KR920010225B1 - 인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 dna의 제법 - Google Patents

인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 dna의 제법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 DNA의 제법
제1도는 DNA 단편 제조용의 제한 엔도뉴클레아제 절단부위와, 인간 TNF폴리펩티드를 코우드하는 클론화된 cDAN의 염기 배열 결정[실시예 1∼(9)]을 위한 배열영향을 도시한 것.
제2도는 형질발현 플라스미드 pHTT 26의 구성방법[실시예 2∼(1)]을 도시한 것.
제3도는 형질발현 플라스미드 pHTR 91의 구성방법[실시예 2∼(2)]을 도시한 것.
제4도는 형질전환 프라스미드 pHTS 115의 구성방법[실시예 2∼(3)]을 도시한 것.
제5도는 형질발현 플라스미드 pHTS 367의 구성방법[실시예 2∼(4)]을 도시한 것.
본 발명은(1)은 인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 주요부분을 코드화하는 염기 배열 또는 변성된 상기 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA의 생산법과, (2) 인간 TNF, 인간 TNF형의 물질, 그의 주요부분 또는 그의 변성된 물질을 갖거나 함유하는 폴리펩티드의 생산법에 관한 것이다.
카아스웰(Carswell)씨 등은, 바실루스 칼메테-구에린(Calmette-Guerin, BCG)으로 감염시킨 후 엔도톡신으로 처리한 쥐의 혈청은 이식된 Meth A 육종을 괴사시키는 물질을 함유한다는 것을 발견하고, 그를 암괴사인자(이후부터는 THF라고 표시한다)라고 명명하였다(Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 72, 3666, 1975).
THF는 마크로파지로부터 방출된 생리 활성물질로 생각되며, 그 특징은;
(i) 이것을 어떤 종류의 종양(에컨대 Meth A 육종)을 갖고 있는 동물에 투여하면 종양의 괴사를 유발하며;
(ⅱ) 이것은 어떤 종류의 육종세포(쥐의 L세포)데 대하여 시험관내에서의 세포 독성효과를 갖고 있으나 정상세포에 대하여는 상해효과를 거의 갖지 않고 ;
(ⅲ) 그의 활성은 동물의 종특이적이 아니다 ;
라고 공지되어 있다.
상기와 같은 특성 때문에 TNF를 새로운 형태의 항종양제로서 개발시킨 것이 강력히 요구되어 왔다.
TNF나 TNF형의 물질은 다음 참고문헌과 특허 명세서에 기록, 출판되어 있다.
Green et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 73, 381(1976).
Matthews et al., Br. J. Cancdr, 42, 416(1980).
Ruff et al., J. Immunol., 125, 1671(1980).
Mannel et al., Infect. Immunity, 28, 204 (1980).
Haranaka et al., Japan. J. Exp Med., 51, 191(1981).
European Patent Publication No. 90892.
European Patent Publication No. 86475.
Japanese Patent Publication No. 21621/1983.
상기 문헌에 기술되어 있는 방법은 체액(즉 혈액)이나, 또는 토끼, 쥐, 햄스터 (hamster)나 기니아 피그의 조직으로부터 조(粗)물질(미가공물질)로서 나온 TNF를 정제하는 것이다.
그러나 이 생성물은 명확히 규명되지 않았고, 확실히 이 조물질의 공급과 최종생산물의 순도의 관점에서 이들 방법에 대하여는 여러가지 제약이 따른다.
효능있는 제암제로서의 임상사용에 있어서는 면역 유전학을 고려하여 사람에게서 나온 TNF가 바람직하다. 그러나 상기한 방법을 TNF 제조에 적용하기는 불가능하다.
다음 문헌은 현재까지 사람으로부터 나온 제암(항종양) 세포독소; 즉 사람의 말초 혈세포에 고유한 세포로부터 나온(Reed씨등 J. Immunol., 115, 395, 1975), 그리고 인간의 B세포주로 부터 나온(Williamson씨등, Proc. Nat. Acad. Sci., USA., 80, 5397, 1983), 사람의 말초단구로부터 생성된 세포 독소와 사람의 골수구 단구 백혈병 세포(Matthew, Immunology, 44, 135, 1981)에 대하여 기술하고 있다.
이들 물질은 세포독소 활성을 갖고 있으나 명확히 규명된 것은 아니다. 본 발명자들은 DNA 재조합 기술을 이용하여 여러가지로 검토하였다.
상기 연구결과로 인간의 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 cDAN의 클론화(cloning)에 성공하였다.
상기 연구과정중 본 발명자들은 인간의 TNF cDAN가 그의 전구체(前驅體)인 폴리펩티드에 대하여 코우드한다는 것도 역시 발견하였다.
또한 본 발명자들은 클론화된 인간 TNF cDAN를 삽입하여 갖고 있는 형질발현 벡터(expression vector)로 변환된 숙주내에서 인간 TNF 폴리펩티드를 생성시키는데 성공하였다.
기술의 간략화를 위하여 본 명세서와 청구범위에서 다음의 약자들을 사용하기로 한다.
A : 아데닌
C : 시토신
G : 구아닌
T : 티민
Ala : 알라닌
Arg : 아르기닌
Asn : 아스파라긴
Asp : 아스파라긴산
Cys : 시스테인
Gln : 글루타민
Glu : 글루타민산
Gly : 글리 신
His : 히스티딘
Ile : 이소로이신
Leu : 로이신
Lys : 리진
Met : 메티오닌
pHe : 페닐알라닌
Pro : 푸롤린
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Trp : 트립토판
Tyr : 티로신
Val : 발린
DNA : 데옥시리보핵산
cDAN : 상보 DNA
RNA : 리보핵산
mRNA : 전령 RNA
폴리(A) mRNA : 폴리(A)-함유 mRNA
dATP : 데옥시아데노신 3인산
dCTP : 데옥시시티딘 3인산
dGTP : 데옥시구아노신 3인산
dTTP : 데옥시티미딘 3인산
올리고(dC) : 올리고데옥시시티딜산
올리고(dG) : 올리고데옥시구아닐산
올리고(dT) : 올리고데옥시티미딜산
폴리(A) : 폴리아데닐산
폴리(U) : 폴리우리딜산
폴리(dc) : 폴리데옥시시티딜산
폴리(dG) : 폴리데옥시구아닐산
ATP : 아데노신 3인산
EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산
kb : 킬로염기
kbp : 킬로염기쌍
bp : 염기쌍
Meth A 육종 : 메틸콜란드렌-유도육종
TNF : 종양괴사인자
rHu-TNF : 재조합인간 TNF
그리고 본 명세서에서 단선으로 나타낸 염기 배열은 감작 스트랜드의 염기 배열이고, 좌측 끝이 5′-말단이고 우측끝이 3′-말단이다. 아미노산 배열에 있어서는 좌단이 N-말단, 우단이 C-말단이다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
[I-1] 본 발명은 인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 주요부분에 상응하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA의 생산법에 관한 것으로 더욱 상세히 말하면 다음 일반식(I)로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기 배열 또는 상기 염기 배열의 3′말단에서 종지코든(termination codon)을 갖는 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA의 제법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기 식에서 A는 1개 이상의 아미노산이 삭제되거나 다른 아미노산으로 대치될 수 있는 다음 식(Ia)의 폴리펩티드이고, B는 1 내지 3개의 아미노산이 삭제되거나 다른 아미노산으로 대치될 수 있는 다음 일반식(Ib)의 펩티드이며, X는 폴리펩티드이고, Y는 Met이며, m,n 및 p는 1 또는 0이다.
일반식 (Ia)는 다음과 같다.
Figure kpo00002
일반식[Ib]는 다음과 같다.
Figure kpo00003
상기식 [I]에서 X로 표시된 폴리펩티드의 바람직한 구체예는 다음식 [Ic]로 표시되는 폴리펩티드이다.
Figure kpo00004
또한 상기 [Ia}, [IIb] 및 [Ic]로 표시되는 아미노산 배열에 대응하는 여기 배열의 구체예로서는 다음식 [IIa], [IIb] 및 [IIc]로 각각 표시된 것이 열거된다.
일반식 [IIa] ;
Figure kpo00005
일반식 [IIb] ;
Figure kpo00006
일반식 [IIc] ;
Figure kpo00007
본 발명에서 생산되는 DNA에는 다음과 같은 형태의 DNA가 포함되는 것으로 이해된다.
(1) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 DNA.
(2) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 DNA의 대립형질 돌연 변이체인 DNA.
(3) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 대립형질 돌연변이체 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 변성하여 얻은 DNA.
(4) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 대립형질 돌연변이체 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 화학적으로 또는 효소적으로 변성하여 얻은 DNA.
(5) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 DNA에 상응하는, 일부 또는 전체가 화학적으로 합성된 DNA.
(6) 활성이 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분의 활성과 실제로 동등한 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
(7) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 DNA의 변성물.
(8) 1개 이상의 코돈이 삭제되거나 또는 다른 코돈으로 대치된 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
(9) 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하고, 개시코돈 및/또는 종지코돈 및/또는 개시코돈의 상류의 샤인-달가노 서열이 뒤따르는 프로모터를 갖는 DNA.
(10) 토끼 TNF의 염기 서열과는 다르지만 이 염기 서열과 상동성이 높은 부분의 염기 서열을 포함하고 있는 DNA.
본 발명에서 생산되는 DNA중 바람직한 DNA는 일반식[I]에 있어서,
(1)A는 일반식[Ia], B는 일반식[Ib], X는 일반식[Ic], m과 n은 1, Y와 p는 일반식[I]에서 정의한 것과 같은 아미노산 배열에 상당하는 염기 배열을 갖거나 또는 함유하는 DNA.
(2)A는 일반식[Ia], B는 일반식[Ib], m은 1, n은 0이고, Y와 p는 일반식[I]에서 정의한 것과 같은 아미노산 배열에 상당하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA.
(3) A는 일반식[Ia], m과 n은 0, Y와 p는 일반식[I]에서 정의한 것과 같은 아미노산 배열에 상당하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA.
이고, 특히 바람직한 DNA는 일반식[I]에 있어서 A가 일반식[Ia]이고, B는 일반식[Ib]이며, m은 1또는 0이고, n과 p는 0인 아미노산 배열에 상당하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 DNA이다.
상기 일반식[I]에 있어서, A는 일반식[Ia]이고, B는 일반식[Ib]이며, X는 일반식[Ic]이며, m,n 및 p는 각각 1인 아미노산 배열에 대응하는 염기 배열은 첨부된 표 2에서 번호를 붙여서 나타내었는바, 그의 제1번으로부터 제699번 까지의 염기 배열로 표시되어 있고, 따라서 상기 일반식[Ia]의 아미노산 배열에 대응하는 염기 배열은 표 2의 제247번부터 제699번까지의 염기 배열로 표시되어 있으며, 그에 대응하는 아미노산의 총수는 151개이다.
또한 표 2의 식에 있어서는 상단에 염기 배열을, 하단에는 그에 대응하는 아미노산 배열이 나타나 있다.
상기 일반식[Ia]에 있어서, 1개 또는 그 이상의 아미노산이 삭제 또는 대치되어 있는 아미노산 배열로서는, 예를들면,
(4) N-말단으로부터 제 1번째의 Thr가 삭제된 것.
(5) N-말단으로부터 제 1번째의 Thr 내지 제 6번째 Pro까지의 아미노산 배열이 삭제된것.
(6) N-말단으로부터 제 1번째의 Thr 내지 제 9번째 His까지의 아미노산 배열이 삭제된것.
(7) N-말단으로부터 제 1번째의 Thr 내지 제12번째 Ala까지의 아미노산 배열이 삭제된것.
(8) N-말단으로부터 제66번째, 제67번째의 Thr-His가 His,Thr 또는 Tyr로 대치된것.
이 포함되어 있다.
본 발명자들은 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코우드하는 DNA의 염기 배열로서는, 표 3 상단에 있어서, 적어도
(9) 제577번의 T로부터 제708번의 G까지의 염기 배열.
(10) 특히, 제658번의 T로부터 제708번의 T까지의 염기 배열
을 갖는 것이 중요하다고 생각한다.
[1-2] 본 발명의 DNA 제조법을 이하에 상세히 기술한다.
본 발명에 따르면 인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 주요부분은 인간의 마이크로파지를 유도제와 함께 배양하고, 유도된 세포로부터 인간 TNF mRNA를 함유하는 분획을 분리하고, 이 분획으로부터 cDAN 라이브러리를 작성하고, 적당한 프로브, 예를들면 토끼 TNF cDAN 단편을 이용하는 미분 혼성화 방법이나 또는 mRNA 혼성화-번역 분석이 뒤따르는 미분 혼성화 방법에 의하여 인간 TNF cDAN를 클로닝함으로써 제조할 수 있다.
즉 다음의 각 단계를 밟아서 제조할 수 있다.
A. 인간 마이크로파지를 유도제와 함께 배양하는 단계.
B. 인간 TNF mRNA를 함유하는 분획을, 유도된 세포로부터 분리하는 단계.
C. 역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 sscDAN를 제조한 다음 이를 dscDAN로 전환시키는 단계.
D. dscDAN를 벡터에 삽입하는 단계.
E. 재조합 벡터를 숙주에 도입하여 이를 형질절환시키고 cDAN(colony) 라이브러리를 작성하는 단계.
F. 이 라이브러리로부터 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 cDAN를 클로닝하는 단계.
그리고, 상기와 같이 생산된 DNA를 소망에 따라,
G. 변형 ;
함에 의하여 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 대응하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 상기 DNA 이외의 기타 본 발명의 DNA를 제조할 수 있다.
본 발명의 DNA를 제조하는 방법을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
그러나 후술하는 방법의 각 단계에 있어서의 조작과 조건은 본 분야에 잘 공지된 것이며, 본 발명 방법이 후술하는 이들 특수방법에 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다.
(1) 인간 TNF mRNA의 제조
인간 TNF mRNA는 예컨대 다음 방법에 의하여 인간 마크로파지로부터 얻을 수 있다.
인간 마크로파지는 예컨대 소네씨등의 방법(Sone, J. Immunol., 129, 1313, 1982)에 의하여 인간의 폐포(肺胞)로부터, 매튜방법(Matthews, Br J. Cancer, 48, 405, 1983)에 의하여 혈액으로부터, 윌슨씨등의 방법(Wilson, J. Immunological Method, 56, 305, 1983)에 의하여 태반으로부터, 또는 기타 조직으로 부터 얻는다.
이와 같은 얻은 마크로파지를 약 2×104내지 1×106세포/cm2의 세포밀도로 접시에 파종하고, 35 내지 38℃, 바람직하게는 약 37℃로 5% 탄산가스를 함유하는 완전한 습기분위기중에서 약 30분 내지 2시간 전-배양시킨다.
다음에 그람-음성세균, 바람직하게는 에스케리치아콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 살모넬라 타이피(Salmonella typHi)로부터 유도된 리포폴리사카라이드로부터 얻은 엔도톡신을 유도제로서 가하고, 시클로헥시미드를 단백질 합성 저해재로서 가한다.
배양을 3 내지 8시간 더 계속시켜 마이크로파지내에 인간 TNF mRNA를 축적시킨다.
전-배양은 생략할 수도 있다.
엔도톡신의 양은 일반적으로 약 0.1 내지 1000마이크로그램/ml, 바람직하게는 1 내지 100마이크로그램/ml 이다.
이때 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트, 포르볼-12,13-디데카노에이드 또는 포트볼-12,13-디벤조에이드와 같은 포트볼 에스테르를 유도제로서 약 1 내지 2000ng/ml의 양으로 가할 수 있다.
단백합성 저해제의 양은 그의 형에 따라 다양하다. 예컨대, 시클로헥시미드의 경우에는 0.1 내지 50마이크로그램/ml이다.
포유동물세포 배양에 적당한 여러가지 배양배지를 배지로서 사용할 수 있다.
그 예로서는 RPM-1640, 이글(Eagle)의 MEM 배지 및 둘베코(Dulbecco)의 변형 MEM 배지(상기 배지 조성에 대하여는 예컨대 “세포배양 매뉴얼”, Y. Sohmura, Kodansha, 1982 및 J, Paul “세포와 조직배양”, E. 5. Livingstone Ltd.1970)가 있다.
바람직하게는 동물혈청(우태아(牛胎兒) 혈청이나 송아지 혈청)을 약 1 내지 20%의 양으로 배지에 가한다.
배양후 통상의 방법, 예컨대 키르귄씨등의 방법 (Chirgwin, Biochemistry, 18, 5294, 1979)에 의하여 세포로부터 총 DNA를 추출한 다음 올리고(67)-셀룰로오스 또는 폴리(U) 세파로오스상의 에피니티 컬럼 크로마토그래피에 의하거나 또는 뱃치법으로 폴리(A) mRNA를 함유하는 분획을 분리한다.
인간 THF mRNA가 많은 mRNA 분획은 폴리(A) mRNA 분획을 산-요소 아가로스 겔 전기영동시키거나 또는 슈크로오스 밀도구배 원심분리시켜 얻을 수 있다.
생성된 mRNA 분획이 인간 TNF 폴리펩티드를 코드하는 mRNA를 함유하는 분획이라는 것을 확인하기 위해서는, mRNA를 단백질로 번역하고 그의 생물활성을 시험한다. 이것은 예컨대, 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 난모 세포에 mRNA를 주사하거나 또는 이것을 망상 적혈구 용해질이나 소맥 배아세포가 없는 단백질합성 시스템과 같은 적당한 단백질합성 시스템에 가함으로써, 또는 번역된 단백질의 쥐의 L세포에 대하여 시험관내에서 세포독소 활성을 갖는다는 것을 확인함으로서 수행될 수 있다.
(2) 인간 TNF cDAN의 클로닝
dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP의 존재하에 역전사효소[예컨댄, 조류의 골수아구종증 바이러스(AMV)로부터 유도된 것]를 사용하여 sscDAN를 합성하기 위하여는 단계(1)에서 얻은 폴리(A) mRNA 또는 mRNA를 다량 함유하는 분획을 주형으로서 이용하고, 올리고(67)를 프라이머로서 이용한다.
다음에는 sscDAN를 주형으로서 사용하고, dscDAN는 역전사효소나 또는 E. 콜리 DNA 폴리머라제(대분획)을 사용하여 합성한다.
통상적인 방법, 예컨대 폴리(dG)-폴리(dC) 단일중합체 신장법(T.S. Nelson “Methods in En-zymology”, 68, 41, 1979, Academic Press Inc., N.Y.)에 의하여 생성된 dscDAN를 예컨대 플라스미드 pBR322의 제한 엔도뉴클레아제 Pst I 분할편에 삽입한다.
생성된 재조합 플라스미드를 E. coli x1776과 같은 숙주에 코헨씨등의 방법(Cohen, Nat. Acad, Sci., USA, 69, 2110, 1972)에 따라 도입하여 이를 변환시키고, 테트라싸이클린-내성 콜로리를 선택함으로써 cDAN(colony) 라이브러리를 작성한다.
cDAN 라이브러리는 참고실시예 1에서 얻은 3P로 표지된 토끼 TNF cDAN 단편을 프로브로서 사용하여 콜로니 혼성화시키고, 인간 TNF 폴리펩터드를 코우드하는 삽입된 cDAN를 함유하는 재조합 플라스미드가 잠복되어 있는 원하는 클론을 선별한다.
만일 상기와 같은 적당한 TNF 프로브를 얻을 수 없는 경우에는 유도 플러스 및 마이너스 프로브를 사용하는 콜로니 혼성화와 다음과 같은 혼성화-번역분석에 의하여 원하는 클론을 스크리닝한다.
32p-표지의 cDAN는 폴리(A) mRNA 분획이나 또는 단계(1)에서 얻은 인간 TNF mRNA를 함유하는, mRNA가 풍부한 분획을 주형으로 사용하여 합성하고, 유도 플러스 프로우브로서 사용한다.
별도로, 비(非)-유도 마크로파지를 출발물로서 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 과정에 의하여 얻은 mRNA 분회을 주형으로 사용하고, 32p-표지의 cDAN를 합성한다.
32p-표지의 cDAN는 유도 마이너스 프로우브로서 사용한다. 상기 cDAN 라이브러리로부터 유도 플러스 프로우브와는 강하게 하이브리다이즈 되었으나 유도 마이너스 프로우브와는 하이브리다이즈되지 않은 플라시미드 클론을 선택한다.
생성된 클론이 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 cDAN 삽입물을 잠복시키고 있다는 것을 확인하기 위하여 다음 방법을 수행한다.
플라스미드 DNA는 상기 클론으로부터 분리시켜 가열이나 알칼리 처리에 의하여 단일 스트랜드 DNA로 전환시키고, 니트로셀룰로오스 필터에 고정시킨다.
인간 TNF mRNA를 함유하는 mRNA 분획을 필터에 가하여 고정된 DNA와 혼성화시킨다.
다음에 혼성화된 mRNA를 용리시켜 회수한다.
회수된 mRNA가 인간 TNF 폴리펩티드를 코드하는지의 여부를 확인하기 위하여 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 난모 세포에 회수된 mRNA를 주입한다.
상기 방법은 헝질전환체로 하여금 DNA 단편을 함유하는 재조합 플라스미드를 함유하게 되며, 이 DNA 단편은 인간 TNF mRNA와 상보적인 염기 배열을 갖는 것이다.
얻어진 클론화된 cDAN가 인간 TNF 폴리펩티드의 전체 코우드영역을 함유하지 않는 경우에는 상기와 같이 선택된 형질전환주로부터 클론화된 TNF cDAN 단편을 프로우브로서 사용하여 cDAN 라이브러리를 스크리닝함으로서 큰 크기의 cDAN를 선택한다.
인간 TNF 폴리펩티드의 아미노산 배열을 함유하는 폴리펩티드를 코우드하는 클론화된 cDAN는 예컨대 토끼 TNF cDAN의 염기 배열과 상동성을 갖는 염기 배열을 조사하는 맥샘-길버어트법[Maxam-Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci., USA,74, 560, 1977에 따라, 생성되는 클론화된 cDAN 단편 몇개의 염기 배열을 분석하고, 인간 TNF 폴리펩티드의 전체 코우드영역에 상응하는 염기 배열을 갖는 cDAN를 선택함으로써 최종적으로 판명될 수 있다.
토끼 TNF에 대하여 코우드하는 염기 배열과 인간 TNF 폴리펩티드에 대하여 코우드하는 것과의 상동성과, 토끼 TNF의 추정된 아미노산 배열과 인간 TNF 폴리펩티드 사이의 상동성은 각각 표 5와 6에 기재되어 있다.
이들 상동성과, 토끼 플라스마 TNF(다음의 참고 실시예 3 참조)의 측정된 N-말단 및 C-말단 아미노산 배열로부터 판단하건대, 인간 TNF cDAN는 233 아미노산 잔유물의 전구체 폴리펩티드에 대하여 코우드하고, 성숙된 인간 TNF 폴리펩티드는 그의 전구체의 카르복시-말단으로부터 나온 155 아미노산 잔유물에 상응하는 폴리펩티드라는 것이 판명되었다.
성숙된 인간 TNF 폴리펩티드는, A가 일반식[Ia]이고, B가 일반식[Ib]이며, m이 1이고 n과 p가 0인 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기 배열에서 코우드된다. 인간 TNF 전구체 폴리펩티드는 A가 일반식[Ia]이고, B가 일반식[Ib]이며, X가 일반식[Ic]이고, m,n 및 p가 1이며, Y가 Met인 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기 배열에서 코우드된다.
상기와 같이 아미노산 배열과 추정된 아미노산 배열상의 높은 상동성은 인간과 쥐의 TNF가 계통발생학적으로 동일한 유전자로부터 유도된다는 것을 나타낼 수 있으며, 또한 공통영역의 상당한 부분이 생물활성을 나타내는데 필요한 배열이라는 것을 암시한다. 그러나 성숙된 인간 TNF 폴리펩티드는 다음에 나타내는 바와 같이 토끼 플라스마 TNF와 면역학적으로 교차되지 않는다.
성숙된 인간 TNF 폴리펩티드의 아미노산 배열이 항상 활성을 나타내는 것은 아니며, 부분변형된 인간TNF 폴리펩티드도 역시 성숙된 TNF 폴리펩티드의 활성부위 만큼의 활성을 갖는다는 것이 지적되었다.
(3) 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 DNA의 변형
인간 TNF 폴리펩티드를 로우드하는 DNA는 일반식(I)로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA를 형성하는 것으로 그 자체가 알려진 방법에 의하여 변형될 수 있다.
수식은, 예컨대 DNA를 적당한 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)로 분할하고 1개이상의 코든을 적당한 엑소뉴클레아제 그리고/또는 엔도뉴클레아제 단독 또는 이를 조합한 것으로 분열시킨 다음 변질된 코돈이나 기타의 코돈, 예를들면 인산트리에스테르법(Ohtsuka, E., et al., Heterocycles, 15, 395,1981)으로 화학 합성된 것으로 대체시키거나, 삭제된 1개이상의 코든을 갖는 DNA를 제조하기 위하여 코돈을 더 보충하지 않으면서 연결시킴으로써 수행된다.
[II-1] 본 발명은 또한 전술한 바와같이 인간 암괴사 인자 폴리펩티드나 그의 주요부분과, 인간 암괴사인자형 물질과 그의 주요부분 및 이들의 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 물질에도 관한 것으로, 이를 더욱 상세히 말하면 다음 일반식[I]로 표시되는 폴리펩티드나 그의 유도체 또는 염을 제조하는 방법에도 관한 것이다.
Figure kpo00008
상기 식에서 A는 다음과 같이 1개이상의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된, 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 1 내지 3개 아미노산이 삭제되거나 다른 아미노산으로 대치된 다음 일반식[Ib]의 펩티드이며, X는 폴리펩티드이고. Y는 Met이고, m,n 및 p는 가각 1 또는 0이다. 일반식[Ia]는 다음과 같다.
Figure kpo00009
일반식[Ib]는 다음과 같다.
Figure kpo00010
상기 식[I]에 있어서, X로 표시되는 폴리펩티드의 바람직한 구체예는 다음 식[Ic]로 표시되는 폴리펩티드이다.
Figure kpo00011
본 발명에서 생산되는 폴리펩티드에는 다음과 같은 폴리펩티드가 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다.
(1) [I-2]항에 기재한 본 발명에서 생산되는 DNA가 삽입된 형질발현 벡터에 의해서 변형된 숙주가 생산하는 해당 DNA에 대응하는 폴리펩티드.
(2) 인간 TNF 폴리펠티드 또는 그의 전구체 폴리펩티드.
(3) 하나 또는 2이상의 아미노산이 삭제되었거나 다른 아미노산에 의해 대치되어 있는 인간 TNF 폴리펩티드.
(4) 인간 TNF 폴리펩티드의 주요부분으로 구성되어 있는 폴리펩티드.
(5) 토끼 TNF 폴리펩티드와는 다르나 이 TNF 폴리펩티드와 상동성이 높은 부분의 펩티드를 포함 또는 갖는 폴리펩티드.
(6) 인간 TNF 플리펩티드의 숙주에서의 분해 산물.
(7) 인간 TNF 폴리펩티드의 화학적 또는 효소적수식에 의해 생기는 폴리펩티드 또는 그의 유도체.
(8) 인간 TNF 폴리펩티드의 활성과 대략 상등하는 생물학적 활성을 갖고 있거나 잠재적으로 갖고 있는 폴리펩티드.
본 발명에서 생산되는 폴리펩티드중에서 바람직한 폴리펩티드는 식(I)에 있어서
(1) A는 식[Ia], B는 식[Ib], m은 1, n은 0, 또한 Y 및 p는 상기 식[I]에서의 정의와 같은 폴리펩티드.
(2) A는 식[Ia], n 및 m은 0, 그리고 Y 및 p는 상기 식[I]에서 정의한 바와같은 폴리펩티드.
(3) A는 식[Ia]이고, B는 식[Ib]이고, X는 식[Ic]이고, m 및 n은 1이고 또한 Y 및 p는 상기 식[I]에서 정의한 바와같은 폴리펩티드이다. 그리고 특히 바람직한 펩티드로 식(I)에 있어서, A는 식[la]이고, B는 [Ib]이고, m는 1 또는 0이고, n 및 p는 0인 폴리펩티드 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염이다.
상기 식[Ia]의 폴리펩티드는 표 4상단의 제86번에서 제236번까지의 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드이다.
상기 식 Ia의 폴리펩티드에 있어서 1개 또는 2이상의 아미노산이 삭제 또는 대치된 폴리펩티드에는 상기 식 Ia의 폴리펩티드의 아미노산 배열에 있어서, (1) N-말단으로부터 첫번째의 Thr가 삭제된 것, (2)N-말단으로부터 첫번째의 Thr 내지 여섯번째의 Pro까지의 아미노산 배열이 삭제된 것, (3) N-말단으로부터 첫번째의 Thr 내지 아홉번째의 His까지의 아미노산 배열이 삭제된 것, (4) N-말단으로부터 첫번째의 Thr 내지 두번째의 Ala까지의 아미노산 배열이 삭제된 것, (5) N-말단으로부터 66번, 67번개의 Thr-His가 His, Thr 또는 Tyr로 대치된 것, 이 포함된다.
본 발명자들은 생물활성을 갖는 폴리펩티드의 아미노산 배열로서 상기 표 4의 상단의 아미노산 배열에 있어서, 적어도 (1) 193번의 Trp 내지 236번의 Leu까지의 아미노산 배열, (2) 특히 220번의 Tyr부터 236번의 Leu까지의 아미노산 배열을 갖는 것이 중요하다고 생각한다.
상기 일반식[I]로 표시되는 폴리펩티드의 유도체로서는, 그의 폴리펩티드[I]의 쇄위의 측쇄관능기, N말단의 아미노기 또는 C말단의 카르복시기를 이용하여 형성되는 유도체, 예컨대 카르복시기와 지방족 알코올과의 에스테르류, 제 1급 또는 제 2급 아민과 산 또는 그의 유도체와의 산아미드류, 또는 히드록시기의 O-아실 유도체를 들수있다.
상기 폴리펩티드[I]의 염으로서는, 그의 폴리펩티드[I]의 카르복시기 또는 아미노기 등과로 형성되는 염, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 알기닌, 카페인, 프로카인, 염산, 글루콘산 등과의 염을 들수있다.
또한 상기의 폴리펩티드[I]는 그의 집합체, 예컨대 3량체로서도 존재할수 있는데, 이러한 집합체도 본 발명의 폴리펩티드에 당연히 포함된다.
[II-2] 본 발명에 의한 폴리펩티드의 제법에 대해 이하에 설명하기로 한다.
본 발명에 의해서, 인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 주요부분을 갖거나 함유하는 폴리펩티드는 다음 단계들로 제조할수 있다.
A. 인간 TNF 폴리펩티드나 그의 주요부를 코우드화하는 염기배열 또는 그의 변형된 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA를 형질발현 벡터에 삽입하는 단계, B. 재조합 벡터를 숙주내에 도입하는 단계, C. 폴리펩티드를 생산하기 위해서 재조합 벡터로 형질전환시킨 숙주를 배양하는 단계, D. 배양된 세포를 수집하고 거기서 생긴 폴리펩티드를 추출하는 단계, E. 단백질에 대한 통상의 정제방법을 사용하여 폴리펩티드를 정제하는 단계, 그리고 상기 단계를 거쳐 제조된 폴리펩티드는 이것을 소망에 따라, F. 변형함에 의해서, 식[I]로 표시되는 상기 폴리펩티드이외의 다른 본 발명의 폴리펩티드 및 그의 유도체 혹은 그의 염을 제조할 수가 있다.
(1) 인간 TNF 폴리펩티드의 제조
본 발명의 DNA를 사용하여 인간 TNF 폴리펩티드를 제조하는 방법을 다음에 상세히 설명한다.
인간 TNF 폴리펩티드의 제조용 형질발현 벡터는 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 플모닝된 cDAN를 적당한 벡터내에 삽입함으로써 얻어진다. 형질전환을 위해 미생물속에 증식하는 모든 벡터를 사용할 수 있다.
예로서는 플라스미드(E.Coli 플라스미드 pBR 322등), 파지(λ파지 유도체 등), 및 바이러스(SV 40등)등이 있다. 이들은 단독으로 또는 pBR 322-SV 40 혼성 플라스미드처럼 조합하여 사용할 수 있다. DNA의 삽입지점은 적당히 선택할수 있다. 환언하면, 적당한 벡터의 적당한 지점을 상법에 의해 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 적당한 길이의 클로닝된 cDAN를 절단지점에 삽입한다.
보다 상세하게는, 비융합된 폴리펩티드 생산용 형질발현 벡터는, 개시코돈 ATG가 5′-말단에 부가되어 있고 종지코돈(TAA,TAG 또는 TGA)이 3′-말단에 존재하는, 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 염기배열 함유 DNA 단편을, 적당한 프로모터와 샤인-달가노 배열을 가진 DNA 단편에 연결하여 그것을 벡터내에 삽입함으로써 만들수 있다. 융합된 폴리펩티드 제조용 형질발현 벡터는 종말코든이 3′-말단에 부가되어 있는 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 염기배열을 가진 cDAN 단편을 번역 판독 프레임이 융합될 조직 유전자의 프레임과 일치되게 벡터내에 삽입함으로써 만들어진다.
인간 TNP 폴리펩티드를 응합된 폴리펩티드로서 제조하는 방법의 이점은 생성물의 형질전환된 숙주 세포내에서의 퇴화를 최소화할수 있는 점이다. 이 경우, 인간 TNF 폴리펩티드를 융합된 생성물에서 절단해 내어야 한다.
표 6의 상열에서 82번 위치의 Ser에서 236번 위치의 Leu까지의 아미노산 배열에 해당하는 성숙된 인간 TNF 폴리펩티드는 전혀 메티오닌을 성분으로서 갖고 있지 않다.
따라서 융합될 조직 유전자의 염기배열의 3′-말단을 메티오닌 코돈(ATG)으로 결착한 인간 TNF cDNA 단편을 삽입함으로써 제작된 형질발현 벡터를 사용함으로써, 메티오닐 펩티드 결합의 분할법 예컨대 시아노브롬법[Itakura, K.등, Science, 198, 1054(1977)]에 의해 융합 생성물로부터 용이하게 인간 TNF 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 프로모터의 예에는 lac, trp, tac, pHoS, pHoA, PL 및 SV40 초기 프로모터가 있다.
형질전환체는 미생물, 동물 또는 식물세포와 같은 숙주속에 형질발현 벡터를 도입하여 얻는다. 예컨대 E.Coli는 Cohen 등의 방법[Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69,2110(1972)]에 의해 형질 변환된다. 그런뒤 한 형질 전환체를 배양함으로써 인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 N-말단에 메티오닌이 붙은 폴리펩티드가 만들어진다. 형질발현 벡터의 구성 방법에 따라 숙주세포의 세포질내에 생성물이 축적되게 할수도 있고 또는 세포질외에 축적되게 할수도 있다. 세포질외에서 폴리펩티드가 분비되게 하기 위해, 알칼리성 인산염 유전자(pHoA), 또는 인산염 결합 단백질 유전자(pHoA)와 같은 분비성 단백질을 위한 유전자 로우딩을 사용하고, 인간 TNF 폴리펩티드를 올바른 번역 판독 프레임에 로우드하는 DNA를, 신호 펩티드를 코우드하는 DNA 영역뒤의 적당한 지점에 있는 상기 유전자에 연결함으로써, 형질발현 벡터를 구성할 수 있다.
그렇게 해서 얻어진 형질전환체는, 형질전환체에 적합한 조건하에서 원하는 폴리펩티드가 충분히 생산될 때까지 배양한다. 그런뒤, 배양물에서 폴리펩티드를 추출한다. 생성된 폴리펩티드가 세포질내에 축적되면, 숙주세포를 라이소자임 소화와 동결 및 해동 또는 초음파처리 또는 프렌치 프레스를 사용하여 파괴하고 그 다음 원심분리 또는 여과하여 추출물을 수집한다. 외질에 축적되어 있을때는 예컨대 월스키 등[Willsky, J. Bacteriol, 127, 595(1976)] 방법에 의해 추출할 수가 있다.
그렇게 얻은 비정제 폴리펩티드는 단백질에 대한 관례적 정제법, 예컨대 염석, 한외여과, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과, 전기영동, 아피니티 크로마토그래피 등의 방법을 조합하여 정제할 수 있다.
이상의 방법에 의해, 본 발명에 관한 인간 TNF 폴리펩티드 및/또는 폴리펩터드의 N-말단에 메티오닌이 있는 폴리펩티드를 제조할수 있다.
인간 TNF 폴리펩티드와 폴리펩틴드의 N-말단에 메티오닌이 있는 폴리펩티드 이외의 본 발명케 의한 폴리펩티드도 또한 대체로 상기 방법에 의해서 필요한 DNA를 사용함으로써 또는 공지 방법을 적당히 조합 사용함으로써 생산할수가 있다.
(2) 인간 TNF 폴리펩티드의 변형
변형된 인간 TNF 폴리펩티드란, 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 대립형질 돌연변이체에서 유도된 폴리펩티드(대립형질 돌연변이체 폴리펩티드), 아미노산 또는 펩티드(둘 또는 그 이상의 아미노산으로 구성 되어 있는)를 인간 TNF 폴리펩티드나 대립형질 돌연변이체 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부가하여 얻는 폴리펩티드, 인간 TNF 폴리펩티드 또는 대립형질 돌연변이체 폴리펩티드로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산을 삭제함으로써 생기는 (예컨대, 다음의 [III-1]-(6)에 표시된 바와같이 인간 TNF 폴리펩티드의 N-말단에서 4개의 아미노산을 삭제) 폴리펩티드, 분자내 관능기, N-말단의 아미노잔기 또는 C-말단의 카르복시 잔기를 사용함으로써 형성되는, 에스테르, 아실 유도체 또는 산 아미드와 같은 유도체, 및 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 아르기닌, 카페인, 프로케인, 염산, 글루콘산 등으로 아미노 잔기나 카르복시 잔기를 사용함으로써 형성되는 그의 염을 의미한다.
인간 TNF 폴리펩티드 또는 그의 대립형질 돌연변이체 폴리펩티드의 수식은 예컨대, 문헌[“Chemical Modification of Proteins, by Means, G.E.and Feeney, R.E., Holder-Day, Inc.California (1971)”] 에 개시된 그 자체 공지의 방법에 의해 행해져서 상술한 수식된 인간 TNF 폴리펩티드가 얻어진다.
[III] 본 발명의 방법에 의해 제조된 대표적 폴리펩티드의 화학 및 물리화학적 성질, 생물학적 활성 및 면역학적 성질을 다음에 상세히 설명한다.
실시예 4에서 얻어진 정제된 인간 TNF 폴리펩티드(재결합 인간 TNF, 약해서는 rHu-TNF로 지칭될 것임)를 사용하여 다음과 같이 분석해 보았다.
[III-1] 화학 및 물리화학적 성질
(1) 분자량
rHu-TNF의 분자량을, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해, 8M 요소와 용제로서의 0.5% 2-메르캅토 에탄올과 함께 또한 없이 0.2M 인산염 완충액(pH7)을 사용하여,TSK-gel G3000 SW 컬럼(7.5×600mm 도오요오 소다)으로 겔여과 분석법에 의해 측정했다. 분자량 지시 단백질로서는 다음 단백질들을 사용했다.
소혈청 알부민(MW : 6.6×104), 토끼 트리오스포스페이트 아이소머라제(MW : 5.3×104), 난 알부민(MW : 4.5×104), 돼지 펩신(MW : 3.27×104), 콩 트립신 억제제(MW : 2.05×104), 말 미요글로빈 (MW : 1.78×104),. 말 시토크롬 c(MW : 1.24×104).
그 결과 rHu-TNF의 분자량은 요소와 2-메르캅토에탄올의 존재하 및 부재하에서 각각 45,000±5,000달톤 및 18,000±3,000달톤 이었다. .
형질발현 플라스미드 pHTR 91속에 삽입된 TNF cDAN는 155개의 아미노산 잔기(개시코든 ATG에서 유도된 메티오닌은 제외하고)를 코우드했다. 추정된 아미노산 배열로부터 계산된 rHu-TNF의 이론분자량은 17,097달톤이었다. 계산분자량은 요소와 2-메르캅토 에탄올의 존재하에서는 측정된 값과 일치했다.
이 발견이 가리키는 것은 요소와 2-메르캅토 에탄올의 존재하에서는 rHu-TNF는 단량체(섬유니트)로서 존재하나 변성제의 부재하에서는 회합체, 예컨대 삼량체로서 존재한다.
(2) 등전점
pHarmalyte(pHarmacia)로 pH 구배가 pH 4.0 내지 pH 6.5에 들도록 만들어 5% 폴리아크릴아미드의 납작한 겔을 사용하여 등전초점 겔 전기영동에 의해서 3watt로 3시간동안에 등전점을 구했다.
단백질은 쿠우마시 브릴리안트 블루(Coomassie brilliant blue)로 착색시켰다. 별도로, 겔을 3mm 폭으로 얇게 베어서 20mM 트리스-HCl(pH7.8) 완충액에 침지시켜 단백질을 용출했다. 착색에 의해 검출된 단백질의 위치에 해당하는 위치에서 베어진 겔에서 나온 용출액 속에서는 세포독소 활성이 분명히 검출되었다.
rHu-TNF의 등전점은 5.9±0.3으로 관찰되었다.
(3) 아미노산 조성
rHu-TNF의 아미노산 조성은, 시료를 염산으로 가수분해한뒤 오르트프탈알데히드를 사용하는 형광법에 의해 마이크로 아미노산 분석기(시맛즈 세이사꾸쇼)로 구했다.
rHu-TNF 50#9을 110′c에서 6N HCI중에서 가수분해 시켰다. 아미노산들의 함량은 각 시료를 24,48 및 72시간동안 가수분해하여 구한 값을 기준하여 보정함으로써 산출했다. 시스틴(또는 시스테인)은 페르폼산 산화하여 얻어지는 시스테인산으로서 정량하였다. 트립토판은 Pajot의 형광법[Eur.J.Biochem., 63, 263(1976)]에 의해 구하였다. 결과는 표 5에 수록되어 있다. 아미노산 조성은 인간 TNF 폴리펩티드를 코우드하는 염기배열에서 추정된 것과 잘 일치했다.
(4) N-말단 아미노산 배열의 결정
rHu-TNF의 N-말단 아미노산 배열을 에드만 감성법[Edman degradation method : Arch.Biochem. BiopHys., 22, 475(1949)]에 의해 구했다.
에드만 감성법에 의해 N-말단 아미노산에서 유도된 페닐티오히단토인-아미노산을 TSK-gel ODS-120A(도오요오 소다)의 4.6×250mm 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 확인했다. 이 과정을 연속 반복하여 연속적으로 새로이 생성된 N-말단 아미노산을 구하였다.
rHu-TNF의 N-말단 아미노산 때열은 결론적으로 다음과 같음을 발견했다.
NH2-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-…
재결합 DNA 기술의 적용에 의해 미생물내에 생성되는 일부 폴리펩티드는 그의 N-말단에 개시코든(ATG)에서 유도된 메티오닌을 갖고 있음은 알려져 있다. 그러나 실시예 5에서 얻어진 rHu-TNF의 경우에는 메티오닌 잔기가 N-말단에서 검출되지 않아 완전 제거될수 없었다.
(5) C-말단 산 배열의 결정
rHu-TNF의 C-말단 아미노산 배열을 카르복시펩티다제를 사용하여 효소적 방법으로 구하였다.
rHu-TNF를 카르복시펩티다제 A와 카르복시펩티다제-Y를 효소대 기질의 몰비 1:25와 1:1,000로 각각 사용하여 소화하였다. 이중소화에 의해 rHy-TNF의 C-말단에서 방출된 유리 아미노산은 소화후 2분 내지 180분의 적당한 간격으로 마이크로 아미노산 분석기 (시맛즈 세이사꾸쇼)로 확인했다.
rHu-TNF의 C-말단 아미노산 배열은 다음과 같음을 결론적으로 발견하였다.
…Tyr-pHe-Gly-Ile-Ala-Leu-COOH
(6) rHu-TNF의 트립신 소화
500개의 rHu-TNF 미생물을 5mM 트리스-HCl(pH 7.8) 완충액에 든 TPCK로 처리된 트립신(타입 XIII, Sigma Chemical Co.)20μg으로 실온에서 5시간동안 소화했다. 소화된 생성물은 실시예 4-(2)에 나타난 바와같은 예비적인 등전집중 겔 전기영동에 공여되었다. 단백질은 쿠우마시브릴리안트 블루로 염색했다.
별도로, 겔을 폭 3mm가 되게 얇게 베고 베어진 겔을 단백질을 용출하기 위해 20mM 트리스-HCl(pH 7.8) 완충액내에 침지했다.
그 결과, rHu-TNF의 등전점보다 약 0.3 낮은 pH 영역에 해당하는 접합된 겔에서 용출된 소화생성물은 세포독소 활성을 갖고 있었다.
세포독소 활성을 가진 소화생성물을 (5)와 (6)에서 각각 기재한 방법에 의해 N-말단 및 C-말단 아미노산 배열의 결정에 공여했다.
그 결과 소화생성물의 부분 아미노산 배열은 다음과 같았다.
N-말단 : NH2-Thr-Pro-Ser-Asp-…
C-말단 ; ………Ile-Ala-Leu-COOH
아미노산 배열로부터 판단해 보면, 소화된 생성물은 rHu-TNF로부터 네 N-말단 아미노산(Ser-Ser-Ser-Arg)이 짤라져 나간 폴리펩티드이고, 상술한 바와같은 세포독소 활성을 갖고 있다. 그것이 의미하는 바는 rHu-TNF의 N-말단에 있는 적어도 네 아미노산은 생물학적 활성에 필수적이지 않다는 말이다.
[III-2] 생물학적 활성
(1) 생쥐 L-M세포에 대한 세포독소 활성
생쥐 L-M세포(ATCC,CCL 1.2)에 대한 세포독소 활성의 측정방법은 다음과 같다.
하기 배지로서 차례로 희석된 시료(0.1ml)와 0.1ml의 생쥐 L-M 세포 현탁액(1×105세포/ml)을 96휄(well) 멀티웰 플레이트(Flow Labs.)의 각 웰에 가하였다. 1% 우태아 혈청을 함유하는 Eagle의 최소 필수배지[예컨대 J.Paule “Cell and Tissue Culture”, E. S. Livingstone Ltd.(1970)을 참조하라.]을 사용했다. 플레이트를 5% 탄산가스를 함유하는 완전가습 대기중에서 37℃에서 48시간동안 배양했다. 배양후 25% 글라타르알데히드 20μl를 가하여 생존 세포를 고정했다. 고정후 플레이트를 세척, 건조했다. 그 뒤 0.05% 메틸렌 블루 용액 0.1ml를 가하여 고정된 세포를 염색했다. 과잉의 메틸렌 블루를 씻어내고 플레이트를 건조했다. 메틸렌 블루로 착색된 고정세포를 0.36N HCl 200μl로 용출하고 665nm에서의 그의 흡수를 타이터텍 멀티스캔(Flow Labs.)로 측정했다. 흡수는 생존세포수에 비례한다. L-M 세포의 50%를 죽이는데 필요한 생물학적 활성의 농도를 1단위/ml로 정의했다. 상기한 조건에서 구한 생쥐 L-M 세포에 대한 세포독소 활성을 목표세포인 생쥐 L-929 세포에 대한 세포독소 활성과 비교하기 위해서 “단위(LM)”으로 표시했다.
단백질 함량은 Lowry, O.H.등의 방법[J.Biol.Chem., 193,265(1951)]으로 구하였다.
그 결과 rHu-TNF는 단백질 mg당 2×106단위 (LM)이상의 비활성을 가짐을 알았다.
(2) 생쥐속에 이식된 Meth A 육종에 대한 항종양 효과
다음 방법으로 Meth A 육종에 대한 항종양 효과를 평가했다.
체중 약 23g의 BALB/c 생쥐의 복부 피부내에 피내적으로 2×105개의 Meth A 육종세포를 이식하고 7일후 종양직경이 6∼7mm 되는 생쥐를 선택했다. 종양이식후 7일째에 rHu-TNF를 종양덩이내에 또는 정맥내적으로 투여했다.
rHu-TNF제제의 내독소는 그의 세포독소 활성 1×104단위(LM)당 0.01ng 이하였다.
그 결과 종양 자체내에 투여한 경우에는, 생쥐당 1×103,3×103및 1×104단위(LM)의 용량으로 rHu-TNF가 주사된 모든 생쥐에게서 주사후 24시간이내에 종양 이식조직에 괴사반응이 관찰되었고, 종양은 위의 각 용량의 경우 각각 3/5,5/5 및 5/5의 비율로 완전히 퇴행되었다. 정맥내 투여의 경우에는, 생쥐당 3×103및 1×104단위(LM)의 용량으로 rHu-TNF가 주사된 모든 생쥐에게서 괴사반응이 관찰되었고 완전 퇴행율은 각 3/5과 4/5였다.
(3) 생체내에서의 인간 종양세포의 성장에 대한 rHu-TNF의 억제효과
다음 조건하에서 인간 종양세포와 정상세포의 상장에 대한 rHu-TNF의 억제효과를 평가해 보았다. 24웰 멀티웰 플레이트를 사용하여 10% 우태아 혈청을 함유하는 이글의 최소 필수배지 1ml속에 웰당 1×104개의 세포의 율로 인간 종양세포 또는 정상세포를 파종하였다. rHu-TNF를 100단위(LM)/ml의 최종농도로 가하고 5% 탄산가스를 함유하는 완전가습 대기중에서 4일간 37℃c에서 배양했다. 배양종료 4시간전에 각 웰에3H-티미딘 1마이크로 큐리를 가했다. 배양후 인산염 완충 생리적 식염수로 세포를 세척하고 0.5% 도데실 황산나트륨으로 용해시켰다. 세포내에 결합된3H-티미딘의 양은 용해액내의 방사능을 계수하여 구하였다.
억제효과는 다음 식으로 계산한 성장억제율에 표시했다.
성장억제율(%)=(a-b)/a×100
상기 식에서 a와 b는 각각 rHu-TNF의 부재하 및 rHu-TNF의 존재하에 세포중에 결합된 방사능이다.
표 6에 종합된 결과는 rHu-TNF는 인간 종양세포의 성장을 유의하게 억제하며 그러나 정상세포에는 영향을 주지않음을 보여준다. 이 발견은 rHu-TNF가 종양세포를 선택적으로 공격하는 것을 보여준다.
[III-3] 면역학적 성질
rHu-TNF용액 [100단위(LM)/ml]을, 참고실시예 4에서 얻은 정제된 항 토끼 플라스마 TNF항체의 100배 희석액 동용적과 혼합했다.
37℃에서 2시간 배양한 뒤, L-M세포를 목표세포로 사용하여 반응혼합물의 세포독소 활성을 상기 방법으로 측정 하였다.
그 결과 rHu-TNF의 세포독소 활성은 항체에 의해 전혀 중화되지 않는 것을 알았다. 그 때문에 인간 TNF폴리펩티드는 면역학적으로 토끼 TNF와 구별될 수 있는 것임을 발견했다.
[Ⅳ] 본 발명 폴리펩티드의 제형은 용액의 형태이건 냉동건조된 제품의 형태건 상관없다. 장기 안정성의 관점에서 냉동건조품의 형태가 바람직하다 하겠다. 증량제나 안정제를 제제에 첨가하는 것이 좋을 것이다.
안정제의 예에는 알부민, 글로불린, 겔라틴, 프로타민, 프로타민 염, 글루코오스, 갈락토오스, 크실로오스, 만니톨, 글루쿠론 산, 트레할로오스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 및 비이온성 계면활성제 (예컨대 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화카스토오일, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 프로필렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시 프로필렌 블록 공중합체, 솔비탄 지방산 에스테르, 수크로스 지방산 에스테르 및 글리세린 지방산 에스테르)가 있다.
[V] 본 발명의 폴리펩티드는 종양세포에 대해 선택적 세포독소 활성을 갖고 있어 종양을 가진 동물의 종양을 퇴행시킬 수 있기 때문에 항종양제로서 유용하다.
이 폴리펩티드 제제는 비경구적 또는 국소적으로 투여하는 것이 바람직하다.
정맥내 및 근육내 경로와 같은 비경구적 경로는 종양이 광범위하게 퍼져 있거나 전이했거나 또는 전이를 방지하려고 할때에 사용된다.
국부적 종양조직에 대해서는 종양내 직접투여가 효과적이다. 용량은 종양의 종류와 크기, 환자의 상태 및 투여경로에 따라 차이가 있다. 통상 kg당 1×102내지 1×107단위(LM)이고, 바람직하게는 1×103내지 1×106단위 (LM) 이다.
[VI] 다음의 실시예와 참고실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시한다. 그러나 본 발명이 이 실시예에만 한정되는 것이 아님을 이해해야 할 것이다.
다음의 실시예를 보다 잘 이해할 수 있도록 하기 위해서 본 명세서에 제1도 내지 제5도가 첨부되어 있다.
[실시예 1]
(1) 인간 폐포 마크로과지로부터 TNF mRNA의 제조 사람의 폐포 마크로파지는 인산염 완충염수로 기관지-폐포를 세척하여 수집하였다.
폐포 마크로파지 세포 6.3×107개 세포를 10%의 우태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640배지에 현탁시켜서, 딧쉬당 9×106세포의 세포밀도로 페트리-딧쉬(직경 8cm)에 파종하였다. 이들을 5%의 탄산가스를 함유하는 충분한 가습분위기중에서 37℃로 전-배양하였다.
1시간 배양한 후 엔도톡신(E.콜리로부터 유도된 리포폴리샤카라이드)과 TPA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트) 및 시클로헥사미드(단백 합성 조해제)를 딧쉬에 가하여 그의 최종농도가 각각 10 microgram/ml, 10ng/ml 및 1microgram/ml가 되게 하였다. 4 내지 4.5시간(총 5 내지 5.5시간) 더 배양을 계속하였다.
배지를 흡인 제거하고, 딧쉬에 남아있는 마크로파지를 0.6%나트륨 N-라우로일 사르코시네이트와 6mM 시트르산 나트륨을 함유하는 5M 구아니딜 티오시아네이트 용액에 용해, 균질화시켰다.
균질물을 0.1M EDTA를 함유하는 5.7M 염화세슘용액에 넣고, 초원심분리기(RPS 27-2로우터, Hitachi Koki)를 사용하여 26,500rpm에서 20시간동안 원심분리하여 총 RNA분획을 입자로서 얻었다. 이 입자를 0.35N NaCl, 20mM 트리스 및 20mM EDTA를 함유하는 소량의 7M요소용액에 용해시키고 에탄올로부터의 침전에 의하여 회수하였다. 159microgram의 총 RNA가 얻어졌다.
총분획을, 1mM EDTA를 함유하는 10mM의 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액(TE용액으로 표시한다)에 용해시키고, 이 용액을 65℃에서 5분간 가열하였다. NaCl용액을 0.5M의 농도로 가하고, 이 용액을 0.5M MaCl을 함유하는 TE용액으로 미리 평형시킨 올리고(dT)셀루로오스 컬럼에 가하였다. 이 컬럼을 TE용액으로 용출하여 8microgram의 폴리(A) mRNA를 얻었다.
폴리 (A)mRNA를 증류수에 1.9ng/nl의 농도로 용해시키고, 이것을 마이크로 인젝션법에 의하여 난모세포당 약 50nl의 용량으로 제노퍼스 래비스의 난모세포에 주사하였다. 10개의 난모세포를 바르트 배지(Barth medium, J.B.Gurdon, J.Embroyol.Exp MorpHol., 20, 401,1968) 100micro-ℓ에서 220℃로 24시간동안 배양하였다. 난모세포를 균질화하고, 원신분리 (10,000rpm, 10분간)하였다. 상징액은 생쥐 L-929세포에 대한 세포동성 활성을 측정함으로써 TNF확성분석을 행하였다. L-929세포에 대한 세포독성 활성 측정법은 다음과 같았다.
배지와, 악티노마이신 D를 함유하는(2microgram/ml) L-929세포(5×105세포/ml)의 현탁액 0.1ml로 연속 희석시킨 시료(0.1ml)를 96웰 멀티-웰 플레이트(Flow Labs.)를 사용하여 각개 웰에 가하였다. 1%의 우태아 혈청을 함유하는 이글 사의 최소 필수배지를 사용하였다. 이 플레이트를 5% 탄산가스를 함유하는 충분한 가습분위기중에서 18시간동안 38.5℃로 배양하였다.
생육성 L-929 세포수를 측정하여 생물활성을 평가하는 과정은, 상기한 바와 같이 표적세포로서 생쥐 L-M세포를 사용하여 세포독성 활성분석 과정과 동일하였다.
상기 조건으로 측정된 L-929세포에 대한 세포독소환성은 생쥐 L-M세포에 대한 세포독소 활성과 구별하기 위하여 “단위 (L-929)”로 표시하였다.
상기와 같이 제조된 상징액은 6.6단위(L-929)/ml의 세포독소 활성을 가졌으며, 이것은 폴리(A)mRNA제제가 TNF mRNA를 함유한다는 것을 나타낸다.
(2) cDAN의 합성
상보적 DNA는 상기(1)에서 얻어진 폴리(A) mRNA를 주형으로서 사용하여 구블러씨등의 방법(Gubler,Gene,25,263,1983)에 따라 합성하였다. .
10mM MgCl2와, 10mM 디티오트레이톨과, 4mM의 나트륨 파이로포스페이트와, 각각 1.25mM의 3종의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 즉 dGTP,dATP 및 dTTP와 0.5mM의 dCTP와, 167nM의 알파-32P-dCTP(비방사능 3,000Ci/m mole)와, 4microgram의 올리고(dT) 12-18 및 조류의 골수아구종 중 바이러스로부터 유도된 역전사효소 120단위를 함유하는 50mM의 트리스-HCl(pH 8.3) 완충액 40m1에 용해시켜서 43℃로 30분간 배양하였다.
다음에 EDTA를 가하여 반응을 정지시켰다. 생성되는 cDAN-mRNA 하이브리드를 제놀/클로로포름(1:1)으로 추출하고 에탄올로부터 침전시킴에 의하여 아세트산 암모늄을 2.5M 농도까지 가하여 수성 상으로부터 회수하였다.
cDAN-mRNA 하이브리드 침전을, 5mM MgCl2, 10mM(NH4)2SO4, 100mM KCl, 0.15mM 베타-니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드, 5microgram의 우태아 혈청 알부민, 각각 0.4mM씩의 4종의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 즉 dGTP,dATP,dTTP 및 dCTP와, 0.9유니트의 E. 콜리 리보뉴플레아제 H와, 23단위의 E.콜리 DNA폴리머라제 I을 함유하는 100m1의 20mM 트리스-HCl(pH7.5) 완충액에 용해시키고, 12℃에서 60분간 배양하고, 22℃에서 60분간 더 배양하여 dscDAN를 합성하였다. EDTA를 가하여 반응을 정지시켰다.
dscDNA를 페놀/플로로포름으로 추출하고 상기와 같이 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다.
(3) 올리고(dC)-테일부가 cDAN의 제조
상기와 같이 얻어진 dscDAN를 2mM CoCl2, 0.2mM 디티오 트레이톨, 0.1mM 알파-32P-dCTP(비방사능, 3Ci/m mole) 및 10단위의 말단 디옥시 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 함유하는 100mM 나트륨 카코딜레이트(pH 7.2) 100micro-ℓ에 응해시키고, 37℃에서 30분간 배양하여 dscDAN의 3′-말단에 올리고(dC) 테일이 부가되게 하였다.
이 반응은 EDTA를 가하여 정지시켰다. 올리고(dC)-테일부가 dscDNA는 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다. 올리고(dC)-테일부가 dscDAN는 1mM EDTA와 100mM NaCl을 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액에 용해시켜서, 이것이 ml당 2microgram의 올리고(dC)-테일부가 dscDAN를 함유하도록 하였다.
(4) 올리고(dG)-테일부가 PBR322 DNA의 제조
10microgram의 PBR 322 DNA를, 10mM MgCl2,와 50mM(NH4)2SO4및 10microgram의 우태아 혈청 알부민을 함유하는 100micro-ℓ의 20mM 트리스-HCL(pH7.4)에 용해시키고, 15단위의 제한 엔도뉴클레아제 Pst I을 가하였다.
이 혼합물을 37℃에서 1시간 배양하였다. 반응이 종단된 후 반응혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 생성되는 DNA는 에탄올로부터 침전시켜 수상(水相)으로부터 회수하였다. 얻어진 DNA는 상기의 dscDAN의 테일부가에서 사용된 것과 동일한 반응완충액(단 이것은 80단위의 말단 데옥시뉴를레오티딜 트랜스퍼라제와 3H-dGTP를 32p-dCTP대신에 함유하였다) 200micro- ℓ에 용해시키고 37℃에서 20분간 배양하여 3′-말단에 약 10-15dG잔기를 부가하였다.
반응혼합물은 페놀/클로로포름으로 추출하고 올리고(dG)-테일부가 pBR322 DNA는 에탄올 침전에 의하여 수상으로부터 회수하였다. 생성되는 테일부가 PBR 322 DNA를 올리고(dC)-테일부가 dscDAN 용해에 사용된 것과 동일한 완충액에 용해시켜서 이것이 ml당 20microgram의 농도로 테일부가 pBR322 DNA를 함유하게 하였다.
(5) 재결합 플라스미드의 구성
120micro-ℓ의 올리고(dC)-테일부가 cDAN용액을 동일용량의 올리고(dG)-테일부가 PBR322 DNA용액과 혼합시키고, 이 혼합물을 65℃에서 5분간, 57℃에서 120분간 연속적으로 배양시켜 숙성될 수 있게 하여 재조합 플라스미드 용액을 구성하였다.
(6) 형질전환체의 선택
상기와 같이 얻어진 재결합 플라스미드에 의하여 E.coli x 1776균주를 변환시켰다.
특히 E.coli x 11776은 600nm에서의 혼탁도가 0.5에 이를때까지 100microgram/ml의 디아미노-피멜산과 40microgram/ml의 티미딘을 보충한 L-브로스(조성 : 1ℓ당 10g의 트립톤, 5g의 효모 추출물, 5g의 NaCl 및 1g의 글루코오스 ; pH 7.2) 20m1내에서 37℃로 배양시켰다.
세포를 4℃에서 원심분리로 수집하고, 50mM CaCl2를 함유하는 10m1의 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)완충액으로 세척하였다. 이 세포를 상기와 같이 사용된 동일 완충액 2ml에 재현탁시키고, 0℃에서 5분간 방치하였다. 이 현탁액 0.2ml에 상기와 같이 얻어진 재조합 플라스미드 용액 0.1ml를 가하였다.
이 혼합물을 0℃에서 15분간 방치한 다음 42℃에서 2분간 유지시켰다. 다음에 위에서 사용된 것과 같은 보충된 L-브로스 0.5ml를 가하고, 1시간동안 진탕하면서 배양을 수행하였다. 배양물 일정량을 취하여 15μg/ml의 테트라싸이클린을 함유하는 보충된 L-브로스 한천판상에 펼쳐 놓고 37℃c에서 약 12시간동안 배양하였다.
테트라싸이클린에 내성에 있는 형질전환체를 선택함으로써 cDAN라이브러리를 제조하였다.
(7) 인간 TNF cDAN의 클로닝
토끼 TNF를 코우드하는 클론화된 cDAN로부터 제조된 DNA단편을 사용하여 콜로니 혼성화분석에 의함으로써, 인간 TNF를 코우드하는 cDAN를 함유한 재조합 플라스미드 잠복 형질 전환체를 상기 (6)에서 얻은 cDAN라이브러리로부터 선택하였다.
특히 토끼 TNF를 코우드하는 클론화된 cDAN를 참고실시예1에 나타낸 것과 같은 재조합 플라스미드 pRTNF802로부터 분리시켰다. 그의 염기배열은 표 1에 나타낸 것과 같다. 클론화된 cDAN는 제한 엔도뉴클레아제 Ava I 또는 HaeII로 소화시켰다. 소화된 DNA단편을 에탄올로부터의 침전에 의하여 회수하였다. 이들을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜서 원하는 DNA단편을 분리하였다.
제한 엔도뉴클레아제 AvaI(AvaI 단편으로 표시하기로 한다)로 소화시킴에 의하여 표 1에 나타낸 바와같은 285번째 내지 583번째 염기에 상응하는 DNA단편(299bp)을 얻었다.
표 1에 나타낸 33′번째 내지 120번째 염기에 상응하는 다른 DNA단편(88bp)은 제한 엔도뉴클레아제 HaeII(HaeII단편으로 표시하기로 한다)로 소화시킴으로써 얻었다. Ava I 단편과 HaeII단편은 32p로 표지하였다.
이와 같은 표지의 DNA단편은 cDAN 라이브러리를 스크리닝하는 프로우브로서 사용하여 하나한씨등의 방법(Hanahan,Gene,10,63,1980)에 따르는 콜로니 하이브리다이제이션에 의하여, 인간 TNF를 코운드하는 cDAN를 함유하는 플라스미드를 갖는 형질전환주를 선택하였다. 프로우브로서 32P-표지의 Ava I 단편을 사용하는 첫번째 스크리닝에 의하여 약 20,000클론으로부터 43클론을 선택하였다.
이들 분석에 의하여 종국적으로 토끼 TNF cDAN단편 양자와 강하게 하이브리다이즈된 cDAN를 갖는 재조합 플라스미드 잠복 6클론을 선택하였다.
(8) 형질발현
월키씨등의 방법(Wilkie,Nucleic Acid Res., 7,859, 1979)에 의하여 (7)에서 선택된 6개의 형질전환주로 부터 재조합 플라스미드를 분리시켜 ; 각각 플라스미드 No.pHTNF1, pHTNF4, pHTNF5, ppHTNF13, pHTNF22 및 pHTNF26으로 명명하였다. 각개의 재조합 플라스미드를 상기 (6)에 기재한 동일한 방법에 따라 E.coli HB101에 도입시켜서 각각의 재결합 플라스미드를 잠복시키고 있는 헝질전환체를 제조하였다.
형질전환체는 약간 수정한 나가타씨등의 방법(Nagata,Nature,284,316,1980)에 의하여 50ml의 LB-브로스(조성, 1ℓ당 10g의 트립톤,. 5g의 효모 추출물 및 10g의 NaCl : pH7.5)에서 배양시켰다. 600nm에서의 배양물 혼탁도가 약 0.8에 이를때까지 배양을 계속하고, 그 다음 약 3 내지 5×1010세포의 세포를 수집하였다.
이 세포를 0.1%리소자임과 30mM NaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 1ml에 재현탁시켰다.
빙수에 30분간 방치한 다음 냉동-해동을 6회 반복함으로써 이 세포를 용해시켰다. 세포 파편을 원심분리로 제거하여 맑은 용해질을 얻었다. 각개의 형질전환체로부터 얻은 용해질은 L-929 세포에 대한 세포독소 활성분석을 행하였다.
결과적으로, 플라스미드 pHTNF13을 잠복시키고 있는 형질전환주로부터 얻은 용해질이 186.1단위 (L-929)/ml의 세포독소 활성을 갖는 것으로 나타났다.
(9) 클론화된 cDAN의 염기배열 결정
재조합 플라스미드 pHTNF13을 상기와 같이 분리하였다.
플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 절단하여 벡터에 삽입된 클론화된 cDAN를 분리시켰다. 클론화된 cDAN 단편은 여러가지 제한 엔도뉴클레아제로 더 절단시키고, 생성되는 16개 단편의 염기배열은 맥샘-길버어트법에 의하여 결정하였다.
제1도는 단편 제조에 사용된 제한 엔도뉴클레아제 절단부위와, 화살표로 표시한 배열의 방향과 정도를 나타내고 있다. 점이 달린 4각형 영역은 인간 TNF에 대한 코우드 영역이다. 표 2는 결정된 염기배열과 염기배열로부터 추정된 아미노산 배열을 나타내는 것이다.
인간 TNF를 코우드하는 영역은 토끼 TNF를 코우드하는 염기배열에 상동하는 염기에 대하여 결정하였다.
인간 TNF를 코우드하는 DNA는 233아미노산 잔유물로 구성되는 그의 전구체 폴리펩티드를 코우드한다.
성숙된 인간 TNF는 카르복시-말단에서 그의 전구체의 155아미노산 잔유물에 상응하는 폴리펩티드이며 이것은 표 2에서 235번째 내지 699번개 염기 (표 2에도 괄호친 부분)의 염기배열에 코우드된다.
인간 TNF를 코우드하는 최종코든이 뒤따르는 종지 코든은 유백색의 코든 TGA이다.
(10) 항-토끼 플라스마 TNF항체와 함께 플라스미드 pHTNF13을 잠복시키는 형질전환체로부터 얻은 용해질에서 인간 TNF의 면역 차단-반응성은 다음과 같이 시험하였다.
용해질을 참고실시예 4에서 얻은 정제된 항-토끼 플라스마 TNF항체의 100-배 희석액 동일용량과 혼합하였다. 37℃에서 2시간동안 배양후, L-929세포를 표적 세포로서 사용하는 상기한 방법에 의하여 반응혼합물의 세포독소 활성을 측정하였다.
참고실시예 2에서 얻은 토끼 플라스마 TNF를 미리 인산염으로 완충된 염수에 희석시키고, 이 희석액을 대조표준 TNF제제로서 사용하였다.
다음에 나타낸 결과와 같이, 인간 TNF의 세포독소 활성은 항체에 의하여 중화되지 않았다.
Figure kpo00012
[실시예 2]
에스캐리사아콜리내에서 인간 TNF 폴리펩티드의 제조
(1) tac 프로모터의 조절하에서의 형질발현
클론화된 cDAN는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 재조합플라스미드 pHTNF13으로부터 분리시켰다.
cDNA는 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI에 의하여 더 소화시켜 TNF코우드화 영역의 비-코우드화 하류영역 일부를 분열시켰다.
생성되는 DNA 단편(약 1.1kbp)은 제한 엔도뉴를레아제 Pst I과 Eco RI로 소화시킴으로써 플라스미드 pBR322로부터 제조된 보다 큰 DNA 단편에 삽입시켜서 TNF cDAN와 테트라싸이클린 내성 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 구성(構成)하고, 이것을 pHT113으로 명명하였다.
성숙된 인간 TNF를 코우드하는 cDAN를 보유하는 형질발현 플라스미드 pHTT26은 제2도에 나타낸 과정으로 구성 하였다.
그 과정은 다음과 같다. ppHT113으로부터 분리된 클론화된 cDAN를 제한 엔도뉴클레아제 Ava I과 Hind III로 소화시키고, 성숙된 인간 TNF에 대한 코우드화 영역 (HTNF단편으로 표시하기로 한다)의 대부분을 포함하는 생성 DNA단편(578bp)을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리시켰다.
한편, tac 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 다음과 같이 분리시켰다; pDR 540(Pharmacia P-L Biochemicals ; Russell, D.R.,et al., Gene,20,231,1982)의 플라스미드 DNA(300microgram)를, 50mM NaCl, 6mM MgCl2및 6mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 10mM 트리스-HCL(pH 7.5) 완충액 2ml에 용해시키고, 37℃로 60분간 배양함으로써 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI과 BamHI로 절단하였다.
NaC을 가하여 최종농도가 0.3M되게 한후, 소화된 DNA단편을 에탄올로부터 회수하였다. tac 프로모터 를 함유하는 DNA단편을 8.3microgram의 수율로 폴리아미드 겔 전기영동에 의하여 분리시켰다. tac프로모터 단편은 다음 일반식으로 표시되는 화학 합성된 올리고 데옥시리보뉴를레오티드 어댑터와 연결시켰다;
Figure kpo00013
이것은 개시코든 ATG, 성숙된 TNF로우드화 영역의 5′-말단부분에 상응하는 염기배열을 포함하며, BamHI와 Ava I의 연관 말단을 갖는다. 생성되는 DNA단편을 tac 프로모터-어댑터 단편이라고 명명한다.
별도로, 암피실린-내성 유전자(pBR322-Ampr 단편으로 표시하기로 한다)를 포함하는 보다 적은 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Hind III과 EcoRI에 의하여 플라스미드 pBR322로부터 절단하고, 저융점 아가로스(0.7%)를 사용하여 겔 전기영동으로 분리시켰다.
1microgram의 HTNF단편과 6microgram의 pBR322-Amp 단편을 6.6mM MgCl2를 함유하는 66mM 트리스-HCl(pH7.6)에 용해시키고, 55℃로 10분간 배양하였다.
다음에 ATP와 디티오트레이톨을 각각 1mM과 10mM까지 가하고, 168단위의 T4DNA리가제를 가한후 22℃에서 120분간 배양하였다. 생성되는 DNA단편은 약 4microgram의 수율로, 페놀에 의한 추출로 회수하였다.
DNA 단편(0.8microgram)의 63단위의 T4DNA 리가제를 사용하는 것을 제외한 상기와 동일조건하에서 tac-프로모터-어댑터 단편(0.3μg)과 연결시켰다. 반응혼합물을 증류수로 6배 희석하여 다음에 기술하는 것과 같이 칼슘으로 처리된 동일용적의 E. 콜리 JM103세포(pHarmacia P-L Biochemicals) 현탁액과 혼합하였다.
이 혼합물은 빙수에서 20분간, 42℃에서 1분간, 실온에서 10분간 연속하여 배양하고, LB브로스를 가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 60분간 배양하였다. 생성되는 세포 현탁액 일정량은 25μg/ml의 암피실린을 함유하는 LB한천 플레이트에 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 암피실린-내성 콜로니를 선택하였다.
인간 TNF를 제조할 수 있는 형질전환체중 하나를 JM103/pHTT26이라고 명명하였다. 칼슘-처리된 E. coli JM103세포는 다음과 같이 제조하였다. E.coli JM103세포를 5ml의 브로스에 접종시키고 37℃에서 하룻밤 배양시켰다.
생성되는 배양물 1ml를 100m1의 LB브로스에 접종시키고, 배양물의 650nm에서의 혼탁도가 0.6에 도달 할때까지 37℃에서 더 배양하였다. 빙수에 30분간 방치한 후 세포를 원심분리로 수집하여 50mM CaCl250ml에 현타시킨 다음 0℃에서 60분간 방치하였다.
세포를 원심분리로 수집하고, 또 다시 20% 글리세롤을 함유하는 50mM CaCl210m1에 현탁시켰고, 이것은 칼슘-처리 E. coli JM103세포로 사용하였다.
형질전환체 JMIG3/pHTT26을 LB-브로스에서 37℃로 하룻밤 방치하였다. 이 배양물(0.5ml)을 새로운 LB-브로스 5ml에 접종시키고, 37℃에서 1시간 더 배양시켰다.
다음에 최종농도 1mM까지 이소푸로필 베타-D-티오갈락토시드를 가하고, 배양을 4시간 더 계속하였다.
세포를 수집하고, 0.1% 리소자임과 30mM NaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 1ml에 현탁시키고 0℃에서 30분간 방치하였다.
다음에 드라이아이스/에탄올 욕에서의 냉동과 37℃에서의 해동을 6회 반복하고, 세포파편을 원심분리로 제거하여 맑은 용해질을 얻었다.
이 용해질은 9.9×104단위 (L-929)/ml의 세포독소 활성을 가졌다.
이 세포독소 활성은 참고실시예 4에 나타낸 바와 같이 토끼 플라스마 TNF에 대한 항체로 중화되지 않았다.
인간 TNF는 토끼 플라스마 TNF와 면역학적으로 교차하지 않음이 확인되었다.
(2) trp 프로모터 조절하의 형질발현
제3도에 나타낸 바와 같을 과정에 의하여 형질발현 플라스미드 pHTR91을 구축하였다.
그 과정은 다음과 같다.
재조합 플라스미드 pHT113으로부터 나온 클론화된 cDAN를 제한 엔도뉴클레아제Ava I와 Sal I으로 소화시켜 3개 단편(크기가 약 0.8kbp, 1.3kbp 및 2.6kbp)으로 절단하였다.
성숙된 인간 TNF에 대한 대부분의 코드화 영역과 테트라싸이클린-내성 유전자 일부를 포함하는 1.3kbp-DNA단편을 분리하였다(Ava I -Sal I단편으로 표시하기로 한다) .
Aval -Sal I단편을 다음의 화학 합성된 올리고데옥시 뉴클레오티드 어댑터와 연결시켰다;
Figure kpo00014
생성되는 DNA단편을 HTNF-어댑터 단편으로 표시하였다.
별도로, 일부의 trp프로모터 영역을 포함하는 DNA단편(35bp)을 제한 엔도뉴를레아제 EcoRI과 HPa I으로 소화시킴으로써 플라스미드 pDR720(pHarmacia P-L Biochemicals ; Russell, D.R., et al., Gene, 20, 231, 1982)로부터 절단하고, DNA단편을 다음 일반식으로 표시되는 화학 합성된 어댑터와 연결시켰다:
Figure kpo00015
플라스미드 pBR322를 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI과 SalI으로 소화시키고, 보다 큰 단편(약 3.7kbp)을 분리시켰다.
이들 3종의 DNA단편, 즉 HTNF단편, trp프로모터단편 및 보다 큰 pBR322단편을 연속적으로 연결시킴으로써 형질발현 프라스미드 pHTR91을 구축하였다. 형질반현 플라스미드를 (1)에서 기술한 방법으로 E. coliHB101세포에 도입시키고, 형질전환체중 하나를 HB101/pHTR 91로 명명하였다.
형질전환체 HB101/pHTR91은 수식된 M-9배지(조성 : 1ℓ당 0.7% Na2HPO4· 12H2O, 0.3% KH2PO4, 0.05% NaCl, 0.1% NH4Cl, 2mg/ℓ의 비타민 B1, 0.45% 카사미노산 1mM MgSO4, 0.1mM CaCl2및 0.5% 글루코오스)내에서 하룻밤 배양하였다.
배양물(0.05ml)을 동일한 배지 5ml 내에 접종시키고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.
다음에 3-베타-인돌 아크릴산을 가하여 최종농도가 20μg/ml가 되게 하고, 배양을 4시간 계속하였다.
세포를 수집하여 상기(1)에 기술한 것과 동일한 과정으로 처리하여 맑은 용해질을 얻었다.
(3) pHoS프로모터조절하의 형질발현
시그널 펩티드와 인산염 결합단백의 N-말단부분과 융합된 TNF폴리펩티드를 생성할 수 있고, 숙주세포의 외질(periplasm)에 융합된 단백을 분비할 수 있는 형질발현 플라스미드 pHTS115 제4도에 설명한 과정으로 구축하였다.
상기 (2)에서 얻어진 Ava I -Bal I 단편은 다음 배열을 갖는 화학 합성된 올리고데옥시리보뉴클레오티드어댑터와 결찰시켰다 ;
Figure kpo00016
결찰된 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제 BamH I으로 소화시켜서 양단에 BamH I 코헨시브(cohensive)말단(HTNF-Tetr.BamHI 단편으로 표시하기로 한다)을 갖는 DNA단편을 제조하였다.
별도로 proS유전자를 함유하는 pSN5182(Morita,T., et al., Eur J.Biochem., 130, 427, 1983)를 제한 엔도뉴클레아제 Hpa I과 EcoRI으로 소화시켜서 pHoS 프로모터의 샤인-달가노 배열을 포함하는 DNA 단편과 시그널 펩티드와 인산염 결합단백의 N-말단부분을 코우드하는 DNA배열 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 제조하였다. 이 DNA 단편을 Hpa I - EcoRI 단편으로 표시하였다. Hpa I - EcoRI 단편은 다음 배열을 갖는 화학 합성된 올리고데옥시뉴클레오티드 링커와 연결시켰다 ;
Figure kpo00017
다음에 결찰된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 BamHI로 소화시켰다.
양단에 BamHI 점착 말단을 갖는 생성된 DNA 단편(약 3.6kbp)은 pHoS 프로모터-BamI·Tetr단편이 라고 표시 하였다.
HTNF-Tetr·BamHI 단편을 pHoS 프로모터-BamHI·Tetr단편과 연결시켜서 인산염 결합단백과 융합된 인간 TNF 생성을 위한 형질발현 플라스미드를 구성하고, 이것을 pHTS 115로 명명하였다. 형질발현 플라스미드는 상기와 같은 방법에 따라 대장균 HB 101에도 도입시켰다.
형질발현주(HB 101/pHTS 115)중의 하나는 TG-배지(조성 0.2% 글루코오스와, 80mM NaCl과, 20mM KCl과, 20mM NH4Cl과, 3mM Na2SO4와, 1mM MgCl2와, 0.2mM CaCl2와, 200mM FeCl3와, 20mg/ℓ의 류신과, 20mg/ℓ의 프롤린 및 10mg/ℓ의 비타민 B1을 함유하는 pH 7.4의 120mM 트리스-HCl 완충액)을 0.64mM KH2PO4로 보충한 것 5ml내에서 37℃로 20시간동안 흔들면서 배양하였다. 원심분리로 세포를 수집하여 0.064mM KH2PO4를 보충한 2ml의 TG-배지내에 재현탁시키고 37℃에서 6시간동안 배양시켰다. 세포를 원심분리로 수집하여 30mM NaCl을 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.2) 완충액 1ml로 세척하였다. 다음에 이들을 0.2ml의 33mM 트리스-HCl(pH 7.2)완충액에 재현탁시키고, 0.1mM EDTA와 40% 슈크로오스를 함유하는 33mM 트리스-HCl(pH 7.2) 동일용적과 혼합시켰다 37℃에서 10분간 배양한 후 세포를 수집하여 냉각된 0.5mM MgCl2, 0.4ml에 재현탁시켜서 가끔 진탕하면서 10분간 빙수에 방치하였다. 세포파편을 원심분리로 제거하여 맑은 추출물(외질 추출물로 표시하기로 한다)을 얻었다.
이 외질추출물은 1.34×105단위 (L-929)/ml의 세포독소 활성을 갖는다.
세포독소 활성을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔(12.5%) 전기영동법으로 측정하여 19,000달톤인 것으로 평가되었는바, 이것은 생성된 폴리펩티드가 융착된 단백질임을 암시하는 것이다.
(4) pHoS 프로모터 조절하의 형질발현
시그널 펩티드와 인산염 결합단백질의 N-말단부분과 융합된 인간 TNF 폴리펩티드와 일부의 전구체부분과 함께 성숙된 인간 TNF를 생성할 수 있고 융합된 단백질을 숙주세포의 외질내로 분비할 수 있는 형질 발현 플라스미드 pHTS 37은 제5도에 설명한 과정에 의하여 구성하였다.
재조합 플라스미드 DNA(pHTNF 13)을 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 소화시켜 인간 TNF cDAN를 포함하는 DNA 단편(약 1.2kbp)을 절단하였다. DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제 Bbe I으로 더 소화시켜 DNA 단편(약 0.9kbp, Bbe I-Pst I 단편으로 표시하기로 한다)을 얻었다. 6μg의 Bbe I Pst I 단편을 12mM CaCl2, 12mM MgCl2, 0.2M NaCl, 1mM EDTA 및 0.02단위의 엑소뉴클레아제 Bal 31을 함유하는80micro-ℓ의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)완충액에 용해시키고, 30℃에서 30분간 배양하여 DNA 단편의 양단으로부터 약 50 내지 150염기대를 부수어내었다. 다음에 이 단편의 말단은 4종의 데옥시리보뉴클레오티드 즉, dGTP, dATP, dCTP 및 dTTP 각각 0.1mM와 50microgram/m의 우태아 혈청 알부민과 함께 E. coli DNA 폴리머라제 I(대 단편 : 10단위로 37℃에서 60분간 배양시킴으로써 교정하였다. 교정된 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 소화시키고 비활성 단부와 EcoRI 점착 단부를 갖는 생성되는 DNA단편(약 750bp)을 약 3μg의 수율로 분리시켰다(Bal31-EcoRI 단편으로 표시하기로 한다). Bal31-EcoRI 단편을 상기(3)에서 기술한 것과 같이 pSN 5182로부터 얻은 Hpa I-EcoRI 단편(약 4kbp)과 결찰시켜서, pHoS 조촉매 영역과, 샤인-달가르노 배열과, 시그널 펩티드와 인산염 결합 단백의 N-말단부분을 코우드하는 DNA배열, 및 성숙된 인간 TNF와 그의 전구체 일부를 코우드하는 DNA배열을 함유하는 형질발현 플라스미드를 구축하였다.
형질발현 플라스미드를 pHTS 37로 명명하고, 이것을 E. 콜리 HB 101에 도입시켜 형질전환주를 얻고, 이것을 HB 101/pHTS 37로 명명하였다. 형질전환주 HB 101/pHTS 37을 배양시키고, 상기(3)에 기술한 것과 동일한 조건하에서 외질 추출물을 얻었다.
얻어진 외질 추출물은 4.93×105단위(L-929)/ml의 세포독소 활성을 갖는다.
이 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔(12.5%) 전기영동 조작을 받게 하였다. 전기영동은 0.1% SDS를 함유하는 트리스-글리신(pH 8.3)완충액을 사용하여 35V로 12시간동안 수행하였다. 단백질을 쿠우마시 브릴리언트 불루로 착색시켰다. E.콜리 HB 101의 추출물에서는 관찰되지 않았던 밴드가 2개 약22,000달톤과 16,500달톤에 상응하는 위치에서 검지되었다. 별도로 이 겔을 폭 2mm로 얇게 썰어서 각개의 겔을 1% 우태아 혈청을 함유하는 어얼레(Earle)의 최소 필수배지 1ml내에서 4℃로 하룻밤 진탕하여 겔로부터 단백질을 용리시켰다. 각개 용리액은 쥐 L-929 세포에 대한 세포독소 활성측정에 사용하였다. 그 결과 쿠우마시 브릴리언트 불루로 착색된 단백질에 상응하는 위치로부터 얇게 절단된 겔로부터 나온 용출액에서 강한 세포독소 활성이 검지되었고, 이것은 16,500달톤의 분자량으로 평가되었다.
형질발현 플라스미드 pHTS 37의 구조로부터, 형질전환체내에서 생성된 인간 TNF는 그의 전구체 일부와 함께 인산염 결합단백 일부와 인간 TNF의 융합된 단백이라고 추측되었다. 융합단백의 이론적 분자량은 약 23,000달톤으로 계산되었다. 한편 성숙된 인간 TNF의 분자량은 17,097달톤이었다. 이와 같은 연구는 생성된 융합단백이 대체로 성숙된 TNF를 그의 전구체 부분에 결합시키는 특정 부위 (Arg-Ser)에서의 제한된 가수분해에 의하여 숙주세포내의 성숙된 인간 TNF로 전환될 수 있다는 것을 암시하였다.
외질 추출물을 5microgram/ml의 트립신(소의 췌장으로부터 , Sigma Chem.Co.)과 함께 37℃에서 1시간동안 배양하고, 상기한 동일 조건하에서 반응혼합물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켰더니, 약22,000달톤의 분자량에 상응하는 위치에서 단백질 밴드가 검지되었으며, 이것은 운합 단백질일 수 있으며 트립신절단에 의하여 소실되었다.
[실시예 3]
[변성된 인간 TNF 폴리펩티드의 제조]
성숙된 인간 TNF로부터 4개의 아미노산을 삭제한 변성된 인간 TNF를 코우드하는 염기배열을 갖는 형질발현 플라스미드 pHTRD 4는 다음과 같이 구성하였다 ; 실시예 2-(1)에서 얻은 pHT 113으로 클론화된 cDAN를, 50ml NaCl, 6ml MgCl2, 6mM 2-메르캅토에탄올, 제한 엔도뉴클레아제 Ava I와 Hind III 각가을 12단위 함유하는 10ml 트리스-HCl(pH 7.5)완충액에 응해시켜, 37℃에서 60분간 배양하였다.
최종농도 0.3M까지 NaCl을 가한후 생성되는 DNA 단편을 에탄올로부터 회수하였다. 성숙된 인간 TNF에 대한 코우드영역 대부분을 포함하는 DNA 단편(약 600bp)을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리시켰다.
DNA 단편은 다음 배열을 갖는 화학 합성된 올리고 데옥시뉴클레오티드 어댑터와 연결시켰다 ;
Figure kpo00018
연결된 DNA 단편은 삭제된 HTNF-어댑터 단편이라고 표시하였다. 형질발현 플라스미드 pHTRD 4는 실시예 2-(5)에 기술한 것과 같은 방법에 따라 상기한 것과 같은 삭제된 HTNF-어댑터 단편과 trp프로모터단편과 pBR 322-Ampr단편을 사용하여 구축하였다.
상기의 합성 어댑터를 사용함으로써 개시코든(ATG)가 뒤따르는 염기배열은 성숙된 인간 TNF의 N-말단으로부터 4개의 아미노산(Ser-Ser-Ser-Arg)을 삭제한 151 아미노산 잔유물로 구성되는 아미노산 배열에 대하여 코우딩한다.
형질발현 플라스미드 pHTRD 4을 E. coli HB 101에 도입시켜 형질전환체를 얻었다. 형질전환체를 배양하고, 세포 용해질은 실시예 2-(5)에 기술한 바와 같이 제조하였다.
용해질은 1.1×105단위 (L-929)/ml의 세포독소 활성을 가졌다.
[실시예 4]
[에스케리치아 콜리에서 인간 TNF 전구체 폴리펩티드의 제조]
233 아미노산으로 구성된 인간 TNF 전구체 폴리펩티드를 코우드하는 cDAN 함유 형질발현 플라스미드 pHTRP 3은 다음과 같이 구성하였다 ; 를론화된 cDAN를 제한 엔도뉴클레아제 PstI과 Hind III로 2중 소화시켜서 재결합 플라스미드pHT 113으로부터 클론화된 cDAN를 분리시키고, cDAN 단편은 엔도뉴클레아제 HgiAI로 더 부분 절단하여 대부분의 전구체 폴리펩티드를 코우드하는 염기배열을 포함한 DNA 단편 (약820bp)을 얻었는 바, 이것은 그의 감작 스트랜드의 개시코든으로부터 7개 염기를 삭제한 것이다. 생성 되는 DNA 단편은 다음 일반식으로 표시되는 화학 합성된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 단편과 연결시켰다 ;
Figure kpo00019
결찰된 DNA 단편은 Pre-TNF 단편으로 표시하였다.
별도로, 제한 엔도뉴클레아제 EcpRI와 Hpa I로 소화시킴으로써 일부의 trp 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편을 절단하고, 이 DNA 단편을 다음의 화학 합성된 어댑터와 연결시켰다 ;
Figure kpo00020
생성된 DNA 단편을 Pre-TNF 단편과 결찰신키고, 결찰된 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI과 Hind III으로 소화시킴으로써 플라스미드 pBR 322로부터 분리된 암피실린-내성 유전자를 갓는 DNA 단편 (약 4.3kbp)에 삽입하였다.
이들 과정으로 구축된 형질발현 플라스미드 pHTRP 3은 E. 콜리 HB 101에 도입시키고, 형질발현주를 37℃로 수식된 M-9 배지에서 하룻밤 배양하였다. 배양물을 동일한 배지 5ml에 접종하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음에 3-베타-인돌 아크릴산을 가하여 최종농도가 20microgram/ml되게 하고, 배양을 하룻밤 계속하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 실시예 2-(1)에 기술한 것과 동일한 방법으로 처리하여 맑은 용해질을 얻었다.
용해질은 1.8×104단위(L-929)/ml의 세포독소 활성을 가졌다.
[실시예 5]
[인간 TNF의 생성과 정제]
(1) 에스케리치아 콜리내에서의 제조
실시예 2-(2)에서 얻은 형질전환주 HB 101/pHTR 91을 인간 TNF 제조에 사용하였다. 형질전환주는 12.5microgram/ml의 테트라싸이클린으로 보충한 LB-브로스내에서 37℃로 하룻밤 배양하였다. 배양물을 실시예 2-(2)에서 사용된 수식된 M-9 배지 10용적에 접종시키고, 37℃에서 1시간동간 배양하였다. 최종농도가 20microgram/ml가 되도록 3-베타-인돌 아크릴산을 가한 후 배양을 4시간동안 계속하였다. 실시예 2-(1)에 기재한 것과 동일한 방법으로 세포를 수집하여 처리하여 맑은 용해질을 얻었다. 이 용해질을 인간 TNF의 정제에 사용하였다.
(2) 인간 TNF의 정제
다음의 과정에 의하여 상기(1)에서 얻은 용해질로부터 인간 TNF를 정제하였다. 20mM 트리스-HCl(pH 7.8) 완충액으로 미리 평형시킨 DEAE-세파로스 CL-6B(pHarmacia)로 충전시킨 컬럼(5×20cm)에 1030m1의 용해질을 가하고, 이 컬럼을 동일한 완충액 3ℓ로 세척한 다음, 133ml/시간의 유동속도로 동일한 완충액내에서 0으로부터 0.3M까지 NaCl의 선상구배로 용출시켰다. 용출액은 10ml-분획으로 분획하였다. 세포독소 활성을 갖는 분획을 수집하여 함께 모았다.
이 단계에서 세포독소 활성의 회수는 53%이었고 비활성(比活性)은 약 9배까지 상승하였다.
합친 분획을 염분 제거하고, YM10 박막(Amicon)을 사용하는 다이아플로(Diaflo)로 초여과함으로써 1/10용적까지 농출시켰다. 농축물을 예비 아이소엘렉토로포커싱 겔 전기영동시켰다. 농축액의 정제수량을 이모빌라인(Immobiline, LKB)을 부여한 pH 5.6 내지 pH 6.1범위의 pH 구배로 폴리아크릴아미드 겔 플레이트(0.2×10×10cm)에 가하였다. 전기영동은 2,400V에서 16시간동안 15℃로 수행하였다. 겔을 10mm 폭으로 얇게 썰어, 20mM 트리스-HCl(pH 7.8)완충액으로 용출하고, 이 과정을 반복하였다. 세포독소 활성을 갖는 용출물을 모아 상기와 같은 초여과에 의하여 농축시켰다 최종적으로 농축물을, 탈염할 Bio-Gel P-6(BIO-RAD)의 컬럼 (0.7×25cm)에 가하였다.
세포독소 활성을 갖는 탈염된 최종제제는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동분석을 기준으로 균질성이었고, 이것을 상기[III]항에서 기술한 분석용의 정제된 인간 TNF 폴리펩티드로서 사용하였다.
[실시예 6]
[동결건조된 재결합 인간 TNF 폴리펩티드의 제조방법]
상기 실시예에서 기술한 방법으로 얻은 정제된 인간 TNF 용액을 동결건조된 인간 TNF 제조에 사용하였다. 2×107단위(LM)의 세포독소 활성을 갖는 정제된 인간 TNF용액 10m1를 10% 인간혈청 알부민과 20% D-만니톨을 함유하는 8% NaCl의 1/10용적과 혼합하였다. 용액의 pH를 6.8로 조정한 다음 생성되는 용액을 미세유동 박막(Microflow membrane, Flow Labs., 구공크기 0.2 미크론)을 통한 여과로 살균하였다. 살균용액 5ml를 유리병에 분배하고 동결건조시켰다.
각개 유리병은 107단위(LM)의 정제인간 TNF를 함유한다.
[참고실시예 1]
[토끼 TNF cDAN의 제조]
(1) 토끼 폐포의 마크로파지로부터 TNF mRNA의 제조
토끼 (체중 약 2.5kg)에서 치사 건조된 푸로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)세포를 토끼 1마리당 100mg의 용량으로 정맥내 주사하고 8일후에 치사시켰다. 토끼의 기관에 삽입한 튜우브를 통하여 인산염 완충액으로 폐를 반복 세척하고, 폐포 마크로파지를 수집하였다. 12마리의 토끼로부터 약 3×109폐포 마크로파지가 얻어졌다.
폐포 마크로파지를 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 배지에 현탁시키고, 딧쉬당 2×107세포의 세포밀도로 페트리딧쉬(직경 8cm)에 파종하였다. 이들을 37℃에서 5% 탄산가스를 함유하는 충분한 가습분위기에서 전-배양시켰다. 1시간동안 전-배양한후 내독소(E.콜리로부터 유도된 리포폴리시카라이드)와 TPA(포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트)와 시클로헥시미드(단백합성 조해제)를 가하여 그의 최종 농도가 각각 10microgram/ml, 10ng/ml 및 1microgram/ml가 되게 하였다. 배양을 4내지 4.5시간(총 5내지 5.5시간) 더 계속하고, 배양물 배지를 흡인 제거하고, 딧쉬에 고착된 마크로파지를 용해시킨 다음, 0.6% 나트륨 N-라우로일 사르코시네이트와 6mM 시트르산 나트륨을 함유하는 5M 구아니딜 티오아네히트 용액에서 균질화하였다. 균질물을 0.1M EDTA를 함유하는 5.7M 염화세슘에 가하고, 초원심분리(RPS27-2로우터, 히다찌 고끼)를 이용하여 26,500rpm으로 20시간동안 원심분리하여 총 RNA 분획을 입자로서 얻었다. 이 입자를 0.35M NaCl, 20mM 트리스 및 20mM EDTA를 함유하는 7M 요소용액 소량에 용해시키고, 에탄올로부터 재결정시켜 회수하였다. 12마리의 토끼로부터 5.2mg의 총 RNA가 얻어졌다. 총 RMA 분획을 1mM EDTA를 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액(TE용액으로 표시하기로 한다)에 용해시키고, 이 용액을 65℃에서 5분간 가열하였다. NaCl 용액을 0.5M 농도까지 가하고, 이 용액을 0.5M NaCl을 함유하는 TE용액으로 미리 평형시킨 올리고(dT)셀루로오스 컬럼에 가하였다. 이 컬럼을 TE용액으로 용출하여 314microgram의 폴리(A) mRNA를 얻었다. 생성되는 폴리(A) mRNA 200microgram을 아가로스 겔 전기영동(겔농도 1%, 6M 우레아 존재하에, pH 4)시키고, 분자크기에 따라 7개 분획으로 분획하였다. 70℃에서 10분간 용융시킨 다음 페놀과 클로로포름으로 연속 추출하고, 에탄올로부터 침전시킴으로써 각개의 겔 분획으로부터 폴리(A) mRNA를 분리하였다. 각개 분획으로부터 회수된 폴리(A) mRNA 내 토끼 TNF mRNA함량을 제노퍼스 레비스의 난모세포를 사용하는 mRNA 트랜슬레이션에 의하여 측정하였다.
토끼 TNF mRNA는 1.6 내지 2.7kb의 분자크기에 상응하는 분획으로부터 높은 농도로 회수되었다(농축 토끼 TNF mRNA로 약칭하기로 한다) .
여기에서 얻어진 농축 토171 TNF mRNA 분획을 다음 실험에서 사용하였다.
(2) cDAN의 합성
다음 조건하에 cDAN를 합성하였다. 농축 rNF mRNA 분획 4microgram을, 10mM MgCl2, 70mMKCl, 1mM 디티오트레이롤, 4종의 데옥시리보뉴클레오티드 3인산 즉 dTTP,dCTP,cATP 및 dGTP (dCTP는 32pp로 표지되었다 ; 비활성 4.4×106cpm/nmole) 각각 0.5mM, 3microgram의 올리고(dT)12-18 및 조류의 골수아구종증 바이러스로부터 유도된 80단위의 역전사효소를 함유하는 50rnM 트리스-HCl(pH 8.3) 완충용액 10micro-ℓ에 용해시키고, 43℃에서 90분간 배양하였다. 다음에 EDTA를 가하여 반응을 중단시켰다. 생성되는 cDAN-mRNA 하이브러드를 페놀/클로로포름(1 : 1)으로 추출하고, 에탄올로부터 침전시켜 수상으로부터 회수하였다. 65 내지 70℃에서 알카리로 처리함으로써 mRNA 주형을 제거하였다. 합성된 sscDAN는 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다.
sscDAN 침전은 4종의 데옥시리보뉴클레오티드 3인산 즉 dATP,dTTP,dCTP 및 dCTP 각각0.5mM과 5mM MgCl2, 70mM KCl, 1.5mM 2-메르캅토에탄올과 8단위의 E. 콜리 DNA 폴리머라제 I (대분획) 을 함유하는 0.1M(pH 6.9) 환충액 40micro-ℓ에 용해시키고, 15℃에서 20시간동안 배양하여 dscDAN를 합성하였다. 나트륨 도데실술페이트를 가하여 반응을 정지시켰다. dscDAN를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다.
생성되는 dscDAN를 1mM ZnSO4, 200mM NaCl, 0.5%글리세롤 및 0.5단위의 S1뉴클레아제를 함유하는 50mM 아세트산나트륨(pH 4.5) 100micro-ℓ에 용해시키고 20분간 37℃에서 배양시켜 헤어핀(hairpin) 구조를 분할시켰다. EDTA를 가하여 반응을 중단시키고, 반응혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 디에틸에테르로 추출하였다. dscDAN는 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다.
(3) 올리고(dC)-테일부가 cDAN의 제조
상기와같이 얻어진 dscDAN를 1mM CoCl2. 0,1mM디티오트레이톨, 0.2microgram의 폴리(A), 0.1mM3H-dCTP(비활성, 5400cpm/pmo1e)과 10단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 함유하는 100micro-ℓ의 130mM나트륨 카코딜레이트-30mM 트리스-HCl(pH 6.8)완충액에 용해시키고, 37℃에서 20분간 배양하여 dscDAN의 3′-말단에 올리고(dC)테일이 부가되게 하였다.
EDTA를 가하여 반응을 중지시켰다. 반응혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 디에틸 에테르로 추출하고, 올리고(dC)-테일부가 dscDAN는 에탄올로부터 침전시켜 회수하였다.
올리고(dC)-테일부가 dscDAN는 1mM EDTA와 100mM NaCl을 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4)완충액에 용해시켜서 이것이 1ml 당 0.2microgram의 올리고(dC)-테일부가 dscDAN를 함유하게 하였다.
(4) 올리고(dG)-테일부가 플라스미드 pBR 322 DNA의 제조
pBR 322(10microgram)를 10mM MgC2, 50mM(NH4)2SO4및 10microgram의 소혈청 알부민을 함유하는 20mM 트리스-HCl(pH 7.4)완충액 100micro-ℓ에 용해시키고, 15단위의 제한 엔도뉴클레아제 Pst I을 가하였다.
혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양하고, 반응폭 종결된후, 반응혼합물을 페놀/플로로포름으로 추출하고, 생성되는 DNA는 에탄올로부터 침전시켜 수상으로부터 회수하였다.
얻어진 DNA는 상기 dscDAN의 테일부가에서 사용된 것과 동일한 반응완충액(단 이것이3H-dCTP대신에 80단위의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와3H-dGTP를 함유하였다)200micro-ℓ에 용해시키고 37℃에서 20분간 배양시켜 1개 말단당 약 10-15dG잔기를 부가하였다.
반웅혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 올리고(dG)-테일부가 플라스미드 pHR 322 DNA를 에탄올 침전에 의하여 수상으로부터 회수하였다. 생성되는 테일부가 플라스미드 DNA는 올리고(dC)-페일부가 dscDAN용해에 사용된 것과 동일한 완충액에 용해시켜서 이것이 2μg/ml의 농도로 테일부가 플라스미드 DNA를 함유하게 하였다.
(5) 재조합 플라스미드의 구성
50μg의 올리고(dC)-테일부가 cDAN용액을 50μg의 올리고(dG)-테일부가 pBR 322 DNA용액과 혼합하고, 이 혼합물을 65℃에서 10분간, 57℃에서 120분간, 45℃에서 60분간, 35℃에서 60분간 그리고 실온에서 60분간 배양시켜 숙성되게 하여 재조합 플라스미드용액을 구성하였다.
(6) 형질전환체의 선택
E. coliχ 1776균주를 상기와 같이 얻어진 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다. 특히 E. coliχ 1776은 37℃에서 100μg/ml의 디아미노퍼멜산과 40μg/ml의 티미딘으로 600nm에서의 혼탁도가 0.5에 이를때까지 보충한 L-브로스 20ml에서 배양하였다.
0℃에서 원심분리하여 세퍼를 수집하고 50mM caCl2를 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)완충액으로 세척하였다. 세포를 위에서 사용된 것과 동일한 완충액 2ml에 재현탁시키고, 0℃에서 5분간 방치하였다.
0.2ml의 현탁액에 위와같이 얻어진 재조합 플라스미드 0.1ml를 가하였다. 이 혼합물을 0℃에서 15분간 방치한 다음 42℃에 2분간 유지시켰다. 다음에 위에서 사용된 보충된 L-브로스 0.5ml를 가하고, 1시간동안 진탕하면서 배양을 수행하였다. 배양물 정제수량을 취하여 15μg/ml의 테트라싸이클린을 함유하는 보충된 L-브로스 한천플레이트에 전개시켜 놓고 37℃에서 약 12시간동안 배양하였다. 테트라싸이클린에 내성인 형질전환체를 선택하고, 이것을 cDAN라이브러리로 사용하였다.
(7) 혼성화 분석
콜로니 혼성화 분석은 토끼 TNF를 코우드하는 cDAN 함유 플라스미드를 갖는 형질전환체에 대하여 cDAN 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 하나한씨등의 방법(Gene,10,63,1980)으로32P-표지의 cDAN프로브를 사용하여 수행하였다. 유도 플러스 및 유도 마이너스32P-표지의 sscDAN 프로브를 각각, 높은 비방사능을 갖는32P-dCTP를 사용하는 것을 제외하고는 상기(1)에 기술한 방법으로 유도 플러스 및 마이너스 페포 마크로파지로부터 얻은 mRNA를 사용하여, 상기(2)에 기술한 방법에 의하여 합성하였다. 이 시험에 의하여 유도 플러스 프로브와는 강화게 혼성화 되었으나 유도 마이너스 프로브와는 혼성화되지 않은 재조합 플라스미드를 잠복시키고 있는 형질 전환체의 선택된 콜로니가 얻어졌다.
약 20,000콜로니로부터 50개 콜로니가 선택되었다. 50개의 선택된 콜로니로부터 20개는 T. 마니아티스씨등의 방법(T Maniatis, ed, “Nolecular Cloning”, 329,1980,Cole Spring Harbor Lab＞)으로 mRNA 혼성화 번역 분석을 받게 하였다.
형질전환체 개체들로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 가열변성후 니트로셀룰로오스 필터에 고정시켰다.
상기(1)에서 얻어진 토끼 TNF mRNA를 함유하는 폴리(A)mRNA 분획을 필터에 가하고 50℃에서 3시간 동안 배양하여 혼성화를 수행하였다.
혼성화된 mRNA를 회수하고 난모세포에 주사하여 회수된 mRNA가 토끼 TNF mRNA인가의 여부를 환인하였다. 이 시험결과로 3개의 콜로니가 토끼 TNF mRNA와 강하게 혼성화된 cDAN를 함유하는 플라스미드를 갖는 것으로 판명되었다.
제한 엔도뉴클레아제 Dde I로의 절단에 의하여 최대크기(약 750bp)의 cDAN를 갖는 플라스미드로부터 cDAN단편이 얻어졌으며, 그후의 스크리닝용 프로브로서 사용하였다.
이들 DNA단편을32P로 표지하였다. 이들 프로브를 사용함으로써 상기(6)에서 얻어진 cDAN라이브러리가 콜로니 혼성화 분석에 이션 분석에 의하여 스크리닝 되었고, 표지된 프로브와 강하게 혼성화된 cDAN함유 플라스미드를 갖는 형질전혼체의 콜로니가 선택되었다.
cDAN라이브러리의 약 60,000콜로니중 98콜로니가 이 시험에서 양성으로 나타났다. 재조합 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 절단시킴으로써 이들 재조합 플라스미드로부터 cDAN삽입물을 절단해내고 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 이들의 크기를 측정하였다. 적어도 1kbp의 cDAN삽입물을 갖는 형질전환주의 17개 클론이 선택되었다. 최대크기 (형질전환 주 No. ; χ 1776/pRTNF 802 ; 플라스미드 No. ; pPRTNF 802)의 cDAN를 함유하는 형질전환주로부터 클론화된 cDAN를 분리하고, 다음 방법에 의하여 그의 염기 배열을 결정하였다.
(8) 클론차된 cDAN의 염기배열 측정
상기 (7)에서 선택된 형질전환주 χ1776/pRTNF 802를 디아미노피멜산과 티미딘으로 보충한 L-브로스내에서 배양하였다. 월끼씨등의 방법에 따라 세포를 처리하여 플라스미드 DNA를 얻었다. 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 Pst I으로 소화시키고, 정제하여 클론화된 cDAN를 얻었다. 콜론화된 cDAN 단편을 여러가지 제한 엔도뉴플레아제로 더 소화시켜서 적당한 제한 엔도뉴클레아제-분할 단편의 염기배열을 맥샘-길버어트 방법으로 결정하였다.
결정된 염기배열이 다음의 표 7에 기재되어 있다. 제277번째 내지 제738번째 염기의 염기배열은 참고실시예 2에 명시한 토끼 플라스마로부터 정제한 TNF의 N-말단 및 C-말단 아미노산 배열에 따라 토끼 TNF에 대한 코우딩 영역으로 지정되었다. 제34번째 내지 제276번째 염기는 토끼 TNF의 전구체를 구성하는데 요구되는 폴리펩티드를 코우드화하는 것으로 추정된다.
[참고실시예 2]
[토끼 플라스마 TNF의 분리와 정제]
토끼(체중 2.5 내지 3.0kg)에게 푸로피오니박테리움 아크네스의 치사, 건조된 세포 50mg을 정맥내에 주사하였다. 8일후에 이 토끼에게 100microgram의 내독소(E. 콜리로부터 유도된 리포폴리사카라이드)100microgram을 정맥내에 주사하였다.
2시간후에 심장에 구멍을 내어 각 토끼로부터 혈액을 취하였다. 혈액을 1ml당 100단위의 나트륨 헤파린과 혼합한 다음 5000rpm으로 30분간 냉각하에서 원심분리하여 혈액세포와 불용물을 제거하였다. 24ℓ의 플라스마가 400마리 쥐로부터 얻어졌다.
24ℓ의 플라스마에 EDTA(24g)와 240g의 셀라이트를 가하고 이 혼합물을 1시간동안 교반한 다음 구공크기가 3미크론, 1미크론 및 0.2미크론인 여과기를 통하여 연속적으로 여과하였다.
여액 24ℓ에 12ℓ의 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8)완충액을 가하고, 이 혼합물을 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8)완충액으로 평형시킨 DEAE-세파로스 CL-6B(pHarmacia)컬럼(27×45cm)에 가하였다.
이 컬럼을 다음에 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8) 75ℓ로 세척한 다음, 0.15M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8)완충액 50ℓ로 세척하고, 0.18M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스 HCl(pH 7.2)완충액으로 용출시켰다. 용축액을 8-ℓ분획으로 분획하고, 세포독소 활성을 갖는 활성분획을 수집 하였다.
활성분획을 합쳐서 동일용적의 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8)완충액으로 회석시켰다. 회석된 용액을 DEAE-세파로스 CL-6B의 컬럼 (10×13cm)에 가하였다. 이 컬럼을 0.1M NaCl을 함유하는 0.04M 트리스-HCl(pH 7.8)완충액 1ℓ로 세척하고, 0.18M NaCl을 함유하는 0.0.4M 트리스-HCl(pH 7.2)완충액 5ℓ로 용출시켰다. 용출액을 250m1분획으로 분획하고, 세포독소 활성을 갖는 분획을 수집하여 한데 합쳤다.
활성분획을 60℃로 30분간 가열하고 4℃까지 신속히 냉각시켰다. 냉각된 용액을 한외여과로 농축시켰다.
생성되는 농축물을 0.1M NaCl을 함유하는 0.005M 인산염 (pH 7.4)완충액으로 평형시킨 세파크릴 S-200(Pharmacia) 컬럼(5×80cm)에 가하고, 동일한 완충액으로 용출시켰다. 용출액을 40ml분획으로 분획하고, 활성분획을 수집하여 한데 합치고 한외여과로 농축시켰다.
겔 여과로 얻어진 활성분획의 농축물을 하기하는 바와같이 Zn2+킬레이트 세파로스 컬럼에 가하였다. J.포라트씨등의 방법 (J. Porath, Nature, 258,598 1975)으로 제조된 킬레이트 세파로스(이미노디아세트산으로 고정된 수지)를 충전시킨 컬럼 (1.6×20cm)을 염화아연 용액(1mg/ml)120ml로 세척한 다음 0.1M NaCl을 함유하는 0.05M 인산염 완충액(pH 7.4)으로 평형시켰다.
다음에 앞의 단계에서 얻어진 농축물을 컬럼에 가하고 동일한 완충액으로 용출시켰다. 컬럼에 흡착되지 않은 분획을 수집하였다. 세포독소 활성은 거의 완전히 이들 분획에 회수되었다.
앞의 단계에서 얻어진 활성분획을 농축시켜서 0.15M NaCl을 함유하는 0.005M인산염 완충액(pH 7.4)으로 충분히 평형시킨 토이오퍼얼 HW-55(Toyopearl, Toyo, Soda Co., Ltd.) 컬럼 (1.5×90cm)에 가하였다. 컬럼을 동일한 완충액으로 용출하고, 활성분획을 합쳤다. 이 제제는 정재된 토끼 혈장 TNF이었다.
여기에서 얻어진 정제된 토끼 플라스마 TNF를 참고실시예 2와 3에서 사용하였다.
[참고실시예 3]
[토끼 플라스마 TNF의 N-말단 및 C-말단 아미노산 배열의 측정]
참고실시예 2에서 얻은 정제된 토끼 플라스마 TNF를 N-말단 및 C-말단아미노산 배열의 측정에 사용하였다.
N-말단 아미노산 배열은 에드만 변성방법으로 측정하였다. 생성되는 페닐티오하이단토인-아모노산은 조르박스(Zorbox) ODS 컬럼(Dupont)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그라피로 확인하였다.
C-말단 아미노산 배열은 카르복시펩티다제를 사용하는 효소적 방법으로 측정하였다. 정제된 토끼 혈장 TNF은 효소와 기질의 몰비율을 각가 1:25와 1:1,000으로 하여 카르복시펩티다제 A와 Y로 소화시켰다.
2중소화에 의하여 토끼 플라스마 TNF로부터 방출되는 유리아미노산은 소화후 2분 내지 180분읜 적당한 간격으로 마이크로-아미노산 분석기(Shimadzu Seisakusho)로 확인하였다.
결국 토끼 플라스마 TNF의 N-말단 및 C-말단 아미노산 배열이 다음과 같다는것이 판명되었다.
Figure kpo00021
[참고실시예 4]
[항-토끼 플라스마 TNF항체의 제조]
참고실시예 2에서 얻어진 정제된 토끼 플라스마 TNF 1.9×105단위(L-929)를 함유하는 TNF용액을 동일용적의 프로인트의(Freund′s)완전 보조제로 유화시키고, 이 유제를 7부분으로 기니아(guinea)피그의 등에 피하주사하였다. 다음에 이 피그를 동일한 방법으로 1,3 및 6주후에 면역시켰다.
또한 8주후에 동일한 양의 정제된 토끼 플라스마를 수산화알루미늄 겔과 함께 복강내에 주사하였다. 첫번째 면역한지 9주후에 심장에 구멍을 내어 전체 혈액을 취하고 원심분리하여 항-토끼 플라즈마 TNF항체를 함유하는 항-혈청을 얻었다.
항혈청은 정상토끼의 혈청 단백질 성분과 결합된 세파토스 4B컬럼에 통과시켰다. 이것을 3회 반복함으로써 토끼 플라즈마 TNF에 특이적인 정제된 항체가 얻어졌다. 이 항체는 정제된 토끼 플라즈마 TNF에 의하여 단일 침전선을 형성한다는 것이 면역 전기영동 및 겔 2중확산법에 의하여 확인되었다.
이 정제 항체를 약 60,000-배 희석시킨 것은 토끼혈장 TNF의 500단위 (L-929)의 세포독소 활성 50%를 중화시킬 중화능을 갖는다.
이 항체를 약 1,000배 희석시킨 것은 토끼 혈장 TNF의 세포독소 활성 50단위 (LM)를 완전히 중화시킬수 있다.
[표 1]
Figure kpo00022
Figure kpo00023
[표 2]
Figure kpo00024
Figure kpo00025
[표 3]
Figure kpo00026
Figure kpo00027
Figure kpo00028
Figure kpo00029
[표 4]
Figure kpo00030
Figure kpo00031
Figure kpo00032
[표 5]
Figure kpo00033
[표 6]
Figure kpo00034
[표 7]
Figure kpo00035
Figure kpo00036
Figure kpo00037

Claims (41)

  1. 인간 마크로파지를 유도제와 함께 배양하는 단계와, 마크로파지로부터 인간 암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 분리하는 단계와, 이 분획으로부터 cDNA 라이브러리를 작성하는 단계와, 인간 암과사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 cDNA의 클로닝 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간 암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부분을 코우드하는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA의 제조방법.
  2. 인간 마크로파지를 유도제와 함께 배양하는 단계와, 마크로파지로부터 인간 암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 분리하는 단계와, 이 분회으로부터 cDNA 라이브러리를 작성하는 단계와, 인간 암괴사인자나 그의 주요부분을 코우드하는 cDNA의 클로닝 단계와, 클로닝된 cDNA를 형질발현 백터에 삽입하는 단계와, 제조합 백터를 숙주에 도입하여 숙주 형질전환시키는 단계와, 형질전환체를 배양하는 단계와, 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분을 갖거나 함유하는 생성된 폴리펩티드를 수집하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분을 갖거나 함유하는 폴리펩티드의 제조방법.
  3. 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분 또는 각개의 수식된 염기배열을 코우드하는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA를 형질발현 백터에 삽입하는 단계와, 재조합 백터로 숙주를 형질전환시키는 단계와, 숙주를 배양하는 단계와, 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분을 갖거나 함유하는 생성 폴리펩티드를 숙주로부터 수집하는 단계와, 다음에 요구에 따라서는 폴리펩티드를 수식하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간 암괴사인자나 그의 주요부분, 또는 인간 암괴사인자형의 물질이나 그의 주요부분, 또는 이들의 각기 수정된 물질을 갖거나 함유하는 폴리펜티드의 제조방법.
  4. (1)인간 마크로파지를 유도제와 함께 배양하는 단계, (2)인간 암괴사인자 mRNA를 함유하는 분획을 마크로파지로부터 분리하는 단계, (3)역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 단일 스트랜드 cDNA를 제조한 다음 이것을 2중-스트랜드 cDNA로 전환하는 단계, (4)2중-스트랜드 cDNA를 백터에 삽입하는 단계, (5)재조합 백터를 숙주에 도입시켜 그를 형질전환시키고 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계, (6)라이브러리로부터 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분을 코우드하는 cDNA를 클로닝 하는 단계, (7)요구에 따라서는 클론화된 cDNA를 수식하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는, 인간 암괴사인자 폴리펩티드나 그의 주요부분, 또는 이들의 각기 수식된 염기배열을 코우드하는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA의 제조방법.
  5. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00038
    상기 식에서 A는 1개이상의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된, 다음 일반식[ Ia]의 폴리펩티드이고, B는 1개 내지 3개의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된, 다음 일반식 [Ib]의 펩티드이며, X는 폴리펩티드이며, Y는 Met이고, m, n 및 p는 1 또는 0이다.
    일반식 Ia는 다음과 같다.
    Figure kpo00039
    Figure kpo00040
    일반식[Ib]는 다음과 같다.
    Figure kpo00041
  6. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코돈을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00042
    상기 식에서 A, B, Y, m, n 및 p는 청구범위 5에서 정의한바와 같고, X는 다음 일반식[Ic]의 폴리펩티드이다.
    Figure kpo00043
  7. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00044
    상기 식에서 A는 청구범위 5항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 청구범위 5항에 기재한 일반식[Ib]의 펩티드이며, Y와 p[는 청구범위 5항에서 정의한 바와 같고, X는 청구범위 6항에 기재한 일반식 [Ic]의 폴리펩티드이며, m과 n은 1이다.
  8. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00045
    상기 식에서 A는 청구범위 5항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 청구범위 5항에 기재한 일반식[Ib]의 펩티드이며, m은 1이고, n은 0이며, Y와 p는 청구범위 5항에서 정의한 것과 같다.
  9. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00046
    상기 식에서 A는 청구범위 5항에 기재한 일반식[ Ia]의 폴리펩티드이고, n과 m은 0이며, Y와 p는 청구범위 5항에서 정의한 바와 같다.
  10. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00047
    상기 식에서 A는 1개 이상의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 5항에서 정의한 것과 같다.
  11. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00048
    상기 식에서 A는 N-말단으로부터 제 1위치에 있는 Thr, 상기 제1위치의 Thr로부터 제6위치의 Pro까지의 아미노산, 상기 제 1위치의 Thr로부터 제9위치의 His까지의 아미노산, 또는 상기 제 1위치의 Thr로부터 제12위치의 Ala까지의 아미노산이 삭제된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 5항에서 정의한 것과 같다.
  12. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산 배열에 상응하는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00049
    상기 식에서 A는 N-말단으로부터 제66위치 및 67위치의 Thr과 His가 His, Thr 또는 Tyr로 대치된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 5항에서 정의한 것과 같다.
  13. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 적어도 다음 일반식[Ia′]로 표시되는 아미노산 배열, 또는 N-말단으로부터 제1위치의 Trp 내지 제27위치의 Asp가 삭제된 일반식[ Ia′]의 아미노산 배열에 상응하는 염기 배열을 갖는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00050
  14. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00051
    상기 식에서 A＇는 1개 이상의 코든이 삭제되거나 또는 다른 코든으로 대치된 다음 일반식[IIa]의 염기배열이고, B＇는 1 내지 3개 코든이 삭제되거나 다른 코든으로 대치된 다음 일반식[IIb]의 염기배열이며, X＇는 다음 일반식[IIc]의 염기배열이고, Y＇는 ATG이며, m, n 및 p는 1이나 0이다.
    일반식[IIa]는 다음과 같다.
    Figure kpo00052
    일반식[IIB]는 다음과 같다.
    Figure kpo00053
    일반식[IIc]는 다음과 같다.
    Figure kpo00054
  15. 제1 또는 제 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열, 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 같거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00055
    상기식에서 A＇는 청구범위 14항에 기재한 일반식[IIa]의 염기배열이고, B＇는 청구범위 14항에 기재한 일반식[IIa]의 염기배열이며, m과 n은 1이고, X＇, Y＇ 및 p는 청구범위 14항에서 정의한 바와 같다.
  16. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열, 또는 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00056
    상기식에서 A＇는 청구범위 14항에 기재한 일반식[IIa]의 염기배열이고, B＇는 청구범위 14항에 기재한 일반식 [IIb]의 염기배열이며, n은 0, m은 1이고, Y＇와 p는 청구범위 14항에서 정의한 것과 같다.
  17. 제1 또는 제4항엔 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열 또는 농기 염기배열의 3＇-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00057
    상기식에서 A＇는 청구범위 14항에 기재할 일반식[IIa] 염기배열이고, m과 n은 0이며, Y＇와 p는 청구범위 14항에서 정의한 바와 같다.
  18. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열, 또는 상기 배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00058
    상기식에서 A는 1개 이상의 코든이 삭제되거나 또는 다른 코든으로 대치된 일반식[IIa]의 염기배열이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 14항에서 정의한 바와 같다.
  19. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열, 또는 상기 배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00059
    상기식에서 A＇는 5′-말단으로 부터 제 1코든의 ACC, 상기 제 1코든의 Acc내지 제6코든의 CCT까지의 코든, 상기 제 1코든의 ACC 내지 제 9코든의 CAT까지의 코든, 또는 상기 제 1코든의 ACC 내지 제12코든의 GCA까지의 코든이 삭제된 일반식[IIa]의 염기배열이고, m과 n은 0이며, Y＇와 P는 청구범위 14항에서 정의된 바와 같다.
  20. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 다음 일반식[II]로 표시되는 염기배열 또는 상기 배열의 3′-말단에 종지코든을 갖는 염기배열을 갖거나 함유하는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00060
    상기식에서, A는 5′-말단으로 부터 제66 및 제67코든의 ACC와 CAT가 CAT, ACC 또는 TAC로 대치된 일반식[IIa]의 염기배열이고, m과 n은 0이며, Y′와 p는 청구범위 14항에서 정의한 바와 같다.
  21. 제1 또는 4항에 있어서, DNA가 적어도 다음 일반식[IIa＇]로 표시되는 염기배열, 또는 5′-말단으로부터 제 1코든의 TGG 내지 제27코든의 GAC까지의 코든이 삭제된 [IIa＇]의 염기배열을 갖는 DNA인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00061
  22. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 폴리펩티드 또는 그의 유도체나 그의 염인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00062
    상기식에서 A는 1개 이상의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된 다음 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 1 내지 3개 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된 다음 일반식[Ib]의펩티드이며, X는 폴리펩티드이고, Y는 Met이며, m, n 및 p는 1 또는 0이다.
    일반식[Ia]는 다음과 같다.
    Figure kpo00063
    일반식[Ib]는 다음과 같다.
    Figure kpo00064
  23. 제2 또는 제 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 폴리펩티드 또는 그의 유도체나 그의 염인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00065
    상기식에서 A, B, Y, m, n 및 P는 청구범위 22항에서 정의한 바와 같고, X는 다음 일반식[Ic]의 폴리펩티드이다.
    일반식[Ic]는 다음과 같다.
    Figure kpo00066
  24. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00067
    상기식에서 A는 상기 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 상기 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ib]의 펩티드이며, X는 상기 청구범위 23항에 기재한 일반식[Ic]의 폴리펩티드이고, m과 n은 1이며, Y와 p는 상기 청구범위 22항에서 정의한 바와 같다.
  25. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00068
    상기식에서 A는 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ib]의 펩티드이며, m은 1, n은 0이고, Y와 p는 청구범위 22항에서 정의한 바와 같다.
  26. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00069
    상기식에서 A는 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 22항에서 정의한 바와 같다.
  27. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00070
    상기식에서 A는 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, B는 청구범위 22항에 기재한 일반식[Ib]의 펩티드이며, m은 1이고, n과 p는 0이다.
  28. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00071
    상기식에서 A는 청구범위 22항에서 기재한 폴리펩티드이고, m, n 및 p는 0이다.
  29. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 폴리펩티드 또는 그의 유도체나 그의 염인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00072
    상기식에서 A는 1개 이상의 아미노산이 삭제되거나 또는 다른 아미노산으로 대치된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 22항에서 정의한 것과 같다.
  30. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00073
    상기식에서 A는 N-말단으로 부터 제1위치의 Thr, 상기 제1위치의 Thr 내지 제6위치의 Pro까지의 아미노산, 상기 제1위치의 Thr 내지 제9위치의 His까지의 아미노산, 또는 상기 제 1위치의 Thr 내지 제12위치의 Ala까지의 아마노산이 삭제된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이고, m과 n은 0이며, Y와 p는 청구범위 22항에서 정의한 것과 같다.
  31. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 다음 일반식[I]로 표시되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00074
    상기식에서 A는 N-말단으로 부터 제66위치 및 67위치의 Thr과 His가 His, Thr 또는 Tyr로 대치된 일반식[Ia]의 폴리펩티드이며, m과 n은 0이고, Y와 p는 청구범위 22항에서 정의한 것과 같다.
  32. 제2 또는 3항에 있어서, 폴리펩티드가 적어도 다음 일반식[Ia＇]로 표시되는 폴리펩티드이거나, 또는 N-말단으로 부터 제 1위치의 Trp 내지 제27위치의 Asp까지의 아미노산이 삭제된 일반식[Ia＇]의 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00075
  33. 제2, 제3 또는 제22항에 있어서, 인간 암괴사인자 폴리펩티드 또는 그의 주요부분을 코우드하는 염기 배열을 갖거나 함유하는 청구범위 2 또는 3항의 DNA가 삽입되어 있는 형질발현 벡터로서는, 다음 일반식[I]로 표시되는 아미노산에 상응하는 염기배열을 포함하고, 상기 염기배열의 3′-말단에 종지코든을 가지며, 또한 이 염기배열은 전사 프로모터의 조절하에 있는 형질발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
    Figure kpo00076
    상기식에서 p는 1이고, A, B, X, Y, m 및 n은 청구범위 5항에서 정의한 바와 같다.
  34. 제33항에 있어서, 전사 조촉매가 trp 프로모터 또는 tac 프로모터인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 염기배열의 3＇-말단에 종지코든을 갖는, 청구범위 33항에서 정의된 일반식[I]의 아미노산 배열에 상응하는 상기 형질발현의 염기배열이 정확한 번역 판독 프레임내에서, 융합될 단백질을 코우드하는 제2염기배열에 연결되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  36. 제35항에 있어서, 융합될 단백질을 코우드하는 제2염기배열이 phoS 유전자인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  37. 제33 내지 36항의 어느 하나에 있어서, 사용된 벡터가 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli)내에서 증식할 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  38. 제37항에 있어서, 벡터가 에스케리치아 콜리 플라스미드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  39. 제38항에 있어서, 에스케리치아 콜리 플라스미드가 pBR 322인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  40. 제2,3 또는 22항에 있어서, 미생물이 숙주로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  41. 제40항에 있어서, 미생물이 에스케리치아 콜리인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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