㎕ 및 실시예 A-4-2 의 재조합 DNA 1 ng 를 가하였다. 수득한 혼합물에 SEQ ID NO:1 의 N 말단 및 C 말단 부근의 염기배열에 근거하여 화학적으로 합성한 5' -CGAGGGATCCTACTTTGGCAAGCTTG-3' 및 5' -CAAGGAATTCCTAGTCTTCGTTTTG-3' 로 나타내어지는 염기배열을 가진 두종류의 올리고뉴클레오티드를 각각 센스 프라이머 또는 안티센스 프라이머로 하여 적당량 가하고, 멸균 증류수로 전체량 100 ㎕ 로 하였다. 수득한 혼합물을 통상의 방법으로 94℃ 에서 1 분, 60℃ 에서 2 분, 72℃ 에서 3 분 동안 연속적으로 인큐베이트하는 사이클을 40 회 반복하여 PCR 생성물을 얻은 다음, 제한 효소 Bam HI 및 Eco RI 로 절단하여 Bam HI-Eco RI DNA 단편을 얻었다. 수득한 Bam HI-Eco RI DNA 단편에 적당량의 멸균 증류수를 혼합한 다음, 이 용액에 미리 제한 효소 Bam HI 및 Eco RI 로 절단해 둔 플라스미드 벡터 " pGEX-2T " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechno-logy AB 판매) 10 ng, 10×연결용 완충액 (ligation buffer) 10 ㎕ 및 적당량의 10 mM ATP 를 가하여 최종 농도 1 mM 로 한 다음 16℃ 에서 18 시간 인큐베이트하여 복제가능한 재조합 DNA pHIGIF 을 얻었다.
재조합 DNA pHIGIF 을 에쉐리히아 콜리 DH5α 주 (일본국의 Toyobo 사 판매) 에 도입하고, 수득한 형질 전환체 " HIGIF " 을 앰피실린을 50 ㎍/ml 함유하는 L-브로스 배지 (pH 7.2) 에 접종하여 37℃ 에서 18 시간 진탕 조건하에 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 증식된 형질 전환체를 얻은 다음 종래의 알칼리-SDS 법으로 처리하여 재조합 DNA pHIGIF 을 추출하였다. 이 재조합 DNA pHIGIF 를 디데옥시법으로 분석한 결과 제 2 도에 있는 바와 같이 SEQ ID NO:2 의 cDNA, 즉 " HIGIF cDNA " 가 Tac 프로모우터 및 글루타티온 S-트란스퍼라아제 유전자의 하류의 부위에 연결되어 있음이 확인되었다.
실시예 A-6 : 형질 전환체로 부터 폴리펩티드의 생산
실시예 A-5 의 형질 전환체 HIGIF 를 앰피실린 50 ㎍/ml 함유의 T-브로스 배지 (pH 7.2) 에 접종하고 37℃ 에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양하여 종배양물을 얻었다. 신선한 T-브로스 배지 (pH 7.2) 를 18 리터 취하여 30 리터 용량의 자아 퍼멘터에 넣고 종배양물 1 v/v ％ 을 접종한 후, 통기 교반 조건하에 37℃ 에서 배양하였다. 배양도중 배양물을 채취하여 파장 650 nm 에서의 흡광도를 모니터링하면서 흡광도가 약 1.5 에 도달했을 때 농도 0.1 mM 되도록 배양물에 IPTG 를 가하였다. 이어서, 배양물을 다시 5 시간 배양한 후 원심분리하여 배양물로 부터 균체를 분리하였다. 이 균체를 139 mM 염화 나트륨, 7 mM 인산 수소 2 나트륨 및 3 mM 인산 2 수소 나트륨을 함유한 혼합액 (pH 7.2) 중에 부유시키고 통상의 방법으로 초음파 처리한 후 원심분리하여 상청액을 얻었다. 상청액을 139 mM 염화 나트륨, 7 mM 인산 수소 2 나트륨 및 3 mM 인산 2 수소 나트륨을 함유한 혼합액 (pH 7.2) 으로 미리 평형화시켜 둔 " GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 의 칼럼에 가하였다. 이 칼럼을 신선한 동일 혼합액으로 세척하고 이 칼럼의 겔 1 ml 에 대해 트롬빈을 100 U 가하여 실온에서 16 시간 동안 칼럼을 방치하여 효소분열 반응시켰다. 이 칼럼에 신선한 동일 혼합액을 가하여 반응 생성물을 용출시키고, 이 용출물을 " SUPERDEX 75 " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 의 칼럼에 가한 다음 18,500 달톤 부근에 해당하는 획분을 회수하였다. 이 획분을 한데 모아 농축하고 동결 건조하여 본 발명의 폴리펩티드를 함유한 고형물을 배양물 1 리터당 약 80 ㎍ 의 수득량으로 얻었다.
실시예 A-7 : 폴리펩티드의 물리화학적 성질
실시예 A-7-1 : 분자량
실시예 A-6 의 방법으로 제조한 정제 폴리펩티드를 문헌 [U. K. Laemmli, Nature, Vol.227, pp.680∼685 (1970)] 에 보고된 방법에 따라 환원제가 함유되지 않은 소디움 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 약 18,500 ± 3,000 달톤에 상당하는 위치에서 IFN-γ 유도능을 가진 단일의 단백질 밴드를 주로 얻었다. 이 실험에 사용된 마아커 단백질은 소혈청 알부민 (MW = 67,000 달톤), 오브알브민 (MW = 45,000 달톤), 대두 트립신 억제제 (MW = 20,100 달톤) 및 α-락토알부민 (MW = 14,400 달톤) 이었다.
실시예 A-7-2 : 등전점
실시예 A-6 의 정제 폴리펩티드를 크로마토포커싱 처리하여 약 4.9 ± 1.0 의 등전점을 얻었다.
실시예 A-7-3 : N 말단 아미노산 배열
단백질 시퀀서 " MODEL 473 A " (미합중국의 Perkin-Elmer 사 판매) 을 사용하여 실시예 A-6 의 정제 폴리펩티드를 분석한 결과, 이 정제 폴리펩티드는 글루타티온 S-트란스퍼라아제의 부가 및 트롬빈에 의한 분열에 의하여 SEQ ID NO:7 의 N 말단 아미노산 배열에서의 티로신 잔기에 " Gly-Ser- " 로 나타내어지는 펩티드가 결합된 구조를 가지고 있었다.
SEQ ID NO:7 :
실시예 A-7-4(a) : 생물학적 작용
8 주령의 암컷 C3H/HeJ 마우스로 부터 비장을 적출하여 혈청 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 중에 부유시키고, 수득한 세포를 신선한 동일 배지로 세척한 후 Gey 완충액 (pH 8.0) 중에 침지하여 용혈 (hemolysis) 시켰다. 수득한 비장 세포를 10 v/v ％ 소혈청을 보충한 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 중에 세포 밀도 1×107 개/ml 가 되도록 부유시켰다. 이 세포 부유물 10 ml 을 취하여 직경 9 cm 의 플라스틱제 페트리 접시에 나누어 넣고 5 v/v ％ CO2 인큐베이터 중에서 37℃ 에서 1 시간 배양하였다. 수득한 배양물중에 부유하는 세포만을 채취하여 10 v/v ％ 소혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 세척한 후 아래의 IFN-γ 유도시험에 사용하였다.
10 v/v ％ 소혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 중에 세포 밀도 1×107 개/ml 가 되도록 마우스 비장 세포를 분산시키고, 이중 0.15 씩을 취하여 96 웰 마이크로플레이트에 주입한 다음, 각 웰에 신선한 동일 배지로 희석시킨 정제 폴리펩티드 용액 0.05 ml 을 가하고, 2.5 ㎍/ml 의 콘카나발린 A 또는 50 단위/ml 의 인터로이킨 2 를 0.05 ml 가하거나 가하지 않고 5 v/v ％ CO2 인큐베이터중에서 37℃ 에서 24 시간 배양하였다.
배양종료후 각 웰의 상청액을 0.1 ml 씩 채취하여 생성된 IFN-γ 의 활성을 효소 면역 측정법으로 측정하였다. 대조로서 정제 폴리펩티드, 콘카나발린 A 및 인터로이킨 2 를 사용하지 않은 외에는 위의 계와 동일한 계를 만들어 마찬가지로 처리하였다. IFN-γ 표준품으로서는 미합중국의 국립공중위생 연구소 (NIH) 로 부터 입수한 표준 마우스 IFN-γ (Gg02-901-533) 을 사용하였고, 활성은 국제 단위 (IU) 로 나타내었다. 그 결과는 표 1 에 나와 있다.
표 1
(주) : 표에서 " 시료 " 라 람은 본 발명의 폴리펩티드를 뜻함.
실시예 A-7-4(b) : 인간 임파구로 부터의 IFN-γ 생산의 유도
헤파린이 들어 있는 주사기를 사용하여 건강한 공여자의 혈액을 채취한 다음 혈청 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 2 배 희석하고, 피콜 (Ficoll) 위에 가한 후 2,000 rpm 에서 20 분간 원심분리하여 임파구를 얻었다. 이 임파구를 10 v/v ％ 소혈청의 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 세척하고 신선한 동일 배지에 세포 밀도 5×106 개/ml 가 되도록 부유시키고, 미합중국의 국립공중위생 연구소로 부터 입수한 인간 IFN-γ 표준품 (Gg23-901-530) 을 IFN-γ 표준품으로 사용한 것 외에는 실시예 A-7-4(a) 와 마찬가지로 처리하였다. 그 결과는 표 2 에 나와 있다.
표 2
(주) : 표에서 " 시료 " 라 함은 본 발명의 폴리펩티드를 뜻함.
표 1 및 표 2 의 결과로 부터 본 발명의 폴리펩티드는 인간 및 마우스를 포함한 포유동물의 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 활성을 가지고 있음이 명백함을 알 수 있다. 대조군에 있어서는 유의(有意)한 IFN-γ 생산은 보이지 않았으나 폴리펩티드가 첨가된 계에서는 유의한 IFN-γ 생산이 관찰되었다. 이러한 본 발명의 폴리펩티드의 활성은 보인자로서 콘카나발린 A 또는 인터로이킨 2 를 병용하면 현저하게 증강됨이 판명되었다.
실시예 A-7-4(c) : 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 의 생산
헤파린화된 주사기로 건강한 지원자로 부터 혈액을 채취하여 혈정 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 2 배 희석하였다. 희석된 혈액을 피콜위에 가하고 원심분리하여 임파구를 얻은 다음, 이 임파구를 10 v/v ％ 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 세척한 후 신선한 동일 배지에 세포 밀도 5×106 개/ml 가 되도록 부유시켰다. 이 세포 부유액을 96 웰 마이크로플레이트에 0.15 ml/웰씩 나누어 넣었다. 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 10 v/v ％ 소태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.4) 로 적당한 농도로 희석하고, 이 희석액을 마이크로플레이트에 0.05 ml/웰씩 나누어 넣은 후, 마이크로플레이트에 2.5 ㎍/ml 의 콘카나발린 A 또는 50 단위/ml 의 재조합 인간 인터로이킨 2 를 첨가하거나 첨가하지 않은 신선한 동일 배지를 0.05 ml/웰씩 가하여 37℃ 에서 24 시간 동안 5 v/v ％ CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양후 각 웰의 배양 상청액을 0.1 ml 씩 채취하여 종래의 효소면역 측정법으로 IFN-γ 함량을 측정하였다. 대조로서 폴리펩티드 무함유의 계를 만들어 위에 나온 바와 마찬가지로 처리하였다. 그 결과는 표 3 에 나와 있다. 표중에서 IFN-γ 함량은 미합중국 국립공중위생 연구소로 부터 입수한 IFN-γ 표준품 (Gg23-901-530) 을 사용하여 보정하여 국제단위 (IU) 로 나타내었다.
표 3
표 3 의 결과로 부터 폴리펩티드를 이들에 작용시키면 면역담당 세포로서의 임파구는 IFN-γ 를 생산하였음을 알 수 있다. 또한, 이들 결과로 부터 명백한 바와 같이 보인자로서 인터로이킨 2 또는 콘카나발린 A 를 폴리펩티드와 병용하면 IFN-γ 생산이 증가하였음을 알 수 있다.
실시예 A-7-4(d) : NK 세포에 의한 세포독성의 증가
헤파린화된 주사기로 건강한 지원자로 부터 혈액을 채취하여 140 mM 염화 나트륨을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.4) 으로 2 배 희석하였다. 혈액을 퍼콜 (PERCOLL) 위에 가하고 원심분리한 후 퍼콜 기울기 원심분리하여 고밀도 임파구를 얻었다.
이 임파구를 세포밀도 1×106 개/ml 가 되도록 10/ml 카나마이신, 5×10-5 M 2-메르캅토에탄올 및 10 v/v ％ 소태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지 (pH 7.2)에 부유시켜 12 웰 마이크로플레이트에 0.5 ml/웰씩 나누어 넣었다. 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 신선한 동일 배지로 적당히 희석하여 마이크로플레이트에 1.5 ml/웰씩 나누어 넣은 다음 이 마이크로플레이트에 재조합 인간 인터로이킨 2 를 50 단위/ml 가하거나 가하지 아니한 신선한 동일 배지를 0.5 ml/웰씩 가한 후 5 v/v ％ CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 24 시간 배양하고, 140 mM 염화 나트륨을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 7.4) 으로 마이크로플레이트를 세척하여 효과 세포로서의 NK 세포를 함유한 배양된 임파구를 얻었다.
통상의 방법으로 51Cr 로 표지한 NK 세포 감수성 표적 세포로서의 인간 만성 골수성 백혈병 유래의 K-562 세포 (ATCC CCL 243) 를 96 웰 마이크로플레이트에 1×104 개/웰씩 취하고, 위에서 제조한 효과 세포를 효과 세포 : 표적 세포의 비를 2.5 : 1, 5 : 1 또는 10 : 1 로 하여 각 웰에 가하여 5 v/v ％ CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 4 시간 배양하였다. 종래의 방법에 따라 각 웰의 각 상청액의 방사능을 측정하여 사멸한 표적 세포의 수를 계산하였다. 각각의 계에 있어서 표적 세포수에 대한 사멸 표적 세포수의 백분율(％) 을 계산하여 세포독성 레벨을 결정하였다. 그 결과는 표 4 에 나와 있다.
표 4
(주) : * 표에서 " pM " 은 10-12 M 을 뜻함.
표 4 의 결과로 부터 이 폴리펩티드는 NK 세포에 의한 세포독성을 증가시키는 활성을 가지고 있음을 알 수 있다. 표 4 에 있는 바와 같이 인터로이킨 2 가 공존하면 세포독성을 훨씬 더 증가시킨다.
실시예 A-7-4(e) : LAK 세포 생성 유도
통상의 방법으로, 51 Cr 표지된 NK 세포에 대해 비감수성인 표적 세포로서의 인간 Burkitt 임파종 유래의 Raji 세포 (ATCC CCL 86) 를 96 웰 마이크로플레이트에 각각 1×104 개/웰이 되도록 가하고 72 시간 배양하였다. 실시예 A-7-4(d) 에서와 마찬가지로 제조한 효과 세포로서의 LAK 세포를 함유한 배양된 임파구와 표적 세포를 5 : 1, 10 : 1 또는 20 : 1 의 비율로 마이크로플레이트에 가하고, 이 마이크로플레이트를 5 v/v ％ CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 4 시간 배양 한 후, 각 웰 중의 상청액의 방사능을 측정하였다. 실시예 A-7-4(d) 에서와 마찬가지로 세포독성 (％) 을 계산하였다. 그 결과는 표 5 에 나와 있다.
표 5
(주) : * 표에서 " pM " 은 10-12 M 을 뜻함.
표 5 의 결과로 부터 이 폴리펩티드는 LAK 세포의 생성을 유도하는 활성을 가지고 있음을 알 수 있다. 또한, 이들 결과에 나온 바와 같이 인터로이킨 2 가 공존하면 유도가 훨씬 더 많이 증가함을 알 수 있다.
실시예 A-7-4(f) : 급성독성 시험
통상의 방법에 따라, 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드를 8 주령되는 마우스에게 경피, 경구 또는 복강내에 투여하였다. 그 결과, 정제 폴리펩티드의 LD50 은 투여경로에 관계없이 약 1 mg/kg 이상이었다. 이것은 본 발명의 폴리펩티드가 인간에게 투여하기 위한 의약품에 안전하게 배합할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
IFN-γ 는 세균에 대한 감염방어, 악성 종양의 성장 억제 활성 및 면역 조절 활성을 통하여 인간의 생체방어에 깊이 관여하고 있다는 것은 널리 알려져 있다. 위에 나온 바와 같이 IFN-γ 는 인간의 감수성 질환제로서 개발된 것인데, 목적으로 하는 질환, 투여량, 투여경로 및 안전성에 대해서는 실질적으로 연구되어 있다. 문헌 [" Cytokines in Cancer Therapy ", edited by Frances R. Balkwill, translated by Yoshihiko WATANABE (1991), published by Tokyo-Kagaku-Dojin, Tokyo, Japan] 에 기재된 바와 같이 NK 세포, LAK 세포 등의 킬러 세포를 사용하는 치료법을 항종양 면역요법을 비롯하여 각종 인간의 질환에 적용했을 경우, 거의 만족스러운 결과를 얻었다고 보고하고 있다. 최근, 사이토카인을 사용하는 킬러 세포에 의한 세포독성 증가 또는 킬러 세포생성의 유도와 치료효과 사이에 어떤 관계가 있다는 것이 주목되고 있다. 예컨대, T. FUJIOKA가 문헌 [" British Journal of Urology ", Vol.73, No.1, pp.23-31 (1994)] 에서 보고한 바로서는 LAK 세포 및 인터로이킨 2 를 사용한 항종양 면역요법에 있어서 인터로이킨 2 는 LAK 세포 생성을 강력히 유도하며 심각한 부작용을 유발함이 없이 인간의 암에 대해 현저한 암전이 억제 활성을 발휘하였다고 하고 있다.
따라서, 각종 인간의 질환 치료 및/또는 예방에 IFN-γ 와 킬러 세포가 깊이 관여하며, 그 완치 또는 경감에 큰 기여를 하고 있음이 판명되고 있다. 이러한 상황에 있어서 실시예 A-7-4(c) 및 A-7-4(f) 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 폴리펩티드는 심각한 부작용을 유발함이 없이 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하고 NK 세포에 의한 세포독성을 증가시키거나 LAK 세포의 생성을 유도한다. 이들 사실은 본 발명의 감수성 질환제는 심각한 부작용을 유발함이 없이 인간에게 반복 투여 할 수 있고, IFN-γ 및 킬러 세포와 밀접하게 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 만족스러운 효과들 발휘한다는 것을 시사하고 있다.
실시예 B-1 : 하이브리도마 H-1 의 제조
실시예 B-1-1 : 형질 전환체 KGFHH2 의 제조
0.5 ml 용량의 반응관에 25 mM 염화 마그네슘 8 ㎕, 10×PCR 완충액 10 ㎕, 25 mM dNTP 믹스 1 ㎕, 2.5 단위/㎕ 의 AmipliTaq DNA 폴리머라아제 1 ㎕, 파아지 DNA 클론으로 부터 제조한 SEQ ID NO:8 의 염기 배열을 가지며 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 를 가진 재조합 DNA 1 ng 및 SEQ ID NO:1 의 N 말단 및 C 말단 부근의 아미노산 배열에 근거하여 화학적으로 합성한 5' -ATAGAATTCAAATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC-3' 및 5' -ATAAAGCTTCTAGTCTTCGTTTTGAAC-3' 로 나타내어지는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머 적당량을 가하고, 이 혼합액을 멸균 증류수로 전체량 100 ㎕ 로 하였다. 이 혼합액을 통상의 방법으로 94℃ 에서 1 분, 43℃ 에서 1 분, 그리고 72℃ 에서 1 분 동안의 순서로 연속적으로 인큐베이트하는 사이클을 3 회 반복하였다. 수득한 혼합물을 다시 94℃ 에서 1분, 60℃ 에서 1 분, 그리고 72℃ 에서 1 분 동안의 순서로 연속적으로 인큐베이트하는 사이클을 40 회 반복하여 PCR 반응시켰다.
수득한 PCR 반응 혼합물과 플라스미드 벡터 " pCR-Script SK(+) " (미합중국의 Stratagene Cloning Systems 판매) 를 DNA 리가아제로 연결하여 재조합 DNA 를 얻은 다음, 컨피턴트셀법에 의해 에쉐리히아 콜리 " XL-1 Blue MRF'Kan " (미합중국의 Stratagene Cloning System 사 판매) 에 도입하여 미생물을 형질 전환하였다. 이렇게 하여 수득한 형질 전환제를 50 ㎍/ml 앰피실린을 함유한 L-브로스 배지 (pH 7.2) 에 접종하고 37℃ 에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양한 다음 배양물을 원심분리하여 증식된 형질 전환체를 채취하고, 종래의 알칼리-SDS법으로 재조합 DNA 를 분리하였다. 재조합 DNA 의 일부를 취하여 디데옥시법으로 분석한 결과, SEQ ID NO:8 의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 Eco RI 절단부위 및 Hind III 절단부위를 가지며, 또한 SEQ ID NO:8 의 N 말단 및 C 말단의 전후에 대응하는 부위에 폴리펩티드 합성을 개시하는 메티오닌 코돈 및 폴리펩티드 합성을 종결시키는 TAG 코돈을 가진 DNA 를 함유하고 있음이 판명되었다.
SEQ ID NO:8 :
나머지의 재조합 DNA 를 제한 효소 Eco RI 및 Hind III 로 절단하고, DNA 연결 키트 DNA LIGATION KIT Version 2 (일본국의 Takara Shuzo 사 판매) 를 사용하여 수득한 Eco RI-Hind III DNA 단편 0.1 ㎍ 과 위에 나온 제한 효소로 미리 절단해 둔 플라스미드 벡터 " pKK 223-3 " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 판매) 10 ng 을 16℃ 에서 30 분간 인큐베이트하여 복제 가능한 재조합 DNA pKGFHH2 를 얻었다. 컴피턴트셀법에 의해 복제가능한 재조합 DNA pKGFHH2 로 에쉐리히아 콜리 Y1090 주 (ATCC 37197) 를 형질 전환하고, 수득한 형질 전환체 KGFHH2 를 50 ㎍/ml 앰피실린을 함유한 L-브로스 배지 (pH 7.2) 에 접종하여 37℃ 에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 증식된 형질 전환체를 채취하고, 이중 일부를 종래의 SDS-알칼리법으로 처리하여 재조합 DNA pKGFHH2 를 추출하였다. 제 3 도에 있는 바와 같이 디데옥시법으로 분석한 결과, 재조합 DNA pKGFHH2 에 있어서 SEQ ID NO:8 의 염기 배열을 가진 KGFHH2 cDNA 가 Tac 프로모우터의 하류에 연결되어 있었다.
실시예 B-1-2 : 형질전환체 KGFHH2 로 부터의 폴리펩티드 생산
앰피실린 50 ㎍/ml 을 함유한 L-브로스 배지 (pH 7.2) 를 오토클레이브 처리하여 멸균하고, 37℃ 로 냉각하여 실시예 B-1-1 의 형질 전환체 KGFHH2 로 접종한 후 동일 온도에서 18 시간 동안 진탕 조건하에 배양하여 종배양물을 얻었다. 신선한 동일 배지 18 리터를 20 리터 용량의 자아 퍼어멘터 (jar fermenter) 에 넣고 위와 마찬가지로 멸균하여 37℃ 로 냉각한 후 종배양물을 1 v/v ％ 접종한 다음 동일 온도에서 8 시간 동안 통기교반 조건하에 배양하였다. 수득한 배양물을 원심분리하여 균체를 채취한 다음, 150 mM 염화 나트륨, 16 mM 인산 수소 2 나트륨 및 4 mM 인산 2 수소 나트륨으로 된 혼합액 (pH 7.3) 중에 분산시켜 초음파 파쇄한 후 원심분리에 의해 균체 파쇄물을 제거하여 상청액을 얻었다.
이 상청액에 황산 암모늄을 농도 40 w/v ％ 되게 가하고 균일히 용해한 용액을 원심분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액을 먼저 1.5 M 황산 암모늄을 함유한 150 mM 인산 완충액 (pH 6.6) 과 혼합한 후 1.5 M 황산 암모늄을 함유한 10 mM 인산 완충액 (pH 6.6) 으로 미리 평형화시켜둔 " PHENYL SEPHAROSE " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 의 칼럼에 가한 다음, 이 칼럼을 신선한 동일 완충액으로 세척하고, 이 칼럼에 1.5 M 로 부터 0 M 까지의 황산 암모늄 농도 기울기하에서 10 mM 인산 완충액 (pH 6.6) 을 통과시켰다.
황산 암모늄 농도 1.0 M 부근에서 용출한 획분을 모아 멤브레인 여과하고 10 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 에 대하여 4℃ 에서 18 시간 투석한 후 10 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 으로 미리 평형화시켜둔 " DEAE 5PW " (일본국의 Tosoh 사제) 의 칼럼에 가한 다음, 이 칼럼을 신선한 동일 완충액으로 세척하고, 0 M 으로 부터 0.2 M 까지의 염화 나트륨의 직선 농도 기울기하에서 10 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 을 통액하여 염화 나트륨 농도 0.05 M 에서 용출하는 획분을 회수하였다.
이어서, 이 획분을 멤브레인 농축하고, 인산 식염 완충액 (이하, " PBS " 라 함)으로 미리 평형화시켜둔 " SUPER DEX 75 " (스웨덴의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 제) 의 칼럼에 가한 다음, 이 칼럼에 신선한 PBS 를 가하여 약 18,500 달톤에 해당하는 획분을 채취하였다. 따라서, 정제 단백질 약 5.2 mg 을 함유한 수용액을 얻었다. 전체 정제 공정을 통한 총 수득율은 약 10 ％ 이었다.
정제 단백질을 분석한 결과, 다음과 같은 물리화학적 성질을 가지고 있었다. 즉, 환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동 할 경우 정제 단백질은 18,500±3,000 달톤에 상당하는 위치에서 IFN-γ 유도능을 가진 주 단백질 밴드로서 나타난 반면, 크로마토포커싱에 의해서는 4.9±1.0 의 pI 를 나타내었다. 정제 단백질의 N 말단 아미노산 배열을 SEQ ID NO:1 에서 메티오닌이 그 말단에 결합한 것과 동일한 SEQ ID NO:9 의 아미노산 배열을 가지고 있었다.
SEQ ID NO:9 :
실시예 B-1-3 : 하이브리도마 H-1 의 제조
10 주령의 BALB/c 마우스의 복강내에 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드를 완전 프로인트 보조제 (complete Freund adjuvant) 와 더불어 20 ㎍/마우스의 비율로 주사한 후 다시 이 마우스에 2 주 간격으로 동일한 용량으로 2 회 주사하고 최종 주사한지 1 주일후에 동일한 용량으로 정맥 주사한 다음, 이들의 비장을 적출하여 분산시켜 세포 현탁액을 얻었다.
이 비장 세포와 마우스 골수종 유래의 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL 1581) 를 37℃ 로 예열된 RPMI 1640 배지 (pH 7.2) 중에 각각 세포 밀도 3×104 개/ml 및 1×104 개/ml 로 부유시키고, 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 평균 분자량 1,500 달톤의 50 w/v ％ 폴리에틸렌 글리콜을 함유한 혈청 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.2) 1 ml 을 상기 침전물에 1 분에 걸쳐 방울씩 가하고, 이 혼합물을 37℃ 에서 1 분간 인큐베이트한 다음, 이 혼합물에 혈청 무함유의 RPMI 1640 배지 (pH 7.2) 를 전체량 50 ml 가 되게 방울씩 가한 후 원심분리하여 생성된 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 HAT 배지에 분산시켜 96 웰 마이크로플레이트에 각 웰당 200 ㎕ 씩 나누어 넣고 37℃ 에서 1 주 동안 인큐베이트한 다음 하이브리도마를 선택하였다. 각 웰의 상청액중에 분비된 항체의 양을 항체와 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드의 면역반응에 근거한 효소 면역 시험법으로 분석하고, 정제 폴리펩티드와 강력히 반응하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 선택하였다. 이들 하이브리도마를 통상의 방법으로 한계 희석법으로 반복하여 처리함으로써 본 발명의 모노클로날 항체 생산능이 있는 클로닝된 하이브리도마 H-1 세포를 얻었다.
실시예 B-2 : 모노클로날 항체 H-1mAb 제조와 웨스턴 블롯법에 의한 분석
실시예 B-2-1 : 모노클로날 항체 H-1mAb 제조
실시예 B-1-3 의 방법으로 얻은 하이브리도마 H-1 세포를 5 v/v ％ 소혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 (pH 7.2) 중에 세포 밀도 약 1×106 개/ml 되도록 분산시키고, 배양 규모를 확대하면서 5 v/v ％ CO2 인큐베이터중에서 37℃ 에서 배양하였다. 배양물의 세포 밀도가 소정의 레벨에 도달하였을 때, 마우스 한마리당 프리스탄 (pristane) 을 0.5ml 주사해둔 8 주령의 BALB/c 마우스의 복강내에 증식된 하이브리도마 H-1 세포를 마우스 한마리당 1×107 개 주사한 다음 통상의 방법으로 마우스를 1 주간 사육하였다.
마우스로 부터 복수를 채취하고 PBS 로 3 배 희석한 후 포화도 50 w/v ％ 가 되도록 황산 암모늄을 혼합하여 4℃ 에서 24 시간 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 20 mM 인산 2 수소 칼륨 수용액 (pH 6.7) 에 대해 4℃ 에서 하룻밤 투석한 후 신선한 동일 수용액으로 미리 평형화시켜둔 히드록시아파타이트의 칼럼에 가한 다음 20 mM 로 부터 300 mM 까지의 범위의 직선농도 기울기의 인산 2 수소 칼륨 완충액 (pH 6.7) 을 가하여 본 발명의 모노클로날 항체 H-1mAb 를 함유한 수용액을 얻었다. 그 수득량은 마우스 한마리당 5 mg 정도이었다. 종래의 분석 결과, 이 항체는 IgG1 의 클라스에 속하는 것이 판명되었다.
실시예 B-2-2 : 웨스턴 블롯법에 의한 분석
디티오트레이톨 100 mg, 10 w/v ％ SDS 수용액 0.5 ml 및 글리세롤 1 ml 로 된 혼합액에 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드 1 ㎍ 을 가하고, 이 혼합물을 37℃ 에서 1 시간 인큐베이트하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 수득한 겔을 통상의 방법으로 니트로셀룰로오스막에 옮긴 다른 하이브리도마 H-1 세포의 배양물 상청액중에 1 시간 침지한 후 0.05 v/v ％ Tween 20 을 함유한 50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 세척하여 과잉량의 항체를 제거하였다. 이 막을 토끼로 부터 제조한 항(抗)마우스 Ig 항체를 함유한 PBS 중에 1 시간 침지하여 면역반응시킨 후, 0.05 v/v ％ Tween 20 을 함유한 50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 으로 세척한 다음, 0.005 v/v ％ 과산화 수소와 0.3 mg/ml 3,3'-디아미노벤지딘을 함유한 50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 중에 침지하여 발색시켰다.
대조로서 정제 폴리펩티드 대신에 재조합 인간 인터로이킨 12 를 사용한 계를 만들어 위와 마찬가지로 처리하였다. 마아커 단백질로서 소혈청 알부민 (MW = 67,000 달톤), 오브알부민 (MW = 45,000 달톤), 카르보닉 안히드라제 (MW = 30,000 달톤), 트립신 인히비터 (MW = 20,100 달톤) 및 α-락토알부인 (MW = 14,400 달톤) 을 사용하였다. 그 결과는 제 4 도에 나와 있다.
제 4 도로 부터 명백한 바와 같이 모노클로날 항체 H-1mAb 는 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드 [레인 (Lane) 1] 와 특이적으로 반응하였으나 인간 인터로이킨 12 (레인 2) 와는 반응하지 않았다. 이것은 본 발명의 모노클로날 항체가 특정한 아미노산 배열을 가진 폴리펩티드와 특이하게 반응한다는 것을 지지하는 것이다.
실시예 B-3 : 하이브리도마 H-2 및 모노클로날 항체 H-2mAb 제조
실시에 B-3-1 : 하이브리도마 H-2 제조
실시예 B-2-1 에서 SP/O-14Ag 세포 대신에 P3-X63-Ag8 세포 (ATCC TIB9) 를 사용한 외에는 마찬가지로 하여 모노클로날 항체 하이브리도마 H-2 를 제조하였다.
실시예 B-3-2 : 모노클로날 항체 H-2mAb 제조
실시예 B-3-1 의 하이브리도마 H-2 를 실시예 B-2-1 에서와 마찬가지로 배양하고, 이 배양물을 정제하여 BALB/c 마우스 한마리당 약 5.6 mg 의 모노클로날 항체 H-2mAb 를 얻었다. 종래의 방법으로 분석한 결과, 이 모노클로날 항체는 IgM 의 클라스에 속하였고, 실시예 B-2-2 에서와 마찬가지로 웨스턴 블로팅법 (Western blotting technique) 으로 분석했을 때 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리 펩티드와 특이하게 반응하였다.
실시예 B-4 : 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 폴리펩티드의 정제
실시예 B-4-1 : 면역 친화성 크로마토그래피용 겔 제조
실시예 B-2-1 의 방법으로 얻은 모노클로날 항체 H-1mAb 80 mg 을 취하여 0.5 M 염화 나트륨을 함유한 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5) 에 대해 4℃ 에서 하룻밤 투석하였다. 물에 불용성인 담체 " CNBr 활성화 Sepharose 4B " (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechology AB 판매) 4 g 을 1 mM 염산 수용액으로 팽윤시켜 신선한 동일한 염산수용액으로 세척하고, 이어서 0.5 M 염화 나트륨을 함유한 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5) 으로 세척한 후, 위에서 얻은 모노클로날 항체 수용액 약 10 ml 을 혼합한 다음 실온 및 4℃ 에서 하룻밤 완만히 교반하였다. 이어서, 수득한 겔을 1 M 에탄올아민 수용액 (pH 8.0)으로 세척한 후, 0.5 M 염화 나트륨을 함유한 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5) 으로 세척한 다음, 0.1 M 아세트산 완충액 (pH 4.0) 으로 세척하는 단계를 5 회 반복하였다. 최후로 이 겔을 PBS 로 세척하여 면역 친화성 크로마토그래피용 겔을 얻었다. 종래 방법으로 분석한 결과, 겔 1 ml 당 약 6 mg 의 모노클로날 항체 H-1mAb 가 결합해 있었다.
실시예 B-4-2 : 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 폴리펩티드 정제
실시예 B-4-1 에서 얻은 면역 친화성 크로마토그래피용 겔 10 ml 을 플라스틱제 원통형 칼럼에 충전하고 PBS 로 세척한 후, 여기에 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드 약 0.1 mg/ml 을 함유한 페닐 세파로오스 용출획분 10 ml 을 가하였다. 이 칼럼을 신선한 PBS 로 세척하고, 여기에 1 M 염화 나트륨을 함유한 0.1 M 글리신-염산 완충액 (pH 2.5) 을 가하여 IFN-γ 유도활성을 가진 획분을 채취하였다. 이들 획분을 한데 모아 PBS 에 대해 4℃ 에서 하룻밤 투석하고 농축한 후 IFN-γ 유도활성과 단백질 함유량을 분석한 결과, 이 정제방법에 의하여 순도 95 w/w ％ 이상의 정제 폴리펩티드를 약 100 ％ 의 수율로 얻었음이 판명되었다.
실시예 B-5 : 효소 면역 시험법에 의한 폴리펩티드의 검출
실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드로 통상의 방법에 따라 토끼를 면역시킨 후 혈액을 채취하였다. 이 혈액으로 부터 면역 글로블린 G 항체를 분리하여 농도 20 ㎍/ml 되도록 PBS 에 용해한 다음, 이 용액을 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕/웰씩 나누어 넣었다. 이 마이크로플레이트를 실온에서 3 시간 인큐베이트한 다음 이 마이크로플레이트로 부터 IgG 함유 용액을 제거하고, 1 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 를 마이크로플레이트에 200 ㎕/웰씩 가한 후 4℃ 에서 하룻밤 방치하였다.
마이크로플레이트로 부터 PBS 를 제거한 다음 0.05 v/v ％ Tween 20 을 함유한 PBS 로 세척하고, 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드를 0.5 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 로 적당히 희석하여 제조한 용액을 100 ㎕/웰씩 가한 후, 이 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 진탕하면서 반응시켰다. 이 마이크로플레이트를 0.05 v/v % Tween 20 을 함유한 PBS 로 세척하고 비오틴으로 표지된 모노클로날 항체 H-1mAb 를 함유한 용액을 100 ㎕/웰씩 가한 다음, 이 혼합액을 실온하에서 2 시간 진탕하면서 반응시킨 후 마이크로플레이트를 0.05 v/v % tween 20 을 함유한 PBS 로 세척하고, 고추냉이 퍼옥시다아제와 스트렙토아비딘의 복합체를 함유한 용액을 100 ㎕/웰씩 가하여 수득한 혼합물을 실온하에서 2 시간 진탕하면서 다시 반응시켰다. 이어서, 이 마이크로플레이트를 0.05 v/v % tween 20 을 함유한 PBS 로 세척하고, 정제 폴리펩티드에 결합한 고추냉이 퍼옥시다이제의 활성을 o-페닐렌디아민을 기질로 사용하여 파장 492 nm 에서의 흡광도에 대해 측정하였다. 그 결과는 표 6 에 나와 있다.
표 6
(주) : * 은 3 회 측정에 대한 통계처리 수치를 뜻함.
표 6 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명에 의한 검출방법에 의하면 폴리펩티드를 약 50∼1,000 pg/ml 의 범위내에서 정밀하게 검출할 수 있다.
실시예 B-6 : 방사선 면역 시험법에 의한 폴리펩티드의 검출
실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드로 통상의 방법에 따라 토끼를 면역시키고 혈액을 채취한 다음, IgG 항체를 분리하였다. 이 항체를 통상의 방법으로 방사선 면역 시험용 폴리스티렌 비이드에 흡착시켜 2 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 중에 4℃ 에서 하룻밤 방치하여 고정화 항체를 얻었다. 비이드 하나를 시험관 속에 넣고, 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 정제 폴리펩티드를 0.5 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 로 희석하여 제조한 용액 0.2 ml 중에 침지하여 4℃ 에서 4 시간 방치하였다. 이어서, 이 비이드를 0.05 v/v ％ tween 20 와 0.5 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 로 세척하고 실시예 B-3-2 의 방법으로 얻은 모노클로날 항체 H-2mAb 를 125I 로 표지한 것을 함유한 용액 0.2 ml (1×105 cpm) 중에 침지하여 4℃ 에서 하룻밤 방치하였다. 과잉량의 125I 표지 항체를 제거한후 비이드를 0.05 v/v ％ tween 20 및 0.5 w/v ％ 소혈청 알부민을 함유한 PBS 로 세척한 다음 감마 카운터로 비이드의 방사능을 카운트 하였다. 그 결과는 표 7 에 나와 있다.
표 7
(주) : * 은 3 회 측정에 대한 통계처리 수치를 뜻함.
표 7 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명의 검출방법은 폴리펩티드를 약 100∼1,000 pg/ml 의 범위에서 정밀하게 검출할 수 있다.
실시예 C-1 : 액제
실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 안정제로서 1 w/v ％ 인간 혈청 알부민을 함유한 생리 식염수에 용해하여 1 mg/ml 폴리펩티드 용액을 얻은 다음 멤브레인 필터로 멸균하여 액제를 얻었다.
이 제품은 안정성이 우수하므로 악성 종양, 바이러스성 질환, 세균 감염증 및 면역 질환 등의 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 주사제, 점안액 및 점비제로 사용할 수 있다.
실시예 C-2 : 건조 주사제
실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 안정제로서 1 w/v ％ 정제 젤라틴을 함유한 생리 식염수 100 ml 에 용해하고, 이 용액을 통상의 방법으로 멤브레인 필터로 멸균하였다. 이 멸균액 1 ml 씩을 취하여 바이알병에 나누어 넣고 동결 건조한 후 캡으로 밀봉하였다.
이 제품은 안정성이 우수하므로 악성 종양, 바이러스성 질환, 세균성 질환 및 면역 질환 등의 감수성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 건조 주사제로 사용할 수 있다.
실시예 C-3 : 연고제
카르복시비닐 폴리머 " HI-BIS-WAKO 104 " (일본국의 Wako Pure Chmicals 사 판매) 와 정제 트레할로오스를 각각 농도 1.4 w/w ％ 및 2.0 w/w ％ 가 되도록 증류수에 용해하고, 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻을 폴리펩티드를 균일히 용해한 후, 이 용액의 pH 를 pH 7.2 가 되게 조정하여 폴리펩티드 약 1 mg/g 을 함유하는 페이스트를 얻었다.
이 제품은 퍼짐성과 안정성이 우수하므로 악성 종양, 바이러스성 질환, 세균 감염증 및 면역 질환 등의 감수성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 연고제로 사용할 수 있다.
실시예 C-4 : 정제
실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드와 세포 활성제로서의 LUMIN, 즉, [비스-4-(1-에틸퀴놀린)][γ-4' -(1-에틸퀴놀린)]펜타메티오닌 시아닌을 무수결정질 α-말토오스 " FINETOSE " (일본국의 林原 사 판매)와 균일히 혼합하고, 이 혼합물을 통상의 방법으로 타정기에서 타정하여 하나당 중량이 약 200 mg 이고, 폴리펩티드와 LUMIN 을 각각 약 1 mg 함유하는 정제를 얻었다.
이 제품은 삼키기가 쉽고 안정성과 세포 활성화 작용이 우수하므로 악성 종양, 바이러스성 질환, 세균 감염증 및 면역 질환 등의 감수성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 정제로서 사용할 수 있다.
실시예 C-5 : 양자 면역요법제 (養子免疫療法劑)
악성 임파종 환자의 말초혈로 부터 단핵 세포를 분리하여, 10 v/v ％ 인간 AB 혈청이 보충되어 37℃ 로 예열된 RPMI 1640 배지 (pH 7.2) 에 분산시켜 세포 밀도 약 1×106 개/ml 로 한 후, 여기에 실시예 B-1-2 의 방법으로 얻은 폴리펩티드를 약 1.0 ㎍/ml 와 재조합 인간 인터로이킨 2 를 약 100 단위/ml 혼합한 다음 5 v/v ％ CO2 인큐베이터중에서 37℃ 에서 1 주간 배양하고, 배양물을 원심분리하여 LAK 세포를 회수하였다.
이렇게 하여 수득한 LAK 세포는 공여자인 환자의 체내에 도입할 경우 임파종 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내고, 또한 인터로이킨 2 단독을 사용하여 양자 면역요법에 의해 얻게 되는 경우보다 훨씬 큰 세포독성을 발휘한다. 위에 나온 임파구 대신에 환자의 종양조직에 침입한 임파구를 마찬가지로 처리하여 얻는 세포독성 T 세포를 공여자인 환자에게 주입한 결과 LAK 세포에 의해 나타나는 것과 마찬가지의 효과를 나타내었다. 이 양자 면역요법제는 신장암, 악성 흑색종, 대장암, 직장암, 폐암 등의 고형 악성 종양을 치료하는데 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명은 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 신규의 폴리펩티드 발견에 근거한 것이다. 이 폴리펩티드는 아미노산 배열이 부분적 내지 완전히 규명된 물질로서 면역담당 세포에 의한 IFN-γ 생산을 유도하는 안정한 활성을 가지고 있다.
이 폴리펩티드는 강력한 IFN-γ 유도능을 가지고 있으므로 소량만으로도 소요량의 IFN-γ 생산을 유도할 수 있다. 이 폴리펩티드는 독성이 극히 낮기 때문에 비교적 다량을 투여하더라도 심각한 부작용을 일으키지 않는다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 그 투여량을 엄격히 제한하지 않고서도 소요량의 IFN-γ 생산을 신속히 유도하는 장점을 가지고 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 이 폴리펩티드와 특이적으로 반응하므로 이 폴리펩티드의 정제와 검출에 널리 사용된다. 이 항체는 하이브리도마를 사용하여 소망량으로 제조할 수 있다.
본 발명의 감수성 질환제는 악성 종양, 바이러스성 질환, 세균 감염증 및 면역 질환 등의 감수성 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 우수한 효과를 발휘한다. 더욱이, 이 감수성 질환제는 킬러 세포에 의한 세포독성을 증가시키거나 킬러 세포의 생성을 유도하는 활성을 가지고 있어 악성 종양 등의 난치성 질환치료에 현저한 효과를 발휘한다. 따라서, 본 발명은 이러한 효과를 가진 것으로써 이 기술분야에 크게 공헌하게 되는 의의가 큰 발명이라 할 수 있다.
제 1 도는 마우스 간 유래의 단백질을 트립신 소화하여 수득된 팹티드 단편의 HPLC 용출 패턴.
제 2 도는 본 발명의 재조합 DNA pHIGIF 의 구조를 나타낸 도면.
제 3 도는 재조합 DNA pKGFHH2 의 구조를 나타낸 도면.
제 4 도는 본 발명의 정제 폴리펩티드 및 인간 인터로이킨 12 와 본 발명의 모노클로날 항체 H-1mAb 의 반응성을 나타낸 웨스턴 블로팅 도면.
HIGIF : 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA
KGFHH2 cDNA : 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA
Ptac : tac 프로모우터
rrnBT1T2 : 리보좀 RNA 오페론의 터미네이터
GST : 글루타티온 S-트란스퍼라아제 유전자
AmpR : 앰피실린 내성 유전자
pBR322ori : 에쉐리히아 콜리의 복제 개시점
배 열 표
SEQ ID NO : 1 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 157 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자형 : 펩티드
(xi) 배열
SEQ ID NO : 2 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 471 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(xi) 배열
SEQ ID NO : 3 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 471 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 중쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : cDNA to mRNA
(iii) 하이포데티칼 배열 : No
(iv) 안티센스 : No
(vi) 기원
(A) 생물명 : 마우스
(F) 조직의 종류 : 간장
(ix) 특징
(A) 명칭/키이 : 1-471 mat peptide
(C) 확인방법 : S
(xi) 배열
SEQ ID NO : 4 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 25 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 펩티드
(v) 단편의 종류 : 내부 단편
(xi) 배열
SEQ ID NO : 5 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 18 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 펩티드
(v) 단편의 종류 : 내부 단편
(xi) 배열
SEQ ID NO : 6 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 1120 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 중쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : cDNA to mRNA
(iii) 하이포데티칼 배열 : No
(iv) 안티센스 : No
(vi) 기원
(A) 생물명 : 인간
(F) 조직의 종류 : 간장
(ix) 특징
(A1) 명칭/키이 : 1-177 5' -UTR
(C1) 확인방법 : S
(A2) 명칭/키이 : 178-285 leader peptide
(C2) 확인방법 : S
(A3) 명칭/키이 : 286-756 mat peptide
(C3) 확인방법 : S
(A4) 명칭/키이 : 757-1120 3' -UTR
(C4) 확인방법 : S
(xi) 배열
SEQ ID NO : 7 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 펩티드
(v) 단편의 종류 : N 말단 단편
(xi) 배열
SEQ ID NO : 8 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 471 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 중쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : cDNA to mRNA
(vi) 기원
(A) 생물명 : 인간
(B) 조직의 종류 : 간장
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키이 : mat peptide
(B) 위치 : 1..471
(C) 확인방법 : S
(xi) 배열
SEQ ID NO : 9 의 정보 :
(i) 배열의 특징 :
(A) 길이 : 11
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자타입 : 펩티드
(v) 단편의 종류 : N 말단 단편
(xi) 배열

Claims (46)

  1. 면역담당 세포에 의한 IFN-γ의 생산을 유도하며, 아래의 SEQ ID NO:1의 아미노산 배열(여기서 "Xaa" 는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 을 뜻함)을 가진 폴리펩티드.
    SEQ ID NO : 1:
  2. 제 1항에 있어서, 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 18,500 ±3,000 달톤이고, 크로마토포커싱에 의한 등전점이 4.9 ±1.0인 폴리펩티드.
  3. 제 1항의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 아래의 SEQ ID NO:2의 염기배열을 가진 DNA.
    SEQ ID NO : 2:
  5. 제 4항에 있어서, SEQ IN NO : 1의 아미노산 배열을 바꿈이 없이 유전자 코우드의 디제너러시(degeneracy)에 의하여 SEQ ID NO : 2의 염기 하나 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
  6. 제 3항에 있어서, 아래의 SEQ ID NO : 6의 염기배열(여기서 "Xaa" 또는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 을 뜻함)을 가진 DNA.
    SEQ ID NO : 6:
  7. 제 3항에 있어서, 인간에서 유래하는 DNA.
  8. 자체복제 가능한 벡터와, 제 1항의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA.
  9. 제8항에 있어서, SEQ ID NO:2의 염기배열을 가진 복제가능한 DNA.
  10. 제 9항에 있어서, SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꿈이 없이 유전자 코우드의 디제너러시에 의해 SEQ ID NO : 2의 염기 하나 이상을 다른 염기로 치환한 복제가능한 재조합 DNA.
  11. 제 8항에 있어서, SEQ ID NO : 6의 염기배열 (여기서 "Xaa" 는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 을 뜻함)을 가진 복제 가능한 재조합 DNA.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 DNA가 인간에서 유래하는 복제 가능한 재조합 DNA.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 복제 가능한 재조합 DNA.
  14. 제 1항의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA와 자체복제 가능한 벡터를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를 에쉐리히아 콜리 또는 바실루스 서브틸리스에 도입하여 수득되는 형질 전환체.
  15. 제14항에 있어서, SEQ ID NO:2의 염기배열을 가진 형질 전환체.
  16. 제 15항에 있어서, SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꿈이 없이 유전자 디제너러시에 의해 SEQ ID NO : 2의 염기 하나 이상을 다른 염기로 치환한 형질 전환체.
  17. 제 14항에 있어서, SEQ ID NO : 6의 염기 배열(여기서 "Xaa" 는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 을 뜻함)을 가진 형질 전환체.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 DNA가 인간에서 유래하는 형질 전환체.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 형질 전환체.
  20. (가) 폴리펩티드를 코우드하는 DNA와 자체복제 가능한 벡터를 함유한 복제 가능한 재조합 DNA를 에쉐리히아 콜리 또는 바실루스 서브틸리스에 도입하여 제조된 제 1항의 폴리펩티드의 생성능이 있는 형질 전환체를 영양배지에서 배양하고, (나) 생성된 폴리펩티드를 수득한 배양물로부터 채취하여서 되는 폴리펩티드의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO:2의 염기배열 또는 이 염기배열에 상보적인 염기배열을 가진 폴리펩티드의 제조방법.
  22. 제 21항에 있어서, SEQ ID NO : 1의 아미노산 배열을 바꿈이 없이 유전자 디제너러시에 의하여 SEQ ID NO : 2의 염기 하나 이상을 다른 염기로 치환한 폴리펩티드의 제조방법.
  23. 제 20항에 있어서, 상기 DNA는 SEQ ID NO : 6의 염기 배열(여기서 "Xaa" 는 "이소로이신" 또는 "트레오닌" 을 뜻함)을 가진 것인 폴리펩티드의 제조방법.
  24. 제 20항에 있어서, 상기 DNA는 인간에서 유래하는 폴리펩티드의 제조방법.
  25. 제 20항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인 폴리펩티드의 제조방법.
  26. 제 20항에 있어서, 상기 숙주는 에쉐리히아 콜리종의 미생물인 폴리펩티드의 제조방법
  27. 제 20항에 있어서, 생성된 폴리펩티드를 농축, 염석, 투석, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수 (疎水) 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택된 한가지 이상의 방법으로 정제하는 폴리펩티드의 제조방법.
  28. 제 1항의 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체.
  29. 제 28항에 있어서, IgG 또는 IgM의 클라스에 속하는 모노클로날 항체.
  30. 제 28항에 있어서, H-1mAb 또는 H-2mAb인 모노클로날 항체.
  31. 제 28항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  32. 제 31항에 있어서, 하이브리도마가 하이브리도마 H-1 또는 H-1인 하이브리도마.
  33. 제 28항의 모노클로날 항체의 생산능이 있는 하이브리도마를 영양배지중 또는 동물의 체내에서 배양하고, 수득한 배양물 또는 체액으로부터 하이브리도마를 채취하여서 되는 모노클로날 항체의 제조방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 하이브리도마가 하이브리도마 H-1 또는 H-2인 모노클로날 항체의 제조방법.
  35. 제 33항에 있어서, 배양물 또는 체액으로부터 상기 모노클로날 항체를 염석, 투석, 여과, 농축, 원심분리, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로 된 군으로부터 선택된 방법 중 한가지 이상의 방법으로 채취하는 모노클로날 항체의 제조방법.
  36. 폴리펩티드와 불순물을 함유한 혼합물을 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체와 접촉시키고, 모노클로날 항체에 흡착된 폴리펩티드를 탈착시켜서 되는 제 1항의 폴리펩티드의 정제방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 물에 불용성인 담체에 결합해 있는 폴리펩티드의 정제방법.
  38. 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 샘플과 접촉시켜 면역반응시키는 단계를 포함하는 제 1항의 폴리펩티드의 검출 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 모노클로날 항체가 방사성 물질, 효소 및 형광물질로 된 군으로부터 선택된 1종으로 표지되어 있는 폴리펩티드의 검출방법.
  40. 유효성분으로서 제 1항의 폴리펩티드를 함유하는, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  41. 제 40항에 있어서, 폴리펩티드는 킬러 세포에 의한 세포독성의 증강 및/또는 킬러 세포의 생성을 유도하는 성질을 가진, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  42. 제 41항에 있어서, 킬러 세포는 NK 세포, LAK 세포(림포카인 활성화 킬러 세포) 및 세포독성 T 세포로 된 군으로부터 선택되는 1종인, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  43. 제 40항에 있어서, 인터로이킨 2 및 콘카나발린 A로 된 군으로부터 선택된 1종 이상을 추가로 함유하는, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  44. 제 40항에 있어서, 항종양 면역요법제인, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  45. 제 40항에 있어서, 혈청 알부민, 젤라틴, 말토오스 및 트레할로오스로 된 군으로부터 선택된 1종 이상을 안정제로 함유하는, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
  46. 제 40항에 있어서, 폴리펩티드를 건조 고형물 기준으로 0.000001 ~ 100 w/w％함유하는, 바이러스성 질환, 악성 종양 또는 면역 장해의 치료 또는 예방제.
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