JP3542763B2 - インターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する新規な蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】
このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の目的は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質を提供することにある。
【０００５】
この発明の別の目的は、斯かる蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用した当該蛋白質の製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記第一の課題を、下記の理化学的性質を有する蛋白質により解決するものである。
（１） 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定
すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点
クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点
を示す。
（３） 部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を有する
。
（４） 生物作用
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１０】
この発明は、上記第二の課題を、斯かる蛋白質をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、上記第三の課題を、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１２】
この発明は、上記第四の課題を、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１３】
この発明は、上記第五の課題を、当該蛋白質を産生し得る形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋白質を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法により解決するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の蛋白質は、上記したごとく、従来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備しており、免疫担当細胞に作用させると、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１５】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該蛋白質の産生を発現する。
【００１６】
この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該蛋白質の産生を発現する。
【００１７】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該蛋白質を産生する。
【００１８】
斯かる形質転換体をこの発明の製造方法にしたがって培養すれば、所望量の蛋白質が比較的容易に得られる。
【００１９】
以下、実施例、実験例等に基づきこの発明を説明するに、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサイトカイン類につき研究していたところ、マウスの肝臓中にＩＦＮ−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理化学的性質を有するものであることが判明した。
（１） 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定
すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点
クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点
を示す。
（３） 部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を有する
。
（４） 生物作用
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００２０】
次に、これら理化学的性質を解明するに到った一連の実験について説明する。
【００２１】
【実験例１】＜精製蛋白質の調製＞
８週齢の雌ＣＤ−１マウス６００匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して調製した死菌体を１ｍｇ／匹注射投与し、通常一般の方法で７日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１μｇ／匹注射投与した。１乃至２時間後、頚椎を脱臼させてマウスを屠殺し、心臓採血後、肝臓を摘出し、８倍容の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）中、ホモゲナイザーにより破砕して抽出した。抽出物を約８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清約９ｌに飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）を硫酸アンモニウムが４５％飽和になるように加え、４℃で１８時間静置後、約８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して当該蛋白質を含む上清約１９ｌを得た。
【００２２】
この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させておいたファルマシア製『フェニルセファロース』約４．６ｌのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、１Ｍから０．２Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）をＳＶ０．５７で通液した。硫酸アンモニウム濃度が０．８Ｍ付近のときに溶出した当該蛋白質を含む画分約４．８ｌを採取し、膜濃縮し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で１８時間透析後、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させておいたファルマシア製『ＤＥＡＥ−セファロース』約２５０ｍｌのカラムに負荷した。カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）をＳＶ１．２で通液したところ、当該蛋白質が０．１３Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出した。
【００２３】
当該蛋白質を含む溶出液約２６０ｍｌを採取し、濃縮し、２５ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．１）に対して４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一の緩衝液で平衡化させておいたファルマシア製『Ｍｏｎｏ−Ｐ』約２４ｍｌのカラムに負荷し、ｐＨ７からｐＨ４に下降するｐＨ勾配下、カラムに１０％（ｖ／ｖ）ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）を通液したところ、ｐＨが約４．８のときに当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質を含む溶出液約２３ｍｌを採取し、濃縮し、予め７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、３ｍＭ燐酸二水素ナトリウム及び１３９ｍＭ塩化ナトリウムからなる混液（ｐＨ７．２）で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデックス ７５』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液を通液してゲル濾過クロマトグラフィーしたところ、分子量１９，０００ダルトン付近に当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質を含む画分を採取し、濃縮して下記の実験例２に供した。収量は、マウス１匹当たり約０．６μｇであった。
【００２４】
【実験例２】
＜蛋白質の理化学的性質＞
【００２５】
【実験例２−１】＜分子量＞
実験例１で調製した精製蛋白質をユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１９，０００±５，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００２６】
【実験例２−２】
＜等電点＞
精製蛋白質を常法にしたがってクロマトフォーカシングしたところ、４．８±１．０に等電点を示した。
【００２７】
【実験例２−３】
＜部分アミノ酸配列＞
実験例１で調製した精製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｖ／ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間インキュベート後、１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。その後、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に浸漬して染色し、１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールと７％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に１８時間浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアントブルー染色された当該蛋白質を含む部分を切出し、凍結乾燥した。
【００２８】
次に、乾燥ゲルをシグマ製『ＴＰＣＫトリプシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質をトリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪後、遠心分離し上清を採取した。新たに生じた沈澱を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む７０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸及び５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの順序で上記と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清をプールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心濾過した。
【００２９】
斯くして得られたペプチド断片を含む水溶液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＨＰＬＣ ＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で洗浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしながら、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約７５分後又は約５５分後に溶出した画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』又は『ペプチド断片Ｂ』と云う。）を別々に採取した。このときの溶出パターンを図１に示す。
【００３０】
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれらペプチド断片Ａ及びＢのアミノ酸配列を調べたところ、それぞれ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３１】
【実験例２−４】
＜生物作用＞
【００３２】
【実験例２−４】
＜（ａ）免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ産生の誘導＞
８週齢の雌ＢＤＦ１マウスから脾臓を摘出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩衝液（ｐＨ８．０）中に浸漬して溶血させた。得られた脾細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０７個／ｍｌになるように懸濁した後、和光純薬工業製細胞分離用ナイロンウールカラムに負荷し、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、カラムに１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を通液してＴ細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、下記のＩＦＮ−γ誘導試験に供した。
【００３３】
細胞密度１×１０７個／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させたマウスＴ細胞を９６ウエルマイクロプレート上に０．１５ｍｌずつとり、精製蛋白質を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で適宜希釈して０．０５ｍｌ加えた後、０．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡの存在下又は非存在下で５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。その後、各ウエルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩＦＮ−γを通常の酵素免疫測定法により測定した。同時に、精製蛋白質を省略した以外は同一の系を設け、これを上記と同様に処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γの標準品には、米国国立公衆衛生研究所から入手した標準マウスＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を使用し、国際単位（ＩＵ）に換算して表示した。
【００３４】
その結果、対照系において有意なＩＦＮ−γの産生が認められなかったのに対して、精製蛋白質を加えた系では顕著なＩＦＮ−γの産生が認められ、０．０２乃至１０μｇ／ｍｌの用量で、コンカナバリンＡの非存在下でマウスＴ細胞１×１０６個当たり約２乃至２００ＩＵ、コンカナバリンＡの存在下で約２乃至２，０００ＩＵのＩＦＮ−γが産生していた。このことは、当該蛋白質に免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する作用のあることを裏付けている。
【００３５】
なお、この発明を通じて当該蛋白質の１単位とは、コンカナバリンＡの存在下で上記のとおり試験したときに、ＩＦＮ−γを１６０ＩＵ誘導する蛋白質の量と定義する。
【００３６】
【実験例２−４】
＜（ｂ）キラー細胞の細胞障害性増強＞
１００μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に実験例２−４（ａ）と同様に調製したマウス脾細胞を細胞密度１×１０７個／ｍｌになるように浮遊させ、組換え型ヒトインターロイキン２を０、１、５又は１０ｕ／ｍｌ加えた後、２５ｍｌ容培養フラスコに収容した。培養フラスコ内の細胞浮遊液に精製蛋白質を０、０．８、４、２０又は１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で７２時間培養し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）で洗浄後、脾細胞を予め放射性クロム酸ナトリウムで標識したＹＡＣ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１６０）とともに効果細胞／標的細胞比２０：１又は４０：１の割合で新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させた。細胞浮遊液を９６ウェルマイクロプレートにとり、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４時間培養し、培養上清中の５１Ｃｒによる放射能をガンマカウンタにより測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
表１の結果は、この発明の蛋白質にキラー細胞による細胞障害性を有意に増強する性質があり、しかも、その性質がインターロイキン２により顕著に増強されることを示している。
【００３８】
【表１】
【００３９】
以上のような理化学的性質を有する蛋白質は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。そこで、本発明者が、マウス肝細胞からｍＲＮＡを単離し、これを鋳型に前記実験例２−３で明らかにした部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させて当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を採取し、これをプローブにして上記ｍＲＮＡから別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索した結果、４７１塩基対からなる、配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列のＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、当該蛋白質は、１５７個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有していることが判明した。なお、配列表における配列番号３において、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを意味するものとする。
【００４０】
配列表における配列番号３及び４に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作を要約すると、次のようになる。
（１） クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてマウス肝細胞から当該蛋白質を単離し、高度に精製した。
（２） 精製蛋白質をトリプシンで消化し、消化物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（３） マウス肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドのプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させてＤＮＡ断片を調製する一方、それら部分アミノ酸配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにしてそれらＤＮＡ断片を検索し、当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を採取した。
（４） 別途、前記ｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを作製し、これに上記で調製したＤＮＡ断片をプローブにしてハイブリダイズさせ、顕著な会合を示す形質転換体を採取した。
（５） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、その塩基配列を決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列を比較して、その塩基配列が当該蛋白質をコードしていることを確認した。
【００４１】
次の実験例３では、上記の工程（３）乃至（５）を中心に具体的に説明するが、本例で用いた手法自体は斯界において公知であり、例えば、ティー・マニャティス等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、村松正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸善出版発行などにも詳述されている。
【００４２】
【実験例３】
＜ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配列＞
【００４３】
【実験例３−１】
＜全ＲＮＡの調製＞
実験例１と同様にして調製したマウス肝細胞を湿重で３ｇとり、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕した。次に、常法にしたがって、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を２５ｍｌ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍｌ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離後、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、等容量のクロロホルム／イソブタノール混液（４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して下記の実験に供した。なお、全ＲＮＡの収量は約４ｍｇであった。
【００４４】
【実験例３−２】
＜蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片の調製＞
実験例３−１で得た全ＲＮＡ １μｇに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした。混合物を０．５ｍｌ容反応管にとり、常法にしたがって２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートして逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。
【００４５】
この第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μｌに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及びプライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。そして、常法により、混合物を９４℃で１分間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返して反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型に当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー１及びプライマー２は、配列表の配列番号１及び２におけるＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ又はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅで表わされるアミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ、５´−ＡＴＲＴＣＲＴＣＤＡＴＲＴＴＹＴＣＮＧＧ−３´又は５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＴＧＡＣＮＧＡＹＡＴ−３´で表わされる塩基配列を有していた。
【００４６】
このようにして得たＰＣＲ産物の一部をとり、常法により２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動して分画し、ナイロン膜上に移し取り、０．４Ｎ水酸化ナトリウムで固定し、２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、プローブ１として、配列表の配列番号１におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏで表わされるアミノ酸配列に基づき５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＲＡＴＧＧＡＹＣＣ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同位体標識した。このプローブ１を１ｐｍｏｌとり、これと５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４５℃で２４時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。ナイロン膜を６×ＳＳＣで洗浄し、常法によりオートラジオグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣＲ産物に含まれていた。
【００４７】
次に、残りのＰＣＲ産物に宝酒造製プラスミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』を５０ｎｇと適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入し、得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によりファルマシア製大腸菌『ＮｏＶａ Ｂｌｕｅ』株に導入して形質転換体とした。得られた形質転換体を１０ｇ／ｌバクトトリプトン、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌＸ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に植菌し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してコロニーを移し取った後、ナイロン膜を剥離し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸漬し、２×ＳＳＣで洗浄し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬して固定し、５×ＳＳＣでさらに洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、常法にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズさせ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオグラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転換体をプレート培地から採取した。
【００４８】
この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは配列表の配列番号４に示す塩基配列における第８５乃至２８１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４９】
【実験例３−３】
＜ｍＲＮＡの調製＞
実験例３−１で得た全ＲＮＡを含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに１ｍＭ二ナトリウム−ＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加えて全量を１ｍｌとした。混合物に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）３０ラテックス『オリゴテックス−ｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱して変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであった。
【００５０】
【実験例３−４】
＜ｃＤＮＡライブラリーの作製＞
アマシャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、実験例３−３で調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液１μｌ、デオキシヌクレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄＴプライマー溶液１μｌをこの順序で加え、さらに、実験例３−３で得たｍＲＮＡを２μｇ加えた後、滅菌蒸留水で１９μｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００５１】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液を３７．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを２単位加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させてｃＤＮＡを採取した。
【００５２】
このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液を２μｌ、Ｅｃｏ ＲＩアダプターを２５０ピコモル、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏ ＲＩアダプターを連結した。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグラフィーにより未反応のＥｃｏ ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で全量４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ ＲＩ切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱してＤＮＡを採取した。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液を１．５μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で全量１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００５３】
【実験例３−５】
＜組換えＤＮＡのクローニング＞
アマシャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実験例３−４で調製したファージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で６時間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークをナイロン膜上に移し取った後、ナイロン膜を剥離し、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に２分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５分間浸漬した。ナイロン膜を５×ＳＳＣで濯ぎ、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、ナイロン膜をアマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』を用いて ３２ Ｐ標識した実験例３−２で得たプローブ２としてのＤＮＡ断片の適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液中、６０℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせ、以後、前記と同様にオートラジオグラフィーして、プローブ２に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。
【００５４】
常法にしたがってこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入し、形質転換体を得た。
【００５５】
【実験例３−６】
＜塩基配列とアミノ酸配列の決定＞
実験例３−５で調製した形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列番号５に示す５´末端からの塩基配列を含んでおり、その塩基配列を解読したところ、同じく配列番号５に示すＮ末端からのアミノ酸配列をコードしていることが示唆された。このアミノ酸配列においては、その第７９乃至１０３番目又は第２６乃至４３番目に配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列が含まれており、このことは、この発明の蛋白質が配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有するものであり、マウス肝臓においては、当該蛋白質が配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列を有するＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００５６】
以上説明したように、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質は、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この蛋白質を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の蛋白質とその製造方法等につき、具体的に説明する。
【００５７】
この発明でいう蛋白質とは、特定の理化学的性質を具備する、天然由来の蛋白質及び組換えＤＮＡ技術により創製された蛋白質全般を意味する。この発明の蛋白質は、通常、一部又は全部が解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の生物作用を実質的に変えることなく、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の生物作用を保持しているものの、配列番号３のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するかぎり、当然、この発明の蛋白質に包含される。
【００５８】
この発明の蛋白質は、それをコードするＤＮＡを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋白質を培養物から採取することにより製造することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該蛋白質の産生を発現するために、当該蛋白質又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは云うまでもない。
【００５９】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、マウスの肝臓が挙げられ、その細胞からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、例えば、コリネバクテリウム・パルバム、ＢＣＧ、マイトジェン、リポ多糖などの細網内皮系刺激物質で刺激しておいたマウスから肝臓を摘出し、破砕後、全ＲＮＡを単離する。この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース、オリゴ（ｄＴ）ラテックスなどで処理してポリ（Ａ）＋ＲＮＡとした後、蔗糖濃度勾配などにより分画してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮＡとし、これを自律複製可能な適宜ベクターに挿入し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌などの適宜宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用してこの発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、この発明のＤＮＡが得られる。一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００６０】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で発現させるにはｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１２が、また、動物由来の細胞で発現させるにはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１が好適である。
【００６１】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００６２】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を産生するものを選択すればよい。
【００６３】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体又は細胞内外に当該蛋白質を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日間培養すれば、当該蛋白質を含む培養物が得られる。この培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該蛋白質を菌体若しくは菌体破砕物から分離し、精製する。精製には菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性物質を精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
【００６４】
前述のとおり、この発明の蛋白質は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。この性質により、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造の際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、エイズや尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用である。
【００６５】
この発明の蛋白質は、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のために哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、ＭＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＥＬ−４細胞、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化された免疫担当細胞をこの発明の蛋白質を含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物を生理活性物質を精製するための通常一般の方法、すなわち、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００６６】
一方、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためには、哺乳類の体内にこの発明によるＩＦＮ−γ誘導剤を直接投与すればよい。具体的には、この発明のＩＦＮ−γ誘導剤を投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経口投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明の蛋白質を投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であってもよい。この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。
【００６７】
くわえて、この発明の蛋白質はキラー細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、インターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の改善に顕著な効果を発揮する。
【００６８】
以下、形質転換体を用いるこの発明による蛋白質の製造につき、実施例に基づいて具体的に説明する。
【００６９】
【実施例１】
＜複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体＞
宝酒造製ＰＣＲキット『ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ』を使用し、実験例３−１の方法により得た全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを調製した。すなわち、０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を２μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ、２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ及び実験例３−１の方法により得た全ＲＮＡ １μｇをとり、滅菌蒸留水で２０μｌとした。そして、混合物を２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間この順序でインキュベートして第一ストランドｃＤＮＡ含む反応物を得た。
【００７０】
この反応物を２０μｌとり、これに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、配列表の配列番号３におけるＮ末端又はＣ末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣ−３´又は５´−ＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＧ−３´で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。次に、常法により、この混合物を９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断してＢａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００７１】
このＤＮＡ断片を適量の滅菌蒸留水中に１００ｎｇとり、これに、予め制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＧＥＸ−２Ｔ』を１０ｎｇ、適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭになるように加えた後、１６℃で１８時間インキュベートした。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＤＨ５（ＡＴＣＣ５３８６８）株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養した後、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。
【００７２】
この組換えＤＮＡを『ｐＭＧＴＧ−１』と命名するとともに、その構造をジデオキシ法により調べたところ、図２に見られるように、このｐＭＧＴＧ−１においては、配列表における配列番号４に示す塩基配列のＭＧＴＧ ｃＤＮＡがＴａｃプロモータ及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子の下流に連結されていた。
【００７３】
【実施例２】
＜形質転換体による蛋白質の製造＞
実施例１の方法で得た形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、振盪しながら３７℃で１８時間種培養した。種培養物を１％（ｖ／ｖ）の割合で新鮮な１８ｌの同一培地に植菌し、３７℃で通気攪拌培養した。そして、波長６５０ｎｍにおける培養物の吸光度が約０．６に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加え、さらに５時間培養した。その後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、常法により超音波処理後、菌体破砕物を遠心分離し、上清を採取した。
【００７４】
この上清を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたファルマシア製『グルタチオン・セファロース４Ｂ』カラムに負荷し、新鮮な同一緩衝液で洗浄後、カラムに５ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液して蛋白質を溶出させた。次いで、蛋白質を含む画分に採取濃度が２．５ｍＭになるように塩化カルシウムを加えるとともに、トロンビンを１，０００単位加え、２５℃で１８時間インキュベートし、反応物を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたグルタチオン・セファロース４Ｂカラムに通液して非吸着画分を採取した。その後、この画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、比活性約５×１０５単位／ｍｇ蛋白質の当該蛋白質を含む固状物が培養物１ｌ当たり約３ｍｇの収量で得られた。
【００７５】
実験例２と同様にしてこの精製蛋白質の理化学的性質を調べたところ、この精製蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法又はゲル濾過法により測定すると分子量１９，０００±５，０００ダルトンを、また、クロマトフォーカシング法により測定すると４．８±１．０に等電点を示した。さらに、実験例２−４の方法により試験したところ、精製蛋白質は、コンカナバリンＡの非存在下及び存在下で免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ産生をよく誘導し、また、キラー細胞の細胞障害性も顕著に増強した。これは、組換えＤＮＡ技術によっても、当該蛋白質を製造し得ることを裏付けるものである。
【００７６】
【発明の効果】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。この発明の蛋白質は、通常、アミノ酸配列の一部又は全部が解明された物質であり、免疫担当細胞において安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。
【００７７】
この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。くわえて、この発明の蛋白質はキラー細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、インターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の改善に顕著な効果を発揮する。
【００７８】
斯くも有用なるこの発明の蛋白質は、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用することにより、所望量を容易に製造することができる。
【００７９】
この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると言える。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の蛋白質をトリプシン消化して得られるペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出パターンを示す図である。
【図２】この発明による組換えＤＮＡであるｐＭＧＴＧ−１の構造を示す図である。
【符号の説明】
ＭＧＴＧ ｃＤＮＡ ： この発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡ
Ｐｔａｃ ： ｔａｃプロモータ
ＧＳＴ ： グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子
Ａｍｐ Ｒ ： アンピシリン耐性遺伝子
ｐＢＲ３２２ｏｒｉ ： 大腸菌における複製開始点
【発明の属する技術分野】
この発明は、免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導する新規な蛋白質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＦＮ−γは、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫調節作用を有する蛋白質として知られ、抗原やマイトジェンによる刺激を受けた免疫担当細胞が産生すると云われている。これら生物作用ゆえに、ＩＦＮ−γはその発見当初より抗腫瘍剤としての実用化が鶴首され、現在では脳腫瘍を始めとする悪性腫瘍一般の治療剤として精力的に臨床試験が進められている。現在入手し得るＩＦＮ−γは免疫担当細胞が産生する天然型ＩＦＮ−γと、免疫担当細胞から採取したＩＦＮ−γをコードするＤＮＡを大腸菌に導入してなる形質転換体が産生する組換え型ＩＦＮ−γに大別され、上記臨床試験においては、これらのうちのいずれかが「外来ＩＦＮ−γ」として投与されている。
【０００３】
このうち、天然型ＩＦＮ−γは、通常、培養株化した免疫担当細胞をＩＦＮ−γ誘導剤を含む培養培地で培養し、その培養物を精製することにより製造される。この方法では、ＩＦＮ−γ誘導剤の種類がＩＦＮ−γの産生量や精製のし易さ、さらには、製品の安全性等に多大の影響を及ぼすと云われており、通常、コンカナバリンＡ、レンズ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、エンドトキシン、リポ多糖などのマイトジェンが頻用される。しかしながら、これら物質は、いずれも分子に多様性があり、給源や精製方法に依って品質が変動し易く、誘導能の一定したＩＦＮ−γ誘導剤を所望量入手し難いという問題がある。くわえて、上記物質の多くは生体に投与すると顕著な副作用を示したり、物質に依っては毒性を示すものすらあり、生体に直接投与してＩＦＮ−γの産生を誘導するのが極めて困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明の目的は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質を提供することにある。
【０００５】
この発明の別の目的は、斯かる蛋白質をコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用した当該蛋白質の製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、上記第一の課題を、下記の理化学的性質を有する蛋白質により解決するものである。
（１） 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定
すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点
クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点
を示す。
（３） 部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を有する
。
（４） 生物作用
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１０】
この発明は、上記第二の課題を、斯かる蛋白質をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１１】
この発明は、上記第三の課題を、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１２】
この発明は、上記第四の課題を、斯かるＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１３】
この発明は、上記第五の課題を、当該蛋白質を産生し得る形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋白質を培養物から採取してなる蛋白質の製造方法により解決するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の蛋白質は、上記したごとく、従来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備しており、免疫担当細胞に作用させると、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００１５】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、この組換えＤＮＡを、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該蛋白質の産生を発現する。
【００１６】
この発明の複製可能な組換えＤＮＡは、本来、当該蛋白質を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該蛋白質の産生を発現する。
【００１７】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該蛋白質を産生する。
【００１８】
斯かる形質転換体をこの発明の製造方法にしたがって培養すれば、所望量の蛋白質が比較的容易に得られる。
【００１９】
以下、実施例、実験例等に基づきこの発明を説明するに、この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。本発明者が、哺乳類由来の細胞が産生するサイトカイン類につき研究していたところ、マウスの肝臓中にＩＦＮ−γの産生を誘導する従来未知の全く新規な物質が存在することを見出した。カラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの物質を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質は蛋白質であり、次のような理化学的性質を有するものであることが判明した。
（１） 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はゲル濾過法で測定
すると、分子量１９，０００±５，０００ダルトンを示す。
（２） 等電点
クロマトフォーカシング法で測定すると、４．８±１．０に等電点
を示す。
（３） 部分アミノ酸配列
配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を有する
。
（４） 生物作用
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。
【００２０】
次に、これら理化学的性質を解明するに到った一連の実験について説明する。
【００２１】
【実験例１】＜精製蛋白質の調製＞
８週齢の雌ＣＤ−１マウス６００匹の腹腔内にコリネバクテリウム・パルバム（ＡＴＣＣ１１８２７）を６０℃で１時間加熱して調製した死菌体を１ｍｇ／匹注射投与し、通常一般の方法で７日間飼育後、静脈内に大腸菌由来の精製リポ多糖を１μｇ／匹注射投与した。１乃至２時間後、頚椎を脱臼させてマウスを屠殺し、心臓採血後、肝臓を摘出し、８倍容の５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）中、ホモゲナイザーにより破砕して抽出した。抽出物を約８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清約９ｌに飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）を硫酸アンモニウムが４５％飽和になるように加え、４℃で１８時間静置後、約８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して当該蛋白質を含む上清約１９ｌを得た。
【００２２】
この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させておいたファルマシア製『フェニルセファロース』約４．６ｌのカラムに負荷し、カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、１Ｍから０．２Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．３）をＳＶ０．５７で通液した。硫酸アンモニウム濃度が０．８Ｍ付近のときに溶出した当該蛋白質を含む画分約４．８ｌを採取し、膜濃縮し、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対して４℃で１８時間透析後、予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化させておいたファルマシア製『ＤＥＡＥ−セファロース』約２５０ｍｌのカラムに負荷した。カラムを新鮮な同一緩衝液で洗浄後、０Ｍから０．２Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６．５）をＳＶ１．２で通液したところ、当該蛋白質が０．１３Ｍ付近の塩化ナトリウム濃度で溶出した。
【００２３】
当該蛋白質を含む溶出液約２６０ｍｌを採取し、濃縮し、２５ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ７．１）に対して４℃で１８時間透析後、予め新鮮な同一の緩衝液で平衡化させておいたファルマシア製『Ｍｏｎｏ−Ｐ』約２４ｍｌのカラムに負荷し、ｐＨ７からｐＨ４に下降するｐＨ勾配下、カラムに１０％（ｖ／ｖ）ポリバッファー７４（ｐＨ４．０）を通液したところ、ｐＨが約４．８のときに当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質を含む溶出液約２３ｍｌを採取し、濃縮し、予め７ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、３ｍＭ燐酸二水素ナトリウム及び１３９ｍＭ塩化ナトリウムからなる混液（ｐＨ７．２）で平衡化させておいたファルマシア製『スーパーデックス ７５』のカラムに負荷し、新鮮な同一混液を通液してゲル濾過クロマトグラフィーしたところ、分子量１９，０００ダルトン付近に当該蛋白質が溶出した。当該蛋白質を含む画分を採取し、濃縮して下記の実験例２に供した。収量は、マウス１匹当たり約０．６μｇであった。
【００２４】
【実験例２】
＜蛋白質の理化学的性質＞
【００２５】
【実験例２−１】＜分子量＞
実験例１で調製した精製蛋白質をユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じ、還元剤の非存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量１９，０００±５，０００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある主たるバンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，４００ダルトン）であった。
【００２６】
【実験例２−２】
＜等電点＞
精製蛋白質を常法にしたがってクロマトフォーカシングしたところ、４．８±１．０に等電点を示した。
【００２７】
【実験例２−３】
＜部分アミノ酸配列＞
実験例１で調製した精製蛋白質を含む水溶液の一部をとり、約５０μｌまで濃縮した。濃縮物に３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０％（ｖ／ｖ）グリセロール及びジチオトレイトール６０ｍｇ／ｍｌからなる混液２５μｌを加え、５０℃で３０分間インキュベート後、１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上に移し、常法にしたがって電気泳動した。その後、ゲルを０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性メタノールと１０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液に浸漬して染色し、１２％（ｖ／ｖ）水性メタノールと７％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の混液で繰返し濯いで脱色し、蒸留水中に１８時間浸漬して洗浄後、ゲルよりクーマシーブリリアントブルー染色された当該蛋白質を含む部分を切出し、凍結乾燥した。
【００２８】
次に、乾燥ゲルをシグマ製『ＴＰＣＫトリプシン』２μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム及び０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０水溶液からなる混液０．６ｍｌに浸漬し、３７℃で１８時間インキュベートして蛋白質をトリプシン消化した。そして、消化物を遠心分離して上清を採取する一方、沈澱部を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸１ｍｌに浸漬し、室温下で４時間振盪後、遠心分離し上清を採取した。新たに生じた沈澱を０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む７０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸、０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５０％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸及び５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルの順序で上記と同様に処理し、得られた上清と上記で得られた上清をプールし、２５０μｌまで濃縮後、遠心濾過した。
【００２９】
斯くして得られたペプチド断片を含む水溶液を、予め０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で平衡化させておいた東ソー製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＨＰＬＣ ＯＤＳ−１２０Ｔ』に負荷し、カラムを０．１％（ｖ／ｖ）水性トリフルオロ酢酸で洗浄後、溶出液中のペプチド濃度を吸光光度計により２１４ｎｍ及び２８０ｎｍの波長下でモニタしながら、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．５ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約７５分後又は約５５分後に溶出した画分（以下、それぞれ『ペプチド断片Ａ』又は『ペプチド断片Ｂ』と云う。）を別々に採取した。このときの溶出パターンを図１に示す。
【００３０】
パーキン・エルマー製プロテイン・シーケンサ『４７３Ａ型』を使用し、常法にしたがってこれらペプチド断片Ａ及びＢのアミノ酸配列を調べたところ、それぞれ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００３１】
【実験例２−４】
＜生物作用＞
【００３２】
【実験例２−４】
＜（ａ）免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ産生の誘導＞
８週齢の雌ＢＤＦ１マウスから脾臓を摘出し、血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）中で分散し、新鮮な同一培地で洗浄後、ゲイ緩衝液（ｐＨ８．０）中に浸漬して溶血させた。得られた脾細胞を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に細胞密度１×１０７個／ｍｌになるように懸濁した後、和光純薬工業製細胞分離用ナイロンウールカラムに負荷し、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で１時間インキュベートした。その後、カラムに１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）を通液してＴ細胞を採取し、新鮮な同一培地で洗浄し、下記のＩＦＮ−γ誘導試験に供した。
【００３３】
細胞密度１×１０７個／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）に浮遊させたマウスＴ細胞を９６ウエルマイクロプレート上に０．１５ｍｌずつとり、精製蛋白質を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．４）で適宜希釈して０．０５ｍｌ加えた後、０．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡの存在下又は非存在下で５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２４時間培養した。その後、各ウエルから培養上清を０．１ｍｌずつ採取し、産生したＩＦＮ−γを通常の酵素免疫測定法により測定した。同時に、精製蛋白質を省略した以外は同一の系を設け、これを上記と同様に処置して対照とした。なお、ＩＦＮ−γの標準品には、米国国立公衆衛生研究所から入手した標準マウスＩＦＮ−γ（Ｇｇ０２−９０１−５３３）を使用し、国際単位（ＩＵ）に換算して表示した。
【００３４】
その結果、対照系において有意なＩＦＮ−γの産生が認められなかったのに対して、精製蛋白質を加えた系では顕著なＩＦＮ−γの産生が認められ、０．０２乃至１０μｇ／ｍｌの用量で、コンカナバリンＡの非存在下でマウスＴ細胞１×１０６個当たり約２乃至２００ＩＵ、コンカナバリンＡの存在下で約２乃至２，０００ＩＵのＩＦＮ−γが産生していた。このことは、当該蛋白質に免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する作用のあることを裏付けている。
【００３５】
なお、この発明を通じて当該蛋白質の１単位とは、コンカナバリンＡの存在下で上記のとおり試験したときに、ＩＦＮ−γを１６０ＩＵ誘導する蛋白質の量と定義する。
【００３６】
【実験例２−４】
＜（ｂ）キラー細胞の細胞障害性増強＞
１００μｇ／ｍｌカナマイシン、５×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に実験例２−４（ａ）と同様に調製したマウス脾細胞を細胞密度１×１０７個／ｍｌになるように浮遊させ、組換え型ヒトインターロイキン２を０、１、５又は１０ｕ／ｍｌ加えた後、２５ｍｌ容培養フラスコに収容した。培養フラスコ内の細胞浮遊液に精製蛋白質を０、０．８、４、２０又は１００単位／ｍｌ加え、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で７２時間培養し、新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）で洗浄後、脾細胞を予め放射性クロム酸ナトリウムで標識したＹＡＣ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１６０）とともに効果細胞／標的細胞比２０：１又は４０：１の割合で新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）に浮遊させた。細胞浮遊液を９６ウェルマイクロプレートにとり、５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で４時間培養し、培養上清中の５１Ｃｒによる放射能をガンマカウンタにより測定した。結果を表１に示す。
【００３７】
表１の結果は、この発明の蛋白質にキラー細胞による細胞障害性を有意に増強する性質があり、しかも、その性質がインターロイキン２により顕著に増強されることを示している。
【００３８】
【表１】
以上のような理化学的性質を有する蛋白質は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。そこで、本発明者が、マウス肝細胞からｍＲＮＡを単離し、これを鋳型に前記実験例２−３で明らかにした部分アミノ酸配列に基づき化学合成したプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させて当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を採取し、これをプローブにして上記ｍＲＮＡから別途作製したｃＤＮＡライブラリーを鋭意検索した結果、４７１塩基対からなる、配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列のＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、当該蛋白質は、１５７個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有していることが判明した。なお、配列表における配列番号３において、符号「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、メチオニン又はトレオニンを意味するものとする。
【００４０】
配列表における配列番号３及び４に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の操作を要約すると、次のようになる。
（１） クロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてマウス肝細胞から当該蛋白質を単離し、高度に精製した。
（２） 精製蛋白質をトリプシンで消化し、消化物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（３） マウス肝細胞からｍＲＮＡを採取し、これを鋳型に上記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドのプライマーの存在下でＲＴ−ＰＣＲ反応させてＤＮＡ断片を調製する一方、それら部分アミノ酸配列に基づき別途化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにしてそれらＤＮＡ断片を検索し、当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を採取した。
（４） 別途、前記ｍＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡライブラリーを作製し、これに上記で調製したＤＮＡ断片をプローブにしてハイブリダイズさせ、顕著な会合を示す形質転換体を採取した。
（５） 形質転換体からｃＤＮＡを採取し、その塩基配列を決定し、解読するとともに、解読したアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列を比較して、その塩基配列が当該蛋白質をコードしていることを確認した。
【００４１】
次の実験例３では、上記の工程（３）乃至（５）を中心に具体的に説明するが、本例で用いた手法自体は斯界において公知であり、例えば、ティー・マニャティス等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー発行や、村松正実『ラボマニュアル遺伝子工学』、１９８８年、丸善出版発行などにも詳述されている。
【００４２】
【実験例３】
＜ＤＮＡの塩基配列と蛋白質のアミノ酸配列＞
【００４３】
【実験例３−１】
＜全ＲＮＡの調製＞
実験例１と同様にして調製したマウス肝細胞を湿重で３ｇとり、これを６Ｍグアニジンイソチオシアナート、１０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳからなる混液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに浸漬し、ホモゲナイザーで破砕した。次に、常法にしたがって、３５ｍｌ容遠心管に５．７Ｍ塩化セシウムを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を２５ｍｌ注入し、その上部に細胞破砕物を１０ｍｌ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍで２０時間超遠心分離後、ＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心管にとり、等容量のクロロホルム／イソブタノール混液（４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈澱させた。この沈澱を採取し、７５％（ｖ／ｖ）水性エタノールで洗浄後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して下記の実験に供した。なお、全ＲＮＡの収量は約４ｍｇであった。
【００４４】
【実験例３−２】
＜蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片の調製＞
実験例３−１で得た全ＲＮＡ １μｇに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム）を２μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ及び２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした。混合物を０．５ｍｌ容反応管にとり、常法にしたがって２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間インキュベートして逆転写酵素反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。
【００４５】
この第一ストランドｃＤＮＡ水溶液２０μｌに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、さらに、センスプライマー又はアンチセンスプライマーとしてプライマー１及びプライマー２をそれぞれ１ｐｍｏｌずつ加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。そして、常法により、混合物を９４℃で１分間、４５℃で２分間、７２℃で３分間の順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返して反応させ、第一ストランドｃＤＮＡを鋳型に当該蛋白質を部分コードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、プライマー１及びプライマー２は、配列表の配列番号１及び２におけるＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ又はＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅで表わされるアミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドであり、それぞれ、５´−ＡＴＲＴＣＲＴＣＤＡＴＲＴＴＹＴＣＮＧＧ−３´又は５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＹＡＴＧＡＣＮＧＡＹＡＴ−３´で表わされる塩基配列を有していた。
【００４６】
このようにして得たＰＣＲ産物の一部をとり、常法により２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動して分画し、ナイロン膜上に移し取り、０．４Ｎ水酸化ナトリウムで固定し、２×ＳＳＣで洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。別途、プローブ１として、配列表の配列番号１におけるＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏで表わされるアミノ酸配列に基づき５´−ＴＴＹＧＡＲＧＡＲＡＴＧＧＡＹＣＣ−３´で表わされる塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより同位体標識した。このプローブ１を１ｐｍｏｌとり、これと５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む混液にナイロン膜を浸漬し、４５℃で２４時間インキュベートしてハイブリダイズさせた。ナイロン膜を６×ＳＳＣで洗浄し、常法によりオートラジオグラフィーしたところ、目的とするＤＮＡ断片がＰＣＲ産物に含まれていた。
【００４７】
次に、残りのＰＣＲ産物に宝酒造製プラスミドベクター『ｐＴ７ブルーＴ』を５０ｎｇと適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、さらに、１００ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加えた後、１６℃で１８時間インキュベートしてプラスミドベクターにＤＮＡ断片を挿入し、得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法によりファルマシア製大腸菌『ＮｏＶａ Ｂｌｕｅ』株に導入して形質転換体とした。得られた形質転換体を１０ｇ／ｌバクトトリプトン、２．５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｇ／ｌバクトアガー、１００ｍｇ／ｌアンピシリン、４０ｍｇ／ｌＸ−Ｇａｌ及び２３．８ｍｇ／ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する。）を含むプレート培地に植菌し、３７℃で２４時間培養してコロニーを形成させた。常法にしたがって、プレート培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してコロニーを移し取った後、ナイロン膜を剥離し、０．５Ｎ水酸化ナトリウム及び１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む混液に７分間浸漬して溶菌した。その後、ナイロン膜を１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に３分間浸漬し、２×ＳＳＣで洗浄し、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに２０分間浸漬して固定し、５×ＳＳＣでさらに洗浄し、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、常法にしたがってナイロン膜にプローブ１をハイブリダイズさせ、６×ＳＳＣで洗浄後、前記と同様にオートラジオグラフィーし、プローブ１と顕著な会合を示した形質転換体をプレート培地から採取した。
【００４８】
この形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを採取した。ジデオキシ法により調べたところ、この組換えＤＮＡは配列表の配列番号４に示す塩基配列における第８５乃至２８１番目に相当する塩基配列のＤＮＡ断片を含んでいた。
【００４９】
【実験例３−３】
＜ｍＲＮＡの調製＞
実験例３−１で得た全ＲＮＡを含む水溶液を０．０５ｍｌとり、これに１ｍＭ二ナトリウム−ＥＤＴＡと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍｌ加えて全量を１ｍｌとした。混合物に日本ロシュ製オリゴ（ｄＴ）３０ラテックス『オリゴテックス−ｄＴ３０スーパー』を１ｍｌ加え、６５℃で５分間加熱して変性させた後、直ちに氷浴中で３分間冷却した。５Ｍ塩化ナトリウムを０．２ｍｌを加え、３７℃で１０分間インキュベートし、２５℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いて得られたペレット状の沈澱に滅菌蒸留水０．５ｍｌを加えて懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートしてオリゴテックスからｍＲＮＡを溶出させた。回収したｍＲＮＡは約５μｇであった。
【００５０】
【実験例３−４】
＜ｃＤＮＡライブラリーの作製＞
アマシャム製ｃＤＮＡクローニングキット『ｃＤＮＡ合成システム・プラス』を使用し、実験例３−３で調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。すなわち、１．５ｍｌ容反応管に第一ストランドｃＤＮＡ合成用溶液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１μｌ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター溶液１μｌ、デオキシヌクレオチド三燐酸混合液２μｌ及びオリゴｄＴプライマー溶液１μｌをこの順序で加え、さらに、実験例３−３で得たｍＲＮＡを２μｇ加えた後、滅菌蒸留水で１９μｌとした。混合物に逆転写酵素２０単位を含む溶液１μｌを加え、４２℃で４０分間インキュベートして第一ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。
【００５１】
反応物に第二ストランドｃＤＮＡ合成用溶液を３７．５μｌ、大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨを０．８単位、ＤＮＡポリメラーゼＩを２３単位この順序で加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした後、１２℃で６０分間、２２℃で６０分間インキュベートし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを２単位加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートして第二ストランドｃＤＮＡを含む反応物を得た。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４μｌ加えて反応を停止させた後、常法によりフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させてｃＤＮＡを採取した。
【００５２】
このようにして得たｃＤＮＡにＬ／Ｋ緩衝液を２μｌ、Ｅｃｏ ＲＩアダプターを２５０ピコモル、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位この順序で加え、滅菌蒸留水で２０μｌとした後、１５℃で１６時間インキュベートしてｃＤＮＡ両端にＥｃｏ ＲＩアダプターを連結した。反応物に０．２５Ｍ ＥＤＴＡを２μｌ加えて酵素を失活させ、常法により分子篩クロマトグラフィーにより未反応のＥｃｏ ＲＩアダプターを除去し、Ｌ／Ｋ緩衝液を４０μｌとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを８０単位加え、滅菌蒸留水で全量４００μｌとし、３７℃で３０分間インキュベートしてＥｃｏ ＲＩ切断部位をメチル化した後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱してＤＮＡを採取した。ＤＮＡに適量のλｇｔ１０アームを含むＬ／Ｋ緩衝液を１．５μｌとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２．５単位加え、滅菌蒸留水で全量１５μｌとし、１５℃で１６時間インキュベートしてライゲートした後、通常の生体外パッケージングを適用して組換えλＤＮＡを含むファージを得た。
【００５３】
【実験例３−５】
＜組換えＤＮＡのクローニング＞
アマシャム製大腸菌ＮＭ５１４株に実験例３−４で調製したファージを常法により感染させた後、１０ｇ／ｌバクトトリプトン、５ｇ／ｌバクトイーストエキストラクト、１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム及び１５ｇ／ｌバクトアガーを含む寒天培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で６時間培養してプラークを形成させた。寒天培地にナイロン膜を載置し、約３０秒間静置してプラークをナイロン膜上に移し取った後、ナイロン膜を剥離し、先ず、０．５Ｍ水酸化ナトリウムと１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む水溶液に２分間、次に、１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５分間浸漬した。ナイロン膜を５×ＳＳＣで濯ぎ、風乾後、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液に浸漬し、６５℃で３時間インキュベートした。その後、ナイロン膜をアマシャム製ＤＮＡ標識キット『レディ・プライムＤＮＡ標識システム』を用いて ３２ Ｐ標識した実験例３−２で得たプローブ２としてのＤＮＡ断片の適量と５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡを１００μｇ／ｍｌ含む混液中、６０℃で２０時間インキュベートしてハイブリダイズさせ、以後、前記と同様にオートラジオグラフィーして、プローブ２に顕著な会合を示したファージＤＮＡクローンを採取した。
【００５４】
常法にしたがってこのクローンを大腸菌中で増幅し、菌体から組換えＤＮＡを抽出した。組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩで切断する一方、プラスミドベクターｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）を同じ制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片とプラスミド断片を常法によりＤＮＡリガーゼで連結して組換えＤＮＡとした。そして、この組換えＤＮＡを通常のコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に導入し、形質転換体を得た。
【００５５】
【実験例３−６】
＜塩基配列とアミノ酸配列の決定＞
実験例３−５で調製した形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した。培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してこの発明のＤＮＡを含む組換えＤＮＡを得た。蛍光光度計を使用する自動シーケンサにより分析したところ、この組換えＤＮＡは配列表における配列番号５に示す５´末端からの塩基配列を含んでおり、その塩基配列を解読したところ、同じく配列番号５に示すＮ末端からのアミノ酸配列をコードしていることが示唆された。このアミノ酸配列においては、その第７９乃至１０３番目又は第２６乃至４３番目に配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列が含まれており、このことは、この発明の蛋白質が配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列を有するものであり、マウス肝臓においては、当該蛋白質が配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列を有するＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００５６】
以上説明したように、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質は、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の蛋白質には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この蛋白質を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の蛋白質とその製造方法等につき、具体的に説明する。
【００５７】
この発明でいう蛋白質とは、特定の理化学的性質を具備する、天然由来の蛋白質及び組換えＤＮＡ技術により創製された蛋白質全般を意味する。この発明の蛋白質は、通常、一部又は全部が解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号３に示すＮ末端からのアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の生物作用を実質的に変えることなく、配列番号３のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の生物作用を保持しているものの、配列番号３のアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それが免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するかぎり、当然、この発明の蛋白質に包含される。
【００５８】
この発明の蛋白質は、それをコードするＤＮＡを含む形質転換体を栄養培地で培養し、産生した蛋白質を培養物から採取することにより製造することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号４に示す５´末端からの塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該蛋白質の産生を発現するために、当該蛋白質又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは云うまでもない。
【００５９】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、マウスの肝臓が挙げられ、その細胞からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、例えば、コリネバクテリウム・パルバム、ＢＣＧ、マイトジェン、リポ多糖などの細網内皮系刺激物質で刺激しておいたマウスから肝臓を摘出し、破砕後、全ＲＮＡを単離する。この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース、オリゴ（ｄＴ）ラテックスなどで処理してポリ（Ａ）＋ＲＮＡとした後、蔗糖濃度勾配などにより分画してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮＡとし、これを自律複製可能な適宜ベクターに挿入し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌などの適宜宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用してこの発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、この発明のＤＮＡが得られる。一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００６０】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１などのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの原核生物で発現させるにはｐＫＫ２２３−２、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２ ＤＮＡ、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１２が、また、動物由来の細胞で発現させるにはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢＩ１２１が好適である。
【００６１】
斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られた組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００６２】
この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、栄養培地で培養し、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する蛋白質を産生するものを選択すればよい。
【００６３】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体又は細胞内外に当該蛋白質を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約１乃至１０日間培養すれば、当該蛋白質を含む培養物が得られる。この培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該蛋白質を菌体若しくは菌体破砕物から分離し、精製する。精製には菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性物質を精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製した蛋白質を濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
【００６４】
前述のとおり、この発明の蛋白質は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する性質を有する。この性質により、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造の際の誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有する、例えば、エイズや尖圭コンジロムなどのウイルス性疾患、腎臓癌、肉芽腫、菌状息肉症、脳腫瘍などの悪性腫瘍、関節リウマチやアレルギー症などの免疫疾患に対する治療剤・予防剤として有用である。
【００６５】
この発明の蛋白質は、通常、免疫担当細胞を培養してＩＦＮ−γを製造するための培養培地に共存させるか、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のために哺乳類の体内に直接投与される。すなわち、前者の用途においては、哺乳類の末梢血から分離される白血球や、例えば、ＨＢＬ−３８細胞、ＭＯ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＥＬ−４細胞、Ｌ１２−Ｒ４細胞などの培養株化された免疫担当細胞をこの発明の蛋白質を含む適宜の培養培地に浮遊させる。必要に応じて、培養培地にマイトジェンやインターロイキン２、抗ＣＤ３抗体などのＴ細胞刺激物質を加え、培養培地を温度約３０乃至４０℃、ｐＨ約５乃至８に保ちつつ、培養培地を適宜新鮮なものと取替えながら、通常一般の方法により約１乃至１００時間培養する。斯くして得られる培養物を生理活性物質を精製するための通常一般の方法、すなわち、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用することにより、ＩＦＮ−γを採取することができる。
【００６６】
一方、ＩＦＮ−γ感受性疾患の治療・予防のためには、哺乳類の体内にこの発明によるＩＦＮ−γ誘導剤を直接投与すればよい。具体的には、この発明のＩＦＮ−γ誘導剤を投与に適した適宜剤型に調製後、哺乳類に経口投与するか、例えば、皮内、皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内に注射投与する。この発明の蛋白質を投与し得る哺乳類はヒトに限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サルなどの哺乳動物であってもよい。この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。
【００６７】
くわえて、この発明の蛋白質はキラー細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、インターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の改善に顕著な効果を発揮する。
【００６８】
以下、形質転換体を用いるこの発明による蛋白質の製造につき、実施例に基づいて具体的に説明する。
【００６９】
【実施例１】
＜複製可能な組換えＤＮＡと形質転換体＞
宝酒造製ＰＣＲキット『ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ』を使用し、実験例３−１の方法により得た全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを調製した。すなわち、０．５ｍｌ容反応管に２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を２μｌ、１ｍＭ ｄＮＴＰミックスを８μｌ、１単位／μｌのＲＮａｓｅインヒビターを１μｌ、２．５単位／μｌの逆転写酵素を１μｌ、２．５μＭランダムヘキサマーを１μｌ及び実験例３−１の方法により得た全ＲＮＡ １μｇをとり、滅菌蒸留水で２０μｌとした。そして、混合物を２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間この順序でインキュベートして第一ストランドｃＤＮＡ含む反応物を得た。
【００７０】
この反応物を２０μｌとり、これに２５ｍＭ塩化マグネシウムを４μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を８μｌ、２．５単位／μｌアンプリタックＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、配列表の配列番号３におけるＮ末端又はＣ末端付近のアミノ酸配列に基づき化学合成した５´−ＣＧＡＧＧＧＡＴＣＧＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＣ−３´又は５´−ＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＡＡＧ−３´で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの適量を加え、滅菌蒸留水で１００μｌとした。次に、常法により、この混合物を９４℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間この順序でインキュベートするサイクルを４０回繰返し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断してＢａｍ ＨＩ−Ｅｃｏ ＲＩ ＤＮＡ断片を得た。
【００７１】
このＤＮＡ断片を適量の滅菌蒸留水中に１００ｎｇとり、これに、予め制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩで切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＧＥＸ−２Ｔ』を１０ｎｇ、適量のＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び１０ｍＭ ＡＴＰを最終濃度１ｍＭになるように加えた後、１６℃で１８時間インキュベートした。得られた組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＤＨ５（ＡＴＣＣ５３８６８）株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間培養した後、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。
【００７２】
この組換えＤＮＡを『ｐＭＧＴＧ−１』と命名するとともに、その構造をジデオキシ法により調べたところ、図２に見られるように、このｐＭＧＴＧ−１においては、配列表における配列番号４に示す塩基配列のＭＧＴＧ ｃＤＮＡがＴａｃプロモータ及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子の下流に連結されていた。
【００７３】
【実施例２】
＜形質転換体による蛋白質の製造＞
実施例１の方法で得た形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、振盪しながら３７℃で１８時間種培養した。種培養物を１％（ｖ／ｖ）の割合で新鮮な１８ｌの同一培地に植菌し、３７℃で通気攪拌培養した。そして、波長６５０ｎｍにおける培養物の吸光度が約０．６に達した時点でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加え、さらに５時間培養した。その後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム及び４ｍＭ燐酸二水素ナトリウムを含む混液（ｐＨ７．３）に浮遊させ、常法により超音波処理後、菌体破砕物を遠心分離し、上清を採取した。
【００７４】
この上清を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたファルマシア製『グルタチオン・セファロース４Ｂ』カラムに負荷し、新鮮な同一緩衝液で洗浄後、カラムに５ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液して蛋白質を溶出させた。次いで、蛋白質を含む画分に採取濃度が２．５ｍＭになるように塩化カルシウムを加えるとともに、トロンビンを１，０００単位加え、２５℃で１８時間インキュベートし、反応物を予め１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたグルタチオン・セファロース４Ｂカラムに通液して非吸着画分を採取した。その後、この画分を濃縮し、凍結乾燥したところ、比活性約５×１０５単位／ｍｇ蛋白質の当該蛋白質を含む固状物が培養物１ｌ当たり約３ｍｇの収量で得られた。
【００７５】
実験例２と同様にしてこの精製蛋白質の理化学的性質を調べたところ、この精製蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法又はゲル濾過法により測定すると分子量１９，０００±５，０００ダルトンを、また、クロマトフォーカシング法により測定すると４．８±１．０に等電点を示した。さらに、実験例２−４の方法により試験したところ、精製蛋白質は、コンカナバリンＡの非存在下及び存在下で免疫担当細胞におけるＩＦＮ−γ産生をよく誘導し、また、キラー細胞の細胞障害性も顕著に増強した。これは、組換えＤＮＡ技術によっても、当該蛋白質を製造し得ることを裏付けるものである。
【００７６】
【発明の効果】
この発明は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質の発見に基づくものである。この発明の蛋白質は、通常、アミノ酸配列の一部又は全部が解明された物質であり、免疫担当細胞において安定したＩＦＮ−γ誘導能を発揮する。これにより、この発明の蛋白質は、細胞培養法によりＩＦＮ−γを製造するためのＩＦＮ−γ誘導剤として、さらには、ＩＦＮ−γに感受性を有するウイルス性疾患、悪性腫瘍、免疫疾患一般に対する治療剤・予防剤として多種多様の用途を有することとなる。
【００７７】
この発明の蛋白質は強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γ産生を誘導でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の蛋白質は、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。くわえて、この発明の蛋白質はキラー細胞による細胞障害性を増強する性質が顕著なことから、インターロイキン２や腫瘍壊死因子と適宜併用することにより、養子免疫療法による肺癌、腎臓癌、乳癌などの固形癌を含む悪性腫瘍の治療における治療効果や副作用の改善に顕著な効果を発揮する。
【００７８】
斯くも有用なるこの発明の蛋白質は、これをコードするこの発明のＤＮＡを利用することにより、所望量を容易に製造することができる。
【００７９】
この発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると言える。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の蛋白質をトリプシン消化して得られるペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出パターンを示す図である。
【図２】この発明による組換えＤＮＡであるｐＭＧＴＧ−１の構造を示す図である。
【符号の説明】
ＭＧＴＧ ｃＤＮＡ ： この発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡ
Ｐｔａｃ ： ｔａｃプロモータ
ＧＳＴ ： グルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子
Ａｍｐ Ｒ ： アンピシリン耐性遺伝子
ｐＢＲ３２２ｏｒｉ ： 大腸菌における複製開始点
Claims (2)
- インターフェロン−γに感受性を有する疾患に対する治療剤・予防剤の製造のための、配列表における配列番号３（ただし、「Ｘａａ」はメチオニン又はトレオニンを意味するものとする。）に示すアミノ酸配列又は、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するとともに、キラー細胞による細胞傷害性を増強する蛋白質の使用方法。
- インターフェロン−γ誘導剤の製造のための、配列表における配列番号３（ただし、「Ｘａａ」はメチオニン又はトレオニンを意味するものとする。）に示すアミノ酸配列又は、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有し、免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導するとともに、キラー細胞による細胞傷害性を増強する蛋白質の使用方法。
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