JPS62255500A - 魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体 - Google Patents
魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体、該ポ
リペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換
え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含む微生物お
よび該微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチド
誘導体の製造法に関する。本発明の魚類の成長ホルモン
ポリペプチド誘導体は魚類の養殖産業分野において広い
用途が期待される。
リペプチド誘導体をコードするＤＮＡを組み込んだ組換
え体プラスミド、該組換え体プラスミドを含む微生物お
よび該微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチド
誘導体の製造法に関する。本発明の魚類の成長ホルモン
ポリペプチド誘導体は魚類の養殖産業分野において広い
用途が期待される。
従来の技術
本発明者は、組換えＤＮＡ技法により魚類の成長ホルモ
ンを製造する方法について研究を行った。
ンを製造する方法について研究を行った。
その結果光に、魚類の成長ホルモン製造に使用すること
ができる、魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的な
りＮＡの採取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび
微生物の製造に成功した。即ちンロサケ（以下サケと略
称する）脳下垂体からメツセンジャーＲＮΔ（ｍＲＮＡ
）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤＮＡ）
を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付近のア
ミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを合成し、このＤ
ＮＡとハイブリダイズするＣＤＮＡを選択することによ
り、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化することに成
功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（
特開昭６１−１５６９９＞。
ができる、魚類の成長ホルモンポリペプチドに相補的な
りＮＡの採取ならびにこれを含む組換え体ＤＮＡおよび
微生物の製造に成功した。即ちンロサケ（以下サケと略
称する）脳下垂体からメツセンジャーＲＮΔ（ｍＲＮＡ
）を抽出し、これと相補的なり Ｎ Ａ （ｃＤＮＡ）
を合成し、次いでサケの成長ホルモンのＮ末端付近のア
ミノ酸配列に対応するＤＮＡプローブを合成し、このＤ
ＮＡとハイブリダイズするＣＤＮＡを選択することによ
り、サケ成長ホルモン遺伝子をクローン化することに成
功した。さらにこのｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（
特開昭６１−１５６９９＞。
また本発明者は該サケ成長ホルモン遺伝子をトリプトフ
ァンプロモーターを有するベクターに組み込み、組換え
プラスミドを大腸菌に入れ、大腸菌においてサケ成長ホ
ルモンを大量生産させることにも成功した（特願昭５９
−２１３３６１）。
ァンプロモーターを有するベクターに組み込み、組換え
プラスミドを大腸菌に入れ、大腸菌においてサケ成長ホ
ルモンを大量生産させることにも成功した（特願昭５９
−２１３３６１）。
このようにして大腸菌において生産されたサケ成長ホル
モンポリペプチドはニジマス稚魚を用いた成長促進活性
測定の結果、サケ脳下垂体より抽出した天然成長ホルモ
ンとほぼ同等の活性を有することが示されている〔プロ
シーディング・オン・ヂ・ナショナル・アカデミイ・オ
ン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）１１５人、 ８２．４３（１６−４３１０
゜（１９８５） 〕。以上のようにサケ成長ホルモンポ
リペプチドは大腸菌において大量生産され、その成長促
進活性も保持していることから、安価で大量な供給が可
能になった。
モンポリペプチドはニジマス稚魚を用いた成長促進活性
測定の結果、サケ脳下垂体より抽出した天然成長ホルモ
ンとほぼ同等の活性を有することが示されている〔プロ
シーディング・オン・ヂ・ナショナル・アカデミイ・オ
ン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、）１１５人、 ８２．４３（１６−４３１０
゜（１９８５） 〕。以上のようにサケ成長ホルモンポ
リペプチドは大腸菌において大量生産され、その成長促
進活性も保持していることから、安価で大量な供給が可
能になった。
本発明が解決しようとする問題点
これまで動物細胞由来の種々の有用ポリペプチドが大腸
菌における生産に成功しているが、一般に天然型と全く
同じ蛋白質を大腸菌を宿主として産生させるのはいくつ
かの点で難しいとされている。その一つに立体構造とジ
スルフィド架橋の問題がある。すなわち大腸菌では動物
細胞と細胞内環境が異なるため、−欠配列を同じくする
ポリペプチドであっても正確なたたみ込み（ｆｏｌｄｉ
ｎｇ）が行われない場合があり、ジスルフィド架橋も正
常に形成されないことがありうる。このような危険性は
複雑な分子であるほど可能性が高く、ジスルフィド結合
する残基の多いほど正確な架橋は困難になる。ジスルフ
ィド結合を形成していない遊離のＳＨ基はその環境によ
り他のＳＨ基と容易に誤ったジスルフィド結合を形成し
得るため分子間の架橋や、さらに多分子の重合体を形成
してしまう可能性がある。このような異常な分子は本来
の生理活性を有し得ない可能性は充分にあり、さらに正
常な分子と拮抗的に作用してその活性を低下させる可能
性もある。
菌における生産に成功しているが、一般に天然型と全く
同じ蛋白質を大腸菌を宿主として産生させるのはいくつ
かの点で難しいとされている。その一つに立体構造とジ
スルフィド架橋の問題がある。すなわち大腸菌では動物
細胞と細胞内環境が異なるため、−欠配列を同じくする
ポリペプチドであっても正確なたたみ込み（ｆｏｌｄｉ
ｎｇ）が行われない場合があり、ジスルフィド架橋も正
常に形成されないことがありうる。このような危険性は
複雑な分子であるほど可能性が高く、ジスルフィド結合
する残基の多いほど正確な架橋は困難になる。ジスルフ
ィド結合を形成していない遊離のＳＨ基はその環境によ
り他のＳＨ基と容易に誤ったジスルフィド結合を形成し
得るため分子間の架橋や、さらに多分子の重合体を形成
してしまう可能性がある。このような異常な分子は本来
の生理活性を有し得ない可能性は充分にあり、さらに正
常な分子と拮抗的に作用してその活性を低下させる可能
性もある。
サケ成長ホルモン分子にはシスティン残基が４箇所（４
９位、１６１位、１７８位、１８６位）存在し、これら
は２つのジスルフィド結合（４９位と１６１位、１７８
位と１８６位）を形成していると考えられる。大腸菌で
サケ成長ホルモンを生産させる場合にも前記のような可
能性を一応考慮に入れる必要がある。
９位、１６１位、１７８位、１８６位）存在し、これら
は２つのジスルフィド結合（４９位と１６１位、１７８
位と１８６位）を形成していると考えられる。大腸菌で
サケ成長ホルモンを生産させる場合にも前記のような可
能性を一応考慮に入れる必要がある。
問題点を解決するための手段
一般的には上記のような問題を解決するためには次のよ
うな手段が考えられる。第１に蛋白質分子の簡略化、低
分子化がある。すなわち目的蛋白質分子をその生理活性
を維持させたままその一応アミノ酸配列を欠失させる手
法である。一般に蛋白質分子は活性の発現について必ず
しもその全構造が必要なわけではなく不必要な部分を含
んでいる。そのためこのような不必要な部分を積極的に
取り除くことにより、より単純な分子を得ようとするも
のであり、その結果より単純な立体構造を与え、活性の
ある構造を取りやす（する。
うな手段が考えられる。第１に蛋白質分子の簡略化、低
分子化がある。すなわち目的蛋白質分子をその生理活性
を維持させたままその一応アミノ酸配列を欠失させる手
法である。一般に蛋白質分子は活性の発現について必ず
しもその全構造が必要なわけではなく不必要な部分を含
んでいる。そのためこのような不必要な部分を積極的に
取り除くことにより、より単純な分子を得ようとするも
のであり、その結果より単純な立体構造を与え、活性の
ある構造を取りやす（する。
第２の方法として蛋白分子中のシスティン残基の欠失ま
たは他のアミノ酸残基への置換がある。前述のように蛋
白質分子の誤った立体構造形成の一因として誤ったジス
ルフィド架橋が考えられるがさらに遊離のＳＨ基を有す
る場合、このような可能性はより高まる。そのためＳＨ
基を有するアミノ酸ンステインが分子中にある場合、そ
れが活性に必須でないならば積極的に除去し、誤ったジ
スルフィド結合形成による異常な立体構造を有する蛋白
分子の生成を抑制しようとするものである。
たは他のアミノ酸残基への置換がある。前述のように蛋
白質分子の誤った立体構造形成の一因として誤ったジス
ルフィド架橋が考えられるがさらに遊離のＳＨ基を有す
る場合、このような可能性はより高まる。そのためＳＨ
基を有するアミノ酸ンステインが分子中にある場合、そ
れが活性に必須でないならば積極的に除去し、誤ったジ
スルフィド結合形成による異常な立体構造を有する蛋白
分子の生成を抑制しようとするものである。
＠遂のようにサケ成長ホルモンにはシスティン残基が４
つあり、２本のジスルフィド架橋を有するものと考えら
れる。そのため正確なジスルフィド架（ユが形成されな
かった場合には誤った立体構造を有する分子が、分子間
ジスルフィド結合による重合体を形成する可能も含んで
いる。
つあり、２本のジスルフィド架橋を有するものと考えら
れる。そのため正確なジスルフィド架（ユが形成されな
かった場合には誤った立体構造を有する分子が、分子間
ジスルフィド結合による重合体を形成する可能も含んで
いる。
サケ成長ホルモンの１〜１２９番目を存するペプチド断
片は本来の成長ホルモン分子に存在する４個の７ステイ
ン残基のうち１個しか有さず、しかもアミノ酸にして５
９個短いという単純な構造となる。このことにより前記
の立体構造やジスルフィド架橋の問題が改善されるもの
と期待される。
片は本来の成長ホルモン分子に存在する４個の７ステイ
ン残基のうち１個しか有さず、しかもアミノ酸にして５
９個短いという単純な構造となる。このことにより前記
の立体構造やジスルフィド架橋の問題が改善されるもの
と期待される。
本発明者は先にサケ脳下垂体のｍ ＲＮ Ａよりサケ成
長ホルモンをコードするｃＤＮＡを得、その全塩基配列
を決定した〔特開昭６１−１５６９９〕。
長ホルモンをコードするｃＤＮＡを得、その全塩基配列
を決定した〔特開昭６１−１５６９９〕。
またサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡを組み込んだ
組換え体ＤＮＡを含む微生物を培養することにより、培
養物中にサケ成長ホルモンポリペプチドが著量生成Ｍ積
することを見出した（特願昭５９−２１３３６１）。
組換え体ＤＮＡを含む微生物を培養することにより、培
養物中にサケ成長ホルモンポリペプチドが著量生成Ｍ積
することを見出した（特願昭５９−２１３３６１）。
本発明者はさらに研究を進め、サケ成長ホルモ、ンの１
番目から１１９番目または１３０番目までを含むポリペ
プチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ
を作製した。そしてこの組換え体ＤＮＡを含む微生物を
＠養することにより、培養物中に前記のポリペプチドが
著量生成Ｍ債することを見出した。
番目から１１９番目または１３０番目までを含むポリペ
プチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡ
を作製した。そしてこの組換え体ＤＮＡを含む微生物を
＠養することにより、培養物中に前記のポリペプチドが
著量生成Ｍ債することを見出した。
以下本発明の新規サケ成長ホルモンポリペプチド誘導体
を発現させるための組換え体ＤＮＡの作製法と、微生物
中での該ポリペプチドの生産について具体的に説明する
。
を発現させるための組換え体ＤＮＡの作製法と、微生物
中での該ポリペプチドの生産について具体的に説明する
。
本発明の組換え体プラスミドは上記サケ成長ホルモン誘
導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発現機能を持つ
適当なプラスミドに組み込まれたものである。
導体をコードするＤＮＡ断片がＤＮＡの発現機能を持つ
適当なプラスミドに組み込まれたものである。
本発明のサケ成長ホルモン誘導体をコードするＤＮＡ断
片としては、第１表に示されるサケ成長ホルモンをコー
ドするＤＮＡの塩基配列中Ｃ末端から５８〜６９アミノ
酸分、塩基にして１７４〜２０７塩基対（以下ｂｐと略
記する）分欠失した配列を有するものが好ましい。
片としては、第１表に示されるサケ成長ホルモンをコー
ドするＤＮＡの塩基配列中Ｃ末端から５８〜６９アミノ
酸分、塩基にして１７４〜２０７塩基対（以下ｂｐと略
記する）分欠失した配列を有するものが好ましい。
第１表に示されるサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡ
としてはサケ成長ホルモンをコードするメツセンジャー
ＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤ
ＮＡ （サケ成長ホルモンＣＤＮＡ）または染色体ＤＮ
Ａから得られるサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡな
どが利用できる。
としてはサケ成長ホルモンをコードするメツセンジャー
ＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で逆転写して得られるｃＤ
ＮＡ （サケ成長ホルモンＣＤＮＡ）または染色体ＤＮ
Ａから得られるサケ成長ホルモンをコードするＤＮＡな
どが利用できる。
サケ成長ホルモンｃＤＮΔとしては、サケ成長ホルモン
をコードしているものであればいかなるものも用いるこ
とができるが、具体的にはｐｓＧＨＩＢ２ （特願昭５
９−２１３３６１）を用いることができる。ｐｓＧＨｒ
Ｂ２には２連結されたトリプトファンプロモーターの下
流にシャイン・ダルガルノ配列（以下ＳＤ配列と略記す
る）、翻訳開始コドンＡＴＧが配され、その直後に第１
表に示したサケ成長ホルモン遺伝子中成熟型ホルモンを
コードする部分くアミノ酸番号１から１８８）と３′−
非翻訳領域全体が連結されている。
をコードしているものであればいかなるものも用いるこ
とができるが、具体的にはｐｓＧＨＩＢ２ （特願昭５
９−２１３３６１）を用いることができる。ｐｓＧＨｒ
Ｂ２には２連結されたトリプトファンプロモーターの下
流にシャイン・ダルガルノ配列（以下ＳＤ配列と略記す
る）、翻訳開始コドンＡＴＧが配され、その直後に第１
表に示したサケ成長ホルモン遺伝子中成熟型ホルモンを
コードする部分くアミノ酸番号１から１８８）と３′−
非翻訳領域全体が連結されている。
ＤＮＡからの塩基の削除は制限酵素による切断およびヌ
クレアーゼＢＡＬ３１またはＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ
を用いる消化によって行われる。
クレアーゼＢＡＬ３１またはＤ Ｎ ＡポリメラーゼＩ
を用いる消化によって行われる。
サケ成長ホルモン誘導体をコードするＤＮＡを組み込む
プラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡを発現できるも
のならいかなるプラスミドでも使うことができる。好ま
しくは適当なプロモーター例えばｔｒｐ系、ｌａｃ系、
ＰＬ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入するこ
とができ、しかもＳＤ配列と開始コドン（ＡＴＧ）の間
を適当な距離、例えば６〜１８ｂｐに調節したプラスミ
ドを用いることができる。具体的に好適なプラスミドと
しては、ｐＧＥＬｌがあげられる。
プラスミドとしては、大腸菌で該ＤＮＡを発現できるも
のならいかなるプラスミドでも使うことができる。好ま
しくは適当なプロモーター例えばｔｒｐ系、ｌａｃ系、
ＰＬ系のプロモーターの下流に外来ＤＮＡを挿入するこ
とができ、しかもＳＤ配列と開始コドン（ＡＴＧ）の間
を適当な距離、例えば６〜１８ｂｐに調節したプラスミ
ドを用いることができる。具体的に好適なプラスミドと
しては、ｐＧＥＬｌがあげられる。
ｐＧＥＬｌを含有する大腸菌菌株はε５ｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ ＩＧＥＬ ＨＦＥＲＭ ０Ｐ−６２９）
として工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭
和５９年１０月６日付で寄託しである。
ｉａｃｏｌｉ ＩＧＥＬ ＨＦＥＲＭ ０Ｐ−６２９）
として工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に昭
和５９年１０月６日付で寄託しである。
また遺伝子を途中まで欠失させた場合、その位置で翻訳
が停止する構造を付与する必要がある。
が停止する構造を付与する必要がある。
これはその遺伝子由来のアミノ酸配列以外の無関係なア
ミノ酸の付加を避けるためであるが、この目的のために
具体的に好適なプラスミドとしてはｐＫＹＰ２６をあげ
ることができる。ｐＫＹＰ２６にはＫｐｎ Ｉ切断部位
の直後に翻訳終止コドンＴＡＡが３つフレームをずらし
て挿入してあり、Ｋｐｎ１部位に任意の遺伝子を挿入し
た場合、どのフレームに対しても翻訳終止コドンが付与
される形となり確実にこの部位でのペプチド合成を終止
させることができる。ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌はＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＫＹＰ２６（ＦＥＲ
ＭＢＰ−８６３）として微工研に昭和６０年８月８日付
で寄託しである。
ミノ酸の付加を避けるためであるが、この目的のために
具体的に好適なプラスミドとしてはｐＫＹＰ２６をあげ
ることができる。ｐＫＹＰ２６にはＫｐｎ Ｉ切断部位
の直後に翻訳終止コドンＴＡＡが３つフレームをずらし
て挿入してあり、Ｋｐｎ１部位に任意の遺伝子を挿入し
た場合、どのフレームに対しても翻訳終止コドンが付与
される形となり確実にこの部位でのペプチド合成を終止
させることができる。ｐＫＹＰ２６を含む大腸菌はＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＫＹＰ２６（ＦＥＲ
ＭＢＰ−８６３）として微工研に昭和６０年８月８日付
で寄託しである。
第１図に示したごとく、ｐＧＥＬ ｌのＳローＡＴＧ間
の距離を縮め、より発現に好適なベクターを造成した。
の距離を縮め、より発現に好適なベクターを造成した。
ｐＧＥＬＩ Ｃ約３．４キロ塩基対（以下ｋｂと略記す
る）〕をＢａｎ■で切断後、ＤＮＡポリメラーゼ■をｄ
ＡＴＰＳｄＴＴＰ存在下作用させ、その突出末端部分を
削る反応を行う。Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼにより末
端を結合させ環状化させた。このようにして得られたｐ
ＧＥＬｌｏはその５Ｄ−Ａ Ｔ Ｇ Ｉ’Ｊ１の配列を
マキサム・ギルバート法〔プロシイ−ディング・オン・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オン・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ、ｃｉ、）ＵＳＡ
、 ７４．５６０（１９７７） ） ｌ、：よって決定
し、ＡＡＧＧＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡユ旦のｘｏｂｐで
あることが確認された。
る）〕をＢａｎ■で切断後、ＤＮＡポリメラーゼ■をｄ
ＡＴＰＳｄＴＴＰ存在下作用させ、その突出末端部分を
削る反応を行う。Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼにより末
端を結合させ環状化させた。このようにして得られたｐ
ＧＥＬｌｏはその５Ｄ−Ａ Ｔ Ｇ Ｉ’Ｊ１の配列を
マキサム・ギルバート法〔プロシイ−ディング・オン・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オン・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ、ｃｉ、）ＵＳＡ
、 ７４．５６０（１９７７） ） ｌ、：よって決定
し、ＡＡＧＧＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴＡユ旦のｘｏｂｐで
あることが確認された。
ついでｐＧＥＬｌｏをＨｉｎｄＩ［［と１３ａ’ｍＨＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動性にて分画し、ｔｒ
ｐプロモーターおよびリポプロティンターミネータ−１
複製開始点を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収する
。すなわち該断片を含むアガロース片を切出し、２〜３
倍容のフェノールを加え、−２０〜−８０℃にて凍結さ
せる。これを融解し、１５．００Ｏｒｐｍ 、５分間遠
心し、上層の水層を回収する。水層に２倍量のエタノー
ルを加え、ＤＮＡを沈殿回収する。以下このＤＮＡ断片
精製法を“凍結融解法”と略記する。
で切断し、アガロースゲル電気泳動性にて分画し、ｔｒ
ｐプロモーターおよびリポプロティンターミネータ−１
複製開始点を含む約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収する
。すなわち該断片を含むアガロース片を切出し、２〜３
倍容のフェノールを加え、−２０〜−８０℃にて凍結さ
せる。これを融解し、１５．００Ｏｒｐｍ 、５分間遠
心し、上層の水層を回収する。水層に２倍量のエタノー
ルを加え、ＤＮＡを沈殿回収する。以下このＤＮＡ断片
精製法を“凍結融解法”と略記する。
別にｐｓＧＨＩＢ２ （約３．８ｋｂ）を１（ｉｎｄＩ
［Ｉ（部分切断）とＢａｍＨＩで切断し、成熟型ｓＧＨ
をコードする領域を含む約１．ｌｋｂの断片を凍結融解
法にて回収する。
［Ｉ（部分切断）とＢａｍＨＩで切断し、成熟型ｓＧＨ
をコードする領域を含む約１．ｌｋｂの断片を凍結融解
法にて回収する。
上述したようにｐＧＥＬ １０のＨｉｎｄｌ］ｌ−１１
−１３ａ断片、ｐｓＣ，ＨＩＢ２の）ＩｉｍｄｌＩＩ−
１３ａｍ）（Ｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し
ｐｓＧＨＩＭ’ｌを得た。ｐｓＧＨＩＭｌの構造は５Ｄ
−ＡＴＧ間の構造が 易匹ＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴ匹であ
る以外はｐｓＧＨＩＢ２と同じである。
−１３ａ断片、ｐｓＣ，ＨＩＢ２の）ＩｉｍｄｌＩＩ−
１３ａｍ）（Ｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し
ｐｓＧＨＩＭ’ｌを得た。ｐｓＧＨＩＭｌの構造は５Ｄ
−ＡＴＧ間の構造が 易匹ＧＴＡＴＡＡＧＣＴＴ匹であ
る以外はｐｓＧＨＩＢ２と同じである。
次にｐｓＣ，ＨＩＭＩをｐｖｕ［で切断後、ヌクレアー
ゼＢＡＬ３１で末端から削り、さらにＳａｌ Ｉで切断
する。凍結融解法により１８０Ｊ１〜２３０ｂｐの断片
を回収する。
ゼＢＡＬ３１で末端から削り、さらにＳａｌ Ｉで切断
する。凍結融解法により１８０Ｊ１〜２３０ｂｐの断片
を回収する。
別にｐｓＧＨＩＭｌを３ａｆ ＩとＰｓｔｌで切断し、
サケ成長ホルモン成熟ポリペプチドのＮ末端付近をコー
ドする領域と、ｔｒｐプロモーターを含む約１．２ｋｂ
の断片を凍結融解法にて回収する。
サケ成長ホルモン成熟ポリペプチドのＮ末端付近をコー
ドする領域と、ｔｒｐプロモーターを含む約１．２ｋｂ
の断片を凍結融解法にて回収する。
さらにｐＫＹＰ２６（約２．６ ｋｂ）をＫｐｎ Ｉ切
断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて突出末端を削り平滑
末端とする。ＰｓｔＩで切断して、翻訳終止コドン、リ
ポプロティンターミネータ、複製開始点を含む約１，７
ｋｂの断片を回収した。
断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて突出末端を削り平滑
末端とする。ＰｓｔＩで切断して、翻訳終止コドン、リ
ポプロティンターミネータ、複製開始点を含む約１，７
ｋｂの断片を回収した。
上記のように精製したｐｓＧＨＩＭｌのＳａｌＩ−ＢＡ
Ｌ３１断片、ｐｓＧＨＩＭｌのＰｓｔＩ−５ａｆＩ断片
、ｐＫＹＰ２６のＫｐｎｌ−ＰｓｔＴ断片の３者を７４
Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼにより連結し、ｐｓＧＨＩＱ
ｌｌ、ｐｓＣ，ＨＩＱ１５を得る。
Ｌ３１断片、ｐｓＧＨＩＭｌのＰｓｔＩ−５ａｆＩ断片
、ｐＫＹＰ２６のＫｐｎｌ−ＰｓｔＴ断片の３者を７４
Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼにより連結し、ｐｓＧＨＩＱ
ｌｌ、ｐｓＣ，ＨＩＱ１５を得る。
ｐｓＧＨＩＱｌｌは成熟型サケ成長ホルモンのＮ末端か
ら１３０番目までのアミノ酸、ｐｓＧＨＩＱ１５は１１
９番目までのアミノ酸にベクター由来の３アミノ酸の付
加した形のペプチドをコードするＤＮＡを含む。
ら１３０番目までのアミノ酸、ｐｓＧＨＩＱ１５は１１
９番目までのアミノ酸にベクター由来の３アミノ酸の付
加した形のペプチドをコードするＤＮＡを含む。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
■のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍ
Ｍ）のトリｘ−ＨＣＩｌ （ｐＨ６，０〜９．５好ま
しくはｐＨ７，０〜８．０）、Ｏ〜２００ｄのＮａＣ１
，２〜３０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍ１わのＭｇＣ
１ｘを含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単位（
好ましくは１■のＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、
２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる
）において、１５分間〜２４時間行う。反応の停止は、
通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによる
が、フェノールまたはジエチルピロカーボネートなどの
試薬により制限酵素を失活させる方法も用いることがで
きる。
■のＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０ｍ
Ｍ）のトリｘ−ＨＣＩｌ （ｐＨ６，０〜９．５好ま
しくはｐＨ７，０〜８．０）、Ｏ〜２００ｄのＮａＣ１
，２〜３０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍ１わのＭｇＣ
１ｘを含む反応液中で、制限酵素０．１〜１００単位（
好ましくは１■のＤＮＡに対して１〜３単位）を用い、
２０〜７０℃（至適温度は用いる制限酵素により異なる
）において、１５分間〜２４時間行う。反応の停止は、
通常５５〜７５℃で、５〜３０分間加熱することによる
が、フェノールまたはジエチルピロカーボネートなどの
試薬により制限酵素を失活させる方法も用いることがで
きる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法（Ｌ、 Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｌ：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ９８．３０５（１９７９）以下ＬＧＴ法という〕や
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、前述の凍結融解法
などによって行う。
点アガロースゲル電気泳動法（Ｌ、 Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｌ：＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ９８．３０５（１９７９）以下ＬＧＴ法という〕や
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、前述の凍結融解法
などによって行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
１０〜４０ｍＭ）のトリｘ−Ｈ（Ｊ！ （ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０ｍ
Ｍ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ ｇ Ｃｉ ２．０
．１〜１０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．０ｍＭ）のＡ
ＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）のジ
チオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮ＾リガー
ゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３
〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）行う。
１０〜４０ｍＭ）のトリｘ−Ｈ（Ｊ！ （ｐＨ６，１〜
９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０ｍ
Ｍ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭ ｇ Ｃｉ ２．０
．１〜１０ｍＭ（好ましくは０．５〜２．０ｍＭ）のＡ
ＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｍＭ）のジ
チオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮ＾リガー
ゼ０．３〜１０単位を用い、１〜３７℃（好ましくは３
〜２０℃）で１５分間〜７２時間（好ましくは２〜２０
時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法Ｃ５゜Ｎ、 Ｃｏ
ｈｅｎら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、、 ＬＩＳＡ ６９゜２１１０ （１９７２） ）に
よって、大腸菌に導入する。
必要によりＣｏｈｅｎらの形質転換法Ｃ５゜Ｎ、 Ｃｏ
ｈｅｎら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、、 ＬＩＳＡ ６９゜２１１０ （１９７２） ）に
よって、大腸菌に導入する。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
ユ、 １５１３（１９７９）Ｅなどを用いて行う。
単離は、Ｂｉｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍら： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
ユ、 １５１３（１９７９）Ｅなどを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
さろにＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキ
サム拳ギルバート法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。
サム拳ギルバート法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ。
Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、７４．５６０（１９７７） ）ま
たはＭ１３ファージを用いたサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ
ら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
たはＭ１３ファージを用いたサンガー法（Ｓａｎｇｅｒ
ら：Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、［ＩＳＡ、、 ７４ 、５４６３
（１９７７） ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ１３ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ）によって決定する。
（１９７７） ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ１３ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ ）によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
ることができる。
本発明のサケ成長ホルモンポリペプチドは以下のとおり
に製造できる。
に製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐｓＧＨＩＱｌｌ）を用
いて大腸ｍＫ−１２ＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピ
シリン耐性（＾ｐＨ以下同じ）のコロニーの中からｐｓ
ＧＨＩＱｌｌを有する大腸菌を選びだす。
いて大腸ｍＫ−１２ＨＢＩＯＩを形質転換させ、アンピ
シリン耐性（＾ｐＨ以下同じ）のコロニーの中からｐｓ
ＧＨＩＱｌｌを有する大腸菌を選びだす。
ｐｓＧＦＩＩＱｌｌを有する大腸菌を培地に培養するこ
とにより培養物中にサケ成長ホルモンポリペプチド誘導
体を生成させることができる。
とにより培養物中にサケ成長ホルモンポリペプチド誘導
体を生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにサケ成
長ホルモンポリペプチド誘導体の生産に好適なものなら
ば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
長ホルモンポリペプチド誘導体の生産に好適なものなら
ば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、Ｎ Ｈ＜ Ｃβ、（ＮＨ４）２ Ｓ
０４ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉
エキス、バタトトリブトン、コーン・ステイープ・リカ
ーなどが、その他の栄ＩＦ。
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、Ｎ Ｈ＜ Ｃβ、（ＮＨ４）２ Ｓ
０４ 、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉
エキス、バタトトリブトン、コーン・ステイープ・リカ
ーなどが、その他の栄ＩＦ。
とじては、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨｉＰＯ＜ 、ＮａＣＡ。
Ｍｇ５Ｏ，、ビタミンＢ、 、ＭｇＣＬ などが使用で
きる。
きる。
培養はｐ Ｈ５，５〜８．５、温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。
攪拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にサケ成長ホルモンポリ
ペプチド誘導体が蓄積するので、培養物から菌体を集菌
し、菌体を超音波処理により破砕し、遠心して得られる
菌体残渣を得る。この菌体残渣よりマーストンらの方法
ＣＦ、＾、０． Ｍａｒｓｔｏｎｅｔ、 ａｌ、 ：Ｂ
ＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２ 、８００（１９８
４） ）によりサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体を
抽出、精製、可溶化、再生し、伊藤らの方法（特願昭６
Ｏ−１６１４２８） に従い稚魚を用いた成長促進活性
を測定する。
ペプチド誘導体が蓄積するので、培養物から菌体を集菌
し、菌体を超音波処理により破砕し、遠心して得られる
菌体残渣を得る。この菌体残渣よりマーストンらの方法
ＣＦ、＾、０． Ｍａｒｓｔｏｎｅｔ、 ａｌ、 ：Ｂ
ＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２ 、８００（１９８
４） ）によりサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体を
抽出、精製、可溶化、再生し、伊藤らの方法（特願昭６
Ｏ−１６１４２８） に従い稚魚を用いた成長促進活性
を測定する。
また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接Ｌａｅｍｍ
ｌｉ のサンプルバッファ −（Ｌａｅｍｍｌｉ ：
Ｎａｔｕｒｅ。
ｌｉ のサンプルバッファ −（Ｌａｅｍｍｌｉ ：
Ｎａｔｕｒｅ。
２２７ 、６８０（１９７０）］に加熱溶解後、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉの方法：
同上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー染色に
よって行う。
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉの方法：
同上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー染色に
よって行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１． ５Ｄ−ＡＴＣ，間の距離が１０ｂｐである
ｐＧＥＬＩＯの造成： ｐＣ，ＥＬＩ （約３．４ｋｂ） ３Ａｇを２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣＪ
！２および１００ｍＭ Ｎａ（ｌを含む溶液（以下″
Ｙ−１００緩衝液”と略記する）４０ＡＩ！に溶かし、
Ｂａｎｍ（東洋紡績社製）５単位を加え３７℃、３時間
消化反応を行った。該反応液をフェノール抽出し、エタ
ノール沈殿にてＢａｎＩ［Ｉ部位−ケ所で切断されたｐ
ＧＥＬｌ 約２．４雌を得た。このＤＮＡ断片約２．
４雌を５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，８）、７ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ（１２および６ｍＭメルカプトエタ
ノールを含む溶液（以下“ＤＮＡポリメラーゼ緩衝緩衝
液絡記する）５０４に溶かし、ｄＡＴＰ。
ｐＧＥＬＩＯの造成： ｐＣ，ＥＬＩ （約３．４ｋｂ） ３Ａｇを２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣＪ
！２および１００ｍＭ Ｎａ（ｌを含む溶液（以下″
Ｙ−１００緩衝液”と略記する）４０ＡＩ！に溶かし、
Ｂａｎｍ（東洋紡績社製）５単位を加え３７℃、３時間
消化反応を行った。該反応液をフェノール抽出し、エタ
ノール沈殿にてＢａｎＩ［Ｉ部位−ケ所で切断されたｐ
ＧＥＬｌ 約２．４雌を得た。このＤＮＡ断片約２．
４雌を５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，８）、７ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ（１２および６ｍＭメルカプトエタ
ノールを含む溶液（以下“ＤＮＡポリメラーゼ緩衝緩衝
液絡記する）５０４に溶かし、ｄＡＴＰ。
ｄＴＴＰをそれぞれ１ｍＭになるよう加え、さらに５単
位のＤＮＡＮＡポリメラーゼューイングランドバイオラ
ブズ社製）を加えて、３７℃、３０分間反応させて、突
出末端を削った。フェノール抽出、エタノール沈殿によ
り、ＤＮＡ断片約２、ＯＮを回収した。該ＤＮＡ断片１
■を２０ｍＭトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，６）、１
０ｍＭ ＭｇＣｊ！２、ｌＱｍＭジチオスレイトール
および１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下“Ｔ４”Ｊ
ガーゼ緩衝液”と略記する）３０ＪｔＩｌに溶かし、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製二以下同じ）を
加え４℃１８時間結合反応を行った。該反応液を用い、
大腸菌）１８１０１株（Ｂｏｌｉｖｅｒ ｅｔ、ａｌ、
： Ｇｅｎｅ、 ２．７５（１９７７））をＣｏｈｅ
ｎらの方法（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ、ａｌ、 ：Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ［ＩＳＡ
、 ６９．２１１０（１９７２）］（以下大腸菌の形質
転換にはこの方法を用いる）により形質転換し、Ａ ｐ
ｌのコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを公知の方法（ＨｌＣｌＢｉｒｎｂｏｉｍ ｅｔ
、ａｌ、： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
位のＤＮＡＮＡポリメラーゼューイングランドバイオラ
ブズ社製）を加えて、３７℃、３０分間反応させて、突
出末端を削った。フェノール抽出、エタノール沈殿によ
り、ＤＮＡ断片約２、ＯＮを回収した。該ＤＮＡ断片１
■を２０ｍＭトリス−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，６）、１
０ｍＭ ＭｇＣｊ！２、ｌＱｍＭジチオスレイトール
および１ｍＭ ＡＴＰを含む緩衝液（以下“Ｔ４”Ｊ
ガーゼ緩衝液”と略記する）３０ＪｔＩｌに溶かし、２
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製二以下同じ）を
加え４℃１８時間結合反応を行った。該反応液を用い、
大腸菌）１８１０１株（Ｂｏｌｉｖｅｒ ｅｔ、ａｌ、
： Ｇｅｎｅ、 ２．７５（１９７７））をＣｏｈｅ
ｎらの方法（Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ、ａｌ、 ：Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ［ＩＳＡ
、 ６９．２１１０（１９７２）］（以下大腸菌の形質
転換にはこの方法を用いる）により形質転換し、Ａ ｐ
ｌのコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
ＤＮＡを公知の方法（ＨｌＣｌＢｉｒｎｂｏｉｍ ｅｔ
、ａｌ、： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
ユ、１５１３（１９７９）） （以下プラスミドＤＮ
Ａの分離はこの方法による）に従って分離し、ｐＧＥＬ
ｌｏ（約３．４ｋｂ）を得た。ｐＧＥＬｌｏの構造はＥ
ｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、Ｈｉｎｄｕ、Ｅ３ａｍＨＩで切断
してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
Ａの分離はこの方法による）に従って分離し、ｐＧＥＬ
ｌｏ（約３．４ｋｂ）を得た。ｐＧＥＬｌｏの構造はＥ
ｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ、Ｈｉｎｄｕ、Ｅ３ａｍＨＩで切断
してアガロースゲル電気泳動にて確認した。
またｔｒｐプロモーター下流のＳＤ配列からインターフ
ェロン−γ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに至る塩基配
列はマキサム・ギルバート法〔Ｐｒｏｃ。
ェロン−γ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに至る塩基配
列はマキサム・ギルバート法〔Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＩＩ Ｓ Ａ、、
７４ 、５６０（１９７７） 〕に実施例２． サケ
成長ホルモン発現プラスミドｐ ｓ Ｇ ＨＩ Ｍ １
の造成： 実施例１で辱だｐＧＥＬｌｏ ５趨をＹ−１００緩衝
液４０ｍに溶かし、ＨｉｎｄＩｌｌ、１３ｍｍＨＩ（宝
酒造社製二以下特記しないかぎり制限酵素はすべて全酒
造社製を用いた）各々１０単位を加え３７℃３時間切断
反応を行った。該反応液からｔｒｐプロモータ一部分お
よび複製開始点、リボプロティンターミネータを含む約
２．７ｋｂ（ＤＤＮＡ断片約２ｇを凍結融解法にて回収
した。
７４ 、５６０（１９７７） 〕に実施例２． サケ
成長ホルモン発現プラスミドｐ ｓ Ｇ ＨＩ Ｍ １
の造成： 実施例１で辱だｐＧＥＬｌｏ ５趨をＹ−１００緩衝
液４０ｍに溶かし、ＨｉｎｄＩｌｌ、１３ｍｍＨＩ（宝
酒造社製二以下特記しないかぎり制限酵素はすべて全酒
造社製を用いた）各々１０単位を加え３７℃３時間切断
反応を行った。該反応液からｔｒｐプロモータ一部分お
よび複製開始点、リボプロティンターミネータを含む約
２．７ｋｂ（ＤＤＮＡ断片約２ｇを凍結融解法にて回収
した。
別にｐｓＧＨＩＢ２ Ｃ参考例１の方法で製造〕（約３
．８ｋｌ））約５μｇを４０ｄのＹ−１００緩衝液に溶
かし１０単位のＢａｍＨＩを加え３７℃３時間反応を行
い、完全に切断し、さらにＨｉ ｎｄ１１１１単位を加
え３７℃３０分間反応を行いＨｉｎｄＩ［［による部分
切断を行った。該反応液より凍結融解法により成熟型サ
ケ成長ホルモンをコードする約１、ｌｋｂのＤＮＡ断片
約０．７河を回収した。
．８ｋｌ））約５μｇを４０ｄのＹ−１００緩衝液に溶
かし１０単位のＢａｍＨＩを加え３７℃３時間反応を行
い、完全に切断し、さらにＨｉ ｎｄ１１１１単位を加
え３７℃３０分間反応を行いＨｉｎｄＩ［［による部分
切断を行った。該反応液より凍結融解法により成熟型サ
ケ成長ホルモンをコードする約１、ｌｋｂのＤＮＡ断片
約０．７河を回収した。
上記のように回収したｐＧＥＬ １０のＤＮＡ断片約０
．１埒とｐｓＧＨＩＢ２のＤＮＡ断片約０．２河とを３
０ｍのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
．１埒とｐｓＧＨＩＢ２のＤＮＡ断片約０．２河とを３
０ｍのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし、２単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、得
られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを回収し、ｐｓＧ
ＨＩＭｌを得た。
られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを回収し、ｐｓＧ
ＨＩＭｌを得た。
ｐｓＧＩ（ｆＭｌの構造はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｆ
、ＢａｍＨＬＰｓｔｌで切断してアガロースゲル電気泳
動にて確認した。
、ＢａｍＨＬＰｓｔｌで切断してアガロースゲル電気泳
動にて確認した。
実施例３、 サケ成長ホルモン誘導体ポリペプチドをコ
ードするｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱ１５の造成： 実施例２で得たｐｓＧＨＩＭ１約１０■を２０ｍＭトリ
スＨＣ１（１）Ｉ（７，５）、１０ｍ１４ ＭｇＣ１
ｘおよび５０ｍＭ Ｎａ’ＣＩ２を含む溶液（以下“
Ｙ−５０緩衝液”と略記する’） １００ 、ｄに溶か
しＰｖｕＩＩ（全酒造社製）２０単位を加え、３７℃
３時間切断反応を行った。該反応液からフェノール抽出
、エタノール沈殿にて約８■のＤＮＡを回収した。
ードするｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱ１５の造成： 実施例２で得たｐｓＧＨＩＭ１約１０■を２０ｍＭトリ
スＨＣ１（１）Ｉ（７，５）、１０ｍ１４ ＭｇＣ１
ｘおよび５０ｍＭ Ｎａ’ＣＩ２を含む溶液（以下“
Ｙ−５０緩衝液”と略記する’） １００ 、ｄに溶か
しＰｖｕＩＩ（全酒造社製）２０単位を加え、３７℃
３時間切断反応を行った。該反応液からフェノール抽出
、エタノール沈殿にて約８■のＤＮＡを回収した。
該ＤＮＡ約８肩を１０ｍＭ）リス−ＨＣ（！ （ｐＨ８
，１）、３００ｍＭ ＮａＣｊ２．５ｍＭ ＣａＣ
ｌ２．６ｍＭＭｇＣ１ｚ 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡよ
りなる溶液５０４に溶かし、ヌクレアーゼＢＡＬ３１（
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製〕
０．２単位を加え、３０℃で４０秒間反応を行った。
，１）、３００ｍＭ ＮａＣｊ２．５ｍＭ ＣａＣ
ｌ２．６ｍＭＭｇＣ１ｚ 、０．５ｍＭ ＥＤＴＡよ
りなる溶液５０４に溶かし、ヌクレアーゼＢＡＬ３１（
ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製〕
０．２単位を加え、３０℃で４０秒間反応を行った。
ヌクレアーゼＢΔＬ３１はＤＮＡ分子を末鎖から削って
ゆく活性（エキソヌクレアーゼ活性）を有し、上記用い
た反応条件はＰｖｕ１１部位から１５〜５０ｂｐ削れる
条件である。この反応液をフェノール抽出、クロロホル
ム抽出後エタノール沈殿により、約２．５肩のＤＮＡ断
片を回収した。該ＤＮＡ＠片約２．５ｇを２０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ｌＡｇＣ１２
，１５０ｍＭ ＮａＣ１を含む４０ｍの緩衝液に溶か
し、５単位の５ａＡＩ（宝酒造社製二以下同じ）を加え
、３７℃３時間切断反応を行った。該反応液より凍結融
解法により、１８０ｂｐ〜２３０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐ
ｓＣ，ＨＩＭＩ−ＰｖｕＩ［−ＢＡＬ３１−５ａｌ Ｉ
断片）約０．１ｄを回収した。
ゆく活性（エキソヌクレアーゼ活性）を有し、上記用い
た反応条件はＰｖｕ１１部位から１５〜５０ｂｐ削れる
条件である。この反応液をフェノール抽出、クロロホル
ム抽出後エタノール沈殿により、約２．５肩のＤＮＡ断
片を回収した。該ＤＮＡ＠片約２．５ｇを２０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ｌＡｇＣ１２
，１５０ｍＭ ＮａＣ１を含む４０ｍの緩衝液に溶か
し、５単位の５ａＡＩ（宝酒造社製二以下同じ）を加え
、３７℃３時間切断反応を行った。該反応液より凍結融
解法により、１８０ｂｐ〜２３０ｂｐのＤＮＡ断片（ｐ
ｓＣ，ＨＩＭＩ−ＰｖｕＩ［−ＢＡＬ３１−５ａｌ Ｉ
断片）約０．１ｄを回収した。
次にｐｓＧＨＩＭｌ ５１Ｊｌを３０ＪｔＩ！のＹ−
１００緩衝液に溶かし、ＰｓｔＩｌＯ単位を加え３７℃
、３時間切断反応を行った。該反応液に０．３ｍの５Ｍ
ＮａＣ１溶液を加え、ＮａＣ１の＃濃度を約１５０
ｍＭとして５ａｆ１１０単位を加えて３７℃、３時間切
断反応を行った。該反応液より凍結融解法にて約１２０
０ｂｐのＤＮＡ断片約０．７Ｍ１ｇを回収した。該ＤＮ
Ａ断片にはｔｒｐプロモーターと成熟型サケ成長ホルモ
ンのＮ末端部分をコードする領域が含まれる。（ｐ ｓ
ＧＨＩ Ｍ １−５ａｆ Ｉ −ＰｓｔＩ断片）。
１００緩衝液に溶かし、ＰｓｔＩｌＯ単位を加え３７℃
、３時間切断反応を行った。該反応液に０．３ｍの５Ｍ
ＮａＣ１溶液を加え、ＮａＣ１の＃濃度を約１５０
ｍＭとして５ａｆ１１０単位を加えて３７℃、３時間切
断反応を行った。該反応液より凍結融解法にて約１２０
０ｂｐのＤＮＡ断片約０．７Ｍ１ｇを回収した。該ＤＮ
Ａ断片にはｔｒｐプロモーターと成熟型サケ成長ホルモ
ンのＮ末端部分をコードする領域が含まれる。（ｐ ｓ
ＧＨＩ Ｍ １−５ａｆ Ｉ −ＰｓｔＩ断片）。
さらにｐＫＹＰ２６（約２，６ｋｂ）５■を２０ｍＭ）
すｘ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）１．１０ｍＭＶＩｇＣ
Ｌ 、１０ｍＭ ＮａＣｊ！を含む全量４０ｇの溶液
に溶かし、１０単位のＫｐｎＩ（全酒造社製）を加え３
７℃３時間切断反応を行った。該反応液からフェノール
抽出後エタノール沈殿により約４■のＫｐｎ Ｉ切断ｐ
ＫＹＰ２６断片を回収した。該ＤＮＡ断片を６７ｍＭ）
リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，８）、６．７ｍＭ Ｍｇ（１
！２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１６．７
ｍ Ｍ （Ｎｌ（４） ２ Ｓ Ｏ４，６，７ＭＭ
ＥＤＴＡおよび各々１ｍＭのｄＡＴＰ。
すｘ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）１．１０ｍＭＶＩｇＣ
Ｌ 、１０ｍＭ ＮａＣｊ！を含む全量４０ｇの溶液
に溶かし、１０単位のＫｐｎＩ（全酒造社製）を加え３
７℃３時間切断反応を行った。該反応液からフェノール
抽出後エタノール沈殿により約４■のＫｐｎ Ｉ切断ｐ
ＫＹＰ２６断片を回収した。該ＤＮＡ断片を６７ｍＭ）
リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，８）、６．７ｍＭ Ｍｇ（１
！２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１６．７
ｍ Ｍ （Ｎｌ（４） ２ Ｓ Ｏ４，６，７ＭＭ
ＥＤＴＡおよび各々１ｍＭのｄＡＴＰ。
ｄＴＴＰＳｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを含む溶液２０頭に溶か
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製）２単位を加
え、３７℃１時間反応を行った。
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製）２単位を加
え、３７℃１時間反応を行った。
この反応によりＫｐｎ Ｉ切断により生じたＤＮＡ断片
の突出末端が削られ平滑末端となる。該反応液よりフェ
ノール抽出、エタノール沈殿により約３．２贋のＫｐｎ
Ｉ切断−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ｐＫＹＰ２６断片
を回収した。該ＤＮＡ断片全量を４ｈＪ！のＹ−１００
緩衝液に溶かし６単位のＰｓｌＩを加え、３７℃、３時
間切断反応を行った。該反応液より凍結融解法により翻
訳終止コドン、リボプロティンターミネータ、複製開始
点を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片（ｐＫＹＰ２６−Ｋｐ
ｎｌ−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ−ＰｓｔＩ断片）約１．
０■を回収した。
の突出末端が削られ平滑末端となる。該反応液よりフェ
ノール抽出、エタノール沈殿により約３．２贋のＫｐｎ
Ｉ切断−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理ｐＫＹＰ２６断片
を回収した。該ＤＮＡ断片全量を４ｈＪ！のＹ−１００
緩衝液に溶かし６単位のＰｓｌＩを加え、３７℃、３時
間切断反応を行った。該反応液より凍結融解法により翻
訳終止コドン、リボプロティンターミネータ、複製開始
点を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片（ｐＫＹＰ２６−Ｋｐ
ｎｌ−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ−ＰｓｔＩ断片）約１．
０■を回収した。
以上のように調製した３断片ｐｓＧＨＩＭ１−ＰｖｕＩ
Ｉ−ＢＡＬ３１−３ａｆ Ｉ断片、ｐｓＧＩＩＩＭｌ−
３ａｊ２ Ｉ−Ｐｓ ｔ Ｉ断片、ｐＫＹＰ ２６−Ｋ
ｐｎｌ −Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ−Ｐ ｓ ｔ Ｉ断
片、各々０．１■、０．０１１１ｇ、 ０．００５μｇ
を３０４のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし２単位のＴ４Ｄ
ＮΔリガーゼを加え、４℃１６時間結時間芯を行った。
Ｉ−ＢＡＬ３１−３ａｆ Ｉ断片、ｐｓＧＩＩＩＭｌ−
３ａｊ２ Ｉ−Ｐｓ ｔ Ｉ断片、ｐＫＹＰ ２６−Ｋ
ｐｎｌ −Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ−Ｐ ｓ ｔ Ｉ断
片、各々０．１■、０．０１１１ｇ、 ０．００５μｇ
を３０４のＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし２単位のＴ４Ｄ
ＮΔリガーゼを加え、４℃１６時間結時間芯を行った。
該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換し、得
られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを回収しサケ成長
ホルモンポリペプチド誘導体をコードする、ｐｓＧＨＩ
Ｑｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５を得た。ｐｓＧＨＩＱＩ Ｌ
ｐｓＧＨＩＱＩ ５の構造は５ａｊ２１、ＥｃｏＲＩ
ＳＨｉｎｄＩＩＩ、１３ａｍＨＩ、Ｐｓ ｔ ｌ５Ｐｖ
ｕ［で切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。さ
らにこれら３種のプラスミドの構造はサケ成長ホルモン
誘導体のＣ末端部分をコードする領域のみが異なると予
想されるため、Ｍ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ）法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ１７４
、５４６３（１９７７） ： ＾ｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ
１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｈａｎｄｂｏｏｋ ）により該領域の塩基配列を決定
した。その結果、ｐｓＧＨＩＱｌｌではサケ成長ホルモ
ンのＣ末端から５８アミノ酸が除かれた形、ｐｓＧＨＩ
ＱＩ５では６９アミノ酸が除かれ、ｐ Ｋ Ｙ Ｐ２６
由来の３アミノ酸が付加した形のポリペプチドをそれぞ
れコードしていることが明らかとなった。これらのプラ
スミドに含まれるサケ成長ホルモンの領域の３′末端を
第１表に示した。
られたコロニーよりプラスミドＤＮＡを回収しサケ成長
ホルモンポリペプチド誘導体をコードする、ｐｓＧＨＩ
Ｑｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５を得た。ｐｓＧＨＩＱＩ Ｌ
ｐｓＧＨＩＱＩ ５の構造は５ａｊ２１、ＥｃｏＲＩ
ＳＨｉｎｄＩＩＩ、１３ａｍＨＩ、Ｐｓ ｔ ｌ５Ｐｖ
ｕ［で切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。さ
らにこれら３種のプラスミドの構造はサケ成長ホルモン
誘導体のＣ末端部分をコードする領域のみが異なると予
想されるため、Ｍ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａ
ｎｇｅｒ）法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ１７４
、５４６３（１９７７） ： ＾ｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ
１３ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｈａｎｄｂｏｏｋ ）により該領域の塩基配列を決定
した。その結果、ｐｓＧＨＩＱｌｌではサケ成長ホルモ
ンのＣ末端から５８アミノ酸が除かれた形、ｐｓＧＨＩ
ＱＩ５では６９アミノ酸が除かれ、ｐ Ｋ Ｙ Ｐ２６
由来の３アミノ酸が付加した形のポリペプチドをそれぞ
れコードしていることが明らかとなった。これらのプラ
スミドに含まれるサケ成長ホルモンの領域の３′末端を
第１表に示した。
ｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５にコードされるポ
リペプチドはそれぞれ１３０アミノ酸、１１９ （＋ｐ
ＫＹＰ２６由来３）アミノ酸からなっていた。
リペプチドはそれぞれ１３０アミノ酸、１１９ （＋ｐ
ＫＹＰ２６由来３）アミノ酸からなっていた。
プラスミドｐｓＧＨＩＱ１１及びｐｓＧＨＩＱＩ５を含
む大腸菌はそれぞれε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
εＳＩＪＩＱ１１（ＦＥＲＭ ０Ｐ−１０２０＞及びＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＳＧＨＩＱ１５（
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２１）として昭和６１年４月２３
日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄
託されている。
む大腸菌はそれぞれε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
εＳＩＪＩＱ１１（ＦＥＲＭ ０Ｐ−１０２０＞及びＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＳＧＨＩＱ１５（
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２１）として昭和６１年４月２３
日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄
託されている。
実施例４゜
ｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５を含む大腸菌によ
るサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体の大量生産 実施例３で得た組換え体プラスミドｐｓＧ旧口１１、ｐ
ｓＧＨＩＱＩ５を用い常法により大腸菌Ｗ３１１０ｓｔ
ｒＡ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−，７３２）を形質転換した
。得られたＡ 、ｌコロニーを３ｍｌのＭＣＧ培地〔０
，６％Ｎａ２１（ＰＯイｏ、 ３％ＫＨ２ＰＯ４，０，
５％ＮａＣ１，０，１％ ＮＨ，（１，０，５％グルコ
ース、０．５％カザミノ酸、１ｍＭ Ｍｇ５Ｏ＜ 、
４ｇ／ｍｌビタミ７Ｂ＋ 、ｐＨ７，２）に接種し、３
０℃で１８時間振盪培養した。得られた培養液を８．０
０ Ｏｒｌ）ｍ 、 １０分間遠心して菌体を回収し
た。
るサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体の大量生産 実施例３で得た組換え体プラスミドｐｓＧ旧口１１、ｐ
ｓＧＨＩＱＩ５を用い常法により大腸菌Ｗ３１１０ｓｔ
ｒＡ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−，７３２）を形質転換した
。得られたＡ 、ｌコロニーを３ｍｌのＭＣＧ培地〔０
，６％Ｎａ２１（ＰＯイｏ、 ３％ＫＨ２ＰＯ４，０，
５％ＮａＣ１，０，１％ ＮＨ，（１，０，５％グルコ
ース、０．５％カザミノ酸、１ｍＭ Ｍｇ５Ｏ＜ 、
４ｇ／ｍｌビタミ７Ｂ＋ 、ｐＨ７，２）に接種し、３
０℃で１８時間振盪培養した。得られた培養液を８．０
０ Ｏｒｌ）ｍ 、 １０分間遠心して菌体を回収し
た。
この菌体をＬａｅ＋ｒ＋ｍ ｌ ｉのサンプルバッファ
ーに懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色した。
ーに懸濁後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行い、クマシーブリリアントブルーにて染色した。
その結果分子量１５．０００ （ｐｓＧ）ＩＩＱＩＩ）
、１３．８００（ｐｓＧ旧０１５）のタンパク質のバン
ドを検出した。これらのバンドはプラスミドを有さない
大腸菌では検出されず、さらにその分子量はアミノ酸数
より計算した値とほぼ一致するため、これらのプラスミ
ドにコードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体
であると推定された。
、１３．８００（ｐｓＧ旧０１５）のタンパク質のバン
ドを検出した。これらのバンドはプラスミドを有さない
大腸菌では検出されず、さらにその分子量はアミノ酸数
より計算した値とほぼ一致するため、これらのプラスミ
ドにコードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体
であると推定された。
実施例５゜
サケ成長ホルモンポリペプチド誘導体のヒラメ稚魚に対
する成長促進活性： ｐｓＧ）ＩＩＱＩＩ、ｐｓＣ，ＨＩＱＩ５を保存する大
腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株を実施例４の方法に従い培養
し培養液を８．００ Ｏｒｐｍ 、 １０分間遠心して
集菌後、３０ｍＭ ＮａＣ１を含む３０ｍＭトリス−
Ｈ（ｌ緩衝液（ｐＨ７，５）にて２回洗浄した。洗浄菌
体を上記緩衝液ＩＱｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕〔
ブランソン・ソニック・パワー中カンパニー （Ｂｒａ
ｎｓｏｎ ５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）
社ソニファイア・セル・ディスラブター（Ｓｏｎｉｆｉ
ｅｒｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ） ２００、アウ
トプット・コントロール（ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ） ２、ｌＯ分間処理〕した。
する成長促進活性： ｐｓＧ）ＩＩＱＩＩ、ｐｓＣ，ＨＩＱＩ５を保存する大
腸菌Ｗ３１１０ｓｔｒＡ株を実施例４の方法に従い培養
し培養液を８．００ Ｏｒｐｍ 、 １０分間遠心して
集菌後、３０ｍＭ ＮａＣ１を含む３０ｍＭトリス−
Ｈ（ｌ緩衝液（ｐＨ７，５）にて２回洗浄した。洗浄菌
体を上記緩衝液ＩＱｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕〔
ブランソン・ソニック・パワー中カンパニー （Ｂｒａ
ｎｓｏｎ ５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）
社ソニファイア・セル・ディスラブター（Ｓｏｎｉｆｉ
ｅｒｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ） ２００、アウ
トプット・コントロール（ｏｕｔｐｕｔ ｃｏｎｔｒｏ
ｌ） ２、ｌＯ分間処理〕した。
これを１５．００ Ｏｒｐｍ 、 ３０分間遠心して菌
体残渣を得た。この菌体残渣からマーストンらの方法（
Ｆ、Ａ、０．１Ｊａｒｓｔｏｎ ｅｔ、ａｌ、 Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、 ２゜８００ （１９８４）
）により上記３種のサケ成長ホルモンポリペプチド誘導
体を抽出・精製した。
体残渣を得た。この菌体残渣からマーストンらの方法（
Ｆ、Ａ、０．１Ｊａｒｓｔｏｎ ｅｔ、ａｌ、 Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、 ２゜８００ （１９８４）
）により上記３種のサケ成長ホルモンポリペプチド誘導
体を抽出・精製した。
得られたポリペプチドを用い、下記のとおりヒラメ稚魚
（ふ化後日令９９日）に対する成長促進活性を測定した
。
（ふ化後日令９９日）に対する成長促進活性を測定した
。
すなわち、ヒラメ２００匹に、体液浸透圧の１．２倍の
浸透圧条件下、１７℃でサケ成長ホルモンポリペプチド
および誘導体それぞれ２０ｍｇ／ｊ！を３時間処理した
。処理したヒラメを井水中１７℃で４０日間飼育した。
浸透圧条件下、１７℃でサケ成長ホルモンポリペプチド
および誘導体それぞれ２０ｍｇ／ｊ！を３時間処理した
。処理したヒラメを井水中１７℃で４０日間飼育した。
飼育１４，３０．４４日後に魚体重および魚体重を測定
した。結果を第４図および第５図に示した。
した。結果を第４図および第５図に示した。
この結果、ｐｓＣ；ＨＩＱＩ ｌ５ｐｓＧＨＩＱ１５に
コードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体はア
ミノ酸数１８８の完全な長さのサケ成長ホルモンと同等
またはそれ以上の成長促進活性を有することがＷｉ認さ
れた。
コードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体はア
ミノ酸数１８８の完全な長さのサケ成長ホルモンと同等
またはそれ以上の成長促進活性を有することがＷｉ認さ
れた。
参考例１． ａ熟すケ成長ホルモンをコードする組換
え体プラスミドＩ）ＳＧＨＩＢ２の造成：サケ成長ホル
モンをコードするＤＮＡを含むブラスミドｐｓＧ）１１
（特開昭６１−１５６９９記載の方法で製造）５μｇを
２０ｍＭ）すｘ −ＨＣｋ （ｐＨ７，５）。
え体プラスミドＩ）ＳＧＨＩＢ２の造成：サケ成長ホル
モンをコードするＤＮＡを含むブラスミドｐｓＧ）１１
（特開昭６１−１５６９９記載の方法で製造）５μｇを
２０ｍＭ）すｘ −ＨＣｋ （ｐＨ７，５）。
１０ｍ！、Ｉ Ｍ ｇ Ｃ１２、および１０ｍＭ Ｎ
ａＣｎを含む溶液（以下“Ｙ−１０緩衝液”と略記する
） ４０Ｊｉ１に溶かし、開眼酵素ＭｂｏＩｌ（Ｎｅｗ
εｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社製）１０単位を加
え３７℃、３時間消化反応を行った。つづいて該溶液の
ＮａＣｌＢ度を１７５ｍ１Ｊとなるよう調整し、５ａ４
７１１０単位を加え、３７℃、３時間消化反応を行った
。この反応液からＬＧＴ法により、Ｎ末端付近に相当す
る１６３ｂｌ）のＤＮＡ断片約０．２μｇを得た。
ａＣｎを含む溶液（以下“Ｙ−１０緩衝液”と略記する
） ４０Ｊｉ１に溶かし、開眼酵素ＭｂｏＩｌ（Ｎｅｗ
εｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社製）１０単位を加
え３７℃、３時間消化反応を行った。つづいて該溶液の
ＮａＣｌＢ度を１７５ｍ１Ｊとなるよう調整し、５ａ４
７１１０単位を加え、３７℃、３時間消化反応を行った
。この反応液からＬＧＴ法により、Ｎ末端付近に相当す
る１６３ｂｌ）のＤＮＡ断片約０．２μｇを得た。
次にｐｓＧＨｌの５μｇをＹ−１００緩衝液４０ρに溶
かし、ＢａｍＨＩ １０単位を加え、３７℃、３時間消
化反応を行った。つづいて該反応液のＮａＣβ濃度を１
７５ｍ旧ご調整し、Ｓ ａ Ｉ！ Ｉ １０−１位を
加え３７℃、３時間消化反応を行った。該反応液からＬ
ＧＴ法により、Ｃ末端側と３′−非翻訳領域を含む約９
００ｂｐのＤＮＡ断片約０．５■を得た。
かし、ＢａｍＨＩ １０単位を加え、３７℃、３時間消
化反応を行った。つづいて該反応液のＮａＣβ濃度を１
７５ｍ旧ご調整し、Ｓ ａ Ｉ！ Ｉ １０−１位を
加え３７℃、３時間消化反応を行った。該反応液からＬ
ＧＴ法により、Ｃ末端側と３′−非翻訳領域を含む約９
００ｂｐのＤＮＡ断片約０．５■を得た。
別にｐＧＥＬｌ ５μｇを４０μｌのＹ−１００緩衝液
に溶かし、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ［Ｉとを各々１０単
位加え、３０℃、３時間消化反応を行った。この反応液
からトリプトファンプロモーターを含む約２．７ｋｂの
ＤＮＡ断片約１μｇを得た。
に溶かし、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ［Ｉとを各々１０単
位加え、３０℃、３時間消化反応を行った。この反応液
からトリプトファンプロモーターを含む約２．７ｋｂの
ＤＮＡ断片約１μｇを得た。
一方成熟サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡの発現に
必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベクター
ＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤ Ｎ
ＡＩＪンカーを合成した。
必要な翻訳開始コドンＡＴＧを付加し、さらにベクター
ＤＮＡと上記ＤＮＡとを連結する目的で下記のＤ Ｎ
ＡＩＪンカーを合成した。
まず−末鎖Ｄ Ｎ Ａ 、 １７ｍｅｒ と１２ｍａｒ
を通常のトリエステル法Ｃアール・フレア（ＲｏＣｒｅ
ａ） ラ：ブロシーディング・オン・ザ・ナショナル・
アカデミイ・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
を通常のトリエステル法Ｃアール・フレア（ＲｏＣｒｅ
ａ） ラ：ブロシーディング・オン・ザ・ナショナル・
アカデミイ・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、） ｔｌｓＡ、、ユ、５７６５（１９７８）
）により合成した。
）により合成した。
１７ｍｅｒおよび１２ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ各々１２ｐ
ｍｏｌｅを５ＱｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）
、１０ｍ！Ｊ Ｍ ｇ Ｃβ２゜ｌＱｍＭジチオスレ
イトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液２０μ矛に溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）６
単位を加え、３７℃、６０分間リン酸化反応を行った。
ｍｏｌｅを５ＱｍＭ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，５）
、１０ｍ！Ｊ Ｍ ｇ Ｃβ２゜ｌＱｍＭジチオスレ
イトールおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液２０μ矛に溶
かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）６
単位を加え、３７℃、６０分間リン酸化反応を行った。
上記で得たｐｓＧＨ１由来のＭｂｏｌＩ−３ａ、ｆ！Ｉ
断片（１６３ｂｐ） ｏ、 １ ｐｍｏｌｅ、 Ｓａｌ
ｌ−ＢａｍＨｌ 断片（約９００ｂｐ）Ｑ、Ｑ ５μｍ
ｏｌｅ、 ｐＧＥＬｌの旧ｎｄＩＩＩ −ＢａｍＨＩ
断片（約２．７ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣＪ （ｐＨ７，５） 。
断片（１６３ｂｐ） ｏ、 １ ｐｍｏｌｅ、 Ｓａｌ
ｌ−ＢａｍＨｌ 断片（約９００ｂｐ）Ｑ、Ｑ ５μｍ
ｏｌｅ、 ｐＧＥＬｌの旧ｎｄＩＩＩ −ＢａｍＨＩ
断片（約２．７ｋｂ） ０．０２ｐｍｏｌｅ を５０ｍ
Ｍ ）リス−ＨＣＪ （ｐＨ７，５） 。
１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ 、１０ｍＭジチオスレイトー
ルおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液３０μβに溶かし
、これに上記の合成り Ｎ Ａ ＩＪン酸化反応液５μ
！を加えた。この混合液にＴ４リガーゼ（宝酒造社製）
６単位を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
ルおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液３０μβに溶かし
、これに上記の合成り Ｎ Ａ ＩＪン酸化反応液５μ
！を加えた。この混合液にＴ４リガーゼ（宝酒造社製）
６単位を加え、４℃、１８時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌８８１０１株を形質転換シＡｐ
ｌのコロニーをｆＬこのコロニーよりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第２図に示したｐｓＧＨＩＢ２を得た。ｐｓ
ＧＨＩＢ２の構造はＥ！ｃｏＲ１，Ｈｉｎｄ ＩＩ［、
Ｃ１ａｌ。
ｌのコロニーをｆＬこのコロニーよりプラスミドＤＮＡ
を回収し、第２図に示したｐｓＧＨＩＢ２を得た。ｐｓ
ＧＨＩＢ２の構造はＥ！ｃｏＲ１，Ｈｉｎｄ ＩＩ［、
Ｃ１ａｌ。
Ｂｇｌ Ｉ［、Ｓａｌ Ｉ 、 Ｂａｍ旧で切断しテア
ガロ−スケルミ気泳劾にて確認した。ｐｓＧ［Ｂ２中の
サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末端付近の配
列はであることをＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓ
ａｎｇｅｒ ）法に従って決定した。その結果ｐｓＧＨ
ＩＢ２は成熟型サケ成長ホルモンポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むことがわかった。プラスミドｐｓＧＨ
ＩＢ２を含む大腸菌は［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＥＳＧ）１１Ｂ２（ＦεＲＭ ０Ｐ−６１２）と
して昭和５９年９月２０日付で工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に寄託されている。
ガロ−スケルミ気泳劾にて確認した。ｐｓＧ［Ｂ２中の
サケ成長ホルモンをコードするＤＮＡのＮ末端付近の配
列はであることをＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓ
ａｎｇｅｒ ）法に従って決定した。その結果ｐｓＧＨ
ＩＢ２は成熟型サケ成長ホルモンポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むことがわかった。プラスミドｐｓＧＨ
ＩＢ２を含む大腸菌は［１ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＥＳＧ）１１Ｂ２（ＦεＲＭ ０Ｐ−６１２）と
して昭和５９年９月２０日付で工業技術院微生物工業技
術研究所（微工研）に寄託されている。
発明の効果
本発明によれば魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体
を微生物を用いて大量に生産することができる。しかも
該ペプチドは天然型に比べより単純な構造を有すること
から大腸菌で生産させるにはより好適である。
を微生物を用いて大量に生産することができる。しかも
該ペプチドは天然型に比べより単純な構造を有すること
から大腸菌で生産させるにはより好適である。
第１図は、ｐＣ，ＥＬＬ （ＳＤ−ＡＴＧ間１４ｂｐ）
からｐＧＥＬｌ Ｏ（ＳＤ−ＡＴＧ間１０ｂｐ）の造成
過程を示す。 第２図はｐｓＧＨＩＭｌの造成過程を示す。 第３図はｐｓＧＨｒＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５の造成過
程を示す。ｐＫＹＰ２６に含まれる翻訳終止コドン領域
をｐＫＹＰ２６の上部に示し、ｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓ
ＧＨＩＱ１５にコードされるサケ成長ホルモンポリペプ
チド誘導体のＣ末端部分の配列を下部に示す。 第４図および第５図はｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧ旧口１
５にコードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体
のヒラメ稚魚に対する成長促進活性を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 第２図 １？ｐｐ Ｃオミプ誇Ｆ＋Ｎｔｃ１１配ゲリＣ５モ貞場らｔジｌｉ
ｅ乙ノ１−曳乙列ｓＧＨ宙大−−モー−べ・ククーφ東
５ＧＨｄＪ俵 −−十一−ヘーグダー
市泉１２７ ＋２８ １２９ １３０
１１７ １１８ １１９第４図 Ｔ：３ 数（ｅ）
からｐＧＥＬｌ Ｏ（ＳＤ−ＡＴＧ間１０ｂｐ）の造成
過程を示す。 第２図はｐｓＧＨＩＭｌの造成過程を示す。 第３図はｐｓＧＨｒＱｌｌ、ｐｓＧＨＩＱＩ５の造成過
程を示す。ｐＫＹＰ２６に含まれる翻訳終止コドン領域
をｐＫＹＰ２６の上部に示し、ｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓ
ＧＨＩＱ１５にコードされるサケ成長ホルモンポリペプ
チド誘導体のＣ末端部分の配列を下部に示す。 第４図および第５図はｐｓＧＨＩＱｌｌ、ｐｓＧ旧口１
５にコードされるサケ成長ホルモンポリペプチド誘導体
のヒラメ稚魚に対する成長促進活性を示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 第２図 １？ｐｐ Ｃオミプ誇Ｆ＋Ｎｔｃ１１配ゲリＣ５モ貞場らｔジｌｉ
ｅ乙ノ１−曳乙列ｓＧＨ宙大−−モー−べ・ククーφ東
５ＧＨｄＪ俵 −−十一−ヘーグダー
市泉１２７ ＋２８ １２９ １３０
１１７ １１８ １１９第４図 Ｔ：３ 数（ｅ）
Claims (16)
- （１）魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体。
- （２）魚類の成長ホルモンがニシン類（Ｃｌｕｐｅｉｆ
ｏｒｍｅｓ）の成長ホルモンである特許請求の範囲第１
項のポリペプチド誘導体。 - （３）第１表のアミノ酸配列を有する魚類の成長ホルモ
ンポリペプチドから一部のアミノ酸が除去または置換さ
れた特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド誘導体。 - （４）魚類の成長ホルモンポリペプチドから一部のアミ
ノ酸の除去がＣ末端からのアミノ酸の除去であり、その
数が５８個または６９個であることを特徴とする特許請
求の範囲第３項記載のポリペプチド誘導体。 - （５）魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体をコード
するＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミド。 - （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 - （７）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち１３１番
目から１８８番目のアミノ酸に対応する塩基が欠失した
配列または１２０番目から１８８番目のアミノ酸に対応
する塩基が欠失した配列を有することを特徴とする特許
請求の範囲第５または第６項記載の組換え体プラスミド
。 - （８）ｐｓＧＨＩＱ１１またはｐｓＧＨＩＱ１５である
特許請求の範囲第５または第６項記載の組換え体プラス
ミド。 - （９）魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体をコード
するＤＮＡ断片かベクタープラスミドに組み込まれた組
換え体プラスミドを用い形質転換した微生物を培地に培
養し、培養物中に魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導
体を生成蓄積させ、該培養物から魚類の成長ホルモンポ
リペプチド誘導体を採取することを特徴とする魚類の成
長ホルモンポリペプチド誘導体の製造法。 - （１０）該ＤＮＡ断片がベクタープラスミドのトリプト
ファンプロモーターの下流に組み込まれたことを特徴と
する特許請求の範囲第９項記載の製造法。 - （１１）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または第１０項記載の製造法。 - （１２）魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体が第１
表に示したアミノ酸配列のうち１３１番目から１８８番
目を欠失した配列、または１２０番目から１８８番目を
欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲
第９、１０または１１項記載の製造法。 - （１３）魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体をコー
ドするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミドを
含む微生物。 - （１４）該ＤＮＡ断片がベクタープラスミドのトリプト
ファンプロモーターの下流に組み込まれたことを特徴と
する特許請求の範囲第１３項記載の微生物。 - （１５）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 - （１６）該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち
１３１番目から１８８番目のアミノ酸に対応する塩基を
欠失した配列または１２０番目から１８８番目のアミノ
酸に対応する塩基を欠失した配列を有することを特徴と
する特許請求の範囲第１３〜１５項記載の微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61097482A JPS62255500A (ja) | 1986-04-25 | 1986-04-25 | 魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61097482A JPS62255500A (ja) | 1986-04-25 | 1986-04-25 | 魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62255500A true JPS62255500A (ja) | 1987-11-07 |
Family
ID=14193491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61097482A Pending JPS62255500A (ja) | 1986-04-25 | 1986-04-25 | 魚類の成長ホルモンポリペプチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62255500A (ja) |
-
1986
- 1986-04-25 JP JP61097482A patent/JPS62255500A/ja active Pending
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