JP3897316B2 - インターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する新規なポリペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生すると云われている。これらの生物作用ゆえに、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】
このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これらの物質は、いずれも分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の目的は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドを提供することにある。
【０００５】
この発明の別の目的は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、斯かる形質転換体を用いる上記ポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記第一の課題を、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列を有するポリペプチドにより解決するものである。
【００１０】
この発明は、上記第二の課題を、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、上記第三の課題を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１２】
この発明は、上記第四の課題を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１３】
この発明は、上記第五の課題を、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を栄養培地で培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取してなるポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明のポリペプチドは、後述のごとく、従来公知のポリペプチドとは明らかに相違するアミノ酸配列を有しており、免疫担当細胞に単独又は適宜補因子とともに作用させると、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１５】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、通常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。
【００１６】
この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、通常、当該ポリペプチドを産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該ポリペプチドの産生を発現する。
【００１７】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該ポリペプチドを産生する。
【００１８】
斯かる形質転換体をこの発明の製造方法にしたがって培養すれば、所望量のポリペプチドが容易に得られる。
【００１９】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサイトカイン類につき研究していたところ、コリネバクテリウの死菌体とリポ多糖により予処置したマウスの肝臓中に、ＩＦＮ−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な蛋白質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの蛋白質を単離し、その部分アミノ酸配列を決定するとともに、マウス肝細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させて蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を採取し、これをプローブにして上記ｍＲＮＡから別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索したところ、４７１塩基対からなる、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、マウス肝臓から単離した蛋白質は１５７個のアミノ酸からなり、配列番号３に併記したアミノ酸配列を有することが判明した。なお、その配列番号３において、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はメチオニン又はトレオニンを表すものとする。
【００２０】
これらの知見に基づき、本発明者がヒト肝細胞由来のｍＲＮＡを引続き検索したところ、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する、さらに別のポリペプチドをコードする遺伝子が存在することを見出した。この遺伝子は配列表における配列番号２に示す塩基配列を含んでなり、解読したところ、１５７個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列のポリペプチドをコードしていることが判明した。なお、その配列番号１において、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。
【００２１】
配列表における配列番号１及び２に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作を要約すると、次のようになる。
（１） クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてコリネバクテリウムの死菌体とリポ多糖により予処置したマウス肝細胞から免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を単離し、高度に精製した。
（２） 精製蛋白質をトリプシン消化し、消化物から２種類のペプチド断片を単離し、アミノ酸配列を決定した。
（３） マウス肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させてＤＮＡ断片を調製する一方、それら部分アミノ酸配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにしてそれらＤＮＡ断片を検索し、蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を得た。
（４） このＤＮＡ断片を同位体標識した後、前記ｍＲＮＡを鋳型に調製したｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取した。
（５） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列を比較することにより、蛋白質が配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有し、マウスにおいて、このアミノ酸配列が配列番号３に併記した塩基配列によりコードされていることを確認した。
（６） さらに、ヒト肝細胞由来のｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを作製する一方、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片を調製し、同位体標識した後、上記ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した形質転換体を採取した。
（７） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、塩基配列を決定し、解読したところ、この発明のポリペプチドは配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有することがあり、ヒトにおいて、このアミノ酸配列は配列表における配列番号２に示す塩基配列によりコードされていることを確認した。
【００２２】
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するこの発明のポリペプチドは、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、配列表における配列番号１に見られるごとく、従来公知のポリペプチドとは明らかに相違するアミノ酸配列を有している。天然由来のポリペプチドであろうと、組換えＤＮＡ技術により創製されたポリペプチドであろうと、それが配列番号１に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列を有するかぎり、すべてこの発明に包含されるものとする。配列番号１のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の生物作用を実質的に変えることなく、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の生物作用は保持しているものの、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するかぎり、当然、この発明のポリペプチドに包含される。
【００２３】
この発明のポリペプチドは、それをコードするＤＮＡを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生したポリペプチドを培養物から採取することにより製造することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号２に示す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該ポリペプチドの産生を発現するために、当該ポリペプチド又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは云うまでもない。
【００２４】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、ヒトの肝臓が挙げられ、その細胞からは、例えば、配列表における配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、例えば、市販のポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ｍＲＮＡを蔗糖濃度勾配などにより分画してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮＡとし、これを自律複製可能な適宜ベクターに挿入し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌などの適宜宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用してこの発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、この発明のＤＮＡが得られる。一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号２に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００２５】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物で発現させるにはｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３が、また、動植物由来の細胞で発現させるにはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１が好適である。
【００２６】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００２７】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドを産生するものを選択すればよい。
【００２８】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体又は細胞内外に当該ポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ５乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま使用されることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性物質を精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は固状にすればよい。
【００２９】
前述のとおり、この発明のポリペプチドは、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。この性質により、この発明のポリペプチドは、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造の際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、エイズや尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用である。
【００３０】
この発明のポリペプチドは、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のために哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、Ｍｏ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｕＴ７８細胞、ＥＬ４細胞、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化された免疫担当細胞をこの発明のポリペプチドを１ｍｌ当り約０．１ｎｇ乃至１μｇ、望ましくは、約１乃至１００ｎｇ含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物を生理活性物質を精製するための慣用の方法、すなわち、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００３１】
一方、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためには、哺乳類の体内にこの発明によるポリペプチドを直接投与すればよい。具体的には、この発明のポリペプチドを投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経口又は経粘皮投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明のポリペプチドを投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であってもよい。この発明のポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、念のために申し述べると、この発明のポリペプチドは医薬品としての安全性の要件を充たしている。
【００３２】
以下、実施例に基づきこの発明を説明するが、そこで用いられる手法は斯界において慣用のものであり、例えば、ティー・マニャティス等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、村松正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸善出版発行などにも詳述されている。
【００３３】
【実施例１】
〈精製蛋白質の調製〉
８週齢の雌ＣＤ−１マウス６００匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して調製した死菌体を１ｍｇ／匹注射投与し、通常一般の方法で７日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１μｇ／匹注射投与した。１乃至２時間後、マウスを屠殺し、採血後、肝臓を摘出し、８倍容の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）中、ホモゲナイザーにより破砕して抽出した。抽出物を約８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清約９ｌに硫酸アンモニウムで飽和させた５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）を硫酸アンモニウムが４５％飽和になるように加え、４℃で１８時間静置後、約８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清約１９ｌを採取した。
【００３４】
この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させておいたファルマシア製『フェニルセファロース』約４．６ｌのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、１Ｍから０．２Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）をＳＶ０．５７で通液した。硫酸アンモニウム濃度が０．８Ｍ付近のときに溶出した画分約４．８ｌを採取し、膜濃縮し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で１８時間透析後、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させておいたファルマシア製『ＤＥＡＥ−セファロース』約２５０ｍｌのカラムに負荷した。カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）をＳＶ１．２で通液し、塩化ナトリウム濃度０．１３Ｍ付近で溶出した画分約２６０ｍｌを採取した。
【００３５】
この画分を濃縮し、２５ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．１）に対して４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一緩衝液で平衡化させておいたファルマシア製『Ｍｏｎｏ−Ｐ』約２４ｍｌのカラムに負荷し、ｐＨ７からｐＨ４に下降するｐＨ勾配下、カラムに１０％（ｖ／ｖ）ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）を通液した。ｐＨが約４．８のときに溶出した画分約２３ｍｌを採取し、濃縮し、予め７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、３ｍＭ燐酸二水素ナトリウム及び１３９ｍＭ塩化ナトリウムからなる混液（ｐＨ７．２）で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデックス７５』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液を通液してゲル濾過クロマトグラフィーしたところ、分子量１９，０００ダルトン付近に目的とする蛋白質が溶出した。蛋白質を含む画分を採取し、濃縮して下記の実施例２に供した。収量は、マウス１匹当り約０．６μｇであった。
【００３６】
【実施例２】
〈部分アミノ酸配列〉
実施例１で調製した精製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｖ／ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間インキュベート後、１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。その後、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に浸漬して染色し、１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールと７％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に１８時間浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアントブルー染色されたＩＦＮ−γ誘導活性ある部分を切出し、凍結乾燥した。
【００３７】
次に、乾燥ゲルをシグマ製『ＴＰＣＫトリプシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質をトリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪後、遠心分離して上清を採取した。新たに生じた沈澱を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む７０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸及び５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの順序で上記と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清をプールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心濾過した。
【００３８】
斯くして得られたペプチド断片を含む水溶液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＨＰＬＣ ＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で洗浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニターしながら、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約７５分後又は約５５分後に溶出した画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』又は『ペプチド断片Ｂ』と云う。）を別々に採取した。このときの溶出パターンを図１に示す。
【００３９】
その後、パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれらペプチド断片Ａ及びＢのアミノ酸配列を調べたところ、それぞれ、配列表における配列番号４及び５に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４０】
【実施例３】
〈蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配列〉
【００４１】
【実施例３−１】
〈全ＲＮＡの調製〉
実施例１と同様にして調製したマウス肝細胞を湿重で３ｇとり、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕した。常法にしたがって、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を２５ｍｌ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍｌ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離後、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、等容量のクロロホルム／ブタノール混液（４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して下記の実施例３−２に供した。なお、全ＲＮＡの収量は約４ｍｇであった。
【００４２】
【実施例３−２】
〈蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片の調製〉
実施例３−１で調製した全ＲＮＡ １μｇに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした。混合物を０．５ｍｌ容反応管にとり、常法にしたがって２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートして逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。
【００４３】
この第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μｌに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及びプライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。そして、常法により、混合物を９４℃で１分間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返して反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型に当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー１及びプライマー２は、配列表の配列番号４及び５におけるＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ又はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅで表されるアミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ５´−ＡＴＲＴＣＲＴＣＤＡＴＲＴＴＹＴＣＮＧＧ−３´又は５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＴＧＡＣＮＧＡＹＡＴ−３´で表される塩基配列を有していた。
【００４４】
このようにして得たＰＣＲ産物の一部をとり、常法により２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動して分画し、ナイロン膜上に移取り、０．４Ｎ水酸化ナトリウムで固定し、２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、プローブ１として、配列表の配列番号４におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列に基づき５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＲＡＴＧＧＡＹＣＣ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同位体標識した。このプローブ１を１ｐｍｏｌとり、これと５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４５℃で２４時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。ナイロン膜を６×ＳＳＣで洗浄後、常法によりオートラジオグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣＲ産物に含まれていた。
【００４５】
次に、残りのＰＣＲ産物に宝酒造製プラスミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』を５０ｎｇと適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入し、得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によりファルマシア製大腸菌『ＮｏＶａ Ｂｌｕｅ』株に導入して形質転換体とした。得られた形質転換体を１０ｇ／ｌバクトトリプトン、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌＸ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に接種し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してコロニーを移取った後、ナイロン膜を剥離し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸漬し、２×ＳＳＣで洗浄し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬して固定し、５×ＳＳＣでさらに洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、常法にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズさせ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオグラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転換体をプレート培地から採取した。
【００４６】
この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間培養後、培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは配列表の配列番号３に示す塩基配列における第８５乃至２８１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４７】
【実施例３−３】
〈ｍＲＮＡの調製〉
実施例３−１で調製した全ＲＮＡを含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに１ｍＭ ＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加え、滅菌蒸留水で全量を１ｍｌとした。混合物に日本ロシュ製オリゴｄ（Ｔ）₃₀ラテックス『オリゴテックス−ｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱して変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであった。
【００４８】
【実施例３−４】
〈ｃＤＮＡライブラリーの作製〉
アマシャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、実施例３−３で調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液１μｌ、デオキシヌクレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄ（Ｔ）₁₆プライマー溶液１μｌをこの順序で加え、さらに、実施例３−３で調製したｍＲＮＡを２μｇ加えた後、滅菌蒸留水で１９μｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００４９】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液を３７．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを２単位加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してｃＤＮＡを採取した。
【００５０】
このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液を２μｌ、Ｅｃｏ ＲＩアダプターを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏ ＲＩアダプターを連結した。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグラフィーにより未反応のＥｃｏ ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で全量４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ ＲＩ切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してＤＮＡを採取した。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液を１．５μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で全量１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００５１】
【実施例３−５】
〈組換えＤＮＡのクローニング〉
アマシャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実施例３−４で調製したファージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取り、剥離した後、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３分間浸漬する操作を繰返した。ナイロン膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣでさらに濯ぎ、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、実施例３−２で調製したＤＮＡ断片をアマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』により³²Ｐ標識してプローブ２とし、その適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液にナイロン膜を浸漬し、６５℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた後、室温下、６×ＳＳＣ中で２０分間、２×ＳＳＣ中でさらに２０分間インキュベートし、洗浄し、オートラジオグラフィーし、プローブ２に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。
【００５２】
常法にしたがってこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入し、形質転換体を得た。
【００５３】
【実施例３−６】
〈ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配列の決定〉
実施例３−５で調製した形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサーにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列番号３に示す塩基配列を含んでなり、解読したところ、同じく配列番号３に示すアミノ酸配列をコードしていることが示唆された。このアミノ酸配列においては、その第７９乃至１０３番目又は第２６乃至４３番目に配列表における配列番号４及び５に示す部分アミノ酸配列が含まれており、このことは、マウスにおいて、配列番号３に示すアミノ酸配列のポリペプチドが、同じく配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。なお、その配列番号３において、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸はメチオニン又はトレオニンを表わすものとする。
【００５４】
次の実施例４乃至７では、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片をプローブに使用し、ヒト肝臓ｍＲＮＡから免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するさらに別のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを採取する。そして、そのｃＤＮＡの塩基配列を決定し、解読して、この発明によるポリペプチドのアミノ酸配列を決定するとともに、ｃＤＮＡを大腸菌で発現させ、産生したポリペプチドの性質・性状を調べる。
【００５５】
【実施例４】
〈ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列とポリペプチドのアミノ酸配列〉
【００５６】
【実施例４−１】
〈ｃＤＮＡライブラリーの作製〉
アマシャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、クローンテック製ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶液を１０μｌ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム溶液を２．５μｌ、１μｇ／μｌヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液を２．５μｌ、１μｇ／μｌデオキシヌクレオチド三燐酸溶液を５μｌ及び１μｇ／μｌオリゴｄＴプライマー溶液を２．５μｌとり、ポリ（Ａ）付加ヒト肝臓ＲＮＡを５μｇ加え、滅菌蒸留水で４５μｌとした後、逆転写酵素を１００単位含む溶液を５μｌ加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００５７】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液を９３．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを４単位、ＤＮＡポリメラーゼを１１５単位加え、滅菌蒸留水で２５０μｌとし、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間、７０℃で１０分間この順序でインキュベートした後、Ｔ４ポリメラーゼを１０単位加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１０μｌ加えて反応を停止させた後、反応物を常法にしたがってフェノール／クロロホルム抽出し、抽出物をエタノール沈澱して第二ストランドｃＤＮＡを得た。
【００５８】
このようにして得た第二ストランドｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を２μｌ、Ｅｃｏ ＲＩアダプタを２５０ｐｍｏｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で２０μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡの両端にＥｃｏ ＲＩアダプタを連結した後、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を２μｌ加えて反応を停止させた。分子篩クロマトグラフィーにより反応物から未反応のＥｃｏ ＲＩアダプタを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ ＲＩ切断部位をメチル化した後、フェノール／クロロホルム抽出し、抽出物をエタノール沈澱してｃＤＮＡを採取した。その後、ｃＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液（ｐＨ８．０）を１．５μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００５９】
【実施例４−２】
〈組換えＤＮＡのクローニング〉
常法により、大腸菌ＮＭ５１４株に実施例４−１で調製したファージを感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１６時間培養してプラークを形成させた。常法にしたがって、寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークを移取った後、ナイロン膜を剥離し、まず、０．５Ｎ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に７分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に３分間浸漬した。その後、ナイロン膜を２×ＳＳＣで濯ぎ、風乾し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬し、５×ＳＳＣで濯ぎ、再度風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。
【００６０】
組換えＤＮＡをクローニングすべく、別途、アマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』を使用し、配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡ断片を同位体標識してプローブ３を調製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に実施例３−５の方法により調製したＤＮＡ断片を２５ｎｇとり、滅菌蒸留水で４５μｌとし、９５℃で３分間加熱した後、反応管にとり、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ溶液を５μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートして同位体標識した。その後、同位体標識したＤＮＡ断片を含む反応物に通常の分子篩クロマトグラフィーを適用し、未反応の［α−³²Ｐ］を除去した。
【００６１】
次に、前記ナイロン膜をプローブ３の適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６０℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせた後、室温下、６×ＳＳＣ中で２０分間、２×ＳＳＣ中でさらに２０分間インキュベートし、洗浄し、オートラジオグラフィーして、プローブ３に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。常法によりこのＤＮＡクローンを大腸菌で増幅後、菌体からＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とベクター断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。コンピテントセル法により、この組換えＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入してこの発明のＤＮＡを含む形質転換体を得た。
【００６２】
【実施例４−３】
〈塩基配列とアミノ酸配列の決定〉
実施例４−２で調製した形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、常法により３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離して菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡを抽出し、その塩基配列を蛍光光度計を使用する自動シーケンサーにより調べたところ、配列表における配列番号６に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はその配列番号６に併記したとおりであり、このことは、この発明のポリペプチドが配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有することがあり、ヒトにおいて、このアミノ酸配列が配列表における配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示唆している。なお、その配列番号６においても、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。
【００６３】
【実施例５】
〈複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体の調製〉
０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを８μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を１０μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、実施例４−２で調製した組換えＤＮＡを１ｎｇとり、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端及びＣ末端付近の配列に基づき化学合成した５´−ＣＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧ−３´及び５´−ＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧ−３´で表される塩基配列の２種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれ、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとして適量加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。常法により、混合物を９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断してＢａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を適量の滅菌蒸留水に０．１μｇとり、これに、予め制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＧＥＸ−２Ｔ』を１０ｎｇ、１０×ライゲーション緩衝液を１０μｌ及び適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、さらに１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートして、この発明による複製可能な組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を得た。
【００６４】
組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』をコンピテントセル法により東洋紡績製大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られた形質転換体『ＨＩＧＩＦ』をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物を遠心分離して形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法を適用して組換えＤＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を抽出した。ジデオキシ法により調べたところ、図２に見られるとおり、この『ｐＨＩＧＩＦ』においては、配列表における配列番号２に示す塩基配列のｃＤＮＡ『ＨＩＧＩＦ ｃＤＮＡ』がＴａｃプロモーター及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子の下流に連結されていた。
【００６５】
【実施例６】
〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉
実施例５で調製した形質転換体『ＨＩＧＩＦ』をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、振盪しながら３７℃で１８時間種培養した。次に、３０ｌ容ジャーファーメンターに新鮮なＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）を１８ｌずつとり、上記で得た種培養物を１％（ｖ／ｖ）の割合で接種し、３７℃で通気撹拌培養した。培養中、培養物の一部を光路長１ｃｍのキュベットにとり、波長６５０ｎｍにおける吸光度が約１．５に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭまで加え、さらに５時間培養した。その後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、１３９ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び３ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．２）に浮遊させ、常法により超音波処理後、菌体破砕物を遠心分離し、上清を採取した。
【００６６】
この上清を予め１３９ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び３ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．２）で平衡化させておいたファルマシア製『グルタチオン・セファロース４Ｂ』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液で洗浄後、カラム中のゲル１ｍｌに対してトロンビンを１００Ｕ加え、室温下で１６時間静置して酵素開裂反応させた。カラムに新鮮な同一混液を通液して反応物を溶出させた後、予め新鮮な前記と同一混液で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデックス７５』のカラムに通液し、分子量１８，５００ダルトン付近の画分を採取した。この画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、この発明のポリペプチドを含む固状物が培養物１ｌ当り約８０μｇの収量で得られた。
【００６７】
【実施例７】
〈ポリペプチドの理化学的性質〉
【００６８】
【実施例７−１】
〈分子量〉
実施例６で調製した精製ポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導活性ある主たるバンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００６９】
【実施例７−２】
〈等電点〉
実施例６で調製した精製ポリペプチドを常法にしたがってクロマトフォーカシングしたところ、４．９±１．０に等電点を示した。
【００７０】
【実施例７−３】
〈Ｎ末端アミノ酸配列〉
常法にしたがって、パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用して分析したところ、実施例６で調製した精製ポリペプチドは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの付加及びトロンビンによる開裂により、配列表における配列番号７に示すＮ末端アミノ酸配列のチロシン残基にＧｌｙ−Ｓｅｒ−で表されるペプチドが付加した構造を有していた。
【００７１】
【実施例７−４】
〈生物作用〉
【００７２】
【実施例７−４（ａ）】
〈マウス脾細胞におけるＩＦＮ−γ産生の誘導〉
８週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスから脾臓を摘出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩衝液（ｐＨ８．０）中に浸漬して溶血させた。得られた脾細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０⁷ 個／ｍｌになるように浮遊させ、口径９ｃｍのプラスチックシャーレに１０ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ₂ インキュベーター中、３７℃で１時間培養した。シャーレ中の培養物から浮遊細胞のみ採取し、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で洗浄し、下記のＩＦＮ−γ誘導試験に供した。
【００７３】
細胞密度１×１０⁷ 個／ｍｌになるように１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させたマウス脾細胞を９６ウェルマイクロプレート上に０．１５ｍｌずつとり、実施例６で調製した精製ポリペプチドを新鮮な同一培地で適宜希釈して０．０５ｍｌ加えた後、２．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ又は５０単位／ｍｌインターロイキン２を０．０５ｍｌ添加するか添加することなく５％ＣＯ₂ インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩＦＮ−γを通常の酵素免疫法により測定した。同時に、精製ポリペプチド、コンカナバリンＡ及びインターロイキン２のすべて省略した以外は同一の系を設け、これを上記と同様に処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γの標準品には、米国国立公衆衛生研究所から入手した標準マウスＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を使用し、国際単位（ＩＵ）に換算して表示した。結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】

【００７５】
【実施例７−４（ｂ）】
〈ヒトリンパ球におけるＩＦＮ−γ産生の誘導〉
ヘパリン加注射器を使用して健常者から血液を採取し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で２倍希釈後、フィコール上に重層し、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心してリンパ球を採取した。リンパ球を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で洗浄後、リンパ球を細胞密度５×１０⁶ 個／ｍｌになるように浮遊させるとともに、ＩＦＮ−γの標準品に、米国国立公衆衛生研究所から入手した標準ヒトＩＦＮ−γ（Ｇｇ２３−９０１−５３０）を使用した以外は、実施例７−４（ａ）と同様に試験した。結果を表２に示す。
【００７６】
【表２】

【００７７】
表１及び２の結果は、この発明のポリペプチドに、ヒト及びマウスを始めとする哺乳類の免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質のあることを裏付けている。すなわち、対照系において有意なＩＦＮ−γ産生が認められなかったところ、この発明のポリペプチドを添加した系においては、ポリペプチド濃度に依存する有意なＩＦＮ−γの産生が認められた。そして、この性質は、補因子としてコンカナバリンＡやインターロイキン２を共存させることにより、顕著に増強されることが判明した。
【００７８】
【発明の効果】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規なポリペプチドの発見に基づくものである。この発明のポリペプチドはアミノ酸配列まで解明された物質であり、免疫担当細胞において安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この発明のポリペプチドは、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。
【００７９】
この発明のポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明のポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。
【００８０】
斯くも有用なるこの発明のポリペプチドは、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用することにより、所望量を容易に製造することができる。
【００８１】
この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【００８２】
【配列表】

【００８３】

【００８４】

【００８５】

【００８６】

【００８７】

【００８８】

【図面の簡単な説明】
【図１】マウス肝細胞由来の蛋白質をトリプシン消化して得られるペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出パターンを示す図である。
【図２】この発明による組換えＤＮＡである『ｐＨＩＧＩＦ』の構造を示す図である。
【符号の説明】
ＨＩＧＩＦ ｃＤＮＡ この発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
Ｐｔａｃ ｔａｃプロモーター
ＧＳＴ グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子
ＡｍｐＲ アンピシリン耐性遺伝子
ｏｒｉ 大腸菌における複製開始点

Claims (1)

1. 配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列（ただし、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとする。）において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、配列表における配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡの断片と、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び変性サケ精子ＤＮＡを含む混液に浸漬し、６０℃で２０時間インキュベートする条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供すると、分子量１８，５００±３，０００ダルトンに相当する位置にインターフェロン−γ誘導活性のある主たる蛋白質バンドが観察されるまでに精製された、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するヒト由来のポリペプチドであるＩＧＩＦ。

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