JPH04305599A - プロラクチン - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57554—Prolactin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は魚類の新規なプロラクチ
ン、より詳細にはカレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来
のプロラクチン、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子
、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該組換えベク
ターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を利用
して産生された新規な魚類の脳下垂体由来のプロラクチ
ンおよびその製造法に関する。本発明はまた上記新規な
プロラクチンを用いた魚類をはじめとする動物の成長促
進方法、およびカレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチンを
含有する魚類をはじめとする動物用飼料に関する。
ン、より詳細にはカレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来
のプロラクチン、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子
、該遺伝子を組み込んだ組換えベクター、該組換えベク
ターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を利用
して産生された新規な魚類の脳下垂体由来のプロラクチ
ンおよびその製造法に関する。本発明はまた上記新規な
プロラクチンを用いた魚類をはじめとする動物の成長促
進方法、およびカレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチンを
含有する魚類をはじめとする動物用飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
魚類から哺乳類に到るまで数多くの成長ホルモンが単離
され、その多くは遺伝子の構造まで明らかになっている
。これはこれらの成長ホルモンは成長促進効果を有する
ので魚類の養殖業および畜産業にあっては魚類、家畜の
成長促進あるいは可食部位の増加などの応用が期待しう
るからである。更にまた、ヒトにおいては小人症の治療
などに有用であるなどの効果が示されてきてもいる。 一方成長ホルモンにそのアミノ酸配列が類似するタンパ
ク質として成長ホルモンと同じく脳下垂体前葉から分泌
されるプロラクチンの存在が知られている。これまで四
足動物から魚類に至るまで多くの種類の動物からプロラ
クチンが単離されている。プロラクチンは哺乳類一般に
おいて乳汁を分泌させ、更に黄体刺激作用を持ち、鳥類
においてはハトの素嚢乳を形成するなど一般には生殖に
関連する広範な作用を持つホルモンであると考えられて
いる。一方、下等脊椎動物においては両生類で変態の制
御および成長作用が知られている。また魚類においては
広塩性魚類および淡水魚の淡水適応時の浸透圧調節に関
わると考えられている（Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｂ
ｅｒｎ，１９８１，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ
“Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ”（Ｃ．Ｈ．Ｌｉ ｅｄ．），Ｖｏｌ
．８，ｐｐ１０５−１９７．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。しかし海産魚においては
免疫組織化学的研究からプロラクチンの存在は知られて
いるものの、その単離および生理作用についての研究は
なされていない。
魚類から哺乳類に到るまで数多くの成長ホルモンが単離
され、その多くは遺伝子の構造まで明らかになっている
。これはこれらの成長ホルモンは成長促進効果を有する
ので魚類の養殖業および畜産業にあっては魚類、家畜の
成長促進あるいは可食部位の増加などの応用が期待しう
るからである。更にまた、ヒトにおいては小人症の治療
などに有用であるなどの効果が示されてきてもいる。 一方成長ホルモンにそのアミノ酸配列が類似するタンパ
ク質として成長ホルモンと同じく脳下垂体前葉から分泌
されるプロラクチンの存在が知られている。これまで四
足動物から魚類に至るまで多くの種類の動物からプロラ
クチンが単離されている。プロラクチンは哺乳類一般に
おいて乳汁を分泌させ、更に黄体刺激作用を持ち、鳥類
においてはハトの素嚢乳を形成するなど一般には生殖に
関連する広範な作用を持つホルモンであると考えられて
いる。一方、下等脊椎動物においては両生類で変態の制
御および成長作用が知られている。また魚類においては
広塩性魚類および淡水魚の淡水適応時の浸透圧調節に関
わると考えられている（Ｃｌａｒｋｅ ａｎｄ Ｂ
ｅｒｎ，１９８１，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ
“Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ”（Ｃ．Ｈ．Ｌｉ ｅｄ．），Ｖｏｌ
．８，ｐｐ１０５−１９７．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．）。しかし海産魚においては
免疫組織化学的研究からプロラクチンの存在は知られて
いるものの、その単離および生理作用についての研究は
なされていない。
【０００３】Ｓｐｅｃｋｅｒらの報告（Ｓｐｅｃｋｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｉｎＰｒｏｌａｃｔｉ
ｎ−Ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃ
ｏｒｒｅｌａｔｅｓ，ｅｄｓ．ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ
ａｌ．，（Ｌｉｖｉａｎａ，Ｐａｄｏａ，Ｉｔａｌ
ｙ），Ｆｉｄｉａ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ
，Ｖｏｌ．１，ｐｐ４２７−４３６．）によると広塩性
魚類であるティラピアのプロラクチンは成長ホルモン以
上の成長促進活性を持つことが示されている。また、プ
ロラクチンは上述のように両生類においては変態の制御
および成長に関わることが知られている。魚類でも、劇
的な変態を行うものとして、例えばカレイ目の魚類が知
られているが、その仔稚魚期における変態と成長に対す
るプロラクチンの役割についての研究はほとんどなされ
ていない。
ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｉｎＰｒｏｌａｃｔｉ
ｎ−Ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃ
ｏｒｒｅｌａｔｅｓ，ｅｄｓ．ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ
ａｌ．，（Ｌｉｖｉａｎａ，Ｐａｄｏａ，Ｉｔａｌ
ｙ），Ｆｉｄｉａ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ
，Ｖｏｌ．１，ｐｐ４２７−４３６．）によると広塩性
魚類であるティラピアのプロラクチンは成長ホルモン以
上の成長促進活性を持つことが示されている。また、プ
ロラクチンは上述のように両生類においては変態の制御
および成長に関わることが知られている。魚類でも、劇
的な変態を行うものとして、例えばカレイ目の魚類が知
られているが、その仔稚魚期における変態と成長に対す
るプロラクチンの役割についての研究はほとんどなされ
ていない。
【０００４】そこで本発明者らは海産魚に新しい生理作
用、特に成長促進作用を持つプロラクチンが存在するの
ではないかと考え、もしそれが得られ、更にそれを大量
に取得しえるならば、科学発展の上からのみでなく、例
えば魚類養殖における成長促進剤への応用など産業上の
有用性も大きいと考えて鋭意研究を進めた結果、ヒラメ
の脳下垂体より新規なプロラクチンを発見し、さらには
そのプロラクチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子の
クローニングに成功すると共に、それを大量に生産する
方法を開発したのである。また、本発明者らはヒラメの
プロラクチンは魚類をはじめとして動物の成長促進に効
果がある等のことを見いだしたのである。
用、特に成長促進作用を持つプロラクチンが存在するの
ではないかと考え、もしそれが得られ、更にそれを大量
に取得しえるならば、科学発展の上からのみでなく、例
えば魚類養殖における成長促進剤への応用など産業上の
有用性も大きいと考えて鋭意研究を進めた結果、ヒラメ
の脳下垂体より新規なプロラクチンを発見し、さらには
そのプロラクチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子の
クローニングに成功すると共に、それを大量に生産する
方法を開発したのである。また、本発明者らはヒラメの
プロラクチンは魚類をはじめとして動物の成長促進に効
果がある等のことを見いだしたのである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はカレイ目ヒラメ
科魚類の、特にヒラメの脳下垂体に新しいプロラクチン
が存在することを見いだすと共に、それを単離精製し、
さらにはそのプロラクチンのアミノ酸配列をコードする
遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術を用
いてクローニングし、その遺伝子を発現させることに成
功し、容易且つ大量に高純度の目的プロラクチンを製造
することを可能にしたのである。本発明は更に上記のよ
うにして脳下垂体から得られたプロラクチンおよび上記
のようにして遺伝子組換え技術を利用して得られたプロ
ラクチンが共に良好な動物、特に魚類の成長促進活性を
示すことを確認してなされたものである。
科魚類の、特にヒラメの脳下垂体に新しいプロラクチン
が存在することを見いだすと共に、それを単離精製し、
さらにはそのプロラクチンのアミノ酸配列をコードする
遺伝子を得、ついでこの遺伝子を遺伝子組換え技術を用
いてクローニングし、その遺伝子を発現させることに成
功し、容易且つ大量に高純度の目的プロラクチンを製造
することを可能にしたのである。本発明は更に上記のよ
うにして脳下垂体から得られたプロラクチンおよび上記
のようにして遺伝子組換え技術を利用して得られたプロ
ラクチンが共に良好な動物、特に魚類の成長促進活性を
示すことを確認してなされたものである。
【０００６】本発明のプロラクチンは以下に示す各種の
方法により分離精製することができる。該方法としては
、例えば上記プロラクチンを含有する組織あるいは細胞
；例えばカレイ目ヒラメ科魚類であるヒラメの脳下垂体
を出発原料として、各種のタンパク質の分離精製法とし
て知られた方法を適用して行うことができる。これらの
タンパク質の分離精製法としては、ホモジュナイザー、
超音波細胞破砕等による可溶化処理、各種塩類を含んだ
緩衝液による抽出処理、酸またはアルカリによる可溶化
あるいは沈澱処理、さらには有機溶媒による抽出あるい
は沈澱処理、硫安等による塩析、透析、メンブレンフィ
ルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー、等電点あるいはゲル電気泳動などがあ
げられ、それらは単独あるいは適宜組み合わせて用いら
れる。本発明のプロラクチンの分離精製法をより詳しく
説明すると、ヒラメから通常の方法で得られた脳下垂体
は、液体窒素あるいはドライアイスで直ちに凍結して使
用時まで約−８０℃程度で保存する。つぎにこの脳下垂
体を冷却下塩酸−アセトン溶液（１：２８）中で破砕後
、遠心する。さらに得られた沈澱を８０％アセトン中で
抽出する。抽出物は−２０℃に冷却したアセトン中に滴
下し沈澱物を遠心分離後得る。この沈澱は凍結乾燥後適
当な緩衝液に溶解した後、ゲル濾過クロマトグラフィー
、例えばセファデックスＧ−７５のクロマトグラフィー
にかける。溶出画分は２８０ｎｍにおける吸光度をモニ
ターすることによって測定し、分取しえる。次にこのよ
うにして得られた画分の内、目的のプロラクチンを含有
する画分を凍結乾燥処理する。
方法により分離精製することができる。該方法としては
、例えば上記プロラクチンを含有する組織あるいは細胞
；例えばカレイ目ヒラメ科魚類であるヒラメの脳下垂体
を出発原料として、各種のタンパク質の分離精製法とし
て知られた方法を適用して行うことができる。これらの
タンパク質の分離精製法としては、ホモジュナイザー、
超音波細胞破砕等による可溶化処理、各種塩類を含んだ
緩衝液による抽出処理、酸またはアルカリによる可溶化
あるいは沈澱処理、さらには有機溶媒による抽出あるい
は沈澱処理、硫安等による塩析、透析、メンブレンフィ
ルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロ
マトグラフィー、等電点あるいはゲル電気泳動などがあ
げられ、それらは単独あるいは適宜組み合わせて用いら
れる。本発明のプロラクチンの分離精製法をより詳しく
説明すると、ヒラメから通常の方法で得られた脳下垂体
は、液体窒素あるいはドライアイスで直ちに凍結して使
用時まで約−８０℃程度で保存する。つぎにこの脳下垂
体を冷却下塩酸−アセトン溶液（１：２８）中で破砕後
、遠心する。さらに得られた沈澱を８０％アセトン中で
抽出する。抽出物は−２０℃に冷却したアセトン中に滴
下し沈澱物を遠心分離後得る。この沈澱は凍結乾燥後適
当な緩衝液に溶解した後、ゲル濾過クロマトグラフィー
、例えばセファデックスＧ−７５のクロマトグラフィー
にかける。溶出画分は２８０ｎｍにおける吸光度をモニ
ターすることによって測定し、分取しえる。次にこのよ
うにして得られた画分の内、目的のプロラクチンを含有
する画分を凍結乾燥処理する。
【０００７】次にこの精製物を適当な緩衝液に溶解した
後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えばＯ
ＤＳ１２０Ｔ等の化学修飾シリカゲルを充填剤として使
用したカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにか
ける。溶出液を２２０ｎｍにおける吸光度でモニターす
ることにより目的とするプロラクチンを含有する画分を
集める。このようにして得られたプロラクチンは、各種
の物理化学的分析にかけることにより、その性質を測定
することができる。
後高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えばＯ
ＤＳ１２０Ｔ等の化学修飾シリカゲルを充填剤として使
用したカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにか
ける。溶出液を２２０ｎｍにおける吸光度でモニターす
ることにより目的とするプロラクチンを含有する画分を
集める。このようにして得られたプロラクチンは、各種
の物理化学的分析にかけることにより、その性質を測定
することができる。
【０００８】本発明のプロラクチンは、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動の結果、約２２，０００ダルト
ンの分子量を持つものであると推定される。また、上記
高速液体クロマトグラフィーによって得られたタンパク
質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バ
ンドを与える。
リルアミドゲル電気泳動の結果、約２２，０００ダルト
ンの分子量を持つものであると推定される。また、上記
高速液体クロマトグラフィーによって得られたタンパク
質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バ
ンドを与える。
【０００９】上記のようにして精製分離して得られたプ
ロラクチンは、塩酸等の酸、ペプシン、キモトリプシン
、カルボキシペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素等で
加水分解した後、得られたペプチド断片をイオン交換ク
ロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにかけて、そ
のアミノ酸組成を分析すると共にそのアミノ酸配列を決
定することができる。
ロラクチンは、塩酸等の酸、ペプシン、キモトリプシン
、カルボキシペプチダーゼ等のタンパク質分解酵素等で
加水分解した後、得られたペプチド断片をイオン交換ク
ロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにかけて、そ
のアミノ酸組成を分析すると共にそのアミノ酸配列を決
定することができる。
【００１０】本発明のプロラクチンのアミノ酸組成の分
析法をより詳しく説明すると、まず精製された該プロラ
クチンを塩酸で加水分解した後、フェニルイソチオシア
ネート（ＰＩＴＣ）を反応させてアミノ酸をそれぞれ対
応するフェニルチオカルバミル誘導体に変換し、それを
逆相高速液体クロマトグラフィーにかけて定量する方法
（ＰＩＴＣ法）があげられる。
析法をより詳しく説明すると、まず精製された該プロラ
クチンを塩酸で加水分解した後、フェニルイソチオシア
ネート（ＰＩＴＣ）を反応させてアミノ酸をそれぞれ対
応するフェニルチオカルバミル誘導体に変換し、それを
逆相高速液体クロマトグラフィーにかけて定量する方法
（ＰＩＴＣ法）があげられる。
【００１１】このようにして得られた本発明のプロラク
チンのアミノ酸組成は第１表に示す通りのものである。 この表から分かるように本発明のプロラクチンは４個の
システインを持ち、更にセリンおよびロイシンに富むと
いうプロラクチン様の特性を示している。
チンのアミノ酸組成は第１表に示す通りのものである。 この表から分かるように本発明のプロラクチンは４個の
システインを持ち、更にセリンおよびロイシンに富むと
いうプロラクチン様の特性を示している。
【００１２】本発明のプロラクチンのアミン酸配列を決
定するには、通常のペプチドシークエンサーを使用する
ことによって行うことができるが、特に気相ペプチドシ
ークエンサーが好適に使用できる。このようなペプチド
シークエンサーによれば、タンパク質のＮ末端からのア
ミノ酸配列を決定することができる。次にこのような手
法で決定された本発明のプロラクチンＮ末端部分の２２
個のアミノ酸残基の配列は次の通りである。
定するには、通常のペプチドシークエンサーを使用する
ことによって行うことができるが、特に気相ペプチドシ
ークエンサーが好適に使用できる。このようなペプチド
シークエンサーによれば、タンパク質のＮ末端からのア
ミノ酸配列を決定することができる。次にこのような手
法で決定された本発明のプロラクチンＮ末端部分の２２
個のアミノ酸残基の配列は次の通りである。
【００１３】
【化３】
【００１４】本発明のプロラクチンのアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子は以下に示す各種の方法により製造する
ことができる。該方法としては、例えば上記プロラクチ
ンの産生細胞であるカレイ目ヒラメ科魚類であるヒラメ
の脳下垂体からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型
としてｃＤＮＡを合成し、次にこれを適当なベクターに
接続して宿主細胞内で増殖させ、本発明の単離精製方法
により魚類より得られたプロラクチンのアミノ酸配列分
析の結果により得られた知見より、適当なＤＮＡプロー
ブを合成し、そのプローブを用いて遺伝子ライブラリー
を検索し、目的のプロラクチンのアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡを含有するクローンを選別し、該クローン
の有するベクターより単離する方法、本発明のプロラク
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡに基づ
いて、例えばリン酸トリエステル法（Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ，３４，３１４３（１９７８），Ａｄｖ．Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６，１３
５（１９７９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１０，２５９７，６５５３（１９８２））、ホ
スホアミダイト法（Ｎａｔｕｒｅ，３１０，１０５（１
９８４））等の常法に従って、核酸の化学合成を行う方
法、これらの方法を組合せた方法等があげられる。
ードする遺伝子は以下に示す各種の方法により製造する
ことができる。該方法としては、例えば上記プロラクチ
ンの産生細胞であるカレイ目ヒラメ科魚類であるヒラメ
の脳下垂体からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製し、これを鋳型
としてｃＤＮＡを合成し、次にこれを適当なベクターに
接続して宿主細胞内で増殖させ、本発明の単離精製方法
により魚類より得られたプロラクチンのアミノ酸配列分
析の結果により得られた知見より、適当なＤＮＡプロー
ブを合成し、そのプローブを用いて遺伝子ライブラリー
を検索し、目的のプロラクチンのアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡを含有するクローンを選別し、該クローン
の有するベクターより単離する方法、本発明のプロラク
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡに基づ
いて、例えばリン酸トリエステル法（Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ，３４，３１４３（１９７８），Ａｄｖ．Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６，１３
５（１９７９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１０，２５９７，６５５３（１９８２））、ホ
スホアミダイト法（Ｎａｔｕｒｅ，３１０，１０５（１
９８４））等の常法に従って、核酸の化学合成を行う方
法、これらの方法を組合せた方法等があげられる。
【００１５】以下に、上記ヒラメの脳下垂体から該遺伝
子を調製する方法について詳述する。本発明の遺伝子を
入手するためには、ヒラメの脳下垂体からＲＮＡを抽出
する必要があるが、そのヒラメとしては養殖のものでも
天然のものでもいずれのものも好適に使用することがで
きる。ヒラメから脳下垂体を摘出するにあたっては、常
法に従って行うことができ、こうして摘出された脳下垂
体は、直ちに液体窒素、ドライアイス・アセトン等を用
いて凍結させたのち、必要に応じ約−８０℃程度で使用
時まで保存することができる。
子を調製する方法について詳述する。本発明の遺伝子を
入手するためには、ヒラメの脳下垂体からＲＮＡを抽出
する必要があるが、そのヒラメとしては養殖のものでも
天然のものでもいずれのものも好適に使用することがで
きる。ヒラメから脳下垂体を摘出するにあたっては、常
法に従って行うことができ、こうして摘出された脳下垂
体は、直ちに液体窒素、ドライアイス・アセトン等を用
いて凍結させたのち、必要に応じ約−８０℃程度で使用
時まで保存することができる。
【００１６】上記のようにして得られた脳下垂体からＲ
ＮＡを抽出するにあたっては、通常の方法によって行う
ことができるが、このような方法としては、ポリソーム
の分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法
などがあげられる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出法
としては、グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ
密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化
セシウム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９））
、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビ
ター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール処理
を行う方法（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グ
アニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グ
アニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニ
ジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、
グアニジン・チオシアネートで処理した後塩化リチウム
で処理してＲＮＡを沈澱させる方法などをあげることが
できる。
ＮＡを抽出するにあたっては、通常の方法によって行う
ことができるが、このような方法としては、ポリソーム
の分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法
などがあげられる。上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出法
としては、グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ
密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化
セシウム法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９））
、バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビ
ター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール処理
を行う方法（Ｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１４３（１９７９））、グ
アニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グ
アニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニ
ジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、
グアニジン・チオシアネートで処理した後塩化リチウム
で処理してＲＮＡを沈澱させる方法などをあげることが
できる。
【００１７】上記脳下垂体からのＲＮＡの抽出方法をよ
り詳しく説明すると、先ず凍結脳下垂体をグアニジン・
チオシアネート溶液中で機械的に破砕して可溶化し、次
に塩化リチウムを加え、必要に応じて遠心して細胞質Ｒ
ＮＡを沈澱として得る。次にこのようして得られた沈澱
物を必要に応じてフェノール抽出処理した後にエタノー
ル沈澱にかけて、ＲＮＡを沈澱物として得る。
り詳しく説明すると、先ず凍結脳下垂体をグアニジン・
チオシアネート溶液中で機械的に破砕して可溶化し、次
に塩化リチウムを加え、必要に応じて遠心して細胞質Ｒ
ＮＡを沈澱として得る。次にこのようして得られた沈澱
物を必要に応じてフェノール抽出処理した後にエタノー
ル沈澱にかけて、ＲＮＡを沈澱物として得る。
【００１８】このようにして得られたＲＮＡから、更に
はポリＡ鎖を有するＲＮＡを、通常の方法にしたがって
精製する。このような方法としては、オリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティカラムクロマトグラフィー
法が有利に使用できる。
はポリＡ鎖を有するＲＮＡを、通常の方法にしたがって
精製する。このような方法としては、オリゴｄＴセルロ
ース等を用いるアフィニティカラムクロマトグラフィー
法が有利に使用できる。
【００１９】次にこのようにして得られたポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素（リバーストラン
スクリプターゼ）をもちいて二本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の合成に用いられる。このｃＤＮＡの合成方法としては
、通常の方法にしたがって行うことができ、先ずオリゴ
（ｄＴ）あるいはベクタープライマーをプライマーとし
て、例えばＡＭＶ、ＭＭＬＶあるいはＲＳＶ等に由来す
る逆転写酵素を用いて第一鎖のＤＮＡを合成し、次にク
レノウフラグメントで処理して、二本鎖ＤＮＡとした後
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓ１ヌクレアーゼ処理
するか、あるいはＳ１ヌクレアーゼで処理した後ターミ
ナルトランスフェラーゼで処理するか、あるいは上記逆
転写酵素を用いて得られた第一鎖のＤＮＡ含有物にＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨを作用させる等
の方法によって行うことができる。このような方法とし
ては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ
，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．ｂｙＳｈｅ
ｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７年に記載
された方法があげられるが、実用上はこのｃＤＮＡの合
成は、例えばアマシャム・ジャパン社等から市販されて
いるｃＤＮＡ合成キットを利用することが便利である。
ＮＡは、これを鋳型として逆転写酵素（リバーストラン
スクリプターゼ）をもちいて二本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の合成に用いられる。このｃＤＮＡの合成方法としては
、通常の方法にしたがって行うことができ、先ずオリゴ
（ｄＴ）あるいはベクタープライマーをプライマーとし
て、例えばＡＭＶ、ＭＭＬＶあるいはＲＳＶ等に由来す
る逆転写酵素を用いて第一鎖のＤＮＡを合成し、次にク
レノウフラグメントで処理して、二本鎖ＤＮＡとした後
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した後Ｓ１ヌクレアーゼ処理
するか、あるいはＳ１ヌクレアーゼで処理した後ターミ
ナルトランスフェラーゼで処理するか、あるいは上記逆
転写酵素を用いて得られた第一鎖のＤＮＡ含有物にＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、リボヌクレアーゼＨを作用させる等
の方法によって行うことができる。このような方法とし
ては、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ
，Ｖｏｌ．１５２，３０７〜３３５，Ｅｄ．ｂｙＳｈｅ
ｌｂｙ Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７年に記載
された方法があげられるが、実用上はこのｃＤＮＡの合
成は、例えばアマシャム・ジャパン社等から市販されて
いるｃＤＮＡ合成キットを利用することが便利である。
【００２０】次に上記のようにして得られたｃＤＮＡは
、これを適当なベクターに挿入、次にこのようにして得
られたベクターを適当な宿主に導入してクローニングす
ることにより増幅し、ついでスクリーニングを行って目
的のプロラクチンのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を含有する組換え宿主を選択し、次にその組換え宿主の
プラークあるいはコロニーから当該プロラクチンのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを単離することができる。
、これを適当なベクターに挿入、次にこのようにして得
られたベクターを適当な宿主に導入してクローニングす
ることにより増幅し、ついでスクリーニングを行って目
的のプロラクチンのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を含有する組換え宿主を選択し、次にその組換え宿主の
プラークあるいはコロニーから当該プロラクチンのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを単離することができる。
【００２１】上記ｃＤＮＡを挿入するのに用いられるベ
クターとしては、通常使用せられる各種プラスミドベク
ター等があげられ、例えばｐＢＲ３２２，λバクテリオ
ファージベクターλｇｔ１０，λｇｔ１１等が好適に使
用できる。また、ここで使用される宿主としては、特に
限定されず、上記組換えベクターが自律複製できるもの
であればよく、このような宿主としては例えば、大腸菌
が好適に使用できる。
クターとしては、通常使用せられる各種プラスミドベク
ター等があげられ、例えばｐＢＲ３２２，λバクテリオ
ファージベクターλｇｔ１０，λｇｔ１１等が好適に使
用できる。また、ここで使用される宿主としては、特に
限定されず、上記組換えベクターが自律複製できるもの
であればよく、このような宿主としては例えば、大腸菌
が好適に使用できる。
【００２２】特に上記ベクターとしてλｇｔ１０ＤＮＡ
を用いた場合には、宿主として大腸菌ＮＭ５１４株が好
適に使用できる。上記ｃＤＮＡをベクターに挿入するに
あたっては、同一制限酵素を用いて生ずるところの接着
末端を利用するか、必要に応じて合成のリンカー部ある
いはアダプター部を付加したり、ホモポリマーを加えた
りする等の通常の方法を用いて行うことができる。
を用いた場合には、宿主として大腸菌ＮＭ５１４株が好
適に使用できる。上記ｃＤＮＡをベクターに挿入するに
あたっては、同一制限酵素を用いて生ずるところの接着
末端を利用するか、必要に応じて合成のリンカー部ある
いはアダプター部を付加したり、ホモポリマーを加えた
りする等の通常の方法を用いて行うことができる。
【００２３】例えば、より詳しくはｃＤＮＡの両末端に
Ｔ４リガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカーを付加した後
、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化処理し、これに同じく制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断されたベクター断片をライゲーシ
ョンして、目的組換えベクターとすることができる。
Ｔ４リガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカーを付加した後
、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化処理し、これに同じく制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断されたベクター断片をライゲーシ
ョンして、目的組換えベクターとすることができる。
【００２４】こうして得られた組換えベクターを宿主に
導入するには、通常使用せられる各種の方法が使用でき
る。このような方法としては、例えばＨａｎａｈａｎ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５
７（１９８３）に従ったＣａＣｌ２又はＲｂＣｌを共存
させて調製されたコンピテント細胞に、これらベクター
を取り込ませる方法、適当な増殖期にある宿主をＭｇＳ
Ｏ４等で処理して後、組換えファージベクターを感染さ
せる方法等があげられる。
導入するには、通常使用せられる各種の方法が使用でき
る。このような方法としては、例えばＨａｎａｈａｎ
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５
７（１９８３）に従ったＣａＣｌ２又はＲｂＣｌを共存
させて調製されたコンピテント細胞に、これらベクター
を取り込ませる方法、適当な増殖期にある宿主をＭｇＳ
Ｏ４等で処理して後、組換えファージベクターを感染さ
せる方法等があげられる。
【００２５】次に当該プロラクチンのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを含有する組換え体をスクリーニングし
て選択する。この選択にあたっては、公知の各種の方法
を適用することにより行うことができ、例えば化学合成
したオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーまた
はプラーク ハイブリダイゼーション法、ハイブリダ
イゼーション・トランスレーションアッセイ法、プラス
・マイナス法等によって有利に実施することができる。
ードするＤＮＡを含有する組換え体をスクリーニングし
て選択する。この選択にあたっては、公知の各種の方法
を適用することにより行うことができ、例えば化学合成
したオリゴヌクレオチドプローブを用いたコロニーまた
はプラーク ハイブリダイゼーション法、ハイブリダ
イゼーション・トランスレーションアッセイ法、プラス
・マイナス法等によって有利に実施することができる。
【００２６】より詳しくは、組換え体のプラークのＤＮ
Ａを、ナイロンメンブレン等のフィルター上に固定し、
次にこれを標識したプローブと反応させ、このプローブ
と選択的に結合するＤＮＡ配列を有する組換え体を選択
する。上記ここで使用されるプローブとしては、目的の
ＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸配列のこ
とを指し、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また化学合成し
たものでも天然のものでも、あるいは組換えＤＮＡの手
法で得られたものでもよいが、公知の方法を適用して化
学的に合成されたＤＮＡ配列を用いるのが一般的であり
好ましい。
Ａを、ナイロンメンブレン等のフィルター上に固定し、
次にこれを標識したプローブと反応させ、このプローブ
と選択的に結合するＤＮＡ配列を有する組換え体を選択
する。上記ここで使用されるプローブとしては、目的の
ＤＮＡ配列に対して相補的な配列を有する核酸配列のこ
とを指し、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また化学合成し
たものでも天然のものでも、あるいは組換えＤＮＡの手
法で得られたものでもよいが、公知の方法を適用して化
学的に合成されたＤＮＡ配列を用いるのが一般的であり
好ましい。
【００２７】ここで化学的にプローブのＤＮＡ配列を合
成するにあたっては、目的とする前記プロラクチンのア
ミノ酸配列、特にヒラメプロラクチンのアミノ酸配列に
基づいてその配列を決めることができる。
成するにあたっては、目的とする前記プロラクチンのア
ミノ酸配列、特にヒラメプロラクチンのアミノ酸配列に
基づいてその配列を決めることができる。
【００２８】以上のようにして選択された組換え体から
得られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサ
ム・ギルバート法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌ
クレオチド・チェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６
５，５６０〜５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ
．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，９，３０９（１９８１）等によって決定するこ
とができる。
得られた本発明の遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、マキサ
ム・ギルバート法、ジデオキシ法、例えばジデオキシヌ
クレオチド・チェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１），
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６
５，５６０〜５８０（１９８０），Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ
．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，９，３０９（１９８１）等によって決定するこ
とができる。
【００２９】かくして決定された本発明のプロラクチン
、特にヒラメ由来のプロラクチンの遺伝子を含むＤＮＡ
配列及びアミノ酸配列は、第４図に示される通りである
。その配列は、ヒラメ由来のプロラクチンの前駆体のＤ
ＮＡ配列及びアミノ酸を包含している。このＤＮＡ配列
中塩基第１番目から第７２番目に相当するアミノ酸配列
部分がシグナルペプチドであり、その塩基第７３番目か
ら第６３３番目に相当するアミノ酸配列部分が成熟タン
パク質である。上記ヒラメ由来の成長ホルモン様糖タン
パク質は、先ず上記前駆体として生合成され、その後シ
グナルペプチド部分が除去されて、分泌性のタンパク質
となることが明かとなっている。
、特にヒラメ由来のプロラクチンの遺伝子を含むＤＮＡ
配列及びアミノ酸配列は、第４図に示される通りである
。その配列は、ヒラメ由来のプロラクチンの前駆体のＤ
ＮＡ配列及びアミノ酸を包含している。このＤＮＡ配列
中塩基第１番目から第７２番目に相当するアミノ酸配列
部分がシグナルペプチドであり、その塩基第７３番目か
ら第６３３番目に相当するアミノ酸配列部分が成熟タン
パク質である。上記ヒラメ由来の成長ホルモン様糖タン
パク質は、先ず上記前駆体として生合成され、その後シ
グナルペプチド部分が除去されて、分泌性のタンパク質
となることが明かとなっている。
【００３０】このＤＮＡ配列から決定されるアミノ酸配
列は、既に天然物から決定された該プロラクチンのアミ
ノ酸配列と完全に一致し、こうして組換え体より得られ
た該ｃＤＮＡは、ヒラメ由来のプロラクチンのアミノ酸
配列をコードしていることが確認された。また、このＤ
ＮＡ塩基配列は、過去に発見されているプロラクチンな
どと有意の相同性を持つことが認められた。
列は、既に天然物から決定された該プロラクチンのアミ
ノ酸配列と完全に一致し、こうして組換え体より得られ
た該ｃＤＮＡは、ヒラメ由来のプロラクチンのアミノ酸
配列をコードしていることが確認された。また、このＤ
ＮＡ塩基配列は、過去に発見されているプロラクチンな
どと有意の相同性を持つことが認められた。
【００３１】ところで、遺伝子組換え技術によれば、Ｄ
ＮＡ鎖の切断、削除、付加及び結合、更にはＤＮＡ鎖中
の塩基の置換は、通常の手法にしたがって行うことがで
きるので、本発明の遺伝子は、第４図に示された塩基配
列を有する遺伝子に関するのみでなく、本発明の目的を
逸脱しない範囲で上記したような改変・修飾を加えたも
のにも関する。このような手法の代表的なものとしては
、オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈ
及びＳ．Ｇｉｌｌａｍ 「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ 及びＡ．
Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ，３，ｐ
．１（１９８１）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７年），
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のものあ
るいはそのうちに引用された文献に記載のものなどがあ
げられる。
ＮＡ鎖の切断、削除、付加及び結合、更にはＤＮＡ鎖中
の塩基の置換は、通常の手法にしたがって行うことがで
きるので、本発明の遺伝子は、第４図に示された塩基配
列を有する遺伝子に関するのみでなく、本発明の目的を
逸脱しない範囲で上記したような改変・修飾を加えたも
のにも関する。このような手法の代表的なものとしては
、オリゴヌクレオチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）として知られた方法、例えばＭ．Ｓｍｉｔｈ
及びＳ．Ｇｉｌｌａｍ 「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ 及びＡ．
Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ．），Ｖｏｌ，３，ｐ
．１（１９８１）、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５３−１５５（１９８７年），
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＣＡに記載のものあ
るいはそのうちに引用された文献に記載のものなどがあ
げられる。
【００３２】本発明の遺伝子に含まれ、第４図に示され
た塩基配列を有する遺伝子の改変・修飾として特に好ま
しいのは、目的とするタンパク質の安定性、生物学的活
性を高めるようなものが挙げられる。本発明のプロラク
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、上記組換え
ベクターより制限酵素を用いて、通常の方法にしたがっ
て処理することにより大量に得ることができ、こうして
得られた遺伝子は、遺伝子組換え技術によって利用され
て、高純度で且つ大量のプロラクチンのアミノ酸配列を
有するタンパク質を製造することができる。
た塩基配列を有する遺伝子の改変・修飾として特に好ま
しいのは、目的とするタンパク質の安定性、生物学的活
性を高めるようなものが挙げられる。本発明のプロラク
チンのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、上記組換え
ベクターより制限酵素を用いて、通常の方法にしたがっ
て処理することにより大量に得ることができ、こうして
得られた遺伝子は、遺伝子組換え技術によって利用され
て、高純度で且つ大量のプロラクチンのアミノ酸配列を
有するタンパク質を製造することができる。
【００３３】このように本発明の遺伝子を利用するに当
たっては、通常の遺伝子組換え技術において用いられて
いる各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝
子は、適当な発現用ベクターに組換えられ、次に適当な
発現用宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し
、得られた組換え体を培養し、適当に発現誘導すること
により、目的のタンパク質を取得することができる。 本発明の遺伝子を用いて目的のタンパク質を宿主中で産
生させるにあたっては、成熟タンパク質として、即ちシ
グナルペプチドを取り去った形で生産させることもでき
るし、上記シグナルペプチドをそのまま利用したりある
いは適当な宿主細胞等に適合したシグナルペプチドを付
加して宿主細胞等から分泌産生させることもできる。
たっては、通常の遺伝子組換え技術において用いられて
いる各種の方法を使用することができる。本発明の遺伝
子は、適当な発現用ベクターに組換えられ、次に適当な
発現用宿主にその組換えベクターを導入して形質転換し
、得られた組換え体を培養し、適当に発現誘導すること
により、目的のタンパク質を取得することができる。 本発明の遺伝子を用いて目的のタンパク質を宿主中で産
生させるにあたっては、成熟タンパク質として、即ちシ
グナルペプチドを取り去った形で生産させることもでき
るし、上記シグナルペプチドをそのまま利用したりある
いは適当な宿主細胞等に適合したシグナルペプチドを付
加して宿主細胞等から分泌産生させることもできる。
【００３４】このような場合において、それに用いる遺
伝子のＤＮＡ配列中には、開始コドン及び終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては、細胞の分泌タンパ
ク質前駆体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタ
マーゼ、リン酸結合タンパク質、アルカリホスファター
ゼ、バチルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌
及びグラム陽性細菌に関連したものが挙げられる。
伝子のＤＮＡ配列中には、開始コドン及び終止コドンが
必要で、必要に応じてそれらは公知の方法を用いて付与
される。上記宿主細胞等に適合したシグナルペプチドと
して好適に使用されるものとしては、細胞の分泌タンパ
ク質前駆体のものがあげられ、例えば大腸菌β−ラクタ
マーゼ、リン酸結合タンパク質、アルカリホスファター
ゼ、バチルス属の中性プロテアーゼ等のグラム陰性細菌
及びグラム陽性細菌に関連したものが挙げられる。
【００３５】更にまた、例えばインターフェロン、イン
ターロイキン２、プロインシュリン、各種ホルモンと一
緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもできる
。本発明の遺伝子を発現用ベクターに組換えるにあたっ
ては、公知の遺伝子組換え技術で用いられる通常の方法
に従って行うことができ、例えば各種制限酵素によるラ
イゲーション処理等があげられる。
ターロイキン２、プロインシュリン、各種ホルモンと一
緒に宿主細胞中で当該遺伝子を発現させることもできる
。本発明の遺伝子を発現用ベクターに組換えるにあたっ
ては、公知の遺伝子組換え技術で用いられる通常の方法
に従って行うことができ、例えば各種制限酵素によるラ
イゲーション処理等があげられる。
【００３６】ここで利用される発現用ベクターとしては
、宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使
用できるが、そのベクター中に複製起源、選択マーカー
、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル
化シグナルなどを有するものが好ましく使用できる。 またこれらベクターとしては、各種バクテリア由来のも
の、バクテリオファージ由来のもの、動物ウイルス由来
のものがあげられ、各種ウイルスベクター、各種プラス
ミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター等
があげられる。
、宿主中で自律複製できるものであれば特に制限なく使
用できるが、そのベクター中に複製起源、選択マーカー
、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル
化シグナルなどを有するものが好ましく使用できる。 またこれらベクターとしては、各種バクテリア由来のも
の、バクテリオファージ由来のもの、動物ウイルス由来
のものがあげられ、各種ウイルスベクター、各種プラス
ミドベクター、コスミドベクター、シャトルベクター等
があげられる。
【００３７】またこれらベクターとしては、大腸菌、特
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクター
、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等があ
げられる。上記ベクターで利用できるプロモーターとし
ては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクト
ース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクト
ース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由来
のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に良
く知られたものが挙げられる。
にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプファージベ
クター、緑膿菌由来のベクター、枯草菌由来のベクター
、酵母由来のベクター、ＳＶ４０由来のベクター等があ
げられる。上記ベクターで利用できるプロモーターとし
ては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクト
ース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクト
ース（ｔａｃ）プロモーター、バクテリオファージ由来
のラムダ（λ）ＰＬプロモーター等の各種の当業者に良
く知られたものが挙げられる。
【００３８】これらの遺伝制御配列は、適宜それらを組
み合わせたり、あるいは化学的に修飾したりして適当な
ベクターに組み込んで、本発明の遺伝子発現用のベクタ
ーを構築することができる。本発明の遺伝子発現用のベ
クターには、さらに複数個の本発明の遺伝子を組み込ん
でその発現を行うこともできる。
み合わせたり、あるいは化学的に修飾したりして適当な
ベクターに組み込んで、本発明の遺伝子発現用のベクタ
ーを構築することができる。本発明の遺伝子発現用のベ
クターには、さらに複数個の本発明の遺伝子を組み込ん
でその発現を行うこともできる。
【００３９】本発明のプロラクチンのアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子発現ベクターは、これを適当な宿主、特
に宿主細胞に通常知られた方法に従って導入して、その
宿主細胞を形質転換させ、次にそのようにして形質転換
された宿主細胞を培養等の方法により増殖させること等
により、大量に形質転換体と呼ばれる該プロラクチンの
アミノ酸配列を有するペプチド産生能を有する細胞を得
ることができる。
ードする遺伝子発現ベクターは、これを適当な宿主、特
に宿主細胞に通常知られた方法に従って導入して、その
宿主細胞を形質転換させ、次にそのようにして形質転換
された宿主細胞を培養等の方法により増殖させること等
により、大量に形質転換体と呼ばれる該プロラクチンの
アミノ酸配列を有するペプチド産生能を有する細胞を得
ることができる。
【００４０】ここで使用される宿主、特に宿主細胞とし
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよいが、大腸菌が好適に使用で
きる。上記宿主への本発明の遺伝子発現ベクターの及び
これによる形質転換方法としては、通常遺伝子組換え技
術の分野で使用せられている方法を用いることができ、
例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合したり
、細胞をプロトプラスト化したのち、上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
ては、大腸菌あるいは大腸菌以外のグラム陰性細菌、枯
草菌、放線菌等のグラム陽性細菌、酵母、動植物細胞等
の真核細胞のいずれでもよいが、大腸菌が好適に使用で
きる。上記宿主への本発明の遺伝子発現ベクターの及び
これによる形質転換方法としては、通常遺伝子組換え技
術の分野で使用せられている方法を用いることができ、
例えばコンピテント細胞と上記ベクターとを混合したり
、細胞をプロトプラスト化したのち、上記ベクターを担
体に結合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシ
ウム共沈法等を用いて行うことができる。
【００４１】このようにして得られた形質転換体は、そ
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖したのち、該
遺伝子の発現を誘導することもできる。この形質転換体
の増殖あるいは培養は、通常の各種の細胞培養用培地を
用いて行うことができ、そのようなものとしては、例え
ば炭素源、窒素源、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基、無
機塩などを含有し、適宜肉汁、ペプトン、カザミノ酸、
酵母エキス、魚肉エキス、バレイショ、麦芽汁、牛乳、
血液、血清、ホルモン、抗生物質などを加えたものがあ
げられるが、好適な培地は一般に広く市販されているも
のを使用してそれをそのままあるいは適当に改変して用
いることができる。
の外来遺伝子の発現を抑制した状態で増殖したのち、該
遺伝子の発現を誘導することもできる。この形質転換体
の増殖あるいは培養は、通常の各種の細胞培養用培地を
用いて行うことができ、そのようなものとしては、例え
ば炭素源、窒素源、ビタミン、アミノ酸、核酸塩基、無
機塩などを含有し、適宜肉汁、ペプトン、カザミノ酸、
酵母エキス、魚肉エキス、バレイショ、麦芽汁、牛乳、
血液、血清、ホルモン、抗生物質などを加えたものがあ
げられるが、好適な培地は一般に広く市販されているも
のを使用してそれをそのままあるいは適当に改変して用
いることができる。
【００４２】上記形質転換体の増殖又は培養にあたって
は、該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、攪
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖又は培養する
ことにより、あるいは該遺伝子の発現を誘導することに
より産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質
は、通常の操作により分離採取することができる。
は、該形質転換体の生育に適したｐＨ、温度、通気、攪
拌、培地交換の頻度等の条件は、実験等により適宜決定
することができる。上記形質転換体を増殖又は培養する
ことにより、あるいは該遺伝子の発現を誘導することに
より産生された本発明の遺伝子発現に基づくタンパク質
は、通常の操作により分離採取することができる。
【００４３】この分離採取法としては、例えば細胞の超
音波破砕、機械的破砕、凍結及び融解による方法、浸透
圧ショック等による方法のほか、培養上清から、例えば
タンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離する
方法などがあげられる。上記の分離方法に加えて、更に
目的とするタンパク質は、その物理学的性質や化学的性
質を利用して、一般に広く採用されている各種分離精製
方法を適用して精製をすることができる。
音波破砕、機械的破砕、凍結及び融解による方法、浸透
圧ショック等による方法のほか、培養上清から、例えば
タンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理する等して分離する
方法などがあげられる。上記の分離方法に加えて、更に
目的とするタンパク質は、その物理学的性質や化学的性
質を利用して、一般に広く採用されている各種分離精製
方法を適用して精製をすることができる。
【００４４】このような分離精製方法としては、上記し
た硫安等の蛋白沈澱剤を用いる沈澱処理のほか、限外濾
過処理、ゲル濾過処理、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等ある
いはそれらの組合せを用いることができる。さらにまた
、上記したような形質転換体から採取された蛋白質は、
適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶液で処
理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で、その
活性なものとすることができる。本発明のプロラクチン
、特にカレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来のプロラク
チンは、その生物活性を次に示すような方法で容易に確
認することができる。これは、ヒラメ幼魚を個体識別し
うるようになしてから、その幼魚の腹腔内あるいは筋肉
内に体重ｇあたり０．０１〜０．１μｇ４日ごとに投与
した後、その体重増加及び体長増加を測定することによ
り行うことができる。
た硫安等の蛋白沈澱剤を用いる沈澱処理のほか、限外濾
過処理、ゲル濾過処理、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー、電気泳動等ある
いはそれらの組合せを用いることができる。さらにまた
、上記したような形質転換体から採取された蛋白質は、
適当な変性、再生処理等、例えば、グアニジン溶液で処
理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で、その
活性なものとすることができる。本発明のプロラクチン
、特にカレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体由来のプロラク
チンは、その生物活性を次に示すような方法で容易に確
認することができる。これは、ヒラメ幼魚を個体識別し
うるようになしてから、その幼魚の腹腔内あるいは筋肉
内に体重ｇあたり０．０１〜０．１μｇ４日ごとに投与
した後、その体重増加及び体長増加を測定することによ
り行うことができる。
【００４５】
【実施例】以下に実施例を記載し、本発明を詳細に説明
する。 実施例１ ヒラメプロラクチンの抽出 １年齢のヒラメ１７０尾より脳下垂体１．２ｇを摘出し
、ただちに液体窒素で凍結後使用時まで−８０℃で保存
した。この脳下垂体１．２ｇを氷冷中塩酸−アセトン（
１：２８）溶液３ｍｌ中ガラスホモジュナイザーで破砕
後１ｈ氷上で酸−アセトン抽出を行った後日立製作所製
遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１０，０００ｒｐ
ｍ、１０分間０℃で遠心分離する。得られた沈澱は更に
３ｍｌの８０％アセトン中でホモジュナイズ後１ｈ氷上
で抽出し上記で得られた遠心上清と共に上記遠心分離機
において１０，０００ｒｐｍ、１０分間０℃で遠心分離
を行う。得られた抽出物は−２０℃のアセトン中に滴下
することによりアセトン沈澱を行い、上清を除いた後沈
澱物を凍結乾燥する。得られた抽出物は約２６ｍｇであ
った。
する。 実施例１ ヒラメプロラクチンの抽出 １年齢のヒラメ１７０尾より脳下垂体１．２ｇを摘出し
、ただちに液体窒素で凍結後使用時まで−８０℃で保存
した。この脳下垂体１．２ｇを氷冷中塩酸−アセトン（
１：２８）溶液３ｍｌ中ガラスホモジュナイザーで破砕
後１ｈ氷上で酸−アセトン抽出を行った後日立製作所製
遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１０，０００ｒｐ
ｍ、１０分間０℃で遠心分離する。得られた沈澱は更に
３ｍｌの８０％アセトン中でホモジュナイズ後１ｈ氷上
で抽出し上記で得られた遠心上清と共に上記遠心分離機
において１０，０００ｒｐｍ、１０分間０℃で遠心分離
を行う。得られた抽出物は−２０℃のアセトン中に滴下
することによりアセトン沈澱を行い、上清を除いた後沈
澱物を凍結乾燥する。得られた抽出物は約２６ｍｇであ
った。
【００４６】実施例２
ヒラメプロラクチンの精製
上記で得た粉末を３ｍｌの０．１Ｎ酢酸に溶解し同溶液
で平衡化したセファデックスＧ−７５カラムにより分画
した。溶出条件は前流７０ｍｌ、流速１５ｍｌ／時とし
試験管一本当りの分取量を３ｍｌとし、２８０ｎｍの吸
光度でタンパク質含量を測定し６つの画分を得た（第１
図）。第１図に示す画分３を凍結乾燥し５．８ｍｇの白
色粉末を得た。次にこれをＯＤＳ１２０Ｔカラムにより
ＨＰＬＣにかけ精製した。ＨＰＬＣの溶出条件は０．１
％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル２０−８０％直線
勾配、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分とし２２０ｎ
ｍの吸光度でタンパク質含量を測定しヒラメプロラクチ
ンを分取した（第２図）。得られた画分Ａは下記に示す
ような物理化学的性質を示した。
で平衡化したセファデックスＧ−７５カラムにより分画
した。溶出条件は前流７０ｍｌ、流速１５ｍｌ／時とし
試験管一本当りの分取量を３ｍｌとし、２８０ｎｍの吸
光度でタンパク質含量を測定し６つの画分を得た（第１
図）。第１図に示す画分３を凍結乾燥し５．８ｍｇの白
色粉末を得た。次にこれをＯＤＳ１２０Ｔカラムにより
ＨＰＬＣにかけ精製した。ＨＰＬＣの溶出条件は０．１
％トリフルオロ酢酸、アセトニトリル２０−８０％直線
勾配、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分とし２２０ｎ
ｍの吸光度でタンパク質含量を測定しヒラメプロラクチ
ンを分取した（第２図）。得られた画分Ａは下記に示す
ような物理化学的性質を示した。
【００４７】実施例３
分子量の測定
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で上記画分Ａを
展開し、ヒラメプロラクチンは約２２，０００の分子量
を持つことが分かった。また同時に画分Ａは単一バンド
を与えた。なお、標準分子量マーカーとしては、ファル
マシア社製着色済み分子量マーカーＬＭＷｋｉｔＥ、分
子量９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０
，０００；２０，０００；１４，０００を用いた。
展開し、ヒラメプロラクチンは約２２，０００の分子量
を持つことが分かった。また同時に画分Ａは単一バンド
を与えた。なお、標準分子量マーカーとしては、ファル
マシア社製着色済み分子量マーカーＬＭＷｋｉｔＥ、分
子量９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０
，０００；２０，０００；１４，０００を用いた。
【００４８】実施例４ アミノ酸組成の分析該ヒラメ
プロラクチン０．１μｇを０．６％フェノールを含む６
Ｎ塩酸２０μｌにより１１０℃で１８時間加水分解した
のち、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）でアミ
ノ酸をフェニルチオカルバミル誘導体に変換後、逆相Ｈ
ＰＬＣで定量するＰＩＴＣ法に従った。ＨＰＬＣの条件
はカラムＴＳＫ ＯＤＳ８０Ｔ（東ソー社製、０．４
×２５ｃｍ）、溶出条件はＡ液０．１４Ｍ酢酸ナトリウ
ムｐＨ５．４；アセトニトリル＝９０：１０（０．０５
％トリエチルアミンを含む）Ｂ液６０％アセトニトリル
を用い、イニシャルＡ液１００％−Ｂ液８０％とし、２
０分、直線グラジエントで行い、カラム温度４５℃、流
速１ｍｌ／分とし、２５４ｎｍにおける吸光度でアミノ
酸の含量を測定した。結果を次表に示した。
プロラクチン０．１μｇを０．６％フェノールを含む６
Ｎ塩酸２０μｌにより１１０℃で１８時間加水分解した
のち、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）でアミ
ノ酸をフェニルチオカルバミル誘導体に変換後、逆相Ｈ
ＰＬＣで定量するＰＩＴＣ法に従った。ＨＰＬＣの条件
はカラムＴＳＫ ＯＤＳ８０Ｔ（東ソー社製、０．４
×２５ｃｍ）、溶出条件はＡ液０．１４Ｍ酢酸ナトリウ
ムｐＨ５．４；アセトニトリル＝９０：１０（０．０５
％トリエチルアミンを含む）Ｂ液６０％アセトニトリル
を用い、イニシャルＡ液１００％−Ｂ液８０％とし、２
０分、直線グラジエントで行い、カラム温度４５℃、流
速１ｍｌ／分とし、２５４ｎｍにおける吸光度でアミノ
酸の含量を測定した。結果を次表に示した。
【００４９】
【表１】
【００５０】該ヒラメプロラクチンは４個のシステイン
を持ち、ロイシン、セリンに富むというプロラクチン様
の性質を示した。
を持ち、ロイシン、セリンに富むというプロラクチン様
の性質を示した。
【００５１】実施例５
Ｎ末端アミノ酸配列の決定
該ヒラメプロラクチン１０μｇを島津製作所製気相ペプ
チドシークエンサーにかけて、Ｎ末端側アミノ酸配列を
決定した。決定されたＮ末端側２２個のアミノ酸配列は
、次のとおりである。
チドシークエンサーにかけて、Ｎ末端側アミノ酸配列を
決定した。決定されたＮ末端側２２個のアミノ酸配列は
、次のとおりである。
【００５２】
【化４】
【００５３】実施例６
ヒラメ脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーの作製ヒラメ脳下
垂体よりＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＲＮＡ抽出キットを用い
全ＲＮＡを抽出した。ヒラメ脳下垂体１．０ｇを２０ｍ
ｌのグアニジン・チオシアネート溶液（グアニジン・チ
オシアネート、８％β−メルカプトエタノールからなる
溶液）中氷浴上で破砕し、０．３容量のエタノールを加
え日立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１
０，０００ｒｐｍ、５分間、０℃で遠心し沈澱させたの
ち、上清を除きさらに上記グアニジン・チオシアネート
溶液に懸濁し、塩化リチウム溶液３０ｍｌを加え、０℃
１６時間静置してＲＮＡを選択的に沈澱させた後、日立
製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１０，０
００ｒｐｍ、９０分間遠心分離する。次に得られた沈澱
を、尿素を含む塩化リチウム溶液３５ｍｌに溶解し、上
記遠心分離機で１０，０００ｒｐｍ、６０分間、４℃で
遠心分離し、上清を除いた後ＲＮＡバッファー５ｍｌに
溶解し、フェノール抽出（フェノール５ｍｌ、室温で６
０分間抽出２回）、クロロホルム抽出（クロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：１）５ｍｌ、５秒間混合
）ついでエタノール沈澱（エタノール２０ｍｌ、２Ｍ酢
酸ナトリウムｐＨ５．０、０．５ｍｌ、−２０℃で１６
時間沈澱させた後上記遠心分離機で９，０００ｒｐｍ、
４℃で３０分間遠心分離する。）により全ＲＮＡを精製
した。得られた全ＲＮＡは、３．６ｍｇであった。
垂体よりＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＲＮＡ抽出キットを用い
全ＲＮＡを抽出した。ヒラメ脳下垂体１．０ｇを２０ｍ
ｌのグアニジン・チオシアネート溶液（グアニジン・チ
オシアネート、８％β−メルカプトエタノールからなる
溶液）中氷浴上で破砕し、０．３容量のエタノールを加
え日立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１
０，０００ｒｐｍ、５分間、０℃で遠心し沈澱させたの
ち、上清を除きさらに上記グアニジン・チオシアネート
溶液に懸濁し、塩化リチウム溶液３０ｍｌを加え、０℃
１６時間静置してＲＮＡを選択的に沈澱させた後、日立
製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳＣＲ２０Ｂで１０，０
００ｒｐｍ、９０分間遠心分離する。次に得られた沈澱
を、尿素を含む塩化リチウム溶液３５ｍｌに溶解し、上
記遠心分離機で１０，０００ｒｐｍ、６０分間、４℃で
遠心分離し、上清を除いた後ＲＮＡバッファー５ｍｌに
溶解し、フェノール抽出（フェノール５ｍｌ、室温で６
０分間抽出２回）、クロロホルム抽出（クロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：１）５ｍｌ、５秒間混合
）ついでエタノール沈澱（エタノール２０ｍｌ、２Ｍ酢
酸ナトリウムｐＨ５．０、０．５ｍｌ、−２０℃で１６
時間沈澱させた後上記遠心分離機で９，０００ｒｐｍ、
４℃で３０分間遠心分離する。）により全ＲＮＡを精製
した。得られた全ＲＮＡは、３．６ｍｇであった。
【００５４】次にこれをバッファー（０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．１
％ＳＤＳ，ｐＨ７．６）１ｍｌに溶解し、ＳＤＳ溶液中
で、オリゴｄＴセルロースカラム（５′−３′Ｐｒｉｍ
ｅ社製、カラム容積１ｍｌ）に通すことによりポリ（Ａ
）ＲＮＡを精製した。全ＲＮＡ１ｍｇより得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、合計２０μｇであった。
Ｃｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，０．１
％ＳＤＳ，ｐＨ７．６）１ｍｌに溶解し、ＳＤＳ溶液中
で、オリゴｄＴセルロースカラム（５′−３′Ｐｒｉｍ
ｅ社製、カラム容積１ｍｌ）に通すことによりポリ（Ａ
）ＲＮＡを精製した。全ＲＮＡ１ｍｇより得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、合計２０μｇであった。
【００５５】次にこのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて相補的
ＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡの合成はｃＤＮＡ合成
システムプラス（アマシャム社製）を用いて行った。ヒ
ラメ下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ５μｇを１ｓｔ ｓｔｒ
ａｎｄ合成用バッファー溶液２５μｌに溶解し、デオキ
シヌクレオシド三リン酸混液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、及びｄＣＴＰをそれぞれ含有）５μｌ、０．１
７ ＯＤ Ｕｎｉｔｓ オリゴ（ｄＴ１２−１８
）プライマー２．５μｌ及び１００Ｕｎｉｔｓの逆転写
酵素を加えて、全量を５０μｌとし、４２℃で６０分間
反応させて、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成した。
ＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡの合成はｃＤＮＡ合成
システムプラス（アマシャム社製）を用いて行った。ヒ
ラメ下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ５μｇを１ｓｔ ｓｔｒ
ａｎｄ合成用バッファー溶液２５μｌに溶解し、デオキ
シヌクレオシド三リン酸混液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、及びｄＣＴＰをそれぞれ含有）５μｌ、０．１
７ ＯＤ Ｕｎｉｔｓ オリゴ（ｄＴ１２−１８
）プライマー２．５μｌ及び１００Ｕｎｉｔｓの逆転写
酵素を加えて、全量を５０μｌとし、４２℃で６０分間
反応させて、ＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成した。
【００５６】次に、得られた反応液５０μｌに、２ｎｄ
ｓｔｒａｎｄ合成用バッファー溶液９３．５μｌ、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ １１５単位、大腸菌リボ
ヌクレアーゼ ４単位を加えて、全量を２５０μｌと
し、１２℃で６０分間、次いで２２℃、６０分間反応さ
せ、さらに７０℃、１０分間加熱して反応を停止させ、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を加え３７℃、１０分
間反応させ平滑末端のｃＤＮＡを合成した。
ｓｔｒａｎｄ合成用バッファー溶液９３．５μｌ、
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ １１５単位、大腸菌リボ
ヌクレアーゼ ４単位を加えて、全量を２５０μｌと
し、１２℃で６０分間、次いで２２℃、６０分間反応さ
せ、さらに７０℃、１０分間加熱して反応を停止させ、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を加え３７℃、１０分
間反応させ平滑末端のｃＤＮＡを合成した。
【００５７】上記反応液に、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）２０μｌを加えて、反応を停止させ、該反
応液を、フェノール−クロロホルム抽出（フェノール１
２５μｌ、クロロホルム１２５μｌ、室温で数分間２回
抽出）、ついでエタノール沈澱（エタノール５００μｌ
、ドライアイス上で１０分間沈澱させた後ＴＯＭＹ社製
ＭＣＸ−１５０で１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分
離する。）により、３μｇのｃＤＮＡを得た。
ｐＨ８．０）２０μｌを加えて、反応を停止させ、該反
応液を、フェノール−クロロホルム抽出（フェノール１
２５μｌ、クロロホルム１２５μｌ、室温で数分間２回
抽出）、ついでエタノール沈澱（エタノール５００μｌ
、ドライアイス上で１０分間沈澱させた後ＴＯＭＹ社製
ＭＣＸ−１５０で１２，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分
離する。）により、３μｇのｃＤＮＡを得た。
【００５８】次に得られたヒラメ脳下垂体ポリ（Ａ）Ｒ
ＮＡに相補的なＤＮＡをλｇｔ１０に組み込み、ヒラメ
脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリ
ーの構築にあたってはアマシャム社のｃＤＮＡクローニ
ングシステムλｇｔ１０を得た。ヒラメ下垂体ｃＤＮＡ
１μｇを含むＥｃｏＲＩ部位メチル化反応用バッフ
ァー溶液１０μｌに、２０単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
、アデノシルメチオニン液２μｌを加えて、全量を２０
μｌとし、３７℃で６０分間反応させ、次に得られた反
応液を７０℃で１０分間加熱し、反応を停止させた。
ＮＡに相補的なＤＮＡをλｇｔ１０に組み込み、ヒラメ
脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリ
ーの構築にあたってはアマシャム社のｃＤＮＡクローニ
ングシステムλｇｔ１０を得た。ヒラメ下垂体ｃＤＮＡ
１μｇを含むＥｃｏＲＩ部位メチル化反応用バッフ
ァー溶液１０μｌに、２０単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ
、アデノシルメチオニン液２μｌを加えて、全量を２０
μｌとし、３７℃で６０分間反応させ、次に得られた反
応液を７０℃で１０分間加熱し、反応を停止させた。
【００５９】次に、得られた反応液２０μｌに、ライゲ
ーションバッファー溶液３μｌ、５単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ、ＥｃｏＲＩリンカー２μｌ（２μｇ）を加えて
、全量を３０μｌとし、１５℃で１６〜２０時間反応さ
せて、ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加した。更に
次に、得られた反応液３０μｌに、ＥｃｏＲＩ消化バッ
ファー溶液１０μｌ、１００単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ
を加えて、全量を１００μｌとし、３７℃で５時間反応
させて、ｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩリンカー由来のＥ
ｃｏＲＩ粘着末端を形成させた。
ーションバッファー溶液３μｌ、５単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ、ＥｃｏＲＩリンカー２μｌ（２μｇ）を加えて
、全量を３０μｌとし、１５℃で１６〜２０時間反応さ
せて、ｃＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加した。更に
次に、得られた反応液３０μｌに、ＥｃｏＲＩ消化バッ
ファー溶液１０μｌ、１００単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ
を加えて、全量を１００μｌとし、３７℃で５時間反応
させて、ｃＤＮＡの末端にＥｃｏＲＩリンカー由来のＥ
ｃｏＲＩ粘着末端を形成させた。
【００６０】該得られた反応液を、キット添付のゲル濾
過カラムに通すことにより得られた溶出液を、エタノー
ル沈澱（エタノール８００ｍｌ、−２０℃で２時間沈澱
させた後ＴＯＭＹ社製ＭＣＸ−１５０で１２，０００ｒ
ｐｍ、３０分間遠心分離する。）することにより、Ｅｃ
ｏＲＩリンカー由来のＥｃｏＲＩ粘着末端を有するｃＤ
ＮＡを得た。
過カラムに通すことにより得られた溶出液を、エタノー
ル沈澱（エタノール８００ｍｌ、−２０℃で２時間沈澱
させた後ＴＯＭＹ社製ＭＣＸ−１５０で１２，０００ｒ
ｐｍ、３０分間遠心分離する。）することにより、Ｅｃ
ｏＲＩリンカー由来のＥｃｏＲＩ粘着末端を有するｃＤ
ＮＡを得た。
【００６１】次に、得られたＥｃｏＲＩリンカー由来の
ＥｃｏＲＩ粘着末端を有するｃＤＮＡ３００ｎｇを有す
る液５μｌに、ライゲーションバッファー溶液１μｌ、
２．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、λｇｔ１０ＥｃｏＲ
Ｉ断片２μｌ（１μｇ）を加えて、全量を１０μｌとし
、１５℃で１６〜２０時間反応させて、該ヒラメ脳下垂
体ｃＤＮＡを組み込んだλｇｔ１０ＤＮＡコニカテマー
を合成した。
ＥｃｏＲＩ粘着末端を有するｃＤＮＡ３００ｎｇを有す
る液５μｌに、ライゲーションバッファー溶液１μｌ、
２．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、λｇｔ１０ＥｃｏＲ
Ｉ断片２μｌ（１μｇ）を加えて、全量を１０μｌとし
、１５℃で１６〜２０時間反応させて、該ヒラメ脳下垂
体ｃＤＮＡを組み込んだλｇｔ１０ＤＮＡコニカテマー
を合成した。
【００６２】この組換えλｇｔ１０ＤＮＡコンカテマー
をキットに添付のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングエ
クストラクトによりパッケージング処理し、大腸菌ＮＭ
５１４において３．３×１０５リコビナント／μｇｃＤ
ＮＡの効率をもつヒラメ脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー
を得た。
をキットに添付のｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングエ
クストラクトによりパッケージング処理し、大腸菌ＮＭ
５１４において３．３×１０５リコビナント／μｇｃＤ
ＮＡの効率をもつヒラメ脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー
を得た。
【００６３】実施例７
ヒラメプロラクチンｃＤＮＡの選択
ヒラメ脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーからのヒラメプロ
ラクチンｃＤＮＡの選択には、該ヒラメプロラクチンの
Ｎ末端側アミノ酸配列の第１番目から第１３番目までの
アミノ酸の配列に対応する合成ＤＮＡ（ＤＮＡ合成装置
、サイクロンミリジェン社製を用いて製造）をプローブ
として用いた。それは次のような塩基配列を有する。
ラクチンｃＤＮＡの選択には、該ヒラメプロラクチンの
Ｎ末端側アミノ酸配列の第１番目から第１３番目までの
アミノ酸の配列に対応する合成ＤＮＡ（ＤＮＡ合成装置
、サイクロンミリジェン社製を用いて製造）をプローブ
として用いた。それは次のような塩基配列を有する。
【００６４】
【化５】
【００６５】該ブローブは〔α−３２Ｐ〕ｄｄＡＴＰ及
び３′末端標識システム（ＮＥＮ／Ｄｕｐｏｎｔ）によ
って標識して用いた。実施例６で得られたライブラリー
２×１０４ＰｆｕをＬＢ培地で１６時間培養した大腸菌
ＮＭ５１４ ５０μｌに感染させ、９ｃｍのＬＢプレ
ートに重層し、生じたプラークのＤＮＡをナイロンフィ
ルター上に固定し、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））にした
がって、プラークハイブリダイゼーションを行った。
び３′末端標識システム（ＮＥＮ／Ｄｕｐｏｎｔ）によ
って標識して用いた。実施例６で得られたライブラリー
２×１０４ＰｆｕをＬＢ培地で１６時間培養した大腸菌
ＮＭ５１４ ５０μｌに感染させ、９ｃｍのＬＢプレ
ートに重層し、生じたプラークのＤＮＡをナイロンフィ
ルター上に固定し、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２））にした
がって、プラークハイブリダイゼーションを行った。
【００６６】プローブの洗浄は１ＸＳＳＣ（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム
）０．１％ＳＤＳ液で４５℃、２回６０分間ずつ行い、
上記標識プローブに強く結合したものに対応するプラー
クを選択し、該ヒラメプロラクチンのｃＤＮＡをもつク
ローンを２０個得た。
ＮａＣｌ ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム
）０．１％ＳＤＳ液で４５℃、２回６０分間ずつ行い、
上記標識プローブに強く結合したものに対応するプラー
クを選択し、該ヒラメプロラクチンのｃＤＮＡをもつク
ローンを２０個得た。
【００６７】実施例８
プロラクチンのｃＤＮＡの塩基配列の決定実施例７で得
られた組換えファージ２０個から、該ヒラメプロラクチ
ンのｃＤＮＡをもつ組換えλｇｔ１０ＤＮＡを単離し、
ＥｃｏＲＩ処理により該ヒラメプロラクチンのｃＤＮＡ
を単離した。得られたプロラクチンのｃＤＮＡを、種々
の制限酵素で消化し、制限酵素地図を作製した結果、そ
れぞれ同一の制限酵素地図を持つことが判明した。得ら
れたクローンのうち最も長い配列をもつクローンを選び
（ｃｆＰＲＬ７（１．３Ｋｂ））、サンガー法（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７）に
よって全塩基配列を決定した。
られた組換えファージ２０個から、該ヒラメプロラクチ
ンのｃＤＮＡをもつ組換えλｇｔ１０ＤＮＡを単離し、
ＥｃｏＲＩ処理により該ヒラメプロラクチンのｃＤＮＡ
を単離した。得られたプロラクチンのｃＤＮＡを、種々
の制限酵素で消化し、制限酵素地図を作製した結果、そ
れぞれ同一の制限酵素地図を持つことが判明した。得ら
れたクローンのうち最も長い配列をもつクローンを選び
（ｃｆＰＲＬ７（１．３Ｋｂ））、サンガー法（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４，５４６３−５４６７）に
よって全塩基配列を決定した。
【００６８】なお、ＤＮＡ断片ｃｆＰＲＬ７を保持する
大腸菌ＮＭ５１４（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ｆＰＲＬ７と命名）は、工業技術院微生物
工業技術研究所にブダペスト条約に基づいて寄託されて
いる（微工研条寄第３３３３号（ＦＥＲＭＢＰ−３３３
３））。塩基配列決定のストラテジーを第３図に示す。 塩基配列決定は制限酵素による消化でｄｅｌｅｔｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔを作成して行い、適当な制限酵素部位
がない場合はｐｒｉｍｅｒを合成して行った。
大腸菌ＮＭ５１４（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ｆＰＲＬ７と命名）は、工業技術院微生物
工業技術研究所にブダペスト条約に基づいて寄託されて
いる（微工研条寄第３３３３号（ＦＥＲＭＢＰ−３３３
３））。塩基配列決定のストラテジーを第３図に示す。 塩基配列決定は制限酵素による消化でｄｅｌｅｔｉｏｎ
ｍｕｔａｎｔを作成して行い、適当な制限酵素部位
がない場合はｐｒｉｍｅｒを合成して行った。
【００６９】決定されたヒラメプロラクチンの塩基配列
を第４図に示す。第４図に示された塩基配列のうち塩基
数１−７２が、シグナルペプチドを、７３−６３３が該
プロラクチンの成熟タンパク質をコードする。このｃＤ
ＮＡの塩基配列は、既に決定された該プロラクチンのア
ミノ酸配列から予測される塩基配列と完全に一致し、該
ｃＤＮＡは、ヒラメプロラクチンから既に決定された該
プロラクチンのアミノ酸配列をコードすることが確認さ
れた。このｃＤＮＡの塩基配列は、過去に発見されたプ
ロラクチンなどと有意な相同性を持つことが認められた
。
を第４図に示す。第４図に示された塩基配列のうち塩基
数１−７２が、シグナルペプチドを、７３−６３３が該
プロラクチンの成熟タンパク質をコードする。このｃＤ
ＮＡの塩基配列は、既に決定された該プロラクチンのア
ミノ酸配列から予測される塩基配列と完全に一致し、該
ｃＤＮＡは、ヒラメプロラクチンから既に決定された該
プロラクチンのアミノ酸配列をコードすることが確認さ
れた。このｃＤＮＡの塩基配列は、過去に発見されたプ
ロラクチンなどと有意な相同性を持つことが認められた
。
【００７０】実施例９
ヒラメプロラクチンをコードする組換体プラスミドの作
製 ヒラメプロラクチンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドｐｆＰＲＬ７５μｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２５０ｍＭ
ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール，
１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンの反応液（以下Ｈ
バッファーという）２０μｌに溶解し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＢｓｐＭＩ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）そ
れぞれ３０単位を加え、３７℃、２時間反応を行った。 反応液をフェノール抽出後、アガロースゲル電気泳動に
より約１．２Ｋｂのヒラメプロラクチンのアミノ酸配列
をコードする部分を切り出し、ＤＮＡ精製用キットＧｅ
ｎｅｃｌｅａｎ（フナコシ薬品製）によりＤＮＡを回収
しｃｆＰＲＬ７ＤＮＡにコードされる成熟ヒラメプロラ
クチン翻訳領域、３′非翻訳領域を含む約１．２Ｋｂｐ
の断片約０．１μｇを得た。
製 ヒラメプロラクチンをコードするＤＮＡを含むプラスミ
ドｐｆＰＲＬ７５μｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２５０ｍＭ
ＮａＣｌ，７ｍＭ ２−メルカプトエタノール，
１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンの反応液（以下Ｈ
バッファーという）２０μｌに溶解し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＢｓｐＭＩ（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）そ
れぞれ３０単位を加え、３７℃、２時間反応を行った。 反応液をフェノール抽出後、アガロースゲル電気泳動に
より約１．２Ｋｂのヒラメプロラクチンのアミノ酸配列
をコードする部分を切り出し、ＤＮＡ精製用キットＧｅ
ｎｅｃｌｅａｎ（フナコシ薬品製）によりＤＮＡを回収
しｃｆＰＲＬ７ＤＮＡにコードされる成熟ヒラメプロラ
クチン翻訳領域、３′非翻訳領域を含む約１．２Ｋｂｐ
の断片約０．１μｇを得た。
【００７１】別に原核細胞発現用ベクター（ファルマシ
ア社製）をＨバッファーに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
（東洋紡績社製）２０単位を加え、３７℃、１時間反応
を行い、反応液をエタノール沈澱後５０ｎｌの６７ｍＭ
ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、３３μＭ
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
）に溶解し、２０単位のＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（東洋紡績社製）を加え、室温、３０分間反応させ
、アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）（東洋紡績社製）
１単位を加え、６０℃、３０分間反応させた。反応液を
フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。
ア社製）をＨバッファーに溶解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ
（東洋紡績社製）２０単位を加え、３７℃、１時間反応
を行い、反応液をエタノール沈澱後５０ｎｌの６７ｍＭ
ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ
２、１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、３３μＭ
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
）に溶解し、２０単位のＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（東洋紡績社製）を加え、室温、３０分間反応させ
、アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）（東洋紡績社製）
１単位を加え、６０℃、３０分間反応させた。反応液を
フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈澱
によりＤＮＡを回収した。
【００７２】次に開始コドン（ＡＴＧ）と成熟プロラク
チンの５′末端ＧＴＣ（Ｖａｌ）から切断部位までを含
む２種のオリゴヌクレオチド（３１、３１量体）を合成
した。合成はモデル３８１Ａシンセサイザー（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて行った。３１量体の
オリゴヌクレオチド２μｇを５０μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００
ｎＭ ＡＴＰ溶液に溶解し、１０単位のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（東洋紡績社製）を加え、３７℃、３
０分間反応させた。フェノール処理後、セファデックス
Ｇ−５０（ファルマシア社製）カラム（容量０．９ｍｌ
）により未反応のＡＴＰを除いた。リン酸化された３１
量体とすでに合成した３０量体のオリゴヌクレオチドを
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、７５℃
、５分間加熱後、室温まで徐冷し、下記の配列を持つＤ
ＮＡリンカーを作製した。
チンの５′末端ＧＴＣ（Ｖａｌ）から切断部位までを含
む２種のオリゴヌクレオチド（３１、３１量体）を合成
した。合成はモデル３８１Ａシンセサイザー（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて行った。３１量体の
オリゴヌクレオチド２μｇを５０μｌの５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００
ｎＭ ＡＴＰ溶液に溶解し、１０単位のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（東洋紡績社製）を加え、３７℃、３
０分間反応させた。フェノール処理後、セファデックス
Ｇ−５０（ファルマシア社製）カラム（容量０．９ｍｌ
）により未反応のＡＴＰを除いた。リン酸化された３１
量体とすでに合成した３０量体のオリゴヌクレオチドを
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、７５℃
、５分間加熱後、室温まで徐冷し、下記の配列を持つＤ
ＮＡリンカーを作製した。
【００７３】
【化６】
【００７４】上記のようにして得たｃｆＰＲＬ７のＢｓ
ｐＭＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．１μｇ、脱リン酸化された
ｐＫＫ２２３−３ＥｃｏＲＩ断片０．７μｇ、ＤＮＡリ
ンカー０．５μｇを１０μｌのＴＥバッファーに溶解し
、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲ
ーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、
アンピシリンを含むＬＢプレート上で良く生育するコロ
ニーを選び成熟ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質のア
ミノ酸配列をコードするプラスミドｐＫＰ１を得た。
ｐＭＩ−ＥｃｏＲＩ断片０．１μｇ、脱リン酸化された
ｐＫＫ２２３−３ＥｃｏＲＩ断片０．７μｇ、ＤＮＡリ
ンカー０．５μｇを１０μｌのＴＥバッファーに溶解し
、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてライゲ
ーション反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＪＭ１
０９株コンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、
アンピシリンを含むＬＢプレート上で良く生育するコロ
ニーを選び成熟ヒラメ成長ホルモン様糖タンパク質のア
ミノ酸配列をコードするプラスミドｐＫＰ１を得た。
【００７５】実施例１０
ｐＫＰ１を含む大腸菌によるヒラメプロラクチンの生産
実施例９で得た組換え体プラスミドｐＫＰ１を用い常法
により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたア
ンピシリン耐性コロニーを１０ｍｌのＭＣＧ培地（０．
６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、
０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、０．
５％グルコース、０．５％カザミノ酸、１ｍＭＭｇＳＯ
４、４ｎｇ／ｍｌビタミンＢ１、ｐＨ７．２）に接種し
、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液を１１の
ＭＣＧ培地に接種し、１６時間３７℃で培養後、得られ
た培養液を日立製作所製遠心分離機 ｈｉｍａｃＳＣ
Ｒ２０Ｂで８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、菌体を
回収した。
実施例９で得た組換え体プラスミドｐＫＰ１を用い常法
により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたア
ンピシリン耐性コロニーを１０ｍｌのＭＣＧ培地（０．
６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、
０．５％ ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、０．
５％グルコース、０．５％カザミノ酸、１ｍＭＭｇＳＯ
４、４ｎｇ／ｍｌビタミンＢ１、ｐＨ７．２）に接種し
、３７℃で１６時間培養した。得られた培養液を１１の
ＭＣＧ培地に接種し、１６時間３７℃で培養後、得られ
た培養液を日立製作所製遠心分離機 ｈｉｍａｃＳＣ
Ｒ２０Ｂで８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、菌体を
回収した。
【００７６】この菌体をレムリサンプルバッファー（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）２２７，６８０−６８５）に懸濁し、直接
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、シロサ
ケプロラクチン（Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．
，（１９８３）Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．Ｖｏｌ．４９，ｐｐ４４６−４５８）に対するウサ
ギ抗体を用いウエスタンプロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ
，ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，４３５０）を行った
。 その結果分子量約２２，０００ダルトンのところにシロ
サケプロラクチン抗体と交差するバンドが見られた。こ
れらのことからｐＫＰ１を保有する大腸菌は確かにヒラ
メプロラクチンを大量に生産していることがわかる。
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ）２２７，６８０−６８５）に懸濁し、直接
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、シロサ
ケプロラクチン（Ｋａｗａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．
，（１９８３）Ｇｅｎ．Ｃｏｍｐ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．Ｖｏｌ．４９，ｐｐ４４６−４５８）に対するウサ
ギ抗体を用いウエスタンプロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ
，ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６，４３５０）を行った
。 その結果分子量約２２，０００ダルトンのところにシロ
サケプロラクチン抗体と交差するバンドが見られた。こ
れらのことからｐＫＰ１を保有する大腸菌は確かにヒラ
メプロラクチンを大量に生産していることがわかる。
【００７７】実施例１１
組換えヒラメプロラクチンの調整
実施例１０に従い得たヒラメプロラクチン生産菌をＬＢ
培地（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエ
クスラクト、０．５％；ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）５００
ｍｌに接種し、３７℃で１６時間培養した。得られた培
養液を１％グルコース、０．５％イーストエクストラク
ト、１％バクトトリプン、０．５％ＮａＣｌ、４５ｐｐ
ｍアンピシリン、ｐＨ７．０からなる１５リットルの培
養液に接種し、３７℃で１６時間培養後集菌した。得ら
れた菌体は３倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸濁し、Ｍａｎｔｏ
ｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーに３回通し破砕した。 次にこの懸濁液を日立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳ
ＣＲ２０Ｂで１７，０００ｇ３０分間４℃で遠心分離し
、沈澱物を１０倍量の蒸留水で洗浄した後再び上記条件
で遠心分離し沈澱物を得た。この沈澱物は２０倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．０２％リゾチームに懸濁し０．２５倍量の
１０％ＳＤＳを加え１時間２３℃でかくはんした。この
溶液は次に１７，０００ｇ３０ｍｉｎ、２３℃で遠心分
離し、沈澱物は２０倍量の蒸留水に懸濁、洗浄し、再び
上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は１０倍量
の蒸留水に懸濁しＴｒｉｓ／ＨＣｌ、塩酸グアニジン溶
液を加え最終的に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、６Ｍ
塩酸グアニジン、ｐＨ８．０になるよう抽出溶液を
調整した。抽出は８０時間室温にて行い抽出溶液はＭｉ
ｌｌｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）限外ろ
過により脱塩し５０ｍｌまで濃縮した。濃縮液は５０ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ
８．０で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマ
シア社製）によりゲルろ過を行った。ゲルろ過によって
分画された分子量約２２ＫＤａ付近の画分を倍量のＢＬ
Ｍバッファー（０．２５％；ＮａＨＣＯ３、０．２％；
α−１ａｃｔｏｓｅ、０．２％；マンニド、ｐＨ８．５
）で希釈しさらにＢＣＭバッファーに対して２４ｈ、４
℃で透析した。透析物は２６，０００ｇ２０分間４℃で
遠心分離後上清を再び限外ろ過により濃縮した。濃縮物
はさらに実施例２で用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、
再生組み換えヒラメプロラクチン２０ｍｇを得た。
培地（１％；バクトトリプトン、０．５％；イーストエ
クスラクト、０．５％；ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）５００
ｍｌに接種し、３７℃で１６時間培養した。得られた培
養液を１％グルコース、０．５％イーストエクストラク
ト、１％バクトトリプン、０．５％ＮａＣｌ、４５ｐｐ
ｍアンピシリン、ｐＨ７．０からなる１５リットルの培
養液に接種し、３７℃で１６時間培養後集菌した。得ら
れた菌体は３倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に懸濁し、Ｍａｎｔｏ
ｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーに３回通し破砕した。 次にこの懸濁液を日立製作所製遠心分離機ｈｉｍａｃＳ
ＣＲ２０Ｂで１７，０００ｇ３０分間４℃で遠心分離し
、沈澱物を１０倍量の蒸留水で洗浄した後再び上記条件
で遠心分離し沈澱物を得た。この沈澱物は２０倍量の２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＥ
ＤＴＡ、０．０２％リゾチームに懸濁し０．２５倍量の
１０％ＳＤＳを加え１時間２３℃でかくはんした。この
溶液は次に１７，０００ｇ３０ｍｉｎ、２３℃で遠心分
離し、沈澱物は２０倍量の蒸留水に懸濁、洗浄し、再び
上記条件で遠心分離後沈澱物を得た。沈澱物は１０倍量
の蒸留水に懸濁しＴｒｉｓ／ＨＣｌ、塩酸グアニジン溶
液を加え最終的に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、６Ｍ
塩酸グアニジン、ｐＨ８．０になるよう抽出溶液を
調整した。抽出は８０時間室温にて行い抽出溶液はＭｉ
ｌｌｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）限外ろ
過により脱塩し５０ｍｌまで濃縮した。濃縮液は５０ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ
８．０で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマ
シア社製）によりゲルろ過を行った。ゲルろ過によって
分画された分子量約２２ＫＤａ付近の画分を倍量のＢＬ
Ｍバッファー（０．２５％；ＮａＨＣＯ３、０．２％；
α−１ａｃｔｏｓｅ、０．２％；マンニド、ｐＨ８．５
）で希釈しさらにＢＣＭバッファーに対して２４ｈ、４
℃で透析した。透析物は２６，０００ｇ２０分間４℃で
遠心分離後上清を再び限外ろ過により濃縮した。濃縮物
はさらに実施例２で用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、
再生組み換えヒラメプロラクチン２０ｍｇを得た。
【００７８】実施例１２
組換えヒラメプロラクチンの調製
実施例１０に従いヒラメプロラクチン生産菌を培養集菌
し、Ｍａｒｓｔｏｎ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ
．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８７）３，５９ ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，ＯＸｆｏｒｄ）の方法に従いヒラメプ
ロラクチン封入体を得、さらにＳｃｈｏｎｅｒらの方法
（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ（１９８５）３，１５１）に従いヒ
ラメプロラクチンを抽出し、再生、ＨＰＬＣによる精製
後、組換えヒラメ２０ｍｇを得た。
し、Ｍａｒｓｔｏｎ（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄ．Ｄ
．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）（１９８７）３，５９ ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，ＯＸｆｏｒｄ）の方法に従いヒラメプ
ロラクチン封入体を得、さらにＳｃｈｏｎｅｒらの方法
（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ（１９８５）３，１５１）に従いヒ
ラメプロラクチンを抽出し、再生、ＨＰＬＣによる精製
後、組換えヒラメ２０ｍｇを得た。
【００７９】実施例１３
生理活性の測定
孵化後４か月齢（１０−１５ｇ）のヒラメ１群１０尾を
、個体識別し、それぞれの腹腔内にヒツジのプロラクチ
ン（ＮＩＡＭＤＤ ｏ−ＰＲＬ−１４）及び実施例１
１で得られた組換え該ヒラメプロラクチン、更に比較と
して生理食塩水を、それぞれ４日おきに魚体重１ｇ当た
り０．０１μｇ、０．１μｇ投与した。飼育は２０℃で
行い、ヒラメ幼魚の体重の１．５％量の飼料（日本配合
飼料）を朝夕２回に分けて与えた。第１回の投与から３
５日目の体重増加率を第２表に示した。第２表から明ら
かなように、本発明のプロラクチンはヒラメ等魚類の成
長促進に有効であることが判明した。
、個体識別し、それぞれの腹腔内にヒツジのプロラクチ
ン（ＮＩＡＭＤＤ ｏ−ＰＲＬ−１４）及び実施例１
１で得られた組換え該ヒラメプロラクチン、更に比較と
して生理食塩水を、それぞれ４日おきに魚体重１ｇ当た
り０．０１μｇ、０．１μｇ投与した。飼育は２０℃で
行い、ヒラメ幼魚の体重の１．５％量の飼料（日本配合
飼料）を朝夕２回に分けて与えた。第１回の投与から３
５日目の体重増加率を第２表に示した。第２表から明ら
かなように、本発明のプロラクチンはヒラメ等魚類の成
長促進に有効であることが判明した。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【図１】セファデックスＧ−７５カラムクロマトグラフ
ィーによるヒラメ脳下垂体の酸−アセトン抽出物の溶出
パターンを示す。
ィーによるヒラメ脳下垂体の酸−アセトン抽出物の溶出
パターンを示す。
【図２】高速液体クロマトグラフィーによるプロラクチ
ンの溶出パターンを示す。
ンの溶出パターンを示す。
【図３】プロラクチンのアミノ酸配列をコードする遺伝
子のシークエンスストラテジーを示す。
子のシークエンスストラテジーを示す。
【図４】本発明のプロラクチンの遺伝子のＤＮＡ塩基配
列およびアミノ酸配列を示す。
列およびアミノ酸配列を示す。
【図５】組換え体プラスミドｐＫＰ１の作製過程を示す
。
。
Claims (20)
- 【請求項１】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチン
- 【請求項２】 次なるの物理化学的性質を有するプロ
ラクチンである請求項１に記載のプロラクチン；（１）
分子量；ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２２，０００（２）アミノ
酸組成；表１ （３）Ｎ末端に２２個の配列番号１のアミノ酸残基を有
する： - 【請求項３】 カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体の抽
出物より精製して得られたプロラクチンである特許請求
の請求項１のプロラクチン - 【請求項４】 遺伝子組換え法によって得られ、分子
中に次なるアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求
項１に記載のプロラクチン； 【化１】 - 【請求項５】 第４図に示されたアミノ酸配列を有す
るポリペプチドである請求項１に記載のプロラクチン。 - 【請求項６】 カレイ目ヒラメ科魚類プロラクチンの
アミノ酸配列またはその一部をコードする遺伝子。 - 【請求項７】 分子中に次なるアミノ酸配列を含むポ
リペプチドまたはその一部をコードするＤＮＡである請
求項６に記載の遺伝子； 【化２】 - 【請求項８】 第４図に示されたアミノ酸配列を含む
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡである
請求項６に記載の遺伝子。 - 【請求項９】 第４図に示された塩基配列を有するＤ
ＮＡである請求項６に記載の遺伝子。 - 【請求項１０】 遺伝子が、カレイ目ヒラメ科魚類の
脳下垂体由来のプロラクチンのアミノ酸配列のうち、Ｎ
末端から１３番目までのアミノ酸配列に対応する合成Ｄ
ＮＡである請求項６に記載の遺伝子。 - 【請求項１１】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチ
ンのアミノ酸配列またはその一部をコードする遺伝子を
組み込んだ組換えベクター。 - 【請求項１２】 請求項７〜１０のうちいずれか一つ
に記載の遺伝子を組み込んだ請求項１１に記載の組換え
ベクター。 - 【請求項１３】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチ
ンのアミノ酸配列またはその一部をコードする遺伝子を
組み込んだ組換えベクターを含む形質転換体。 - 【請求項１４】 該形質転換体が請求項１２に記載の
組換えベクターを含むものである請求項１３に記載の形
質転換体。 - 【請求項１５】 該形質転換体が微生物である請求項
１３に記載の形質転換体。 - 【請求項１６】 該形質転換体が大腸菌に属するもの
である請求項１５に記載の形質転換体。 - 【請求項１７】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチ
ンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだ組換
えベクターで形質転換された形質転換体を増殖せしめて
、生成するカレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチンを採取
することを特徴とするカレイ目ヒラメ科魚類のプロラク
チンの製造方法。 - 【請求項１８】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチ
ンを動物類に投与して動物類の成長を促進させることを
特徴とする動物類の成長促進方法。 - 【請求項１９】 該タンパク質が請求項２〜５のうち
いずれか一つに記載のものである請求項１８に記載の方
法。 - 【請求項２０】 カレイ目ヒラメ科魚類のプロラクチ
ンを含有する動物用飼料。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3142251A JPH04305599A (ja) | 1991-04-01 | 1991-04-01 | プロラクチン |
| NO92921259A NO921259L (no) | 1991-04-01 | 1992-03-31 | Prolaktin |
| EP19920302867 EP0508672A3 (en) | 1991-04-01 | 1992-04-01 | Fish prolactin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3142251A JPH04305599A (ja) | 1991-04-01 | 1991-04-01 | プロラクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04305599A true JPH04305599A (ja) | 1992-10-28 |
Family
ID=15310967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3142251A Pending JPH04305599A (ja) | 1991-04-01 | 1991-04-01 | プロラクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0508672A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04305599A (ja) |
| NO (1) | NO921259L (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114106142B (zh) * | 2021-11-03 | 2024-05-14 | 中山大学 | 一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用 |
| CN117487770B (zh) * | 2023-11-08 | 2024-05-10 | 华南农业大学 | 一种与种鸽嗉囊发育相关的蛋氨酸-tRNA合成酶及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0387457A1 (en) * | 1989-01-06 | 1990-09-19 | Eurogentec S.A. | Recombinant fish hormone proteins |
-
1991
- 1991-04-01 JP JP3142251A patent/JPH04305599A/ja active Pending
-
1992
- 1992-03-31 NO NO92921259A patent/NO921259L/no unknown
- 1992-04-01 EP EP19920302867 patent/EP0508672A3/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0508672A2 (en) | 1992-10-14 |
| EP0508672A3 (en) | 1993-04-28 |
| NO921259L (no) | 1992-10-02 |
| NO921259D0 (no) | 1992-03-31 |
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