KR930000187B1 - Dna 재조합 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법 및 상기 물질을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

DNA 재조합 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법 및 상기 물질을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말의 제조방법

제1도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 DNA를 함유하는 각 플라스미드 삽입물의 제한 지도를 나타낸 것이다.

제2도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 재조합 DNA( pT NF-lac-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.

제3도는 종래의 토끼 생리적 활성 폴리펩티드를 코오딩하는 또다른 재조합 DNA(pTNF-lacUV5-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.

제4도는 본 발명에 사용되는 생리적 활성물질의 유전자를 함유하는 플라스미드 부분의 제한 지도를 나타낸 것이다.

제5도는 종래의 토끼 TNF의 유전자를 함유하는 플라스미드 부분의 제한 지도를 나타낸 것이다.

제6도는 본 발명에 사용되는 생리적 활성물질을 코오딩하는 재조합 DNA( pHTNF-lacUV5-1)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.

제7도는 본 발명에 사용되는 생리적 활성물질을 코오딩하는 또다른 재조합 DNA(pHTNF-lacUV5-2)를 제조하는 방법의 유통도를 나타낸 것이다.

제8도는 4℃에서 7일 동안 저장한 후, 본 발명에 사용되는 생리적 활성물질의 잔류활성에 대한 인체 혈청 알부민 농도의 영향을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 DNA 재조합 기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법, 보다 상세히는 DNA 재조합 기술에 의해 제조되고 항종양 활성을 갖는 생리적 활성물질을 함유하는 수용액 또는 분말에 알부민을 가하는 것을 특징으로 하는, 생리적 활성물질의 안정화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생리적 활성물질 및 유효량의 알부민을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말에 관한 것이다.

인체로부터 유도되고, L-M 세포에 대한 세포 독성 활성을 가지며, BALB/c 생쥐에 이식된 종양인 Meth A 육종의 출혈성 괴사를 유도할 수 있는 생리적 활성 성분이 공지되어 있다. 상기한 생리적 활성물질은 항종양 활성을 가지므로 인체 종양 괴사 인자(이하에서는 “인체 TNF”로 기재함)로 불리운다. 또한 상기 생리적 활성물질은 시험관내에서 정상적인 세포에 대하여 독성을 갖지 않는다고 알려져 있다. 또한, 생리적 활성물질이 인체로부터 유도되므로, 근원이 다른 물질을 인체내에 투여할때 유발될 수 있는 아나필락틱 쇼크에 대한 위험성이 없다. 따라서, 상술한 생리적 활성물질을 항종양 약제로서 임상적으로 사용할 것이 크게 기대되어 왔다. 항종양 약제로서 인체 TNF의 대량 및 안전한 임상적 사용을 확인하기 위하여 고도로 정제된 형태의 인체 TNF를 수득할 것이 요구된다. 이미 DNA 재조합 기술에 의하여 인체 TNF를 수득하는 방법이 제안되어 왔다. 상기 방법에 의하여, 바람직한 인체 TNF는 충분히 순수한 형태로서 대량으로 제조될 수 있다. 상기 방법은 하기와 같이 설명된다.

인체 TNF를 코오딩하는 데옥시리보핵산을 복제 가능한 형질 발현 운반자와 결찰시켜 상기한 데옥시리보핵산 및 상기한 복제 가능한 형질 발현 운반자를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를 수득하고; 미생물의 세포 또는 세포 배양액을 상기한 복제 가능한 재조합 DNA로 형질 전환시켜 형질 전환체를 형성시키고 ; 미생물의 모세포 또는 세포 배양액으로부터 상기 형질 전환체를 분리하고; 상기한 형질 전환체를 배양하여 상기한 형질 전환체가 상기한 데옥시리보핵산을 형질 발현시켜 인체 TNF를 제조하고; 배양된 형질 전환체로부터 상기한 인체 TNF를 분리한 다음 정제한다.

상술한 것과 같이, DNA 재조합 기술을 사용한 상기 방법에 의하여 바람직한 인체 TNF가 충분히 순수한 형태로서 대량으로 수득될 수 있다. 그러난 항종양 약제로 사용하기 위하여 인체 TNF를 대량 생산할 경우에, 충분히 순수한 인체 TNF를 용액의 형태 또는 동결된 덩어리 형태로 오랜기간동안 저장할 필요성 및 활성물질 용액을 동결건조시킬 필요성이 통상적으로 요구된다. 그러나, 본 발명자들은 실제로 순수한 인체 TNF의 활성이 저장, 동결, 냉동물의 용해 및 동결건조시 현저히 감소된다는 것을 발견했다. 나아가, DNA 재조합 기술에 의해 제조된 실제로 순수한 TNF를 암을 앓고 있는 환자에게 실제 투여할때까지 저장하는 동안에도, TNF의 활성은 현저히 감소된다고 알려져 있다. 항종양 작용을 갖는 단백질의 안정화에 관하여, USP 4,447,355 및 일본국 특허출원 공개 명세서 제59-39829(1984) 및 59-59625(1984)호와 같은 문헌들이 있다. 그러나 본 발명자들이 알고 있는 한, DNA 재조합 기술에 의해 제조된 실제로 순수한 인체 TNF의 안정화에 관한 연구는 발표되지 않았다. 상기한 상황하에서, 인체 TNF가 항종양 약제로 유효하다는 사실에도 불구하고 특히 상업적 규모에서 실제로 순수한 인체 TNF의 효율적이고 지속적인 공급이 확실하지 않다.

생리적 활성물질의 안정화에 관한 상술한 결점들을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 광범위하고 집중적인 연구를 하였다. 결과로서, 생리적 활성물질을 함유하는 수용액 또는 분말에 안정화제로서 유효량의 알부민을 첨가할 경우, 활성의 상실없이 오랜기간동안 저장할 수 있고, 상기 물질의 분리 및 정제과정 및 동결, 냉동물의 용해, 동결건조시에도 안정성이 유지된다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명의 목적은 DNA 재조합기술에 의해 제조된 생리적 활성물질의 안정화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 오랜기간동안 활성이 유지되고 동결, 냉동물의 용해, 동결 건조시에도 안정한 생리적 활성물질의 안정화 수용액 또는 분말을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적, 사상 및 이점은 하기의 설명 및 첨부하는 도면과 연관된 특허청구의 범위등에 의해 더욱 명백할 것이다.

본 발명의 첫번째 양상은 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 사용한 DNA 재조합 기술에 의해 제조되었으며, L-M 세포에 대한 세포 독성 활성을 가지며, BALB/c 생쥐에 이식된 메스 A 육종의 출혈성 괴사를 유도할 수 있는 생리적 활성물질을 함유한 수용액 또는 분말에 유효량의 알부민을 가함을 특징으로 하는, 생리적 활성물질의 안정화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 양상은 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 사용한 DNA 재조합 기술에 의해 제조되었으며, L-M 세포에 대한 세포 독성 활성을 가지며, BALB/c 생쥐에 이식된 메스 A 육종의 출헐성 괴사를 유도할 수 있는 생리적 활성물질 및 유효량의 알부민을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말을 제공하는 것이다.

상기에 설명한 바와 같이, 본 발명에 사용된 생리적 활성물질은 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 사용하여 통상적인 DNA 재조합 기술에 의해 제조된 것이다. 생리적 활성물질을 후술하는 방법에 따라 분석할때, 생리적 활성물질은 L-M 세포에 대한 세포 독성 활성을 나타내며, BALB/c 생쥐에 이식된 메스 A 육종의 출혈성 괴사를 유도한다. 특히, 이 생리적 활성물질은 하기 일반식( I )의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다.

(상기 식중, Gln은 글루타민 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Tyr은 티로신 잔기, Val은 발린 잔기, Lys는 리신 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Ala는 알라닌 잔기, Asn은 아스파라진 잔기, Leu는 류신 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ser은 세린 잔기, Thr은 트레오닌 잔기, Ile는 이소류신 잔기, Trp는 트린토판 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, Met는 메티오닌 잔기, 및 Cys는 시스테인 잔기를 나타낸다 )

상술한 아미노산 서열을 갖는 생리적 활성물질을 하기 일반식(ll)의 염기 서열 및 이 염기 서열의 상보적 염기 서열로 구성된 군에서 선택된 한가지 이상의 염기 서열을 함유한 생리적 활성물질-코오딩 DNA를 갖는 재조합 DNA를 사용하여 통상의 DNA 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.

(상기 식중, A는 데옥시아데닐산 잔기, G는 데옥시구아닐산 잔기, C는 데옥시시티딜산 잔기 및 T는 티미딜산 잔기를 나타내며, 일반식 (ll)의 좌측 말단 및 우측 말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기측으로 표시한다.)

상술한 생리적 활성물질 및 DNA는 다음과 같이 제조될 수 있다.

1. 미합중국 메사추세트 02138 케임 브리지 7 디비너티 애비뉴 하버드 대학교 생화학 및 분자 생물학부티, 매니아 티스교수가 제조한 박테리오파지 λ/토끼 게노믹 라이브러리 및 박테리오파지 λ/인체 게노믹 라이브러리를 사용한다. 이들 물질은 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다. [Cell, 15, p.687(1978)] : (1) 토끼 또는 인체조직, 예를들면 토끼 또는 인체 이자 조직을 동결된 분말 형태로 만들고, RNA 및 단백질 물질을 분해 처리하여 침전물에 고 분자량의 토끼 또는 인체 DNA를 얻는다 ; (2) 고 분자량 DNA을 유전자 위치에 따라 임의로 부분 분해한다 ; (3) 생성된 DNA 단편을 15∼20킬로 염기쌍(kb) 단편이 얻어지도록 크기-분획화한다. (4) 상기 (3)에서 생성된 단편을 λ 샤론 4A 파지벡타를 사용하여 클로닝한다; 및 (5) 생성된 벡타를 rDNA를 함유한 감염성 파지입자로 생체 외에서 포장하여 상술한 토끼 또는 인체 게노믹 라이브러리를 수득한다.

2. 참고예 1에서 수득된 토끼 TNF cDNA를 피 더블유.제이 리그비 등의 니크 번역 방법[J.Mol.Biol.113. p 237(1977)]에 의해³²P-표지시킨다.

3. 각 박테리오 파지 λ/토끼 게노믹 라이브러리 및 박테리오 파지 λ/인체 게노믹 라이브러리를 박테리아의 가상 교회 (交會)에 도포하고³²p-표지된 토끼 TNF cDNA로 혼성 스크린한다.

4. 적당한 클론으로부터, 상응하는 DNA를 분리하여 제한 지도를 그리고 셔던 혼성법에 의해 분석한다.[E.M.Southern.J.Mol, Biol.,98, p 503(1975)] 토끼 또는 인체 TNF 유전자를 함유한 제한 단편을 플라스미드 벡타에 서브 클로닝하고, 서열화한다.

5. 토끼 TNF cDNA의 염기 서열을 토끼 TNF 유전자의 염기 서열과 비교하여 토끼 TNF 유전자의 엑손(토끼 TNF의 아미노산 서열을 코오딩하는 염기 서열) 및 인트론(토끼 TNF의 아미노산 서열을 코오딩하지 않는 염기 식열)을 결정한다.

6. 인체 TNF 유전자의 염기 서열을 토끼 TNF 유전자의 염기 서열과 비교하여 인체 TNF 유전자의 엑손 및 인트론을 결정한다.

7. 토끼 TNF 유전자의 인트론을 삭제하고 그의 엑손을 결합시킴으로써 얻어진 염기 서열로부터 추론된 토끼 TNF의 아미노산 서열은 토끼 TNF cDNA의 염기 서열로부터 추론된 것과 일치한다는 것이 확인된다.

8. 생리적 활성물질을 코오딩하는 유전자 인트론을 삭제하고 그의 엑손을 결합시킴으로써 얻어진 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA의 염기 서열로부터 본 발명에 사용된 생리적 활성물질의 아미노산 서열을 추론해 낸다. 생리적 활성물질의 아미노산 서열은 토끼 TNF의 아미노산 서열과 부분적으로 일치한다는 것이 확인된다.

9. 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 적당한 형질 발현 운반자에 삽입하기 위해 생체의 테일링화하여 코오딩 DNA를 함유하는 재조합 DNA를 형성한다. 이 재조합 DNA를 사용하여 적당한 숙주 세포를 형질 전환시키고, 이를 배양액중에서 성장시켜 필요한 생리적 활성물질을 형질 발현시킨다.

10. 이렇게 제조된 생리적 활성물질은 성숙된 형태일때 세린으로부터 시작하는 155 아미노산 잔기를 갖는다. 그의 전 서열에 시그날 펩티드를 가질때, 시그날 펩티드는 매우 소수성이다.

앞에서, 생리적 활성물질을 코오딩하는 유전자의 수득방법, 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA의 염기 서열 및 이 DNA를 이용한 생리적 활성물질의 제조방법을 기재한다. 그러나, 이 설명은 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 본 발명의 기본적 개념을 변화시키지 않는 범위내에서 적당히 변형시킬 수 있다.

각 아미노산에 상응하는 코오돈(유전 코오드)의 여러가지 사용 빈도로 인해 그리고 기타의 이유로 해서, 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA의 염기 서열의 부분 또는 전체 부분은 그로부터 수득된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 유기화학적으로 합성된 인공 DNA에 의해 대치될 수 있다.

생리적 활성물질은 중간체를 통해 가공 과정에서 생리적 활성물질을 성숙시킬 수 있는 프리펩티드 또는 프리프로펩티드로서 미성숙된 헝태로 세포내에서 제조될 수 있다. 생리적 활성물질의 미성숙 형태는 인체 TNF 유선자의 염기 서열로부터 추론될 수 있다. 미성숙 또는 중간체 형의 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 DNA는 천연 또는 인공적으로 합성된 DNA와 함께 제조합될 수 있다.

이 방법의 일예는 5'-말단에 메티오닌 코오돈(ATG)를 삽입하고 성숙 또는 중간체 또는 미성숙 TNF DNA의 3'-말단에 TAA,TAG 및 TGA에서 선택된 적어도 하나의 스톱 코오돈을 삽입함으로써 성취될 수 있다. 메티오닌 코오돈의 존재로 인해, 성숙 또는 중간체 또는 미성숙 생리적 활성물질은 적당한 프로모터의 도움으로 합성된 mRNA으로 제조될 수 있다. 그러나 생리적 활성물질의 N-말단에 붙은 메티오닌 잔기는 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 절단되거나 절단되지 않을 수 있다. 스톱 코오돈을 삽입하는 목적은 적당한 위치 (일반식 ( I )의 폴리펩티드의 C-말단)에서 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA로부터 전사된 mRNA의 번역을 중단시키는 것이다.

이 방법의 또다른 예는 DNA에 “시그날 서열”로 공지된 매우 소수성의 염기 서열을 가함으로써 성취될 수 있다. 이 염기 서열을 가함으로써 숙주 세포의 외부로 또는 그램-음성 박테리아의 경우 “외질(periplasm)”이라는 공간으로 생리적 활성물질을 분비하는 것이 용이해진다.

출발 코오돈이 삽입된 벡타를 이용할때, 생리적 활성물질 및 벡타로 인한 펩티드로 구성된 융합 펩티드가 제조될 수 있다. 이 경우, 융합 펩티드는 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있다. 그렇지 않으면, 이 융합 펩티드는 생리적 활성물질의 주요 활성에 역효과를 나타내지 않는다면 그 자체로 이용될 수 있다.

생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 그의 5'-말단의 상류 부분에서 프로모터의 유선자 서열에 연결시켜 그의 복제를 방해하지 않으며 생성 RNA의 번역에 역효파를 일으키지 않는 TNF DNA 프로모터 서열을 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 TNF DNA-프로모터 서열을 박테리아 또는 고등 생물체에서 복제할 수 있는 벡타와 결합시켜 재조합 유전자를 수득할 수 있다. 이렇게 수득된 재조합 DNA는 숙주로 이용된 박테리아 또는 고등 동물 세포를 형질 전환시키는데 사용될 수 있다. 이렇게 수득된 형질 전환체를 배양하여 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 형질 발현시킴으로써 생리적 활성물질을 제조할 수 있다.

에스케리키아 콜리를 상술한 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 HB101( ATCC33694), C600k(ATCC33955), D1210, RRI(ATCC31343), MC1061, LE 392(ATCC33572), JM101(ATCC33876), JM83 및 1776(ATCC31244)와 같은 이.콜리 K-12의 각종 변이 주가 있다.이.콜리숙주를 사용할때, 적당한 벡타로는 pBR322, pBR325, pBR327, pUC3, pUC9, pMB9(ATCC37019), pJB8(ATCC 37 074) 및 pKC7(ATCC37084)와 같은 플라스미드, λgt, λB 및 샤론 4A와 같은 λ파지, 및 Ml3 파지가 있다.이.콜리세포에서 활성물질을 제조하기 위해,이.콜리의 프로모터 및 파지 유전자로부터 선택된 프로모터를 이용할 수 있다. 적당한 프로모터로는 락토오즈 분해효소(LAC), 그의 UV5 변이체, 페니실리나제(BLA) 및 트립토판 합성효소 (TRP)용 유전자, λ파지 P_L프로모터 및 트립토판 합성효소 및 락토오즈 분해효소의 융합 프로모터인tac프로모터가 있다.

바실루스 서브틸리스를 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로주 BD 170 균주( ATCC33608), BR 151 균주(ATCC33677) 및 MI 112 균주(ATCC33712)가 있다.바실루스 서브틸리스숙주를 이용할때, 적당한 벡타로는 플라스미드 pC194(ATCC 37034), pUB110(ATCC37015), pSA2100(ATCC37014) 및 pE194가 있다. 또한,바실루스 서브틸리스숙주를 이용할때 적당한 프로모터로는 클로람페닐콜 아세틸화 효소(CAT), 페니실리나제 및 항-에리트로마이신용 유전자가 있다.

이스트를 숙주로 사용할때, 적당한 숙주로는 RH218(ATCC44076), SHY1 (ATCC44769), SHY3(AT-CC44771), D131A, 483 및 830과 같은사카로미세스 세레비시아에의 균주가 있다. 이스트 숙주를 이용할 때, 적당한 벡타로는 YEp13 (ATCC37115), YEp6, YRp7 및 YIp5와 같은 플라스미드가 있다. 또한 이스트 숙주를 이용할때, 적당한 프로모터로는 산 포스파라제, 알콜 탈수소효소(ADHI), 트립토판 합성효소(TRP), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK), 치토그롬 B(COB) 및 액틴용 유전자가 있다.

이렇게 제조된 형질 전환체를 통상의 방법에 따라 대규모로 배양하여 목적하는 생리적 활성물질을 제조한다. 배양 상층액 및 세포 추출물을 수거하여 조 생리적 활성물질을 수득한다.

상술한 방법에 의해 제조된 조 생리적 활성물질을 후술하는 통상적인 생화학 방법을 단독으로 또는 섞어서 이용함으로써 정제하여 순수한 생리적 활성물질 수용액을 수득하고, 이를 동결건조시켜 정제된 생리적 활성물질 분말을 수득할 수 있다.

활성물질의 정제를 위한 적당한 생화학 방법으로는 암모늄설페이트를 이용한 염석방법, 음이온 교환수지를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 및 전기영동 방법이 있다. 이런 정제 방법을 이용함으로써 활성물질의 순도가 증가할때, 활성물질은 점차 불안정해진다. 예를들면, 500,000단위/mg의 비활성 (비활성은 mg 단백질당의 활성단위로 표시되며, 활성단위는 이후에 정의한다)를 갖도록 정제된 생리적 활성물질의 시료는 실시예에 기재된 데이타로부터 볼 수 있는 바와 같이 매우 불안정하다. 또한 500,000단위/mg 이하의 비활성을 갖는 시료도 저장 또는 동결, 동결된 것의 용해, 동결건조 및 기타 공정시에 각 활성이 어느정도 감소한다.

따라서, 본 발명은 고도로 정제되어 불안정한 생리적 활성물질의 안정화에 관한 것이다. 본 발명에 따라 안정화될 활성물질은 용액 또는 분말 형태일 수 있다. 그러나, 안정화될 활성물질은 용액 형태인 것이 바림직하다.

본 발명에 따라 안정화될 생리적 확성물질의 용액은 pH 5∼10의 일정한 pH를 가지는 것이 바람직하며, 또한 안정화될 용액의 용매가 적당한 완충액인 것이 바람직하다. 적당한 완축액으로는 예를들면 인산 완충액 및 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄-HCl 완충액이 있다. 필요에 따라 염화나트륨 및 염화칼륨과 같은 염을 용액에 가할 수 있다. 예를들어, 용액을 주사용으로 사용할때, 염을 용액에 가하여 등장 용액을 제조한다. 염을 가하는 목적은 상기한 것에 제한되지 않는다. 용액중의 염의 농도는 염을 가하는 목적에 따라 변화될 수 있다. 예를들어, 최종 TNF 용액을 주사제로 사용할때, 용액에 0.15M 농도 이하가 되도록 염화나트륨을 가하여 등장용액을 제조한다.

본 발명의 방법에 따라 생리적 활성물질을 함유한 수용액 또는 분말에 유효량의 알부민을 가한다.

적당한 알부민으로는 인체 알부민 또는 소의 알부민이 있다. 또한, 말, 양, 염소 또는 닭과 같은 각종 동물로부터의 알부민이 있다. 적당한 알부민의 특정예로는, 소혈청 알부민, 인체혈청알부민, 소의 락트알부민, 인체 락트알부민 및 인체 태반으로부터 유도된 알부민이 있다. 활성물질을 안정화시키는 능력에 있어서, 상술한 알부민들 사이에 특별한 차이는 관찰되지 않는다. 그러나, 주사용 제제를 위한 안정화제로는 인체 혈청 알부민이 가장 바람직하다. 상술한 알부민을 통상의 방법에 따라 정제될 수 있다.

본 발명에 사용되는 알부민은 10²∼10⁹단위/ml(활성단위는 이후에 정의한다)의 L-M 세포에 대한 세포 독성 활성을 갖는 용액 1ml당 약 1㎍ 이상, 바람직하게는 10㎍ 이상, 특히 바람직하게는 100㎍ 이상의 양으로 용액에 가한다. 알부민의 양에 대한 상한선은 보통 알부민의 용해도 및 생성용액의 점도, 및 경제적인 관점에서 결정된다. 알부민 양의 상한선은 TNF 용액 1ml당 일반적으로 50mg, 바람직하게는 10mg이다. 안정화될 활성물질이 분말 형태일때, 10²∼10⁹단위/ml의 활성을 나타내는 분말상 생리적 활성물질을 용해시킴으로써 수득된 수용액이 상술한 알부민 농도를 갖도록 알부민을 분말에 가함으로써 수득된다. 알부민을 가하는 방법은 특별한 것은 아니다. 예를들면, 분말형의 알부민을 활성물 용액에 직접 가할 수 있다. 그렇지 않으면, 알부민의 분말을 물 또는 적당한 완충액에 미리 용해시키고나서, 용액에 가한다. 또는 알부민의 분말을 활성물질의 분말과 혼합할 수 있다. 알부민의 첨가는 정제 공정 또는 약학제제를 제조하는 공정동안 어느 시기에 수행할 수도 있다.

본 발명에 따라 사용된 알부민을 배합한 생리적 활성용액을 저장 및 정제하거나 약학적 제제를 제조하는 것은 용액형태로 유지된다면 0℃∼30℃, 더 바람직하게는 0℃~10℃의 온도에서 수행될 수 있다. 용액을 동결된 형태로 저장할때, 저장온도는 0℃ 이하, 더 바람직하게는 -20℃ 이하로 유지하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 유효량의 알부민을 배합한 용액은 그것이 용액형이든 동결된 형이든 저장동안 또는 정제 또는 약학적 제제로 제조하는 동안 그의 활성을 유지한다.

더우기, 본 발명의 생리적 활성물질의 안정화 방법은 동결건조시에도 이용될 수 있다. 상세히 설명하면, 생리적 활성물질의 용액 (특히, 고정제 활성물질의 경우)을 동결 건조시킬때, 그의 활성은 현저히 감소된다. 그러나 본 발명에 따라 유효량의 알부민을 함유한 용액은 그의 활성손실없이 동결건조시켜 생리적 활성물질의 분말을 수득할 수 있다. 분말을 용해시켜 알부민 및 활성물질의 농도가 상기에 정의된 범위내에 있는 안정한 수용액을 수득할 수 있다. 또는, 알부민을 생리적 활성물질의 동결건조 제제에 배합할 수 있다. 생리적 활성물질을 분말형태로 저장할때, 저장온도는 실온 이하에서 유지하는 것이 바람직하다.

메스 A 육종이 이식된 생쥐를 사용한 후술하는 생체내 분석에 있어서, 본 발명에 따라 안정화된 정제된 생리적 활성물질 300단위를 생쥐를 투여할때, 활성은 (+)로 평가된다. 또한, 생리식염수를 주사한 대조군의 생쥐와 비교할때, 결장암 콜론링으로 이식된 생쥐에 정제된 생리적 활성물질을 투여한 후 암의 성장 저해 또는 감소가 관찰된다. 더우기, 정제된 생리적 활성물질의 각종 암세포에 대한 세포 독성 활성은 대조군으로 L-M 세포 대신에 KB 세포(선암), PC-8 세포(폐암) 및 정상 세포(태아의 콩팥세포 및 태아의 포피세포)를 사용하며 세포를 37℃에서 48시간 대신에 37℃에서 72시간 동안 배양하는 것을 제외하고는 이후에 설명하는 시험관 내 분석시험 같은 방법으로 평가된다. 그 결과, 정제된 생리적 활성물질은 정상세포에 대해서는 어떤 세포 독성도 나타내지 않고 암세포에 대해 중요한 세포 독성 활성을 나타낸다. TNF의 활성을 분석하기 위해, 보통 2가지 방법, 즉 종양 괴사 효과를 생체내에서 측정하는 생체내 방법, 및 신생 세포에 대한 세포 독성 효과를 시험관내에서 측정하는 시험관 내 시험 방법이 이용된다.

(1) 생체내 분석 시험

생체 내 방법으로는 예를들면 카스웰등의 방법[Proc.Nat.Acad.Sci.USA,72( 9), 3666∼3670(1975)]이었다. 이 방법에 따라, 메스 A 세포(2×10⁵세포)를 각 BALB/c 생쥐의 겨드랑이 피부내에 이식하고, 7일 후, 직경 7∼8mm이고, 우수한 혈관신생을 가지며, 자발적 중심 괴사가 없는 종양을 갖는 생쥐를 선택한다. 생리식염수로 희석된 시료(0.5ml)를 각 생쥐의 꼬리정맥에 주사한다. 하기의 기준에 따라 24시간 후 시료의 활성을 평가한다.

(-) : 변화없음

(+) : 약한 출현성 괴사

(++) : 보통의 출혈성 괴사(중심 괴사가 종양표면의 약 50% 이상으로 확장)

(+++) : 현저한 출혈성 괴사(종양 주위를 따라 작은 생존 가장자리만이 남아 있는 대량괴사)

(2) 시험관내 분석시험

활성 분석을 위한 시험관 내 분석으로는 예를들면 루프등의 방법[림포킨즈. Vol.2, E.Pick, Academic Press, N.Y., 245∼248(1980)] 및 쿨등의 방법[J .Im munol.,126(4), 1279∼1283(1981)]이 있다.

본 발명자들이 활성의 분석에 이용한 시험관 내 방법을 상술한 공지 방법을 개량함으로써 개발되었다. L-M 세포(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 CCL 1.2)에 대한 TNF의 세포 독성 활성을 측정하는 본 발명자들의 시험관 내 방법은 다음과 같이 수행된다. 배양 용기로는 플루오 실험실(USA)에서 제조된 96-웰 마이크로 타이터 플레이트를 사용하며, L-M 세포를 10 v/v % 태내 송아지 혈청을 함유한 이글의 최소 필수배지 [Science,130, 432∼437(1959)]에서 배양한다. 배지로 여러가지 종류로 희석된 시료(0.1ml) 및 L-M 세포 현탁액 (0 1ml, 1×10⁴세포)을 플레이트의 각 웰에서 혼합하고, 플레이트를 5% 이산화탄소를 함유한 공기중 및 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 배양기간의 말기에 글루타르 알데히드의 20% 수용액을 가하여 세포를 고정시킨다. 고정후, 플레이트를 증류수로 세척하고 건조시킨 다음, 0.05% 메틸렌 블루(0.1ml)를 가하여 생존 세포를 염색한다. 플레이트를 증류수로 철저히 세척하여 과량의 염료를 제거하고 건조시킨다. 3% 염산(0.2ml)을 각 웰에 가하여 염색된 세포로부터 염료를 추출한다. 플로우 실험실에서 제조된 티터텍 물티스칸(Titertek Multiskan)에 의해 665nm에서 각 웰의 흡광도를 측정한다. 흡광도는 생존 세포의 수에 비례한다. 활성, 단위 (U)/ml는 50% 세포 독성을 일으키는 TNF의 역희석으로 정의하며, 그래프에서 희석에 대한 흡광도를 플로팅함으로써 수득될 수 있다. 시험관 내 방법에 따라 분석된 모든 활성은 참고예 1 및 2를 제외하고 상기에 정의한 단위에 의해 표현된다. 참고예 1 및 2에서, 활성은 L-M 세포 대신에 L929세포(어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션,CCL1)를 사용하고, 10 v/v % 태내 송아지 혈청을 함유한 이글의 최소 필수 배지 대신에 1 v/v % 태내 송아지 혈청 및 5㎍/ml 액티노 마이신 D를 함유한 이글의 최소 필수 배지를 사용하며, 48시간 대신 21시간 동안 배양을 수행하는 것을 제외하고는 상술한 것과 같은 방법으로 평가한다.

본 발명의 방법에 따라, 임상적으로 효과적인 항종양 의약인 고정제 생리적 활성물질을 상업적 규모로 효과적 및 일정하게 공급하는 것은 본 발명의 방법에서 활성물질이 용액형태, 동결된 덩어리 또는 동결건조된 제제 형태이든 간에 저장동안, 및 정제 및 약학적 제제 제조 공정동안에 활성물질의 활성을 유지하기 때문에 보장된다. 또한, 인체 알부민을 배합한 용액 또는 분말은 인체에 안전하게 투여될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 신규 조성물은 생리적 활성물질은 항종양 의약으로 임상적으로 사용할때 특히 유용하다.

본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기의 참고예, 실시예 및 비교예를 참조로 더욱 상세히 설명된다.

본 발명을 실시하는데 있어, 재조합 DNA의 형성, 및 재조합 DNA를 미생물에 삽입하는 것은 특별한 지시가 없는한 하기의 실험 보고서[문헌(1) -(4)]에 기재된 방법에 따라 수행된다.

(1) 다까시 야스다까 유전공학의 매뉴얼, 고단-샤, 도오꾜

(2) 다까기 야스다까 유전공학의 실험방법, 고단-샤, 도오꾜

(3) 티.매니아티스, 이.에프.프리쓰크, 제이.샘브룩, 분자 클로닝, 콜드 스프링 하버 실험실, 뉴욕

(4) 레이 유 등, 효소학의 방법, 101권, 아케데믹 프레스, 뉴욕

참고예 및 실시예에 사용된 약어

MOPS : 모르폴리노프로판 술폰산

LB배지 : 루리아-베르타니 (Luria-Bertani) 배지

DMSO : 디메틸술폭시드

PFU: 플라크 형성 단위

EDTA: 에틸렌디아민 테트라아세트산

SDS : 소듐 도데실 설페이트

BRL : 베데스다 연구 실험실

DMT : 디메톡시트리틸

lac : 락토오즈

Tris : 트리스(히드록시메틸)아미노 메탄

XAR-5 : 이스트맨 코닥사제 시판품인 X-선 필름

1×SSC : 0.15M NaCl+0.015M 소듐시트레이트, pH7

2×SSC : 0.30M NaCl+0.030M 소듐시트레이트, pH7

3×SSC : 0.45M NaCl+0.045M 소듐시트레이트, pH7

5×SSC: 0.75M NaCl+0.075M 소듐시트레이트, pH7

6×SSC : 0.9M NaCl+0.09 M 소듐시트레이트, pH7

FDSS : 50%탈이온화 포름아미드+5×덴하트+5×SSPE+0.1% SDS+100㎍/ml 변성 송아지 흉선 DNA

(SSPE : 0.18M NaCl+10mM NaH₂PO₄+1mM EDTA, pH 7.4)

SM : 1l 당 5.8g의 NaCl, 2g의 MgSO₄· 7H₂O, 50ml의 1M 트리스, Cl(pH7.5) 및 5ml의 2%젤라틴을 함유한 파지 저장배지.

NZ-브로스 10g의 NZ아민, 59의 NaCl 및 29의 MgSO₄7H₂O를 함유한 배지.

(NZ아민은 흄코 쉐필드 케미칼 디비젼 어브 크래프트사제 상품인 카제인의 A형 가수분해물이다)

IPTG: 이소프로필 티오갈락토시드

X-gal 5-디브로모-4-클로로-3-인돌릴갈락토시드

TAE : 0.04M 트리스-아세테이트(pH8.0) -0.002M EDTA

5×덴하트 용액 : 1l당 피콜(Ficoll) 1000mg, 폴리비닐피롤리돈 1000mg 및 BSA 1000mg을 함유한 수용액.

bp : 염기쌍

[참고예 1]

단계 1

[토끼 혈청으로 부터 TNF의 제조]

체중 2.5∼3kg의 암컷 토끼의 귀 정맥을 통해 50mg의 포르말린-치사된프로피오니 박테리움 아크네스(코리네 박테리움 파르붐; 웰컴 연구 실험실, 영국)을 주사한다. 8일후, 귀 정맥을 통해 100㎍의 내독소(에스케리키아 콜리0.26 : B6으로 부터의 리포폴리사카라이드, 디프코실험실, 미국)를 다시 주사하고, 2시간 후 심장으로 부터 총혈액을 채취한다. 수거된 혈액에 100m1당 100단위의 헤파린 소듐을 가한다. 50 00rpm에서 30분간 냉각시키면서 혈액을 원심분리하여 혈액 세포 및 불용성 고체를 제거한다. 결과로서, 40토끼로 부터 3×10⁴단위/㎖의 혈청 TNF 세포 독소활성을 갖는 혈장(2.4 l )이 수득된다.

단계 2

[토끼 혈청으로 부터 TNF의 부분 정제]

단계 1에서 수득된 혈장(2.4ℓ)에 24g의 셀라이트를 가한다. 생성물을 1시간 동안 교반하고 여과한다. 여과액을 1. 2l의 0.04M 트리스-HCl 완충액 (pH7.8)과 혼합하고, 0.1M NaCl을 함유한 0.04M 트리스 HCl 완충액 (pH7,8)으로 충분히 평형된 DEAE-세파로즈 CL-6B컬럼 (파마시아 파인 케미칼사제, 스웨덴)에 넣는다. 컬럼을 0.04M 트리스-HCI 완충액으로 세척하고, 흡착된 TNF를 0.18M NaCl을 함유한 0.04M 트리스-HCI 완충액 (pH 7.2)으로 용출시킨다. L세포에 대한 세포 독소 활성을 나타내는 분획을 한외 여과에 의해 농축한다. 이렇게 수득된 농축물을 5mM 인산완충액으로 충분히 평형된 세파크릴 S-200의 컬럼 (파마시아 파인 헤미칼재, 스웨덴)에 넣고, 같은 완충액을 사용하여 겔 여과한다. 활성분획을 한외 여과에 의해 농축하여 3.5×10⁶단위의 활성 및 18×10⁶단위/mg의 비활성을 갖는 정제된 TNF를 수득한다.

단계 3

[항-TNF항체]

단계 2에서 부분적으로 정제된 토끼 혈청 TNF를 완전한 후레운드의 보조제와 흔합(1: 1)하고, 12주된 BALB/c 숫컷 생쥐의 등에 피하 주사한다. 최초 주사후 2 및 4주때 상기의 공정을 반복한다. 최종 주사 1주후, 총 혈액을 채취한다. 수거된 혈액으로 부터 혈청을 수득한다.

최종 농도에서 500배 희석된 량으로 L세포에 대한 TNF의 세포독소활성을 평가하기 위해 상기에서 수득된 혈청을 배양배지에 가한다. L세포에 대한 토끼혈청 TNF의 세포독소활성을 전술한 것과 같은 방법으로 평가한다. 토끼 혈청 TNF는 L세포에 대한 어떤 세포 독성도 나타내지 않는다는 것이 발견된다. 상기의 결과로 부터, 이 단계에서 수득된 생쥐 혈청은 토끼 혈청 TNF에 대한 항체(이후 “항-TNF항체”로 약칭한다)를 함유한다는 것을 알 수 있다.

단계 4

[TNF-생성 세포의 제조]

암컷 토끼에 프로피오니박테리움 아크네스(코리네 박테리움 파르붐 :웰컴 연구 실험실, 영국)의 포르말린-치사된 세포를 정맥내 주사한다. 7일 후, 토끼를 기관 절개하고, 허파를 생리 식염수로 세척하여, 뜨는 세포를 수득한다. 수득된 세포를 생리 식염수로 세척한다. 배양배지로 10v/v% 태내 송아지 혈청을 함유한 RPMI 1640(플로우 실험실, 미합중국)를 사용하여 5% 이산화탄소를 함유한 공기 중에서 37℃로 세포를 배양한다. 세포 배양액을 2군으로 나누고, 그중 하나에 에스케리키아 콜리로 부터 유도된 내독소(에스케리키아 콜리026 : B6로 부터의 리포폴리사카라이드, 디프코 실험실, 미합중국)를 10㎍/ml의 농도로 가한다. 같은 양의 멸균 수를 또 다른 하나에 가한다. 내독소를 가한 세포 배양액의 상층액은 L세포에 대한 세포독소 활성을 나타내며, 7시간 내에 활성은 최대치에 도달한다. 이 활성은 항-TNF 항체에 의해 소실되나, 정상 생쥐 혈청에 의해서는 소실되지 않는다.

한편, 내독소를 가하지 않은 세포 배양액의 상층액은 L세포에 대한 어떤 세포 독성도 나타내지 않는다.

단계 5

[TNF의 분자량]

내독소를 가한 단계 4에서 제조된 세포 배양액에 방사성[L-35s] 메티오닌( 1300Ci/밀리몰, 아메르샴 공업사, 영국)을 더 가한다(1mCi/ml) . 라엠리의 방법[라엠리, 영국(1970), Nature(런던), Vol. 227, pp 680∼685]에 따라, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동에 의해 상층액을 분석한다. 겔 농포를 12.5중량%로 조절한다. 전기 영동 후, 겔을 ENHANCE

(뉴잉글랜드 뉴클리어사(미국)제 상품명)로 처리하고, 건조시킨 다음, X-선 필름(후지 RX, 후지포토필름사제)에 노출시킨다. 내독소 존재하의 세포 배양액의 상층액에 약 17500의 분자량을 갖는 물질이 형성되는 것이 관찰된다.

또한, 단계 4에서 제조된 각 세포 배양액의 상층액을 상술한 바와같은 방법으로 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동한다. 겔을 2.5% NP 40

(칼비오켐사제 표면 활성제)에서 1시간 동안 진탕하고, 물에서 2시간 동안 진탕한다. 진탕 후, 각 이동 부분을 절단 분리하고 이동방향에 수직방향의 2mm너비의 스트립으로 절단한다. 각 스트립을 L세포와 함께 배양하고, L세포에 대한 세포 독소활성을 평가한다. 내독소를 함유한 세포 배양액의 상층액이 전개된 부분에 있어서, 17500의 분자량에 해당하는 위치에 L세포에 대한 세포독성이 관찰된다. 다른 위치에서는 세포 독성이 관찰되지 않는다.

단계 6

[mRNA의 추출]

단계 4에서 제조된 세포 배양액에 내독소를 가한 후 2시간 동안 배양하고, 원심분리하여 세포를 수거한다. 치르윈 등의 방법[Chirgwin, J.M. et al, Biochemistry, Vol. 18, p 5294(1979)]에 따라, 수거된 세포로 부터 세포질 RNA를 추출하고, 세포질 RNA로부터 mRNA를 추출한다. 4ml의 4M 구아니딘 티오시 아네이트 용액을 3×10⁸세포에 가하고, 혼합물을 균질화기 (모델 : AM-7, 너혼세이끼세이샤꾸쇼제, 일본)에 의해 분쇄한다. 잔류물을 원심 분리에 의해 제거하고, 2.4g의 염차세슘을 용해시킨다. 혼합물을 2.5ml 의 5.7M 염화세슘 및 0.1M EDTA 용액(pH7.5)이 미리 채워진 폴리알로머 튜브에 조심스럽게 붓고, 베크만 SW 41로우터 (베크만 인스트루먼트 제, 미국)를 사용하여 30,000rpm 및 20℃에서 12시간 동안 초원심 분리한다. 상층액을 제거한 후, 펠릿을 1ml의 10mM 트리스-HCl 완충액(5mM EDTA 및 1w/v% SDS 함유)에 용해시킨다. 생성된 용액을 클로로포름 및 1-부탄올의 4 : 1 부피 혼합물로 추출한다. 수상에 0.05부피의 2M 소듐 아세테이트 및 2.5부피의 에탄올을 가하고, -20℃에서 2시간 이상 방치하여 RNA 를 침전시킨다. 침전물을 원심 분리에 의해 수거하여 건조시키고, 500㎍의 멸균수에 용해시킨다. 그 결과, 세포질 RNA 용액이 수득된다.

상기에서 수득된 RNA 용액을 68℃에서 2분 동안 가열한 후, 급속 냉각시킨다. 2배 농도의 10mM트리스-EDTA 완충액(pH7.4) (1mM EDTA,'0.1w/v% SDS 및 0.5염화리튬 함유) 500㎕를 용액에 가하고, 혼합물을 200mg올리고 dT-셀룰로오즈(베데스다연구실험실, 미합중국)컬럼에 넣은후, 상기와 같은 완충액(1배농도) 10ml로 세척한다. 컬럼에 남아있는 물질을 10mM 트리스-HCl 완충액 pH 7.4, 1mM EDTA 및 0.1w/v% SDS를 함유한 용리 완충액 2ml로 용출시킨다. 용출액에 0.05부피의 소듐 아세테이트 및 2.5 부피의 에탄올을 가하고, 혼합물을 -20℃에서 냉각시켜 침전시킨다. 침전물을 원심 분리에 의해 수거하여 올리고 dT-셀룰로오즈 컬럼에 넣고, 올리고 dT-셀룰로오스에 흡착된 분획을 수거한다. 자외선 스펙트럼 분석에 의해 결정된 85㎍의 mRNA를 회수한다.

단계 7

[mRNA의 크기 분획화]

단계 6과 같은 방법에 의해 제조된 mRNA 880㎍을 250㎕의 물에 용해시키고, 생성 용액을 10ml 5∼25% 선상 슈크로오즈 밀도 경사에 층 분리한다. 슈크로오즈 밀도 경사는 5% 슈크로오즈 및 25% 슈크로오즈를 각각 함유한 트리스 완충용액[25mM 트리스-HCl(pH7.2), 2mM EDTA 및 1w/v% SDS]을 사용하여 ISCO570 경사기 (ISCO사제, 미합중국)에 의해 제조된다.

베크만 SW 41로우터를 사용하여 40000rpm 및 4℃에서 12시간 동안 초원심 분리하고, 각 400㎕의 분획을 분획 회수 장치 (베크만 인스트루먼트사제, 미합중국)에 의해 회수한 후, 에탄을 침전시킨다. 침전된 분획을 원심 분리하고, 멸균수에 용해시킨다.

단계 8

[mRNA의 번역 실험]

실험 보고서 (예, 히로시 데라오라, 미끼오이쓰끼 및 겐따로 다나까, “단백질, 헥산, 효소”, 유전공학, 엑스트라판, 1981, p602)에 기재된 방법에 따라크세노푸스 라에비스의 난모세포(하마마쓰 생물학 교수 물질)를 사용하여 mRNA의 번역을 수행한다. 크세노푸스 라에비스는 하마마쓰 생물학 교수 물질로 부터 획득한다. 단계 7에서 수득된 분획화 mRNA를 멸균수에 용해시켜 1㎍/㎕농도로 만들고, 용액을 세포당 50nl 정도의 소량으로 난모세포에 주사한다. 1mg/ml 소혈청알부민을 함유한 바쓰의 용액[7.5mM 트리스-HCl(pH7. 6), 88mM NaCl, 1mM 염화칼륨, 0.33mM 질산칼슘, 0.41mM 염화칼슘, 0.82mM 황산마그네슘, 2.4mM 중탄산나트륨, 18U/ml 페니실린 G 및 18㎍/ml 스트렙토마이신]중에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 난모세포를 유리바에 의해 배양 용액중에서 파쇄시킨다. 배양액을 원심분리하고, 상층액을 L세포에 대한 세포 독소 활성을 평가한다. mRNA를 번역하여 16S 크기의 최대 활성 침전물을 갖는 폴리펩티드를 수득한다. 이 활성은 단계 3에서 수득된 항-TNF항체에 의해 제거되나, 정상 생쥐 혈청에 의해서는 제거되지 않는다.

단계 9

[형질 전환체의 제조]

단계 7에서 수득된 분획화 mRNA 5㎍을 사용하여 문헌(1)의 96페이지에 기재된 방법에 따라 이중가닥 DNA를 제조한다. 역전사효소로는 미합중국 라이프 사이언스사의 생성물을 사용한다. 이중가닥 DNA를 3.5% 폴리아크릴아미드겔에 크기-분획화하고. 약 1000∼2000bp의 330ng분획을 수득한다. 문헌 (1)의 방법에 따라, 7ng의 이 분획을 말단데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (베데스다 연구실험실제, 미합중국)를 사용하여 데옥시 C잔기를 확장시키고,PstI으로 분해되고 데옥시 G잔기로 확장된 플라스미드 pBR 322 56ng으로 어닐링한다. 이렇게 어닐링된 혼합물을이 .콜리K-12 균주(HB 101, ATCC 33694)에 삽입하여 균주를 형질전환시킨다. 그 결과, 12000형질전환체가 수득된다.

단계 10

[토끼 TNF의 부분 아미노산 서열]

단계 2에서 부분정제된 토끼 TNF(활성 : 5×10⁷단위)를 단계 5에서 정제한 것과 같이 SDS-폴리아크릴 아미드겔 전기 영동한다. 겔의 일부를 로마시 브릴리언트 블루로 염색한다. 분자량 17000에 해당하는 위치의 밴드를 겔로 부터 절단하고, 1% 중탄산암모늄으로 추출한다. 약 180㎍의 TNF를 단백질로 회수한다.

회수된 TNF 150㎍을 75㎍의 1%중탄산 암모늄에 용해시키고, 3㎍의 TPCK 트립신(워싱톤 바이오케미칼제, 미합중국)을 가한다. 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 패킹 물질로 코스모실 5C8(나까라이 케미칼제, 일본)이 패킹된 고속액체크로마토그래퍼에 의해 상기 혼합물을 분획화하여 트립신으로 분해된 단편을 수득한다.

고정제 TNF 및 그의 트립신-분해 단편을 세파덱스 G-25컬럼에 의해 탈염시키고, 동결건조시킨다. 알.엠 헤위크 등의 방법 (J,Biol.Chem., Vol 256 pp 799 0∼7997, 1981)에 따라, 정제된 TNF 및 트립신-분해 단편을 각각 N-말단으로 부터 에드만 분해한다. 컬럼으로 솔팩스 ODS(이. 아이.듀퐁.미합중국)를 사용하여 고속 액체 크로마토그래퍼 모델 SP8100(스펙트라 피직스, 미합중국)에 의해 통상의 방법에 따라 각 단계에서 생성된 PTH-아미노산을 분석한다. 그 결과, TNF가 하기의 N-말단아미노산 서열을 갖는 것이 발견된다.

Se r-Al a-Se r-Arg-Al a-Leu-Se r-AsP-Lys-Pro-Leu-Al a-Hi 5-Va l-Va l-Al a-Asn-Pro-G1 n-Va 1-G1 u-G1 V-G1 n-Leu-Gl n-트립신-분해 단편중의 하나는 하기의 N-말단 아미노산 서열을 갖는다.

Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala

단계 11

[올리고데옥시뉴클레오티드 탐침의 합성]

단계 10에서 수득된 토끼 TNF의 아미노산서열로 부터 추론된 mRNA의 염기 서열 상보적인 올리고데옥시뉴클레오티드를 본 발명자에 의해 이미 보고된 개량된 포스포트리에스테르 방법[“Nucleic Acid Res. ”10, 1755∼1769(1982)]에 따라 합성한다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 제조하는데 있어서, 토끼 TNF의 아미노산 서열로 부터 평가된 128올리고데옥시뉴클레오터드를 5군, 즉 16, 16,32,32 및 32의 군으로 분류하고, 각 군의 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼합물로 합성한다. 각군의 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드를 통상의 방법에 따라 탈보호하고, 세파덱스 G-50(파마시아파인 케미칼, 스웨덴)을 사용한 컬럼 크로마토그래피, 7M의 우레아를 함유한 20중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동 및 DE 52(와트만사, 미합중국)를 사용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제한다. 각 군의 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드를 0.1mM 트리스-EDTA 완충용액에 투석시킨다.

각군의 정제된 올리고데옥시뉴클레오티드 각각을 통상의 방법에 따라 T₄,폴리뉴클레오티드 키나아제 (베데스다연구실험실, 미합중국) 및 y-32_P-아데노신 트리포스페이트를 사용하여 표지시키고, DE52(와트만사,미합중국)를 사용한 컬럼크로마토그래피에 의해 정제한다. 방사성 물질을 약 3×10⁸cpm/㎍의 양으로 각군의 올리고데옥시뉴클레오티드 각각에 배합한다. 각군의 혼합물 형태로 수득된 각 올리고데옥시뉴클레오티드 탐침은 표 1에 나타낸 바와같이 정의한다.

토끼 TNF의 아미노산 서열 일부, 토끼 TNF의 아미노산 서열로 부터 평가된 mRNA의 염기서열 및 각 군의 합성올리고데옥시뉴클레오티드 탐침의 염기서열은 표 1에 나타낸다.

[표 1]

주 : X는 A,C,G 또는 U의 리보핵산 잔기를 나타낸다.

Y는 A 또는 G의 리보핵산 잔기를 나타낸다.

M는 T 또는 C의 데옥시리보핵산 잔기를 나타낸다.

N는 A 또는 G의 데옥시리보핵산 잔기를 나타낸다.

Z는 A,C,G 또는 T의 데옥시리보핵산잔기를 나타낸다.

단계 12

[올리고뉴클레오티드의 검사]

단계 6에 따라 수득된 TNF를 생성하는 세포의 mRNA를 1몰의 글리옥살, 10밀리몰의 NaH₂PO₄및 50부피%의 디메틸술폭시드를 함유한 용액으로 50℃에서 60분간 처리하고, 1.1중량%의 아가로즈겔에 전기 영동하여 분획화한다. 분획화된 mRNA를 메이커의 매뉴얼에 따라 전기영동형 전이 블로팅 장치의 필터 (바이오래드제, 미합중국)에 전이시킨다. 장치의 필터에 있는 mRNA를 5×SSC용액 및 150㎍/ml의 변성 살몬스페르마토조아 DNA를 함유한 5×덴하트 용액으로 65℃에서 2시간동안 처리하고, 1×10⁷cpm/ml의 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드 및 5×SSC용액을 함유한 5×덴하트 용액으로 50℃에서 2시간동안 처리한다. 상기에서 수득된 필터를 6×SSC 용액으로 실온, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 연속해서 4번 세척한다. XAR-5×선 필름(이스트맨 코닥사제, 미합중국)으로 필터를 조사시킨다. 그 결과, 탐침 MJ에 의해 지정된 올리고데옥시뉴클레오티드는 mRNA와 함께 강하게 혼성되며, 이것은 mRNA에 완전히 상보적인 염기서열을 갖는 올리고데옥시뉴클레오티드가 탐침 MJ에 의해 지정된 올리고데옥시뉴클레오티드에 함유된다는 것을 나타낸다.

단계 13

[토끼의 TNF의 유전자의 클로닝]

문헌(2) 162페이지에 기재된 방법에 따라, 단계 9에서 수득된 형질 전환체를 셀룰로오즈 필터에 전이시키고, 형질전환체의 DNA를 단계 12와 같은 조건(군락 혼성법)하의 단계 12에서 선택된 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 혼성시킨다. 이 방법에서, 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 강하게 혼성된 49군락을 선택하고, 또다른 니트로셀룰로오즈 필터에 더 고정시킨다. 49군락을 사용하여 더 혼성시켜 표지된 올리고데옥시뉴클레오티드(탐침 MJ)와 더 강하게 혼성된 9군락을 선택한다.

문헌(1) 6페이지에 기술된 급속 플라스미드 분리방법에 따라, 각 9군락으로 부터 약 5㎍플라스미드를 수득한다. 수득된 플라스미드 각각을 메이커의 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 제한효소,PstI,TagI,RsaI및PvuII(배데스타 연구실험실, U.S.A)를 사용하여 절단하구 1중량%의 아가로츠겔에 전기영동한다. 각 제한효소로 절단함으로써 수득된 단편들이 길이를 비교한다. 이 결과는 9군락에 상응하는 9균주 모두가PvuII및RsaI에 의해 절단함으로써 수득된 약 50bp로 구성된 단편의 염기서열을 가지며, 9균주의 대부분 이 RsaI에 의해 절단됨으로써 수득된 약 200bp로 구성된 단편이 염기서열을 갖는다는 것을 나타낸다. 다시 말해서, 9균주는 부분적으로 공통인 염기 서열을 갖는다. 제한 효소에 의한 분석 결과는 제 1도에 나타낸다.

하기 표 2에 기재된 플라스미드를 함유한 7균주를 용액의 광학 밀도가 하기 표 2에 나타내는 값을 나타낼 때까지 10㎍/ml의 테트라시클린을 함유한 LB배지 2ml에서 따로 배양하고, 원심 분리하여 각 균주를 수득한다. 수득된 각 균주를 2ml의 생리 식염수에 따로 가하고, 음파 파쇄한다. 수득된 용액을 원심 분리하고, 수득된 상층액의 L세포에 대한 세포독소활성을 결정한다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다. 공시험으로, 플라스미드 pBR 322을 함유한 균주를 사용하여 상기의 방법을 반복한다. 결과는 하기 표 2에 나타낸다.

[표 2]

L세포에 대한 세포독성 활성은 항-TNF항체에 의해 소실되나, 정상생쥐 혈청에 의해서는 제거되지 않는다. 이것은 상술한 9군락 모두가 TNF를 코오딩한 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드를 갖는다는 것을 나타낸다.

단계 14

[토끼 TNF를 코오딩한 DNA의 염기서열의 결정]

플라스미드 pB2-7 및 pRl8을 함유한 이 .콜리균주를 문헌(3) 440페이지에 기재된 10㎍/ml의 테트라시클린을 함유한 M9 배지 1ℓ에서 배앙한다. 문헌(3) 90페이지에서 기재된 방법에 따라, 각 플라스미드를 약 150㎍양으로 분리한다.

각 플라스미드 삽입물의 염기서열을 막삼 등 “효소학의 방법” 55, p49O (19 80), 아카데믹프레스의 막삼 길버트 화학방법에 따라 결정한다. 이렇게 결정된 염기서열이 단계 9에서 결정된 부분아미노산서열과 일치하는 것이 발견된다. 따라서 토끼 TNF의 총 서열이 밝혀진다.

단계 15

프로모터로Lac을 사용하여 TNF를이.콜리에서 직접 형질발현시켜서 수득한 제조합플라스미드 pRl2를 사용하여 플라스미드를 형성한다. 그 방법은 제 2도에 상세히 나타낸다. 첫번째 10㎍의 플라스미드 pRl2를 10단위의ApaI(베데스다 연구실험실, 미합중국)으로 37℃에서 2시간 동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하여 610bp단편을 분리한다. 약 1㎍의 단편을 전기영동에 의해 겔로부터 분리한다. 단계 10과 같은 방법을 제 2도에 기재된 두 올리고데옥시뉴클레오티드, 즉 5'-GATCCATGTCAG- CTTCTCGGGCC-3' 및 5'-CGAGAAGCTGACATG-3'을 합성한다. 올리고데오시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5'말단을 문헌(3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T₄폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 포스포릴화한다. 반응 완결후, 반응혼합물을 페놀로 추출하고 클로로포름으로 더 추출한다. 수득된 합성올리고머를 0.5㎍의ApaI 630bp단편과 혼합하고, 에탄올 침전시킨다. 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T₄DNA리가아제를 사용하여 단편을 합성올리고머와 함께 4℃에서 밤새 결찰시킨다.

반응 완결후, 반응흔합물을 에탄올 침전시키고, 20단위의BamHI으로 37℃에서 3시간 동안 분해한후, 4중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하고, 전기용출에 의해 670bp단편을 회수한다. 1㎍의 시판플라스미드 pUC-8(카탈로그 번호 4916, P-L바이오케미칼제, 미합중국)을BamHI으로 분해하고, 페놀로 추출한 후, 클로로포름으로 더 추출하고, 에탄을 침전시켜 벡타를 수득한다. 수득된 벡타 0.5㎍을 T₄DNA리가아제를 사용하여 그의 양끝에BamHI부위를 가지며 TNF를 코오딩하는 약 670bp를 함유한 상기의 단편과 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여이.콜리HM101을 형질전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004%(w/v)의 X-gal을 함유한 한천 배지에서 배양하여 약 200의 백색군락을 수득한다. 이들 형질전환체 100으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고,BamHI으로 분해한다. 그 결과, 15플라스미드가 목적하는BamHI단편(약 670bp)을 함유하는 것이 발견된다. 삽입방향을 시험하기 위해, 상기의 15플라스미드를 그의 pUC-8에 단 하나의 인지부위를 갖는EcoRI및 그의 약 670염기 쌍 단편부분에 단하나의 인지부위를 갖는PvuII로 분해한 다음 6중량%의 폴리아크릴아미드겔로 전기영동한다. 그 결과, 7플라스미드가 약 140bp로 구성된 목적 단편을 가지며,lac프로모터를 pUC-8에 전사하는 방향은 TNF를 코오딩한 올리고데옥시뉴클레오티드의 방향과 일치한다는 것이 결정된다.

이들 7플라스미드가 같은 서열을 가지며,lac프로모터, 합성 DNA 및 cDNA 사이의 교차점에 목적 뉴클레오티드서열을 갖는다는 것이 DNA서열분석에 의해 나타난다.

단계 16

프로모터로lacUV5를 사용하여 TNF를이.콜리에 직접 형질발현하기 위해 제조합플라스미드 pR17를 사용하여 플라스미드를 더 형성한다. 그 방법은 제 3도에 상세히 나타낸다. 먼저, 10㎍의 플라스미드 pRl7을 10단위의 Apa I (베데스다 연구실험실, 미합중국)으로 37℃에서 2시간동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하여 약 630bp로 구성된 단편을 분리한다. 약 1㎍의 단편을 전기용출에 의해 겔로부터 분리한다. 단계10과 같은 방법에 의해, 제 3도에 나타낸 두 올리고데옥시뉴클레오히드, 즉 5'-AATTCATGTCACCTTCTCGGGCC-3'및 5'-CGAGAAGCTGACA TG-3'을 합성한다. 두 올리고데오시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5'말단을 문헌 (3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T₄폴리뉴클레오티드키나아제를 사용하여 포스포릴화한다. 반응 완결후, 반응혼합물을 페놀로 추출하고 클로로포름으로 더 추출한다. 합성올리고머를 플라스미드 pR17로부터 제조된 Apa I단편(약 630bp) 0.5㎍과 혼합하고 에탄올침전시킨다. 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T₄리가아제를 사용하여 단편을 합성올리고머와 함께 4℃에서 밤새 결찰시킨다.

반응 완결 후, 반응혼합물을 에탄올침전시키고, 20단위의 EcoRI으로 37℃에서 3시간 분해한 다음, 4중량%의 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하고, 전기용출에 의해 단편(약 670bp)을 회수한다.

에프풀러 “유전자”19, pp42∼54(1982)애 기재된 방법에 따라, 플라스미드 pOP95-15를 제조한다.

1㎍의 pOP95-15를EcoRI으로 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄올 침전시켜 벡타를 수득한다. 0.5㎍의 상기 수득된 벡타를 합성 올리고뉴클레오티드와 TNF를 코오딩한 올리고뉴클레오티드를 결찰함으로써 수득된 단편(약 670bp)과 함께 T₄DNA리가아제를 사용하여 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여이 콜리JM101(ATCC33876)를 형질 전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004%(w/v)의 X-gal을 함유한 배지에 배양하여 약 150백색군락을 수득한다. 이들 군락 100으로 부터 플라스미드 DNA를 제조하고,EcoRI으로 분해시킨다. 그 결과, 12플라스미드가 목적EcoRI단편(약 670bp)을 함유하는 것이 발견된다. 삽입방향을 시험하기 위해 약 12플라스미드를PvuII및Pst I으로 분해하고, 1. 5중량%의 아가로즈겔에 전기 영동한다. 그 결과, 4플라스미드가 목적하는 단편(약 1280bp 및 약 2600bp)을 가지며,lacUV5프로모터의 전사방향이 TNF를 코오딩하는 올리고데옥시뉴클레오티드의 것과 일치한다는 것이 발견된다.

이들 4플라스미드가 같은 서열을 가지며, lacUV5프로모터, 합성올리고데옥시뉴클레오티드 및 cDNA가 서로 적당히 결합된다는 것이 염기서열 분석에 의해 나타난다. 수득된 플라스미드는 pTNF-lacUV5-1으로 정의한다.

단계 17

[이.콜리에 의해 제조된 TNF의 정제]

단계 16에서 수득된 플라스미드를 함유한이.콜리균주를 100㎍/ml의 앰피실린을 함유한 LB배지 50ml에 37℃에서 밤새 배양한다. 균주를 100㎍/ml의 앰피실린을 함유한 LB배지 5ℓ에 옮기고, 37℃에서 3시간 더 배양한다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(시그마케미칼제, 미합중국)을 가하여 최종 농도가 1mM이 되도록 하다. 6시간동안 더 배양하고 냉각시킨다. 균주를 원심분리에 의해 수거한다. 단계 13과 같은 방법으로, 균주를 5ℓ의 0.04M 트리스-HCl완충용액(pH 7.8)에 가하고, 초음파 분쇄하여 균주 단백질 용액을 수득한다. 수득된 용액은 L세포에 대해 5×10⁷단위/l의 세포독소활성을 갖는다.

수득된 용액을 단계 2와 같은 방법으로 정제하여 1.2×10⁶단위의 TNF를 수득한다. TNF의 비활성을 6.8×10⁷단위 /mg이다.

단계 18

(생쥐에 이식된 메스 A육종을 사용한 평가) .

단계 17에서 수득한 TNF의 시료(0. 2ml)를 전술한 것과 같이 생체내 분석방법에 의해 시료의 활성을 평가한다.

시료의 주사후 20일 되었을 때, 종양의 퇴화정도를 관찬하고, 하기의 방정식에 따라 회복율을 측정한다.

결과는 표 3에 나타낸다.

[표 3]

참고예 2

단계 1

(pR18,'B2-7 및 pB2-2플라스미드에 의한이 .콜리K12균주 MC1061의 형질전환).

이 .콜리K12균주 MC1061의 군락을 통상의 방법에 따라 참고예 3에서 수득된 pR18, pB2-7 및 pB2-2-플라스미드로 각각 형질 전환시킨다. 특히, 이 콜리 K12균주 MC1061의 군락을 배양브로스의 광학밀도가 550nm에서 0.3이 될때까지의 LB배지에서 배양한다. 성장된 이 .콜리 배양액 50ml를 수거하여 10mM MOPS(pH 7. 0) 및 10mM RbCl을 함유한 25m1혼합물로 세척하고, 0.1M MOPS(pH 6.5), 50mM CaCl₂및 10mM RbCl을 함유한 25ml혼합물에 현탁시킨다. 생성 현탁액을 30분간 빙냉시키고, 원심분리한 후, 0.1M MOPS(pH 6.5), 50mM CaCl₂및 10mM RbCl을 함유한 상술한 혼합물 2mL 및 DMSO 30㎖의 혼합물에 현탁시킨다. 생성 현탁액의 200㎖분에 플라스미드 DNA용액 각 10㎖를 따로 가한다. 생성혼합물 각각을 30분간 빙냉하고, 44℃에서 60초간 열충격을 준다. 그후 즉시, 37℃에서 미리 예열된 5ml의 LB배지를 각 가열혼합물에 가하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 수득된 배양브로스를 각각 원심분리하여 세포펠릿을 형성한다. 상층액을 제거한 후, LB배지를 가하고 교반하여 자 세포펠릿을 재현탁시킨다. 생성 현탁액 각각을 30㎍/ml 테트라시클린을 함유한 LB한천플레이트에 접종시키고, 37℃에서 밤새 배양한다. 그 결과, pR18, pB2-7 및 pB2-2플라스미드에 의해 각각 형질 전환된 테트라시클린 내성 형질전환체의 군락이 수득된다.

단계 2

[pB2-7 및 pRl8 플라스미드 DNA의 제조].

단계 1에서 수득된 pB2-7 및 pR18 플라스미드에 의해 각각 형질전환된 형질전환체 각각을 (1)형질전환체의 성장 및 플라스미드의 증식 : (2)형질전환체의 수거 및 파괴 ; 및 (3)플라스미드 DNA의 정제를 수행한다(미합중국 콜드스프링하버 실험실에서 출판된 티 .마니아티스, 이.에프.프리치 및 제이.샘브륙의 “분자클로닝” 88∼96페이지에 기재된 방법) . 상세하게 설명하면, 각 형질 전환체를 LB배지에 접종하고, 세개 진탕하면서 37℃에서 배양한다. 이 단계를 반복하여 형질 전환체를 성장시키고 플라스미드를 증식시킨다. 형질 전환체 배양액을 4000g 및 4℃에서 10분간 원심분리하여 수거한다. 상층액은 버린다. 생성펠릿을 100ml의 빙냉 STE[0.1M NaCl, 10mM 트리스.Cl(pH 7.8) 및 1mM EDTA]에 세척하고, 10mM트리스.Cl, pH 8.0에 녹인 20mg/ml 라이소자임을 사용하여 비등시킴으로써 분해시킨다. 점성 생성물을 초원심분리 튜브에 옮기고 25000rpm으로 4℃에서 30분간 원심 분리하여 DNA용액을 수득한다. DNA용액의 부피를 측정한다. 매 1ml마다 정확히 1g의 고체염화세슘을 가하고, 염이 전부 용해될때까지 천천히 혼합한다. 염화 세슘 용액 10ml마다 0.8ml의 브롬화 에티듐(10mg/m1, H₂O)을 가한다.

용액의 최종밀도는 1.55g/ml이고, 브롬화에티듐을 농축하면 약 600㎍/ml이다. 염화세슘 용액을 원심분리용 튜브에 옮기고, 튜브의 나머지부분을 경파라핀유로 채운다. 45,000rpm으로 20℃에서 36시간 동안 원심분리하여 두 밴드의 DNA, 즉 선상박테러아 DNA 및 니크 환상 플라스미드 DNA로 구성된 상부밴드 및 닫힌 환상 플라스미드 DNA로 구성된 하부 밴드를 수득한다. 하부 밴드의 DNA를 튜브의 측면에 삽입된 피하 주사기를 통해 유리튜브에 수거한다. 브롬화 에티듐을 제거하고, 수상을 TAE에 투석시킨다. 플라스미드 DNA용액을 RN아제로 처리하고, 같은 부피의 평형 페놀로 추출한다. TAE(pH 8.0) 및 0.1% SDS로 평형된 바이오-겔 A-150의 컬럼에 수상을 층층이 넣는다. 컬럼의 DNA를 세척하고, 0.1% SDS로 TE를 처리하여 분획을 수거한다. 분획을 에탄을 침전시켜 순수한 플라스미드 DNA를 수득한다.

상기 방법을 수행함으로써, 250㎍의 순수 pB2-7플라스미드 DNA 및 134㎍의 순수 pR18 플라스미드 DNA가 수득된다.

단계 3

[순수 pB2-7 및 pR18 플라스미드 DNA의 니크번역]

단계 2에서 수득된 순수 pB2-7 플라스미드 DNA로 부터 40㎍을 취하여PstI 제한 효소로 분해하고, 4% 아크릴아미드 겔에 전기 영동한다. 전기 영동 후, DNA를 염색하고, 목적하는 밴드를 절단하여PstI 삽입물을 분리한다.

분리된PstI 삽입물 500ng을 사용하여 티 .매니아티스등 방법[PRoc. Natl. Acad. Sci. U.S.A72, 1184(1975)]에 따라 니크 번역을 수행한다. 니크 번역을 위해, 베데스다 연구실험실(미합중국)제의 니크번역키트를 사용하며, 80피코몰의 방사성 dCTP를 24㎕ 반응계(400Ci/밀리몰)에 넣는다. 2.5㎕ 용액A(dTNP의 홍액), 2.5㎕ 용액B(500ng의 시험 DNA viz. Pst I 삽입물), 5㎕ 뜨거운 dCTP(3200Ci/밀리몰), 1.3㎕ 냉 dCTP(65피코몰, 50피코몰/㎕ dCTP) 및 11.2㎕ 용액I(H₂O)으로 구성된 총 22.5㎕의 혼합물에 2.5㎕의 용액C(DN아제 I , DNA폴리머라제 I )를 가하고, 15℃에서 60분간 반응시킨다. 용액D(스톱 완충액)를 반응생성물에 가하여 반응을 중단시킨다. 운반자 tRNA를 가하고, 두번 에탄올 침전 시킨후, 500㎖의 물에 용해시킨다. 1㎍ DNA당의 비활성은 9.3×10⁷cpm이다.

단계 2에서 수득된 순수 pR18 플라스미드 DNA에 대해 상술한 방법을 수행하여 니크 번역을 한다. 1㎍ DNA당의 비활성을 7×10⁷cpm이다.

단계 4

[pRl8 플라스미드 DNA의RsaI삽입 단편의 제조].

80㎍의 pR18 플라스미드 DNA를RsaI제한효소로 분해하고, 4% 폴리아크릴아미드촌에 전기영동한다.

하기의 목적하는 삽입물의 밴드를 절단하고, BND 컬럼에 의해 정제한다 :

약 640bp 3.77㎍ (회수율 52%)

약 175bp 1.77㎍ (회수율 50%)

상기의 약 640bp 삽입물을 pR18의 3'-단편(pR18의 3'-비번역부분)으로 정의하고, 상기의 약 175bp 삽입물을 pR18-cfr(pr18의 코오딩부분)으로 정의한다.

또한,RsaI 제한효소 대신PstI 및MstII 제한효소를 사용하여 상기의 방법을 반복한다.

약 450bp 3.65㎍ (회수율 60%)

상기의 삽입물은 pR18의 5'-단편으로 정의한다.

단계 5

[인체 게노믹 TNF유전자의 분리] .

실시예 1의 단계 3에서 수득된 32p-표지 플라스키드 pB2-7삽입물을 혼성화 탐침으로 사용하여, 인체 DNA를 부분 분해하여 생성된 크기 단편[매니아티스 등 “세포”15, 687(1978)]을 샤론 4AEcoRl결찰부위[블래트너등 “사이언스”196, 16 1(1977)]에 삽입함으로써 제조된 박테리오파지 샤론 4A 인체게노믹 라이브러리의 10⁶플라크를 스크린한다. 벤톤 및 데이비스의 플라크 혼성화 방법[벤톤 및 데이비스, “사이언스”196, 180(1977)]을 사용한다. 출발 배양액 중의 박테리오파지가 전부 연체 TNF를 제조하기 위해 필요한 유전물질을 함유하지는 않기 때문에, 토끼 TNF유전자에 상보적인 염기 서열을 갖는 탐침을 사용한다. 목적하는 유전물질을 갖는 파지플라크의 DNA를 방사성 탐침과 배합하고, 그의 방사능을 확인한다. 라이브러리로 부터 9혼성 플라크가 분리된다. 사용된 방법 및 조건은 하기와 같다.

1) 플라크의 수 : ∼1×10⁶플라크(∼4×10⁴플라크/ф150mm플레이트×25)

2) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이 : [벤톤 및 데이비스, 사이언스, 196, 186(1977)]

3) 혼성화 : 실시예 1의 단계 3에서 제조된 1.25×10⁵cpm/ml의 pB2-7 삽입탐침을 42℃에서 19.5시간동안 첨가.

4) 세척 : 2×SSC-0.1% SDS, 실온(침지 10분×4)→1×SSC-0.1% SDS, 50℃ (침지 30분×2).

5) 노출 : XAR-5(이스트맨코닥사, 미합중국) -80℃, 2강한 스크린, 39시간

상기 스크린에서,12후보 균주를 수득한다. 상술한 방법으로 제 2스크린을 수행하여 목적하는 단편을 함유한 9균주를 수득한다. 이들 균주를 이용하여 상술한 방법으로 제 3스크린을 수행하여 목적을 단편를 함유한 9균주를 수득한다. 수득된 균주를 사용하여 제 4스크린을 수행하여 9균주가 목적하는 단편을 함유한다는 것을 확인한다. 목적하는 단편을 함유한 9박테리오파지를 각각 HG-1∼HG-9로 정의한다.

단계 6

[토끼 게노믹 TNF유전자의 분리].

분해된 인체DNA 대신에 분해된 토끼DNA[매니아티스 등, Cell,15, 687 (1978)]를 사용하여 제조된 10⁶플라크의 박테리오파지 샤론 4A/토끼 게노믹 라이브러리를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 단계 5와 같은 방법을 반복한다. 10⁶플라크의 박테리오파지 샤론 4A/인체게노믹 라이브러리 대신에 6.7×10⁵플라크의 박테리오파지 샤론 4A/토끼게노믹 라이브러리를 사용한다. 따라서, 토끼게노믹 TNF유전자를 함유한 2박테리오파지 균주(RG-1 및 RG-2)를 수득한다.

단계 7

[인체클론의 서던 블로팅 분석]

실시예 1의 단계 5에서 수득된 박테리오파지 HG-3,HG-6 및 HG-7을 사용하여 하기의 방법에 따라 각 박테리오 파지의 DNA를 수득한다.

6×10¹⁰세포의 이.콜리 LE 392(숙주세포)를 18ml의 SM에 현탁시키고, 3×10⁹PFU의 박테리오파지 HG-3을 가한 후, 이.콜리를 37℃에서 20분간 감염시킨다. 수득된 흔합물을 3ℓ의 NZ-브로스에 가하고, 37℃에서 23시간동안 진탕배양한다. 60ml의 CHCl₃을 혼합물에 가하고, 30분간 더 진탕 배양한다. 최종 농도가 1M이 되도록 또 다른 NaCl을 흔합물에 가하여 15분간 방치하고, 원심분리하여 상층액을 수득한다. 폴리에틸렌 글리콜의 농도가 10%(w/v)가 되도록 폴리에틸렌글리콜(분자량 : 약 6000)을 가하고, 4℃에서 22시간 동안 방치한다. 원심분리에 의해 박테리오 파지를 수거한다.

수득된 박테리오 파지를 28ml의 SM에 현탁시키고, 동 부피의 CHCl₃을 가한다. 교반기에서 30초간 교반한 후, 혼합물을 원심분리하여 수상을 수득한다. SM을 수상에 가하여 총량이 30ml가 되게 한다. 26.4g의 CsCl을 수득된 혼합물에 가하여 천천히 용해시킨후, 초원심분리 (45000rpm,20시간)하여, 밴드형태의 박테리오파지를 수득하다. 수득된 박테리오파지-함유 혼합물을 10mM NaCl-5OmM 트리스(pH8)-10mM MgCl₂에 투석시킨다. EDTA, 프로테나제 K 및 SDS를 흔합물에 가하여 그의 농도가 각각 20mM, 50㎍/ml 및 0.5%(w/v)가 되게 한다. 혼합물을 65℃에서 1시간 처리하고, 페놀로, 페놀 및 CHCl₃의 1:1 부피 혼합물로 및 CHCl₃로 추출한다. 수득된 수상을 10mM 트리스(pH8)-1mM EDTA에 투석시킨다. 수득된 수상의 자외선 흡수 스펙트럼은 박테리오파지 HG-3의 순수 DNA가 수득된다는 것을 나타낸다.

박테리오 파지 HG-3의 DNA의 제조와 같은 방법을 반복하여 박테리오파지 HG-6 및 HG-7의 DNA를 수득한다.

따라서, 2920㎍의 HG-3, 1100㎍의 HG-6 및 819㎍의 HG-7이 수득된다.

서던 방법[E.M.Southern, J.Mol.Biol.,98,503(1975)]에 따라, 수득된 DNA의 서던 블로팅 분석을 수행한다. 방법 및 조건은 하기와 같다.

1) DNA :

HG-3 825ng 각각

HG-6 935ng 각각

HC-7 685ng 각각

2) 각종 제한 효소 분해 :

10단위BamHI, 10단위EcoRI,

10단위BamHI+10단위EcoRI.

10단위HindIII

10단위HindIII+10단위EcoRI

10단위PvuII

37℃, 3시간

3) 전기영동 :

0.8% 아가로즈겔

TAE

28V, 15.5시간

4) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이

[E.M.Southern, J.Mol.Biol.,98,503(19750]

5) 전-혼성화 :

30ml FDSS

42℃, 6시간

6) 혼성화

pH18의 5'-단편(1×10⁵cpm/ml)

(실시예 1의 단계 4에서 제조)

42℃, 14시간

7) 세척 :

2×SSC-0.1% SDS, 실온

침지 10분×4

↓

1×SSC-0.1% SDS, 50℃

침지 30×2

8) 노출 :

XAR-5(이스트맨코닥사, 미합중국)

-80℃, 2 강한 스크린, 14시간

혼성화의 결과는 표 4에 나타낸다.

[표 4]

주 : “←”같은 단편이 혼성화되는 것을 의미한다.

단계 8

[토끼클론의 서던 블로팅분석]

박테리오파지 HG-3, HG-6 및 HG-7 대신에 박테리오파지 RG-1 및 RG-2를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1의 단계 7과 같은 방법을 반복하여 서던 블로팅 분석을 수행한다. 그 결과, pR18 5'-단면이 RG-1 및 RG-2를BamHI,EcoRI,BglII,HindIII 및BamHI+EcoRI으로 절단함으로써 수득된 단일 밴드 단편과 혼성화되었다는 것이 발견된다.

단계 9

[인체게노믹 TNF 유전자를 함유한 박테리아 클론의 형성]

랜디등의 방법[Biochemistry, Vol.13,2134(1974)]을 이용하여, 상기 단계 5에서 수득된 HG-3의 DNA를 수득한다.

생성된 HG-3 DNA 33㎍을 80단위의EcoRI으로 37℃에서 3시간 분해한다. 분해물을 1% 저융점 아가로즈겔(조건 : 1×TAE, 20V, 14.5시간)에 전기 영동한다. 티.매니아티스에 기재된 바와같이 아가로즈겔로부터 2.9kb 밴드를 분리한다[분자클로닝 .콜드스프링 하버 실험실, p 377(1982)] 특별하게는, 2.9kb 밴드 부분의 절단된 겔을 65℃에서 15분간 가열한다. 2.9kb 길이의EcoRI-절단 HG-3, 단편(이후 “HG-3/EcoRI 2.9kb 단편”이라 약칭함)을 페놀로 3번 및 에탄올로 3번 추출함으로써 용융된 겔로부터 회수하고, 암모늄 아세테이트를 함유한 에탄올로 침전시킨다. 따라서, 637ng(수율 : 약 30%)의 HG-3/EcoRI 2.9kb단편을 수득한다.

상기에서 수득된 단편 255ng을 2.5단위의 T₄리가아제를 사용하여 4℃에서 20시간 동안 56.5ng의EcoRI -절단 pUC13 [J . Messing. Methods in Enzymology . Vol .101, 20 (1983) ]에 결찰시킨다.

상술한 결찰 생성물을 사용하여이 .콜리K12 균주 JM83을 형질전환시킨다. 특별하게는, 배양 브로스의 광학밀도가 550nm에서 0.3이 될때까지이 콜리K12 균주 JM83을 LB배지에서 배양한다.

50ml의 성장된이.콜리K12 균주 JM83 배양액을 수거하여 25ml의 10mM MOPS(pH 7.0) -10mM RbCl로 세척하고, 25ml의 0.1M MOPS(pH 6.5) -5OmM CaCl₂-10mM RbCl에 재현탁시킨다. 현탁액을 30분간 빙냉시키고, 원심 분리한후, 2ml의 0.1M MOPS(pH 6.5)-5OmM CaCl₂-10mM RbCl 및 30㎕의 DMSO의 혼합물에 재현탁시킨다. 203㎕의 현탁액에 10ng의 결찰생성물을 함유한 10㎕의 결찰 생성물 수용액을 가한다. 혼합물을 30분간 빙냉시킨 후, 42℃에서 60초간 가열한다. 그후 즉시, 가열혼합물에 37℃에서 예열된 LB 브로스 5ml를 가하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다. 수득된 배양 브로스를 원심분리하고, 상층액을 제거한다. LB 배지를 생성된 세포 펠릿에 가하고, 30㎍/ml 앰피실린 및 40㎍/ml X-gal을 함유한 LB 플레이트에 접중시킨다. 삽입물을 갖는 플라스미드에 의해 형질 전환된이.콜리K12 균주 JM83을 함유한 군락은 백색이며, 플라스미드만으로 형질 전환된이.콜리K12 균주 JM83을 함유한 군락을 청색이다. 수득된 백색 군락을 30㎍/ml 앰피실린 및 40㎍/ml X-gal을 함유한 LB 플레이트에 확인에 위해 다시 접종시킨다.

상기에서 수득된 백색 군락으로부터 10군락(박테리아클론)을 선택하고 홈즈 및 퀴글리의 미니-프레프 기술[Anal.Biochem.Vol 114, 193(1981)]을 사용하여 스크린한다.

특별하게는, 각 군락을 30㎍/ml 앰피실린을 함유한 LB배지에서 밤새 배양한다. 성장된 세포를 수거하여 2mg/ml 라이소자임-50mM 글루코즈-10mM EDTA-25 mM 트리스 HCI(pH 8.0)에 현탁시킨다.

현탁액을 실온에서 5분간 방치하고, 200㎕의 0.2N NaOH-1% SDS를 가한다. 천천히 교반한후, 현탁액을 실온에서 2분간 방치한다. 그후, 150㎕의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2)를 가하고, -20℃에서 10분간 방치한 다음, 15분간 원심 분리하여 생성된 상층액을 회수한다. 상층액에 900㎕의 냉 에탄올을 가하고, 5분간 원심분리하여 생성된 침전물을 수득한다. 수득된 침전물을 70% 에탄올로 세척하고, 건조시켜 플라스미드 DNA를 얻는다. 상술한 방법에서, 10 플라스미드 DNA를 수득한다.

각 플라스미드 DNA를 10mM 트리스-0.1mM EDTA(pH 8.0)에 용해시키고,EcoRI으로 분해한 후, 제한 분석을 위해 전기 영동한다. 분해 및 전기영동조건은 하기와 같다.

분해 : 플라스미드 DNA용액, 상기에서 제조된 양의 1/5 ;EcoRI, 3단위 ; 3단위, 37℃ ; 1.5시간

전기영동 : 1% 아가로즈겔 ; I×TAE : 120V ; 2시간.

상기의 제한 분석은 10군락중 8이 양성이라는 것을 나타낸다. 즉, 8군락은 2.9kb 단편을 갖는다. 8양성 군락으로부터 1군락을 선택하고,이.콜리K12 균주 J, 83(pHGE) (ATCC 39656, KFCC 10142)으로 정의한다.

pB 2-7 및 pR 18을 갖는이 .콜리대신에이 콜리Kl2 균주 JM83(pHGE)을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복하여 1.89mg의 pHGE DNA를 제조한다.

단계 10

[EcoRI-절단 RG-1의 서브클로닝]

상기 단계 6에서 제조된 30㎍의 RG-1을EcoRI으로 분해시킨다. 상기에서 제조된 단편 혼합물 및 0.8% 저융점 아가로즈겔을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 실제로 같은 방법에 의해, 생성 단편 혼합물로부터 약 3.5kb 길이의 단편을 회수한다. 1.0㎍의EcoRI-절단 RG-1단편(약 3.5kb)을 수득한다.EcoRI-절단 HG -3 단편(2.9kb) 대신에 상기에서 수득된EcoRI-절단 단편(3.5kb)을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 같은 방법에 의해, 상기에서 수득된EcoRI-절단 RG-1 단편 (3.5kb)을EcoRI-분해 pUC13에 결찰시킨다. 상기에서 수득된 결찰 생성물을 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 9와 같은 방법에 의해이.콜리Kl2 균주 JM83의 형질전환, 박테리아클론의 스크린, 클론의 분해 및 전기영동을 수행한다. 수득된 클론은이.콜리Kl2 균주 JM83(pRGE) (ATCC 39655, KFCC 10141)로 정의한다.

pB2-7 및 pR18 대신에이.콜리K12 균주 JM83(pRGE)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복하여 1.70mg의 pRGE DNA를 제조한다.

단계 11

[pHGE 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석]

상기 단계 9에서 수득된 pHGE DNA의 제한 효과분석을 매니아티스의 방법 [분자 클로닝, 콜드스프링하버 실험실, 98(1982)]에 따라 수행한다.

사용된 방법 및 조건은 다음과 같다.

1)EcoRI에 의한 pHGE DNA의 분해 :

18.6㎍ pHGE DNA

64단위 EcoRI

37℃, 2시간

2) 에탄올 침전 침전

3) 침전물에 증류수의 첨가 :

1㎍/㎕EcoRI-절단 pHGE용액의 제조

4) 각종 제한 효소로 분해 :

1㎍ pHGE/EcoRI

제한 효소 : 5단위PvuII, 5단위 PvuII+10 단위RsaI, 10단위RsaI , 4단위MstII, 3단위AvaI , 9단위 Pst I 37℃, 2시간

5) 전기영동 :

2% 아가로즈겔, 1 ×TAE, 28V, 14.5시간

6) 니트로셀룰로오즈 필터에 전이 :

[E.M.Southern, J.Mol.Biol.,98503(1975)]

7) 제 1 전 -혼성화 :

30ml FDSS

42℃, 6시간

8) 제 1 혼성화 :

pR 18의 5'-단편(5×10⁴cpm/ml)

(상기 단계 4에서 제조)

42℃, 14시간

9) 세척 :

2×SSC-0.1% SDS실온

침지 10분 ×4

↓

1× SSC-0.1% SDS 50℃

침지 30분×2

10) 노출 :

XAR-5 (이 스트멘코닥사, 미합중국)

-80℃, 2 강한 스크린, 17.5시간

11) 세척제거 :

0.5M NaOH-1.5M NaCl(침지 : 1분)

0.5M 트리스-1.5M NaCl(침지 : 1분)

↓

3×SSC(침지 : 1분)

12) 노출 :

노출시간이 19시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법

13) 제 2 전 -혼성화 :

상기 7)과 같은 방법 .

14) 제 2 혼성화 :

pB2-7 삽입물(상기 단계 3에서 제조)

42℃, 16.5시간

15) 세척 :

상기 9)와 같은 방법.

16) 노출 :

노출시간이 19.5시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법.

17) 세척제거 :

상기 11)과 같은 방법.

18) 노출 :

노출시간이 20시간인 것을 제외하고는 상기 10)과 같은 방법.

19) 제 3 전 -혼성화 :

상기 7)과 같은 방법.

20) 제 3 혼성화 :

pR18의 3'-단편 (4.5×10⁵cpm/ml)

(상기 단계 4에서 제조), 42℃, 15시간

21) 세척 :

상기 9)와 같은 방법.

22) 노출 :

상기 10)과 같은 방법 .

제한 효소 분석의 결과는 제 4도에 나타낸다.

단계 12

[pRGE 플라스미드 DNA의 제한효소 분석]

pHGE 플라스미드 DNA 대신 pRGE 플라스미드 DNA를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 11과 같은 방법에 의해, 상기 단계 10에서 제조된 pRGE 플라스미드 DNA의 제한 효소 분석을 수행한다. 수득된 pRGE DNA 삽입물의 제한 지도는 제 5도에 나타낸다.

단계 13

[토끼 TNF 유전자 및 인체 TNF 유전자의 염기 서열 결정]

pB2-7을 갖는이. 콜리K12 균주 MC1061 및 pR18을 갖는이.콜리K12 균주 MC1061 대신에 상기 단계 9에서 수득된이.콜리K12 균주 JM83(pHGE) 및 상기 단계 10에서 수득된이.콜리K12 균주 JM83(pRGE)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 단계 2와 같은 방법을 반복한다. 따라서, 각각 150㎍의 pRGE 플라스미드 DNA 및 pHGE 플라스미드 DNA를 수득한다.

pRGE 및 pHGE의 염기 서열을 막삼-길버트 방법에 따라 결정한다. [Maxam et al, Methods in Enzymology.Vol.55,490(1980), Academic press]

참고예 1에서 결정된 pR-18의 염기서열을 상기에서 결정된 pRGE의 염기서열과 비교하여 엑숀 및 인트론을 포함한 토끼 TNF 유전자의 구조를 밝혀낸다. pRGE DNA 삽입물의 구조는 제 5도에 나타낸다. 계속해서, pRGE의 염기서열을 pHGE의 염기서열과 비교하여 인트론과 엑숀사이의 경계주위의 유사성 및 일치성을 연구한다. 따라서, 엑숀 및 인트론을 포함한 인체 TNF 유전자의 구조를 밝혀낸다. 인체 TNF 유전자의 구조는 제 4도에 나타낸다.

상기에서 얻어진 토끼 TNF 및 인체 TNF를 코오딩하는 염기서열은 하기에 나타낸다. 이 염기서열에서 윗줄은 토끼 TNF를 코오딩하는 염기 서열(R)이고, 아랫줄은 인체 TNF를 코오딩하는 염기 서열(H)이다.

주 : “…” 기호는 토끼 TNF를 코오딩하는 DNA 염기서열중, 이 부분이 존재하지 않아서 이 기호의 양측에 인접한 두 코오돈이 직접 연결된 것을 의미한다.

단계 14

[올리고데옥시 뉴클레오티드의 합성]

각 끝에 스테인레스스틸 필터가 달린 스테인레스스틸 500㎕ 반응 용기에 뉴클레오시드(2.OμM)가 숙시네이트 결합을 통해 연결된 폴리스티렌 수지 20mg을 가한다. 수지를 디클로로메탄 이소프로판올(85:15)에 녹인 브롬화 아연 (1M)으로 처리하여 디메톡시트리틸(DMT) 보호기를 제거하고, 디메틸포름아미드, 피리딘 및 아세토니트릴로 세척한후, 질소기류하에 건조시킨다. 200㎕ 피리딘에 용해시킨 DMT-뉴클레오티드 (20μM) 및 메시틸렌술포닐니트로트리아졸(60μM)의 용액을 건조된 수지에 가한다. 결합 반응을 45℃에서 20분간 진행한다. 이와 같이 탈보호 및 결합반응을 목적하는 올리고데옥시뉴클레오티드가 수지에 모일때까지 뉴클레오티드에 대해 반복한다. 수지를 처리하여 그로부터 올리고데옥시뉴클레오티드를 제거하고, 이또오, 이께이꾸다 및 이따구라의 방법[Nuc.Ac.Res.10:1755(1982)]에 의해 정재한다.

따라서, 하기의 을리고데옥시뉴클레오티드가 수득된다.

1) 5'-AATI'CATGTCATCTTCTCCAACCCCGAGTGACAA-3'

2) 3'- GTACAGTAGAAGAGCTTGGCGCTCACTGTTCGG -5'

3) 5'- GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC -3'

4) 3'- ACATCCGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCCACT -5'

단계 15

[TNF를 위한 인체 미니유전자를 함유한 M13mp9-HGE의 형성]

플라스미드 pHGE(10㎍)를EcoRI(20단위)으로 분해한다. 1%저융점 아가로즈겔에 전기영동한 후, 2.9kb 단편을 용출시킨다. 이 단편을 M13mp9 파지의 재생형으로부터의EcoRI 단편에 삽입한다. M13mp9 파지는 DNA의 단편을 받기에 특히 적당하기 때문에 선택된다. 생성물을이.콜리JM103에 형질 이전시킨다.

[BRL(베데스다 연구실험실, 미합중국) User Manua1/M13mp7 Cloning/ 'Dideoxy'sequencing 1980]. 생성물을 M13mp9-HGE로 정의한다.

단계 16

(M13mp9-HGE 단일가닥 DNA 및 딜리터(Deletes) E3-4를 사용한 인트론 3의 삭제)

M13mp9-HGE의 단일가닥 DNA를 BRL User Manua1/M13mp7 cloning/ 'Dideoxy'Sequencing. 1980의 방법에 의해 제조한다.

단계 14에서 제조된 올리고데옥시뉴클레오티드 4) 3'-ACATCGGGTACAAC ATCGTTTGGGAGTTC GACT-5'를 인트론 3을 위한 딜리터로 사용한다. 인트론 3을 위한 딜리터는 “E3-4”로 정의한다.

딜리터 E3-4는 삭제된 인트론 3의 앞(엑손3) 및 뒤 (엑손4) 염기의 염기 서열에 상보적인 염기서열을 갖는다. 인트를 3의 삭제를 하기와 같은 왈레스 등의 보고 (Science 209 : 1396(1980))에 따라 수행한다.

T₄키나아제 (10단위) 및 ATP(3mM)를 사용하여 E3-4(16ng,15피코몰)를 포스포틸화하고, 템플레이트 M13mp9-HGE(1.65㎍,0.5피코몰)에 가한다. 반응 혼합물을 65℃에서 10분간 가열하고, 실온에서 5분간 냉각 시킨 후, 최종적으로 빙수에 냉각시킨다.

dATP,dCTP,dGTP,dTTP 및 ATP(0.4mM)에 클레노(Klenow) 단편(5단위), Hin 완충액[Wallace 등, Nuc.Ac.Res.9: 3647(1981)]에 녹인 T₄리가아제 (10단위), 10mM 트리스 HCl(pH7.2) . 2mM MgCl₂및 1mM β-메르캅토에탄올을 가한다. 반응 혼합물(최종부피 50μ)을 4℃에서 30분 및 실온에서 30분간 배양한다. 올리고뉴클레오티드의 반응으로부터의 DNA를 사용하여 BRL Uesr Manua1/M13mp7 cloning/ 'Dideoxy'Sequencing.1980의 방법에 따라이.콜리JM103을 형질이전 시킨다. 이 방법으로 수득된 플라크를 YT플레이트에 찍어 넣는다 [J.H.Miller p.433 .Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratory( 1972)]. 수득된 군락을 32p-표지 E3-4와 함께 55℃에서 2시간동안 혼성화 한다. 이 단계에서, 딜리터를 탐침으로 사용하여 인트론이 삭제된 후의 상응하는 상보적 염기서열을 갖는 DNA의 서열을 확인한다. 딜리터로 혼성화된 군락으로부터 파지를 분리한다.

생성된 파지를 플레이트하고, 플라크를 YT플레이트에 찍어 넣는다. 클론을 32p-표지 E3-4와 함께 55℃에서 2시간 동안 혼성화 한다. 양성 클론을 수득하고, 파지 DNA를 서열화하여 인트론 3이 완전히 삭제된 파지를 선택한다. 이런 파지를 mp9-HGE △3-1로 정의한다.

단계 17

[pHTNF - lacUV5 -2의 형성]

mp9-HGE △3-1의 복제형의EcoRI으로 분해한다.EcoRI 단편을 분리하고,EcoRI-절단 pBR327에 클로닝하여 플라스미드 pHGE △3-1을 수득한다. 플라스미드 pHGE △3-1을 사용하여 플라스미드를 형성함으로써, 프로모터로lacUV5를 사용하여 TNF를이 콜리에 직접 형질 발현시키는 플라스미드 △3-1을 수득한다. 이 방법은 제 7도에 상세하게 나타낸다. 먼저, 10㎍의 플라스미드 pHGE △3-1을 10단위의AVaI및EcoRI (베데스다 연구실험실,미합중국)으로 37℃에서 2시간 동안 분해하고, 4중량%의 폴리아크 릴 아미드겔에 전기 영동하여 단편을 분리한다.

전기 용출에 의해 약 1㎍의 단편을 겔로부터 분리해낸다. 단계 14와 같은 방법으로, 제7도에 나타낸 두 올리고데 옥시 뉴클레오티드, 즉 5'-AATTCATGTCATCTTC TCGAACC-3' 및 5'-TCGGCGTTCGAGAAGATGACATG-3'를 합성한다. 두 올리고데옥시뉴클레오티드(약 100피코몰)의 각 5' 말단을 문헌(3) 122페이지에 기재된 방법에 따라 T₄폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 포스폴릴화한다.

반응 완결후, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 클로로포름으로 더 추출한다. 이렇게 수득된 합성 올리고머를 플라스미드 pHGE △-1로부터 미리 수득된AvaI-EcoRI 단편 0.5㎍과 혼합하고, 에탄을 침전시킨다.

이들 단편을 문헌(1) 37페이지에 기재된 방법에 따라 10단위의 T₄리가아제를 사용하여 4℃에서 밤새 결찰시킨다. 반응 완결후, 혼합물을 에탄을 침전시키고, 4중량% 폴리아크릴아미드겔에 전기영등하여 전기용출시킴으로써 단편을 회수한다.

에프.플러 “유전자”19, pp 42-54(1982)에 기재된 방법에 따라 플라스미드 pOP95-15를 제조한다.

1㎍의 pOP95-15를 EcoRI으로 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출한 후, 에탄을 침전시켜 벡타를 수득한다. T₄DNA 리가아제를 사용하여, 0.5㎍을 수득된 벡타를 상기에서 수득된 단편과 결찰시킨다. 문헌(4) 20페이지에 기재된 방법에 따라, 상기에서 수득된 벡타를 사용하여이.콜리JM101(ATCC 33876)을 형질 전환시키고, 1mM의 IPTG 및 0.004w/v% x-gal을 함유한 한천 배지에서 배양하여 약 100백색 군락을 수득한다.

이들 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 제조하고,EcoRI으로 분해하여 이들 플라스미드가 목적하는EcoRI 단편을 함유한다는 것을 확인한다. 삽입 방향을 검사하기 위해, 이들 플라스미드를 PvUII 및 PstI으로 분해하고, 1.5중량% 아가로즈겔에 전기 영동하여 lacUV5 프로모터의 전사 방향이 TNF를 코오딩하는 올리고데옥시뉴클레오티드의 방향과 일치하는 약 1280 염기쌍 및 약 2600 염기쌍의 단편을 함유한 플라스미드를 선택 한다.

염기서열 분석을 하면 이들 2플라스미드가 같은 염기서열을 가지며, lacUV5 프로모터, 합성된 올리고데 옥시뉴클레오티드 및 cDNA가 서로 적당히 결합되었다는 것이 나타난다. 수득된 플라스미드를 pHTNF lacUV5-2로 정의한다.

pHTNF-lacUV5-2를 함유한이.콜리를 통상의 영양 배지에서 배양한다. 생성물의 TNF 활성을 바이오어쎄이하면lac프로모터 조절하에 토끼 TNF 유전자를 함유한 플라스미드 pTNF-lacUV5-1에 의해 수득된 것과 거의 같은 활성을 나타낸다.

[참고예 3]

참고예 2의 단계 1∼14에 기재된 방법에 의해 수득된 올리고데옥시뉴클레오티드 1-4 및 플라스미드 pHGE를 사용하여 제 6도에 설명된 방법에 따라 pHTNF-lacUV5-1을 제조한다.

[실시예 1]

참고예 3에서 제조된 pHTNF-lacUV5-2를 함유하는이.콜리를 종래의 영양 배지에서 배양하고, 통상적인 방법에 따라 유도를 수행한다.이.콜리를 더욱 배양하여, 본 발명에 사용되는 생리적 활성 물질을 함유하는 이.콜리 세포를 수득한다. 원심 분리하여 세포를 수거하고, 1ℓ의 0.04M트리스-염산 완층액(pH 7.8)안에서 옴파 파쇄에 의한 세포 분해를 수행하여 생리적 활성 물질을 함유하는 세포 추출물을 수득한다.

상기 세포 추출물은 4.5×10⁵/ml의 세포독소 활성을 갖는다. 추출물내의 활성 물질의 비활성은 3.0× 10⁴'U/mg -단백질이다.

이어서, 추출물을 0.04M트리스-염산 환충액(pH 8.0)으로 충분히 평형시킨 DEAE-세파로즈 CL-6B(스웨덴,파마시아 파인 케미칼스 AB제조) 컬럼에 가한다. 상기 컬럼을 0.04M트리스-염산 완충액(pH 8.0)으로 세척하고, 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M트리스-염산 완충액(pH8.0)을 사용하여 용출 공정을 수행한다.

활성 분획들을 혼합하고, 한외여과에 의해 농축시켜 4.0×10⁵U/mg-단백질의 비활성을 갖는 활성 물질을 함유하는 조 용액이 수득된다. 수득된 조 용액을 0.15M NaCl을 함유하는 5mM인산 완충액(pH7.4)으로 평형을 맞춘 세파크릴 S-200(스웨덴, 파마시아 파인 케미칼스 AB제조) 컬럼에 가한 다음 동일한 완충액을 사용하여 겔 여과를 수행한다. 활성 분획들을 혼합하고, 환외여과에 의해 농축시켜 7.0×10⁵/mg-단백질의 비활성을 갖는 생리적 활성 물질을 함유하는 용액이 수득된다. 수득된 용액 1 분취량을 0.15M NaCl을 함유하는 5mM인산 완충액(pH 7.4)으로 희석하여 120U/ml의 세포 독소 활성을 갖는 생리적 활성물질 용액이 제조된다.

수득된 용액 분취량들에 각각의 HSA(인체 혈청 알부민) 및 BSA(소의 혈청 알부민)를 가하여 표 5에 나타낸 것과 같은 알부민 농도를 갖는 시료용액을 제조한다. 생성된 시료 용액 각각에 대하여, 4℃에서 2일, 7일 및 30일 동안 저장한 후 잔류 활성을 측정한다. 상기 실험의 수행에 있어서, 알부민을 함유하지 않는 활성 물질 용액을 대조용으로 사용한다.

잔류 활성을 측정하기 위하여, 상술한 방법에 따라 각 시료의 활성을 시험관내 또는 생체내에서 측정한다. 시험관내의 실험 방법에서, 잔류 활성 (%)은 하기 항정식에 의한 분석치로부터 계산된다.

(상기식중, A는 저장 또는 물리적 처리후의 시료의 세포 독소 활성을 나타내고, B는 저장 또는 물리적 처리전의 시료의 세포 독소 활성을 나타낸다)

생체내 실험 방법에서, 각 시료 용액을 미니-모듈레 NM-3(일본국 아사히 화학공업 주식회사가 생산하는 한외여과 장치의 상표명, 일본국 후나꼬시 야꾸힝 판매)를 사용하여 처음 농도의 20배로 농축시킨다. 이어서, 각각의 농축된 TNF 용액 0.5ml를 종양을 앓고 있는 5마리의 생쥐그룹 각각에, 꼬리 정맥을 통해, 주사한다.

상술한 기준에 따라 항 종양 작용을 24시간후에 분석한다. 수득된 결과를 표 5 및 제 8도에 나타낸다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 방법을 반복하여 실시예 1에 기재된 시료 용액을 제조한다.

각각의 용액에 대하여, i) 각각의 시료 용액을 동결(-70℃) 및 이어서 냉동물의 용해를 1번 및 3번 반복시키고, ii) 시료용액들을 -70℃로 동결, 냉동 건조 및 실온에서 7일동안 저장한 후 잔류 활성을 측정한다. 상기 실험을 수행할때, 알부민을 함유하지 않는 활성 물질 용액을 대조용으로 사용한다. 냉동 건조된 제제[상기한 ii)항]에 있어서,상기 제제를 멸균 증류수에 용해하고,이어서 세포 독소 활성 분석을 수행한다.

각 시료의 잔류 활성은 실시예 1과 같이 생체내 또는 시험관내에서 측정한다. 결과는 표 5에 나타낸다.

[비교예]

실시예 1에 사용된 것과 동일한 세포독소 활성을 갖는 인체 TNF용액의 분취량들에 평상적인 생리적 활성 물질 용액의 안정화 제제로 공지된 각종 아미노산, 금속염 및 킬레이팅 제제 각각을 표 6에 기재된 것과 같이 각기 다른 농도로 가한다. 생성된 용액 각각을 4℃에서 7일 동안 저장하고, 생체내 분석 방법에 따라 항 종양 활성의 분석을 수행한다.

실시예 1과 동일한 방법으로 잔류 활성 (%)을 계산한다. 결과는 표 6에 나타낸다.

[표 5]

[주] : “시험관내”에 표시된 각 난의 숫자는 전술한 잔류 활성을 나타낸다.

“ 생체내”에 표시된 각 간의 숫자는 생쥐의 수를 나타낸다.

기호(-,+, , 등)의 의미는 전술한 것과 같다.

HAS : 미합중국 시그마 화학사 제품

BSA : 미합중국 아모르 약품회사 제품

[표 6]

Claims (19)

1. 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 사용한 DNA 재조합 기술에 의해 제조되었으며, L-M세포에 대한 세포독성 활성을 가지며 BALB/c 생쥐에 이식된 메스 A육종의 출혈성 괴사를 유도할 수 있는 생리적 활성물질을 함유하는 수용액 또는 분말에 유효량의 알부민을 가함을 특징으로 하는 생리적 활성물질의 안정화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기의 생리적 활성물질이 하기 일반식 ( I )의 아미노산 서열을 폴리펩티드인 방법.

   

   (상기식중, Gln는 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 리신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알리닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser는 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, Ile는 이소류신잔기, Trp는 트림토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기, 및 Cys는 시스레인잔기를 나타낸다).
3. 제1항에 있어서, 상기의 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA가 하기 일반식(ll)의 염기서열 및 이 염기서열에 상보적인 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 한가지 이상의 염기서열을 함유하는 방법.

   

   (상기 식중, A는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜산잔기 및 T는 티미틸 산잔기를 나타내며, 일반식 (II)의 좌측말단 및 우측말단은 각가 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측으로 표시한다)
4. 제1항에 있어서, 상기의 알부민이 인체 혈청 알부민인 방법.
5. 제1∼4항중 어느 한 항에 있어서, 상기의 알부민은 10²∼10⁹단위/ml의 L-M세포에 대한 세포독성 활성을 갖는 수용액 1ml당 약 10㎍∼50mg의 양으로 수용액에 가하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 알부민의 양이 수용액 1ml당 약 100㎍∼10mg인 방법.
7. 제1∼4항중 어느 한항에 있어서, 생리적 활성물질을 함유한 분말을 물에 용해시켜 10²∼10⁸단위/ml의 세포독성 활성을 나타내는 수용액을 수득할때, 상기의 알부민을 수용액 1ml당 악 10㎍∼50mg의 농도가 되는 양으로 분말에 가하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 알부민의 농도가 수용액 1ml당 약 100㎍∼10mg인 방법.
9. 제1∼4항중 어느 한항에 있어서, 상기의 알부민을 가함으로써 생성된 수용액을 더 동결 건조시키는 방법.
10. 생리적 활성 물질을 코오딩하는 DNA를 함유한 재조합 DNA를 사용한 DNA재조합 기술에 의해 제조되었으며, L-M세포에 대한 세포독성 활성을 가지며 BALB/c생쥐에 이식된 메스 A육종의 출혈성 괴사를 유도할 수 있는 생리적 활성물질을 함유하는 수용액 또는 분말에 유효량의 알부민을 가함을 특징으로 하는, 생리적 활성물질 및 유효량의 알부민을 함유하는 안정화 수용액 또는 분말의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 상기의 생리적 활성물질이 하기 일반식 ( I )의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 방법.

    

    (상기식중, Gln은 글루타민잔기, Asp는 아스파르트산잔기, Pro는 프롤린잔기, Tyr은 티로신잔기, Val은 발린잔기, Lys는 라신잔기, Glu는 글루탐산잔기, Ala는 알라닌잔기, Asn은 아스파라진잔기, Leu는 류신잔기, Phe는 페닐알라닌잔기, Gly는 글리신잔기, His는 히스티딘잔기, Ser은 세린잔기, Thr은 트레오닌잔기, lie는 이소류신잔기, Trp는 트립토판잔기, Arg는 아르기닌잔기, Met는 메티오닌잔기 및 Cys는 시스레인 잔기를 나타낸다)
12. 제10항에 있어서, 상기의 생리적 활성물질을 코오딩하는 DNA가 하기 일반식 (II)의 염기서열에 상보적인 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 한가지 이상의 염기 서열을 함유하는 방법.

    

    (상기식중, 4는 데옥시아데닐산잔기, G는 데옥시구아닐산잔기, C는 데옥시시티딜산잔기 및 T는 티미딜잔기를 나타내며, 일반식 (II)의 좌측말단 및 우측말단은 각각 5'-히드록실기 측 및 3'-히드록실기 측으로 표시한다)
13. 제10항에 있어서, 상기의 알부민의 인체 혈청 알부민인 방법.
14. 제10∼13항중 어느 한항에 있어서, 상기의 알부민을 10²∼10⁹단위/ml의 L-M세포에 대한 세포독성 활성을 갖는 수용액 1ml당 약 10㎍∼50mg의 양으로 수용액에 가하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 알부민의 양이 수용액 당 약 100㎍∼10mg인 방법 .
16. 제10∼13항중 어느 한항에 있어서, 생리적 활성물질을 함유한 분말을 물에 용해시켜 10²∼10⁹단위/ml의 세포독성 활성을 나타내는 수용액을 수득할때, 상기의 알부민을 수용액 1ml당 약 10㎍∼50mg의 농도가 되는 양으로 분말에 가하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 알부민의 농도가 수용액 1ml당 약 100㎍∼10mg인 방법.
18. 제5항에 있어서, 상기의 알부민을 가함으로써 생성된 수용액을 더 동결건조시키는 방법.
19. 제6항에 있어서, 상기의 알부민을 가함으로써 생성된 수용액을 더 동결건조시키는 방법.

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