JPH04502260A - Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 トアセチルムラミダーゼ旧 発明の背景 本発明は、一般には、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１に関し、更に詳しくは微生 物由来のトアセチルムラミダーゼＭｌ　、　Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１をコ ードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の組み換え体発現によるポリペプチド 生産物、その配列がこれらのＤＮＡ配列から演鐸されたアミノ酸配列に基ずくペ プチド、かかる蛋白質及びペプチドに特異的な抗体、かかる蛋白質及びそれに関 連した核酸の検出及び定量方法、及びトアセチルムラミダーゼＭ１を用いた治療 薬の開発に関連した方法に関する。

動物、植物及び微生物に於て、細菌溶解酵素は、広く分布している。これらの酵 素は、ペプチドグリカンのような細菌細胞壁を形成する高分子炭水化物に於る反 応機構に基ずいて三つのクラスに分類される。第１のクラスの酵素、グリコシダ ーゼは、ドアセチル−Ｄ−グルコサミン及びドアセチルムラミン酸残基の直鎖配 列に作用して細胞壁を分解する。第２のクラスのエンドペプチダーゼは、ペプチ ド中の結合及びペプチド間の架橋結合を切断する。第３のクラスのアミダーゼは 、グルカン及びペプチド部分の間の結合を加水分解する。

ペプチドグリカンの多糖類骨格のβ−１，４−グリコシド結合を加水分解するこ れらのグリコシダーゼは、リゾチーム（β−１，４−Ｎ−アセチルムラミダーゼ ）として知られている。動物、植物及び微生物を含むさまざまの起源由来のりゾ チームは、そのアミノ酸配列の相同性に基ずいて四つの異なった型、即ち、ｉ） ニワトリ、ｉｉ）ファージ、　１ｉｉ）ガチョウ、ｉマ）菌類（Ｃｈａｌｉｒｏ ｐｓｉｓ　）に分類される。参照、Ｉｏｌｌｅｓ等Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｃｂｅｍ；６３：１６５−１８９　（１９８４年）。各クラスのリゾチー ムの相互間には明確な配列の相同性は見られないが、Ｘ線構造分析は、最初の三 つのクラスの型の三次元構造が相互に類似していることを示している。

放線菌Ｈｒｅｐｌｏｍ７ｃｅｓ　ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｏｓは、２種類のリゾチー ム、Ｍｌ及びＭ２を生産する。Ｓ、ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓの培養濾液を用いて 、Ｙｏｋｏｇｓｖ＞、　Ｋ、等＾ｎ１１ｍ１ｃ＋ｏｂ、＾ｇ、　Ｃｂｅｍｏｊｈ ｅｒ；　６：１５６　（１９７４年）及びＹｏｋｓｇｓｖｓ等＾ｇ＋、Ｂｉｏｌ 、ＣｈｅＩｌ；３９：１５３３　（１９７５年）は、Ｍｌ及びＭ２を含む複数の 酵素活性を有するムタノリシンの精製について記載している。Ｍｌ及びＭ２の両 者は、Ｎ−アセチルムラミダーゼであることが見いだされている。しかしながら 、Ｍｌ酵素る。Ｍｌ及びＭ２は、アミノ酸組成、免疫学的特性及び溶解反応様式 に於て相互に異なる。Ｋｉｖｘｊｔ、　Ｓ、等ＡＨｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ；　４７　：１５０１　（１９８３年）。Ｍｌ　（１８６のアミノ酸残基か らなる）の加水分解作用は、ペプチドグリカン部位に於るムラミン酸残基の０− アセチル基の存在に依存せず、一方、Ｍ２　（９９のアミノ酸残基からなる）の 反応は、かかる基の存在により抑制される。このように、旧は、Ｃｂ１１ｕｏｐ ｓｉｓ型リゾチームのクラスに、両者の酵素がＮ、Ｏ−ジアセチルムラミダーゼ 活性を有するという点でより類似している。Ｍ２は、ニワトリ型リゾチームのク ラスに、両者の酵素が０−アセチル化ペプチドグリカンを効果的に溶解できない という点でより類似している。Ｍｌ又はＭ２のいずれも、配列決定されていない し、酵素の遺伝子も単離されていない。予備的なＸ線結晶学的情報のみが入手可 能であり、それもＭｌリゾチームに限られる。Ｌｔｓｄｇ等１．　Ｍｅｔ、Ｂｉ ｏｌ；２０７：８５１−８５２（１９日９年）。

Ｂｉｒｔ、Ｅ、等＾ｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、 ３０：３５ｇ　（１９８９年）伝子を単離する試みについてのみ記載がある。Ｓ ｌｒｅｐｌｏｍ７ｃｅｓれた。２．ｉｂインサートが同定され、突然変異体に於 るリゾチーム生産を再現することが示された。しかし、２．９ｋｂインサートが リゾチームの構造遺伝子を含んでいるかどうかを示す証拠はなかった。

トアセチルムラミダーゼＭ１は、広範なスペクトルの細菌溶解活性を有し、５ｌ ｒｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓ及びＬｘｃｆｏｂｔｃｉｌｌａｓのようなリゾチーム抵 抗性細菌の溶解に於て特に効果的である。炎症性関節炎の誘導に於けるリゾチー ム抵抗性ペプチドグリカンの関与を暗示する事実は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ 旧のように、かかる抵抗性ペプチドグリカンを溶解することのできる薬剤が、関 節炎に対する有効な薬剤であることを示唆している。細菌の細胞壁ペプチドグリ カン（特に、リゾチーム抵抗性があるもの）は、炎症及び免疫学的プロセスの有 力な刺激物である。例えば、グループＡのＨ＋ｅｐｌｏｅｏｃｃｉ又はＬｇｃｔ ｏｂｘｃｉｌｌａｓ　ｃｉｓｅｉから得たリゾチーム抵抗性ペプチドグリカン− 多糖類複合体（ＰＧ−ＰＳ）を実験動物に注入する場合、ヒトに於て観察される 症候群とほぼ同様の様式で炎症性関節炎が発生する。Ｃｒｏ＋ｕｒｊｉｅ等；Ｊ 。

Ｅ！１０Ｍｅｄ、、１０：１５８５　ｆ１９７７年）及びＬｅｈ＋ｏｎ等＾ｒｌ ｂｒｉｌｉｓ　Ｒｂｅａｍ、、２６：１２５９　（１９８３年）。この病気の重 症度は、注入したＰＧ−Ｐａの投与量と直接比例する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉｌｇｏ ｎｏｒｒｂｅｘから得たリゾチーム抵抗性０〜アセチル化ペプチドグリカンを注 入されたラットに重症の関節炎が発生することも示されている。しかしながら、 もし、実験がＮｅｉｓｓｅｒｉＩｇｏｎｏｒ＋ｂｅｓから得たりゾチーム感受性 ０−アセチレーション欠乏ペプチドグリカンを用いて繰り返えすと、炎症性応答 に著しい減少がある。ＦＩｅａ＋ｉＢ等Ｉｎｊｅｃｔ、１ｍｍ＋ｕ、、５２：６ ００−６０１１　（１９８６年）。

更に近年では、トアセチルムラミダーゼＭｌは、グループＡＳｌｒｅｐｌｏｃｏ ｃｃｓｌ　ＰＧ−ＰＳをラットに注入することにより起こる関節炎の治療に効果 的であることが示されている。この関節炎は、それ自体、急性関節炎として現れ 、続いて慢性再発生びらん性関節炎を起こす。グループＡ　Ｓｌ＋ｅｐｊｏｃｏ ｅｃｘｌ　ＰＧ−ＰＳの注入後３日（急性炎症がほぼピークの時点）のうちに注 入されたトアセチルムラミダーゼＶｔは、慢性関節疾患の予防と同時に、急性関 節炎の完全な解消をもたらす。更に、ＰＧ−ＰＳの注入後、トアセチルムラミダ ーゼＭ１の注入が１４日（はぼ関節炎の慢性化が始まる時点）まで延期された場 合、慢性関節炎の重症度を著しく減少させることができる。Ｊ＊ｅｗｓｔ等Ｊ、 　ＥＸＩｌ、　Ｍｅｄ、、’１６０：１３６０−Ｈ７４（１９８４年）。

トアセチルムラミダーゼＭｌのヒト関節炎の治療に使用される可能性は、リゾチ ーム抵抗性ペプチドグリカンがヒトの関節炎の誘起の役割を果たすかどうかによ る。多量の細菌がヒトの消化管中にコロニーを形成することが知られている。こ れらの細菌の生活環に於て、関節及び滑液膜組織に局在し得る多数の細胞壁成分 が生産される。人体中の微生物由来成分の関節症性潜在力は、多数の消化管感染 、陰部尿性感染及び皮膚感染が複合性炎症性関節炎を起こすことで明らかである 。

Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１は、又、歯垢及びう蝕を誘導するう触性細菌の多 数の菌株の溶解に効果的であることが示されている。Ｙｏｋｏｇｓｖ＋等Ａｇｒ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、３９：１５３３−１５４３（１９７５年）。

従って、トアセチルムラミダーゼＭｌは、歯のう蝕の予防及び治療のためにチュ ーインガム、練り歯みがき又は口内洗浄剤に混ぜることができる。一方、類似の アイデアがＹｏｋｏｇｘｖｓ等＾ｇｒ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　３６：２０５５−２０６５　（１９７２年）及びＹｏ ｓｈｉｍｕｒｘ等米国特許第３．９２９．５７９号（１９７５年）により提起さ れ、これらの研究者等はムタノリシン（Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１を含む、 Ｓ。

る予防剤として使用することを提案した。

う触性細菌を攻撃するためのＮ−アセチルムラミダーゼＭｌの使用は、これらの 細菌を排除するための従来の抗生物質の経口投与よりも著しく有利であることが 明らかである。一方の有利性は、トアセチルムラミダーゼＭ１は一旦摂取される と胃内で酵素により分解されることである。即ち、酵素は抗生物質のように全身 的に循環しない。Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１使用の他方の有利性は、この酵 素が、ある種の抗生物質に見いだされた静菌活性よりもむしろ殺菌活性を有する 点である。さらに、多数のう触性細菌が抗生物質に対する抵抗性を新しく獲得し たのに対し、トアセチルムラミダーゼＭ１の作用に対する抵抗性があろう触性細 菌の例は報告されていない。

Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１は、この酵素に対する感受性がある細菌を溶解す ることが有効な他の医薬用又は工業用の用途に用いることができる。このように 、喉用トローチは喉の感染の治療及び予防をするためにＮ−アセチルムラミダー ゼＭｌを含有することができる。Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌは、皮膚感染を 抑制するために軟膏又はクリームに配合することもできる。

又、トアセチルムラミダーゼＭｌは、食品、医薬、化粧品又は微生物分解を受け やすい他の製品の保存剤として用いることができる。現在、多くの製品が化学物 質を用いて保存されている。

Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌは、大または環境に対し無害である天然の保存剤 として供するという有利性がある。

明らかに、その広範なスペクトルの細菌溶解活性のために、Ｎ−アセチルムラミ ダーゼＭ１は、細菌溶解活性を必要とする治療剤として多くの用途を有する。し かし、これまでに組み換えＤＮＡ技術を用いて、単離精製した多量のトアセチル ムラミダーゼＭｌの製法は開発されていない。このように、かかる方法の必要性 は当業界に存在し続けている。これまでに、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌのア ミノ酸配列も提供されていなければ、この蛋白質をコードしているＤＮＡ配列も 提供されていない。Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌをコードしているＤＮＡ配列 の取得は、この蛋白質に関連した核酸の検出、定量及び／又は単離のためのＤＮ Ａ−ＤＮＡ、　ＤＮＡ−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション法 と同様に、原核及び／又は真核宿主細胞に於るこの蛋白質の大量生産に対する組 み換え法の応用を可能にする。試料中のこの蛋白質及び／又はこの蛋白質のアミ ノ酸配列の知識の取得は、試料中のこの蛋白質及び相同蛋白質の検出及び定量用 の免疫学的方法に於て使用する、これらに対するモノクローナル及びポリクロー ナル抗体（蛋白質断片又はそれをモデルにした合成ペプチドに対する抗体を含む ）の開発を可能にし、又、トアセチルムラミダーゼＭ１を用いた治療剤の開発に 関連した手法の開発をも可能にする。又、トアセチルムラミダーゼＭｌのアミノ 酸配列の知識は、蛋白質工学と呼ばれる技法の応用を可能にし、それによって、 この酵素の特定のアミノ酸のＤＮ＾コドンを変えることにより酵素の性質を改変 することができる。このように、この酵素の安定性、活性、効果的なｐＨの範囲 及び温度範囲等は、新しく発現及び改良した性質に改変することができる。

発明の概要 本発明は、一般には、トアセチルムラミダーゼＭｌに関し、更に詳しくは微生物 由来のＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ　、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１をコー ドしたＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の組み換え体発現によるポリペプチド生 産物、その配列がこれらのＤＮＡ配列から演鐸されたアミノ酸配列に基ずくペプ チド、かかる蛋白質及びペプチドに特異的な抗体、かかる蛋白質及びそれに関連 した核酸の検出及び定量方法、及びトアセチルムラミダーゼＭ１を用いた医薬用 組成物及び治療薬の開発に関連した方法に関する。

本発明の好ましい態様に於ては、新規なりＮＡ配列は、Ｎ−アセチルムラミダー ゼＭ１蛋白質をコードしたＤＮＡ配列を含む。この配列は、ｐＭＵＴ−１と命名 され、受入番号６８１１２で米国特許商標局の微生物寄託に関する要件に基ずい てアメリカンタイプカルチャーコレクション、１２３０１パークローンドライブ 、ロックビル、メリーランド２ｆｌｌ１５２に１９８９年Ｉｌ１月１２日寄託さ れたプラスミドに含まれている。ヌクレオチドからの部分的又は完全的化学合成 により調製された他のＤＮＡ形態、及び付加、欠失及び置換類似体ポリペプチド をコードしているＤＮＡ形態も、又、本発明の範囲に含まれる。

本発明により提供されるＤＮＡ配列と、プロモーター、オペレーター及びレギュ レーター等のような、同一種又は異種の発現調節ＤＮＡ配列との組み合わせによ って、翻訳を受けて、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌ蛋白質及び関連の（ポリ及 びオリゴ）ペプチドを大量に生産するｍＲＮＡの形成が、インビトロ転写で可能 になる。

適切なウィルス及び環状ＤＮＡプラスミドベクターを潜在的に用いる、標準的な トランスフォーメーション（形質転換）及びトランスフェクション（核酸感染） により原核及び真核宿主細胞へのＤＮＡ配列の取り込みも又、本発明に含まれる 。これによって、これまで多量に天然の材料からは入手不可能であった有益な蛋 白質が提供される。

本発明の好ましいＤＮＡ発現系に於て、Ｎ−アセチルムラミダーゼＩＪＩをコー ドしたＤＮＡをプラスミドｐｌＪ６９９から得た断片に連結し、その結果できた 、ｐｌ（Ｌ４？と命名したプラスミドをＳｌｒｔｐｌｏｍＹｃｅｓ　１ｉｖｉｄ ｓｎｓ　ＴＫ２４の形質転換に用いた。これによって、例えば、Ｎ−アセチルム ラミダーゼに対する抗血清との交差反応性、及びＭｉｃｒｏｃｏｃｃａｓ　ｌ１ ｆｅａｓ溶解に於るβ−１，４−１１−アセチルムラミダーゼ活性を含む、本来 のＮ−アセチルムラミダーゼＭｌの機能的特質を示す、機能的Ｎ−アセチルムラ ミダーゼＭｌ蛋白質が生産される。

本発明の他の好ましいＤＮＡ発現系に於て、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌをコ ードするＤＮＡを、プラスミドｐ１３２００２から得た５ｌｎｐｌｏｉ７ｃｅｓ 　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼのプロモーター及びシグナル配列と融合させ 、その結果できた、ｐＬＢｓｌＧと命名したプラスミドをＳ、ｌｉマ１ｄｕｓ　 丁に２４の形質転換に用い、これにより転写及び翻訳させてＮ−アセチルムラミ ダーゼＭｌを生産させる。

本発明のさらに別の好ましいＤＮＡ発現系に於て、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ ｌをコードするＤＮＡは、Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉｘ　ｃｏｌｉ内に於る発現のた めにプラスミドｐｃＦＭ１１５６から得た断片に連結させ、これにより転写及び 翻訳させて、例えば、トアセチルムラミダーゼに対する抗血清との交差反応性、 及びＭｉｃ＋ｏｃｏｃｃｎｓｌａｌ’ｅｎ＋溶解に於るβ−１，４−１１−アセ チルムラミダーゼ活性を含む、本来のＮ−アセチルムラミダーゼＭ１の機能的特 質を示す、機能的２７−２８　ｋＤ　Ｈ−アセチルムラミダーゼＭ１蛋白質が生 産される。

本発明の新規な蛋白質生産物は、図１に示すように、トアセチルムラミダーゼＭ １蛋白質の一次構造構成（即ちアミノ酸配列）を有するポリペプチド、そのペプ チド断片、及びそのアミノ酸配列の複製するべく構築された合成ペプチドを含む 。本発明の蛋白質、蛋白質断片及び合成ペプチドは、治療の用途を含む種々の用 途を有するべく考案され、トアセチルムラミダーゼＭｌに対し特異的な免疫反応 性を持つモノクローナル及びポリクローナル抗体の調製の基礎を提供する。本発 明の抗体は、他の材料及び細胞型からのＮ−アセチルムラミダーゼＭ１の親和精 製に用いることができる。

本発明は、又、正常、異常又は突然変異型のＮ−アセチルムラミダーゼＭ１及び それに関連した核酸（例えばＤＮＡ及びｍＲＮＡ）の検出及び／又は定量の手法 を提供する。例えば、本発明の抗体は、試料中のトアセチルムラミダーゼＭｌ蛋 白質の定量的検出、及び適切に標識し、これらの蛋白質をコードしたｍＲＮＡの 定量的検出に利用することのできる本発明のＤＮＡ配列（特にはＮ−アセチルム ラミダーゼＭｌをコードした配列を有する）の検出のための既知の免疫学的手法 に利用される。

本発明の複数の態様により、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌ（β−１，４，Ｎ− アセチルムラミダーゼ活性を有することを特徴とする）の生物活性を有するポリ ペプチドの発現をコードし、（１）図１に示す、新規なトアセチルムラミダーゼ Ｍ１をコードしたＤＮＡ配列、（ｂ）厳格なハイブリダイゼーション条件下（即 ち、ここに記載し、本発明のＤＮＡの初期単離で用いた条件と同等又はより厳格 な条件）でそれにハイブリダイズするＤＮＡ配列、及び（Ｃ）少なくとも一部に 縮重コドンの使用によって、同一、対立変異又は類似のＮ−アセチルムラミダー ゼＭｌ蛋白質又はポリペプチド断片をコードした［ｌＮ＾配列、を含む新規な精 製単離したＤＮＡ配列が提供される。同様に、かかるＤＮＡ配列及びベクターで 形質転換又はトランスフェクトした原核及び真核宿主細胞中のこのようなりＮＡ 配列を導入するウィルス又は環状プラスミドＤＮＡベクターが提供される。同様 に、かかる宿主を培養して増殖させ、及び宿主又はその培養培地からこれらの蛋 白質を単離することによる、組み換えＮ−アセチルムラミダーゼＭ１生産の新規 な方法が提供される。又、Ｎ−アセチルムラミダーゼ１１１　ＤＮＡは、Ｎ−ア セチルムラミダーゼＭｌ蛋白質及びその類似体の変異の検出及び単離のためのプ ローブとして用いることができる。

トアセチルムラミダーゼＭ１を利用した溶菌法、治療法及び医薬用組成物も又提 供される。

本発明の他の態様及び有利性は、本発明を実施するに当っての多数の具体例及び 参照による図（ここで図１は１３５３塩基対ヌクレオチドＤＮＡ配列、及び２３ ．６０６　ダルトンと算定された分子量を有するトアセチルムラミダーゼＭｌの 演鐸された２１７アミノ酸残基の配列を提供する）を含む以下の詳細な説明によ り明らかになるであろう。

実施例１０は、大腸菌におけるＮ−アセチルムラミダーゼＭｌの実施例１は、ト アセチルムラミダーゼＭｌに対するウサギポリクローナル抗血清の作出に関する 。

実施例２は、Ｓ、ｇｌｏｂｉ＋ｐｏｒｕｓからのトアセチルムラミダーゼＭ１の 精製に関する。

実施例３は、トアセチルムラミダーゼＭｌのト末端アミノ酸配列決定に関する。

実施例４は、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１から得たトリプシン切断断片のアミ ノ酸配列の決定に関する。

実施例５は、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１遺伝子の検出のためのプローブの設 計及び合成の決定に関する。

実施例６は、ゲノムライブラリーの構築及びＮ−アセチルムラミダーゼＭ１遺伝 子の単離の決定に関する。

実施例７は、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌ遺伝子の特徴付けの決定に関する。

Ｍｌの発現の決定に関する。

とも６箇所に皮下注射した。追加免疫（７，２１，３５，５６日目）は、発現に 関する。

実施例１１は、トアセチルムラミダーゼ旧を利用した治療法に関する。

実施例１２は、プローブとしてのトアセチルムラミダーゼＶｌの利用に関する。

以下に本発明の実施例を具体的に示すが、本発明はこれらの実施例に限定される ものではない。

実施例Ｉ Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１に対するウサギポリクローナル抗血清の作出 生化学工業株式会社から得たトアセチルムラミダーゼＭｌからウサギポリクロー ナル抗血清を作出した。この蛋白質を（１，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ Ｓ＞に溶解させ６０℃で３０分間加熱した。この調製物を３個体のニューシーラ ント白ウサギ（初期体重５−８１ｂ）に注射した。１８目、等容量のフロイント 完全アジュバントで乳化したＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ　５０μｇで、各個 体を免疫処置した。全容量２１以下（１ウサギ当り、ｌ：ｌ　Ｎ−アセチルムラ ミダーゼＭ１ニアシュバント）を、後半身の少なくフロイント不完全アジュバン トに変更して同じ手順により行った。

第一回注射の前日（前免疫血清）及び２Ｂ及び６３日目に耳静脈穿刺によりウサ ギの採血をした。血液を減圧管に集め、室温にて１６時間凝血させた。凝血物を 除去し、血清を２２０Ｏｒｐｍで１０分間回転させて残存している血球を除去し た。血清をガラスびんに流し込み、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％にな るように加えた。血清をポリプロピレンチューブに分注し、−２０℃で保存した 。

固相ラジオイムノアッセイを用いて血清の力価を測定した［５ｅｌｅｃｌｅ＋Ｉ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌｕ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７．　（Ｂ、Ｂ 、Ｍｉｓｈｅｌ、Ｓ、　Ｍ、　Ｓｈｉｉｇｉ、編）、　Ｆｒｅｅｍ＊ｎ、５１１ １　ＦｒｇＩＩｃｉｓｃｏ、１９１１０．　ｐｐ、３７３−３９７及びＨ７ｂｒ ｉｄｏａ＋＊　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ７　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ 　ｔｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｔ、Ａ、５ｐｒｉＢｅ＋、編）、ＰＩｅｎ＋ｕａ 　Ｐ＋ｅｓｓ、１９８５、ｐａ、　２９−３６］　、　Ｎ−アセチルムラミダー ゼＭｌを炭酸−重炭酸緩衝液ｐＦＩｉ１．２で０．５μｇ７５０μｍになるよう に希釈し、ポリスチレンウェル中で（５０μｍ／ウェル）室温にて２時間保温し た。抗原溶液をデカントした後、プラスチックに残存する結合部位をブロックす るために、ウェルを５％牛血清アルブミン（ＢＳ＾）で室温にて３０分間充たし た。

５％ＢＳ＾をデカントした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　ｐＨ７゜＋１ ％ＢＳＡで希釈したウサギ血清の希釈液をウェルに（５０μｍ／ウェル）加えた 。室温で２時間保温した後、０．０２％ツイーン２ｏを含むイミダゾール緩衝生 理食塩水でウェルを洗浄した。　■標識プロティン＾（１００，０００ＣＩＩＯ Ｉ１５０μｌ）をウェルに加え、室温にて３０　分間保温し続いて二度目の洗浄 をした。ウェルを折りはなし、ガンマ−カウンターでカウントした。抗血清希釈 度に対するカウントをグラフにし５０％タイター、即ち、抗血清が最大結合カウ ントの半分結合する希釈度を決定した。

ｔ　２１５５３）から精製してＮ−末端アミノ酸分析に十分な純粋な物質を得た 。この精製で用いた段階は次の通りである。

酵から得た無細胞ブロス１Ｂ５５　ｍｌに最終濃度１　ｍＭになるように加えた 。１７．００Ｇｘ　ｇで２０分間の遠心分離して不溶物を除いた後、１万分子量 カットオフポリスルホンメンプランカセット（５ｆ１２全膜面積）を付けたミリ ポア　（Ｍｉｌｌｉｐｏ＋ｅ）ペリコンＰｅ１ｌｉｃｏｎ接面流型限外濾過装置 を用いて５０θ１に濃縮し、更にＹＩＪ　１０メンプランを付けたアミコン（Ｔ Ｍ、八ｍ１ｃｏｎ）撹拌セルを用いて１００１に濃縮し、再度遠心分離（１３， ８００ｘ　１；２［１分）して不溶物を除いた。

試料を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したセファクリル（ＴＭ）　 Ｓ−２００（ファルマシア）ゲル濾過カラム（５Ｘ１５０　ｃｍ）に供した。７ ０　ｍｌ／ｂｒの流速で１５１の両分を集めた。銀染色法［Ｍｏｒｒｉｓｓｅ７ ．　Ａｌ１１！、　Ｂｉｏｃｂｅｔ、１１７：３０７−３１０　（１９８１）］ 又はイムノブロッティング法［Ｂｒｌｖｎｓｒ等Ｇｅｎｅ、４０：１９１−２０ １　（１９８５）］と、Ｌｘｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７：６８０− ６８５　（１９７０）に記載の手法に従い、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ） ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、両分を分析した。４％（ Ｗ／マ）アクリルアミドを含むスタッキングゲル及び１２．５％（Ｗ／マ）アク リルアミドを含む分離用ゲルを用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。試料は、常に 供する前に２−メルカプトエタノールで還元した。トアセチルムラミダーゼＭｌ 標準（生化学工業株式会社）は、用いた分子量マーカー（ホスホリラーゼｂ、　 Ｍ　は９７．４００　、牛血清アルブミン、Ｍ　はｒ ６６、２００；卵白アルブミン、Ｍ　は４２．７００　、カルボニックアンヒド ラーゼ、Ｍ　は３１．　ｆｌｕ　、大豆トリプシンインヒビター、Ｍ。

は２＋、　５０Ｇ　、及びリゾチーム、Ｍ　は１４．４００　；　）に比較して 、見かけのＭ　２７．Ｈ［ｌ〜２８．（ＩＨで移動した。５画分ごとのプール（ 目的物質が溶出すると想定されるカラム溶出量の範囲にわたって）からとった１ ０μｍを５ＯＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により分析した。

蛋白質のバンドは、画分５５−１８４にわたっているのが明らかであった。５Ｏ Ｓ−ＰＡＧＥ及びイムノプロット分析により、トアセチルムラミダーゼＭｌは、 実質的にこれらの両分の全てに存在した、即ち、不均質性及び自己凝集又は他の 蛋白質との凝集を反映する様式で溶出した。

みかけの凝集を解決するために、解離剤、デオキシコール酸の存在下、ゲル濾過 を繰り返した。前述のセファクリルＳ−２００から得た画分５５−２１９をプー ルし、全プールの９３％（即ち１０２１０２Ｏを、ＹＭ１０メンプランを付けた アミコン（ＴＭ）撹拌セルを用いて８０　ｍｌに濃縮した。しかる後、この試料 を２０ｄ　トリス−ＨＣｌ。

１００　ｍＭ　ＮｇＣＩ、　ｐＨ８，２で透析し、同じ緩衝液で１００　ｍｌ容 量に希釈した。同じ緩衝液に溶解させた１０％（ｖ／マ）デオキシコール酸ナト リウム２５１を、デオキシコール酸ナトリウムが２％（Ｗ／Ｖ）濃度になるよう に加えた。この試料を撹拌しながら４℃で３時間保温し、５０　ｓＭ　トリス− ＭＣＩ、　２００　ｍＭ　Ｎ５ＣＩ、　２％（ｖ＃）デオキシコール酸ナトリウ ム、ｐＨ８，２で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（ＳＸ１６０　ｃｍ ）に供した。１５１の画分を７０１／時間の流速で集めた。このカラムにわたる ５両分ごとのプールの４０μｍを、５Ｏ５−ＰＡＧＥと銀染色及び５０ｇ−ＰＡ ＧＥとイムノブロッティングにより分析した。画分１２５−１４９は、免疫反応 性５ＯＳ−ＰＡＧＥバンドを含み、このプールもＭ　がほぼ３５．σ００の主な 夾雑物を含む。

Ｂ、モノＱ陰イオン交換クロマトグラフィーゲル濾過から得たプールの約８０％ （１７５ｉｆ）を、ＹＭＩＯメンブランを付けたアミコン（ＴＭ）撹拌セルを用 いて５０１１に濃縮し、２リツトルの２０ｍＭトリス−１１ｃＩ、ｐｉ　８．２ で十分に透析した後、２０ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ、　０．０５％（Ｗ／マ）デ オキシコール酸ナトリウム。

ｐＨ８，２で透析した。透析後の容量は、ＴＯｍｌであり、この試料は、２００ ０Ｘｇで１５分間遠心分離して不溶物を除いた。遠心分離から得た上澄を、トリ ス−ＨＣｌ／デオキシコール酸ナトリウム緩衝液で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ） Ｑカラム（ファルマシア；１１カラムボリューム）に供した。試料供試後、結合 物質を溶出するために同じ緩衝液に溶解させたＯから０．５　Ｍ　ＮｌＣｌ勾配 （全勾配量、　１５０　ｍｌ）に供した。流速０．５ｍｌ／分で２１の両分を集 めた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色（４０μｍ供する、ゲルには５画分ごとのプールを 供する）により、はとんどの夾雑物は試料供試中にカラムを通過することが明ら かになった（非結合）。５Ｏ３−ＰＡＧＥと引き続くイムノブロッティング法で 免疫活性な物質は、非結合画分に見いだせなかったが、塩勾配の二つの部分の両 分に見いだした。７５−１ｏｏ　ｓＭ　Ｎ５Ｃｌで比較的少量が溶出し、はぼ１ ３５ｍ１Ｊ　Ｎ＊Ｃｌで多量成分が溶出した。この勾配の両分１９−２３をプー ルしたが、これは高度に精製されたトアセチルムラミダーゼＭｌであることを示 した。精製の概要を以下に表１に示す。

表１ Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１の精製 １、このプールの一部（７％）を他の用途に用いた。

ｂ、このプールの一部（２０％）を他の用途に用いた。

Ｃ９牛血清アルブミンを標準として用いてブラッドフォード法［Ａｎ＊Ｉ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　、　？２：２４ｇ−２５４　（１９７６３］により決定。

ｄ、未決定。

ｅ、　５ＯＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色に基ずいて推定。

ｆ、　ＳＯ３−［’ＡＧＥ及びイムノブロッティング法に基ずいて推定。

Ｃ，Ｎ−末端アミノ酸配列決定用試料の調製モノＱクロマトグラフィーから得た 、プールした両分１９−２３の一部（３，２５ｉｆ　）をＩＱ　ｍｌＪリン酸ナ トリウム、１ｌＨＩ１．２に対して透析し、アミコンセントリコン１０限外濾過 ユニツトを用いて１０２μｍに濃縮し、実施例３に記載したようにＮ−末端アミ ノ酸゛　配列決定法に供した。

実施例３ Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１のト末端アミノ酸の配列決定Ｎ−アセチルムラミ ダーゼＭ１のＮ−末端アミノ酸配゛列は、Ｓ。

１１ｏｂｉｓｐｏｔ＋＋ｓ　ＤＮＡのライブラリーから得たＮ−アセチルムラミ ダーゼＭ１遺伝子を検出するためのＤＮＡプローブを作出するために決定した。

実施例２に記載の如くして得たＮ−アセチルムラミダーゼＭｌは、アブライドバ イオシステムズプロティンシーケンサーを用いた配列決定法に供した。同定した 主要な配列（ここでＸは不明確なアミノ酸を表す）を以下に示す。

トアセチルムラミダーゼＭｌから得たトリプシン処理断片のアミノ酸配列決定 市販のＮ−アセチルムラミダーゼλ１１のトリプシン断片のアミノ酸配列を同定 して、トアセチルムラミダーゼＭｌ遺伝子のクローニングを確認した。トアセチ ルムラミダーゼＭｌ　（生化学工業株式会社）を処理してシスティンを還元及び アルキル化した後、この蛋白質をトリプシンで消化してそのペプチドを逆相高性 能液体クロマトグラフィーにより単離した。精製したペプチドの一つをアプライ ドバイオシステムズシーケンサーを用いＮ−アセチルムラミダーゼＭ１遺伝子の 検出のためのプローブの設計及び合成 Ｓｊｒｅｐｌｏｍ７ｃｅｓ　ＤＮＡは、７３％Ｇ＋Ｃの塩基組成を有することが 知られている。Ｅｎｑｕｉｓｊ及びＢｒｔｄｌｅ７　、Ｄｅｗ、Ｉｎｄ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、。

１２：２２５−２３６　（１９７１）　、　ＳＩｒｅｐｌｏｍ７ｃｔｓゲノムの 高Ｇ＋Ｃ含有量は、第三位がＧ又はＣであるコドンが多いという傾向が強いこと を反映している。ｌｌｉｂｂ等Ｇｅｎｅ、　３０：ｌ５７−１５６　（１９８４ ）。オリゴヌクレオチドのプローブは、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌのＮ−末 端アミノ酸配列、及び第三位がＧ又はＣであるコドンの優先を考慮して設計した 。混合４５量体オリゴヌクレオチドプローブの配列はトアセチルムラミダーゼＭ ｌのアミノ酸４−１８に対応しており、次の通りである。

このプローブは、Ｂｅ易ｕｃａｇｔ等Ｔｅ１ｎｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 、２２＋１８５９−１８６２　（１９Ｂ＋）のホスホトリエステル法を用いて合 成した。

実施例６ ゲノミツクライブラリーの構築及びＮ−アセチルムラミダーゼＭＩＡｃｌｔ、７ ２：６１９−６２９　（１９６２）を応用した手法を用いて単離した。

Ｓ、Ｈｌｏｂｉｓｐｏｒｗｓ　ＩＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，＄２１５５３）の単コロ ニーを、Ｌ＋＋ｒｉ厳Ｂ＋＋ｒｊｓｎｉ　（ＬＢ）の培地１０１中で３０℃にお いて一晩増殖させた。

７０００Ｘ、で１０分間遠心分離することにより菌糸を集め、１０％グリセロー ルで二回洗浄した。細胞ベレットを１０１の溶菌緩衝液（０，１５Ｍ　ＮｚＣｌ 、０．　ＩＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，２ｍｇ／＋１　リゾチーム）に再懸濁し 、振蕩しながら３７　℃で３０分間保温した。この混合物をドライアイス／エタ ノール浴で凍結させ５０１の０．１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ９，０，０，１Ｍ 　Ｎ５Ｃ１，１％ＳＯ８を加えながら徐々に融解した。５０１のフェノール（Ｔ Ｅ（２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ＤＨ８，０゜１ｉＭ　ＥＤＴＡ）で飽和１で抽 出することにより、蛋白質を除去した。

５０１フエノール／クロロホルム（ｌ；ｌ）を用いて液相を再抽出した。ＮｚＣ ｌを０．５Ｍになるように水相に加え、３倍容量のエタノールの添加によりＤＮ Ａを沈殿させた。染色体ＯＮ＾を巻き取って回収し、この後２ｍｌのＴＨに再懸 濁して４℃で一晩保温した。

２８０−ターを用いて、２８．０００　ｒｐｍで１・８時間、庶糖勾配超遠心法 ＲＮアーゼを最終濃度５０μｇ／ａｔになるように加え、ＤＮＡを、フェノール で一回、フェノール／クロロホルムで二回、クロロホルムで一回抽出した。酢酸 ナトリウムを最終濃度０．３１４になるように、最終液相に加え、３倍容量のエ タノールの添加によりＤＮＡを沈殿させた。この懸濁液を１０．０ＯＯＸ　ｇで １５分間遠心分離し、このペレットを１　ｍｌ　ＴＥに再懸濁した。約２００μ ｇのＳ。

（ｌｏｂｉ＠ｐｏｒｍｓ染色体ＤＮＡを回収した。

５１ｇ１ｏｂｉｓｐｏｒａｓゲノムＤＮＡ６０μｇを１ユニツトの皿３＾（ベー リンガーマンハイムバイオケミカルズ）を用いて３７℃で１０分間、部分的に切 断した。ＥＤＴＡを最終濃度５０　ｍＭになるように加えて切断を止め、ＤＮＡ をフェノール／クロロホルムを用いて抽出した。酢酸ナトリウムを０．３Ｍにな るように液相に加え、２倍容量のエタノールの添加によりＤＮＡを沈殿させた。

１２．０ＯＯＸｇで５分間の遠心分離によりＤＮＡを回収し、５００μｍのＴＥ に再懸濁して、既存の手法による１０−４０％庶糖勾配に供した。

Ｃｌ１ｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｃｃｕｌｔｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇ７；　Ｆ、＾ｕｓａｂｅｌ、　Ｒ。

Ｂｒｅｎｔ、　Ｒ，Ｋ１Ｂｓ１ｏｅ、　Ｄ、　１Ｊｏｏｒｅ、１．　Ｓｅｉｄｍ ｓｎ、Ｊ、Ｓｍ１ｔｈ　ｕｄＫ、　５ｌｒｏｈｌ、編Ｇｔｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｉｎｇ＾５ｓｏｃｉ鳳１ｅｓ　ｔｎｄ　Ｗｉｌｅ７−１ｎｆｅｒｓｃｉｔｎｃ ｅ　（１９ｇ？）。ベックマンＬ８−５５超遠心機のベックマンｓｗ−μｍの大 腸菌ＤＨ５αＭＣＲ感応細胞（ＢＲＬ）の形質転換に用いた。

を行った。０．５１の両分を集め、２倍容量のエタノールの添加によりＤＮＡを 沈殿させた。Ｉ）Ｎ＾を１２．’（ｌ（（ｌＸｆで５分間の遠心分離により回収 し、各画分から得たＤＮＡを水に再懸濁した。全ての両分の一定量を０．６％ア ガロースゲル上で電気泳動させ、このＤＮＡをエチジウムブロマイドを用いた染 色により可視化した。

分子量７−１０　ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を含む両分を、以下のクローニング実 験に用いた。

ＢＩＩ１１旧で切断し、ホスファターゼにューイングランドバイオラブズ）を用 いて脱リン酸した１μｇのｐＢＲ３２２に」。

ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ　５ｘａ３人ＤＮＡ断片　（？−１０ｋｂ）　４μｇを 連結した。

このＤＮＡを、１単位Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ［ベセスダリサーチラボラトリーズ （８１１Ｌ）］を含む２５（１μ＋のりガーゼ緩衝液（＆Ｌｏｌｅｃｏ１ｇｒＣ １ｏｎｉｎｇ、Ｔ、Ｍｕｉｌｉｓ、Ｅ、Ｆ＋１ｌｓｃｂ　ｕｄ　１．Ｓｔｍｂｒ ｏｏｋ、編　Ｃｏ１ｄＳｐ＋ｉＢ　Ｈｔｔｂｏｒ　Ｌｔｂｏｒｇｌｏｒ７．１９ ！１２）中で１６℃で１５時間連結した。

酢酸ナトリウムを最終濃度が０．３Ｍになるように加え、３倍容量のエタノール の添加によりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを１２．θ００×１で５分間の遠心分 離により回収し２０μｍの水に再懸濁した。

連結ＤＮＡの８μｍをＢＲＬにより記載された手法に従って、４００形質転換し た細胞を、１００μｇ／＋　１アンピシリンを含む８枚のＬ−アガープレート（ １５［ＩＸ　１５　ｍｓ）に接種し、３７℃で１６時間保温した。

この形質転換により、プレート当り約５００個の形質転換体を得た。シーンスク リーンメンブラン（デュポン社）を所定のサイズに切断し、１２．５μｇ／ｍｌ のクロラムフェニコールを含むし一アガープレート上に形質転換体を移すのに用 いた。このプレートを３７℃で１５時間保温した。メンプランを、ＤＮＡ変性及 び再生のために、コロニー／プラークスクリーン（デュポン社）に関する記載の 手法により処理した後、８０℃の真空炉で１時間メンプランを加熱した。

このメンプランを、１％　ＳＤＳ、ｌ　Ｍ　ＮｔＣｌ、５０　ａ＋Ｍ　）リス− １（ＣＩ。

ｐＨ７，５を含むＩＸＸシンルト（Ｄｅｎｂｓｒｄｌｇ）溶液中で６５℃で３゜ ５時間プレハイブリダイズした。しかる後、プレハイブリダイゼーション溶液は 、熱処理サケ精子ＤＮＡが最終濃度２０μｇ／ａｔになるようにし、Ｎ−アセチ ルムラミダーゼＭｌの末端アミノ酸（実施例５参照）に相当する混合オリゴマー プローブ、約２５５Ｘ１０６　ｃ９ｍ　（２，５ｐｍｏｌｅｓ）を加えた。ハイ フリタイセーションハ、６５℃で１６時間行った。メンプランの洗浄は、６５℃ の２ＸＳＳＣ＋１％ＳＯ３を用いて３０分間を２度繰り返した。Ｘ線フィルムに 対するメンプランの露光により、１４個のコロニーがオリゴマーにハイブリダイ ズしているのを見いだした。ここで単離した単一陽性コロニーを、前述の条件の プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションに供することによって 、これらのコロニーを２回目のスクリーニングに供した。６個のコロニーがオリ ゴマープローブと強固にハイブダイズした。プラスミド叶＾を、このように選ば れたコロニーから既存の手法を用いて調製した。Ｍｏ１ｅｃｕｌｘｒ　Ｃ１ｏｎ ｉＢ、Ｔ、　Ｍｔｎｉｌｌｉｓ、Ｅ、Ｆｒ１ｌｓｃｂ　ｔｎｄＪ、　Ｓ＊ｍｂｒ ｏｏｋ、編Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨｕｂｏｒ　Ｌｘｂｏｒｘｌｏ＋７．　（１ ９Ｂ２）。

６個のプラスミドを５ｌｌｌで切断し、制限断片をアガロースゲル電気泳動によ り分離し、エチジウムブロマイド染色及びＵＶ照明により可視化した。しかる後 、この制限断片をシーンスクリーンプラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ、 デュポン社）に移し、プレハイブリダイズした後、前述の如〈実施例５の混合４ ５量体オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした。６個のプラスミドは 全て制限酵素パターンが異なっていたが、６個全てのプラスミド中の約１．４　 ｋｂ　５ａＦｌ断片は、オリゴマープローブとハイブリダイズした。６個のプラ スミドの内、最も小さいものを更なる研究のために選び山ト１と命名した。この プラスミドは、Ｓ、ｇｌｏｂｉｓｐｏｒＩＩｓの９　ｋｂインサートを有した。

ｐＭｕｌ−１から得た１、４ｋｂ　５ａｌｔ断片を、バクテリオファージＭＩ３ 　ｔｒｒｐ１９に両配向にサブクローンした。−重鎖ＤＮＡを、このファージか ら調製し、実施例５の４５量体オリゴヌクレオチドを、シークエナーゼ（Ｓｅｑ ｕｅａｔ≦ｅ）　（ユナイティッドスティトバイオヶミヵルコーポレーション） を用いた配列決定反応に於て、配列決定プライマーとして用いた。このＤＮＡ配 列（プライマー末端の３′側）によりコードされた波線アミノ酸配列が、Ｎ−ア セチルムラミダーゼＭ１の精製調製物の蛋白質配列決定法により決定されたアミ ノ酸配列と正確に一致することを見いだした。一旦、部分的なりＮＡ配列を得た ならば、更なる相補的オリゴヌクレオチドブライマーを合成し、遺伝子の二本鎖 の完全な配列決定に用いた。

実施例７ Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌ遺伝子の特徴付は基対ＤＮＡ配列を図１に示す。

ヌクレオチド配列から波線た完全なＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ蛋白質のアミ ノ酸配列は、２１７の残基からなる、算定分子量２３．６０６ダルトン及び推定 等電点１０．８８を有するポリペプチドをコードする。実施例４に記載したトア セチルムラミダーゼ旧のトリプシン処理断片のアミノ酸配列を、この配列中に見 いだした　（残基１５８−１７８１゜Ｓｔｒｅｐｌｏｍｙｃｅｓ種に於て、＾Ｔ Ｇ及びある程度はＧＴＧコドンが蛋白質の翻訳の開始に用いられる。従って、完 全なＮ−アセチルムラミダーゼＭｌをコードした遺伝子のＤＮＡ配列上流中のイ ンフレーム＾ＴＧ又はＧＴＧコドンの存在を調べた。箱印で示した２個のインフ レーム＾ＴＧコドンを、完全なＮ−アセチルムラミダーゼ１１Ｉｌポリペプチド を示した初めのコドン（二重下線で示す）の上流−２３及び−７７位に見いだし た。７７コドン上流の開始コドンが翻訳を開始すると考えられる。なぜならば、 典型的なシグナルペプチド配列がこのコドンに続いており、Ｈｒｅｐｊｏｍ７ｃ ｃｇにより分泌される他の蛋白質がアミノ末端シグナルペプチドと共に合成され ることが知られている。完全な１５ｂｐ逆位反復（下線で示す）をトアセチルム ラミダーゼＭ１遺伝子のＴＧ人停止コドンの下流に見いだした。この反復は、こ の遺伝子の転写を停止させるのに役立つ。

Ｓ、ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓから得たＮ−アセチルムラミダーゼＭ１を発ンズ研 究所のり、　Ｈｏｐｖｏｏｄより入手）を選んだ。トアセチルムラミダーゼＭ１ 遺伝子を含む山１−１から得た５、？ｋｂＢ憇旧−Ｂｇ１１１断片を、２．１ｋ ｂ上流の配列、及び２．９ｋｂ下流の配列と共に、プラスミＦ　ｐｌＪ６９９か ら得た５、Ｏｋｂ　Ｂｇｌ１１断片に連結した（Ｋｉｅｓｅ＋等Ｇｅｎｅ、　６ ５＋８３−９１　（１９８８）　［ジョーンインズ研究所（英ｔＨｃ　Ｍｓｎｉ ｐｗｌＪｌｉｏｎ　ｏｒ　Ｓ＋ｒｅｐ（ｏｔＨｃｅｓ、丁ｈｅ　Ｊｏｈｎ　１ｕ ｎｅｓ　Ｆｏｒｒｖｄｓｊｉｏｎ　（１９８５）。その結果できたプラスミドを ｐＨＬ４？と命名し、このプラスミド中のＮ−アセチルムラミダーゼＭ１遺伝子 の配向を図３に示す。ｐＨＬ４７の誘導体も、ｐＨＬ４７をＫｐｎｌで切断し、 連結してＴＥ０１に形質転換することにより構築した。この結果できたプラスミ ドｐＬＢｓＩ２は、ｐＨＬ４７の３．２　ｋｂ　Ｋｐｃｌ断片が欠落しているこ とを除いてはｐＨＬ４７と同一であった。

イムノプロット技術を用いて、プラスミドｐＨＬ４７又はｐＬＢｓ１２を含むＴ Ｅ０１が、トアセチルムラミダーゼＭｌを分泌することを示した。これらの菌株 及び対照として用いたプラスミドｐ１３６９９含有ＴＫ２４株は、２％デキスト リン、０．５％ハイソイ（Ｈ７Ｓｏ７．シェフイールド）、０．２５％ポリペプ トンペプトン（ＢＢＬ）　、０．５％リン酸酸水素ナナトリウム０，１％リン酸 二水素カリウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．５％塩化ナトリウム、０．３ ％酵母エキス、０．３％麦芽エキス、３４％庶糖及び０．０００５％チオストレ プトン（スクイブ）を含む５０１の液体培地で３０℃で９６時間増殖させた。

増殖の７２時間及び９６時間後、１２，０ＯＯＸ、で５分間の遠心分離により菌 糸を沈殿させ、上澄中の蛋白質を５ＯＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法 により分析した（結果は示さない）。□τＸ・２４（ｐｌ（Ｌ４７）及びＴＫ２ ４　（ｐＬＢｓ１２）の上澄は、トアセチルムラミダーゼＭ１に対する抗血清と 交差反応する二種の蛋白質を含有していた。一方の蛋白質はＮ−アセチルムラミ ダーゼＭ１標準（２７，０・００から２８，０００ダルトン）と同じ位置に移動 し、他方の蛋白質はみかけの分子量３０．０００ダルトンの位置に移動した。予 想したように、対照として使用した上澄中には、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１ に対する抗血清と交差反応する蛋白質の存在は認められなかった。

発現した蛋白質の溶菌活性を以下の如く分析した。７２及び９６時間増殖後の培 養物から上澄を集めた。この上澄を０．５１１ＩＭ　ＥＤＴ＾、１ｍＭ）リス− ＣＩ、ｐＨ７，０で十分透析した。しかる後、上澄中の蛋白質を、セントリコー ン−１０（アミコン社）微量濃縮装置に於る限外濾過により約４０倍に濃縮した 。しかる後、濃縮前の上澄液の１１に相当する量を、５　ｍＭト’Ｊ　ス−Ｃｌ 、ｐＨ７，０，０，０２５％Ｍｉｅｒｏｃｏｅｃｏｓ　１７ｓｏｄｅｉｋｔｉｃ ｕｓ　（シグマ社）を含む反応混合液！１中で活性を分析した。反応の開始時点 及び３７℃で１６時間の保温後に、６００ｎＩ１１波長に於る吸光度（ＯＤ）を 測定した。

００ｎｍ 丁に２４　（ｐｌ（Ｌ４７）及びＴＫ２４　（ｐＬＢｓＩ２）から得た上澄は、 溶菌活性に対応する、１６時間後のＭ、１７ｓｏｄｅｉＨｉｅｏｓ細胞のＯＤ　 に於る−　６００　ｎ　Ｗ 著しい減少を示した。ＴＫ２４　（ＰＩＪ６９９）の上澄は、溶菌活性を示さゼ Ｍｌの発現 プロモーター及びシグナル配列を、完全なＮ−アセチルムラミダーゼＭ１をコー ドしているＤＮＡ配列に融合させることができる。

Ｓ、ｌ１ｗ１ｄｘｎｓ中での分泌のための組み換えプラスミドの構築は、次のス テップを含む。

（１）アガラーゼ転写に於て用いた４個のプロモーター及びアガラーゼシグナル 配列の約３７４を含むプラスミドｐｌ＋２００２（Ｂυ目ｎｅｒ等Ｍｏ１．Ｇｅ ｎ、Ｇｅｎｅｌ、、２０９：１０１−１０９　（１９８７）（ジョーンインズ研 究所から入手可能）から得た３３６：：ｂｐ　＾マａｌｌ　−Ｐｓｌｌ断片の単 離。

このアダプターは、アガラーゼシグナル配列に残存するアミノ酸を再構築し、こ れらをＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ遺伝子ののトアセチルムラミダーゼＡｌｌ の真正配列と異なるヌクレオチドを有する。ヌクレオチド６３０（図１）は、完 全なＮ−アセチルムラミダーゼ遺伝子のＮ−末端領域のＣ１ｇ１部位を作出、及 びこの遺伝子の遺伝子操作を容易にするために、ＣからＴに変えた。

このヌクレオチドの変更は、トアセチルムラミダーゼＭ［蛋白質のこの位置で見 いだされる天然に存在するアミノ酸を変化させることはない。

（３）ステップ１及び２で得た断片の、匹１及び５ＩＣＩで切断したプラスミド ｐＧＥＭ−５２１（＋１　（プロメガコーポレーションから入手）へのライゲー ションによるプラスミドｐＬＢＳ６の作出。

（４）完全なＮ−アセチルムラミダーゼＭ１の初めの２０個のアミノ酸に融合し たアガラーゼプロモーター及びシグナル配列を含むｐＬＢＳ６から得た４２０ｂ ｐＰ具ｌ−迩１断片の単離。

（５）Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１遺伝子の残存部を含むｐＭａ　ｆ＝１　か ら得た１、２ｋｂ迩１−　Ｋｌは１断片の単離。

（６）ステップ４及び５で得た断片の、−（」Ｉ及びＰｓｔｌで切断したプラス ミドｐＧＥＭ−３０Ｄ）　（プロメガコーポレーションから入手）へのライゲー ションによるプラスミドｐＬＢｓ９の作出。

（７）　ＳｌｒｅｐｔｏｍＨｃｅｔ中でのプラスミド複製を可能にする配列を含 むプラスミドｐ１３６９９から得た４、２ｋｂ−叩ユｄｌｌｌ−Ｋｐｎｌ断片の 単離。

（８）完全なトアセチルムラミダーゼＭ１に融合させたアガラーゼプロモーター 及びシグナル配列を含むｐＬＢＳ９から得た１、６形質転換後のライゲージタン によるプラスミド９ＬＢＳ１０の作出。

ｐＬＢｓｌＧは、４個のアガラーゼプロモーターにより推進されるＮ−アセチル ムラミダーゼＭｌの転写能力を有する。アガラーゼのリボゾーム結合部位が用い られ、アガラーゼのシグナルペプチド中の＾ＴＧコドンから翻訳が開始する。シ グナルペプチドプロセシングが、アガラーゼシグナルペプチド切断部位で起こり 、大腸菌中でのＮ−アセチルムラミダーゼＭ１の発現大腸菌中での外来蛋白質の 高水準の発現は、プラスミドｐＣＦＭ１１５６を用いることにより示されている 。プラスミドｐｃＦＭ１１５６は、プラスミドｐＣＦＭ８３６　（１９８７年１ ２月１日発行された米国特許第４、７１０．４７３号に記載、参照により本明細 書に含めるものとする）から、二ケ所の内在性Ｎｄｅｌ制限部位を切断し、Ｔ４ ボリメラーオチドで置換することにより誘導することができる。

ＴＴＡＡＧＣ５’ プラスミドｐｃＦＭ１１５６中で、外来遺伝子は、Ｐ、プロモーター及び合成リ ボゾーム結合部位の下流でクローンされた。大腸菌中での完全なＮ−アセチルム ラミ７−ゼＭ１遺伝子発現のための組み換えプラスミドの構築は、次のステップ を含む。

このオリゴマーは、Ｎ−アセチルムラミダーゼ遺伝子内の遺伝子工学的に処理し たＣｌｒｌ部位（実施例９参照）から皿１部位までの範囲の完全なトアセチルム ラミダーゼ遺伝子の５′側末に於るＣからＴへの変化（実施例９に記載）に加え て、二ケ所の真正Ｎ−アセチルムラミダーゼ遺伝子と異なるヌクレオチドを有す る。これらの変化によって、６３３位のＧがＴに置換され、６３６位のＧがＣに 置換される（図１参照）。これらの変化は、対応するＳｌ＋ｅｐｌｏｍ７ｃｕの コドンを大腸菌が好む他のコドンに変更させる。

（２）Ｎ−アセチルムラミダーゼ遺伝子の残存部を含むｐＭｕｌ−１か断したｐ ＧＥＭ−７Ｘ　（＋）へのライゲーションによるプラスミドｐＬＢＳ７の作出。

（４）大半のＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ遺伝子を含むｐＬＢｓ７このオリゴ マーは、図１のＮ−アセチルムラミダーゼ遺伝子内のヌクレオチド６１８をＣか らＴに、ヌクレオチド６２４をＧからＴに変化させる。これらの変化は、対応す るＳｌｒｅｐｌｏｍ７ｃＣｓのコドンを大腸菌が好むコドンに変更させる。

（６）ステップ４及び５で得た断片の、Ｋｐｎｌ及びＮｄｅｌで切断したプラス ミドｐｃＦＭ１１５６へのライゲーションによる、大腸菌ＦＩＪ５　（Ａ、　Ｔ 、　Ｃ９Ｃ１５３９１１）中でのプラスミドｐＬＢＳ８の作出。

ｐＬＢｓ８に於る、トアセチルムラミダーゼ旧遺伝子の転写は、ＰＬプロモータ ーの働きによっている。ト末端のメチオニンの追加を除いてはＮ−アセチルムラ ミダーゼＭｌと同一の蛋白質の翻訳を開始するために合成リボゾーム結合部位を 用いる。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法を用いて、プラスミドｐｔａｓ＋ ＋を保有するＦＭ５がＮ−アセチルムラミダーゼＭ１を発現することを示した。

この菌株及びプラスミドｐｃＦＭ１１５６を保有する対照菌株ＦＭ５を、カナマ イシン（２０μｇ／ｌ）を含むＬ−ブロス中でＯＤ　が０．５になるまで増殖さ せた。各培養液の０．４１を００ｎｍ 取り出して１２．０ＯＯＸ　ｇで５分間遠心分離した。この上澄をデカントして 除き、ペレットを０．６１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８，２％ＳＤＳ。

１０％グリセロール及び５％２−メルカプトエタノールに溶解させた。しかる後 、ＰＬプロモーターを誘導するために、残りの培養液を４２℃で１５時間振蕩培 養した。最終的なＯＤ　は、１．４６ＧＯｎ＋＊ であった。各培養液０．１４ｍ１を取り出して菌体ペレットを調製し、誘導前の 試料と同様に溶解させた。４個の試料及び市販のトアセチルムラミダーゼＭ１を ５Ｏ３−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法により分析した。ＦＭ５中のｐＬ ＢＳ８のこの誘導後の試料は、トアセチルムラミダーゼＭｌに対する抗血清との 交差反応性のある蛋白質を含んでいた。この蛋白質のみかけの分子量は、市販の Ｎ−アセチルムラミダーゼＭｌ（２７−２８ｋＤ）　と同じであった。

他の３個の試料は、トアセチルムラミダーゼＭ１に対する抗血清との交差反応性 のある蛋白質を含んでいなかった。

実施例１１ トアセチルムラミダーゼＭ１を利用した治療法実用的な量の精製単離Ｎ−アセチ ルムラミダーゼＭｌの製法に関する前述の実施例は、Ｎ−アセチルムラミダーゼ Ｍｌを利用した治療剤の開発を可能にする。広範なスペクトルの細菌溶解活性を 有することから、トアセチルムラミダーゼＭ１は、治療剤として単独で、又は医 薬、又は他の組成物と混合することにより多数の用途を有する。Ｎ−アセチルム ラミダーゼＭ１を、ヒト関節炎の治療に用いることが期待される。歯垢及びう蝕 をもたらす、う触性細菌の多数の菌株の溶菌に於る、これの効果を利用した用途 も又期待される。この酵素は、歯のう蝕の予防及び治療のためにチューインガム 、歯磨き粉又は口内洗浄剤の中に含有させることができる。又、Ｎ−アセチルム ラミダーゼＭｌは、この酵素に感受性のある細菌を溶解することが有益である他 の医薬的又は工業的用途に用いることが期待される。例えば、Ｎ−アセチルムラ ミダーゼＭｌを含有するノド用トローチは、ノドの感染の予防及び治療に用いる ことができる。この酵素は、細菌起源の皮膚感染を防ぐための軟膏またはクリー ムに配合することもできる。さらに、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１は、食品、 医薬品、化粧品又は微生物分解を受けやすい他の製品の保存剤に応用できる。

実施例１２ プローブとしてのトアセチルムラミダーゼＭＩ　ＤＮＡの利用地の生物からのト アセチルムラミダーゼの単離、精製及び研究に於るプローブとして、Ｎ−アセチ ルムラミダーゼＭＩ　ＤＮＡの利用が期待される。トアセチルムラミダーゼＭＩ ＤＮＡの好適なオリゴヌクレオチド断片を、例えば、細菌、カビ、鳥類及び哺乳 動物起源から単離したゲノムＤＮ＾を増幅する（特定のＤＮＡポリメラーゼを用 いて）ためのプライマーとして用いることも又期待される。増幅させたゲノムＤ Ｎ＾は、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いた分析により、配列の変化及び異常を検 出することができる。５ｘｉｋｉ等、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：１３５０　 （１９８５）。Ｍｕｆｔｉｓ、　Ｋ、Ｂ、。

米国特許第４．６８３，２０２号；　１９１１７年７月２８日、及びＭａｌｌ目 、に、Ｂ、。

米国特許第４．６８３．１９５号；　１９８７年７月２８日も参照のこと。

Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１のｍ１ｌＮＡ、又はその関連の蛋白質のｉＲＮ＾ の分析のために、ドツトハイブリダイゼーション分析及びノーザンハイブリダイ ゼーション分析を用いて、ｌ１ｌＲＮＡ及びＮ−アセチルムラミダーゼＭ１又は Ｍｌ様分子を定量的及び定性的に特徴づけることができる。これらの研究から、 種々の細胞型、例えば、細菌、カビ、鳥類及び哺乳動物に於るトアセチルムラミ ダーゼ遺伝子の数多くの異なった形態、及び発現について、価値ある情報を得る ことができる。

以上の具体例は、一般には、ムラミダーゼＭ１に関し、更に詳しくは微生物由来 のＮ−アセチルムラミダーゼＭｌ　、　Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１をコード したＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列の組み換え体発現によるポリペプチド生産 物、その配列がこれらのＤＮＡ配列から波線されたアミノ酸配列に基づくペプチ ド、かかる蛋白質及びペプチドに特異的な抗体、かかる蛋白質及びそれに関連し た核酸の検出及び定量方法、及びＮ−アセチルムラミダーゼＭ１を用いた治療薬 の開発に関連した方法に関する。

以上に、本発明を特定の方法及び組成物に関して説明したが、本発明の種々の変 形、改善は当業者にとって明白である。従って、本明細書に記載した好ましい実 施例は例示的なものであり限定的なものではない。発明の範囲は添付のクレーム によって示されており、それらのクレームの意味の中に入る全ての変形例は本願 発明に含まれるものである。

国際調査報告 り ０発　明　者　ズコウスキー、マーク　アス メリカ合衆国、カリフォルニア・９１３２０、ニューベリー・ノ（−７、サウス ・ダンバーズ・サークＪｌ／　−７１４とメリカ合衆国、カリフォルニア・９１ ３６０、サウザンド・オークζ、ブライト・スター・ストリート・９９６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１又はその生物学的に活性な断片をコードする 精製単離したＤＮＡ配列。
2. ２．部分的又は完全合成した、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. ３．添付図１に示す蛋白質コード領域を含む精製単離したＤＮＡ配列。
4. ４．（ａ）添付図１に示すＤＮＡ配列、（ｂ）厳格な条件下で（ａ）にハイブリ ダイズするＤＮＡ配列、及び （ｃ）遺伝暗号の冗長性のために厳格な条件下で（ａ）にハイブリダイズするＤ ＮＡ配列 からなる群より選択される、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１の生物学的活性を有 するポリペプチドの発現をコードする、精製単離したＤＮＡ配列。
5. ５．Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１の生物学的活性を有することを可能にするの に十分に、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１のアミノ酸配列に対する相同性を持つ アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から本質的に成る精 製単離したＤＮＡ配列。
6. ６．請求項１または４に記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトし た、原核または真核性の宿主細胞。
7. ７．請求項１または４に記載のＤＮＡ配列を含むウィルス性または環状ＤＮＡプ ラスミド。
8. ８．ｐＭｎｔ−１と命名され、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６８１１２に該当する 、請求項７に記載のプラスミド。
9. ９．Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１をコードするＤＮＡと機能的に関連する発現 調節ＤＮＡ配列をさらに含む請求項７に記載のウィルス性または環状ＤＮＡプラ スミド。
10. １０．Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１をコードするＤＮＡ配列で形質転換または トランスフェクトした宿主細胞を培養により増殖させ、該宿主細胞または培養物 から該ＤＮＡの発現ポリペプチド生産物を単離する過程から成る方法によって生 産されるポリペプチド生産物。
11. １１．請求項１に記載のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトした宿主 細胞を培養して増殖させ、該宿主細胞または培養物から該ＤＮＡの発現ポリペプ チド生産物を単離する過程からなる、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１の生産法。
12. １２．遺伝学的に形質転換した宿主細胞中で、請求項１に記載のＤＮＡ配列から 発現されるポリペプチド生産物。
13. １３．β−１，４−Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性によって特徴づけられる請求 項１２に記載のポリペプチド生産物。
14. １４．請求項１２に記載のポリペプチド発現生産物の少なくとも１個の独自エピ トープに対して特異的に免疫反応性のある抗体調製物。
15. １５．Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１と請求項１４に記載の抗体との免疫反応に 基づいた、Ｎ−アセチルムラミダーゼＭ１の定量的検出法。
16. １６．請求項４に記載のＤＮＡ配列と請求項１に記載のＤＮＡ配列のハイブリダ イゼーションに基づいた、請求項４に記載のＤＮＡ配列の定量的検出法。
17. １７．試料中に含まれるＮ−アセチルムラミダーゼＭ１に特異的な遺伝子配列ま たはそれに実質的に相同な配列の定量的、定性的検出法であって、 （ａ）オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズされる各配列の各鎖に対 して、各核酸鎖に相補的な各プライマーの伸張産物が合成されるハイブリダイゼ ーション条件下で、該試料を該特異的配列の各鎖に対して１個のオリゴヌクレオ チドプライマーで処理（ここで、１個のプライマーから合成された伸張産物は、 その相補体から単離した時に、他のプライマーの伸張産物の合成のための鋳型と して働くように、ハイブリダイズされるべき各特異的配列の各鎖に対して十分に 相補的になるように、単独または複数のプライマーが選択される）し、（ｂ）検 出されるべき該特異的配列（単独または複数）が存在する場合は、プライマー伸 張産物をそれらの鋳型から単離するために、該試料を変性条件下で処理し、（ｃ ）プライマー伸張産物がステップ（ｂ）で生産された一本鎖の各々を鋳型として 用いて合成されるように、該試料をオリゴヌクレオチドプライマーで処理し、即 ち該特異的配列が存在するならばそれを増幅させ、 （ｄ）検出されるべき該配列またはその突然変異体とハイブリダイズすることの できる該配列の各々に対する標識オリゴヌクレオチドプローブを、ステップ（ｃ ）の生産物に添加し、（ｅ）該ハイブリダイゼーションの有無を確認する各ステ ップからなる検出法。
18. １８．細菌溶解に効果的な量の、請求項１２に記載のポリペプチドを用いるステ ップから成る、細菌溶解法における改良。
19. １９．医薬的に許容可能な溶剤、希釈剤、アジュバントまたは担体、及び有効物 質としての細菌溶解に効果的な量の請求項１２に記載のポリペプチドを含む医薬 用組成物。
20. ２０．効果的な量の請求項１９に記載の医薬用組成物を投与するステップから成 る、細菌溶解法における改良。